專利名稱：：硫氧還蛋白產(chǎn)生促進劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及痘苗病毒(Vacciniavirus)接種炎癥組織提取物的新醫(yī)藥用途，具體而言，涉及含有痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的硫氧還蛋白(Thioredoxin)產(chǎn)生促進劑。
背景技術：
：機體因暴露于紫外線或微粒等環(huán)境有害物質(zhì)、暴露于由病毒或細菌感染引起的炎癥等各種應激而在細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧種，使蛋白質(zhì)和基因被氧化而受到損傷。因此，機體具備以氧化還原(redox)應答為基本的系統(tǒng)，作為對活性氧種的防御機構(gòu)，作為其代表性系統(tǒng)之一，可以列舉硫氧還蛋白系統(tǒng)。硫氧還蛋白是在大腸菌的DNA合成中必須的酶——核糖核苷酸還原酶中，作為供給氫離子的輔酶而被發(fā)現(xiàn)的。硫氧還蛋白是細胞內(nèi)的氧化還原控制因子，具有-Cys-Gy-Pro-Cys-這樣的活性部位，存在有在2個半胱氨酸殘基之間形成二硫化物(S-S)鍵的氧化型和形成二硫醇(-SH-SH)的還原型。已知硫氧還蛋白因紫外線、放射線、氧化劑、病毒感染、缺血再灌注損傷和投與抗癌劑等而被誘導。已報告，被各種應激所誘導的硫氧還蛋白除了單獨地消除單線態(tài)氧和羥基自由基以外，還通過與抗氧化蛋白的協(xié)調(diào)作用，作為消除活性氧種的抗氧化物質(zhì)而在機體內(nèi)發(fā)揮作用，控制著各種調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子和細胞內(nèi)信號傳遞分子的活性。因此，如果誘導硫氧還蛋白，則可期待能夠保護細胞、組織、器官等免于成為以在細胞內(nèi)引起的各種氧化還原現(xiàn)象為基礎的病態(tài)或其前期階段的狀態(tài)，所以，硫氧還蛋白誘導物質(zhì)的研究得到進展，例如，作為那樣的誘導物質(zhì)，公開了異戊間二烯類化合物(參照專利文獻O。作為上述那樣的氧化/抗氧化，即氧化還原狀態(tài)的不均衡造成的疾病和病態(tài)之一，可以列舉包括慢性阻塞性肺病(COPD)等的肺病。COPD是由有害微粒的吸入而在氣道和末梢肺組織中引起慢性炎癥，以由痰液阻塞和支氣管浮腫(慢性支氣管炎)、肺泡破壞(肺氣腫)引起的持續(xù)的氣道閉塞狀態(tài)為病態(tài)的疾病，其最大的原因是吸煙。在香煙的煙中含有大量氧化劑(oxidant),從而使肺陷入暴露于氧化應激的狀態(tài)。因此提示，已知具有抗氧化、抗炎癥和細胞保護作用的硫氧還蛋白抑制由吸煙引起的組織損傷和炎癥。實際上已有報告，相比于非吸煙者，健康正常吸煙者的血中硫氧還蛋白濃度為有意義的高值，認為硫氧還蛋白的產(chǎn)生增加是作為對慢性吸煙這種持續(xù)的氧化應激的防御機構(gòu)而發(fā)揮作用。從這樣的觀點出發(fā)，將其作為治療策略使用是妥當?shù)模呀?jīng)公開了硫氧還蛋白作為慢性阻塞性肺病的預防或治療劑是有效的(參照專利文獻2)。關于作為本發(fā)明醫(yī)藥有效成分的痘苗病毒接種炎癥組織提取物，公開了鎮(zhèn)痛作用、鎮(zhèn)靜作用、抗應激作用、抗變應性作用(參照專利文獻3)，免疫促進作用、抗癌作用、肝硬化抑制作用(參照專利文獻4)，對特發(fā)性血小板減少性紫癜的治療效果(參照專利文獻5)，對帶狀皰疹后神經(jīng)痛、腦水腫、癡呆、脊髓小腦變性癥等的治療效果(參照專利文獻6),對雷諾綜合癥、糖尿病性神經(jīng)障礙、亞急性視神經(jīng)脊髓病后遺癥等的治療效果(參照專利文獻7)，激肽釋放酶產(chǎn)生抑制作用、末梢循環(huán)障礙改善作用(參照專利文獻8)，骨萎縮改善作用(參照專利文獻9)，在敗血癥和內(nèi)毒素休克的治療中有效的一氧化氮產(chǎn)生抑制作用(參照專利文獻IO)，對骨質(zhì)疏松癥的治療效果(參照專利文獻11)，基于Nef作用抑制作用和趨化因子產(chǎn)生抑制作用的愛滋病治療效果(參照專利文獻12、13)，對腦梗塞等缺血性疾病的治療效果(參照專利文獻14)，對纖維肌痛癥的治療效果(參照專利文獻15)，對感染癥的治療效果(參照專利文獻16)等。但是，還沒有關于該提取物促進硫氧還蛋白產(chǎn)生和保護肺細胞、在慢性閉塞肺病的預防或治療中有效的醫(yī)藥用途的發(fā)表或報告。專利文獻l:日本特開2001—322929號公報專利文獻2:日本特開2005—60408號公報專利文獻3:日本特開昭53—101515號公報專利文獻4:專利文獻專利文獻6:專利文獻7:專利文獻8:專利文獻9:專利文獻10:專利文獻ll:專利文獻12:專利文獻13:專利文獻14:專利文獻15:專利文獻16:日本特開昭55—87724號公報(第3、5、6頁)曰本特開平1—265028號公報(第l、2頁)日本特開平1—319422號公報(第3、4頁)日本特開平2—28119號公報(第3頁)曰本特開平7—97336號公報(第4頁)曰本特開平8—291077號公報日本特開平10—194978號公報曰本特開平11一80005號公報(第2、3頁)日本特開平11—139977號公報日本特開2000—336034號公報(第2、3頁)日本特開2000—16942號公報國際公開WO2004/039383號公報日本特開2004—300146號公報
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種促進具有抗氧化、抗炎癥和細胞保護作用、作為細胞內(nèi)的氧化還原控制因子發(fā)揮重要作用的硫氧還蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)。還在于提供含有該物質(zhì)作為有效成分、在慢性閉塞肺病的預防或治療中有效且安全性高的醫(yī)藥。本發(fā)明的發(fā)明人等進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痘苗病毒接種炎癥組織提取物對硫氧還蛋白產(chǎn)生具有優(yōu)異的促進作用，顯示出肺細胞的保護作用，作為慢性閉塞肺病的預防或治療劑有用，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明的效果痘苗病毒接種炎癥組織提取物對于由慢性吸煙等引起的氧化應激等，具有促進硫氧還蛋白產(chǎn)生、顯示肺細胞保護效果的優(yōu)異的藥理作用，因此，含有痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的本發(fā)明藥劑作為沒有副作用等問題的安全的醫(yī)藥，是有用性高的藥劑。圖1是本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物針對過氧化氫刺激和無血清刺激的細胞保護作用的調(diào)查結(jié)果。圖2是本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物針對吸煙提取物質(zhì)刺激的細胞保護作用的調(diào)査結(jié)果。圖3是調(diào)查本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物針對過氧化氫刺激和無血清刺激的抗細胞凋亡作用的顯微鏡照片。圖4是本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用(基因水平)的調(diào)査結(jié)果。圖5是本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用(蛋白水平)的調(diào)查結(jié)果。圖6是調(diào)查本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物在吸煙暴露的小鼠肺組織中產(chǎn)生的組織保護作用的顯微鏡照片。圖7是計算測定吸煙暴露小鼠的支氣管肺泡洗凈液中的炎癥細胞數(shù)，調(diào)査本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物產(chǎn)生的炎癥細胞浸潤抑制作用的結(jié)果。具體實施例方式關于在本發(fā)明醫(yī)藥中使用的痘苗病毒接種炎癥組織提取物，如上所述，關于接種痘苗病毒的炎癥組織中產(chǎn)生的各種生理活性物質(zhì)、從病態(tài)組織提取該物質(zhì)的方法及其藥理活性等，有多種報告(上述專利文獻316等)。另外，作為市售的醫(yī)藥品，有痘苗病毒接種家兔炎癥皮膚提取液制劑。如醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集(2006年版，財團法人日本醫(yī)藥情報中心編輯發(fā)行)的2585—2587頁中的記載，該制劑是含有從接種了痘苗病毒的家兔的炎癥皮膚組織提取分離的非蛋白性活性物質(zhì)的藥劑，確認適用于腰痛癥、頸肩腕綜合癥、癥狀性神經(jīng)痛、肩周炎、變形性關節(jié)炎、伴隨皮膚病(濕癥、皮炎、蕁麻癥)的瘙癢、變應性鼻炎、亞急性視神經(jīng)脊髓病后遺癥的冷感-異常知覺-疼痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等，皮下、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑和片劑作為醫(yī)療用醫(yī)藥品取得制造認可，并在市場上銷售。本發(fā)明醫(yī)藥中所使用的痘苗病毒接種炎癥組織提取物，是從上述那樣的痘苗病毒接種炎癥組織中提取的非蛋白性的機體功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，也刊載在上述的醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集中的痘苗病毒接種家兔炎癥皮膚提取液制劑己經(jīng)取得醫(yī)藥品制造認可并被市售，而能夠獲得。另外，能夠?qū)⒃谏鲜鰧＠墨I中記載的各種痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為本發(fā)明物質(zhì)利用，其制造方法和優(yōu)選給藥量等也在文獻中得到說明。在本發(fā)明醫(yī)藥中使用的痘苗病毒接種炎癥組織提取物，能夠通過接種痘苗病毒、破碎發(fā)痘的炎癥組織、加入提取溶劑、除去組織碎片后，進行除蛋白處理，使其吸附在吸附劑上，接著洗脫有效成分而得到。痘苗病毒接種炎癥組織提取物，例如，采用以下工序制造。(a)接種痘苗病毒，采集發(fā)痘的兔、小鼠等的皮膚組織等，破碎發(fā)痘組織，加入水、苯酚水、生理食鹽水或加酚甘油水等提取溶劑后，過濾或離心分離，由此得到提取液(濾液或上清液)。(b)將上述提取液調(diào)整為酸性的pH并加熱，進行除蛋白處理。接著，將除去蛋白的溶液調(diào)整為堿性并加熱后，過濾或離心分離。(c)將得到的濾液或上清液調(diào)整為酸性，使之吸附在活性碳、高嶺土等吸附劑上。(d)在上述吸附劑中加入水等提取溶劑，調(diào)整為堿性的pH，洗脫吸附成分，由此能夠得到痘苗病毒接種炎癥組織提取物。此后，根據(jù)希望，也能夠適當?shù)卦跍p壓下蒸發(fā)干燥固體化或冷凍干燥洗脫液而得到干固物。作為用于接種痘苗病毒得到炎癥組織的動物，可以使用兔、牛、馬、綿羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等痘苗病毒感染的各種動物，作為炎癥組織，優(yōu)選兔的發(fā)痘皮膚組織。采取這些炎癥組織并破碎，加入其1至5倍量的提取溶劑，制成乳濁液。提取溶劑可以使用蒸餾水、生理食鹽水、弱酸性至弱堿性的緩沖液等，也可以適當添加甘油等穩(wěn)定劑、苯酚等殺菌-防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，也可以通過冷凍融解、超聲波、細胞膜溶解酶或表面活性劑等的處理破壞細胞組織而容易地進行提取。通過過濾或離心分離等將得到的乳狀提取液除去組織碎片后，進行除蛋白處理。除蛋白操作可以采用通常進行的公知方法實施，可以適用加熱處理、采用蛋白質(zhì)變性劑，例如酸、堿、尿素、胍、丙酮等有機溶劑等的處理、等電點沉淀、鹽析等方法。接著，采用除去不溶物的通常方法，例如，使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃過濾器、硅藻土制品(Celite)、賽茨過濾板的過濾、超濾、離心分離等，除去析出的不溶蛋白質(zhì)。使用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸，將這樣得到的含有有效成分的提取液調(diào)整為酸性，優(yōu)選調(diào)整為pH3.5至5.5，進行向吸附劑吸附的操作。作為能夠使用的吸附劑，可以列舉活性碳、高嶺土等，向提取液中添加吸附劑并攪拌，或者使提取液通過填充有吸附劑的柱，從而能夠使有效成分吸附在該吸附劑上。當向提取液中添加吸附劑時，通過過濾或離心分離等除去溶液，能夠得到吸附了有效成分的吸附劑。為了使有效成分從吸附劑中洗脫(脫離)，向上述吸附劑中加入洗脫溶劑，在室溫或適當加熱下或者在攪拌下洗脫，以過濾或離心分離等通常的方法除去吸附劑，從而能夠?qū)崿F(xiàn)該洗脫。作為所使用的洗脫溶劑，可以使用堿性溶劑，例如，調(diào)整為堿性pH的水、甲醇、乙醇、異丙醇等或其混合溶液，可以優(yōu)選使用調(diào)整為pH9至12的水。這樣得到的提取物(洗脫液)能夠適當調(diào)制為作為制劑用原料和醫(yī)藥品制劑優(yōu)選的形態(tài)。例如，既可以將溶液的pH調(diào)整在中性附近，制成制劑用原料，也可以通過濃縮、稀釋來符合所希望的濃度。還可以作為注射用制劑而加入氯化鈉，調(diào)制與生理食鹽水等張的溶液。另外，也可以通過將這些溶液濃縮干固或冷凍干燥而調(diào)制為能夠作為片劑等的原料利用的固態(tài)物形態(tài)。作為向患者給藥的方法，除口服給藥外，可以列舉皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)給藥等，給藥量可以根據(jù)痘苗病毒接種炎癥組織提取物的種類適當設定。市售制劑認可的給藥量，如果根據(jù)上述醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集(2585頁)，作為醫(yī)療用醫(yī)藥品基本上表示為內(nèi)服1日給藥16NU、注射劑l日給藥3.6至7.2NU，但能夠根據(jù)疾病種類、重傷程度、患者個人差異、給藥方法、給藥期間等適當增減(NU:神經(jīng)妥樂平單位。所謂神經(jīng)妥樂平單位，是使用疼痛閾值比正常動物低的慢性應激動物SART應激小鼠，按照Randall-Selitto變法進行試驗，具有鎮(zhèn)痛效力的ED5Q值規(guī)定的單位。1NU是表示ED5。值為100mg/kg時的神經(jīng)妥樂平制劑的鎮(zhèn)痛活性含有成分lmg的活性。)以下表示痘苗病毒接種炎癥組織提取物的制造方法的例子以及本發(fā)明提取物的新藥理作用，即，表示硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用和COPD預防-治療作用相關的藥理試驗結(jié)果，但本發(fā)明并不受這些實施例記載的任何限制。實施例實施例1在健康的成熟家兔皮膚上接種痘苗病毒，剝出發(fā)痘的皮膚，將其破碎、加入苯酚水。接著，將其加壓過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為pH5后，以9010(TC加熱處理30分鐘。過濾除蛋白后，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9，再以90100。C加熱處理15分鐘后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為約pH4.5，加入2%的活性碳，攪拌2小時后離心分離。向采集的活性碳中加水，以氫氧化鈉調(diào)整為pH10，以6CTC攪拌1.5小時后，離心分離過濾，得到上清液。再向采集的活性碳中加水，用氫氧化鈉調(diào)整為pHll,以6(TC攪拌1.5小時后，離心分離，得到上清液。合并兩次得到的上清液，以鹽酸中和，得到痘苗病毒接種家兔炎癥皮膚提取物。在以下的藥理試驗中，適當調(diào)整為適合實驗的濃度使用。實施例2在健康的成熟家兔皮膚上接種痘苗病毒使之感染后，無菌剝出發(fā)痘的皮膚，將其切碎后，加入加酚甘油水，以勻漿器磨碎成為乳狀。接著，將其過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為弱酸性(pH4.55.5)后，以IO(TC加熱處理并過濾。以氫氧化鈉將濾液調(diào)整為弱堿性(pH8.510.0)，再以IO(TC加熱處理后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為約pH4.5，加入約1.5%的活性碳，攪拌15小時后過濾。向濾取的活性碳中加入水，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9.410，攪拌35小時后過濾，以鹽酸中和濾液。實施例3在健康的成熟家兔皮膚上接種痘苗病毒，使之活化后，無菌剝出活化的皮膚，將其切碎，加入水，以勻漿器磨碎成為乳狀物。接著，將其加壓過濾，以鹽酸將得到的濾液調(diào)整為pH5.0后，在流通蒸氣下以10(TC加熱處理。過濾除蛋白后，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9.1，再以100"C加熱處理后過濾。以鹽酸將濾液調(diào)整為pH4.1，加入2%的活性碳，攪拌2小時后過濾。再向濾液中加入5.5%的活性碳，攪拌2小時后過濾。向最初濾取的活性碳中加水，以氫氧化鈉調(diào)整為pH9.9，以60°C攪拌1.5小時后過濾。向最初的活性碳和其后的活性碳中加水，以氫氧化鈉調(diào)整為pH10.9，以6(TC攪拌1.5小時后過濾。合并濾液，以鹽酸中和后，通過使用分子量100的膜的電透析法進行脫鹽處理，在減壓下干燥固化。接著，表示以使用在上述實施例1中得到的本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為被檢物質(zhì)的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用相關的藥理試驗結(jié)果的一個例子。藥理試驗l:針對過氧化氫(H202)損傷的細胞保護作用在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基(以下，在不特別說明時，該培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基)中添加被檢物質(zhì)，對來自人肺泡細胞上皮的細胞株A549細胞進行16小時前培養(yǎng)。再添加0.3mMH202(最終濃度)，培養(yǎng)6小時后，通過LDHassay(RocheDiagnostics社)測定培養(yǎng)上清液中的LDH(乳酸脫氫酶)，作為細胞活性(viability)的指標。在圖1中表示本發(fā)明提取物針對過氧化氫損傷的細胞保護效果的調(diào)査結(jié)果的一個例子。如果在無血清培養(yǎng)基中向A549細胞施加&02刺激，則引起細胞損傷，但通過添加本發(fā)明提取物進行前培養(yǎng)，則細胞損傷被有意義地抑制，且呈濃度依賴性。另外，對由無血清刺激引起的細胞損傷，也可以確認抑制效果。藥理試驗2:針對吸煙提取物質(zhì)剌激的細胞保護作用在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基中添加被檢物質(zhì)(0.01U/mL)，對A549細胞進行16小時前培養(yǎng)。再添加吸煙提取物質(zhì)，培養(yǎng)6小時后，通過LDHassay測定培養(yǎng)上清液中的LDH，作為細胞活性的指標。另外，吸煙提取物質(zhì)(cigarettesmokeextract,CSE)使用香煙煙發(fā)生裝置SG-200(柴田科學)制作。艮P，以10支香煙(Researchstandardcigarettes2R4F:KentuckyTobaccoResearchandDevelopmentCenter)的煙通過10mL的除去硫醇的DMEM(添加10%HEPES)得到的物質(zhì)作為100%CSE，適當稀釋為適合實驗的濃度使用。在圖2中表示本發(fā)明提取物針)(寸吸煙提取物質(zhì)的細胞保護效果的調(diào)查結(jié)果的一個例子。通過添加本發(fā)明提取物進行前培養(yǎng)，由CSE引起的細胞損傷被有意義地抑制，其效果和NAC(N-乙酰基半胱氨酸，O.lmM)相同。藥理試驗3:抗細胞凋亡作用對于在腔室玻璃(Chamberslide)上培養(yǎng)的A549細胞，在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基中添加被檢物質(zhì)，進行10小時前培養(yǎng)后，再添加H202，培養(yǎng)24小時。另外，為了比較，也在添加有胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中同樣培養(yǎng)A549細胞。用Hoechst33342和碘化丙啶染色，以熒光顯微鏡評價細胞死亡。在圖3中表示本發(fā)明提取物的抗細胞凋亡作用的調(diào)查結(jié)果的一個例子。本發(fā)明提取物抑制了由無血清刺激和H202刺激引起的細胞凋亡(圖3的熒光顯微鏡照片中，具有高亮度小型核的細胞是凋亡細胞)。藥理試驗4:抗氧化作用在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基中添加被檢物質(zhì)(0.01U/mL)，對A549細胞進行16小時前培養(yǎng)，再添加0.3mMH2O2(最終濃度)，培養(yǎng)3小時。接著，進行胰蛋白酶處理后，添加氧化劑(oxidant)反應性熒光底物CM-H2DCFDA(MolecularProbe社)，培養(yǎng)20分鐘。通過流式細胞儀(FACSCalibur，BDbioscience社)測定綠色熒光。以由氧化應激引起熒光亮度上升的細胞作為陽性細胞，通過陽性細胞率判斷結(jié)果。在表1中表示本發(fā)明提取物的抗氧化作用的調(diào)查結(jié)果的一個例子。由無血清和H202刺激等氧化應激引起的細胞的陽性細胞率上升被本發(fā)明提取物有意義地抑制。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>藥理試驗5:硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用(基因水平)在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基中添加被檢物質(zhì)，培養(yǎng)A549細胞9小時。提取RNA，通過RT-PCR法測定硫氧還蛋白的mRNA表達(ABI社7300實時PCR系統(tǒng))。在圖4中表示本發(fā)明提取物在基因水平的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用的調(diào)查結(jié)果的一個例子。確認本發(fā)明提取物的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進效果在基因水平呈濃度依賴性。藥理試驗6:硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用(蛋白水平)在除去硫醇的DMEM培養(yǎng)基中添加被檢物質(zhì)，培養(yǎng)A549細胞。通過蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)測定細胞溶解物中的硫氧還蛋白表達量。在圖5中表示本發(fā)明提取物在蛋白水平的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用的結(jié)果的一個例子。確認本發(fā)明提取物的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進效果在蛋白水平呈濃度依賴性。另外，在使用人肺纖維母細胞株W138時，也確認本發(fā)明提取物具有和A549細胞同樣的細胞保護作用、硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用等。藥理試驗7:組織保護作用(invivo)將C57BL/6J雄性小鼠(8周齡)進行吸煙暴露3日(dayl-3)，檢驗被檢物質(zhì)給藥(day0-3，100NU/kg/day，i.p.)的效果。吸煙暴露使用香煙煙發(fā)生裝置SG-200(柴田科學)進行，1日1小時全身暴露。在最終吸煙24小時后，將小鼠放血致死，在10%中性緩沖甲醛中制作伸展固定肺標本。肺標本進行HE染色和ssDNA免疫染色，評價炎癥和損傷。在圖6中表示本發(fā)明提取物的組織保護作用(invivo)的調(diào)查結(jié)果的一個例子。由吸煙暴露引起(1)細支氣管的細胞死亡、血管周圍間質(zhì)水腫和炎癥細胞浸潤(HE染色)；(2)細支氣管、肺泡、小血管的細胞凋亡(ssDNA免疫染色)，但通過本發(fā)明提取物的給藥，確認這些肺炎癥和損傷有被抑制的傾向(在圖6的ssDNA免疫染色的顯微鏡照片中，具有濃染為黑色核的細胞是凋亡細胞)。藥理試驗8:炎癥細胞浸潤抑制作用(invivo)和上述藥理試驗7同樣，對8周齡的C57BL6小鼠，使用香煙煙發(fā)生裝置SG-200(柴田科學)使之1日1小時暴露3日。小鼠分為被檢物質(zhì)給藥組(n=3，在吸煙30分鐘前腹腔內(nèi)給藥lNU/kg)和生理食鹽水給藥組(n=3)，在最終吸煙暴露24小時后，進行支氣管肺泡洗凈(BAL)，比較研究BAL液中的中性粒細胞數(shù)。BAL以lmL生理食鹽水合計進行5次，由得到的細胞制作細胞離心涂片標本，DiffQuik染色后，計算細胞數(shù)。在圖7中表示本發(fā)明提取物的炎癥細胞浸潤抑制作用(invivo)的調(diào)查結(jié)果的一個例子。通過本發(fā)明提取物的給藥，由吸煙暴露引起的炎癥細胞(中性粒細胞)的浸潤被有意義地(p〈0.05)抑制。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性由上述藥理試驗結(jié)果可知，本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物對于由吸煙提取物質(zhì)、過氧化氫、無血清等刺激引起的氧化應激具有優(yōu)異的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用，同時，顯示出抗氧化作用、細胞凋亡抑制作用等顯著的肺細胞保護效果。因此，本發(fā)明痘苗病毒接種炎癥組織提取物對由氧化還原狀態(tài)不均衡造成的疾病或病態(tài)有效，例如，也作為在以慢性吸煙等持續(xù)的氧化應激為主要原因的慢性阻塞性肺病(COPD)的預防或治療劑有用。市售的痘苗病毒接種家兔炎癥皮膚提取液制劑被長年使用，確認是安全性非常高的藥劑。這樣，本發(fā)明提取物作為硫氧還蛋白產(chǎn)生促進劑、肺細胞保護劑或肺氣腫、慢性支氣管炎等慢性阻塞性肺病的預防-治療劑，是新的藥劑，作為也幾乎未發(fā)現(xiàn)副作用的安全性高的醫(yī)藥，是有用性高的藥劑。權利要求1.一種硫氧還蛋白產(chǎn)生促進劑，其特征在于含有痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分。2.—種肺細胞保護劑，其特征在于含有痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分。3.—種慢性阻塞性肺病的預防或治療劑，其特征在于:含有痘苗病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分。4.如權利要求13中任一項所述的劑，其特征在于炎癥組織是兔的皮膚組織。5.如權利要求14中任一項所述的劑，其特征在于其為注射劑。6.如權利要求14中任一項所述的劑，其特征在于其為口服劑。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種促進具有抗氧化、抗炎癥和細胞保護作用，作為細胞內(nèi)的氧化還原控制因子發(fā)揮重要作用的硫氧還蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)。還在于提供含有該物質(zhì)作為有效成分、在慢性阻塞性肺病的預防或治療中有效而且安全性高的醫(yī)藥。本發(fā)明涉及痘苗病毒接種炎癥組織提取物的新醫(yī)藥用途，涉及含有該提取物作為有效成分的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進劑。該提取物對于由吸煙提取物質(zhì)、過氧化氫等刺激引起的氧化應激，具有優(yōu)異的硫氧還蛋白產(chǎn)生促進作用，顯示出顯著的肺細胞保護效果。因此，以該提取物作為有效成分的本發(fā)明醫(yī)藥，作為以慢性吸煙等持續(xù)的氧化應激為主要原因的慢性阻塞性肺病的預防或治療劑，且作為副作用少、安全性高的醫(yī)藥品，是有用性高的醫(yī)藥。文檔編號A61K35/36GK101410124SQ200780011408公開日2009年4月15日申請日期2007年3月29日優(yōu)先權日2006年3月30日發(fā)明者中村肇,星野勇馬,淀井淳司申請人:國立大學法人京都大學;日本臟器制藥株式會社