專利名稱：：神經(jīng)變性疾病的治療的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽在提高PP2A活性的方法和組合物中的應用。本發(fā)明還涉及硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽在抑制或降低tau蛋白磷酸化的方法，抑制GSK3(3活性的方法，具體說是治療或預防神經(jīng)變性疾病的方法中的應用。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及將硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽與其它治療藥物聯(lián)合用于治療或預防神經(jīng)變性疾病的方法中的應用。
背景技術：
：神經(jīng)變性疾病是一些疾病的總稱，包括使腦功能正常的神經(jīng)元受損而致的腦控制自身或機體能力的喪失。神經(jīng)變性疾病是老年人的主要疾病。隨著預期壽命的增長，世界人群活得更長，神經(jīng)變性疾病患者的數(shù)目隨之增多。在一些神經(jīng)變性疾病中，腦中的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞中存在異常tau蛋白的沉積。例如，在阿爾茨海默病(AD)特征性神經(jīng)原纖維纏結中發(fā)現(xiàn)了異常的tau蛋白。神經(jīng)原纖維纏結(NT)是AD的二種神經(jīng)病理改變之一[Lee等，2001]。形成配對的螺旋纖維是NT的主要成分，其主要由微管相關蛋白tau組成[Lee等，1991;Grundke-Iqbal等，1986a;Grundke-Iqbal等，1986b]。PHF-tau(從PHF分離的tau蛋白)是高度不溶性的蛋白，在SDS凝膠(電泳)中顯示停滯不移動，不能結合微管，因為它被異常磷酸化(與正常tau蛋白相比，有多個位點磷酸化)[Lee等，1991;Grundke-Iqbal等，1986a;Grundke-Iqbal等，1986b]。去磷酸化后，PHF-tau蛋白變成可溶性蛋白而如同正常tau蛋白那樣能結合和促進微管裝配[Wang等，1995;Wang等，1996;Bramblett等，1993]。認為是tau蛋白異常磷酸化引起了tau功能不全、微管不穩(wěn)定、軸突轉運喪失、神經(jīng)變性和與AD相關的癡呆。4一種異常類型的tau蛋白是超磷酸化的tau蛋白。已知體內(nèi)糖原合酶的激酶3p(GSK3(3)可使tau蛋白的多個磷酸化位點，包括阿爾茨海默病的特有Ser^殘基磷酸化[Li和Paudel，2006]。進而，已知蛋白激酶Akt可使GSK3(3磷酸化，已知蛋白磷酸酶PP2A可減弱Akt的活性。PP2A是一種異質三聚體全酶，存在多種形式，由結合于不同調(diào)節(jié)亞基的共同核心結構組成[Mumby和Walter,1993]。此酶的核心是由催化(C)亞基和結構(A)亞基組成的復合體。第三種亞基稱為B亞基，其包括能調(diào)節(jié)PP2A活性和特異性的幾種多肽[Mumby和Walter,1993;Kamibayashi等，1994]。PP2A的ABC同工型重要部分能與神經(jīng)元微管結合[Sontag等，1995]，意味著PP2A可能調(diào)節(jié)微管相關蛋白(MAP)如tau蛋白的磷酸化狀態(tài)。已證明含B調(diào)節(jié)亞基的PP2A，而非其它形式(即含B，和B"亞基)的PP2A能在體外結合tau蛋白使之強效去磷酸化。另外，抑制PP2A的ABC同工型可誘導tau蛋白超磷酸化、tau蛋白與微管分離、和喪失tau蛋白導致的微管穩(wěn)定性[Sontag等，1996]。近年來證明PP2A占人腦tau蛋白磷酸酶總活性的約7P/。[Liu等，2005]。AD病人腦中磷酸酶總活性和PP2A針對tau蛋白的活性顯著降低，而AD腦中的其它磷酸酶如PP2B的活性實際上升高[LIU等，2005]。人腦中PP2A活性與大多數(shù)磷酸化位點的tau蛋白磷酸化水平呈負相關。這表明PP2A是主要的tau蛋白磷酸酶，調(diào)節(jié)著人腦多處部位的tau蛋白磷酸化。這意味著AD腦中tau蛋白的異常超磷酸化部分是由于PP2A活性下調(diào)所致，因此其作用是能提高PP2A活性，特別是能提高PP2A的ABC同工型活性的制劑將具有臨床用途，可治療或預防神經(jīng)變性疾病的發(fā)展。有證據(jù)證明，tau蛋白異常磷酸化的逐漸增多可能與存在異常的cx-共核蛋白(a-synuclein)的神經(jīng)變性疾病相關。在阿爾茨海默病、帕金森病、Guarn-帕金森-ALS-癡呆復合癥和由a-共核蛋白突變引起的帕金森病中tau蛋白和a-共核蛋白二者發(fā)生病變[Duda等，2002;Forman等，2002;Ishizawa等，2003]。a-共核蛋白看來在帕金森病(PD)的病理生理學中起著重要作用。雷維小體(Lewybody)是PD的病理學標志，其主要由a-共核蛋白組成[Spillantini等，1997;Spillantini等，1998b]。認為a-共核蛋白在PD的病理生理學中起著關鍵作用，因為它在雷維小體中積累，且因為遺傳學研究鑒定到ot-共核蛋白中存在與家族性PD相關的突變[Kmger等，1998;Polymeropoulos等，1997;Singleton等，2003;Spillantini等，1998b;Za腿z等，2004]。a-共核蛋白中的A53T和A30P突變導致a-共核蛋白聚集傾向升高看來是PD的病因。這二種突變提高了a-共核蛋白自發(fā)性聚集或因對外源因子如金屬和氧化應激的反應而聚集的傾向[Conway等，2000;Hashimoto等，1999;Kruger等，1998;Ostreova-Golts等，2000;Paik等，1999、2000;Polymeropoulos等，1997〗。在轉基因小鼠和果蠅中，a-共核蛋白的A53T和A30P突變也可引起年齡依賴的a-共核蛋白聚集和神經(jīng)元損傷[Feany和Bender,2000;Giasson等，2002;Kahle等，2001;Masliah等，2000]。這些研究結果強調(diào)了a-共核蛋白與神經(jīng)變性相關。異常磷酸化的tau蛋白存在于散發(fā)PD病人的雷維小體中，出現(xiàn)在靠近含ot-共核蛋白病態(tài)微管裝配體區(qū)域的神經(jīng)元中[Ishizawa等，2003]。體外證據(jù)也將a-共核蛋白與tau蛋白相聯(lián)系，因為a-共核蛋白在體外能結合tau蛋白和通過蛋白激酶A剌激tau蛋白磷酸化[Giasson等，2003;Jensen等，1999]。近年的研究結果表明a-共核蛋白體外能提高tau蛋白的纖維化，而異常的tau蛋白纖維存在于過度表達A53T突變型a-共核蛋白的有癥狀轉基因小鼠腦中[Giasson等，2003]。FrasierM等，2005證明，在過度表達A30Pa-共核蛋白轉基因小鼠中，A30Pa-共核蛋白聚集發(fā)生在病理性tau蛋白旁邊，即產(chǎn)生的a-共核蛋白聚集與病理性tau蛋白平行分布，并證明有癥狀的A30Pa-共核蛋白轉基因小鼠出現(xiàn)異常的tau蛋白磷酸化，這種磷酸化與c-jun激酶活化相關。除了a-共核蛋白(a-^")聚集外，氧化應激和接觸某些神經(jīng)毒素如1_甲基_4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)與PD的病變相聯(lián)系。在小鼠和靈長動物中MPTP能誘導黑質紋狀體多巴胺能(神經(jīng))通路的選擇性變性，如PD中所見，此與"-5>7表達水平和聚集升高相關，但不誘生真正的雷維小體[Dauer和Przedborski，2003]，而連續(xù)給予MPTP可引發(fā)對泛素和a-共核蛋白具有免疫反應性的黑質包涵體形成[Fomai等，2005]。某些雷維小體的另一種成分是異常磷酸化的tau蛋白[Ishizawa等，2003]。已報導在家族性阿爾茨海默病(AD)、唐氏綜合征和雷維小體病病人的腦中tau蛋白和作為聚集體或包涵體共同定位在神經(jīng)元中，或位于某些雷維小體或雷維小體樣包涵體內(nèi)部[Kotzbauer等，2001;Lippa等，1999;Arima等，1999;Iseki等，1999]。tau蛋白和a-^"之間的相似處包括在突觸前神經(jīng)元中的表達、體內(nèi)半壽期長、它們的"天然不折疊"性質使它們對熱穩(wěn)定，和它們通過疏水性殘基臂形成裝配纖維的核心的纖維化傾向[Friedhoff等，2000;Serpell等，2000]。S3E雙突變(模擬PHF-1磷酸化位點的偽磷酸化結構，其中在最長的人tau蛋白同工型-ht40中396位和404位的二個絲氨酸殘基被替換成谷氨酸殘基)的tau蛋白的其它體外資料也表明，Ser396/404的超磷酸化可引起tau蛋白C末端采取更為延伸的構型，而改變其對tau蛋白寡聚化的抑制作用和提高纖維形成的速度[Abraha等，2000]。Duka等，2006現(xiàn)已證明，MPTP誘導的中腦多巴胺能神經(jīng)元a-S"表達水平升高促進了tau蛋白PHF-1結合位點(Ser396/404)磷酸化模式的改變，導致這二種蛋白的失位(mislocation)，促進其共同免疫沉淀，并提高了十二烷基肌氨酸鈉不溶性超磷酸化tau蛋白的水平，提示MPTP-誘導的帕金森病機理和神經(jīng)毒性的啟動步驟是a-^w指導的tau蛋白Ser396/404超磷酸化。MPTP引起a-^"與微管分離增加和與細胞骨架結合分數(shù)有關的磷酸化tau蛋白水平降低的發(fā)現(xiàn)，也可能是與神經(jīng)變性過程的機制相關。tau蛋白的超磷酸化大大降低了tau蛋白對微管的親和力，導致其失去穩(wěn)定[Drechsel等，1992;Biernat等，1993;Michaelis等，2002]。此外，也知道磷酸化的tau蛋白能結合其它微管結合蛋白如MAPI和MAP2并從微管上除去這些蛋白[Iqbal和Grundke-Iqba1,2005]。然而，由于已知a-5>"能結合微管[Wersinger和Sidhu，2005]并且在軸突信號轉運中可能起作用[Sidhu等，2004]，因此該蛋白與微管分離有可能進一步加劇微管的不穩(wěn)定，破壞細胞骨架網(wǎng)絡和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，在導致與包涵體形成相關的神經(jīng)變性過程的鏈式反應中，a-S^7與微管分離和結合于微管的tau蛋白發(fā)生異?？赡馨硪环N聯(lián)系。MPTP-誘導的a-^"水平異常調(diào)節(jié)著磷酸化tau蛋白的形成，具體說，tau蛋白的PHF-1形式使我們能夠了解PHF形成和重要神經(jīng)功能相關喪失的早期階段的情況，提示MPTP-誘導的帕金森綜合征或神經(jīng)毒性可能是tau蛋白疾病，伴隨使人聯(lián)想到共核蛋白病的"-^"改變。這提示，已知AD發(fā)病中的tau蛋白異常移動也可能出現(xiàn)在帕金森病中，但發(fā)生在與AD不相關的腦部區(qū)域中，因此提示其在某些神經(jīng)變性疾病的發(fā)生中有相當大的重疊。由此提出，看似無關的神經(jīng)變性疾病實際上可能有著共同的觸發(fā)機制和后續(xù)病理變化，啟動了運動神經(jīng)元的變性。因此需要能影響tau蛋白磷酸化的，臨床上可用于治療或預防神經(jīng)變性疾病的制劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分是基于以下發(fā)現(xiàn)，即蛋白磷酸化酶PP2A接觸硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽可提高其活性。提高PP2A活性可降低或抑制tau蛋白的磷酸化，特別是超磷酸化，包括二種分支方法i)去磷酸化滅活Akt，從而降低GSK3(3的磷酸化，然后降低tau蛋白的磷酸化，和ii)tau蛋白直接去磷酸化。降低tau蛋白磷酸化特別是超磷酸化水平可減少或防止神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞中異常tau蛋白的積累或沉積，因而可用于治療或預防神經(jīng)變性疾病。因此，在一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供治療或預防對象神經(jīng)變性疾病的方法，包括給予所述對象有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。在某些實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是tau蛋白疾病。在某些實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是a-共核蛋白疾病。在特定實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病和帕金森病。在本發(fā)明另一方面內(nèi)容中，提供抑制或降低神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞或雷維小體中tau蛋白磷酸化的方法，包括使神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞接觸有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。在某些實施方式中，所述tau蛋白是微管相關tau蛋白。在某些實施方式中，所述tau蛋白位于神經(jīng)原纖維纏結中。在某些實施方式中，抑制或防止了tau蛋白的超磷酸化。在另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供增強PP2A活性的方法，包括使PP2A接觸有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。在某些實施方式中，所述PP2A是去磷酸化Akt的一種同工型。在某些實施方式中，所述PP2A是去磷酸化tau蛋白，特別是在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞和雷維小體中發(fā)現(xiàn)的微管相關tau蛋白的一種同工型。在另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞中GSK3(J活性的方法，該方法包括使神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞接觸有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。在本發(fā)明還有一方面內(nèi)容中，提供硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽在制造治療或預防神經(jīng)變性疾病藥物中的應用。在上述已廣泛描述的方法和應用的某些實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽與適合治療或預防神經(jīng)變性疾病的其它療法，或與適合減輕神經(jīng)變性疾病癥狀的療法聯(lián)用。發(fā)明詳述1.定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員共同理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但本文描述的是優(yōu)選的方法和材料。對于本發(fā)明的目的，下面定義了以下術語。本文所用冠詞"一個"和"一種"指該冠詞語法對象有一個或一個以上(即至少一個)。例如，"一種元件"指一個元件或一個以上元件。本文所用術語"約"指與參比品的數(shù)量、水平、數(shù)值、維度、大小或用量相比，差異可高達30%、20%或10%的數(shù)量、水平、數(shù)值、維度、大小或用量。9在全篇說明書和權利要求書中，除非另有要求，以下詞語"包含"和其變體"含有"和"包括"應理解為意指包括所述的整體或步驟，或一組整體或步驟，但不排除任何其它整體或步驟，或其它一組整體或步驟。術語"去磷酸化"本文用于指用化學方法去除生化物質如蛋白質中的磷酸基團(P042—)。在細胞環(huán)境中，可通過酶如磷酸酶的酶促作用實現(xiàn)去磷酸化。本文所用術語"膠質細胞"指非神經(jīng)元細胞，它們能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元提供結構和代謝支持。膠質細胞也稱為神經(jīng)膠質細胞或膠質。術語"超磷酸化"指某生化物質如蛋白質中所有可利用的磷酸化位點都被磷酸化。該生化物質不會發(fā)生進一步磷酸化。短語"抑制或減少超磷酸化"包括防止該生化物質所有的位點被磷酸化，和減少其所有磷酸化位點被磷酸化的生化物質的數(shù)量。本文所用的術語"聯(lián)用"指用至少二種制劑治療對象，使得它們對神經(jīng)變性疾病的作用在同一段時間內(nèi)至少發(fā)揮一部分?？稍谝环N組合物中同時給予至少二種制劑，或可用分開的組合物同時或依次給予各制劑。術語"雷維小體"指神經(jīng)細胞中發(fā)生的蛋白異常聚集。雷維小體中的主要蛋白聚集體由CX-共核蛋白組成。術語"神經(jīng)變性疾病"本文用于指特征為神經(jīng)元喪失或變性的神經(jīng)疾病。神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性運動疾病和與記憶喪失和/或癡呆相關的神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病包括tau蛋白病和a-共核蛋白病。神經(jīng)變性疾病的例子包括但不限于早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進行性失語癥、額顳葉癡呆、皮質基底(核)癡呆、帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。術語"神經(jīng)原纖維纏結"本文用于指位于腦中的異常結構，其由成對的螺旋纖維絲(神經(jīng)原纖維和微管)的致密陣列組成。神經(jīng)原纖維纏結中包含有tau蛋白，特別是微管相關tau蛋白。認為腦中存在的神經(jīng)原纖維纏結數(shù)量與對象癡呆程度相關。神經(jīng)原纖維纏結是阿爾茨海默病的一種區(qū)別特征。本文所用術語"神經(jīng)元"指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的細胞，它們是專門接收、加工和傳輸信息的細胞。神經(jīng)元也可稱為神經(jīng)細胞。本文所用術語"營養(yǎng)量"包括能提供每日平均攝入硒量的硒用量。在美國每日平均攝入量是80—120微克/天。與硒酸鹽相關的本文所用的"藥學上的鹽"指對于人類和動物給藥毒理學安全的金屬離子鹽。例如，合適的藥學上可接受的鹽包括但不限于藥學上可接受的無機酸如氫氯酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、磺酸和氫溴酸的鹽，或藥學可接受的有機酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來酸、羥基馬來酸、延胡索酸、馬來酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲垸磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、苯磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗壞血酸和正戊酸的鹽。堿鹽包括但不限于與藥學上可接受的陽離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鎳、鋅、銨和垸基銨形成的那些鹽?？捎弥T如低級垸基鹵如甲基、乙基、丙基、丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸鹽如二甲基和二乙基酸鹽；和其它鹽制劑季銨化堿性含氮基團。合適的硒酸的金屬離子鹽包括但不限于鈉、鉀、鋰、鎂、鈣、鐵、鎳、鋅、銨和烷基銨鹽。在某些實施方式中，所述鹽不是硒酸鋰。優(yōu)選的硒酸鹽是鈉鹽Na2Se04。術語"磷酸化"本文用于指在生化物質如蛋白質中化學加入磷酸基團(P042—)。在細胞環(huán)境中，可通過酶如激酶的酶促作用實現(xiàn)磷酸化。短語"抑制或減少磷酸化"包括防止生化物質的一個或多個磷酸化位點發(fā)生磷酸化，包括防止所有的磷酸化位點發(fā)生磷酸化，如超磷酸化。此短語也包括通過防止一個或多個磷酸化位點的磷酸化降低生化物質的磷酸化程度，或導致在該生化物質的一個或多個磷酸化位點發(fā)生去磷酸化。術語"對象"或"個體"或"病人"本文中可互換使用，指需要預防或治療的任何對象，特別是脊椎動物對象，更具體說是哺乳動物對象。合適的屬于本發(fā)明范圍的脊椎動物對象包括但不限于靈長類、禽類、家畜11動物(如豬、綿羊、牛、馬、驢)、實驗動物(如家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、豬、倉鼠)、陪伴動物(如貓和狗)和捕獲的野生動物(如狐貍、鹿、野狗)。優(yōu)選的對象是需要治療或預防神經(jīng)變性疾病，特別是阿爾茨海默病或癡呆的人。然而，應理解以上術語不暗示存在癥狀。術語"超營養(yǎng)量"本文用于指所用劑量高于認為符合營養(yǎng)要求的量。在美國，平均每日的硒攝入量為80-120微克/天。超營養(yǎng)的硒用量向對象提供了高于推薦的每日允許量。例如，超營養(yǎng)硒量可以是每天3ug-20mg/kg、每天0.015mg-20mg/kg、0.1mg-20mg/kg、0.1mg-14mg/kg、0.1mg-13mg/kg、0.1mg-12mg/kg、0.1mg-10mg/kg、0.1mg-9mg/kg、0.1mg-8mg/kg、0.1mg-7mg/kg、0.1mg-6mg/kg、0.15mg-5mg/kg、0.15mg-4mg/kg、0.15mg-3mg/kg、0.15mg-2mg/kg、0.15mg-lmg/kg，具體是每天0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-54mg/kg，更具體說是每天0.07mg-2mg/kg。本文所用的術語"a-共核蛋白病"指涉及腦神經(jīng)細胞中和a-共核蛋白聚集或異常(x-共核蛋白的神經(jīng)變性疾病或病癥。oc-共核蛋白病包括但不限于帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。在治療或預防神經(jīng)變性疾病，或抑制或降低tau蛋白磷酸化，或抑制GSK3P活性的本文描述中所用術語"有效量"指以單劑量或一系列劑量的一部分給予或加入的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的用量，該用量能有效提高PP2A的活性，具體是能有效預防神經(jīng)變性疾病相關的癥狀、維持對癥狀的控制和/或治療現(xiàn)有癥狀。此有效量取決于所治療個體的健康和身體狀況，所治療個體的分類類別、組合物配方、醫(yī)療狀況的評估和其它相關因素。預計所述劑量范圍較廣，可通過常規(guī)試驗確定。在具體實施方式中，有效量是營養(yǎng)量或超營養(yǎng)量。術語"tau蛋白病"本文用于指涉及腦神經(jīng)元和膠質細胞中異常tau蛋白沉積的神經(jīng)變性疾病或病癥。tau蛋白病包括的疾病和病癥中，tau蛋白異常磷酸化，包括tau蛋白超磷酸化。tau蛋白病包括但不限于早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進行性失語癥、額顳葉癡呆、皮質基底(核)癡呆。么游或微機體疾微方法
技術領域：
：本發(fā)明的預測部分基于確定硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽能有效提高PP2A的活性，進而可通過GSK3P導致減少tau蛋白的磷酸化和/或提高tau蛋白去磷酸化的速率。本發(fā)明的方法通常包括使神經(jīng)元或膠質細胞中的PP2A接觸能增強PP2A活性用量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。在某些實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的用量，具體是硒酸鹽或其鹽的用量每日為約O.Ol5mg-20mg/kg，常為約0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。本發(fā)明可有效用于治療或預防神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性運動疾病和與記憶喪失相關的神經(jīng)變性疾病，包括tau蛋白病和a-共核蛋白病。神經(jīng)變性疾病的示范性例子包括早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進行性失語癥、額顳葉癡呆、皮質基底(核)癡呆、帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明適合治療或預防tau蛋白病，特別是阿爾茨海默病和癡呆。在其它實施方式中，本發(fā)明適合治療或預防a-共核蛋白病，特別是帕金森病。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的適合有效用量是營養(yǎng)性或超營養(yǎng)性硒酸量。在某些實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的用量是0.015mg-20mg/kg，通常為每日約0.1mg-14mg/kg或0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。在優(yōu)選實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽是硒酸鈉(Na2Se04)。在某些實施方式中，給予硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽時聯(lián)用另一種能治療或預防神經(jīng)變性疾病的藥物。可與硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽聯(lián)用的治療或預防神經(jīng)變性疾病藥物的示范性例子包括但不限于膽堿脂酶抑制劑如他克林(Cognex⑧)、杜尼匹次、加蘭他敏和雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑如美金剛胺；雌激素制劑如倍美力；非類固醇消炎藥物(NSAID)如阿斯匹林和布洛芬；左旋多巴(L-多巴)，多巴脫羧酶抑制劑如卡比多巴和芐絲肼，或左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑如信尼麥⑧和Stalevo⑧聯(lián)用；多巴胺激動劑如溴隱亭(Parlode1⑧)、硫丙麥角林(Permax㊣)、派拉米蘇(Mirapex⑧)、羅比尼洛(Requip⑧)、卡麥角林、阿撲嗎啡(APOKYNTM)和稠環(huán)乙脲；單胺氧化酶B抑制劑如司來吉蘭(EldepryKS)和Carbex⑧)和拉撒斯林(rasasiline)(Azilect⑧)；抗膽堿能藥物如苯并托品甲磺酸溴隱亭(Cogentin⑧)和鹽酸苯海索(Artane⑧)；以及COMT抑制劑如恩他卡朋(Commtan)和托卡朋(Tasmar);或其它藥物如酒石酸雷司替明(Exelon)和金剛胺(Symmetrel⑧)；或左旋多巴、多巴脫羧酶抑制劑、多巴胺激動劑、單胺氧化酶B抑制齊l」、抗膽堿能藥物和COMT抑制劑的二種或多種混合物。聯(lián)合治療可包括有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽，和通常在缺乏硒酸鹽時所用的一定量的治療或預防神經(jīng)變性疾病的(其它)藥物。例如鹽酸他克林可作為聯(lián)用藥物的一部分與硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽一起給予神經(jīng)變性疾病如AD病人，用量為40mg-160mg/天，或可給予用量5-10mg/天的杜尼匹次?？山o予癡呆病人劑量達到1.25mg/天偶聯(lián)馬雌激素(CEE)的倍美力?；蛘?，由于與硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽共同給藥，可減少治療神經(jīng)變性疾病所用的藥物劑量。在某些實施方式中，這種聯(lián)用可顯示協(xié)同效應。本發(fā)明的某些實施方式涉及治療或預防對象神經(jīng)變性疾病的方法，該方法通常包括給予所述對象有效量的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。為實施這些方法，治療該對象的人員可根據(jù)該對象的具體情況和環(huán)境確定硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的有效劑量。硒酸鹽的有效劑量是能有效治療或預防神經(jīng)變性疾病，包括預防癥狀，維持對癥狀的控制或治療癥狀的用量。在某些實施方式中，此有效量是營養(yǎng)量。在其它實施方式中，此有效量是超營養(yǎng)量。在具體實施方式中，所述硒酸或其藥學上可接受的鹽是硒酸鈉。以下敘述用于本發(fā)明方法的給藥方式，硒酸鹽的給藥量和硒酸鹽制劑。對于所要治療的神經(jīng)變性疾病，可通過測定能表明此類疾病進程的一種或多種診斷參數(shù)并與合適的對照相比而確定。以對象是人為例，"合適的對照"可以是治療前的該個體，或可以是用安慰劑治療的人(年齡相配或類似的對照)。按照本發(fā)明，神經(jīng)變性疾病的治療包括但不限于(i)預防有患神經(jīng)變性疾病傾向但尚未診斷此病的對象發(fā)生此病，因此這種治療是對神經(jīng)變性疾病的預防性治療；(ii)抑制神經(jīng)變性疾病，即制止神經(jīng)變性疾病的發(fā)展；或(iii)緩解神經(jīng)變性疾病產(chǎn)生的癥狀。本發(fā)明的方法適合治療已診斷為神經(jīng)變性疾病，懷疑患有神經(jīng)變性疾病，或已知被懷疑和認為可能發(fā)生神經(jīng)變性疾病的個體。在上述方法的某些實施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是tau蛋白病，特別是帕金森病，所述治療任選還包括給予適合治療上述a-共核蛋白病的其它藥物。在優(yōu)選實施方式中，所述硒酸鹽是硒酸鈉?？捎帽景l(fā)明方法治療的對象例子是脊椎動物，特別是哺乳動物。在某些實施方式中，所述對象選自人、綿羊、牛、馬、母牛、豬、狗和貓。優(yōu)選的對象是人。可采用藥物遞送領域已知的以下任何技術配制硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。當然要記住，可以許多方式給予硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽，但并非所有的制劑都適合每種給藥途徑?？山o予固體或液體形式的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。其應用可經(jīng)口服、直腸、鼻、局部(包括口頰、舌下)或吸入途徑。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽可與常規(guī)的藥學上可接受的輔佐劑、載體和/或稀釋劑一起給藥。給藥可用的固體劑型包括片劑、膠囊、粉劑、藥丸、糊劑、栓劑和顆粒形式。它們也可包含載體或添加劑，如調(diào)味劑、染料、稀釋劑、軟化劑、粘合劑、防腐劑、持久劑和/或包裹材料。給藥的液體劑型包括溶液、混懸液和乳液。這些也可與上述添加劑一起給予。具有合適粘度易于使用的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的溶液和混懸液可用于注射。如需要，對注射而言太過粘稠的混懸液可用設計的裝置將其植入(體內(nèi))。可通過腸胃道外途徑或腸溶裝置給予持續(xù)釋放劑型。腸胃道外給藥是用于實施本發(fā)明給予硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的另一種途徑。"腸胃道外"包括適合注射和經(jīng)鼻、陰道、直腸和口頰給藥的制劑。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽給藥可包括口服延長給藥劑型?？诜苿﹥?yōu)選以緩釋膠囊或片劑劑型，或者以水溶液形式每日給藥l一3次?？擅咳?、連續(xù)、一周一次或一周三次經(jīng)靜脈內(nèi)給予硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的給藥可包括每日給藥，優(yōu)選采用緩釋膠囊或片劑劑型每日給予一次，或每日給予一次水溶液。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽與適合治療神經(jīng)變性疾病的至少一種藥物聯(lián)用時，可采用單一制劑或組合物，或采用分開的制劑或組合物的固體或液體劑型給藥。在某些實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽和治療神經(jīng)變性疾病的這種藥物，可作為單一片劑或膠囊，或作為分開的片劑或膠囊口服給藥。在其它實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽和治療神經(jīng)變性疾病的這種藥物，可作為單一組合物或分開的組合物靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明也提供含營養(yǎng)量或超營養(yǎng)量硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的治療或預防神經(jīng)變性疾病的藥物組合物。在某些實施方式中，所述組合物含有0.5mg-1.0g，例如5-450mg的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。在某些實施方式中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的用量是約5.0-700mg或5-450mg。在說明性例子中，硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的用量是1.6mg-450mg、5-450mg、7.5-250mg，具體是50-200mg，例如50-100mg或100-150mg，每日一次或分幾次給藥。在某些實施方式中，所述藥物組合物可用于治療或預防tau蛋白病，特別是阿爾茨海默病或癡呆。在其它實施方式中，所述藥物組合物可用于治療或預防a-共核蛋白病，特別是帕金森病。含有硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物也可包含其它治療或預防神經(jīng)變性疾病的藥物。例如，所述組合物可含硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽，和膽堿脂酶抑制劑如他克林、杜尼匹次、加蘭他敏或雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑如美金剛胺；雌激素制劑如倍美力；或非類固醇消炎藥物(NSAID)如阿斯匹林或布洛芬；左旋多巴，多巴脫羧酶抑制劑；左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑聯(lián)用；和/或COMT抑制劑；多巴胺激動劑；單胺氧化酶B抑制劑；抗膽堿能藥物；COMT抑制劑或其它藥物16如酒石酸雷司替明或金剛胺。本發(fā)明的藥物組合物可包含作為整個分子而無免疫原性、與硒酸鹽生物相容的、能生物吸收、可生物降解而消除的任何其它成分。所述制劑可以即用劑型提供，或以給藥前需加入運載體的滅菌粉末或液體劑型提供。如需無菌，可在無菌條件下制備該制劑，可滅菌混合物的各成分，或可除菌過濾該制劑后再使用。這種溶液還可含適當?shù)乃幬镙d體，例如但不限于緩沖劑、鹽、賦形劑、防腐劑等。在某些實施方式中，本發(fā)明方法采用緩釋的口服劑型給予硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽。這些制劑通常所含的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽溶解性較低以延緩其被吸收入血流中。此外，這些制劑可包含也能延緩硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽吸收的其它成分、藥物、載體等?？赡芑蚩赡懿粫l(fā)生生物腐蝕的微膠囊、聚合物包裹系統(tǒng)和滲透泵也可用于延緩或控制硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽從膠囊或基質中釋放。硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽可單用，或作為另一種藥物的組成部分使用。因此，本發(fā)明也考慮含有用于治療神經(jīng)變性疾病的硒酸鹽或其藥學上可接受的鹽的藥物。為了更清楚了解本發(fā)明的性質和付諸實施，現(xiàn)參考以下非限制性實施例描述本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方式。附圖的簡要說明圖1A是治療后，PC3細胞的完整細胞中和無細胞環(huán)境中磷酸化Akt水平的比較報告。圖1B是采用卡爾生物化學公司(Calbioehem)K-LISATMAkt活性檢測試劑盒，比較硒酸鈉與星孢素(一種非特異性的蛋白激酶強抑制劑)對重組人Aktl酶活性影響的示意圖。圖2A是存在硒酸鈉或岡田酸(一種紅潮藻類的聚醚毒素，能抑制磷酸蛋白的磷酸酶PP1和PP2A)時，Akt在Se/"位點磷酸化的比較圖。圖2B是存在硒酸鈉，或一些磷酸蛋白的磷酸酶抑制劑、互變霉素、岡田酸、內(nèi)皮肽A(endothallA)、花萼海綿誘癌素A(calyculinA)和環(huán)孢菌素A時，Akt在Ser473位點磷酸化的比較圖。圖2C提供PC3細胞中的Akt的免疫沉淀圖，顯示在缺乏(對照)和存在硒酸鹽(ATE)或胎牛血清(FCS)時，與PP2A形成復合物的Akt量。圖2D是在存在或缺乏硒酸鈉時，PC3細胞中磷酸酶PP2A活性的示意圖。圖3是PP2A磷酸酶活性翻譯后調(diào)節(jié)及底物特異性的示意圖(LCMT-亮氨酸羧甲基轉移酶，PME-l-磷酸酶甲基酯酶l，PTPA-磷酸酪氨酰(phospholyrosyl)磷酸酶激活劑)。圖4A(i)是在缺乏(對照)或存在硒酸鈉或岡田酸(OKA)時，PP2A磷酸酶相對活性的示意圖。.圖4A(ii)示意圖顯示，硒酸鈉對PP2A磷酸酶作用下絲氨酸磷酸肽釋放無機磷酸濃度的影響。一圖4B是顯示硒酸鈉對PP1的磷酸酶活性影響的示意圖。圖5A是在氧化環(huán)境中PP2A失活的示意圖。圖5B顯示硒酸鈉和過氧化氫對Akt磷酸化水平的影響。圖5C是在存在N-乙基馬來酰亞胺(NEM)、過氧化氫、硒酸鈉、硒酸鈉和過氧化氫時，PP2A磷酸酶中的游離巰基示意圖。圖5D是有或沒有過氧化氫時，用硒酸鈉或N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理的細胞的熒光分布圖。圖5E示意圖顯示，用過氧化氫、硒酸鈉、過氧化氫和硒酸鈉、NAC、過氧化氫和NAC處理時，熒光細胞的平均百分數(shù)。圖6A示意圖顯示，用硒酸鈉(ATE500^M)或內(nèi)皮肽A(ETA100pM)或不用添加劑(對照)時，免疫沉淀的PP2A的相對磷酸酶活性。圖6B是以岡田酸(OKA500nM)預處理或不預處理時，用LY294003(LY50(iM)或硒酸鈉(ATE500pM)處理后，磷酸化p70S6K水平的比較圖。圖6C是用能識別Akt的抗體檢測PP2A的不同B家族亞基(B和B，)的比較報告。Akt只與PP2A的B家族亞基共沉淀。圖7顯示硒酸鈉對GSK3(5活化的影響。圖8是顯示硒甲硫氨酸不影響Akt磷酸化水平，而硒酸鹽抑制Akt磷酸化的比較圖。18圖9是顯示不同的硒化合物對Akt活化影響的示意圖。處理對照(con);硒酸鈉(ATE);硒酸(Sdacid);亞硒酸鈉(ITE);二氧化硒(Se02);硫化硒(SeS2);甲基硒代半胱氨酸(MSC);和硒代半胱氨酸(SeC)?；钚訟kt信號的相對強度與Akt蛋白總水平相關，顯示在y-軸上。此圖表明只有硒酸鈉(ATE)才能抑制Akt的活化，使磷酸化Akt的水平降低到對照(con)水平之下。相反，硒酸(Selacid)、亞硒酸鈉(ITE)、二氧化硒(Se02)、硫化硒(SeS2)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、硒代半胱氨酸(SeC)均導致Akt活化高于對照(con)水平。圖10A和10B示意圖顯示，在用pNPP(圖IOA)或絲氨酸磷酸肽(圖10B)作為底物的pNPP水解試驗中，硒酸鈉(ATE)、亞硒酸鈉(ITE)和硒甲硫氨酸(SeMet)對PP2A磷酸酶活性的影響。圖11是在不同包被條件下存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時，人神經(jīng)母細胞瘤BE2M17細胞系用抗人PHF-tau蛋白抗體作免疫印跡的比較圖。圖12是在不同包被條件下存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時，人神經(jīng)母細胞瘤SY5Y細胞系用抗人PHF-tau蛋白抗體AT270(圖12A)和HT-7(圖12B)作免疫印跡的比較圖。圖13是在存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時，14周齡Balb/cNuNu雄性裸小鼠的全腦裂解物用抗人PHF-tau蛋白抗體AT100(圖13A)、AT180(圖13B)、AT270(圖13C)和HT-7(圖13D)作免疫印跡的比較圖。圖14示意圖顯示，在場地自主活動試驗(趨觸性(thigmotaxis))輪次l(圖"A)和輪次2(圖14B)中，硒酸鈉處理對所測試行為的影響。圖15示意圖顯示，在以逃離潛伏期(時間秒，圖15A)和游泳路徑(長度米，圖15B)進行評估的Morris水迷宮試驗中，硒酸鈉治療對(小鼠)學習和記憶力的影響。圖16示意圖顯示，在hTAU441轉基因TMHT小鼠中，用HT7免疫組化方法測定，硒酸鈉對腦海馬回(圖16A)和腦扁桃體(amygdala)(圖16B)中tau蛋白載量的影響。圖17示意圖顯示，在hTAU441轉基因TMHT小鼠中，用AT180免疫組化方法測定，硒酸鈉對腦海馬回(圖17A)和腦扁桃體(圖17B)中tau蛋白載量的影響。實施例敬虔辨遞過席麥教劍使爿"去錄麼眾硒酸鈉能一致地誘導前列腺癌完整細胞中的Akt去磷酸化。這種去磷酸化可能是由于對Akt蛋白本身的直接抑制作用。或者可能是通過增強對Akt磷酸化的負調(diào)節(jié)或抑制其正調(diào)節(jié)而間接實現(xiàn)。為鑒別直接與間接作用機制，在無細胞環(huán)境中測定了硒酸鈉對Akt磷酸化和活性的影響。將PC3前列腺癌細胞接種在100mm平皿中，當細胞達到70-80%鋪滿時血清饑餓過夜。為檢測對完整細胞中Akt磷酸化的作用，用新鮮無血清培養(yǎng)液配的500pM硒酸鈉處理PC3細胞1小時。裂解細胞，用活化特異性抗體作免疫印跡分析測定AktSer473位點的磷酸化水平，與表達的Akt蛋白水平作比較。為檢測對純化Akt的作用，類似地接種但不處理PC3細胞，用RIPA(磷酸酶負調(diào)節(jié)劑，一種嚴謹?shù)募毎呀饩彌_液，能最大程度降低對蛋白-蛋白復合物的維持)裂解。用泛Akt單克隆抗體作免疫沉淀純化得到等量(40-500ng)全細胞裂解液(WCL)中的Akt，然后在37。C金屬加熱塊上與50(HiM硒酸鈉一起培育1小時。如上所述用免疫印跡分析分辨免疫沉淀蛋白和測定Akt活化水平。圖1A比較了PC3細胞的完整細胞與無細胞環(huán)境經(jīng)處理后的磷酸化Akt水平。完整PC3細胞用500pM硒酸鈉處理1小時后Akt磷酸化大為降低。為驗證這些發(fā)現(xiàn)，用卡爾生物化學公司的K-LISAtmAkt活性檢測試劑盒檢測了曬酸鈉對重組人Akt酶活性的作用，將其與星孢素(一種非特異性的蛋白激酶抑制劑)的作用相比較。此ELISA試驗采用的生物素化肽底物(GRPRTSSFAEG)在第二個絲氨酸處被Akt磷酸化。在鏈霉親和素包被孔中將250ng的重組人Akt加或不加500pM硒酸鈉或lpM星孢素，與生物素化Akt底物一起3(TC培育30分鐘。用磷酸絲氨酸的檢測抗體，然后用HRP-抗體偶聯(lián)物和TMB底物產(chǎn)生的顏色，來測定結合的磷酸化底物。測定450nm吸光值和590nm參比值?？偨Y三次獨立實驗的結果，計算出平均吸光值(A45o-A59o-空白)士SEM，見圖1B所示。與以上發(fā)現(xiàn)相一致，沒有檢測到硒酸鈉對重組人Akt激酶活性的直接作用。相反，非特異性抑制劑星孢素強烈抑制了Akt的激酶活性。小結這些數(shù)據(jù)表明，硒酸鈉對Akt活性無直接抑制作用，說明觀察到的去磷酸化必然是通過一種間接機制完成。實蘑伊"，薪麼欽邀過腐激尸尸Z4游艨廢朦舒絲新去錄麼眾^,通過防止最初的Akt磷酸化，或提高Akt去磷酸化，可間接降低Akt的凈活性[Kohn等，1996]。然而，鑒于硒酸鈉誘導的Akt磷酸化為雙向反應(起初是瞬間增強，隨后是深度和持續(xù)減弱)，似乎硒酸鈉的作用不可能是簡單地減弱上游激酶磷酸化Akt的能力。因此測定了硒酸鈉的蛋白磷酸酶抑制作用能否誘導Akt去磷酸化。先用岡田酸，一種紅潮藻類的聚醚毒素(是導致有殼水生生物造成毒性腹瀉的致病因子)，其能抑制磷酸化蛋白的磷酸酶PP1和PP2A(二種調(diào)節(jié)Akt去磷酸化的磷酸酶)[Fernandez等.，2002]。在6孔板的每孔中接種5xl(^個PC3前列腺癌細胞，使細胞貼壁8小時，然后血清饑餓過夜。在無血清的新鮮培養(yǎng)液中用或不用5nM或1000nM的岡田酸預處理細胞30分鐘，然后加入最終濃度500pM的硒酸鈉培養(yǎng)1小時。用SDS-PAGE分辨裂解的細胞，然后用能特異性識別AktSer^殘基位點磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測Akt該位點的磷酸化，與表達的Akt蛋白總水平作比較(圖2A)。用硒酸鈉處理PTEN缺陷的PC3細胞，如預期那樣顯著降低了該細胞系中觀察到的長期Akt磷酸化高水平，這種降低不受先前與5nM岡田酸培育的影響。相反，用1000nM岡田酸預處理不僅增強了非硒酸鹽對照中的Akt磷酸化，而且完全抵消了硒酸鈉的抑制作用。為進一步精細辨別參與的磷酸酶，篩檢了范圍廣泛的一組磷酸化蛋白的磷酸酶(PPP)抑制劑(它們對PPP抑制的特異性不相同)能否抵消硒酸鈉對Akt磷酸化的抑制作用。這組(抑制劑)包括500^iM互變霉素(PPl)、500pM岡田酸(低劑量PP2A〉PP1)、lOOinM內(nèi)皮肽A(PP2AA)、2nM花萼海綿誘癌素A(低劑量PP1〉PP2A)、10nM花萼海綿誘癌素A(高劑量抑制PP1和PP2A)和400ng/ml環(huán)孢菌素A(PP2B)?；旧习慈缟纤?，接種PC3前列腺癌細胞，類似地用500pM硒酸鈉處理1小時，之前用或不用PPP抑制劑預處理30分鐘。另外，用SDS-PAGE分辨細胞裂解液，用能特異性識別AktSer^殘基位點磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測細胞膜上Akt該位點的磷酸化，與表達的Akt蛋白總水平作比較，見圖2B所示。沒用PP1或PP2B特異性PPP抑制劑預處理，或處理的細胞，接觸硒酸鈉后導致Akt磷酸化的顯著降低。相反，用低劑量岡田酸或內(nèi)皮肽A(PP2A的特異性或相對特異性抑制劑)處理細胞完全阻斷了硒酸鈉誘導的Akt去磷酸化。硒酸鈉可能通過提高PP2A與Akt之間復合物的形成速率，或提高已結合于PP2A的磷酸酶固有活性，或二者而增強PP2A介導的Akt去磷酸化。為有助于鑒別這二種機制，先測定了硒酸鈉上否能提高PP2A與Akt之間形成復合物的水平。將lx106PC3前列腺癌細胞接種在6cm平皿上，讓其貼壁8小時然后血清饑餓過夜。用新鮮無血清培養(yǎng)液或10%FCS配的500pM硒酸鈉處理細胞1.5小時，然后用ELB緩沖液裂解。用捕獲在蛋白A-瓊脂糖珠上的抗Akt單克隆抗體免疫沉淀每份400pg全細胞裂解液中的總Akt。陰性對照裂解液(空白)省略免疫沉淀抗體。洗滌減少非特異性結合后，在3xSDS蛋白加樣緩沖液中煮沸珠5分鐘，高速離心后用SDS-PAGE分辨上清液。用能特異性識別此磷酸酶催化亞基的抗體作免疫印跡分析，測定PP2A結合水平，與珠結合的Akt量和沉淀抗體(IgG)的濃度作比較。如圖2C所示，免疫沉淀去除未處理PC3細胞中的Akt，將可檢測到的PP2A催化亞基量提高到高于非特異性結合于珠(空白)的量，表明即使在基礎狀態(tài)下也有高水平的Akt磷酸化，至少某些Akt已與PP2A形成了復合物。用硒酸鈉處理促進了PP2A催化亞基與Akt的結合，而用血清刺激使復合物的形成降低到基礎水平之下。為了定量測定復合物形成的這種增加，數(shù)字化三次獨立實驗的免疫印跡數(shù)據(jù)，進行光密度分析，按每次實驗的對照標準化。檢測值為(檢測的)PP2A催化亞基量與免疫沉淀得到的Akt總蛋白量的平均比率土SEM。見圖2C所示，觀察到硒酸鈉處理后，PP2A催化亞基與Akt的結合提高了大約50%。為了確定硒酸鈉對Akt去磷酸化的作用是否完全可用簡單促進這二種蛋白之間的結合來解釋，檢測了硒酸鈉對Akt-相關磷酸酶活性的作用。將2xl(^個PC3前列腺癌細胞接種在10cm平板上，讓其貼壁8小時然后血清饑餓過夜。用或不用新鮮無血清培養(yǎng)液配的50(HlM硒酸鈉處理細胞1小時，再用低濃度磷酸緩沖液裂解。用抗Akt單克隆抗體(1:100)和30pl蛋白A漿液免疫沉淀得到的總蛋白500-600ng，為了檢測洗滌后有無磷酸污染，將25^最終洗滌緩沖液與孔雀綠一起培育。3(TC與500)iM合成的磷酸化蘇氨酸培育10分鐘，檢測免疫沉淀物的磷酸酶活性。每個樣品一式二份加入孔雀綠溶液，讀取590nm吸光值檢測游離磷酸鹽。三次獨立實驗的平均磷酸酶活性土SEM見圖2D。用硒酸鈉處理的PC3細胞使得與免疫沉淀Akt蛋白相關的磷酸酶活性高二倍以上，顯著高于先前觀察到的PP2A結合的簡單增加。小結這些數(shù)據(jù)表明，硒酸鈉是間接通過磷酸化蛋白的磷酸酶，特別是PP2A誘導了Akt去磷酸化。雖然硒酸鈉提高了PP2A與Akt的結合量，但相關的磷酸酶活性卻提高了約二倍，表明硒酸鈉主要是影響酶活性。實雄i'繊斜直接潛蔬尸尸24拔ur鋪微艇絲PP2A的核心結構由36kD的催化亞基(PP2Ac)和65kD的調(diào)控亞基(PR65或A亞基)組成。與第三個調(diào)節(jié)性B亞基結合可調(diào)節(jié)底物特異性[Wera禾口Hemmings，1995]。PP2A磷酸酶的活性受翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，其示意圖見圖3。已證明體外PP2A可被受體和非受體酪氨酸激酶二者，如EGFR、胰島素受體p60v-src和p561ck磷酸化[Chen等，1992]。體內(nèi)也鑒定到此種磷酸化，在用血清或EGF刺激或用p60v-src轉化的成纖維細胞中此種磷酸化增加，而血清饑餓使其減少[Chen等，1992]。毗鄰的Thr304磷酸化也與磷酸酶活性顯著喪失相關[Guo和Damuni，1993]。與Tyr307相反，看來Thr304是通過自身磷酸化激活的蛋白激酶作用而磷酸化，從而放大了最初的抑制信號。二種情況中，PP2A的作用是其自身的磷酸酶，因為用岡田酸或微囊藻素-LR抑制提高了磷酸化[Chen等，1994，Guo和Damuni，1993]。因此，去除抑制性刺激后PP2A可水解二者的磷酸基團而快速再生活性磷酸酶。PP2Ac也受羧基末端賴氨酸殘基L309的可逆性甲基化調(diào)節(jié)。亮氨酸羧基甲基轉移酶可催化此甲基化反應[Xie和Clarke，1994]，這看來是亞基正確結合形成活性三聚體所需[Wu等，2000，Tulstylch等，2000，Bryant等，1999]。磷酸酶甲基脂酶l(PME-l)可去除PP2A的甲基[Lee等，1996]。令人感興趣的是，據(jù)報導PME-1也能結合并明顯穩(wěn)定PP2A二聚體及三聚體的無活性構型，一種先前鑒定到的能刺激PP2A酪胺酰磷酸酶活性的磷酸酪胺酰磷酸酶激活劑(PTPA)可逆轉此情況[Cayla等，1994，Langin等，2004，VanHoof等，2005]。為了確定觀察到的硒酸鈉增強PP2A磷酸酶活性不依賴于對上游參與翻譯后調(diào)節(jié)成分的作用，測定了在存在或缺乏硒酸鈉時培育的從血紅細胞純化得到的人PP2AA-C異質二聚體的酶活性。在初步試驗中，采用了磷酸酶催化作用的化學底物對-硝基苯磷酸(pNPP)，其磷酸基團水解后可產(chǎn)生對-硝基苯酚，一種堿性條件下可溶解的深黃色色素。37。C將0.05單位的純化PP2A二聚體與5pM的硒酸鈉或500nM的岡田酸一起培育30分鐘，測定產(chǎn)生的對-硝基苯酚量，作為磷酸酶活性的讀數(shù)，與未處理對照樣品作比較。一式二份地測定各樣品的405nm吸光值，以590nm值為參比值。用以下公式計算PP2A活性活性-(樣品體積升數(shù))xA405/1.78x104M力cm(消光系數(shù))x0.25cmx15分x0.05U酶提供的數(shù)據(jù)是至少三次獨立實驗的磷酸酶相對平均活性士SEM。如圖4A(i)所示，即使用如此低濃度的純化酶，磷酸酶的活性也相當明顯，但與岡田酸一起培育完全消除了此活性。相反，PP2A與硒酸鈉一起培育觀察到的磷酸酶活性幾乎為三倍。接著通過檢測硒酸鈉對PP2AA-C二聚體由內(nèi)部蘇氨酸殘基上磷酸化的合成的6氨基酸肽釋放無機磷酸的作用的影響，來確定磷酸酶活性的增強是否為底物特異性。37。C培育0.01-0.05UPP2A與500pM磷酸化肽15分鐘，加或不加50pM硒酸鈉。酶活性釋放的無機磷酸量通過加入孔雀綠測定，讀取590nm吸光值。在存在鉬酸鹽和正磷酸鹽時孔雀綠形成穩(wěn)定的綠色復合物，得以檢測存在的無機磷酸濃度。提供的數(shù)據(jù)為至少三次獨立實驗的平均590mn吸光度土SEM。見圖4A(ii)所示，硒酸鈉再次使絲氨酸磷酸化肽因PP2A磷酸酶的作用而釋放的無機磷酸濃度升高二倍以上。PP1的催化亞基與PP2A的催化亞基具有大約50%的序列同源性，這是任何相關磷酸酶中最高的[Barton等，1994]。為了確定硒酸鈉刺激增強磷24酸酶活性是否對PP2A有特異性，測定了它對PP1活性的影響。37C培育從家兔骨骼肌純化的0.05UPP1與500jiM磷酸化蘇氨酸合成肽15分鐘，加或不加50nM硒酸鈉，游離磷酸的濃度如上所述用孔雀綠檢測。提供的數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均590nm吸光度士SEM。見圖4B所示，硒酸鈉不影響PP1的磷酸酶活性。敏麼斜不嚴聘戶PZ4效奪眾還嚴謬夢不斷增長的工作提示，可逆性氧化是負調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶的常見機制[Wang等，1996，Barrett等，1999，Sohn和Rudolph2003]。催化結構域中的保守性半胱氨酸殘基是它們酶活性的關鍵，但在氧化環(huán)境中，此結構域可能通過形成分子內(nèi)二硫鍵或磺酰胺鍵而受到修飾(圖5A)喪失了磷酸酶活性[Salmeen等，2003，Kwon等，2004]。鑒于硒化合物可能影響細胞的氧化還原狀態(tài)，研究了硒酸鈉通過減輕對氧化的抑制作用而激活PP2A的可能性。先測定硒酸鈉誘導的Akt去磷酸化是否對細胞氧還狀態(tài)敏感。在6孔板的每孔中接種5xl()S個PC3前列腺癌細胞，使細胞貼壁8小時，然后血清饑餓過夜。用或不用50(HiM以新鮮培養(yǎng)液配的硒酸鈉處理細胞，然后使其接觸0.25mM或1mM的過氧化氫10分鐘。分析等量全細胞裂解液，然后進行免疫印跡測定磷酸化AktSe,"的水平。與表達的Akt蛋白總水平作比較。如圖5B所示，用硒酸鈉處理細胞顯著降低了Akt磷酸化水平，并且不受緊急加入0.25mM過氧化氫的影響。相反，緊急接觸高劑量的lmM過氧化氫完全消除了硒酸鈉的去磷酸化作用，表明這種阻斷是氧還敏感的。使蛋白磷酸酶的可逆性氧化作用失活涉及到催化結構域中關鍵半胱氨酸的修飾，最終導致形成分子內(nèi)二硫鍵或磺酰胺鍵。為了確定硒酸鈉是否對PP2A的半胱氨酸有修飾作用，用Ellman試驗[Ellman，1958]定量測定各種處理后純化人PP2AA-C二聚體中游離巰基的數(shù)目。Ellman試劑(5，5，-二硫-二(2-硝基苯甲酸)，DTNB)能與游離的巰基迅速形成二硫鍵，伴隨釋放色素磺酸鹽離子。37。C培育0.01UPP2A與10mMN-乙基馬來酰亞胺(NEM)，或10mM過氧化氫，或10mM硒酸鈉，或10mM硒酸鈉和lOmM過氧化氫15分鐘。加入Ellman試劑然后檢測412nm吸光值來測定磷酸酶25中游離巰基的量(圖5C)。與NEM(—種巰基浣化劑)和過氧化氫二者培育后顯著降低了存在的游離巰基數(shù)目。相反，與硒酸鈉一起培育沒有作用，特別是不能保護PP2A的巰基不受到過氧化氫介導的修飾。實際上，過氧化氫對巰基的修飾在存在硒酸鈉時更顯著有效。接著用二乙酸2',7'-二氯二氫熒光素(DCFDA)測定硒酸鈉是否影響了完整細胞的氧還電勢。DCFDA無熒光可自由滲透入細胞，但在存在活性氧物質(ROS)時可快速轉變成不能滲透細胞但發(fā)出亮熒光的2',7'-二氯二氫熒光素(DCF)[Bass等，1983]。在60mm平板中接種1x1()6個PC3前列腺癌細胞，使細胞貼壁8小時，然后血清饑餓過夜。細胞用5pMDCFDA培育15分鐘然后處理。細胞用500pM硒酸鈉或lmMN-乙酰半胱氨酸(NAC)處理1小時，然后接觸500nM過氧化氫IO分鐘。用流式細胞儀測定熒光細胞比例。圖5D顯示各處理組的熒光分布圖。圖5E小結了三次獨立實驗的熒光細胞平均百分比。如預計的那樣，PC3細胞接觸過氧化氫導致胞內(nèi)氧自由基的顯著增加，如分布圖中峰形向右偏移所示。用硒酸鈉預處理細胞對熒光細胞的基礎比例無影響，不能保護細胞在接觸過氧化氫后不產(chǎn)生ROS。相反，用氫供體NAC預處理導致熒光細胞基礎比例的微小降低，特別是顯著減弱了過氧化氫所產(chǎn)生的ROS。小結這些數(shù)據(jù)表明，雖然硒酸鈉誘導的Akt磷酸化對細胞氧還狀態(tài)敏感，但硒酸鈉不能通過減輕固有、可逆的抑制性氧化作用而增強PP2A的磷酸酶活性。實蘑伊/5:敏虔辦育教/^M^驊廢艨話絲屋示秀庶欽錄,性PP2A是一種遍在的高表達蛋白質，估計占細胞總蛋白的0.1-l。/。[GallegoM和Virshup2005;Cohen，1997],涉及調(diào)節(jié)的蛋白底物數(shù)量不斷增加[Zhu等，2004;Woetmann等，2003;Silverstein等，2002]?？刂芇P2A底物特異性的機制尚不完全了解，但特異性調(diào)節(jié)B亞基的差異性結合看來至關重要[VanKanegan等，2005]。檢測了對于特定異質三聚體硒酸鈉刺激的PP2A磷酸酶活性增強是否不加選擇或有特異性。上面已證明，硒酸鈉能增強從PC3前列腺癌細胞免疫沉淀的Akt相關的磷酸酶活性，和硒酸鈉能直接刺激純化的PP2AA-C二聚體的磷酸酶活性。為了確定這種磷酸酶活性的增強是否遍在化，用500nM硒酸鈉或100pM內(nèi)皮肽A處理1小時和用抗PP2A催化亞基的單克隆抗體檢測從PC3細胞免疫沉淀得到的PP2A。使細胞裂解液通過脫鹽柱除去游離磷酸，用磷酸化絲氨酸酸肽和孔雀綠檢測磷酸酶活性。不同條件下免疫沉淀的PP2A的磷酸酶活性見圖6A，為三次獨立實驗的平均吸光度士SEM。用硒酸鈉處理PC3細胞不影響胞內(nèi)PP2A混合物的磷酸酶活性。相反，用PP2A磷酸酶特異性抑制劑內(nèi)皮肽A處理顯著降低了磷酸酶活性。檢測了硒酸鈉對另一種已知的PP2A底物p70S6K的作用[Peterson等，1999]。在6孔板的每孔中接種5xl()S個PC3前列腺癌細胞，使細胞貼壁8小時，然后血清饑餓過夜。用或不用500nM岡田酸預處理30分鐘，然后用50|iM的LY294002或500pM的硒酸鈉處理細胞1小時。用SDS-PAGE分析等量全細胞裂解液(75pg)，用能特異性識別Thr389位磷酸化的p70S6K蛋白的抗體作免疫印跡分析，測定p70S6K磷酸化水平。與蛋白加載對照卩微管蛋白作比較。如圖6B所示，即使在基礎條件下，p70S6K的磷酸化也很明顯，用PI3K抑制劑LY294002處理可消除此現(xiàn)象。與已知岡田酸是p70S6K磷酸化的負調(diào)節(jié)劑作用相符，用此酸抑制PP2A提高了所觀察的磷酸化水平。然而與硒酸鈉誘導Akt去磷酸化相反，在類似條件下p70S6K的磷酸化不受影響。嘗試了檢測前列腺癌細胞中哪個B亞基家族可與Akt形成復合物。在100mm平皿中接種2xl(^個PC3前列腺癌細胞，使細胞貼壁8小時，然后血清饑餓過夜。用ELB(—種溫和的洗滌劑緩沖液)裂解細胞。用泛-Akt單克隆抗體(1:100)和3(^1蛋白A瓊脂糖珠免疫沉淀500pg裂解液中的總Akt蛋白。陰性對照(空白)中省略免疫沉淀抗體。反復洗滌后在3xSDS蛋白加樣緩沖液中煮沸珠5分鐘，高速離心，用凝膠電泳分析得到的上清液。在同一凝膠上將lO(Hig全細胞裂解液跑電泳，用能特異性識別B或B'家族亞基的抗體檢測得到的膜。用識別泛-Akt的抗體檢測相同印跡斑證實已成功將Akt去除。如圖6C所示，此系統(tǒng)中只有B家族調(diào)節(jié)性亞基才能與Akt共沉淀，提示PP2Ac、A和R2B亞基家族成員的三聚體才能介導這些細胞中的Akt去磷酸化。實婦6胰島素的代謝作用受Akt的直接下游底物糖原合酶激酶3(GSK-3)介導。GSK-3是一種遍在表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能磷酸化和滅活糖原合酶。在對胰島素受體活化的反應中，Akt磷酸化和滅活了阻抑蛋白GSK-3，因而刺激了糖原的合成[Cross等，1995]。此外，GSK-3涉及對蛋白質翻譯的控制，細胞周期進程和Wnt信號傳遞[Diehl等，1998，Welsh等，1996，He等，1995]。為了測定硒酸鈉處理對GSK-3P活化的影響，接種PC3前列腺癌細胞，使細胞血清饑餓過夜，然后用新鮮培養(yǎng)液配的500pM硒酸鈉處理(圖7)所示的不同時間。用只能特異性識別Ser9位磷酸化(此位點是其激酶活性的關鍵位點)的GSK-3|3的抗體作免疫印跡分析全細胞裂解液，與作為加樣對照的細胞骨架蛋白(3微管蛋白相比較。對照泳道(0時)觀察到的高度磷酸化表明，PC3細胞中GSK-3(3基礎活化水平高。用硒酸鈉處理導致磷酸化顯著降低，l小時和3小時最大，6小時時間點回復到基礎水平。為定量測定硒酸鈉導致的抑制程度，制備數(shù)字化的免疫印跡結果，比較500pM硒酸鈉3小時與50LY2940021小時的效果，并測定GSK-3p磷酸化程度，光密度表示表達蛋白質的比例。硒酸鈉平均降低了GSK-3(3超過20%,而LY294002導致磷酸化水平降低約60%。實應伊/7..麻麼辦瓶求^伊疏賓麼遂！滯歩y:T/^/歪^激艨5游話眾為了測定硒酸鈉能否干擾PI3K通路的活性，用500nM硒酸鈉處理PC3細胞不同時間。用活化特異性抗體檢測全細胞裂解液中的Akt磷酸化狀態(tài)。因為即使不加入血清PTEN也會喪失，故(認為)Akt的Ser473和Thr308二個位點被強激活。加入硒酸鈉在接觸的IO分鐘內(nèi)誘導了Akt此二位點磷酸化增強。這種增強之后是顯著和長久的失活，同時細胞的總Akt(泛Akt)水平基本上維持不變。用500nM各化合物處理不同時間評估Akt的Ser473磷酸化(情況)，將硒酸鈉對激活PC3細胞Akt的作用與與硒甲硫氨酸相比較。如圖8所示，硒甲硫氨酸不影響所測定的所有時間點的Akt磷酸化水平，而硒酸鈉明顯抑制了Akt磷酸化。誘導J"去鏵麼眾^激力麼敏麼欽教,效鑒于硒酸鈉一直能誘導關鍵的激酶Akt深度去磷酸化而硒甲硫氨酸無此作用，測定了此能力是否為硒酸鈉所獨有或是與其它化學形式的硒所共有。測試了其它無機硒(硒酸鈉、二氧化硒、硫化硒和硒酸)和有機硒物質(甲基硒半胱氨酸、硒半胱氨酸)能否影響Akt活化。除了硫化硒溶于DMSO外，所有形式的硒均溶于水，以500pM濃度將它們加入血清饑餓的PC3細胞中1小時。分析全細胞裂解液，用能特異性識別AktSe一"位點磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測Akt該位點的活化狀態(tài)，以及Akt表達總水平(泛Akt)。為了定量測定Akt活化程度，將免疫印跡結果數(shù)字化，以光密度測定磷酸化Akt與總Akt的比例。圖9小結了三次獨立實驗測定的磷酸化Akt與總Akt蛋白水平的平均比例士SEM。與未處理細胞相比，用500pM硒酸鈉處理PC3細胞1小時導致Akt的Ser473位磷酸化降低80%以上(p<0.05，斯氏t-檢驗)。相反，在相同條件下用其它無機和有機硒物質處理PC3細胞對Akt磷酸化程度無顯著影響。小結這些數(shù)據(jù)表明誘導Akt去磷酸化的能力是硒酸鈉獨有的。實蘑激入獰裔PP24話絲游激力老敏麼辦救,游在實施例7中，數(shù)據(jù)顯示所有測試的化學形式硒中，只有硒酸鈉能顯著誘導Akt去磷酸化。為了明確對PP2A活性的不同影響可否解釋這種特異性，在pNPP水解試驗中分別用pNPP和絲氨酸磷酸肽作為底物，比較了硒酸鈉(5mM或50pM)、亞硒酸鈉(5mM或50nM)和硒甲硫氨酸(5mM或50nM)對PP2A磷酸酶活性的影響(圖IOA和10B)。與觀察到的用硒酸鈉明顯增強磷酸酶活性相反，亞硒酸鈉或硒甲硫氨酸均不顯著影響PP2A磷酸酶活性。實施例1一9的材料和方法試劑^^^系實驗程序中所用的哺乳動物細胞系詳情列于表1中。__細胞系起源來源參考文獻^衍生自62歲高加索男性IV級ATCC「KaighnME等，前列腺腺癌的骨轉移1979)所有培養(yǎng)物維持在含5%或10%二氧化碳的37°C富馬科技公司(FormaScientific)培養(yǎng)箱中，按照標準在培養(yǎng)液RPMI1641中加入L-谷氨酰胺(吉布科英杰公司(GibcoInvitrogen)#11875-119)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100pg/ml)和兩性霉素B(25ng/ml)(吉布科英杰公司#15240-062)。作為常規(guī)，細胞用5%或10%胎牛血清(吉布科英杰公司#10099-141)培養(yǎng)，除非另有說明。將接近鋪滿的細胞用胰蛋白酶-EDTA(吉布科英杰公司M5400-054)消化后傳代。辦效郝做沐在上述實驗中釆用了許多商品購得的第一抗體和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的或熒光標記的或生物素化的第二抗體，其詳細情況小結如下.-兔抗-Akt多克隆抗體，商品目錄號9272，細胞信號轉導技術公司(CellSignallingTechnology,CST》小鼠抗-Akt(5G3)單克隆抗體，商品目錄號2966，CST;兔抗磷酸化Akt(ser473)多克隆抗體，商品目錄號9271，CST;兔抗磷酸化GSK3(3(ser9)多克隆抗體，商品目錄號9336，CST;不同的抗-PP2A抗體，商品目錄號05-421、06-2221、07-334和05-592，安普斯特公司(Upstate)。'、驊廢艨鄰激浙布錄眾游錄;表2:激酶和磷酸酶抑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>餅發(fā)、審棘潛養(yǎng)基所有溶液貯存在室溫(RT)除非另有說明。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>硒化合物硒酸鈉購自西格瑪公司(Sigma)。所有溶液用蒸餾水新鮮制備，按說明濃度使用。蛋白表達SZW-^兩辨激嚴凝皮冶妖(37^-iMG②按說明處理后，用PBS洗滌培養(yǎng)的細胞一次，然后4。C在細胞刮刀幫助下，用含蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學公司的蛋白酶抑制劑混合物，編號#539131)和磷酸酶抑制劑(10mM正釩酸鹽和10mM氟化鈉)的雞蛋裂解緩沖液(ELB)或RIPA裂解緩沖液裂解細胞。4°C，14,000rpm離心15分鐘澄清樣品液，用上清液分析。用二辛可寧酸溶液試驗(BCA)檢測樣品的蛋白濃度。取lpl裂解液在96孔板中用蒸餾水作l:25稀釋。各樣品中加入200pl二辛可寧酸溶液和4%(w/v)硫酸銅的80:1溶液，37°C培育30分鐘。檢測一系列蛋白標準液的590nm吸光度(珀金埃爾瑪公司(PerkinElmer)MBA2000)。用變性聚丙烯酰胺凝膠(包括濃縮膠和分離膠)電泳分析蛋白質樣品。將不同濃度的50-100pg蛋白質加到SDS-PAGE凝膠上。在加樣前加入與樣品相等體積的SDS樣品緩沖液100°C煮沸5分鐘。以大約100V跑凝膠電泳。利用各凝膠上加有的蛋白大小標記(伯樂萬花筒(BioradKaleidoscope))評估感興趣蛋白質的分子量。Western印跡分析將(電泳)分離的蛋白質轉移到PVDF膜(ImmobilonP，密理博公司(Millipore))后，將此膜浸入100%甲醇中10分鐘，用蒸餾水淋洗，用印跡轉移緩沖液平衡，室溫IOOV轉移1.5小時或4。C過夜。用TBS-T洗滌膜5分鐘后讓其干燥1小時。用含3%奶粉和0.1%吐溫的TBS室溫封閉1小時。用TBS-T洗滌此膜5次后，與用3%奶粉/0.1%TBS-T或3%BSA/0.1%TBS-T稀釋的第一抗體在室溫下輕輕攪拌培育l一2小時或4°C培育過夜。用0.1%TBS-T洗滌5分鐘三次，將此膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體(用封閉緩沖液配)一起培育。再洗滌此膜5分鐘三次，然后用SuperSignalWestDura時間延長底物(皮爾斯公司(Pierce)弁34075)或ECLWestern印跡檢測試劑(安瑪西亞生物科學公司(AmershamBiosciences)#RPN2106)進行增強化學發(fā)光反應，以檢測抗體結合。用CL-曝光膠片(柯達公司(Kodak))記錄放射自顯影的發(fā)光。初步分析免疫印跡條帶后用膜剝離緩沖液(62.5mMTRISpH7，2%SDS，7%P-巰基乙醇)60°C剝離15分鐘，以TBS-T洗滌三次后封閉，可用于再探測。光密度分析用Vista數(shù)字掃描儀(優(yōu)麥公司(Umax))以第8版科勒爾照片繪圖軟件(CorelPhoto-Paint)(科勒爾公司(CorelCorporation))將有關免疫印跡條帶轉換成.tif文件。采用為Windows設計的專業(yè)圖像軟件(Image-Pro-Plus)V4.5丄22版(媒體控制公司(MediaCybernetics))進行光密度分析。采用線性校正法，其中白色值設為0，黑色值設為225，選擇對應于有關條帶的感興趣區(qū)域測定其信號強度。免疫沉淀在轉臺上的微量離心管中將100-500pg的全細胞裂解液與1:100稀釋的不同抗體在室溫下培育l-2小時或4。C培育16小時。簡單離心后，各管加入30-40^1的預先洗滌過的50%蛋白A瓊脂糖快速流動珠(西格瑪#9424)，室溫或4。C轉動1小時。簡單離心后，棄上清液用500pl細胞裂解緩沖液洗滌沉淀。如此洗滌三次后用珠作酶試驗，或用3xSDS蛋白加樣緩沖液煮沸5分鐘洗脫蛋白質，在SDS-PAGE凝膠上分析。磷酸酶試驗將純化的人PP2A和兔PP1用提供的稀釋緩沖液稀釋到0.01U/pl，分裝等份-20。C保存。用純化磷酸酶進行的磷酸肽試驗將1mg合成的磷酸肽K-R-pT小R-R(安普斯特公司#12-219)和R-R-A-pS-V-A(安普斯特公司弁12-220)溶于1.10-1.285ml蒸餾水中制備1mM溶液，然后分裝等份-20。C保存待用。將從人血紅細胞純化的0.01-0.05U純化PP2AA-C二聚體，或0.05U由骨骼肌純化的兔PP1與500pM磷酸肽混合，在存在的所示不同處理條件下在37°C加熱塊上培育15分鐘。各反應物總體積為25pi,由pNPP緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.0，100CaCl2)組成。加入100pl孔雀綠溶液(用10mM鉬酸銨、1NHC1、3.4%乙醇、0.01%吐溫-20液配制的0.034。/?？兹妇G)終止酶反應?？兹妇G在存在鉬酸鹽和正磷酸鹽時可形成穩(wěn)定的綠色復合物，得以檢測無機磷酸存在的量。讀取每個樣品一式二份590nm的吸光度。PP2A免疫沉淀和磷酸酶試驗將lxl()S個PC3前列腺癌細胞接種在60mm平板上，讓其貼壁8小時然后血清饑餓過夜。如所示進行各種處理后，吸棄培養(yǎng)液，細胞用TBS洗滌一次。用0.3ml裂解緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.0，1%Igepal-CA，2mMEDTA，2mMEGTA，lx蛋白酶完全抑制劑混合液)裂解細胞，使裂解液通過2mlZeba脫鹽離心柱(皮爾斯公司#89890)除去磷酸。脫鹽后裂解液所含蛋白嘗試用上述BCA試驗檢測。用4嗎抗PP2A單克隆抗體和30nl蛋白A瓊脂糖珠漿液4。C免疫沉淀100-150pg總蛋白2小時。14,000rpm離心樣品1分鐘，用過量TBS洗滌三次，pNPP試驗緩沖液洗滌一次。最后一次離心后小心除去所有的上清液，在珠中加入500nM磷酸蘇氨酸肽，終體積80^。30。C攪拌培育樣品IO分鐘，加入孔雀綠溶液終止反應。讀取每個樣品一式二份5卯nm的吸光度。pNPP水解試驗對-硝基苯磷酸(pNPP)是磷酸酶的一種化學底物，磷酸部分水解后產(chǎn)生對-硝基苯酚是一種深黃色色素，在堿性條件下可溶。檢測磷酸酶相對活性的試驗，在微離心管中將0.05U純化的PP2A與5p140mMNiCl2和5plBSA液(5mg/ml)混合。如所示加入不同的處理液，用pNPP試驗緩沖液調(diào)體積至80)iil。樣品37°C預培育15分鐘。每次試驗前新鮮配制pNPP底物液，將用50mMTris-HCl，pH7.0溶解pNPP至1.5mg/ml。為啟動磷酸酶反應，加入120plpNPP，37。C再培育樣品15分鐘。檢測每個樣品一式二份的405nm吸光度，以590nm吸光度作參比。用以下公式計算PP2A活性活性=(樣品體積升數(shù)八A405/1.78x1()4M力cm(消光系數(shù))x0.25cmx15分x0.05U酶檢測游離巰基總含量用Ellman試劑檢測不同處理后純化PP2A中游離巰基的變化。將0.01UPP2A加到37.5nl稀釋緩沖液(30mMTris-HCl，3mMEDTA，pH8.2)、12.5nlDTNB試劑(Ellman試劑)和200|il甲醇中，室溫培育樣品5分鐘，然后檢測每個樣品一式二份的412nm消光(extinction)。結果與用N-乙酰半胱氨酸產(chǎn)生的標準曲線相比較。Akt激酶活性試驗用K-LISAAKT活性試劑盒(卡爾生物化學公司弁CBA019)檢測硒酸鈉對重組人Aktl激酶活性的影響。此ELISA試驗采用生物素化的肽底物(GRPRTSSFAEG)，其第二個絲氨酸可被Aktl、Akt2、Akt3、SGK(血清糖皮質素激酶)和MSK1磷酸化。生物素化的Akt底物和Akt樣品在鏈霉親和素包被的96孔板孔中與ATP—起培育，得以在一步中磷酸化和捕獲底物。用磷酸絲氨酸檢測抗體檢測磷酸化的底物，然后用HRP-抗體偶聯(lián)物處理，用TMB底物顯色檢測。每次試驗開始時，用蒸餾水l:IOO稀釋生物素化Akt底物貯存液制備其新的工作液等份。按以下順序加入各孔10^15x激酶試驗緩沖液；lOpl生物素化Akt底物工作溶液；含250ng重組人Aktl的10pi蒸餾水；含500pM硒酸鈉或l^M星孢素的10pi蒸餾水，或只用水的陽性對照；10^5xATP/MgCl2混合液，每孔總體積50pl。用密封條密封平板，微孔板振蕩器上簡單混合，37。C培育30分鐘。各孔加入10^激酶終止液終止激酶反應。倒棄各孔中內(nèi)容物，用lxELISA洗滌液(將ELISA貯存液用水1:20稀釋制制備)洗滌三次，倒置在印跡紙墊上拍打干。各孔加入ioow磷酸絲氨酸檢測抗體工作溶液(用蒸餾水1:1000稀釋磷酸絲氨酸抗體貯存液制備)室溫培育1小時。如上所述洗滌平板。然后各孔加入100plHRP-抗體偶聯(lián)物工作溶液(每次試驗全部用蒸餾水1:1000稀釋HRP-抗體貯存液得以新鮮制備)室溫培育1小時。再如上所述洗滌平板。各孔加入IO(HUTMB底物，室溫發(fā)色20分鐘。各孔加入100plELISA終止液以停止反應，用微孔板讀板儀讀取450nm吸光度，以590nm吸光度為參比。細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)試驗細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)可用二乙酸2',7'-二氯二氫熒光素(DCFDA)測定。DCFDA無熒光，可自由滲透入細胞，但在存在活性氧物質(ROS)時可快速轉變成不能滲透細胞但具有亮熒光的2'，7'-二氯二氫熒光素(DCF)。先用5pMDCFDA平衡細胞15分鐘再進行不同處理。然后收獲貼壁細胞，用PBS洗二次，用流式細胞術立即檢測熒光細胞比例。本文所引用的每一項專利、專利申請和出版物，其內(nèi)容納入本文作參考。本文對任何參考文獻的引用不代表承認這些參考文獻是本申請的"現(xiàn)有技術"。本說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，而不是將本發(fā)明限制于任何一種實施方式或具體的特征集合。因此，本領域技術人員將明白，借助本文可對示范性的具體實施方式進行各種修改和變化，但這不脫離本發(fā)明的范圍。所有這類修改和變化都包括在附件權利要求書的范圍內(nèi)。實施例10:硒酸鹽對小鼠腦組織和人神經(jīng)母細胞瘤細胞系tau蛋白磷酸化的影響材料和方法細胞培養(yǎng)。人神經(jīng)母細胞瘤細胞SY5Y禾BBE2M17細胞獲自JanettaCulvenor(墨爾本大學病理學系，VIC)。SY5Y細胞常規(guī)培養(yǎng)在添加10%胎牛血清(FBS，英杰公司(Invitrogen)，吉布科(GIBCO))、1%非必須氨基酸(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，StLouis，MO，USA))、10mMHEPES(英杰公司，吉布科(GIBCO))、lmM丙酮酸鈉(英杰公司，吉布科(GIBCO))禾卩1。/。抗生素/抗霉菌素混合物(Invitrogen,GIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)基(新西蘭奧克蘭的英杰公司(Invitrogen，Auckland,NewZeal))中，。BE2M17細胞培養(yǎng)在添加1。/。FBS(英杰公司，吉布科)、1%非必須氨基酸(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)、10mMHEPES(英杰公司，吉布科)、1mM丙酮酸鈉(英杰公司，吉布科)和1%抗菌素/抗霉菌素混合物(英杰公司，吉布科)的OPTI-MEM1血清減少的培養(yǎng)基(英杰公司，吉布科)中。37°C/5%C02培養(yǎng)細胞。硒酸鈉獲自西格瑪公司(美國密蘇里州圣路易斯)?？贵w除非另有說明，以下抗體均購自美國洛克福特(Rockford，USA)的皮爾斯公司(Pierce)Endogen:抗人PHF-Tau單克隆抗體(克隆AT100;AT180;AT270)和抗人Tau單克隆抗體(克隆HT-7)。多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP37(丹麥大科公司(Dako，Denmark))和抗微管蛋白(G712A，普洛麥格公司)。體外試驗在有包被或無包被表面的Falcon6孔板每孔中接種2x105個SY5Y或B2M17細胞，在5%C02/37°C和完全生長培養(yǎng)基中讓其貼壁過夜(如前所述)。用含100nM濃度硒酸鈉的新鮮完全生長培養(yǎng)基置換舊培養(yǎng)基，培養(yǎng)3小時。細胞培養(yǎng)在用0.1%明膠(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)、基質膠(目錄號#354234，BD，NSW，澳大利亞)或用0.5fxg/ml纖連蛋白(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)包被表面的Falcon6孔板中。體內(nèi)試驗14周齡Balb/CNuNu雄小鼠購自ARC。小鼠接受300嗎硒酸鈉/200plPBS的一次皮下注射。注射后在不同時間點處死小鼠，收集血、液和腦標本。制備裂解液和免疫印跡用冷PBS洗滌細胞，用150pl冷RIPA緩沖液(含10%甘油、20mMTris、137mMNaCl、0.1%SDS、0.05%IGEPAL、1%TritonX-IOO、2mMEDTA、10%NaV、2%NaF和4X蛋白酶抑制劑)裂解，類似地，在干冰上用研缽和碾槌勻漿腦組織，用150(!lRIPA緩沖液裂解。冰上培育樣品30分鐘，然后4。C，13000rpm離心10分鐘。收集上清液用BCA試劑(Sigma)計算各樣品的蛋白估計值。將等量蛋白加到10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠的各泳道中。(電泳后)將蛋白轉移到PVDF膜(密理博公司)上用5%脫脂奶粉溶液封閉2小時。封閉膜后加入第一抗體或抗人PHF-Tau抗體(ATlOO為1:200;AT180為1:1000;AT270為1:2500)，或抗人Tau蛋白抗體(HT-7為1:1000)，在5%脫脂奶粉溶液中4°C培育過夜。加二抗培育前，用含0.01%吐溫的Tris緩沖鹽水室溫淋洗膜三次3x5分鐘。然后加入用5%脫脂奶粉溶液1:10000稀釋的偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠多克隆第二抗體(丹麥大科公司)，室溫培育1小時。按上述洗滌膜用安瑪西亞ECLwestern印跡檢測試劑(英國白金漢郡的安瑪西亞生物禾斗學公司(AmershamBioscience，Buckinghamshire，UK))檢測。用20/。SDS/(3-巰基乙醇剝離緩沖液剝離膜，重新探測微管蛋白(普洛麥格)以驗證蛋白加樣量。在存在(+)或缺乏(_)硒酸鈉時，在不同包被表面用抗人PHF-Tau抗體免疫印跡人神經(jīng)母細胞瘤BE2M17細胞系，見圖ll所示。BE2M17完全培養(yǎng)基中含100pM硒酸鈉。在纖連蛋白包被、未包被(塑料)或基質膠包被的表面上用硒酸鈉培養(yǎng)細胞3小時(如方法章節(jié)中所述)。結果在6Mi^必搶,/教貧乂iWF-7Vi"克虔爿77卯。培養(yǎng)在纖連蛋白和基質膠表面上的細胞在硒酸鈉存在時的PHF-Tau信號似乎比不用硒酸鹽處理的細胞更低。在7M/M浙必檢,教貧乂iWF-7Viw^"虔v477卵。培養(yǎng)在纖連蛋白、塑料(未包被)和基質膠上的硒酸鈉處理細胞的PHF-Tau信號似乎比不用硒酸鹽處理的細胞更弱。培養(yǎng)在基質膠上的細胞在67kDa產(chǎn)生的PHF-Tau信號比纖連蛋白和塑料上培養(yǎng)的細胞更強。在界6MZM必檢,/^/貧乂^^虔爿r27tf。培養(yǎng)在纖連蛋白、塑料(未包被)和基質膠上的硒酸鈉處理細胞的PHF-Tau信號似乎比不用硒酸鹽處理的細胞更弱。注意，培養(yǎng)在基質膠上的硒酸鈉處理和不處理的細胞之間只有輕微差異。在68、64和57kDa檢測到抗人PHF-Tau克隆HT-7。在纖連蛋白上培養(yǎng)硒酸鈉處理的細胞似乎能降低Tau蛋白的表達。抗微管蛋白檢測顯示蛋白加樣量相等。在存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時，在不同培養(yǎng)表面用抗人PHF-Tau抗體免疫印跡人神經(jīng)母細胞瘤SY5Y細胞系，見圖12所示。SY5Y完全培養(yǎng)基中含100nM硒酸鈉。在明膠、纖連蛋白、未包被(塑料)或基質膠包被表面上用硒酸鈉培養(yǎng)細胞3小時(如方法章節(jié)中所述)。結果在7MZ^必錄^絲檢,教貧乂iWF-rfl"克虔爿m相比，培養(yǎng)在明膠和纖連蛋白表面上的硒酸鹽處理細胞的PHF-Tau信號似乎比不用硒酸鈉處理的細胞更弱。在6^D"必檢,/身貧乂^^廣flT-7?；|膠和纖連蛋白似乎降低了抗Tau信號。具體說，培養(yǎng)在纖連蛋白表面用硒酸鈉處理的細胞的39抗Tau信號似乎比不用硒酸鈉處理的培養(yǎng)細胞更弱?？刮⒐艿鞍讬z測顯示蛋白加樣量相對等量。用抗人PHF-Tau免疫印跡14周齡Balb/CNuNu雄小鼠存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時的全腦裂解液(如指示的那樣)，見圖13。皮下注射1.5嗎/pl硒酸鈉處理小鼠，不注射硒酸鈉的小鼠(-)皮下注射PBS。在不同時間點0、2和6小時收集腦組織(如方法章節(jié)中所述)。結果PBS似乎對所有研究的克隆(AT100，AT180禾BAT270)抗人PHF-Tau信號有影響。為驗證蛋白加樣量相等，按方法章節(jié)中所述剝離所有膜，并再檢測微管蛋白。圖13A顯示抗人PHF-Tau克隆AT100在60kD處有免疫反應。存在硒酸鈉時的2和6小時時間點，PHF-Tau信號似乎比不用硒酸鈉處理的細胞低。圖13B顯示抗人PHF-Tau克隆AT180在60kD處有免疫反應。存在硒酸鈉時的2和6小時時間點，PHF-Tau信號比不用硒酸鈉處理的細胞顯著降低。圖13C顯示AT270的免疫反應信號與AT180克隆相似?？磥鞟T270克隆能檢測到73、70和60kDa的三種PHF-Tau蛋白同工型。圖13D顯示在存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時小鼠全腦裂解液中的Tau蛋白表達?？谷薚au蛋白，特別是克隆HT-7在小鼠腦組織中似乎無特異性。實施例11:硒酸鈉對過度表達人Tau441轉基因小鼠(TMHT)的行為和腦Tau蛋白病理學的影響方法岸享設計此項研究以評價用硒酸鈉治療對過度表達在腦特異性小鼠Thy-l啟動子控制下的人TAU441基因(含二處突變V337M和R406W)的TAU441轉基因(Tg)TMHT小鼠(C57BL6背景)的行為和腦形態(tài)的影響。評價治療后1.5和3個月在開場(OpenField，OF)試驗、旋轉桿(RotaRod，RR)試驗和伸鼻(Nosepoke)好奇心和活動試驗(后者是評價好奇心行為的試驗)中所有Tg小鼠的行為。治療結束時另在莫利斯(Morris)水迷宮(MWM)試驗中評價記憶和學習能力。也用OF試驗、RR試驗、鼻觸試驗和MWM任務測定未治療的基線組小鼠。先檢測每個治療組3只動物的腦TAU病理學變化。動欽所用的TgTMHT雄性和雌性小鼠表達人TAU441，其攜帶有在腦特異性小鼠Thy-l啟動子調(diào)控下的錯義突變V337M和R406W。在奧地利格拉茨的JSW研究中心(JSW-Research，Graz，Austria)中繁殖和育種小鼠。這些小鼠的C57BL/6背景導致小鼠具有所知的良好學習能力。此小鼠模型類似于人阿爾茨海默病的Tau蛋白病理。治療開始時小鼠為5個月士2周齡，這也是基線組的年齡。動激辨W浙銜養(yǎng)小鼠靠耳環(huán)標記辨認，飼養(yǎng)在單個通風籠子(IVC)中，籠子中裝有由ABEDD⑧提供的標準鼠類草墊。每只籠子最多裝5只小鼠。按照基于國際標準的標準操作規(guī)程保持飼養(yǎng)小鼠。每只籠子用顏色卡片辨認，表明研究的動物數(shù)目、性別、個體登記號(IRN)、出生日期及篩選日期和治療組分配。研究期間的溫度維持在大約24。C，相對濕度維持約40—70%。在恒定的光照周期(12小時光照/黑暗)下飼養(yǎng)動物。動物可自由獲得干燥的顆粒狀鼠類餅干(Altromin⑧)和普通自來水。潛伊將小鼠隨機分配到A組(硒酸鈉)、B組(運載體)和C組(基線)。治療組A通過飲水接受硒酸鈉12周，而對照組(B)小鼠可飲用普通自來水。為了應用，將1.2mg硒酸鈉溶于100ml滅菌水，記錄重量，將水瓶放在籠子中，每周一、三、五這樣做，換瓶時測定消耗的水重量。行為試驗開場^#,最標準化的通用運動功能檢測是開場(OF)試驗中的自主活動。本項研究采用Plexiglas開場(48x48cm;TSE-System⑧)試驗。將紅外光束置于盒子周圍1.4cm距離。為檢測后腿站立，將另一排光束固定在第一束光上方4cm處。測試持續(xù)5分鐘以檢査小鼠在新環(huán)境中的行為和習慣。然后，計數(shù)糞團數(shù)目作為情緒激動的衡量。每只鼠活動后用70%乙醇清洗OF去除味道痕跡。試驗在標準的晝夜節(jié)律光照期室內(nèi)光照條件下進行。應存^f^11^利用該試驗來檢測TAUTg小鼠可能的運動缺陷。在加速的5道旋轉桿(TSE-Systems⑧)上進行研究。小鼠必須在最多300秒內(nèi)完成程序。它們開始時的速度為5rpm，120秒后桿旋轉速度達到60rpm。此后，計算出跌倒的潛伏期和當時的速度。辦葬好^A浙薪動試驗洞板裝置提供檢測小鼠對新環(huán)境反應的簡單方法，其優(yōu)點是利用了小鼠的好奇心和它們將鼻子伸入洞內(nèi)的傾向。在裝配有洞板(每板16個洞)的OF盒中進行好奇心行為研究。頭伸入洞即阻斷了剛好裝在每只洞邊緣下方的紅外光束。計算出每只動物在5分鐘內(nèi)頭伸入的次數(shù)和時間。,符資水迷宮(M『i^試驗莫利斯水迷宮(MWM)試驗在直徑100cm的黑色圓形水池中進行。水池裝滿自來水，溫度22士1。C，水池實際上分成4區(qū)。透明平臺(直徑8cm)安置在水表面下方約0.5cm處。整個試驗期間，除了預測試，平臺都位于水池的西南1/4區(qū)。在4天持續(xù)訓練課程前一天，動物必須進行所謂的"預試驗"(二次60秒試驗)以確保每只動物的視力正常。只有完成這種試驗的動物才繼續(xù)MWM試驗。在MWM任務中，每只小鼠必須在連續(xù)4天內(nèi)進行三次試驗。一次試驗持續(xù)最長一分鐘。在這段時間，小鼠有機會找到隱藏的模糊目標。如果動物不能找到離開水的"路"，研究人員可引導或將此小鼠放到平臺上。每次訓練后讓小鼠在平臺上休息10—15秒。此時小鼠可能弄清周圍的方向。研究在昏暗的光照條件下進行以防止跟蹤系統(tǒng)受到不良影響(Kaminski;PCS，生物醫(yī)學研究系統(tǒng)公司(BiomedicalResearchSystems))。在水池四周池壁上，貼有固定的黑色醒目的幾何符號(如園圈和方塊)，使小鼠可利用這些符號作為定向標志。每次游泳訓練一組有5—6只小鼠，以保證訓練間隙約5—10分鐘。為了定量測定逃脫潛伏期(小鼠找到隱藏的平臺而從水中逃脫的以秒計的時間)、路徑(以米計的到達目標的游泳軌跡長度)和在目標1/4區(qū)停留的時間，采用計算機處理的跟蹤系統(tǒng)。將計算機連接于水池中央上方放置的照相機。用照相機檢測用小發(fā)夾固定在小鼠尾巴上的發(fā)光二極管(LED)的信號。凍縈試驗^P/^e7W^:第4天最后一次訓練后1小時，小鼠必須完成所謂的探索試驗。此時，拆去水池中的平臺，在一分鐘探索試驗中，實驗者計算出(小鼠)穿越先前平臺位置的次數(shù)。測定在此1/4區(qū)停留的時間。組織的制備和取樣治療結束和完成所有的行為測試后，處死各動物，采集血液(血漿和血清)、CSF和腦，立即加工或貯存待進一步實驗。為此目的，用標準吸入麻醉劑(異氟垸，Baxter)鎮(zhèn)定所有小鼠。鈍性解剖并暴露枕骨大孔，獲得腦脊液。暴露時，將巴斯得(Pasteur)移液器尖頭插入枕骨大孔內(nèi)約0.3-lmm深處。依靠抽吸和毛細管作用收集CSF直到液流完全停止。立即-80。C凍存各樣品，直到用ELISA進行分析。CSF取樣后，將各小鼠置于背平臥位，用套在1ml注射器上的26號針頭插入胸腔通過橫隔膜深入約2cm。向針頭施加輕微吸力，通過回血確認已將針頭置于小鼠的心室中。抽取血液直到血流停止。將血液收集在EDTA小瓶中-20。C保存待用。采集轉基因小鼠血樣后心內(nèi)灌注0.9%氯化鈉。迅速取出腦，右半側浸沒在新配制的4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋作組織學檢査。左半球在干冰上凍結，于-80。C保存用于隨后可能進行的生化分析。先進行9個腦半球(每個Tg小鼠組^3個)的組織學評價以定量和定性評價Tau蛋白病變。按照Paxinos和Franklin編著的"小鼠腦"(TheMouseBrain)(第2版)的形態(tài)學實驗集選擇在大腦前鹵的-1.82與-1.34mm之間的不同5層，在各層中切取厚5pm的15張冠狀連續(xù)切片(LeicaSM2000R)，作Gallyas染色，用特異性抗體(AT180和HT7)檢測Tau蛋白病理變化。以精確相同的方法操作研究的所有轉基因小鼠組織以避免由于此方法的差異引起的偏差。保存和儲存未使用的剩余的腦半球或組織，直到負責人決定如何處理或直到研究結束。^度教眾檢漱7Vi"^A癰潘變眾用單克隆TAU-抗體AT180和HT7(皮爾斯公司Endogen⑧)檢測Tau蛋白的沉積。AT180能識別PHF-TAU和形成的纖維纏結[此抗體識別的表位是磷酸化的Thr231殘基]，HT7識別正常人Tau蛋白及PHF-TAU[此抗體識別的表位在人Tau蛋白的殘基159與163之間]。用上述單克隆小鼠抗人Tau蛋白抗體(AT180—l:100;HT7—1:1000)處理不同5層各層的5pm厚冠狀石蠟切片，用抗小鼠Cy3二抗(1:500，杰克遜實驗室公司(JacksonLaboratories))顯色。染色的詳細方法見下檢測人PHF-TAU蛋白沉積的AT180培育方法1.)使組織切片通過組織清洗液(櫻花(Sakum)⑧)和一系列等級酒精(Merck⑧)脫蠟和水化。2.)用重蒸餾水(Fresenius-Kabi⑧)洗滌2分鐘。3.)將組織切片置于10。/。檸檬緩沖液(Labvision⑧)中在95°C蒸氣中蒸15分鐘然后冷卻到室溫15分鐘，以便進行抗原暴露(unmasking)4.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。5.)室溫用1。/。過氧化氫(Linaris⑧)的甲醇(Merck⑧)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘。6.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。7.)在潮濕室中用MOM-封閉試劑(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結合60分鐘。8.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。9.)用MOM-稀釋液(Vector㊣)在室溫下封閉非特異性結合5分鐘。10.)在潮濕室中與AT180(皮爾斯公司Endogen;用MOM-稀釋液1:100稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。11.)用PBS洗滌切片3x5分鐘。12.)在潮濕室中用10。/。非免疫山羊正常血清(Dako⑧)封閉非特異性結合10分鐘。13.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。14.)在潮濕室中與Cy3山羊抗小鼠抗體(Jackson⑧；用MOM-稀釋液1:500稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。15.)用PBS洗滌切片5分鐘。16.)用重蒸餾水洗滌切片5分鐘。17.)用香柏油(Moviol)和蓋玻片覆蓋切片?；瘜W試劑1%過氧化氫的甲醇溶液60mL甲醇+2mL30%過氧化氫+0.6mLTritonX-100(Amresco)。MOM-封閉試劑2滴MOM-小鼠IgG封閉試劑(來自MOM-試劑盒(Vector⑧))+2.5mLPBS。MOM-稀釋液10mLPBS+800蛋白濃縮液(來自MOM-試劑盒(Vector⑧))。抗體AT180:用MOM-稀釋液1:100稀釋抗體Cy3山羊抗小鼠用MOM-稀釋液1:500稀釋檢測正常人Tail蛋白和PHF-Taii蛋白沉積的HT7培育方法1)使組織切片通過組織清洗液(櫻花(Sakura)⑧)和一系列等級酒精(Merck⑧)脫蠟和水化。2)用重蒸餾水(Fresenius-Kabi⑧)洗滌2分鐘。3)將組織切片置于10。/。檸檬緩沖液(Labvision⑧)中在95°C蒸氣中蒸15分鐘然后冷卻到室溫15分鐘，以便進行抗原暴露。4)用PBS洗滌切片2x5分鐘。5)室溫用"/。過氧化氫(Linaris⑧)的甲醇(Merck⑧)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘。6)用PBS洗滌切片2x5分鐘。7)在潮濕室中用MOM-封閉試劑(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結合60分鐘。8)用PBS洗滌切片2x5分鐘。9)用MOM-稀釋液(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結合5分鐘。10)在潮濕室中與HT7(皮爾斯公司Endogen;用MOM-稀釋液1:100045稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。11)用PBS洗滌切片3x5分鐘。12)在潮濕室中用10。/。非免疫山羊正常血清(Dako⑧)封閉非特異性結合IO分鐘。13)用PBS洗滌切片2x5分鐘。14)在潮濕室中與Cy3山羊抗小鼠抗體(Jackson⑧；用MOM-稀釋液1:500稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。15)用PBS洗滌切片5分鐘。16)用重蒸餾水洗滌切片5分鐘。17)用香柏油(Moviol)和蓋玻片覆蓋切片。化學試劑1%過氧化氫的甲醇溶液60mL甲醇+2mL30%過氧化氫+0.6mLTritonX-100(Amresco)。MOM-封閉試劑2滴MOM-小鼠IgG封閉試劑(來自MOM-試劑盒(Vector))+2.5mLPBS。MOM-稀釋液10mLPBS+800蛋白濃縮液(來自MOM-試劑盒(Vector))?？贵wHT7:用MOM-稀釋液1:100稀釋抗體Cy3山羊抗小鼠用MOM-稀釋液1:500稀釋評價療為在開場(OF)試驗中，檢測了水平和垂直運動、排便次數(shù)、直立次數(shù)和持續(xù)時間、過度活動及在開場中心與外圍消耗的時間比例在伸鼻好奇心和活動試驗中，計算了小鼠頭伸入(洞)的次數(shù)和持續(xù)時間。在旋轉桿(RotaRod)試驗中，計算了跌倒的潛伏期和當時的桿旋轉速度。在莫利斯水迷宮(MWM)試驗中,記錄了游泳路徑的長度和逃離潛伏期。游泳速度的計算方法為游泳路徑長度除以逃離潛伏期。在探索試驗中，拆去平臺進行試驗，在記錄紙上記錄(小鼠)穿越先前平臺位置的次數(shù)，以及在水池每一1/4區(qū)消耗的時間。辦經(jīng)i^潘學變眾為測定腦海馬回和腦扁桃體中的Tau蛋白免疫反應性程度，采用專用的圖象分析軟件(專業(yè)圖像軟件(ImageProPlus)，4.5丄29版)。評價和計算了以下參數(shù)每張切片的腦海馬回和腦扁桃體區(qū)域面積；特定腦區(qū)域海馬回和扁桃體中免疫反應陽性細胞所占的絕對面積；免疫反應陽性面積與海馬回和扁桃體特定腦區(qū)域面積之比。定著,促方法a)調(diào)整該圖像的對比度以更好觀察切片形狀，但不應將該對比度施加于該圖像。b)人機交互繪制海馬回輪廓圖測量其面積(=區(qū)域面積)c)人機交互繪制感興趣區(qū)域(AOI)，其中檢測到高于強度閾值水平的染色對象。為檢測此域值，人機交互繪制在靠近AOI的沒有可見免疫反應區(qū)域中的線直方圖。此線直方圖所有像素的平均強度水平，加上一個常數(shù)，得到此強度域值水平。排除小于7^11112的對象。d)測定各對象的面積和AOI中染色面積之和，e)對腦扁桃體重復步驟a)-d)，f)計算相對Tau蛋白免疫陽性面積(==Tau蛋白免疫反應性的總面積/區(qū)域面積x100)g)將數(shù)據(jù)自動輸出到Excel電子數(shù)據(jù)表中，包括參數(shù)"圖像標題、區(qū)域面積、Tau總面積和Tau面積百分比"。利用注釋區(qū)分別記錄圖像質量和排除標準。排除標準是該切片的丟失部分、許多是皺紋和明顯裂縫。h)關閉該圖像而不保存(以保留原始數(shù)據(jù))。統(tǒng)^學必潘計算所有測定參數(shù)的平均值、標準差或SEM。結果一^^^^:一般說，用硒酸鈉治療不會導致不良副作用或引起成熟前死亡。綠試教翁菜開場試驗雖然硒酸鈉治療不影響活動參數(shù)(活動、過度活動和直立行為)，但硒酸鈉治療小鼠在第一次OF試驗中顯示趨觸行為被擾亂。這導致在該開場盒的中心區(qū)停留時間顯著延長，意味著第一輪治療后與運載體相比硒酸鈉治療的動物的趨觸性差(見圖14一"趨觸性"，治療組動物的T檢驗p=0.019)。第二輪治療結束時，將趨觸性行為按運載體對照組水平標準化。一個半月后，與所研究的二個治療組相比，OF試驗中基線動物的特征是排便率較高(二個治療組的ANOVA分析p=0.018，p<0.05)，表明實驗動物對此試驗方法有較高的情緒反應。旋轉桿(RotaRod)試驗，硒酸鈉治療不會改變小鼠的運動行為。伸鼻好奇心和活動試驗，硒酸鈉治療不會改變小鼠的好奇心行為。莫利斯水迷宮(MWMH式驗，圖15顯示了二個不同治療組加基線(5月齡動物治療)的莫利斯水迷宮(MWM)行為結果，表4顯示其統(tǒng)計學分析結果。此MWM任務深刻揭示在某些情況下(見表4)，與運載體組、甚至是年幼3個月的基線組相比，硒酸鈉治療動物之間差異的顯著性甚至更高。48表4:莫利斯水迷宮(MWM)試驗結果的MannWhitneyU-檢驗結果表:時間硒酸鈉與運載體nn硒酸鈉運載體p-值15160.002015160.008215160.026715160.1015硒酸鈉與基線nn硒酸鈉基線p-值15150.029515150.682715150.366915150.5125運載體與基線nn運載體基線p-值16150.519616150.065516150.119516150.1751長度硒酸鈉與運載體nn硒酸鈉運載體p-值第l天15160.4945第2天15160.4701第3天15160.6823第4天15160.5196硒酸鈉與基線nn硒酸鈉基線p匿什第l天15150.6236第2天15150.8063第3天15151.0000第4天15150.9349運載體與基線nn運載體基線p-值第l天16150.6260第2天16150.7701第3天16150.7112第4天16150.6260此結果清楚表明硒酸鈉能夠提高認知功能。腦組織學和免疫組化檢測結果在AT180和HT7IHC定量中，在所有受檢腦中海馬回和扁桃體區(qū)的區(qū)域面積高度恒定，排除了免疫組化染色步驟中對組織的不良作用(如皺縮、切割環(huán)境不同)，因此進一步表明治療不會導致萎縮。檢測到的Tau蛋白含量數(shù)據(jù)與切片的個別區(qū)域大小相關，能應對小差異。丑77浙/477卵與運載體組(ANOVA:p0.05，治療組T-檢驗p=0.04)和未治療的基線組(ANOVA:p<0.05，見圖16A)相比，硒酸鈉(1.2mg)治療的動物海馬回中HT7-Tau相對面積的百分比顯著降低。這種作用在扁桃體天天天天1234第第第第天天天天1234第第第第天天天天1234第第第第中更顯著(見圖16B)，其中與未治療基線組(ANOVA:p〈0.01)和運載體治療動物(ANOVA:p<0.05，治療組T-檢驗pL0018)相比，硒酸鈉治療小鼠的HT7-Tau相對面積百分比明顯降低。與HT7-Tau類似，硒酸鈉(1.2mg)治療的動物海馬回中AT180-Tau相對面積的百分比低于運載體組(治療組T-檢驗p=0.04，見圖17A)，然而顯著性水平更低。還有，這種作用在扁桃體中更顯著(見圖17B)，其中硒酸鈉治療小鼠的HT7-Tau相對面積百分比顯著低于運載體組(ANOVA:p<0.05，治療組T-檢驗p=0.0045)，但不低于未治療基線組。海馬回和扁桃體中的AT180和HT7免疫反應陽性神經(jīng)元顯示在與PHF-Yau緊密擠在一起的神經(jīng)元細胞體中有大量的Tau蛋白沉積。硒酸鈉治療顯著減少扁桃體和海馬回CA1區(qū)神經(jīng)元層中的Tau蛋白載量和Tau陽性細胞。作用小結和結論在硒酸鈉治療轉基因小鼠中，治療開始后一個半月趨觸性降低，表明與扁桃體樣結構相關的恐懼心理變化。經(jīng)長期硒酸鈉治療后，小鼠在第二輪開場試驗處死之前，趨觸行為恢復到與運載體治療對照組相仿和正常的水平。硒酸鈉治療不影響所有的運動參數(shù)，如旋轉桿能力、開場活動、過度活動和直立行為。硒酸鈉治療可提高小鼠在Mffi水迷宮(MWM)試驗中的認知能力。第1、2和3天硒酸鈉治療動物找到平臺明顯快于運載體組動物(p《0.01)，第1天也快于基線組的年幼3個月的動物。當評價TMHTTg小鼠海馬回和扁桃體中的HT7免疫陽性Tau蛋白沉積和Tau蛋白載量時，可見硒酸鈉治療的顯著影響。與未治療的基線組相比，甚至在扁桃體中也可與運載體(水)治療的對照相比，可觀察到這種治療顯著減少了海馬回和扁桃體中HT7陽性Tau蛋白區(qū)域面積。HT7-Tau沉積的結果得到AT180培育的支持。硒酸鈉治療后海馬回和扁桃體中的AT180陽性Tau蛋白比運載體(水)治療對照組顯著減少。參考文獻_Alonso，A.D.C.等，阿爾茨海默病神經(jīng)原纖維纏結和失裝配微管中超磷酸化的Tau蛋白螯合正常Tau蛋白C4/z/ze/附e,sWwa^ti/sa^，6/es/m'cr齒6w/e51.)Nat.Med.，1996.2:p.783-787。Barrett,W.C.等.，過氧自由基離子在蛋白酪氨酸磷酸IB可逆性調(diào)節(jié)介導的信號轉導中的作用o/swperox/t/e/W/c"/am'o"/"w'g""/加朋f/wWo"/neapedreww'6/eregw/Wowo//ro^'"-(yro57'we//zos//atoseJBiolChem，1999.274(49):p.34543-6。Barton,G丄，P.T.Cohen和D.Barford，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的保守分析和結構預測與大腸桿菌二腺苷四磷酸酶序列相似提示此二蛋白磷酸酶同源(Co/werv加.owawa/戸i"m/欲w"wre/7rWc,/owo/Ae/rWw;/zo—齒薦)EurJBiochem，1994.220(1):p.225-37。Bass，D.A.等，流式細胞計數(shù)研究中性白細胞氧化產(chǎn)物的形成指導對膜刺激的應答(F/owcyfomefn'cWwWeso/ox/t/a"ve/rot/w"/orma".o"6>>wew&o/jA/As.'flgrac/ed;-e5po"sefowe附6ra"e幼'wm/油'ow)JImmunol,1983.130(4):p.1910-7。Bramblett，G.T.等，阿爾茨海默病中Tau蛋白Ser396位的異常磷酸化改變了對減少微管結合發(fā)生的貢獻046"orma/faw//zo印/7wj/^m'o"WSer396m/cr幽6w/eZuW/wg).Neuron，1993.10:p.1089-1099。Bryant,J.C.，R.S.Westphal，禾卩B.E.Wadzinski，PP2A催化亞基的甲基化C-末端亮氨酸殘基對調(diào)節(jié)Balpha亞基的結合至關重要(Me^y/W^/o/regw/a組yjBa/p/zaswZmm力.BiochemJ，1999.339(Pt2):p.241-6。Cayla，X.等，能激活蛋白磷酸酶2A的酪氨酸磷酸酶活性的蛋白PTPA的分子克隆、表達和特征鑒定(Afo/ecw/arc/om>zg,oc,/vz(yo//roWwp/w—w認Z4).JBiolChem，1994.269(22):p.15668-75。Chen，J.，B丄.Martin和D丄.Bmutigan，酪氨酸磷酸酶可調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2A(/egw/a"'oo//roe/w"W"e-Areom."e;Aay;^atose妙e-Z4/yms/"e/^osp/iOAj/af/o")Science,1992.257(5074):p.1261-4。Chen，J.，S.Parsons和D丄.Brautigan，蛋白磷酸酶2A的酪氨酸在對成纖維細胞生長刺激和v-src轉化應答反應中磷酸化(7>row'"eflwc/v-wcfra/wybrma"ow/6ro6/a加).JBiolChem，1994.269(11):P.7957-62。Cohen，P.T.，新的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶多樣化是生命的調(diào)味品TrendsBiochemSci，1997.22(7):p.245-51。Conway，K.，Harper,J.，Lansbury，P.,1998.與早期發(fā)作帕金森病有關的突變a-共核蛋白加速了體內(nèi)纖維結形成G4cce/era&dw>oy6n7Nat.Med.4，1318-1320。Cross,D.A.等，胰島素介導的蛋白激酶B抑制糖原合酶的激酶3(/"/n.6"/o"o/g7_ycogewi^W/^eA:/"iwe-3/wsw//"/nW她d;ro^'wh'wase5).Nature,1995.378(6559):p.785-9。Diehl，J.A.等，糖原合酶的激酶3(3調(diào)節(jié)周期蛋白Dl的水解和細胞定c函/or/婦fea"ow).GenesDev.，1998.12(22):p.3499-511。Duda，J.E.，Giasson，B丄，Mabon，M.E.，Miller,D.C.，Golbe，L丄，Lee，V.M.，Trojanowski，J.Q.，2002.在腦挫傷親屬中同時發(fā)生的a-共核蛋白病禾口Tau蛋白病(Cowcw^rewceo//"w6ra/"/"fAo/ogy/"/zeCo幽ns/h'w<irecO.ActaNeuropathol.(Berl.)104，7-11。Ellman，G.L.，檢測低濃度硫醇的比色方法(^co/on'me^cme^od/or<ie&/vm>7/"g/owcowcew加"'o/wo/werca/tow).ArchBiochemBiophys，1958.74(2):p.443-50。Feany，M.B.，Bender,W.W.，2000.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3月29日優(yōu)先權日2006年3月29日發(fā)明者C·霍文斯,N·科爾科蘭申請人:維拉科治療學控股有限公司