專利名稱：直接細胞能量遞送系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當前公開的主題涉及對于向細胞遞送生物分子有用的脂質(zhì)泡囊以及使用它的方法。

背景技術(shù)：
例如，由于緊張的環(huán)境條件，細胞和組織可能變得缺乏特別的生物分子。為了細胞和組織能夠生存，在所述細胞和組織內(nèi)缺乏的生物分子的水平必須被提高以滿足代謝需求。例如，ATP作為能量的主要來源是細胞所依賴的生物分子，提高的代謝需求或者對細胞的ATP供應(yīng)不足可以引起細胞的死亡，如果需求沒有被很快地滿足。
ATP是驅(qū)動所有細胞——動物、植物、細菌、真菌等等的燃料。如同沒有汽油的汽車一樣，具有空的ATP“罐”的人和其他生物將不能運轉(zhuǎn)。實際上，他們會死亡。來自營養(yǎng)物的分解的能量最終保存在ATP的高能磷酸鍵中。當這些鍵斷裂時，它們向細胞、組織、器官和器官系統(tǒng)提供可使用的能量。細胞持續(xù)地合成并代謝ATP。ATP可以通過氧化磷酸化，用氧氣作為末端電子受體并產(chǎn)生二氧化碳(CO2)和水作為副產(chǎn)品來有氧地產(chǎn)生，或在糖酵解期間厭氧地產(chǎn)生。雖然糖酵解可以向細胞提供能量，由于細胞環(huán)境變得酸性化，損害細胞并抑制ATP產(chǎn)生，這種供應(yīng)是有限的。
血管循環(huán)系統(tǒng)輸送來自氧氣和營養(yǎng)物的能量的持續(xù)供應(yīng)。在血管系統(tǒng)中，內(nèi)皮細胞的屏障分隔了從血管管腔給養(yǎng)的細胞。為了到達血管系統(tǒng)之外的細胞，氧氣和營養(yǎng)物必須穿過內(nèi)皮內(nèi)襯進入細胞間隙。作為疾病或外傷的結(jié)果，血液的流動，因而營養(yǎng)物和氧的流動可能被切斷或降低。例如，心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、中風(fēng)、血壓過低和嚴重的外傷，例如在車禍中切斷頸動脈，導(dǎo)致氧損失，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境平衡的喪失，可能引起死亡。
當在引起組織的氧和營養(yǎng)物損失的缺血性事件之后血液供給被重新建立時，可能發(fā)生缺血-重灌注損傷。在復(fù)氧(reoxygenation)之后，隨著細胞試圖合成ATP，產(chǎn)生了有毒的代謝物，例如自由基。缺血不僅僅是與外傷或疾病相關(guān)的現(xiàn)象，也可以作為手術(shù)的副作用被誘導(dǎo)，所述手術(shù)例如主動脈搭橋、開放心臟手術(shù)、主要組織重構(gòu)、腫瘤移除、腸切除術(shù)和器官移植。
缺血是對成功的組織和器官移植的巨大挑戰(zhàn)。在美國每年移植約14,000個腎臟和2500個心臟。在取出之后，器官在缺乏營養(yǎng)物和氧氣的情況下具有有限的生命期。心臟必須在取出之后4到6小時內(nèi)移植，而腎臟必須在72小時內(nèi)移植。由于接受者通常遠離供體，這種短的生存時間妨礙了移植。血液可以在4℃保存僅僅約45天，然后必須被丟棄。更復(fù)雜的是在等待手術(shù)時自體血液的獲取?；颊咄ǔＴ?5天內(nèi)僅可以提供兩個單位的血液。這個數(shù)量是不足夠的，因為許多外科操作使用三個、四個或更多單位的血液。
已經(jīng)進行了一些嘗試來克服或抑制低氧供應(yīng)的不利影響。這些方法包括(1)提供糖酵解中間體來增加厭氧性ATP產(chǎn)生；(2)降低代謝需求，例如在4℃保存細胞、組織和器官；以及(3)直接向細胞、組織或器官添加ATP。向細胞提供能量優(yōu)選地通過直接施用ATP來實現(xiàn)；然而，細胞很少地接受外源ATP，因為它們?nèi)狈TP受體或通道。此外，細胞質(zhì)膜是疏水性的，而ATP是親水性的，阻止了ATP穿過。向血流中導(dǎo)入ATP是低效的，因為ATP不能跨越內(nèi)皮屏障，并且ATP傾向于水解。此外，ATP是嘌呤能受體激動劑，當靜脈內(nèi)地施用時，ATP可能引起血管舒張和血壓過低。使用脂質(zhì)體來遞送ATP的嘗試已經(jīng)是很不成功的和低效的(Arakawa et al.1998，Puisieux et al.1994)。例如，Puisieux等人構(gòu)建了磷脂酰膽堿、膽固醇和磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)泡囊，其封裝了ATP，然后與精細胞、肝臟及腦組織溫育所述泡囊。雖然觀察到一些攝取，沒有實現(xiàn)匹配ATP的代謝需求的受控的遞送。當在血流中施用時，脂質(zhì)體通常不能突破內(nèi)皮細胞屏障；此外，它們通常不具有與細胞膜融合的高速度，融合是泡囊遞送它的ATP有效載荷進入細胞所必需的事件。
動物細胞質(zhì)膜含有四種主要的磷脂，其代表了超過總脂質(zhì)的一半磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂。磷脂酰膽堿和鞘磷脂主要在外葉中存在，而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸主要在內(nèi)葉中存在。磷脂酰膽堿是動物細胞中最豐富的磷脂。因而，任何脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)應(yīng)當主要由這種磷脂構(gòu)成。此外，磷脂酰膽堿是形成閉合的脂質(zhì)泡囊的僅有的天然形成的磷脂，脂質(zhì)泡囊保護泡囊內(nèi)的內(nèi)容物并降低滲漏。質(zhì)膜幫助維持細胞的完整性并是選擇透過性的。雖然某些分子能夠擴散通過膜，大多數(shù)的分子，包括ATP，需要其他方式來進入，例如轉(zhuǎn)運蛋白或通道。
因而，一直地需要新的方法來為了各種應(yīng)用將生物分子遞送給細胞，包括但不限于提供生物分子，例如ATP給未接受足夠數(shù)量的生物分子的細胞和組織來滿足代謝需求。


發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明內(nèi)容部分列出了當前公開的主題的幾個實施方式，在很多情況下列出了這些實施方式的變體和變換體。發(fā)明內(nèi)容部分僅僅示例了很多和不同的實施方式。提及給定實施方式的一個或多個代表性的特征同樣是示范性的。這樣的實施方式一般可以在有或沒有提及上述特征的情況下存在；同樣地，那些特征可以應(yīng)用于當前公開的主題的其他實施方式，無論是否在發(fā)明內(nèi)容部分中列出。為了避免過多的重復(fù)，發(fā)明內(nèi)容部分沒有列出或暗示這樣的特征的所有可能的組合。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了泡囊，其包含是穩(wěn)定泡囊形成者(former)的磷脂和至少一種不穩(wěn)定泡囊形成成員，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員選自不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)、PEG、筏形成者(raftformer)和融合蛋白。是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂或者不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)可以具有式(I)的結(jié)構(gòu) X-L-(Z)2 (I) 其中X是H、A，或具有式(II)的結(jié)構(gòu)
B是陽離子或烷基基團， A是H或烷基基團， L是進一步缺少兩個氫原子的烷基，和 每個Z獨立地是H、E或式(XI)的結(jié)構(gòu)，
其中E是烷基或烯基，當一個Z是H時，另一個Z不是H。
在當前公開的泡囊的某些實施方式中，A是H，或具有選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的結(jié)構(gòu)。

其中n是0到4的整數(shù)； L具有選自式(VIII)、(IX)或(X)的結(jié)構(gòu)


；以及 E具有選自(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)的結(jié)構(gòu)
進一步的，在某些實施方式中，E可以是細菌脂肪酸。示范性的細菌脂肪酸包括，但不限于，異支鏈脂肪酸、反異支鏈脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不飽和或順式-不飽和脂肪酸、a-羥基脂肪酸、b-羥基脂肪酸、a-羥基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羥基脂肪酸、環(huán)己基脂肪酸、(Z，Z)-不飽和脂肪酸、a-羥基-(bE)-烯和2-己基環(huán)丙烷癸酸。
在泡囊的某些實施方式中，所述是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂是磷脂酰膽堿，在某些實施方式中，所述磷脂酰膽堿是大豆磷脂酰膽堿、卵磷脂酰膽堿、大腸桿菌(E.coli)提取的磷脂酰膽堿、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、1-棕櫚?；?2-二十二碳六烯?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PDPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)或其混合物。進一步的，在某些實施方式中，所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是具有選自式(XXIV)、(XXV)、(XXVI)、(XXVII)、(XXIX)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定泡囊形成極性脂質(zhì)。在其他實施方式中，所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是具有約20到約8000個重復(fù)單元的分子量、約3000到約4000個重復(fù)單元的分子量、或約3350個重復(fù)單元的分子量的PEG。更進一步，在某些實施方式中，所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是選自膽固醇和鞘磷脂的筏形成者，或所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是選自受精素(fertilin)、可溶的N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子附著蛋白受體(SNARE)、secl/munc18(SM)多肽、病毒包膜融合蛋白和膜聯(lián)蛋白(annexin)的融合蛋白。在某些實施方式中，所述泡囊包含兩種或更多的所述不穩(wěn)定泡囊形成成員。
在所述泡囊的某些實施方式中，所述泡囊進一步包含生物分子。在某些實施方式中，所述生物分子是脂質(zhì)可溶的生物分子，其可以選自a-生育酚(維生素E)、視黃醇(維生素A)、phyllochinon(維生素K)、麥角鈣化醇(維生素D)、膽固醇、膽固醇酯、類固醇、藿烷類(hopanoids)、洗滌劑、脂肪酸、細菌支鏈脂肪酸、類異戊二烯化合物、長鏈醇、脂質(zhì)可溶的麻醉劑、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂多糖、生物素標記的磷脂、膜離子電導(dǎo)通道、轉(zhuǎn)運蛋白、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、粘附蛋白、間隙連接蛋白、聯(lián)會接點蛋白、半胱氨酸蛋白酶(caspases)、粘著蛋白(adherence protein)、G-蛋白、MHC蛋白、補體蛋白、脂質(zhì)可溶的病毒蛋白、細胞受體、脂質(zhì)可溶的熒光探針分子和脂質(zhì)可溶的放射性示蹤分子。在某些實施方式中，所述生物分子是水溶性的生物分子，其可以選自氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、單糖、二糖、多糖、核苷酸、多核苷酸、水溶性維生素、礦物質(zhì)、高能磷酸、糖酵解中間物、氧化中間物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+或NADH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD+或FADH2)、水溶性細胞酶、胰島素、水溶性熒光探針分子、水溶性放射性示蹤分子和水溶性藥物。進一步的，在某些實施方式中，所述生物分子是選自ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鳥嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP和次黃苷的高能磷酸。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了泡囊，其包含生物分子(例如ATP)、大豆磷脂酰膽堿和DOTAP。在某些實施方式中，所述ATP以約0.01mM到約200mM的濃度存在。進一步的，在某些實施方式中，所述泡囊具有約50:1的大豆磷脂酰膽堿比DOTAP的比例。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了泡囊，其包含生物分子(例如ATP)、DOPC和DOTAP。在某些實施方式中，所述ATP以約0.01mM到約200mM的濃度存在。進一步的，在某些實施方式中，所述泡囊具有約50:1的大豆磷脂酰膽堿比DOTAP的比例。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了向細胞遞送生物分子的方法，包括用當前公開的主題的泡囊接觸所述細胞。在某些實施方式中，所述泡囊進一步包含生物分子，所述生物分子在某些實施方式中是ATP。進一步的，在某些實施方式中，通過所述泡囊遞送給細胞的ATP的數(shù)量足以在低氧或低營養(yǎng)物的期間補償ATP利用事件并幫助維持細胞。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了治療傷口的方法，包括用包含當前公開的主題的泡囊的組合物接觸所述傷口，所述泡囊包含生物分子。在某些實施方式中，所述生物分子是ATP。在某些實施方式中，所述泡囊進一步包括貝卡普勒明(becaplermin)、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、抗生素、含銀組合物、皮膚移植組合物或其組合。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了提高具有至少一個細胞的生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率的方法，包括用泡囊接觸所述細胞。所述泡囊可以包含生物分子，其在某些實施方式中是ATP。
在某些實施方式中，當前公開的主題提供了保存組織的方法，包括用當前公開的主題的泡囊接觸組織。所述泡囊可以包含生物分子。在某些實施方式中，所述生物分子是ATP。
因而，當前公開的主題的目的是提供脂質(zhì)泡囊，用向細胞遞送于生物分子，以及使用脂質(zhì)泡囊的方法。通過當前公開的主題完全地或部分地實現(xiàn)了這個目的和其他目的。
以上已經(jīng)聲明了當前公開的主題的目的，隨著描述的進行，當結(jié)合下文中描述的實施例和附圖時，其他的目的將變得明顯。



圖1是顯示在一小時之后ATP在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)內(nèi)的分配系數(shù)的柱形圖。
圖2是顯示在裸鼠中當前公開的主題的組合物對傷口愈合的效果的線形圖。
圖3是顯示大鼠中切斷的肢體的成功再植的一對相片。在重新連接之后，肢體是完全有功能的。
圖4是顯示通過GC/MS測定的大豆磷脂酰膽堿(PC)的脂肪酸成分的圖表。大豆PC具有非常低的飽和/不飽和比例(0.3)，這表明不飽和脂質(zhì)的優(yōu)勢，其可以提高融合。
圖5A至圖5C是顯示包含大豆PC/DOTAP(50:1)的泡囊提高細菌生長速率(圖5A)以及還幫助肝臟保存(圖5B和圖5C)的圖表。
圖6A和圖6B是顯示用于向股靜脈遞送生物素化的脂質(zhì)的、當前公開的主題的泡囊的顯微照片。大鼠后肢用含有生物素化的PE的泡囊灌注。圖6A是在用生物素化的泡囊和熒光鏈霉抗生物素蛋白灌注14天之后的顯微照片。圖6B是非生物素化的泡囊和熒光鏈霉抗生物素蛋白的顯微照片。圖6A和6B的放大率為100×。
圖7是顯示了與對照動物相比施用ATP-SUV的動物的出血性休克模型中提高的存活率的線形圖。
圖8是顯示了與對照動物相比施用ATP-SUV的動物的化學(xué)誘導(dǎo)的缺氧模型中提高的存活率的柱形圖。

具體實施例方式 當前的主題利用了這一發(fā)現(xiàn)，即，與細胞雙層脂質(zhì)膜吸收性相容的小的脂質(zhì)泡囊可以封裝生物分子并將生物分子直接遞送給細胞。生物分子遞送的速率可以通過改變脂質(zhì)泡囊組成，以及通過其他方式，產(chǎn)生不同的吸收速率來控制。此外，泡囊組成可以被調(diào)整來適應(yīng)不同的的施用方式。例如，可以制成小的脂質(zhì)泡囊，從而當被注射到循環(huán)中時，泡囊可以繞過內(nèi)皮細胞，打開缺口，從而它們可以被目標細胞有效地吸收。為了促進或靶向吸收，其他成分可以添加到泡囊，例如某特定的多肽。通過裝載到脂質(zhì)泡囊中，生物分子可以被穩(wěn)定以對抗水解作用。
當前公開的主題的組合物和方法滿足了對于向細胞的有效生物分子遞送，例如向細胞遞送ATP的需求。向細胞的有效的生物分子遞送的四個目標是第一，取決于要遞送的生物分子，生物分子必須穿過或進入細胞膜。第二，生物分子的數(shù)量必須以一定速率遞送，其可以幫助補償細胞對生物分子的基礎(chǔ)代謝需求，例如，在各種條件下細胞對ATP的代謝需求。第三，含有生物分子的組合物必須與給藥途徑相容。最后，為了有效，生物分子必須在生物分子降解之前進入細胞或細胞膜。
脂質(zhì)泡囊膜相似于漿細胞膜；此外，它們是容易制取的。因為它們具有水性部分，脂質(zhì)泡囊可以封裝各種溶液，包括含有生物分子例如ATP的那些。然而，泡囊還包含疏水性成分，因而也可以被利用來向細胞遞送疏水性生物分子。脂質(zhì)泡囊可以制成被細胞膜吸收，容許脂質(zhì)泡囊的內(nèi)容物的遞送。
在此公開的主題的方法和組合物具有廣泛的用途，包括治療出血性休克、心臟病發(fā)作、冠心病、中風(fēng)、血壓過低、嚴重外傷、傷口愈合、組織和器官保存、心肺復(fù)蘇和移植。在嚴重外傷的情況下，當前公開的主題的組合物可以就地施用來最小化損傷直到獲得醫(yī)學(xué)幫助。所述方法和組合物也可以用于延長血液和血小板保存。
在整個說明書和權(quán)利要求中，給定的化學(xué)式或名稱應(yīng)當涵蓋所有的光學(xué)和立體異構(gòu)體以及外消旋混合物，在外消旋混合物中存在這樣的異構(gòu)體和混合物。
以下的秒行速并非意圖限制當前公開的主題，而是被呈現(xiàn)以幫助醫(yī)師，但是可以使用其他的方法、技術(shù)、細胞、試劑和途徑。
定義 “烷基”(或烷基-或烷-)是指取代的或未取代的、直鏈的、支化的或環(huán)狀的烴鏈，優(yōu)選地含有1到20個碳原子。未取代的烷基的適合的實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、叔-丁基、仲-丁基、環(huán)丁基、戊基、環(huán)戊基、己基、環(huán)己基，等等。沿著烷基鏈可以有任選地插入的一個或多個氧、硫或取代或未取代的氮原子?！巴榛蓟焙汀巴榛s環(huán)”基團是分別共價結(jié)合到芳基或雜環(huán)基團的烷基。
“烯基”是指取代的或未取代的、直鏈的、分支的或環(huán)狀的、不飽和的烴鏈，其含有至少一個雙鍵，優(yōu)選地2到22個碳原子。示范性的未取代的烯基基團包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(或烯丙基)、1，3-丁間二烯基、己烯基、戊烯基、1，3，5-己三烯基，等等。優(yōu)選的環(huán)烯基含有五到八個碳原子和至少一個雙鍵。環(huán)烯基的實例包括環(huán)己二烯基、環(huán)己烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)辛烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚二烯基、環(huán)辛三烯基等等。
“烷氧基”是指取代的或未取代的，-O-烷基。示范性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、異丙氧基、n-丁氧基、t-丁氧基，等等。
“芳基”是指任何單價的芳香族碳環(huán)的或芳香雜環(huán)的基團，優(yōu)選具有3到10個碳原子。芳基基團可以是二環(huán)的(即，苯基(或Ph))或多環(huán)的(即，萘基)，并可以是取代的或未取代的。優(yōu)選的芳基基團包括苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吲哚基、喹啉基或異喹啉基。
“氨基”是指未取代的或取代的-NRR′基團。胺可以是伯胺(-NH2)、仲胺(-NHR)或叔胺(-NRR′)，取決于取代基(R或R′)的數(shù)目。取代的氨基的實例包括甲基胺基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、2-丙基氨基、1-丙基氨基、二(n-丙基)氨基、、二(異-丙基)氨基、甲基-n-丙基氨基、t-丁基氨基、苯胺基，等等。
術(shù)語“季氮”是指氮原子，其參與四個單鍵、兩個單鍵和一個雙鍵、一個單鍵和一個三鍵、或兩個雙鍵。因而，在當前公開的主題的某些實施方式中，術(shù)語“季氮”是指被四個取代基團取代的氮原子，包括一個基團，其進一步用于將該季氮連接到連接基團“L”或在此公開的式(II)的化合物的氧原子上。因而，在某些實施方式中，所述季氮具有以下結(jié)構(gòu)
其中每個R1獨立地選自H、烷基、取代的烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基、烯基、羥烷基、烷氧基烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。
“雜環(huán)基”是指穩(wěn)定的飽和環(huán)、部分不飽和環(huán)或芳香環(huán)，優(yōu)選含有5到10個、更優(yōu)選含有5個或6個原子。環(huán)可以被取代基取代1次或更多次(優(yōu)選地，1、2、3、4或5次)。環(huán)可以是單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)的。雜環(huán)基團由碳原子和1到3個雜原子組成，所述雜原子獨立地選自氮、氧和硫。雜原子可以是保護的或未保護的。有用的雜環(huán)基團的實例包括取代的或未取代的、保護的或未保護的吖啶、苯并噻唑啉(benzathiazoline)、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噻唑(benzthiazole)、苯并苯硫基(benzothiophenyl)、咔唑、肉啉、呋喃、咪唑、1H-吲唑、吲哚、異吲哚、異喹啉、異噻唑、嗎啉、噁唑(即，1，2，3-噁二唑)、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、酞嗪、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑琳、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噻吩、1，3，5-三嗪、三唑(即，1，2，3-三唑)，等等。
“取代的”是指所述部分含有至少一個、優(yōu)選1-3個取代基。適合的取代基包括氫(H)和羥基(-OH)、氨基(-NH2)、氧基(-O-)、羰基(-CO-)、硫氫基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、鹵、腈、硝基、芳基和雜環(huán)基團。這些取代基任選地可以進一步被1-3個取代基取代。被取代的取代基的實例包括氨甲酰、烷基巰基、烷基磺?；?、烷基氨基、二烷基氨基、季氮、羧化物(carboxylate)、烷氧羰基、烷基芳基、芳烷基、烷基雜環(huán)基，等等。
脂質(zhì)泡囊 脂質(zhì)泡囊相似于質(zhì)膜，它們可以被制成被細胞膜吸收。早先的脂質(zhì)體研究顯示了在脂質(zhì)體和細胞膜之間觀察到四種主要類型的相互作用對細胞表面的吸附；內(nèi)吞作用(脂質(zhì)體被吞噬細胞的主動攝取)；脂質(zhì)交換(涉及脂質(zhì)體和質(zhì)膜之間各種脂質(zhì)分子的轉(zhuǎn)移)；和融合(其中脂質(zhì)體膜與漿細胞膜結(jié)合)。“吸收(absorb)”、“吸收(absorption)”和“吸收的(absorptive)”，作為在此使用的術(shù)語，涵蓋了脂質(zhì)體和細胞膜之間的所有的相互作用，包括吸附、內(nèi)吞作用、脂質(zhì)交換和融合。
融合物提供了感興趣的機制，因為它容許漿泡囊內(nèi)容物直接進入細胞內(nèi)。吸收或脂質(zhì)交換也是感興趣的，特別是當希望脂質(zhì)可溶的生物分子向目標細胞遞送時。內(nèi)吞作用可以在特定細胞類型中發(fā)生，例如白細胞，也可以是泡囊被目標細胞吸收的機制。
大多數(shù)脂質(zhì)體和多層泡囊不容易融合，主要是因為泡囊曲率半徑的保存的能量是最小的。然而，當前公開的主題的單層小泡囊，其具有非常小的曲率半徑，可以被制成具有強吸收性的，在某些實施方式中包括融合。當前公開的主題的單層小泡囊(SUV)的平均水動力學(xué)直徑在某些實施方式中是約20nm到約600nm；在某些實施方式中是約100nm到約300nm；在其他實施方式中是約10nm到約100nm，更優(yōu)選的是約20nm到約60nm，包括約40nm。這種大小容許泡囊穿過內(nèi)皮細胞之間的缺口。當前公開的主題的有用的泡囊可以在大小上大大地變化，并根據(jù)特定的應(yīng)用和向目標細胞遞送的期望機制(例如，融合、脂質(zhì)交換、內(nèi)吞作用，等等)來選擇。
形成當前公開的泡囊的組合物可以包含極性磷脂，其是穩(wěn)定泡囊形成者，優(yōu)選地，與至少一種不穩(wěn)定泡囊形成成員一起，所述不穩(wěn)定泡囊形成成可以選自不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)、PEG、筏形成者和/或融合蛋白。
極性脂質(zhì)，包括磷脂穩(wěn)定泡囊形成者，以及，在某些實施方式中，不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)，是具有疏水性末端和親水性末端的有機分子，并含有至少六個碳原子。它們可以具有式(I)的結(jié)構(gòu) X-L-(Z)2 (I)， 其中X是頭部基團，L是主干基團，每個Z是脂肪基團。兩個Z基團可以是相同的或不同的。
磷脂是極性脂質(zhì)，其具有包括磷脂的頭部基團。當前公開的主題包括磷脂，其被具有式(II)的頭部基團的組合物涵蓋，其中A和B是頭部基團的取代基。
當前公開的主題涵蓋的極性脂質(zhì)包括例如穩(wěn)定泡囊形成脂質(zhì)和不是穩(wěn)定泡囊形成者的脂質(zhì)，所述極性脂質(zhì)的頭部基團X可以是任何極性基團，優(yōu)選的是陽離子的、陰離子的或兩性離子的基團，或H。在某些實施方式中，X是具有式(II)的基團。在其他實施方式中，X是A。A可以是H，或烷基。在某些實施方式中，A是被胺取代的烷基，在某些實施方式中A是具有式(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的基團，其中n是從0到4的整數(shù)。B可以是陽離子，例如Na+、K+或四甲基銨離子，或烷基。
要注意的是，在整個說明書中，結(jié)構(gòu)式可以顯示質(zhì)子化形式的結(jié)構(gòu)，但是它們還包括非質(zhì)子化的形式(反之亦然)；在任何組合物中存在哪種形式將取決于組合物的確切pH值、水和/或適合的對抗離子的存在。
主干基團L可以是進一步缺少兩個氫原子的烷基(來得到總共三個開放的連接位點)，在某些實施方式中可以是烷氧基，或氨基取代的烷基。在特定的實施方式中，L是具有式(VIII)、(IX)或(X)的基團。
脂肪基團Z可以是相同的或不同的，在某些實施方式中是H、E基團或式(XI)的結(jié)構(gòu)，其中E是烷基或烯基。在某些實施方式中，E是未取代的直鏈烷基或烯基，具有6-26個碳原子。在特定的實施方式中，E是式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)的組。在其他特定的實施方式中，E是細菌脂肪酸。示范性的細菌脂肪酸包括，但不限于，異支鏈脂肪酸、反異支鏈脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不飽和或順式-不飽和脂肪酸、a-羥基脂肪酸、b-羥基脂肪酸、a-羥基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羥基脂肪酸、環(huán)己基脂肪酸、(Z，Z)-不飽和脂肪酸、a-羥基-(bE)-烯和2-己基環(huán)丙烷癸酸。如果脂肪基團之一是H，則另一個是不同的。如果存在雙鍵，在特定的實施方式中順式構(gòu)型是優(yōu)選的。
X—L—(Z)2(I)


是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂(或極性脂質(zhì))是一種磷脂(或極性脂質(zhì))，當如下制備時其將形成泡囊，它的至少50％將存留至少一個小時磷脂溶于氯仿中并置于玻璃試管中。通過在氮氣的穩(wěn)定氣流下蒸發(fā)來除去溶劑，隨后使樣品經(jīng)歷十二小時真空來除去溶劑。干燥的脂質(zhì)材料然后在10mMNa2HPO4中、在高于脂質(zhì)相變溫度的溫度下重新水化60分鐘；期望的終濃度是25mg/ml。然后利用在40％負載周期下使用的microtip 450瓦超聲發(fā)生器的超聲處理來攪動脂質(zhì)混合物。在某些情況下，優(yōu)選的是使用高壓均質(zhì)化和/或高壓擠壓通過固定直徑的過濾器。
適合用作穩(wěn)定泡囊形成成員的極性脂質(zhì)的實例包括，但不限于1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)(式XXIII)、1-棕櫚?；?2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PDPC)(式XXVIII)、二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、大豆磷脂酰膽堿(大豆PC)、卵磷脂酰膽堿、大腸桿菌提取物磷脂酰膽堿或其混合物。
在當前公開的主題的某些實施方式中，穩(wěn)定泡囊形成極性脂質(zhì)可以來源于天然來源，例如來自天然脂質(zhì)的提取物，所述天然脂質(zhì)來自植物、動物、酵母和細菌的。來自天然來源的極性脂質(zhì)的提取物可以提供適合的脂質(zhì)以及節(jié)省成本的益處。例如，對當前公開的主題有用的極性脂質(zhì)可以來源于大豆來源。大豆油是食品工業(yè)的大宗商品，被用于大豆磷脂(大豆PC)的提取。獲得了從30％-100％的不同程度純度的大豆PC。大豆PC具有二不飽和亞油酸和混合鏈(例如，sn-1飽和的和sn-2不飽和的)的優(yōu)勢，其可以提高這種天然脂質(zhì)提取物的吸收能力。參見圖4。大豆PC的主要“成分”是溶血磷脂酰膽堿(溶血PC)和游離脂肪酸，其是提取和精致加工的副產(chǎn)物。有趣地，溶血PC和游離脂肪酸可以用來促進目標細胞對泡囊的吸收。因此，在當前公開的主題的某些實施方式中，泡囊可以包含，例如，95％的大豆PC作為穩(wěn)定泡囊形成者，和5％的溶血PC和游離脂肪酸作為不穩(wěn)定泡囊形成成員。這種配方降低了為了實現(xiàn)相同的期望的吸收率所必需的其他不穩(wěn)定泡囊形成成員的數(shù)量，例如DOTAP或POPA。因而，這種制劑可以或可以不需要添加其他不穩(wěn)定泡囊形成成員，這取決于期望的吸收率。
除了以上特別提及的大豆PC的益處之外，來自動物、植物、酵母和細菌的脂質(zhì)的天然提取物可以用作脂質(zhì)的循環(huán)來源，用于當前公開的主題的泡囊的生產(chǎn)。作為非限制性的實例，利用大腸桿菌用于胰島素生產(chǎn)的生物反應(yīng)器可以用作當前公開的主題的脂質(zhì)體中穩(wěn)定的形成脂質(zhì)的脂質(zhì)材料來源(來自大腸桿菌)。照這樣，大的批次所需的脂質(zhì)材料的數(shù)量被降低了，從而降低成本。
在某些實施方式中，除了是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂之外，包括了至少一種其他的極性脂質(zhì)，例如，不是穩(wěn)定泡囊形成者的一種或多種極性脂質(zhì)。
用于當前的主題中是不穩(wěn)定泡囊形成成員的極性脂質(zhì)的實例包括但不限于，1-棕櫚酰-2-油?；?sn甘油基-3-磷酸(POPA)(式XXIV)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DOPC-e)(式XXV)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(式XXVI)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-[磷酸-L-絲氨酸](DOPS)(式XXVII)、典型的鞘磷脂(例如，式XXIX)(當添加到鞘磷脂和DOPC的混合物形成泡囊中時膽固醇(式XXX)將形成筏)、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油(式XXXI)、1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(XXXII)、1，2-二油酰-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)(式XXXIII)和1，2-二油酰-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)(式XXXIV)。
作為不穩(wěn)定泡囊形成成員對于當前公開的主題的實踐有用的其他極性脂質(zhì)包括磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PGG)、混合鏈磷脂酰膽堿(MPC)、磷脂?；掖?PE)和含有二十二碳六烯酸的磷脂。cit-DOPC和cit-DOPC-e是作為不穩(wěn)定泡囊形成成員有用的極性脂質(zhì)的實例?？梢允褂昧字Ｄ憠A，包括在sn-1和sn-2位置中具有二十二碳六烯酸的那些(DHPC)。其他二不飽和的脂質(zhì)，例如二花生西烯?；字Ｄ憠A(例如，20:4 DOPC:DArPC)，二亞麻酰基磷脂酰膽堿(例如18:3 DOPC:DLnPC)是有用的。例如，DOPC可以在泡囊制備期間與提高數(shù)量的DLnPC、DArPC和DHPC混合。有用的比例包括(DOPC:DLnPC、DArPC或DHPC)從1-1000:1，實例例如25-500:1，包括1:1、25:1、50:1、100:1、500:1和1000:1。也可以使用具有大的平均分子面積的磷脂的組合，例如DOPC:DLnPC:DHPC。非層狀相脂質(zhì)甘油二酯也可以與DOPC混合。
在某些實施方式中，不穩(wěn)定泡囊形成成員是DOTAP和/或DODAP。DOTAP和DODAP是在生理學(xué)的pH值下攜帶凈正電荷的修飾的脂質(zhì)。DOTAP和DODAP與帶負電的物質(zhì)的相互作用是復(fù)雜的。然而，不希望受理論的限制，當DOTAP和/或DODAP在當前公開的主題的泡囊組合物中被利用作為不穩(wěn)定泡囊形成成員時，細胞內(nèi)遞送的可能的機制是經(jīng)由提高的膜透過性的被動進入。當DOTAP和/或DODAP被添加到磷脂酰膽堿脂質(zhì)泡囊時，例如，DOTAP和/或DODAP可以作為絡(luò)合劑用于帶負電的物質(zhì)，以及，作為提高脂質(zhì)泡囊的表面電荷密度的手段。提高的表面電荷可能是膜吸收事件中的重要因素。此外，DOTAP和DODAP具有頭部基團，例如，當植入磷脂酰膽堿泡囊中時，其占據(jù)較少的空間并因而可以誘導(dǎo)裝填約束結(jié)果(packing constraint issue)。
有趣的是注意到，由DOTAP和/或DODAP組成的脂質(zhì)泡囊很可能具有對帶負電試劑的細胞內(nèi)遞送有用的超過一種機制。例如，DOTAP和DODAP可以提高細胞的脂質(zhì)泡囊吸收，容許細胞內(nèi)的內(nèi)容物遞送，或作為選擇，DOTAP和/或DODAP可以結(jié)合帶負電的物質(zhì)，并在細胞質(zhì)膜中存在的帶負電物質(zhì)的數(shù)量上起幫助作用(即，吸收DOTAP和/或DODAP進入質(zhì)膜可以引起物質(zhì)在膜上的沉積，包括外葉和內(nèi)葉)。DOTAP和DODAP也是商業(yè)上生產(chǎn)的，因而是容易獲得的。它們也已經(jīng)在GMP過程中使用。
因而，DOTAP和DODAP是當前公開的主題的泡囊中不穩(wěn)定泡囊形成成員的非常適合的實例。在特定的實施方式中，所述泡囊包含大豆PC/DOTAP(50:1mol/mol)。在其他特定的實施方式中，所述泡囊包含DOPC/DOTAP(50:1mol/mol)。進一步的，在某些實施方式中，所述泡囊包含ATP(例如，10mM的濃度)。這些制劑已經(jīng)用于肝臟保存應(yīng)用。這種脂質(zhì)組合引起的肝臟ATP水平的顯著的維持，還在延長的體外保存時間上維持了肝臟保存(圖5B和圖5C)。進一步的，這些制劑已經(jīng)成功地用于提高細菌生長速率(圖5A)。




筏形成者也可以被利用作為當前公開的主題的泡囊中的不穩(wěn)定泡囊形成成員。筏形成者是一種化合物，其將形成獨立的區(qū)域或引起獨立的區(qū)域的形成，所述區(qū)域含有膜雙分子層內(nèi)的筏形成化合物。這些獨立的區(qū)域傾向于使泡囊不穩(wěn)定，提高它的吸收性，即，它的融合性。筏形成者的實例是膽固醇(式XXX)、鞘磷脂和已知為膜結(jié)合的蛋白質(zhì)和多肽。吸收性也可以通過選擇極性脂質(zhì)來增強，其將引起泡囊上的表面電荷，這與目標細胞的Gouey-Chapman層的電荷是相反的(一般地，Gouey-Chapman層是帶正電的)。
在某些實施方式中，一種或多種融合蛋白，即參與膜融合的多肽，可以被利用作為不穩(wěn)定泡囊形成成員來控制泡囊的吸收速率。用于摻入當前公開的主題的泡囊的融合蛋白的非限制性實例包括參與膜融合的多肽，例如受精素、可溶的N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子附著蛋白質(zhì)受體(SNARE)、SM(secl/munc18)多肽(例如，Vps33p、Sly1p和Vps45p的哺乳動物同種型(isomer)；(Jahn and Sudhof1999)和病毒包膜融合蛋白，例如來自人類免疫缺陷病毒(HIV；例如，gp41)，Semiliki Forest病毒，和流感的那些)。哺乳動物SNARE家族包括突觸融合蛋白(syntaxins)(1A、1B、1C；2(和剪接變體)；3、3A、3B、3C、3D；4；5、5A、5B、6、7、8、10、11、12、13(可以是相同于12)；16(A、B、C)；和17)、Hsyn16、rbet1、GS15、GOS32、GOS28、Membrin、SNAP(25、25a、25b；23、23A、23B；29)、vtilb、突觸泡蛋白(Synaptobrevins)(1和剪接變體；2)、縮纖蛋白(Cellubrevin)、VAMP4、VAMP5/6、Ti-VAMP、Endobrevin、Tomosyn和msec22b(Jahnand Sudhof1999)。在此使用的術(shù)語“融合蛋白”還指使膜不穩(wěn)定的兩親性肽，即使它們的主要功能不是介導(dǎo)膜融合，實例例如膜聯(lián)蛋白(Jahn and Sudhof 1999)。
為了靶向特定的細胞，與特異于目標細胞的多肽相互作用(例如配體受體相互作用(至少在施用泡囊的區(qū)域中))的多肽，或與識別細胞特異性抗原的抗體相互作用的多肽可以被摻入當前公開的主題的泡囊中，并也被認為是在此使用的術(shù)語“融合蛋白”。其他靶向多肽包括在細胞間膜轉(zhuǎn)運期間使用的那些以及Rab GTPase蛋白。病毒融合蛋白也可以被采用作為靶向分子。也可以使用膜結(jié)合物質(zhì)，例如生物素化的脂質(zhì)和碳水化物。
此外，在某些實施方式中，聚乙二醇(PEG)可以被利用作為不穩(wěn)定泡囊形成成員。在某些實施方式中PEG可以具有從約20直到約8,000個重復(fù)單元的分子量，在某些實施方式中具有從約1,000到約6,000個重復(fù)單元的分子量，在某些實施方式中具有從約3,000直到約4,000個重復(fù)單元的分子量。在特定的實施方式中，PEG具有約3,350個重復(fù)單元的分子量。在某些實施方式中，PEG可以與穩(wěn)定泡囊形成成員同時地摻入泡囊中。例如，所述穩(wěn)定泡囊形成成員和PEG在泡囊的形成之前或期間混合在一起。
穩(wěn)定泡囊形成成員與不穩(wěn)定泡囊形成成員的比例(穩(wěn)定不穩(wěn)定)在某些實施方式中可以是1:9到100,000:1，在某些實施方式中是1:1到1,000:1，在某些實施方式中是1:1到500:1，在某些實施方式中是1:1到250:1，更優(yōu)選地是10:1到100:1(例如，50:1)。非限制性的實例包括DOPC/DOPC-e(1:1)；DOPC/POPA(50:1)，DOPC/POPA(1:1)，DOPC/DOTAP(50:1)，大豆PC/DOTAP(50:1)和大豆PC/PEG3350(1:1)。
脂質(zhì)泡囊構(gòu)建 為了構(gòu)建脂質(zhì)泡囊，在一個實施方式中，脂質(zhì)溶于氯仿或其他合適的有機溶劑中，并置于器皿，例如玻璃試管中。通過在氮氣或其他惰性氣體的穩(wěn)定氣流下蒸發(fā)，隨后排氣，來除去溶劑，例如，使樣品經(jīng)歷真空達0.1到48小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、24、25、30、36、40、42或48小時。十二個小時通常是足夠的。干燥的脂質(zhì)材料然后在合適的緩沖液，例如Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)或10mM Na2HPO4中、在高于脂質(zhì)相變溫度的溫度下重新水化30-60分鐘，期望的終濃度通常是大約1到30mg/ml，一般約10mg/ml。然后攪動脂質(zhì)混合物。例如，可以使用超聲處理；例如，在40％負載周期下使用的microtip 450瓦超聲發(fā)生器來產(chǎn)生SUV。超聲處理的持續(xù)時間取決于脂質(zhì)材料的數(shù)量；在任何情況下，當沒有觀察到透光百分率的進一步降低時、或通過利用顆粒大小分析器分析實現(xiàn)了恰當?shù)呐菽掖笮r，停止超聲處理。
在另一個實施方式中，通過將脂質(zhì)材料(例如，基礎(chǔ)脂質(zhì)(base lipid)和融合脂質(zhì))溶解到有機溶劑中、凍干一定時間足以除去溶劑(例如，過夜)，來構(gòu)建脂質(zhì)泡囊。然后可以用緩沖液在大約45℃水化脂質(zhì)。脂質(zhì)泡囊在45℃攪拌大約1小時。將要封裝到泡囊中的化合物，包括例如海藻糖和Mg-ATP，添加到溶液中，產(chǎn)生的多層泡囊在基礎(chǔ)脂質(zhì)的相變溫度以上經(jīng)歷高壓勻質(zhì)化。從這個步驟形成的單層泡囊可以通過高壓擠壓另外處理。這樣制備的泡囊可以直接凍干用于最后使用。
可以進行動態(tài)光散射(DLS)來測定乳化的脂質(zhì)體的直徑，如本領(lǐng)域一般已知的，使用基于熒光素的分析通過發(fā)光來測定封裝百分比。進一步的，如果希望，通過UV光譜和薄層層析(TLC)來分析脂質(zhì)，以評估氧化的程度。
當再水化干燥的脂質(zhì)時，可以使用其他的溶液。這些包括用以下物質(zhì)緩沖的那些N，N-二(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、組氨酸、二(2-羥基乙基)氨基-三(羥基甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N’3-丙磺酸(EPPS或HEPPS)、glyclclycine、N-2-羥基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N’-二(2-乙烷-磺酸)(PIPES)、碳酸氫鈉、3-(N-三(羥基甲基)-甲基-氨基)-2-羥基-丙磺酸)TAPSO、(N-三(羥基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羥基甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)和三(羥基甲基)-氨基甲烷(Tris)。適合的溶液的其他實例包括鹽溶液，例如Alseverr’s溶液、Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)、Earle’s平衡鹽溶液、Gey’s平衡鹽溶液(GBSS)、Puck’s鹽水A、Tyrode’s鹽溶液、St.Thomas溶液和威斯康星大學(xué)溶液(University of Wisconsin solution)。
生物分子封裝和遞送 當前公開的主題公開了脂質(zhì)泡囊，其可以被利用來遞送分子，例如生物分子，其是細胞在特定條件下(例如，代謝應(yīng)激)需要的以滿足在特定條件下的代謝需求。當前公開的主題的脂質(zhì)泡囊可以被目標細胞質(zhì)膜吸收，并遞送所述泡囊攜帶的生物分子給目標細胞。由于當前公開的主題的泡囊包含疏水性脂質(zhì)膜和由所述膜封裝的水性區(qū)室，在此公開的泡囊可以遞送兩種不同類別的物質(zhì)；泡囊膜中攜帶的疏水性分子和由所述泡囊封裝的水溶性分子。
所述泡囊攜帶的疏水性生物分子可以沉積到目標細胞質(zhì)膜中，沉積的速率可以通過改變泡囊的吸收速率(例如，大小，電荷、聚集劑、不同的脂質(zhì)種類)和每個泡囊中脂質(zhì)可溶生物分子的濃度來控制。通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將生物分子添加到目標細胞雙分子層上，每種脂質(zhì)可溶生物分子的膜溶解度可以實驗地測定。每個泡囊可以遞送的每種生物分子的數(shù)量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛可用的放射示蹤實驗測量脂質(zhì)可溶生物分子進入目標組織的攝取來測定。例如，3H-ATP可以封裝到上述的脂質(zhì)泡囊中，然后添加到細胞。在給定的時間之后，洗滌細胞幾次來除去沒有被細胞吸收的泡囊。從它們的平皿中移除細胞，然后置于液體閃爍液中，使用β計數(shù)器可以測定3H-ATP的摻入程度。
可以由在此公開的包含脂質(zhì)可溶生物分子的泡囊遞送的脂質(zhì)可溶生物分子的實例包括，但不限于，α-生育酚(維生素E)、視黃醇(維生素A)、phyllochinon(維生素K)、麥角鈣化醇(維生素D)、膽固醇、膽固醇酯、類固醇、藿烷、洗滌劑、脂肪酸、支鏈脂肪酸(例如細菌中發(fā)現(xiàn)的)、類異戊二烯化合物、長鏈醇、和麻醉劑、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂多糖、生物素標記的磷脂、膜結(jié)合蛋白質(zhì)、膜離子電導(dǎo)通道(例如，Na/K-ATPase、H-ATPase、Ca-通道、Na-通道、K-通道、Cl-通道)、轉(zhuǎn)運蛋白、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、GLUT-1、GLUT-2、GLUT-3、GLUT-4)、粘附蛋白、間隙連接蛋白、聯(lián)會接點蛋白質(zhì)蛋白、半胱氨酸蛋白酶、粘著蛋白(例如，ICAM、PECAM、VCAM)、G-蛋白、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白、補體蛋白、病毒蛋白、細胞受體、脂質(zhì)可溶的熒光探針和脂質(zhì)可溶的放射性示蹤劑。例如，圖6A和圖6B描繪了用使用在此公開的脂質(zhì)泡囊遞送的膜結(jié)合熒光探針染色的大鼠股靜脈的切片。
水溶性分子也可以通過將所述生物分子封裝到在此公開的泡囊的水性區(qū)室內(nèi)來遞送給目標細胞。各種各樣的水溶性分子可以通過當前公開的主題的脂質(zhì)泡囊來遞送，只有少數(shù)的限制指標，例如，分子可以放入所述脂質(zhì)泡囊的內(nèi)部。在200nm的平均大小下，大多數(shù)分子可以放入這個空間?？梢苑庋b到當前公開的主題的脂質(zhì)泡囊內(nèi)的水溶性生物分子的實例包括，但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、單糖、二糖、多糖、核苷酸和多核苷酸(例如，DNA、RNA、mRNA、tRNA、siRNA和miRNA)、水溶性維生素、礦物質(zhì)、高能磷酸(例如，ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鳥嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP和次黃苷)、磷酸肌酸、糖酵解中間物(例如，葡萄糖、葡糖-6-磷酸、葡萄糖-1，6-二磷酸、FDP、DHA-P、G-3-P、PEP和丙酮酸)、氧化中間物(例如，乙?；鵆o-A、檸檬酸和異檸檬酸)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)、水溶性細胞酶、胰島素、水溶性熒光探針、水溶性放射性示蹤劑和水溶性藥物。
在當前公開的主題的某些實施方式中，ATP是摻入所述脂質(zhì)泡囊的生物分子。存在著當前公開的主題可以利用的幾種不同的腺苷-5’-三磷酸(ATP)的鹽，包括ATP鎂(Mg-ATP)、ATP的二鈉鹽、ATP的二鉀鹽、和ATP的二Tris鹽。
對于代表性的實施方式，利用ATP的Mg鹽(Mg II)。ATP的Mg鹽具有稍微更大的γ磷酸鹽的水解作用的ΔG′，發(fā)現(xiàn)的是所有細胞ATP的超過90％是鎂鹽。雖然Mg-ATP的水解作用的ΔG′已經(jīng)被報道為-8.4千卡/mol，它在細胞的胞質(zhì)溶液內(nèi)可能不同。例如，Mg-ATP的水解作用的ΔG′可能受到pH值和存在的其他二價金屬的影響。在某些環(huán)境中，Mg-ATP的水解作用的ΔG′在細胞內(nèi)可以高達-12.5千卡/mol。
Mg-ATP的重要特征是它作為高能磷酸的根本來源的中心作用，高能磷酸作為供體(例如，葡糖-6-磷酸)或接受體(例如，磷酸肌酸)。Mg-ATP通過它在細胞中的負反饋作用充當了所有高能磷酸的中央調(diào)節(jié)物。例如，隨著細胞內(nèi)Mg-ATP水平提高，存在著果糖磷酸激酶的抑制，降低了葡萄糖的利用。此外，對于它的中心細胞內(nèi)作用，Mg-ATP還以幾種不同的方式起到了細胞外作用。例如，Mg-ATP結(jié)合并活化嘌呤能受體(P2X)，引起多種細胞內(nèi)影響，包括但不限于，通過K+進入的去極化、提高細胞內(nèi)鈣、蛋白激酶的活化、細胞回縮、氧化氮(NO)釋放、以及血管平滑肌細胞(VSMC)松弛。在通過生物反應(yīng)或合成來合成性生產(chǎn)ATP方面的新近進展顯著地改善了商品市場上可獲得的Mg-ATP的數(shù)量和質(zhì)量。
在某些實施方式中，ATP的鎂鹽或其他鹽可以摻入泡囊中，可以在脂質(zhì)重新水化的時候添加。ATP濃度可以改變，并將取決于特定的應(yīng)用。在某些實施方式中使用的ATP的濃度包括約0.001mM到約1M，在某些實施方式中包括約1mM到約200mM或約1mM到約50mM。在特定的實施方式中，ATP的濃度可以是約0.1mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、25mM或50mM。含有ATP的緩沖液可以具有低的蛋白含量以降低脂質(zhì)材料的非特異性吸收的概率。為了方便起見，含有ATP的SUV被稱為ATP-SUV。
評估了通過SUV的ATP封裝。例如，使用了標記的ATP分子(使得標記物不干擾泡囊形成)，例如放射性標記的ATP。放射性標記物包括32P和3H，在干燥之后、攪動之前當脂質(zhì)重新水化時添加。溶液施加到SephadexG-25柱(或其他適合的基質(zhì))上來除去未封裝的ATP。收集柱的流出物，分析泡囊的存在。SUV通常在最早的級分中洗脫。通過測定泡囊和上清液級分中的放射性，確定封裝的ATP的比例并乘以100，來測定封裝百分比。優(yōu)選的封裝百分比從大約1％到20％。
除了ATP以外的分子可以使用SUV遞送給細胞，例如有機和無機分子，包括藥物、多肽、核酸和與細胞內(nèi)抗原作用的抗體。
測量SUV吸收性的分析 可以測定吸收速率，作為HUVEC細胞吸收的脂質(zhì)泡囊的數(shù)量的度量，單位孔/秒(約106個細胞)。分析包括以下步驟 (1)培養(yǎng)HUVEC細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)；Manassas，Virginia or BioWhittaker；Maryland)； (2)制備SUV并用熒光探針例如羧基熒光素裝載； (3)SUV接觸細胞并容許吸收； (4)在選定的時間，除去任何殘余的SUV；并且 (5)測量熒光。
在除去SUV之后熒光信號的存在和強度表明了SUV被細胞膜吸收和遞送內(nèi)容物的能力。
給出人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為實例。細胞在標準的12孔培養(yǎng)皿(例如，來自COSTAR；細胞的數(shù)目是大約106個)中在內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(EGM)中生長到匯合。然后用緩沖液例如HBSS洗滌HUVEC3次。制備的脂質(zhì)泡囊(實例例如，DOPC/DOPC-e(1:1)；DOPC/POPA(50:1)，DOPC/POPA(1:1)，PS，PG，MPC，PE，cit-DOPC和cit-DOPCe)，用1mM羧基熒光素裝載。在37℃、95％空氣/5％CO2下，泡囊與細胞溫育120分鐘，每5分鐘分析熒光，在此之后用緩沖液洗滌細胞來除去殘余的泡囊。如果使用帶負電的脂質(zhì)泡囊，在吸收步驟添加鈣(終濃度0.1-10mM)。
通過用胰蛋白酶處理來將細胞從平皿上除下。使用熒光分光光度計或其他適合的設(shè)備測量熒光(在495nm激發(fā)和在520nm發(fā)射)。
在某些實施方式中，生物分子-SUV組合物的吸收速率是大約20個泡囊吸收/秒/細胞到8.0×1011個泡囊吸收/秒/細胞，包括500到1×108個泡囊吸收；750,000到50×107個泡囊吸收/秒/細胞；5×106到1×107個泡囊吸收/秒/細胞；包括1×106到8×108個泡囊吸收/秒/細胞；1×107到5×108個泡囊吸收/秒；以及5×107到1×108個泡囊吸收/秒/細胞。吸收速率的實例是至少100、1000、104、105、106、107、108、109、1010和1011個泡囊吸收/秒/細胞。這些值的一些是使用DOPC和DOPC/DOPC-e和DOPC/POPA的混合物、在37℃、有和沒有鈣的情況下，使用人內(nèi)皮細胞實驗地獲得的。脂質(zhì)泡囊的吸收性速率是在細胞到細胞之間不同的。此外，吸收速率可以受到溫度、離子強度和壓力的影響。
由于質(zhì)膜的脂質(zhì)組成隨細胞類型而變化，用于該分析中的細胞的選擇被仔細地考慮，應(yīng)當最好地匹配目標細胞類型。例如，肝臟細胞質(zhì)膜包括約7％磷脂酰乙醇胺，而紅細胞質(zhì)膜含有18％(Alberts et al.2002)。原代培養(yǎng)細胞以及細胞系(可從美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC)；Manassas，Virginia獲得)是有用的，然而原代培養(yǎng)物是優(yōu)選的，因為質(zhì)膜脂質(zhì)組成在轉(zhuǎn)化的細胞中可能改變。細胞類型包括胰腺、腸、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)元(包括腦、眼、鼻和耳的)、肺、心臟、血液、循環(huán)(淋巴和血液)、骨骼、軟骨、生殖、腺體、牙釉質(zhì)、脂肪、皮膚和肝臟的。細胞系包括來自這些組織的那些，例如Madin-Darby犬腎臟(MDCK)、中國倉鼠卵巢(CHO)、HeLa，等等。細胞可以來自其他有機體，例如植物、真菌(包括酵母)和細菌。這些其他細胞類型的吸收速率的實例包括至少100、1000、104、105、106、107、108、109、1010和1011個泡囊吸收/秒/細胞。除非另作說明，吸收速率是針對在以上指定的條件下的HUVEC。對于其他細胞類型的吸收速率是對于大約106個細胞、使用緩沖液，例如HBSS，泡囊與細胞在37℃、95％空氣/5％CO2溫育120分鐘，此后通過用緩沖液洗滌細胞除去殘余的泡囊。
優(yōu)化吸收速率的分析 吸收速率的分析可以進一步改進，此時優(yōu)化特定細胞類型對特定的泡囊組成的吸收速率。例如，脂質(zhì)泡囊可以含有作為泡囊的膜雙分子層的一部分的熒光或放射性示蹤劑。
可以利用的熒光探針包括，但不限于，異硫氰酸熒光素；熒光素二氯三嗪(fluorescein dichlorotriazine)和熒光素的氟化的類似物；萘熒光素羧酸和它的琥珀酰亞胺基酯；羧基羅丹明6G；吡啶基噁唑衍生物；Cy2、3和5；藻紅素；琥珀酰亞胺基酯、羧酸、異硫氰酸、磺酰氯和丹磺酰氯的熒光物質(zhì)，包括丙酸琥珀酰亞胺基酯和戊酸琥珀酰亞胺基酯；羧基四甲基羅丹明的琥珀酰亞胺基酯；羅丹明Red-X琥珀酰亞胺基酯；得克薩斯Red磺酰氯；得克薩斯Red-X琥珀酰亞胺基酯(Texas Red-X sodium tetrafluorophenol ester)；得克薩斯Red-X鈉四氟苯酚酯；Red-X；得克薩斯Red染料；四甲基羅丹明；麗絲胺羅丹明B；四甲基羅丹明；四甲基羅丹明異硫氰酸酯；萘熒光素；香豆素衍生物；嵌二萘；吡啶基噁唑衍生物；dapoxyl染料；Cascade Blue和Yellow染料；苯并呋喃異硫氰酸酯；四氟苯酚鈉(soium tetrafluorophenols)；和4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-引達省(4，4-difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)。這些化合物的激發(fā)波長將不同。在以例如1:800脂質(zhì)/探針的比例存在示蹤物的情況下制成脂質(zhì)泡囊。其他有用的比例包括1:200到1:10,000，包括1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000。
改變吸收速率 通過改變多種因素，例如溫度、離子、脂質(zhì)濃度、脂質(zhì)泡囊組成、流速、脂質(zhì)泡囊大小等等，任何脂質(zhì)泡囊的吸收速率可以被改變。改變脂質(zhì)泡囊的磷脂配方可以用于最大化吸收速率以及最小化毒性。例如，為了保存用于移植的器官或懸浮中的細胞(例如血液)，具有更慢的、延遲的吸收速率的脂質(zhì)泡囊是期望的。這種速率可以使用僅含有DOPC的泡囊來獲得。另一方面，如果生物分子的細胞內(nèi)濃度的立即提高是關(guān)鍵的，例如對于中風(fēng)、心臟病發(fā)作或外傷患者，具有非常快速的遞送速度的脂質(zhì)泡囊是期望的。例如，DOPC/POPA組合物以足夠的濃度遞送生物分子例如ATP，以在少于5分鐘內(nèi)滿足受影響組織的代謝需求(參見實施例)。
四種通用的方法可以用于通過操作脂質(zhì)組成來改變吸收速率 (1)提高靜電相互作用； (2)使膜雙分子層不穩(wěn)定化； (3)增加非雙分子層相；和 (4)產(chǎn)生不同的脂質(zhì)相。
提高靜電相互作用 可以采用靜電相互作用來提高吸收速率。磷脂根據(jù)它們的電荷來分類(陽離子的、陰離子的和兩性離子的)。許多陽離子磷脂，例如PE，和陰離子磷脂，例如磷脂酸(POPA)，在生理學(xué)的pH值下不形成封閉的泡囊。然而，與兩性離子的磷脂酰膽堿混合的陰離子和陽離子脂質(zhì)可以在生理學(xué)pH值下形成封閉的泡囊。
大多數(shù)細胞的質(zhì)膜具有凈負電荷。由于這種負電荷，存在著抗衡離子層，一般是鈣、鎂、鈉和鉀，其呈現(xiàn)凈正電荷。利用脂質(zhì)體和質(zhì)膜之間的靜電相互作用，脂質(zhì)泡囊可以被工程化以具有凈負電荷，因而最大化細胞-脂質(zhì)泡囊吸收。然而，某些細胞質(zhì)膜含有更多的陽離子脂質(zhì)，其被陰離子層抗衡。在這些位置，脂質(zhì)泡囊被工程化以具有凈正電荷來最大化細胞-脂質(zhì)吸收。
產(chǎn)生不同的脂質(zhì)相 質(zhì)膜含有富含特定的脂質(zhì)種類的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域或筏。在這種膜筏的邊界處是不同的脂質(zhì)種類的區(qū)域。這種區(qū)域具有不穩(wěn)定性的潛力，影響著膜與其他的膜如何相互作用。已知幾種磷脂提高脂質(zhì)筏形成，包括磷脂酰膽堿、鞘磷脂和膽固醇的混合物。例如，DOPC、18:0鞘磷脂和膽固醇在脂質(zhì)泡囊制備期間以1:1:1比例混合。膽固醇優(yōu)選在鞘磷脂相中分布，產(chǎn)生富含DOPC并缺少膽固醇的區(qū)域，以及富含鞘磷脂和富含膽固醇的區(qū)域。
改變吸收、溫度、濃度、離子強度和吸收周期的物理參數(shù)，可以用于影響吸收速率。通過改變溫度，系統(tǒng)的自由能(G)被改變，產(chǎn)生不同的吸收速率。提高脂質(zhì)泡囊濃度還影響膜吸收速率，特別是在非常高的濃度下。吸收周期(吸收的長度)和吸收周期的數(shù)量也影響SUV的封裝內(nèi)容物的遞送速率。
溫度 例如，含有ATP的脂質(zhì)泡囊在組織被保存的溫度下(4℃-低溫，22℃-室溫，37℃-正常體溫)與組織溫育5、10、15、30、60或120分鐘。提高泡囊溶液的溫度產(chǎn)生提高的泡囊動能，由此提高吸收能力。溫度還影響泡囊的自由擴散。
泡囊吸收的濃度 雖然提高的濃度引起提高的脂質(zhì)泡囊內(nèi)容物遞送是直觀的，膜融合的速率不是線性的。一旦脂質(zhì)泡囊脂質(zhì)占據(jù)了所有可用的質(zhì)膜表面，進一步的吸收受到限制。質(zhì)膜吸收的程度影響膜體積和性質(zhì)，例如離子滲透性和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。因而，當使用SUV時，SUV濃度必須被控制，使得目標細胞被有效地處理。
吸收周期 容許發(fā)生吸收的時間長度幫助控制封裝的物質(zhì)被遞送的程度。優(yōu)選的吸收周期包括1-180分鐘，例如，1、5、10、30、60、120和180分鐘。為了停止吸收，除去泡囊(例如通過用緩沖液洗滌)，或者施用的泡囊的濃度是這樣，從而在希望的時間的終點泡囊被耗盡。吸收可以被優(yōu)化，從而泡囊的總體遞送通過一次或多次施用被控制。例如，如果目標吸收周期是120分鐘，可以使用兩個60分鐘的周期，或四個30分鐘，十二個10分鐘，或24個五分鐘的吸收周期。只要可獲得適當?shù)脑O(shè)備，1分鐘或更短的吸收周期也可以實現(xiàn)，雖然這些周期通常是麻煩的和需要技術(shù)的。
測定目標細胞和組織的生物分子需求 生物分子施用的最佳速率是，其接近細胞對特定生物分子的基礎(chǔ)需求，實例例如，細胞的基礎(chǔ)代謝ATP需求，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來測定。例如，可以計算耗氧速率、丙酮酸、葡萄糖、乳酸和質(zhì)子漏，根據(jù)這些數(shù)據(jù)，測定組織的ATP消耗，為消耗的ATP/分鐘。
測量ATP水解的速率 細胞內(nèi)ATP水平可以使用本領(lǐng)域一般已知的幾種技術(shù)之一來測量。例如，HPLC提供了細胞的核苷酸含量的信息，但是受限于它提供給定時間的核苷酸水平的“快照”。31P-NMR可能是測量特定環(huán)境下細胞內(nèi)核苷酸的更優(yōu)選的方法，因為它提供了細胞中ATP水平的動態(tài)測量。
膜電位和質(zhì)子漏 分離組織樣品，與膜電位熒光探針MC540(Sigma；St.Louis，Missouri)溫育。測量在添加各種數(shù)量的鉀時MC540的熒光的改變作為膜電位和質(zhì)子漏出的指標，如早先描述的(Brand，1995)。
葡萄糖、丙酮酸和乳酸水平 使用標準方法或商業(yè)上可獲得的分析試劑盒(例如，可從Sigma獲得的那些)來測定這些代謝中間物。這些中間物的水平被調(diào)節(jié)成蛋白質(zhì)水平，在120分鐘的時間周期上測量。
ATP消耗的測定 根據(jù)乳酸鹽、丙酮酸和葡萄糖積累、氧消耗以及質(zhì)子漏出的速率，通過使用如Ainscow和Brand(1999)所描述的反應(yīng)化學(xué)計量法，能夠計算通過系統(tǒng)的所有流量。
施用 藥物組合物 在很多情況下，當前公開的泡囊可以作為包含泡囊和用來制備泡囊的緩沖液的簡單組合物來遞送，所述泡囊也可以包含生物分子。然而，如果希望，可以添加其他產(chǎn)品，例如，通常在藥物組合物用作載體的那些。
“藥學(xué)上可接受的載體”包括與藥物施用相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包被、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲試劑，等等(Remington2000)。這種載體或稀釋劑的優(yōu)選的實例包括水、鹽水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。補充的活性化合物也可以摻入到組合物中。
一般施用考慮 當前公開的主題的藥物組合物被配制成相容于它預(yù)定的施用途徑，包括靜脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、皮下的、口服的、吸入、穿表皮的、穿粘膜的和直腸的施用。用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下的應(yīng)用的溶液和懸浮液可以包括無菌的稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)滲漲度(tonicity)的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。使用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉，可以調(diào)節(jié)pH值。胃腸外的制品可以封裝到由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
如果帶負電的脂質(zhì)泡囊用于在此公開的組合物中，可以包括鈣，使得在吸收部位的終濃度優(yōu)選地是0.1mM-10mM；包括0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。
在ATP脂質(zhì)泡囊中，例如，ATP通常是處于與圍繞ATP-SUV的任何溶液中的ATP的平衡中的；一般僅1-10％的總ATP處于ATP-SUV之內(nèi)。其余的ATP可以與受體結(jié)合，例如嘌呤受體P2y，引起離子流出細胞，并感染離子平衡和穩(wěn)態(tài)。雖然細胞通?？梢灾亟x子平衡和穩(wěn)態(tài)，這消耗額外的ATP。因此，特別是對于期望功能立即恢復(fù)的組織(例如，在器官移植或肢體重接期間)，在組合物中包括一種或多種嘌呤受體P2y拮抗劑將是有益的。嘌呤受體P2y拮抗劑可以在形成泡囊之后，或僅在施用之前添加到組合物中，因為拮抗劑不需要處于SUV之內(nèi)。嘌呤受體P2y拮抗劑的實例包括吡哆醛5-磷酸、維生素B6(吡哆醛-5-磷酸)和活性藍(Reactive Blue)2(1-氨基-4-[[4-[[4-氯-6-[[3(或4)-磺苯基]氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-3-磺苯基]氨基-9，10-二氫-9，10-二氧代-2-蒽磺酸)，和其組合。嘌呤受體P2y拮抗劑優(yōu)選地可以在0.1到250微摩爾/L、更優(yōu)選在1-100微摩爾/L的濃度下使用。
可注射制劑 適合于注射的藥物組合物包括無菌水溶液或分散體，用于無菌可注射溶液或分散體的臨時制備。對于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括，生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無菌的，并應(yīng)當是液體以便使用注射器施用。這種組合物應(yīng)當在制造和保存期間是穩(wěn)定的，必須對抗微生物例如細菌和真菌的污染來保存。載體可以是分散介質(zhì)，其含有，例如水、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇)和其他相容的、適合的混合物。各種抗細菌和抗真菌試劑，例如，對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞，可以含有微生物污染。等滲試劑，例如糖類、多元醇，例如甘露醇、山梨醇，和氯化鈉可以被包括入組合物中?？梢匝舆t吸收的組合物包括試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠。
通過將在此公開的脂質(zhì)泡囊以所需的數(shù)量摻入到具有所需成分的一種或組合的適合的溶劑中，繼之以滅菌，來制備無菌可注射溶液。用于制備無菌可注射溶液的無菌固體的制備方法包括真空干燥和凍干，來產(chǎn)生在無菌溶液中含有脂質(zhì)泡囊和任何希望的成分(例如，生物分子，例如ATP)的固體。
口服組合物 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以封裝入膠囊中或壓縮成片劑。對于口服治療施用來說，活性化合物可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用液體載體制備來用作嗽口水，其中所述液體載體中的化合物口服地施用?？梢园ㄋ帉W(xué)上相容的結(jié)合試劑，和/或佐劑材料。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等等可以含有任何以下的成分，或類似性質(zhì)的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖，崩解劑，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或STEROTES；助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。
用于吸入的組合物 對于通過吸入來施用，化合物作為來自噴霧器或壓縮空氣容器的氣溶膠噴霧被遞送，所述壓縮空氣容器含有適合的推進劑，例如氣體如二氧化碳。
穿粘膜或穿表皮的 施用可以是穿粘膜或穿表皮的。對于穿粘膜或穿表皮的施用，選擇可以滲透目標屏障的滲透劑。穿粘膜滲透劑包括洗滌劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。鼻噴霧或栓劑可以用于穿粘膜施用。對于穿表皮施用，活性化合物被配制成軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑。還可以制備栓劑(例如，具有基質(zhì)例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸劑用于直腸遞送。
載體 在一個實施方式中，使用載體制備活性化合物，所述載體將保護所述化合物對抗身體的快速消除，例如控釋制劑，包括植入物和微密封的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾幕蛏锵嗳莸木酆衔锘蚶缫蚁┐姿嵋蚁?、聚酐、聚羥基乙酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。這些材料可以商業(yè)地獲自Alza Corporation(Mountain View，California)和NOVAPharmaceuticals，Inc.(Lake Elsinore，California)，或由本領(lǐng)域的技術(shù)人員制備。
劑量 劑量由脂質(zhì)泡囊的獨特特征指示或直接取決于脂質(zhì)泡囊的獨特特征，劑量將隨不同的脂質(zhì)組合物、特定的期望治療效果以及給藥途徑而變化。任何特定患者或應(yīng)用的特定劑量水平和頻率可以變化。應(yīng)當考慮一些因素，包括(1)進行施用和允許吸收時的溫度；(2)施用部位的離子環(huán)境和脂質(zhì)泡囊組合物的離子強度；和(3)允許吸收的時間長度?？刂七@些因素幫助控制封裝的物質(zhì)被遞送的程度，所述封裝的物質(zhì)包括例如ATP。
當施用脂質(zhì)泡囊時，通過用脂質(zhì)泡囊脂質(zhì)飽和質(zhì)膜，控制脂質(zhì)泡囊濃度來有效地處理目標細胞，而不抑制它們的功能。取決于脂質(zhì)組合物、目標細胞分散體和施用的體積，脂質(zhì)泡囊的優(yōu)選的濃度可以是0.5mg/ml-100mg/ml，例如0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml和100mg/ml。
經(jīng)由靜電相互作用發(fā)生的泡囊吸收顯著地受到鈣和/或鎂濃度方面的改變的影響，在較低的程度上，受到鈉和/或鉀濃度方面的改變的影響。調(diào)節(jié)用于施用脂質(zhì)泡囊的組合物中的這些離子濃度、或在泡囊施用之前或之后施用到目標位點的組合物中的這些離子濃度，影響劑量考慮。優(yōu)選地，使用0.01nM到1mM的離子濃度，包括0.1nM、1nM、10nM、100nM、1000nM、10微摩爾/L和100微摩爾/L的離子濃度。也可以使用這些離子和其他離子的組合。
可以使用長期施用或單次給藥的方式，并根據(jù)治療的類型、施用途徑和泡囊本身來選擇。優(yōu)選的吸收周期包括1-180分鐘，例如，1、5、10、30、60、120和180分鐘。為了停止吸收，除去泡囊(例如通過用緩沖液洗滌)，或者施用的泡囊的濃度是這樣，從而在希望時間的終點泡囊被耗盡。吸收也可以被優(yōu)化，從而泡囊的總體遞送通過一次或多次施用被控制。例如，如果目標吸收周期是120分鐘，可以使用兩個60分鐘的周期，或四個30分鐘，十二個10分鐘，或24個五分鐘的吸收周期。
ATP-SUV的用途 由于對ATP存在普遍的細胞需求，ATP-SUV和其他SUV/ATP組合物具有跨越生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛的應(yīng)用。
已經(jīng)確定的是，當靜脈內(nèi)地(IV)注射時，簡單的脂質(zhì)泡囊一般具有非常短的循環(huán)時間(15分鐘-2小時的數(shù)量級)(Oku et al.1994)。對于藥物用途，為了最大的組織分布，這不是高度有益的，因為藥物被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)快速地清除。可以潛在地“屏蔽”脂質(zhì)泡囊的物質(zhì)，例如聚乙二醇、神經(jīng)節(jié)苷脂、硫苷脂作為脂質(zhì)泡囊的部分，可以產(chǎn)生“隱形泡囊”(Oku et al.1994)。隱形泡囊容許長得多的循環(huán)時間(超過24小時直到2-3天)。對于需要緩釋的抗生素或藥物，這可能是有益的。然而，在需要向組織快速遞送ATP的缺血期間，這種類型的脂質(zhì)泡囊就其遞送特征而言是所期望的正相反的。例如，在心臟中，最長的可容忍缺血時間是約10分鐘(Childs & Lower1969)，“隱形”的脂質(zhì)泡囊將不足以按需要快速地提高心臟ATP水平。
在體內(nèi)ATP-SUV與RES系統(tǒng)的相互作用已經(jīng)有文獻記載。當靜脈內(nèi)(IV)給藥時ATP-SUV可以與內(nèi)皮細胞和巨噬細胞非?？焖俚叵嗷プ饔?。
發(fā)明人在過去10年中的研究顯示了，血管內(nèi)皮是缺血-重灌注損傷中的主要“罪犯”之一。因而，有益的是在嚴重的缺血期間維持內(nèi)皮細胞ATP水平(Ehringer et al.2000，Ehringer et al.2006(In press)，Ehringer et al.2001，Ehringer et al.2002)。降低的內(nèi)皮細胞ATP水平可以引起次黃嘌呤的積累，其在重灌注時被轉(zhuǎn)變成黃嘌呤和氧自由基(Albrecht et al.2003)。此外，內(nèi)皮對于低流動性缺血條件也更為敏感(Eltzschig & Collard 2004)，其最終可以引起酸中毒和代謝廢物副產(chǎn)品的積累(例如，用鹽水沖洗組織可以降低重灌注損傷)。本發(fā)明人對內(nèi)皮細胞、血管、復(fù)合組織、器官和有機體的研究都表明，內(nèi)皮可能是ATP-SUV的攝取的重要區(qū)域。一定百分比的ATP-SUV還逃逸進入實質(zhì)間隙，可以被血管系統(tǒng)外的細胞獲得。很好的實例似乎是心臟，在其中發(fā)明人檢測到在存在ATP-SUV時在缺氧之下心肌ATP的近乎加倍(與僅僅乳酸化的ringers相比較)。
RES也由免疫細胞、特別是單核細胞組成，其通過吞噬作用引起ATP-SUV在這些細胞和在內(nèi)皮中的積累。RES的這些細胞中最為活性的是肝臟的Kupfer細胞(Arii & Imamura 2000)，一種對于缺氧高度敏感的非常重要的細胞。Kupfer細胞、嗜中性細胞、淋巴細胞和甚至RBC，通過多種機制主動地攝取ATP-SUV泡囊(通過融合或吞噬作用)。這維持了這些對氧化劑敏感的細胞中的ATP水平，并產(chǎn)生較少的重灌注副產(chǎn)物。
因為幾個理由，ATP-SUV被選擇性地靶向，用于RES的最大攝取。首先，ATP-SUV包含液體雙分子層，在某些實施方式中主要由磷脂酰膽堿組成，向其中添加了不穩(wěn)定泡囊形成成員，或“融合劑”。Pusieux等(1994)使用了含有PC、膽固醇和硫苷脂的泡囊，它們是隱形脂質(zhì)體的主要成分，所述泡囊不具有在此公開的ATP-SUV的快速遞送特征。Arkawa等人(1998)使用了各種比例的PC和膽固醇來實現(xiàn)更高的ATP原生質(zhì)水平，向組織的ATP遞送非常緩慢。實際上，同一個小組報道說，“約35％的封裝的ATP在37℃在90小時后從脂質(zhì)體釋放”，(Arkawa et al.1998)。在兩種情況中，遞送給對缺血最敏感的細胞、內(nèi)皮細胞和WBC的ATP的數(shù)量是最小的。在生理學(xué)的溫度下，泡囊的液體特性加速了ATP-SUV從血流中到RES的清除。此外，ATP-SUV可能攜帶凈電荷，其對于RES的細胞是可以自由接近的。這種電荷密度提高了進入RES的ATP-SUV清除和吸收。此外，泡囊的大小，在某些實施方式中為100-200nm的數(shù)量級，使得泡囊更可能被RES的細胞獲取。
血液 在紅細胞變得不能存活之前，血液可以在冷凍下保存約45天。紅細胞一般在循環(huán)中存活約120天，之后脾臟和肝臟除去并破壞它們。因而如果不能存活的細胞被輸血，它們同樣地被立即從循環(huán)中除去。
向采集的血液添加ATP-SUV或其他SUV封裝的ATP組合物維持紅細胞更久，提高了存活保存時間以及細胞將保留在循環(huán)中且不被破壞的可能性。
脂質(zhì)組合物可以被改變來優(yōu)化ATP遞送。例如，由于血液保存在4℃，對ATP的代謝需求將是低的。即使SUV的吸收速率在這個溫度下也將被降低，該速率對于活體保存可能是過高的，獲得SUV脂質(zhì)組合物來更好地匹配血細胞的代謝需求。
當全部采集的血液與當前公開的主題的組合物接觸地被保存時，白血球和血小板也將受益并保持存活更久。
維持切斷的身體部分用于再植 在身體部分切斷(通常是無意的)之后，再植的成功率很大部分取決于肢體離開它的所有者而存活的能力。缺血的時間越久，再植產(chǎn)生功能性的肢體或甚至任何種類的成功的可能性越低。
在一個實例中，回收的斷肢的主要供養(yǎng)動脈被插管用于灌流。每4個小時肢體用ATP-SUV灌注，或如由于組織ATP水平的改變必要確定的。在灌流期間監(jiān)視肢體的動脈血壓以降低流動誘導(dǎo)的損傷的幾率，并監(jiān)視斷肢的總體保存，更高的灌流壓力可以表明肢體病態(tài)。在保存期之后，肢體用Ringers或其他適合的溶液洗滌來除去痕量的ATP-SUV。然后使用公知的方法外科地重新連接肢體。評估在接合之后肢體功能的外部指標(顏色、微血栓的證據(jù)、溫度、脈搏、氧飽和、Doppler流量測定)來監(jiān)視成功性。在再植之前和之后，應(yīng)用肝素，開始抗生素療法來降低感染的可能性。
心博停止 在低氧發(fā)作之后立即地或盡可能快地，將ATP-SUV通過靜脈內(nèi)或心內(nèi)注射而注射到心臟中。操作SUV脂質(zhì)組合物，使得ATP遞送小心地與心臟組織的代謝需求匹配，最大化心臟功能。ATP-SUV可以在生理學(xué)條件下持續(xù)地灌注到心臟中，直到度過了缺血危險的時間。
遞送ATP用于器官保存 器官(例如，心臟、肝臟、肺、腎臟或胰腺)從供體中移出，進入該器官的主要供養(yǎng)動脈被插管。使用鹽水、Ringers溶液或其他適合的溶液洗出器官中的血液。ATP-SUV添加到常規(guī)的保存溶液或添加到緩沖液中，輕輕地灌注(≥80mm Hg)到器官中，其頻率將取決于器官。
在動物實驗組中可以使用相同的ATP-SUV。例如，使用Lagendorff心臟(或其他器官)灌注設(shè)備。主動脈被插管，心臟置于灌流室中。用已經(jīng)添加ATP-SUV的充氧的灌注液灌注心臟?？梢宰⑸涓邼舛鹊拟浫芤阂砸鹦膭油Ｖ埂Ｊ褂肁TP-SUV的心麻痹可以在保存期期間使用。心臟可以被重灌注用于功能研究，或可以在缺血保存之后移植。
全身地遞送ATP 為了各種原因，ATP-SUV可以被施用給有機體。例如，ATP-SUV可以用于補充體內(nèi)的能量(優(yōu)選的給藥途徑是口服地、局部地和吸入地)，或者它可以用于降低全身對氧的依賴(這種情況下優(yōu)選的給藥途徑將是靜脈內(nèi)的)。當ATP-SUV通過經(jīng)頸動脈的連續(xù)輸注施用給動物時，心跳速度和血壓降低，呼吸停止。甚至在9分鐘的缺氧之后，動物可以復(fù)蘇(參見實施例)。
用于傷口的ATP-SUV 由于傷口的血流減少，在傷口中和傷口周圍的細胞可獲得的氧較少。氧遞送的降低引起ATP產(chǎn)生量的降低，其減慢傷口愈合必需的許多細胞事件，包括蛋白和核酸合成、離子通道功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和運動。
如痊愈的程度或傷口的ATP消耗所需的，將ATP-SUV施加到傷口上。例如，為了向傷口的邊緣細胞提供足夠的ATP來加速傷口閉合，優(yōu)選地可以每天1-12次地施用ATP-SUV，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次/天。優(yōu)選地，ATP-SUV被直接置于傷口上特別設(shè)計的敷涂器中，其保持水基ATP-SUV與傷口邊緣細胞直接接觸。做為選擇，ATP-SUV可以作為乳膏劑或其他體表藥物組合物局部地施用。
ATP-SUV也可以與已經(jīng)可獲得的痊愈組合物組合來進一步增強痊愈。例如，ATP-SUV可以與

(Ethicon，Johnson & Johnson，Somerville，New Jersey)中存在的貝卡普勒明組合到組合物中。此外，ATP-SUV可以與生長因子(例如，成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子)、一種或多種抗生素、含銀的傷口軟膏劑、和/或局部氧氣療法共同施用或組合到組合物中。與ATP-SUV一起有用的其他的傷口治療成分包括防腐劑、抗生素、麻醉劑和皮膚移植組合物。術(shù)語“傷口治療成分”不包括SUV。
在此使用的術(shù)語“皮膚移植組合物”是指由于例如損傷、例如灼傷，其他皮膚外傷，或甚至老化，對于皮膚組織的臨時或永久替代有用的天然的和人造的材料。“天然”材料將包括來自供體組織的表皮和/或真皮組織。供體組織可以來源于接受皮膚移植組合物的患者(即，自體組織)、來源于同一物種的不同個體(即，同種異體組織)、或來源于與接受者不同物種的供體有機體(即，異種組織)。供體組織可以在移植之前被處理，例如，以降低接受者的免疫排斥的風(fēng)險、或富集或耗盡某些組織成分，例如，某些細胞，包括但不限于真皮細胞(例如，成纖維細胞)和表皮細胞(例如，角質(zhì)形成細胞)。在此使用的“人造的材料”包括完全合成的皮膚代替物(實例例如基于膠原的基質(zhì))以及包含活組織(實例例如成纖維細胞和/或角質(zhì)形成細胞)和合成的生物材料(實例例如生物可降解的支架)的雜合組合物。特別是，人造皮膚移植組合物包括“人工皮膚”組合物，所述“人工皮膚”組合物例如包括

(Smith & Nephew，San Diego，California)和

(Integra Life LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)，

包含人類成纖維細胞衍生的皮膚代替物，

包含用于替代真皮組織的雙分子層膜系統(tǒng)。參見，例如，美國專利NO.4,947,840，通過引用合并在此，其公開了

皮膚替代組合物的組成和用途。在此公開的ATP-SUV可以與皮膚移植組合物共同施用以促進傷口愈合。
用于出血休克的ATP-SUV 出血休克由血液的大量損失引起，起因于內(nèi)部或外部的損傷。由于血液供給是不充分的，受試者常常變?yōu)榈脱獕赫撸鹌鞴偎ソ卟⑧徑劳觥?br> 為了對抗出血休克的影響，ATP-SUV作為對輸血的補充靜脈內(nèi)地注入。隨著整個身體供氧改善，然后ATP-SUV可以被降低。參見實施例9，數(shù)據(jù)顯示了ATP-SUV用于對抗出血性休克的影響的有效性。
用于血小板保存的ATP-SUV 血小板具有約5天的保存期，之后它們必須被丟棄。血小板功能的喪失部分地由于ATP的損失。
根據(jù)維持細胞內(nèi)ATP水平的需要，將ATP-SUV給予分離的血小板。然后延長了血小板的保存期。ATP-SUV懸浮在用于血小板保存的適合的溶液中，例如鹽水?？梢愿淖僑UV脂質(zhì)組成來優(yōu)化ATP施用。例如，由于血小板被保存在室溫下(22-24℃)，ATP的代謝需求將低于生理學(xué)的溫度(37℃)下。即使SUV的融合速率在這個溫度下也將被降低，該速率對于活體保存可能是過高的，改變SUV脂質(zhì)組成來更好地匹配血小板的代謝需求。
用于器官和組織工程化的ATP-SUV 組織現(xiàn)在可以以很高的效力離體生長。然而，這種組織缺乏血管系統(tǒng)來連接到血液供給。ATP-SUV幫助克服了這種缺點。
ATP-SUV可以用于選擇性地保持來自分離的組織例如骨骼肌的血管網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)造ATP-SUV的脂質(zhì)組合物，使得ATP-SUV不容易從血管中逃逸。ATP-SUV的施用維持了血管系統(tǒng)，而不是死亡的實質(zhì)細胞。完整的血管系統(tǒng)然后被播種并在合適的條件下與干細胞一起培養(yǎng)，所述干細胞對于分化成特定的組織是感受態(tài)的?？梢哉者@樣來血管化的離體產(chǎn)生的組織包括肝臟、胰腺、心臟、肺和脾臟。
做為選擇，經(jīng)歷了體外構(gòu)建的器官可以使用這種相同的方法部分地血管化，只是在器官細胞已經(jīng)開始生長之后收獲和處理血管系統(tǒng)。
手術(shù)期間的ATP-SUV 在大多數(shù)外科操作中經(jīng)歷血流和氧氣的減少。ATP-SUV可以施用給整個身體或涉及外科操作的區(qū)域來最小化來自缺血或缺氧的任何損傷。ATP-SUV有用的手術(shù)的實例包括冠狀動脈架橋術(shù)、開放心臟手術(shù)、游離皮瓣轉(zhuǎn)移和某些整形手術(shù)操作。
在某些手術(shù)中，由于在操作期間脊髓沒有接受足夠的氧氣，有時產(chǎn)生麻痹。這主要在主動脈瘤切除術(shù)中發(fā)生。ATP-SUV向受影響區(qū)域的應(yīng)用或靜脈內(nèi)地施用允許外科醫(yī)生有更多時間來工作，并降低缺氧誘導(dǎo)的損傷的可能性，并產(chǎn)生降低的發(fā)病。
用于中風(fēng)的ATP-SUV 當前，在中風(fēng)之后高葡萄糖溶液的立即施用被用于降低腦部降低的血流的影響。預(yù)計葡萄糖提高神經(jīng)細胞ATP水平并降低神經(jīng)細胞死亡。然而，當供氧有限時這個目標難以實現(xiàn)。ATP-SUV將更有效地向神經(jīng)組織提供ATP。
用于呼吸問題的ATP-SUV 許多呼吸性給養(yǎng)降低生活質(zhì)量，常常導(dǎo)致死亡。在這些情況中，死亡的主要原因是血液中缺乏氧氣，引起組織和器官死亡。用ATP-SUV灌注受試者來減小血液含氧量降低的影響。
用于癌癥患者的ATP-SUV 末期的癌癥患者死于產(chǎn)生的并發(fā)癥。由于癌或治療已經(jīng)削弱了他們，癌癥患者常常死于肺炎。虛弱來自于癌細胞爭奪有價值的代謝資源以及因而衰竭的健康細胞，或者非癌健康細胞在治療期間被破壞，或這兩者。癌癥患者每天施用ATP-SUV來補充整個身體的ATP水平，因而降低癌細胞盜用代謝資源的影響。通過施用ATP-SUV，癌癥的后遺癥被降低，延長了預(yù)期壽命。
用于化學(xué)毒物的ATP-SUV 阻斷線粒體ATP產(chǎn)生或以其他方式降低細胞ATP產(chǎn)生的氰化物和其他化學(xué)物質(zhì)可以通過使用ATP-SUV來抵制。當浸浴在氰化物中時，ATP-SUV維持了細胞和組織生存力和功能，在沒有線粒體ATP產(chǎn)生的情況下ATP-SUV提高了細胞質(zhì)ATP。ATP-SUV可以用作氰化物和其他按照與氰化物類似的方式起作用的其他毒物的解毒劑。參見實施例10，實驗數(shù)據(jù)顯示了ATP-SUV用于減輕氰化物中毒的影響的有效性。ATP-SUV也可以用于降低一氧化碳中毒的影響。
用于遞送蛋白、碳水化物、寡核苷酸和其他藥物的生物分子-SUV 在此公開的的高度吸收性的脂質(zhì)泡囊可以在存在水溶性和膜結(jié)合蛋白、碳水化物、寡核苷酸和其他藥物的情況下制成，從而獲得對細胞質(zhì)或?qū)毎さ娜魏紊鲜鑫镔|(zhì)的有效遞送。這種藥物遞送的方法可以繞過許多傳統(tǒng)的難題，(1)容許導(dǎo)入膜不滲透性的藥物，因而大大地擴展可以使用的藥物的范圍，以及提高那些具有低的膜穿透速率的藥物的效力；和(2)容許向細胞膜直接摻入多肽和碳水化物。這后一種益處容許，例如，繞過不確定的基因治療方法的替代治療。例如，如果受試者缺乏細胞上的受體，該受體可以被摻入在此公開的脂質(zhì)泡囊中并適當?shù)厥┯谩?br> 這些方法模擬了將ATP導(dǎo)入細胞的方法，只是SUV含有泡囊內(nèi)的物質(zhì)，和/或膜摻入的分子。
用于其他低氧情形的ATP-SUV 氧氣稀少的水下潛水、空間旅行、高空和其他情形可以引起對身體的降低的氧氣遞送。為了補償氧氣缺乏，靜脈內(nèi)地、口服地或通過吸入來施用ATP-SUV。
用于肉類保存的ATP-SUV 除了它在組織和器官保存、動物和患者中的用途之外，ATP-SUV可以在缺氧的情況下保持肉類中的細胞存活。在屠宰之后，動物被放血，殘余血液從尸體中流出。ATP-SUV經(jīng)由頸動脈或其他大動脈注入動物中，用ATP-SUV填充血管系統(tǒng)。動物然后與就位的ATP-SUV裝運，保持動物的細胞存活，因而延長肉類的保存期，如同ATP-SUV延長血液的保存期一樣。由于ATP-SUV利用了內(nèi)源的成分，肉類的口味和紋理不受影響。
用于植物的ATP-SUV 植物利用光合作用來維持生命和生長。光合作用可以分成兩種反應(yīng)光反應(yīng)，其從陽光收獲能量并轉(zhuǎn)變成化學(xué)能、ATP，乙基尼克酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)的還原形式；以及暗反應(yīng)，其使用ATP和NADPH來固定CO2。
經(jīng)由根系或直接施加到葉、莖、花、分生組織或其他植物部分來向植物提供ATP-SUV。ATP-SUV向植物細胞遞送暗反應(yīng)所需的ATP。利用ATP-SUV的ATP遞送降低了或回避了對陽光的需要，允許它們在暗處或在較少光照的條件下生長。此外，ATP-SUV提高了植物生長并維持植物壽命，這是市場的新鮮蔬菜、切花工業(yè)和水培園藝的重要方面。
用于生物反應(yīng)器的ATP-SUV 生物反應(yīng)器生產(chǎn)力的主要限制因素是，來自生物反應(yīng)器的分子的初級生產(chǎn)者細菌和酵母必須具有足夠的底物來產(chǎn)生ATP。因而，細菌或酵母的數(shù)量在任何一個培養(yǎng)中都受到限制。ATP-SUV被注入到生物反應(yīng)器中來提高微生物的數(shù)量，提高生物反應(yīng)器的產(chǎn)量。這種應(yīng)用不局限于細菌和真菌，因為培養(yǎng)的昆蟲、動物、植物和其他真核細胞對ATP產(chǎn)生具有相似的需求。
實施例 提供以下的實施例來說明當前公開的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地在當前公開的主題的組合物和方法中進行無關(guān)緊要的改變。這些實施例無論如何不意味著限制當前的主題。
實施例1 脂質(zhì)泡囊的構(gòu)建 從1，2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)；1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DOPC-e)和1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸(POPA)脂質(zhì)(都來自Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)構(gòu)建泡囊。沒有進一步純化地使用脂質(zhì)。在將脂質(zhì)溶解在氯仿中并置于玻璃試管中之后，通過在穩(wěn)定的氮氣氣流下蒸發(fā)來除去氯仿，隨后抽真空過夜。干燥的脂質(zhì)材料在HBSS實驗緩沖液(Sigma；St.Louis，MO)中在高于它的相變溫度(25℃)下重新水化30分鐘。兩種玻璃珠添加到緩沖液/脂質(zhì)混合物中，懸浮液渦旋五分鐘來產(chǎn)生多層泡囊。然后使用microtip Branson超聲波儀450，用置入試管中的微小尖端來對乳狀溶液進行超聲。然后在第5級用40％負載周期對泡囊進行超聲五分鐘來產(chǎn)生單層小泡囊(SUV)。
實施例2 ATP的封裝 為了展現(xiàn)ATP向?qū)嵤├?的泡囊中的摻入，將30μCi的3H-ATP(Amersham；Arlington Heights，IL)添加到實驗緩沖液中，然后制備多層泡囊。懸浮液通過Sephadex G-25(Sigma)柱(1cm×40cm)來除去未封裝的ATP。在流出物的前50ml中收集泡囊。通過液體閃爍計數(shù)測量泡囊內(nèi)和上清液中含有的放射性來測定封裝百分比。包含DOPC、DOPC:DOPC-e(1:1)、DOPC:POPA(50:1)和DOPC:POPA(1:1)的泡囊都得到了大約相同的ATP封裝百分比，在溶液中ATP的原始數(shù)量的1到2.5％之間變動。
實施例3 HUVEC的泡囊吸收率和封裝的內(nèi)容物向細胞質(zhì)的釋放 為了測定SUV的吸收速率(例如，融合速率)，用熒光探針加載SUV，體外呈現(xiàn)給細胞，洗滌，然后分析細胞熒光。
傳代I的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)購自BioWhitaker(Walkersville，MD)，培養(yǎng)直到傳代8，之后不再使用它們。HUVEC在內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基(EGM；BioWhitaker)中在12孔培養(yǎng)皿上在EGM培養(yǎng)基中生長到匯合。然后用HBSS洗滌HUVEC3次。如實施例1中那樣構(gòu)建脂質(zhì)泡囊，但是將1mM羧基熒光素加載到泡囊中。然后泡囊在37℃在濕潤的CO2孵化器中與細胞溫育5、10、30、45、60、90、120或240分鐘，之后從細胞洗滌泡囊，通過用胰蛋白酶柔和處理從培養(yǎng)皿移除細胞。使用Perkin-Elmer LS5OB發(fā)光分光光度計(Wellesly，MA)，利用495nm的激發(fā)和520nm的發(fā)射來測量HUVEC中的羧基熒光素的熒光。在某些實驗中，細胞不被胰蛋白酶化，采集細胞的顯微照片以展現(xiàn)吸收事件的均勻性。這個實驗的熒光單位(FU)的范圍是0到450單位。吸收速率高度取決于SUV的脂質(zhì)組成。對于前30分鐘，DOPC顯示了很少的吸收或根本沒有吸收，之后吸收速率變?yōu)閷?shù)性的，達到大約350FU。相比之下，DOPC:DOPC-e(1:1)得到快得多的初始吸收速率，和更慢的末期吸收速率(在5分鐘大約35FU；在120分鐘大約100FU)。使用DOPC:POPA(1:1)發(fā)現(xiàn)最快的吸收速率，其顯示了5分鐘內(nèi)羧基熒光素的顯著的遞送。如所設(shè)計的，三種泡囊的吸收速率可以被表征為快速、中速和慢速。
解決的一個問題是泡囊是否與細胞實際地融合或僅是聚集在細胞表面上。為了檢查這一點，通過熒光顯微鏡來檢查暴露于脂質(zhì)泡囊和未從培養(yǎng)孔移除的HUVEC的熒光分布。暴露于所有三種組合物的細胞顯示了5分鐘后全部細胞的彌散熒光，而不是點狀的熒光，產(chǎn)生點狀的熒光表明溶酶體隔離了泡囊，從而防止細胞接近羧基熒光素。做為選擇，泡囊聚集在細胞表面上。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)泡囊融合到細胞并釋放封裝的內(nèi)容物到細胞質(zhì)內(nèi)，而不是聚集在細胞表面上或被溶酶體隔離。
為了測定ATP是否如羧基熒光素一樣被導(dǎo)入細胞，使用實施例2的含3H-ATP的泡囊進行向HUVEC中的泡囊吸收和ATP釋放。泡囊與HUVEC溫育5、10、15、30、45、60、90、120或240分鐘。圖1中顯示的結(jié)果是1小時后細胞內(nèi)ATP的分配系數(shù)。DOPC/POPA在這個長的時間周期得到了最大的摻合百分比，隨后是DOPC/DOPC-e，然后是沒有泡囊的僅3H-ATP。當反復(fù)地洗滌細胞時，細胞的放射性發(fā)生顯著的變化。DOPC顯示了輕微的但是顯著的放射性降低；在反復(fù)洗滌之后DOPC/DOPC-e沒有顯示放射性的降低，而游離3H-ATP顯示了放射性的完全損失，確認了游離ATP不能穿透細胞膜的觀察結(jié)果。這些數(shù)據(jù)，與融合數(shù)據(jù)結(jié)合起來，表明了DOPC泡囊是細胞吞噬性的，DOPC:DOPC-e泡囊是融合的，游離ATP不進入細胞。DOPC:POPA也不能被洗去，表明它們也與細胞融合并將封裝的內(nèi)容物遞送到細胞質(zhì)中。
實施例4 內(nèi)皮的高分子透過性 與直接向細胞遞送分子相比，當前公開的主題的泡囊通過循環(huán)系統(tǒng)體內(nèi)遞送封裝的分子的任何用途需要所述泡囊和/或分子必須穿透血管內(nèi)皮。血管內(nèi)皮構(gòu)成了屏障，但是細胞與細胞間的屏障可以被跨越，例如，當白細胞離開循環(huán)并進入細胞間隙時。為了解決這個問題，測量了當前主題的脂質(zhì)泡囊對內(nèi)皮透過性的影響。
HUVEC在EGM中在多微孔過濾器(0.8μm)上生長到匯合。細胞被置于特殊的室中，其容許測量跨越內(nèi)皮單層的蛋白質(zhì)流量。用于檢查脂質(zhì)泡囊對內(nèi)皮透過性的影響的示蹤物是FITC-白蛋白(1mg/ml)。FITC-白蛋白和脂質(zhì)泡囊在零時間添加給內(nèi)皮細胞。每5分鐘，收集500μl上清液樣品，然后使用Perkin-Elmer LS5OB發(fā)光分光光度計分析熒光。DOPC泡囊對透過性沒有影響，然而在存在DOPC/DOPC-e的情況下HUVEC透過性提高，表明這些泡囊在鄰近的內(nèi)皮細胞之間創(chuàng)建了小的缺口。
實施例5 對ATP的代謝需求 作為測定需要的最佳速率的實例，測定了大鼠肝細胞對ATP的代謝需求。分離完整的大鼠肝臟，植入分離緩沖液(0.25M蔗糖、0.04M Tris、pH值7.2)中，用無菌剪刀切碎，小心地修整結(jié)締組織的碎片。然后肝臟通過#_60不銹鋼金屬網(wǎng)篩，在冰上收集細胞流出物。在4℃離心懸浮液5分鐘來團化細胞。丟棄上清液，細胞重新懸浮在充氧緩沖液(200mM蔗糖、70mMKCL、5mM馬來酸鹽和40mM Tris，pH7.3)中。五毫升的充氧緩沖液置于Yellow Springs Instruments測氧計(Yellow Springs，Ohio)中，并容許平衡到37℃。50μl的細胞提取物置于室中，達到2-3mg/ml的最終蛋白質(zhì)濃度。然后監(jiān)視基線氧消耗達1分鐘，之后100mM ADP添加到細胞中，測量狀態(tài)2的呼吸作用。然后，添加5mM谷氨酸鹽，測量狀態(tài)3的呼吸作用。通過測量添加的ADP的數(shù)量和消耗的氧的數(shù)量來測定ADP/O2比例。因而狀態(tài)3的呼吸作用是基于每毫克組織，在每分鐘內(nèi)被細胞消耗的ATP的量的量度。
實施例6 ATP-SUV加速傷口痊愈 在裸鼠上在顱骨頂部區(qū)域的皮膚上產(chǎn)生淺表創(chuàng)傷(大約80mm2圓形)。然后每天兩次將ATP-SUV施加到傷口，為傷口的邊緣細胞提供ATP。ATP-SUV直接置于傷口上特別設(shè)計的敷涂器中，其保持水基ATP-SUV與傷口直接接觸。
如圖2所示，與用對照物質(zhì)處理的傷口相比，用ATP-SUV處理的傷口更快地痊愈。對于ATP-SUV處理的傷口，相對于痊愈時間標繪的傷口面積的曲線表現(xiàn)對數(shù)性的曲線，而對照顯示了更為線性的痊愈速度。在第4天，在ATP-SUV處理(≈30mm2；低于原始傷口面積的一半)和對照處理(≈60mm2)之間觀察到大約30mm2的差異；而在第10天，在ATP-SUV處理的傷口中傷口面積實際上消失，但對照處理的傷口沒有消失(≈25mm2)。定性地，ATP-SUV處理第4天的傷口情況相似于對照中第10天的傷口情況；而第10天的傷口情況類似于對照的第17天的傷口情況。用ATP-SUV處理的傷口到第17天傷口痊愈，而對照在這一天還沒有完全痊愈。
實施例7 肢體重連接 從大鼠上切斷后腿，切斷的肢體的主要供養(yǎng)動脈被插管用于ATP-SUV(1mM ATP)溶液的輸注。每3個小時、或如認為組織ATP水平的改變所必需的，肢體用ATP-SUV或?qū)φ杖芤?參見表1)灌注。在輸注期間監(jiān)視肢體的動脈血壓以降低流動誘導(dǎo)的損傷的幾率，并監(jiān)視斷肢的總體保存(高的輸注壓力可以表明肢體病態(tài))。在保存期之后，肢體用Ringers溶液洗滌來除去痕量的ATP-SUV。然后外科地重新連接肢體，評估在接合之后肢體功能的外部指標(肢體顏色、微血栓的證據(jù)、凝膠、肢體溫度)。在再植之前和之后動物接受肝素來防止凝血。此外，動物進行抗生素療法來降低感染。對照肢體用僅媒介物、僅媒介物和ATP、或僅媒介物和SUV來灌注。
在再植后21小時，ATP-SUV處理的肢體展現(xiàn)了健康的粉色，并具有重新獲得的生理學(xué)溫度。在超過150天之后，接受ATP-SUV處理的斷肢的那些動物運用這些肢體就好像肢體從未被切斷一樣。僅有的性質(zhì)上的副作用是趾部的卷曲，最可能是由于缺乏物理治療所致，物理治療將很可能矯正這種微小的缺陷。然而，在對照中，肢體是暗色的，觸摸時是冷的，展現(xiàn)了壞死的病征。在保存之后后肢的組織學(xué)檢查表明ATP-SUV組維持了內(nèi)皮細胞和肌細胞生存力。所有的對照具有非存活的內(nèi)皮和肌肉。這些結(jié)果的概述在表1中示出。定性結(jié)果在圖3中示出。
表1 肢體再植研究的結(jié)果的概述 實施例8 ATP-SUV保護分離的心臟免于缺氧 從大鼠移除的心臟使用Lagendorff心臟灌流設(shè)備來監(jiān)視。心臟被插管并置于特別設(shè)計的室中，其灌注心臟并容許注射ATP-SUV。循環(huán)到心臟的充氧的灌注液被停止，ATP-SUV注射到心臟中。然后通過注射高鉀溶液使心臟置于心博停止。在無流動條件下在37℃在心臟中保持ATP-SUV 120分鐘。然后心臟用充氧的灌注溶液沖洗，監(jiān)視心臟的性能。與對照相比，ATP-SUV處理的心臟恢復(fù)了心臟功能。
實施例9 ATP-SUV提高了出血性休克之后的存活率 使用戊巴比妥麻痹Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。頸動脈被插管，插入壓力傳感器用于測量血壓和心率。股動脈被插管用于放血。在30分鐘的穩(wěn)定期之后，以1cc/分鐘的速率從動物中抽出血液，直到33％的動物總血液供給被除去。動物保持在這種降低的血液體積中60分鐘的時間。在60分鐘時間的末期，將乳酸化的ringers鹽水(傳統(tǒng)的晶體復(fù)蘇)或ATP-SUV腹膜內(nèi)(IP)地給予動物。監(jiān)視存活時間、血壓和心率，持續(xù)另外的120分鐘。在實驗的末期，動物被安樂死，移除血液的樣品用于pCO2、乳酸的分析和高能磷酸的測量。當與鹽水處理的對照動物相比時，ATP-SUV處理的動物顯示了跨越所有時間點的提高的存活率，如圖7中顯示的數(shù)據(jù)所指示的。此外，ATP-SUV組具有顯著更低的pCO2、乳酸，并具有血液和組織高能磷酸水平的顯著提高。
實施例10 在化學(xué)誘導(dǎo)的缺氧之后ATP-SUV提高存活率 使用戊巴比妥麻痹Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。頸動脈被插管，插入壓力傳感器用于測量血壓和心率。股動脈被插管用于施用氰化鉀(KCN)(2.5mM)。在30分鐘的穩(wěn)定期之后，IP地給予動物ATP-SUV(在圖8中標記為“Vitasol”)或乳酸化的ringer’s鹽水。五分鐘之后，經(jīng)由股動脈注射大量(bolus)KCN藥劑。在4小時時間內(nèi)測量存活時間、血壓和心率。圖8中顯示的結(jié)果顯示與對照動物相比施用ATP-SUV的動物的存活率提高。
實施例11 血液保存的改進(預(yù)測實施例) 為了確定含有ATP的泡囊是否能夠保存血液以及添加糖酵解中間物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和果糖-1，6-二磷酸(FDP)是否能夠進一步改善生存力，進行了以下的實驗。僅使用DOPC構(gòu)建泡囊，遵照實施例2的方法。血液將根據(jù)標準方法收集到含有標準的葡萄糖-檸檬酸-腺嘌呤-磷酸混合物(Baxter；Deerfield，Illinois)的袋中。對于每組實驗，一個單位的血液被分成相等的等分量，無菌地轉(zhuǎn)移到不含有其他添加劑(對照)的聚乙烯袋中。測試物質(zhì)將添加到其他等分量中，如下 ·對照，沒有添加劑 ·對照，含有PEP、FDP和核糖的泡囊 ·ATP-SUV。
在30、45、60和90天，收回等分量，根據(jù)以下參數(shù)評估紅細胞的狀況ATP含量、血細胞比容、血紅蛋白和細胞生存力(使用錐蟲藍(Sigma)排阻或LIVE/DEAD試劑盒(Molecular Products；Eugene，Oregon)。預(yù)期的結(jié)果在存在含ATP的泡囊的情況下保持的細胞將處于相比對照更好的狀態(tài)；也就是說，ATP含量將更高，pH將降低更少(表明更少的糖酵解)，紅細胞將保持功能性紅細胞典型的雙面凹的形狀。
參考文獻
以下列出的參考文獻和在說明書中引用的所有參考文獻通過引用合并在此，達到它們補充、說明、提供背景或教導(dǎo)方法、技術(shù)和/或在此采用的組合物的程度。本申請中引用的所有引證的專利和公開物通過引用明確地合并在此。
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權(quán)利要求
1.一種泡囊，包含
(a)是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂；和
(b)至少一種不穩(wěn)定泡囊形成成員，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員選自不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)、PEG、筏形成者和融合蛋白。
2.權(quán)利要求1的泡囊，其中是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂或不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)具有式(I)的結(jié)構(gòu)
X-L-(Z)2　　　　　　　(I)，
其中X是H、A，或具有式(II)的結(jié)構(gòu)
B是陽離子或烷基基團；
A是H或烷基基團；
L是進一步缺少兩個氫原子的烷基；和
每個Z獨立地是H、E或式(XI)的結(jié)構(gòu)，
其中E是烷基或烯基，且當一個Z是H時，另一個Z不是H。
3.權(quán)利要求2的泡囊，其中
A是H，或具有選自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的結(jié)構(gòu)
其中n是0到4的整數(shù)；
L具有選自式(VIII)、(IX)或(X)的結(jié)構(gòu)
和
E是選自異支鏈脂肪酸、反異支鏈脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不飽和的或順式-不飽和脂肪酸、a-羥基脂肪酸、b-羥基脂肪酸、a-羥基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羥基脂肪酸、環(huán)己基脂肪酸、(Z，Z)-不飽和脂肪酸、a-羥基-(bE)-烯和2-己基環(huán)丙烷癸酸的細菌脂肪酸，或E具有選自(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)的結(jié)構(gòu)
4.權(quán)利要求1的泡囊，其中是穩(wěn)定泡囊形成者的所述磷脂是磷脂酰膽堿。
5.權(quán)利要求4的泡囊，其中所述磷脂酰膽堿是大豆磷脂酰膽堿、卵磷脂酰膽堿、大腸桿菌提取物磷脂酰膽堿、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、1-棕櫚?；?2-二十二碳六烯?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(PDPC)、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)或其混合物。
6.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是具有選自式(XXIV)、(XXV)、(XXVI)、(XXVII)、(XXIX)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定泡囊形成極性脂質(zhì)
7.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是具有約20到約8000個重復(fù)單元的分子量的PEG。
8.權(quán)利要求7的泡囊，其中所述PEG具有約3000到約4000個重復(fù)單元的分子量。
9.權(quán)利要求8的泡囊，其中所述PEG具有約3350個重復(fù)單元的分子量。
10.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是選自膽固醇和鞘磷脂的筏形成者。
11.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員是選自受精素、可溶的N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)、secl/munc18(SM)多肽、病毒包膜融合蛋白和膜聯(lián)蛋白的融合蛋白。
12.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述泡囊進一步包含生物分子。
13.權(quán)利要求12的泡囊，其中所述生物分子是脂質(zhì)可溶的生物分子。
14.權(quán)利要求13的泡囊，其中所述脂質(zhì)可溶的生物分子選自a-生育酚(維生素E)、視黃醇(維生素A)、phyllochinon(維生素K)、麥角鈣化醇(維生素D)、膽固醇、膽固醇酯、類固醇、藿烷類、洗滌劑、脂肪酸、細菌支鏈脂肪酸、類異戊二烯化合物、長鏈醇、脂質(zhì)可溶的麻醉劑、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂多糖、生物素標記的磷脂、膜離子電導(dǎo)通道、轉(zhuǎn)運蛋白、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、粘附蛋白、間隙連接蛋白、聯(lián)會接點蛋白、半胱氨酸蛋白酶、粘著蛋白、G-蛋白、MHC蛋白、補體蛋白、脂質(zhì)可溶的病毒蛋白、細胞受體、脂質(zhì)可溶的熒光探針分子和脂質(zhì)可溶的放射性示蹤分子。
15.權(quán)利要求12的泡囊，其中所述生物分子是水溶性的生物分子。
16.權(quán)利要求15的泡囊，其中所述水溶性的生物分子選自氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、單糖、二糖、多糖、核苷酸、多核苷酸、水溶性維生素、礦物質(zhì)、高能磷酸、糖酵解中間物、氧化中間物、煙酰胺二核苷酸(NAD+/NADH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD+/FADH2)、水溶性細胞酶、胰島素、水溶性熒光探針分子、水溶性放射性示蹤分子和水溶性藥物。
17.權(quán)利要求16的泡囊，其中所述高能磷酸選自ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鳥嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP、次黃苷和磷酸肌酸。
18.權(quán)利要求17的泡囊，其中所述高能磷酸生物分子是ATP。
19.權(quán)利要求18的泡囊，其中所述ATP是Mg-ATP。
20.權(quán)利要求18的泡囊，其中所述ATP以約1M或更低的濃度存在。
21.權(quán)利要求20的泡囊，其中所述ATP以約0.001mM到約200mM的濃度存在。
22.權(quán)利要求21的泡囊，其中所述ATP以約1mM到約50mM的濃度存在。
23.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有至少1個泡囊吸收/秒/細胞的吸收速率。
24.權(quán)利要求23的泡囊，其中所述泡囊具有至少103個泡囊吸收/秒/細胞的吸收速率。
25.權(quán)利要求24的泡囊，其中所述泡囊具有至少106個泡囊吸收/秒/細胞的吸收速率。
26.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有1:9到100,000:1的穩(wěn)定泡囊形成成員比不穩(wěn)定泡囊形成成員的比例。
27.權(quán)利要求26的泡囊，其中所述泡囊具有1:1到1,000:1的穩(wěn)定泡囊形成成員比不穩(wěn)定泡囊形成成員的比例。
28.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述泡囊是單層泡囊。
29.權(quán)利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有約20nm到約600nm的水動力學(xué)半徑。
30.權(quán)利要求29的泡囊，其中所述泡囊具有約100nm到約300nm的水動力學(xué)半徑。
31.一種泡囊，包含
生物分子；
大豆磷脂酰膽堿；和
DOTAP。
32.權(quán)利要求31的泡囊，其中所述生物分子是ATP。
33.權(quán)利要求32的泡囊，其中所述ATP以約0.01mM到約200mM的濃度存在。
34.權(quán)利要求31的泡囊，其中所述泡囊具有50:1的大豆磷脂酰膽堿比DOTAP的比例。
35.權(quán)利要求31的泡囊，其中所述泡囊具有約100nm到約300nm的水動力學(xué)半徑。
36.一種泡囊，包含
生物分子；
DOPC；和
DOTAP。
37.權(quán)利要求36的泡囊，其中所述生物分子是ATP。
38.權(quán)利要求37的泡囊，其中所述ATP以約0.01mM到約200mM的濃度存在。
39.權(quán)利要求36的泡囊，其中所述泡囊具有50:1的DOPC比DOTAP的比例。
40.權(quán)利要求36的泡囊，其中所述泡囊具有約100nm到約300nm的水動力學(xué)半徑。
41.一種向細胞遞送生物分子的方法，包括用權(quán)利要求12的泡囊接觸所述細胞。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述生物分子是ATP。
43.權(quán)利要求42的方法，其中遞送給所述細胞的ATP的數(shù)量足以滿足細胞的代謝需求。
44.一種處理傷口的方法，所述方法包括用包含權(quán)利要求12的泡囊的組合物接觸所述傷口。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述組合物進一步包括貝卡普勒明、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、抗生素、含銀組合物、皮膚移植組合物或其組合。
46.權(quán)利要求44的方法，所述方法進一步包括用皮膚移植組合物和包含權(quán)利要求12的泡囊的組合物接觸所述傷口。
47.一種保存組織的方法，包括用權(quán)利要求12的泡囊接觸組織。
48.一種提高具有至少一個細胞的生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率的方法，包括用權(quán)利要求12的泡囊接觸所述細胞。
全文摘要
提供了包含是穩(wěn)定泡囊形成者的磷脂和至少一種不穩(wěn)定泡囊形成成員的脂質(zhì)泡囊，其中所述不穩(wěn)定泡囊形成成員選自不是穩(wěn)定泡囊形成者的極性脂質(zhì)、PET、筏形成者和融合蛋白。所述泡囊可以進一步包含生物分子，實例例如ATP。還提供了使用所述泡囊用于遞送生物分子的方法。
文檔編號A61P17/02GK101466357SQ200780011537
公開日2009年6月24日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月7日
發(fā)明者威廉·D·埃林格, 錢蘇帆 申請人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會