專(zhuān)利名稱(chēng)：治療帕金森病的方法和組合物的制作方法
治療帕金森病的方法和組合物
背景技術(shù)：
帕金森病(PD)為慢性、進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病。每年約50, 000美國(guó) 人診斷有PD。該神經(jīng)退行性疾病的主要癥狀為震顫、僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和 平衡破壞。另外，很多PD患者經(jīng)歷多種其它癥狀，包括情感變化、記憶 損失、言語(yǔ)問(wèn)題或睡眠困難。
PD由特定的進(jìn)行性中腦多巴胺(DA)神經(jīng)元的神經(jīng)元損失導(dǎo)致。通 常，這些神經(jīng)元產(chǎn)生多巴胺， 一種負(fù)責(zé)傳遞黑質(zhì)和紋狀體間信號(hào)的化學(xué)信 使，其引起光滑、有目的的肌肉活動(dòng)。然而，多巴胺損失導(dǎo)致紋狀體神經(jīng) 細(xì)胞以未控制的方式興奮(fire),給患者指揮和控制他們行動(dòng)的能力以損 壞。
目前對(duì)PD的療法主要依靠通過(guò)給患者口服劑量的多巴胺前體 L-DOPA (L-二羥苯-丙氨酸)來(lái)補(bǔ)充多巴胺。該治療需要隨著治療的繼續(xù) 增加劑量，且其最終引發(fā)嚴(yán)重的副作用。需要另外的PD治療法。

發(fā)明內(nèi)容
申請(qǐng)人已開(kāi)發(fā)新的帕金森病療法、引起干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元 的方法和用于識(shí)別治療帕金森病化合物的篩選方法。
從而，在一個(gè)例子中本發(fā)明特征為治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法， 其包括如下步驟(a)確定患者是否具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森病，且(b) 如果所述患者具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森病，則施用足以治療或抑制帕金森 病發(fā)展的量的或可選擇性地足以活化在所述患者細(xì)胞中Nurr 1的量的7-氯-4-氨基*啉化合物，如阿莫地會(huì)或格拉非寧給所述患者。
在另一個(gè)例子中，本發(fā)明特征為試劑盒，其包括7-氯-4-氨基喹啉化合說(shuō)明書(shū)。
本發(fā)明進(jìn)一步特征為引起體外干細(xì)胞如人胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺 能神經(jīng)元的方法，所述方法通過(guò)使所迷干細(xì)胞與以足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分
化的量存在的7-氯-4-氨基喹啉化合物接觸。
另外本發(fā)明特征為治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法，其包括如下步
驟(a)注射含干細(xì)胞的組合物到患者的腦中；且(b)接著步驟(a)，施 用給患者足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步特征為通過(guò)注射含千細(xì)胞和7-氯-4-氨基全啉化合物的 組合物到患者腦中來(lái)治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法。
在另一個(gè)例子中，本發(fā)明特征為含千細(xì)胞和7-氯-4-氨基奮啉化合物的 藥物組合物。
另外本發(fā)明特征為識(shí)別在帕金森病中作治療用途的化合物的方法，其 包括如下的步驟(a)用含Nurrl基因結(jié)構(gòu)域的第一質(zhì)粒和含可操作性連 接到報(bào)告基因的啟動(dòng)子的第二質(zhì)粒來(lái)共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如， SK-N-BE(2)C細(xì)胞；(b)使所述細(xì)胞接觸候選化合物；(c)測(cè)量產(chǎn)生的報(bào) 告基因的表達(dá)水平；且(d)與對(duì)照值比較報(bào)告基因的表達(dá)水平，這樣， 如果所述表達(dá)水平比對(duì)照值高至少20%,則識(shí)別所述候選化合物為在帕金 森病中作治療用途的化合物。在一些例子中，在步驟(c)前培養(yǎng)步驟(b) 中產(chǎn)生的混合物18個(gè)小時(shí)。第一質(zhì)粒與第二質(zhì)粒的摩爾比率可為任何比 率，如O.l和10間。笫二質(zhì)?？砂ㄋ谢虿糠掷野彼彷p化酶啟動(dòng)子，如， 酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子的100個(gè)堿基或2,600個(gè)堿基?？墒褂萌魏螆?bào)告基因， 如螢火蟲(chóng)熒光素酶。在一些例子中，第一質(zhì)粒包含可操作性連接到Nurrl 基因結(jié)構(gòu)域的GAL4 DNA結(jié)合域，且第二質(zhì)粒包含可操作性連接到報(bào)告基 因的GAL4結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步特征為識(shí)別用于在帕金森病中作治療用途的化合物的 方法，其包括如下步驟(a)提供能產(chǎn)生多巴胺的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和使用本 發(fā)明方法識(shí)別的化合物；(b)使所述細(xì)胞與這樣識(shí)別的化合物接觸；(c)
7測(cè)量產(chǎn)生的酪氨酸羥化酶或多巴胺表達(dá)水平；且(d)與對(duì)照值比較所述 表達(dá)水平，這樣，如果所述表達(dá)水平比對(duì)照值高至少20%，則識(shí)別所述化 合物為在帕金森病中作治療用途的化合物。步驟(c)的測(cè)量可包括例如 使用實(shí)時(shí)PCR或免疫染色定量酪氨酸羥化酶，或使用HPLC分析定量多巴 胺。步驟(a)的識(shí)別可包括化合物識(shí)別的任何方法的使用；如，可使用包 括如下步驟的方法(i )用含Nurrl基因結(jié)構(gòu)域的第一質(zhì)粒和含可操作性 連接到報(bào)告基因的啟動(dòng)子的第二質(zhì)粒來(lái)共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如， SK-N-BE(2)C細(xì)胞；(ii )使所述細(xì)胞接觸候選化合物；(iii)測(cè)量產(chǎn)生的 報(bào)告基因表達(dá)水平；且(iv)與對(duì)照值比較報(bào)告基因的表達(dá)水平，這樣如 果所述表達(dá)水平比對(duì)照值高至少20%,則識(shí)別所述候選化合物為在帕金森 病中作治療用途的化合物。
在任何本發(fā)明方法、組合物和試劑盒中，所使用的7-氯-4-氨基喹啉化 合物可為，如阿莫地喹或格拉非寧。適用于任何本發(fā)明方法、組合物和試 劑盒的干細(xì)胞包括，如人胚胎干細(xì)胞。
如上面描述的，本發(fā)明的一些方法采用7-氯-4-氨基*啉化合物。這些 化合物具有下式
其中R!、 R2和R3每一個(gè)獨(dú)立選自H、 OH、 OC(O)-R4、 C(0)-0-R5、
面素、d-7烷基、C2-7烯基、C2.7炔基和Cw雜烷基；且JU和R5每一個(gè)獨(dú) 立選自Cw烷基、C2-7烯基、C2.7炔基和Cw雜烷基?？扇缭诿绹?guó)專(zhuān)利第2,
474， 821號(hào)和第3， 232， 944號(hào)中描述地制備這種化合物，其中每一個(gè)在
此通過(guò)引用并入。示例性商業(yè)可獲得的7-氯-4-tt奮啉化合物為阿莫地喹 和格拉非寧
8格拉非寧
可在本發(fā)明方法和試劑盒中使用其它7-氯-4-氨基喹啉化合物，包括4-(3'-N-哌啶基甲基-4'-羥苯胺基)-7-氯醌；4-(3'-二乙氨基曱基-4'-羥苯胺基)-7-氯醌；4-(3'-乙氨基乙基-4'-羥苯胺基)-7-氯醌；4-(3'-二-n-丁基氨基甲基_4'-鞋苯胺基)-7-氯醌；4-(3'-N-哌啶基曱基-4',6'-二羥苯胺基)-7-氯醌；4-(3'-二乙絲甲基-4'-羥苯胺基)-7-氯醌；2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-苯曱酸；苯曱酸，2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-,甲酯；和苯曱酸，2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-,乙酯。
在本發(fā)明化合物類(lèi)別描述中，在取代基團(tuán)中特定種類(lèi)原子數(shù)目通常給作一個(gè)范圍，如，包含從1到7個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)或Cw烷基。對(duì)這個(gè)范圍的提及意為包括具有在所指定范圍內(nèi)每個(gè)整數(shù)個(gè)原子的基團(tuán)。如，從l到7個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)包括d, C2， C3， C4， C5, C6和C7中每一個(gè)。Cw雜烷基如包括除了一個(gè)或多個(gè)雜原子外從1到6個(gè)碳原子。可以相似的方式指示其他原子數(shù)目和其它原子種類(lèi)。
如這里使用的，術(shù)語(yǔ)"烷基"和前綴"烷-，，包括直鏈和支鏈基團(tuán)兩者和環(huán)狀基團(tuán)，即環(huán)烷基。環(huán)狀基團(tuán)可為單環(huán)或多環(huán)，且優(yōu)選地具有從3到6個(gè)環(huán),灰原子包含在內(nèi)。示例性環(huán)狀基團(tuán)包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。d—7烷基可為取代的或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、卣化物、羥基、氟代烷基、全氟代烷基、氨
基、氨基烷基、雙取代氨基、季氨基、羥基烷基、羧基烷基和羧基。Cw
烷基包括但不限于甲基；乙基；n-丙基；異丙基；環(huán)丙基；環(huán)丙基甲基；環(huán)丙基乙基；n-丁基；異丁基；仲丁基；叔丁基；環(huán)丁基；環(huán)丁基甲基；環(huán)丁基乙基；n-戊基；環(huán)戊基；環(huán)戊基甲基；環(huán)戊基乙基；l-曱基丁基；2-甲基丁基；3-曱基丁基；2,2-二甲基丙基；l-乙基丙基；l,l-二甲基丙基；
1.2- 二曱基丙基；l-甲基戊基；2-曱基戊基；3-曱基戊基；4-甲基戊基；1,1-二曱基丁基；1,2-二曱基丁基；1,3-二曱基丁基；2,2-二曱基丁基；2,3- 二甲基丁基；3,3-二甲基丁基；l-乙基丁基；2-乙基丁基；1,1,2-三曱基丙基；1,2,2-三甲基丙基；l-乙基-l-甲基丙基；l-乙基-2-甲基丙基；和環(huán)己基。.
"C2—7烯基"表示包括一個(gè)或多個(gè)雙鍵且具有從2到7個(gè)碳原子的支鏈
或未分支的烴基團(tuán)。C2-7烯基可任選包括單環(huán)或多環(huán)，其中每個(gè)環(huán)按需要
具有從3到6個(gè)成員。C2-7烯基可為取代的或未取代的。示例性取代基包括烷tt、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、卣化物、鞋基、氟代烷基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、雙取代氨基、季氨基、羥基烷基、羧基烷基和羧基。(:2-7烯基包括但不限于乙烯基；烯丙基；2-環(huán)丙基-l-乙烯基；l-丙烯基；l-丁烯基；2-丁烯基；3-丁烯基；2-曱基-l-丙烯基；2-甲基-2-丙烯基；l-戊烯基；2-戊烯基；3-戊烯基；4-戊烯基；3-甲基-l-丁烯基；3-曱基-2-丁烯基；3-甲基-3-丁烯基；2-甲基-l-丁烯基；2-甲基-2-丁烯基；2-甲基-3-丁烯基；2-乙基-2-丙烯基；l-甲基-l-丁烯基；l-甲基-2-丁烯基；1-曱基-3-丁烯基；2-曱基-2-戊烯基；3-曱基-2-戊烯基；4-甲基-2-戊烯基；2-甲基-3-戊烯基；3-甲基-3-戊烯基；4-曱基-3-戊烯基；2-甲基-4-戊烯基；3-甲基-4-戊烯基；1,2-二甲基-1-丙烯基；1,2-二甲基-1-丁烯基；1,3-二甲基-1-丁烯基；1,2-二甲基-2-丁烯基；1,1-二曱基-2-丁烯基；2,3-二甲基-2-丁烯基；
2.3- 二甲基-3-丁烯基；1,3-二曱基-3-丁烯基；1,1-二甲基-3-丁烯基和2,2-二甲基-3-丁烯基。"C2-7炔基"表示包括一個(gè)或多個(gè)三^;且具有從2到7個(gè)碳原子的支鏈
或未分支的烴基團(tuán)。C2-7炔基可任選包括單環(huán)，雙環(huán)或三環(huán)，其中每個(gè)環(huán)
按需要具有5或6個(gè)成員。C2.7炔基可為取代的或未取代的。示例性取代
基包括烷tt、芳M、巰基、烷硫基、芳硫基、離化物、羥基、氟代烷 基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、雙取代氨基、季氨基、羥基烷基、羧
基烷基和M。 C2—7炔基包括但不限于乙炔基、l-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、l-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、 5-己烯-l-炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基；l-甲基-2-丙炔 基；l-甲基-2-丁炔基；l-曱基-3-丁炔基；2-曱基-3-丁炔基；1,2-二曱基-3-丁炔基；2,2-二曱基-3-丁炔基；l-曱基-2-戊炔基；2-甲基-3-戊炔基；1-甲 基-4-戊炔基；2-曱基-4-戊炔基；和3-曱基-4-戊炔基。
"Cw雜烷基"表示除了獨(dú)立選自N、 O、 S和P組成的組的1、 2、 3或 4個(gè)雜原子外具有從1到7個(gè)碳原子的支鏈或未分支的烷基、烯基或炔基。 雜烷基包括但不限于叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸 酯、硫代氨基曱酸酯、腙、亞胺、磷酸二酯、氨基磷酸酯、名黃酰胺和二硫 化物。雜烷基可任選包括單環(huán)，雙環(huán)或三環(huán)，其中每個(gè)環(huán)按需要具有從3 到6個(gè)成員。雜烷基可為取代的或未取代的。示例性的取代基包括烷tt、 芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、面化物、羥基、氟代烷基、全氟代烷基、 氨基、氨基烷基、雙取代氨基、季氨基、羥基烷基、羥基烷基、氣基烷基 和羧基。
"施用"表示將劑量藥物給患者的方法。在本發(fā)明方法中使用的組合物 可通過(guò)選自但不限于如下途徑施用吸入、眼部、腸胃外、皮膚、經(jīng)皮、 口腔、直腸、舌下、舌周(Perilingual)、鼻、局部給藥和口服給藥。腸胃 外給藥包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和肌內(nèi)給藥。優(yōu)選的給藥方法可根據(jù)多 種因素變化，如，^皮施用的組合物的組分和被治療的病癥的嚴(yán)重度。
"足以治療的量"表示以臨床相關(guān)的方式改善、抑制或緩解患者病癥或 疾病癥狀所需的化合物的量。患者中任何改善認(rèn)為足以實(shí)現(xiàn)治療。用以實(shí) 施本發(fā)明的、足以帕金森病治療的活性化合物的量根據(jù)給藥方式、患者的 年齡、體重和患者一般健康而變化。最終，處方藥師或研究者會(huì)決定合適
ii的量和纟會(huì)藥方案。
"足以活化細(xì)胞中Nurrl的量"表示以可檢測(cè)和可重復(fù)的方式增加可操 作性連接到酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子的基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄所需的本發(fā)明化 合物的量。希望地，相比參考或?qū)φ账降霓D(zhuǎn)錄增加為至少10%， 20%, 30%, 40%， 50%， 60%, 70%， 80%, 90%或100%。所述基因可為酪氨酸 羥化酶或l艮告基因，如螢火蟲(chóng)焚光素酶。因?yàn)槔野彼崃u化酶啟動(dòng)子為Nurrl 直接靶，所以酪氨酸幾化酶活化指示Nurrl水平增加。
"足以誘導(dǎo)分化的量"的干細(xì)胞表示引起未分化的干細(xì)胞分化為如神經(jīng) 元的需要的細(xì)胞類(lèi)型所需的本發(fā)明化合物的量。
"候選化合物"表示通過(guò)釆用這里描述的測(cè)定方法中一個(gè)測(cè)定其改變基 因或蛋白質(zhì)表達(dá)水平或基因或蛋白質(zhì)的生物活性的任何化合物。候選化合 物包括如，肽、多肽、合成有機(jī)分子、天然存在的有機(jī)分子、核酸分子和 它們的組分。
"分化"表示未特化干細(xì)胞獲得如神經(jīng)細(xì)胞的特化細(xì)胞特征的過(guò)程。分 化也可指細(xì)胞自我更新潛力的限制，且通常與所述細(xì)胞的功能能力改變相 關(guān)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知方法確定干細(xì)胞分化，包括分析與指定分化狀態(tài)細(xì) 胞相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志物或形態(tài)學(xué)特征。這種標(biāo)志物和特征的例子包括測(cè)量糖 蛋白、堿性磷酸酶和癌胚抗原表達(dá)，其中這些蛋白質(zhì)任一的增加指示分化。
"作治療用途的化合物，，表示在正確醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與人組織 接觸，而沒(méi)有過(guò)分的毒性、刺激，過(guò)敏反應(yīng)及類(lèi)似反應(yīng)；與合理的收益/ 風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)；且對(duì)它們預(yù)期用途有效的化合物以及本發(fā)明組合物可能的兩 性離子形式。
"胚胎干細(xì)胞"表示衍生自胚泡期胚胎或在細(xì)胞實(shí)質(zhì)分化為三胚層前的 細(xì)胞，其可自我更新且展示未分化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，將其與胚胎或成體 來(lái)源的分化細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。示例性形態(tài)學(xué)特征包括高核/質(zhì)比和顯微鏡下明 顯的核仁。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件下，胚胎干細(xì)胞可分化為如 下三胚層的細(xì)胞或組織內(nèi)胚層，中胚層和外胚層。用于識(shí)別胚胎干細(xì)胞 的測(cè)定包括在合適宿主中形成畸胎瘤或染色如Oct-4未分化細(xì)胞標(biāo)志物的能力。
在篩選化合物上下文中"擊中(hit)"表示在給定測(cè)定中試驗(yàn)陽(yáng)性的候 選化合物。如，在其中通過(guò)才艮告基因活性升高指示陽(yáng)性結(jié)果的篩選中，如 果其引起在指定闊值以上的報(bào)告基因活性水平，如，高于活性對(duì)照水平
10%, 20%, 30%, 40%， 50%, 60%, 70%, 80%, 90%， 100%, 200%或 甚至500%,則候選化合物認(rèn)為是擊中。
"Nurrl生物活性"表示已知通過(guò)Nurrl多狀體內(nèi)或體外引起的任何活 性。如，這種活性可包括活化酪氨酸羥化酶轉(zhuǎn)錄。
本文可互換地使用"Nurrl核酸"和"Nurrl基因"，且指編碼所有或部分 Nurrl多狀或與所有或部分GenBank登陸號(hào)AB017586 (Ichinose等人, Gene 230: 233-239,1999)的核酸序列或其類(lèi)似物大致相同的核酸。
"Nurrl多肽"表示與所有或部分GenBank登陸號(hào)BAA75666的多肽序 列或其類(lèi)似物大致相同，且具有Nurrl生物活性的多肽。
"可操作性地連接"表示當(dāng)如轉(zhuǎn)錄激活蛋白的合適的分子結(jié)合到調(diào)控元 件時(shí)允許基因表達(dá)的基因和一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件的結(jié)合。
"患者"表示接受內(nèi)科治療的任何人。
"啟動(dòng)子"表示促進(jìn)可操作連接的編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始的基因調(diào)控元件。
"報(bào)告基因"表示編碼如酶的報(bào)告分子的基因序列。報(bào)告分子可在包括 但不限于以下任何檢測(cè)系統(tǒng)中檢測(cè)熒光、酶(如，ELISA,還有基于酶 的組織化學(xué)測(cè)定)，放射性的和發(fā)光系統(tǒng)。示例性^^告基因包括螢火蟲(chóng)熒 光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、大腸桿菌P-半乳糖苷酶或葡糖醛酸糖苷酶、 人胎盤(pán)堿性磷酸酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT );其它報(bào)告基因在本領(lǐng)域已 知，且可按需要采用。
胞或特定細(xì)M^或組織的任何細(xì)胞。干細(xì)胞可為多能性的(pluripotent)或多 能的(multipotent )。干細(xì)胞包括但不限于胚胎千細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、成 體干細(xì)胞和臍帶血細(xì)胞。"大致相同，，表示多肽或核酸展示與參考氨基酸或核酸序列至少75%， 85%, 90%, 95%或甚至99%同一性。對(duì)于多肽，比對(duì)序列長(zhǎng)度通常為至 少35個(gè)氛基酸、45個(gè)氨基酸、55個(gè)氨基酸或甚至70個(gè)氨基酸。對(duì)于核 酸，比對(duì)序列長(zhǎng)度通常為至少60個(gè)核苦酸、90個(gè)核苷酸或甚至120個(gè)核 苦酸。
通常使用公開(kāi)可獲得的計(jì)算機(jī)程序測(cè)定序列同一性。測(cè)定兩條序列間 同 一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，Nucleic Adds Research 12 : 387, 1984)、 BLASTP、 BLASTN和FASTA (Altsclml等, J. Mol. Biol. 215:403, 1990)。熟知的Sm池Waterman算法也可用來(lái)確定同 一性。BLAST程序可從NCBI和其它來(lái)源(如，BLAST手冊(cè),Altschul等, NCBINLM NIH, Bethesda, MD 20894)/>開(kāi)獲得。這些豐欠件程序通過(guò)對(duì)各種 置換、缺失和其它修改指定同源程度來(lái)匹配相似序列。氨基酸比對(duì)的保守 置換通常包括在以下組中的置換甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、 亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴(lài) 氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
"酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子"表示能夠通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始來(lái)調(diào)控酪氨酸羥化 酶基因表達(dá)的酪氨酸羥化酶基因上游元件。酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子可操作性 的連接到任何基因以調(diào)控該基因的表達(dá)。可在本發(fā)明中使用任何酪氨酸羥 化酶啟動(dòng)子，如，如在Kim等，J. Neurochem, 85: 622-634， 2003中提供 的。
本發(fā)明方面提供了多種優(yōu)點(diǎn)。如，用7-氯-4-氨基喹啉化合物治療帕金 森病患者可減輕如下的癥狀平衡和協(xié)調(diào)的破壞；臂、頜、腿或臉的節(jié)律 震顫；肌肉強(qiáng)直；和運(yùn)動(dòng)徐緩，即，自主動(dòng)作的緩慢。另外，用干細(xì)胞和 7-氯-4-氨基喹啉化合物兩者治療帕金森病患者可提供增加治療功效或降 低以其他方式實(shí)現(xiàn)治療所需要的7-氯-4-氨基*啉化合物劑量的進(jìn)一步優(yōu) 點(diǎn)。這里描述的篩選測(cè)定也是有利的，因?yàn)樗鼈兲峁┳R(shí)別在治療帕金森病 中可為有用的其他化合物的方法。
通過(guò)下面具體描述和權(quán)利要求，本發(fā)明其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。
1

圖1為表示Nurrl在多巴胺神經(jīng)元發(fā)育中作用的圖解。
圖2為表示Nurrl 、酪氨酸羥化酶和多巴胺間關(guān)系的圖解。
圖3為表示發(fā)現(xiàn)和試驗(yàn)Nurrl激活子方法的流程圖。
圖4為表示在SK-N-BE(2)C細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析結(jié)果的圖表。通過(guò)分 別與2.6kb-TH啟動(dòng)子和6.0-TH啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染來(lái)測(cè)量SK-N-BE(2)C細(xì)胞中 瞬時(shí)表達(dá)的Nurrl活性。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用來(lái)轉(zhuǎn)染的效應(yīng)質(zhì)粒對(duì)報(bào)告質(zhì)粒 的摩爾比為0.5。熒光素酶活性被測(cè)定并標(biāo)準(zhǔn)化為作為內(nèi)參的P-半乳糖苷 酶活性。
圖5A為表示用小化學(xué)藥品文庫(kù)的初步篩選數(shù)據(jù)的圖表。在與每個(gè)化 合物孵育18小時(shí)后通過(guò)具有2.6-TH啟動(dòng)子的熒光素酶活性測(cè)量在 SK-N-BE(2)C細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的Nurrl活性?；诩?xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)產(chǎn)生陽(yáng) 性的擊中候選物，弗司扣林，其表示相比具有DMSO的對(duì)照熒光素酶活性 明顯升高。每列具有八個(gè)不同的化合物。圖5B為表示利用小化學(xué)藥品文 庫(kù)進(jìn)一步初步篩選數(shù)據(jù)的圖表。與每個(gè)化合物孵育18小時(shí)后通過(guò)具有 2.6-TH啟動(dòng)子的熒光素酶活性測(cè)量在SK-N-BE(2)C細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的 Nurrl活性?；诩?xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)產(chǎn)生陽(yáng)性的擊中候選物，二磷酸氯會(huì)， 其表示相比具有DMSO的對(duì)照熒光素酶活性明顯升高。每列具有八個(gè)不同 的化合物。
圖6包括表示利用初步擊中候選物重復(fù)的初步篩選數(shù)據(jù)的圖表。每個(gè) 化合物與pcDNA-Nurrl構(gòu)建體孵育18小時(shí)后通過(guò)熒光素酶活性測(cè)量在 SK-N-BE(2)C細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的Nurrl活性。識(shí)別了兩個(gè)擊中候選物，阿 莫地喹和格拉非寧。
圖7包括表示利用初步擊中化學(xué)藥品第二次篩選數(shù)據(jù)的圖表。每個(gè)化 合物與融合有Nurrl-LBD的GAL4-DBD構(gòu)建體孵育18小時(shí)后通過(guò)熒光素 酶活性測(cè)量在SK-N-BE(2)C細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的Nurrl活性。識(shí)別了兩個(gè)擊 中候選物，阿莫地喹和格拉非寧。也表示了激活螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因 的GAL4-DBD-Nurrl-LBD融合構(gòu)建體圖示。
15圖8A為表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告測(cè)定的圖解。圖8B為表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告測(cè) 定的圖解，其中Nurrl為效應(yīng)基因，啟動(dòng)子來(lái)自TH基因且螢火蟲(chóng)熒光素 酶為報(bào)告基因。
圖9A為表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告測(cè)定的圖解，其中pcDNA-Nurrl為效應(yīng)基 因，所述啟動(dòng)子來(lái)自TH基因上游2.6Kb且螢火蟲(chóng)熒光素酶為報(bào)告基因。 圖9B為表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染才艮告測(cè)定的圖解，其中在2.6KbTH啟動(dòng)子和愛(ài)火蟲(chóng) 熒光素酶報(bào)告基因存在時(shí)沒(méi)有加入效應(yīng)基因。確定在該系統(tǒng)中顯示升高的 熒光素酶活性的擊中化合物為假陽(yáng)性。
圖IOA為表示接受間接免疫組織化學(xué)測(cè)定(TH+/Tuj l+染色)的胚胎 千細(xì)胞(ES)衍生的神經(jīng)元的一對(duì)照片。利用抗P-微管蛋白III和抗-TH免 疫標(biāo)記ES衍生的神經(jīng)元。在熒光顯微鏡下兩種蛋白質(zhì)疊印顯示為白色。 使用DMSO作為對(duì)照。圖IOB為表示體外ES細(xì)胞分化過(guò)程中阿莫地會(huì)相 比對(duì)照DMSO增加了 TH+細(xì)胞數(shù)目的條線圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明特征為帕金森病獨(dú)特療法。該治療方法特征為施用足以治療疾 病的量的7-氯-4-氨基會(huì)啉化合物；其通常包括以足以激活被治療患者細(xì)胞 中Nurrl的量施用。在本發(fā)明其它的治療方面還可使用干細(xì)胞；如，可使 用胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞中的每一種。 另外本發(fā)明特征為引起胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺神經(jīng)元的方法，這種方法 特征為使用7-氯-4-氨基4r啉化合物。本發(fā)明進(jìn)一步特征為用于識(shí)別治療帕 金森病的化合物的篩選方法。所述識(shí)別方法特征為篩選用于激活一個(gè)或多 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的小分子，所述轉(zhuǎn)錄因子在促進(jìn)DA神經(jīng)元存活和/或保持中發(fā) 揮作用。如，Nurrl,中腦多巴胺神經(jīng)元中關(guān)鍵的命運(yùn)決定轉(zhuǎn)錄因子，是本 發(fā)明篩選測(cè)定中有用的耙。
7-氯-4-^奎啉化合物
上面定義的7-氯-4-氨基喹啉化合物在本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物 中有用。在本發(fā)明方法中使用的示例性化合物為阿莫地喹，其為具有裂殖體殺滅活性的抗瘧化合物，和格拉非寧，其為具有麻醉性質(zhì)、用于減輕疼 痛的鄰氨基苯甲酸衍生物。
治療
本發(fā)明治療可單獨(dú)或與另一個(gè)治療聯(lián)合實(shí)行，且可在家、醫(yī)生辦公室、 診所、醫(yī)院門(mén)診部或醫(yī)院被提供。治療通常在醫(yī)院開(kāi)始，以便醫(yī)生可密切 的觀察療法的效果和作出任何需要的調(diào)整。所述療法持續(xù)時(shí)間取決于患者 的年齡和狀況、患者帕金森病的階段和患者對(duì)治療如何響應(yīng)。另外，具有
更大發(fā)展帕金森病風(fēng)險(xiǎn)的人(如，遺傳上易罹患的人)可接受預(yù)防性治療 來(lái)抑制或延遲疾病癥狀。
診斷患者患有或有風(fēng)險(xiǎn)患有帕金森病的方法在本領(lǐng)域?yàn)槭熘?。如?br> 可以使用一個(gè)或多個(gè)以下癥狀的存在作為PD診斷的部分震顫，如一條 臂或一條腿非自主的節(jié)律的震顫；肌肉強(qiáng)直、僵硬或不適；在日常生活的 任何活動(dòng)中通常的緩慢，如運(yùn)動(dòng)不能或運(yùn)動(dòng)徐緩；行走、平衡或作姿勢(shì)困 難；書(shū)寫(xiě)改變；情感變化；記憶損失；言語(yǔ)問(wèn)題；和睡眠困難。觀察患者 癥狀、活動(dòng)、藥物治療、共存的醫(yī)療問(wèn)題或可能的毒性暴露可在做PD診 斷中為有用的。另外，可才全測(cè)患者基因突變的存在或不存在，所述基因突 變指示增加的患帕金森病的可能性。例如，可利用在NURR1、 a-突觸核蛋 白、帕金蛋白、MAPT、 DJ-1、 PINK1、 SNCA、 NAT2、或LRRK2基因 中一個(gè)或多個(gè)特定突變或多態(tài)性的存在來(lái)診斷患者是患者或有風(fēng)險(xiǎn)患有 帕金森病。見(jiàn)，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布第2003-0119026號(hào)和第2005-0186591 號(hào)；Bonifati, Minerva Med. 96:175-186,2005;和Cookson等，Curr. Opin. Neurol. 18:706-711,2005,其中每一個(gè)在此通過(guò)引用并入。
秀參i^^參^潔教
以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方式制備本發(fā)明藥物組合物，如通過(guò)常 ^見(jiàn)的溶解、凍干、混合、制?；虺尚头椒āＶ圃熘苿┑谋绢I(lǐng)域熟知方法示 于^t口 Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第20 "反，A. R. Gennaro編，2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,和 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (制藥才支術(shù)百牙牛)，J. Swarbrick 和J. C. Boylan編，1988-1999, Marcel Dekker, New York。合適的給藥方式包括但不限于口服、直腸、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、
吸入、局部或經(jīng)皮、陰道和目艮。
本發(fā)明組合物給藥可通過(guò)產(chǎn)生有效治療或抑制(如，通過(guò)延遲)帕金 森病發(fā)展的化合物濃度的任何合適方法。所述化合物與合適的載體物質(zhì)混 合，所述載體物質(zhì)如，保持給藥的化合物治療性質(zhì)的藥學(xué)可接受賦形劑。 一個(gè)示例性藥學(xué)可接受賦形劑為生理鹽水。合適載體物質(zhì)通常以組合物總
重量的1到95%重量的量存在。可以適合如下給藥的劑量形式提供所述組 合物口服、直腸的、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、吸入、鼻、局部或經(jīng)皮、 陰道或眼給藥。這樣，所述組合物可為如下的形式如片劑、膠嚢、丸劑、 粉劑、粒劑、混懸液、乳劑、溶液、包括水凝膠的凝膠、糊劑、軟膏劑、 乳油、膏藥、灌服劑(Drenches )、遞送裝置、栓劑、灌腸劑、注射劑、植 入劑、噴霧劑或氣溶膠。
可使用控制釋放的制劑將根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物配制為基本上在 給藥時(shí)即刻或在給藥后任何預(yù)定的時(shí)間段釋放活性化合物。
化合物以控制釋放制劑給藥在下述情況中是有用的單獨(dú)或聯(lián)合施用 的化合物具有(i )窄的治療指數(shù)(如，導(dǎo)致有害副作用或毒性反應(yīng)的血 漿濃度和導(dǎo)致治療效果的血漿濃度之間差異??；通常定義治療指數(shù)，TI, 為半數(shù)致死劑量(LD5Q)與半數(shù)有效劑量(ED5G)之間的比率)；(II )在 胃腸道中窄的吸收窗；或(iii)短的生物半衰期，以致于需要在一天中頻 繁給藥以使血漿水平保持在治療水平。
的控制釋放。如，可通過(guò)適當(dāng)選擇包括如合適的控制釋放組合物和包衣的 制劑參數(shù)和成分來(lái)獲得控制的釋放。合適的制劑對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已 知的。例子包括單個(gè)或多個(gè)單位片劑或膠嚢組合物、油溶液、混懸液、乳 劑、微膠嚢、微球、納米顆粒、貼劑(Patches)和脂質(zhì)體。
口應(yīng)^萄傳浙教
口服用制劑包括在具有無(wú)毒藥學(xué)可接受賦形劑混合物中包含活性成 分的片劑。這些賦形劑可為如，惰性稀釋劑或填充物(如，蔗糖和山梨醇)，
18潤(rùn)滑劑，助流劑和抗黎合劑(如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化 硅、氳化植物油或滑石)。
也可提供口服用制劑作可咀嚼片劑或硬明膠膠嚢，其中所述活性成分 與惰性固體稀釋劑混合，或作軟明膠膠嚢，其中所述活性成分與水或油介 質(zhì)混合。
毅
本發(fā)明方法中使用的化合物的合適劑量取決于幾個(gè)因素，包括給藥方 法、帕金森病嚴(yán)重程度和待治療患者的年齡、體重和患者健康。另外，關(guān) 于特定患者的藥學(xué)基因組(基因型對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)或功效特 征的影響)信息可影響使用的劑量。
可不需要連續(xù)每日施用在本發(fā)明方法中使用的化合物。治療方案可需 要期間沒(méi)有給藥的周期，或基于需要提供治療。
如上面描述的，可以片劑、膠嚢、酏劑或糖漿形式口服或以栓劑形式 直腸施用所討論的化合物或組合物?；衔锏奈改c外給藥適合例如以生理 鹽水溶液或所述化合物包入脂質(zhì)體的形式進(jìn)行。當(dāng)所迷化合物本身不具有 足以溶解的溶解性時(shí)，可應(yīng)用如乙醇的增溶劑。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可容易地確定在本發(fā)明方法中使用的任何化合 物的劑量。希望地，本發(fā)明方法中使用的任何化合物的劑量會(huì)足以緩解患 者中帕金森病癥狀?？蛇x擇性地，所述劑量會(huì)足以激活患者細(xì)胞中的
Nurrl。對(duì)包括體外干細(xì)胞分化的本發(fā)明方法，希望所述劑量會(huì)足以誘導(dǎo)千 細(xì)胞分化。
下面，為說(shuō)明性目的描述了阿莫地會(huì)和格拉非寧的劑量。本領(lǐng)域熟練 技術(shù)人員能夠容易地確定其它7-氯-4-氨基喹啉化合物和在本發(fā)明方法中 有用的其它化合物的合適的劑量。
口嚴(yán)發(fā)秀
對(duì)普通成年人阿莫地喹總的每天口服劑量可為約1-600 mg (0.02- 8.5 mg/kg),優(yōu)選地約25-400mg (0.35-5.7 mg/kg)，且更優(yōu)選地約100-300 mg (1.4-4.2 mg/kg)的總的日劑量。給藥可為一天到一年中每天一到三次，且甚至可在患者生命中每天給藥。慢性、長(zhǎng)期給藥適應(yīng)很多情況。達(dá)到600 mg的每天劑量可能是必要的。
對(duì)適以口服給藥以全身應(yīng)用的格拉非寧而言，每天劑量可為約0.1-60 mg (0.002- 0.85 mg/kg)，優(yōu)選地約2.5-40 mg ( 0.035-0.57 mg/kg),且更優(yōu) 選地約10-30 mg ( 0.14-0.42 mg/kg)的總的每天劑量。類(lèi)似于阿莫地奮， 格拉非寧可在一天到一年中，甚至患者生命中給藥。達(dá)到60mg的每天劑 量可能是必要的。
;弱發(fā)秀賴(lài)
對(duì)阿莫地喹的靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸、吸入、局部、陰道或眼 部給藥而言，總的每天劑量可為約1-600 mg (0.02- 8.5 mg/kg)，優(yōu)選地約 25-400 mg ( 0.35-5.7 mg/kg),且更優(yōu)選地約100-300 mg (1.4-4.2 mg/kg )。 格拉非寧總的每天劑量可為約0.1-60 mg (0.002- 0.85 mg/kg),優(yōu)選地約 2.5-40 mg (0.035-0.57 mg/kg),且更優(yōu)選地約10-30 mg ( 0.14-0.42 mg/kg )。 通過(guò)這些途徑，阿莫地奮或格拉非寧的給藥為每天一到四次。
干細(xì)胞
可在本發(fā)明所述方法、試劑盒和組合物中與7-氯-4-氨基喹啉化合物結(jié) 合使用千細(xì)胞。如，本發(fā)明特征為通過(guò)使干細(xì)胞接觸7-氯-4-氨基p奎啉化合 物而引起體外干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法。本發(fā)明特征還為使用 干細(xì)胞的體內(nèi)方法，如與施用7-氯-4-氨基會(huì)啉化合物一起注射千細(xì)胞到患 者腦中。這樣，考慮到本發(fā)明，干細(xì)胞提供了治療患包括多巴胺能神經(jīng)元 損失或損壞病癥如帕金森病患者的強(qiáng)有力工具。
干細(xì)胞為獨(dú)特的具有如下能力細(xì)胞群在不確定時(shí)間段中和正確的條 件或信號(hào)下分裂(自我更新)，分化為很多組成生物體的不同細(xì)胞類(lèi)型。 衍生自胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的干細(xì)胞已知為胚胎干(ES)細(xì)胞。衍生自原始生殖 細(xì)胞且一般發(fā)育為成熟配子(卵子和精子)的干細(xì)胞已知為胚胎生殖(EG) 細(xì)胞。這兩種干細(xì)胞已知為多能細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇蟹只癁樗腥齻€(gè)胚胎胚 層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)衍生物的獨(dú)特能力。
所述多能千細(xì)胞可進(jìn)一步特化為另一種通常衍生自成體組織的多能干細(xì)胞。多能干細(xì)胞也能經(jīng)過(guò)自我更新和分化，但不同于胚胎干細(xì)胞，其 負(fù)責(zé)產(chǎn)生具有特定功能的細(xì)胞。成體干細(xì)胞例子包括能增殖分化產(chǎn)生淋巴
細(xì)胞和骨髓細(xì)胞種類(lèi)的造血千細(xì)胞(HSC);能分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、 骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元的骨髓衍生干細(xì)胞(BMSC);能分化 為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC);和外周血 干細(xì)胞。多能干細(xì)胞也衍生自上皮和脂肪組織和臍帶血(UCB )。
識(shí)別衍生自預(yù)移植胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的ES細(xì)胞為最多能干細(xì)胞群，且因 而為本發(fā)明方法優(yōu)選的細(xì)胞。這些細(xì)胞能體外無(wú)限制的增殖，同時(shí)保持分 化為多種體細(xì)胞組織和胚胎外組織能力。ES細(xì)胞可為雄性(XY)或雌性 (XX);優(yōu)選雌性ES細(xì)月包。
也可在本發(fā)明方法中使用多能、成體千細(xì)胞。優(yōu)選的成體千細(xì)胞包括 整個(gè)生命中能增殖和分化產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞種類(lèi)的造血干細(xì)胞 (HSC);能分化為包括脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞 和神經(jīng)元各種細(xì)胞類(lèi)型的骨髓衍生干細(xì)胞(BMSC );和能分化為星形膠質(zhì) 細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)。在本發(fā)明方法中也可 使用衍生自上皮和脂肪組織和臍帶血細(xì)胞的多能干細(xì)胞。
干細(xì)胞可衍生自包括但不限于小鼠、人和靈長(zhǎng)類(lèi)的任何哺乳動(dòng)物。在 采集干細(xì)胞后，可在本發(fā)明方法中直接使用這些細(xì)胞；如，可以足以直接 用于治療目的的量獲得臍帶血細(xì)胞?？蛇x擇性地，可首先擴(kuò)增干細(xì)胞用來(lái) 增加可獲得細(xì)胞數(shù)目，參見(jiàn)如，美國(guó)專(zhuān)利第6,338,942號(hào)。優(yōu)選的用于干 細(xì)胞制備的小鼠林包括129,C57BL/6和雜交株(Brook等，尸rac. Ato/. A^/.
94:5709-5712 (1997)， Baharvand等,/w附ra Ce//Z)ev.歷o/.爿m附. 40:76-81 (2004))。制備小鼠、人或靈長(zhǎng)類(lèi)干細(xì)胞方法在本領(lǐng)域已知并描述 于如Nagy等,M"啤w/""'wg壺mowse e附—o: X /fif6orafo^y層"船/ (操作鼠 胚胎實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港 實(shí)驗(yàn)室出版社)(2002); Thomson等，S"朋ce 282: 1145- 1147 (1998), Marshall等,Me^oAMo/說(shuō)W. 158:11-18(2001); Thomson等，J>ewA
18:53-57 (2000); Jones等，i^/ rad MW. 18:219-223 (2000); Voss等，Ex/ . 230:45-49 (1997);和Odorico等，
2119: 193-204 (2001)。
ES細(xì)胞可直接衍生自胚泡或任何其它發(fā)育早期階段，或可為衍生自體 細(xì)胞核轉(zhuǎn)移和其它類(lèi)似程序的"克隆"干細(xì)胞系?？稍陬}為"5^/w : 5We油力'c Pragma朋dF她re i esearc/2 Z^yec"朋s (干細(xì)胞科學(xué)進(jìn)展和未來(lái) 研究指導(dǎo))"(2001年6月)的關(guān)于干細(xì)胞的MH報(bào)告的附錄C中找到培 養(yǎng)來(lái)自胚泡的小鼠、人或靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的通常方法。如在第一步，預(yù)移 植胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)從圍繞其的滋養(yǎng)外胚層去除。(對(duì)于人ES細(xì)胞培養(yǎng)物， 通過(guò)體外受精產(chǎn)生胚泡并贈(zèng)送作研究。)用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞的小塑料培#^包 含添加有胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，有時(shí)涂有不分裂細(xì)胞的"喂養(yǎng)，，層。所述 喂養(yǎng)細(xì)胞通常為已化學(xué)失活使它們不分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。 也可加入另外試劑，如細(xì)胞因子白血病抑制因子(LIF )，到小鼠ES細(xì)胞 的培養(yǎng)基中。第二步，幾天到一周后去除并*細(xì)胞增殖集落到新培養(yǎng)皿 中，其每個(gè)可包含或可不包含MEF喂養(yǎng)層。如果所述細(xì)胞為了用于人治 療目的，優(yōu)選不包括MEF喂養(yǎng)層。在這些體外的條件下，所述ES細(xì)胞聚 集形成集落。在產(chǎn)生ES細(xì)胞系所需的第三個(gè)主要步驟中，分離并轉(zhuǎn)皿所 述單獨(dú)、不分化集落到新培養(yǎng)皿，稱(chēng)為傳代的步驟。該轉(zhuǎn)亞過(guò)程建立ES 細(xì)胞"系"。如果單獨(dú)ES細(xì)胞產(chǎn)生它，所述細(xì)胞系稱(chēng)為"克隆的"?？捎孟拗?稀釋方法來(lái)產(chǎn)生克隆的ES細(xì)胞系。干細(xì)胞培養(yǎng)需要的試劑可商業(yè)途徑獲 自^口 Invitrogen, Stem Cell Technologies, R&D Systems禾口 Sigma Aldrich,且 描述于如美國(guó)專(zhuān)利公布第2004/0235159號(hào)和第2005/0037492號(hào)和NIH報(bào) 告附錄C,"泣e附ce〃s:iSc/e油y c Pragma朋(i F她re i^earc/z Z)/reC朋s (干 細(xì)胞科學(xué)進(jìn)展和未來(lái)研究指導(dǎo))"，同上。
使用由此描述的千細(xì)胞的方法可用于治療可通過(guò)移植衍生自ES細(xì)胞 的分化細(xì)胞治療的疾病。本發(fā)明的或用本發(fā)明方法生產(chǎn)的干細(xì)胞可用來(lái)治 療任何患者、優(yōu)選人的帕金森病，其它神經(jīng)退行性疾病如阿爾海默茨病， 或?qū)Υ竽X或脊髓創(chuàng)傷性損傷。
本發(fā)明還可用于研究分化或發(fā)育的研究目的，和用于產(chǎn)生用于研究目 的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。由此描述的干細(xì)胞和它們使用方法可用于例如產(chǎn)生和試 驗(yàn)帕金森病或其它神經(jīng)病癥的動(dòng)物模型。還可用本發(fā)明干細(xì)胞和方法來(lái)研究特定化合物對(duì)干細(xì)胞分化、發(fā)育和組織產(chǎn)生或再生的作用。
檢測(cè)Nurrl活化的測(cè)定和篩選
Nurrl為對(duì)中腦多巴胺神經(jīng)元重要的命運(yùn)決定轉(zhuǎn)錄因子(圖1 ),且從 而其為在本發(fā)明篩選測(cè)定中有用的乾。Nurrl以細(xì)胞特異性方式直接反式 激活酪氨酸羥化酶(TH)基因啟動(dòng)子活性(Kim等，J. Neurochem., 85: 622-634, MO3 )(圖2)。另外，多巴胺能表型標(biāo)志物年齡相關(guān)下降與在黑質(zhì) 中Nurrl表達(dá)下調(diào)相關(guān)。因而，激活Nurrl功能分子可通過(guò)增加TH基因 表達(dá)而促進(jìn)DA神經(jīng)元的神經(jīng)元存活和增加多巴胺生產(chǎn)。可根據(jù)本發(fā)明方 法使用小分子文庫(kù)的篩選如高通量篩選(HTS)。
本發(fā)明特征為測(cè)定激活Nurrl功能化合物，因此通過(guò)升高TH基因表 達(dá)促進(jìn)DA神經(jīng)元的神經(jīng)元存活且增加多巴胺生產(chǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)測(cè)定 中，利用包含可操作性連接到天然或修飾的酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子部分的報(bào) 告基因的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包含全部或部分Nurrl基因的效應(yīng)質(zhì)粒。在單獨(dú) 候選化合物或化合物文庫(kù)存在和不存在時(shí)實(shí)行報(bào)告基因測(cè)定。包括但不限 于質(zhì)粒比率、在效應(yīng)質(zhì)粒中存在的Nurrl基因部分、TH啟動(dòng)子長(zhǎng)度和序列、 才艮告基因、細(xì)胞系和報(bào)告基因測(cè)定的各種參數(shù)可單獨(dú)或聯(lián)合地變化來(lái)優(yōu)化 篩選條件。
如，所述效應(yīng)質(zhì)粒包括與編碼另 一結(jié)構(gòu)域(如GAL4 DNA結(jié)合域 (DBD ))的基因融合的編碼Nurrl或其結(jié)構(gòu)域(如LBD (配體結(jié)合域)) 的基因。相應(yīng)的上游DNA激活區(qū)域，如GAL4結(jié)合位點(diǎn)，可操作性連接 到報(bào)告質(zhì)粒中的報(bào)告基因。在候選化合物存在和不存在下，效應(yīng)質(zhì)粒和報(bào) 告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，且基于才艮告基因測(cè)定結(jié)果識(shí)別擊中候選物。
希望地，在一體外測(cè)定中試-瞼候選化合物文庫(kù)，且在第二個(gè)不同體外 測(cè)定中試驗(yàn)該測(cè)定產(chǎn)生的擊中候選物，以去除假陽(yáng)性擊中候選物。
識(shí)別一組擊中候選化合物的體外篩選或其它研究后，希望在體內(nèi)實(shí)行 研究以驗(yàn)證所述擊中候選物。如，可施用候選化合物給試驗(yàn)受試者，如小 鼠；接著，可在來(lái)自試驗(yàn)受試者中腦多巴胺能神經(jīng)元實(shí)行研究以確定擊中 候選化合物相比對(duì)照實(shí)驗(yàn)是否升高了多巴胺表達(dá)。圖3提供了在創(chuàng)建基于細(xì)胞測(cè)定中包括的過(guò)程的綜述，使用它們識(shí)別
和確定(refine)擊中候選化合物，且在體內(nèi)試驗(yàn)這些化合物。以下描述了 篩選和測(cè)定試驗(yàn)的具體實(shí)施例。
實(shí)施例
提供以下的實(shí)施例作說(shuō)明本發(fā)明的目的，且不該理解為限制。 實(shí)施例1. Nurrl基于細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)
創(chuàng)建利用Nurrl激活TH的基于細(xì)胞系統(tǒng)以開(kāi)發(fā)識(shí)別Nurrl激活化合 物的測(cè)定。使用SK-N-BE(2)C(TH表達(dá))細(xì)胞作宿主細(xì)胞系，表明Nurrl效 應(yīng)子對(duì)轉(zhuǎn)染中報(bào)告質(zhì)粒明確應(yīng)答。另外，選擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，而非使用穩(wěn)定細(xì) 胞系轉(zhuǎn)染，來(lái)支持化合物對(duì)所述報(bào)告基因最大應(yīng)答性，以檢測(cè)在第一次篩 選中低親和性的擊中化學(xué)藥品?？紤]的另一個(gè)參數(shù)為選擇具有所有重要 NBRE (Nurrl結(jié)合)樣基序而非某一特定種類(lèi)的NBRE基序的短長(zhǎng)度天然 TH啟動(dòng)子，基于如下的假設(shè)天然啟動(dòng)子比人工復(fù)制啟動(dòng)子產(chǎn)生更接近 的生物學(xué)篩選條件，且因?yàn)槠渌幌嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用的^^陽(yáng)性化學(xué)藥 品可通過(guò)有效的第二篩選方法容易地排除。
為了開(kāi)發(fā)該新的Nurrl基于細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)，嘗試包括效應(yīng)基因啟動(dòng)子、 內(nèi)參基因啟動(dòng)子、TH啟動(dòng)子大小、內(nèi)參基因啟動(dòng)子、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件、血 清濃度和DMSO效果的多種參數(shù)的幾個(gè)組合。如，考察TH啟動(dòng)子大小對(duì) 才艮告基因的影響(圖4 ),表示在SK-N-BE(2)C細(xì)胞中，外源Nuni表達(dá)強(qiáng) 烈地反式激活由2.6 kb-TH驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因表達(dá)好于由6.0 kb-TH驅(qū)動(dòng)的報(bào) 告基因表達(dá)。
利用小化學(xué)藥品文庫(kù)實(shí)行在部分優(yōu)化條件下初步篩選Nurrl激活子。 如在圖5A-5B和6中表示， 一些候選化合物顯示相比對(duì)照熒光素酶活性幾 倍的升高。
-使用該方法，識(shí)別幾個(gè)初步擊中候選物為使用Nurrl效應(yīng)子和融合到 螢火蟲(chóng)熒光素酶2.6-TH啟動(dòng)子起始篩選的Nurrl激活子。作為第二篩選體 系，使用GAL4DNA結(jié)合域(DBD)構(gòu)建體，其分開(kāi)地融合全部Nurrl 、Nurrl-配體結(jié)合域(LBD)或Nurrl-DNA結(jié)合域到酵母GAL4 DBD。如， 在表7中表示初步擊中候選物對(duì)具有GAL4 DBD-Nurrl LBD報(bào)告基因的作 用，其表示該第二體系可從初步擊中候選物篩選出假陽(yáng)性。使用6-MP作 該實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照，其通過(guò)在氨基終端區(qū)域調(diào)控Nurrl。識(shí)別阿莫地喚和 格拉非寧為在該第二測(cè)定中的擊中候選化合物。
該實(shí)驗(yàn)系列表明使用初步和第二篩選兩者的值來(lái)識(shí)別可用作治療帕 金森病的先導(dǎo)化合物。
實(shí)施例2. 7-氯-4-M會(huì)啉化合物相對(duì)活性測(cè)定
在添加有10%胎牛血清(Hyclone )、 100嗎/mL鏈霉素和100單位/mL 青霉素的Dulbecco修飾Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SK-N-BE(2)C 細(xì)胞，且在轉(zhuǎn)染前一天以在無(wú)抗生素的上述培養(yǎng)基中25,000細(xì)胞/孔加入 96孔板。以1: 1摩爾比的包含Nurrl基因的效應(yīng)質(zhì)粒與包含報(bào)告基因的 才艮告構(gòu)建體轉(zhuǎn)染每個(gè)96孔板(圖8A-8B和9A-9B)。通過(guò)脂質(zhì)體 (Lipofectamine )方法執(zhí)4亍壽爭(zhēng)染，且利用Qiagen 4主(Qiagen Co., Santa Clarita, CA， USA)制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒。每個(gè)96孔板使用的總DNA量為0.2 嗎，且0.02嗎pRSV-b-gal用作內(nèi)參。在轉(zhuǎn)染日，在25 pi Opti-MEM I減 少的血清培養(yǎng)基中稀釋0.2貼DNA,且在對(duì)每個(gè)96孔板的25 jil Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋0.5 [il脂質(zhì)體。培養(yǎng)五分鐘后，合并稀釋的DNA和稀釋的脂 質(zhì)體，且在室溫培養(yǎng)四十分鐘來(lái)允許形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
在去除50jilDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物后，加入三種化合物(阿莫地唾、格 拉非寧和二磷酸氯喹)且過(guò)夜培養(yǎng)，每種化合物在有3%活性炭處理的胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基中稀釋到合適濃度。然后用50nl裂解緩沖液裂解 來(lái)自每個(gè)96孔板的細(xì)胞，所述裂解緩沖液包含25 mM Tris磷酸鹽(pH 7.8)、 2mMDTT、 2mM CDTA(l,2-二氨基環(huán)己烷-N,N,N',N'-四乙酸)、10%甘油 和l%TritonX-100。接著，加入等體積的螢火蟲(chóng)熒光素酶底物，且使用光 度計(jì)板讀數(shù)器測(cè)量所述熒光素酶活性，且如在下表表示，將其標(biāo)準(zhǔn)化作j3-半乳糖苦酶活性
25衍生物(+: REL.活性)溶于DMSO溶于lxPBS
阿莫地喹(4E)++++++++
格拉非寧(11D)++++++
二磷酸氯喹■++
實(shí)施例3.建立體外功能體系來(lái)研究擊中候選物
可建立體外功能研究體系來(lái)選擇作進(jìn)一步治療帕金森病藥物先導(dǎo)開(kāi) 發(fā)的最佳擊中候選物。 一個(gè)可能的Nurrl激活子功能研究系統(tǒng)由以下組成 通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)TH基因表達(dá)的升高、通過(guò)HPLC的多巴胺量的檢測(cè)和 在多巴胺能細(xì)胞系中TH蛋白質(zhì)的免疫染色。
遞過(guò)-^PO 定#77/多巴胺細(xì)胞系MN9D提供有用的研究 擊中候選物功能的體外模型。通過(guò)來(lái)自小鼠胚胎14日中腦嘴側(cè)被蓋部和 成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系N18TG2的初級(jí)神經(jīng)元體細(xì)胞融合產(chǎn)生MN9D (Choi 等，Brain Res., 552:67-76,1991)。 MN9D細(xì)胞合成兒茶酚胺，具有胚胎性質(zhì)， 表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，且對(duì)DA細(xì)胞毒素N-甲基-4-苯基吡啶鎗(MPP) 敏感(Kim等，Biochem. Biophys. Res. Commun., 286:659-665, 2001)。在這些 實(shí)驗(yàn)中，MN9D細(xì)胞在添力。10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 pg/ml 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中在37°C 、 5% C02下培養(yǎng)。利用TriReagent、 接著DNA酶I處理來(lái)制備來(lái)自暴露于候選化合物MN9D細(xì)胞的總RNA。 利用5昭RNA以及用于RT-PCR的Superscript 第一鏈合成系統(tǒng)獲得 cDNA。產(chǎn)生的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板。可使用以下的引物組合作實(shí) 時(shí)PCR分析
肌動(dòng)蛋白5'-GGCATTGTGATGGACTCCGG-3'和 5'-TGCCACAGGATTCCATACCC誦3' (358 bp); TH: 5'誦TTGGCTGACCGCACATTTG-3'和 5'-ACGAGAGGCATAGTTCCTGAGC-3' (336 bp); GAD: 5'-GGGTTTGAGGCACACATTGATAAG-3'和 5'-GCGGAAGAAGTTGACCTTGTCC-3' (279 bp);
26Nurrl : 5'-CATGGACCTCACCAACACTG-3'和 5'誦GAGACAGGTGTCTTCCTCTG-3' (383 bp)。
可實(shí)行實(shí)時(shí)PCR以定量表達(dá)水平?？墒褂肈NA發(fā)動(dòng)機(jī)Opticon (MJ Research, Waltham, MA)在包含0.5pM每個(gè)引物、0.5xSYBR Green I (Molecular Probes )和2jxl 10倍稀釋cDNA的25^il體積中實(shí)行擴(kuò)增。所 述PCR反應(yīng)由使用以下溫度特征的50個(gè)循環(huán)組成95°C 30秒、60°C 30 秒、72°C 30秒和79。C 5秒。確定每個(gè)PCR產(chǎn)物的熔解溫度。每個(gè)PCR 循環(huán)后，在79。C檢測(cè)熒光信號(hào)以熔解引物二聚體(這里使用的所有引物二 聚體的Tm為低于79°C )。然后通過(guò)凝膠電泳確定每個(gè)PCR產(chǎn)物純度(定 義為單個(gè)特異條帶的出現(xiàn))。使用GAPDH質(zhì)粒DNA (從103到108分子) 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將來(lái)自特異PCR產(chǎn)物的熒光信號(hào)相比肌動(dòng)蛋白的熒光 信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)每個(gè)基因，分析兩個(gè)獨(dú)立樣品，且應(yīng)該重復(fù)所有的反應(yīng)至 少兩次。
ifi^/ff丄C ;€#,。麼。在暴露于候選化合物后用細(xì)胞裂解物實(shí)行 HPLC分析多巴胺。來(lái)自6個(gè)孔的細(xì)胞裂解物收集到一起，并通過(guò)加入200 高氯酸(PCA)和EDTA (終濃度分別為0.33 M和0.17 mM)沉淀蛋白 質(zhì)。在14,000xg離心10分鐘后，分離細(xì)胞內(nèi)組分(上清液)和細(xì)胞沉淀， 分別作纟田月包內(nèi)DA禾口蛋白質(zhì)分才斤。廿口在Andersson等，Neurotoxicology, 16:201-210, 1995描述的，使用反相分離柱來(lái)實(shí)行用電化學(xué)檢測(cè)的HPLC分 析。
^i^襲^ 77/ f ^{。在化合物處理后，用4%曱醛(Electron Microscopy Sciences, Ft. Washington, PA)固定MN9D細(xì)胞30分鐘，用PBS洗滌，然后 用封閉緩沖液[PBS, 10%正常猴血清(NDS)或正常羊血清(NGS), 0.1% TritonX-100]孵育十分鐘。利用在包含2%NDS或NGS的PBS中稀釋的 初級(jí)抗體，在4。C培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。可使用多種初級(jí)抗體，如兔抗P-微管蛋 白(l : 2000; Covance, Richmond, CA)、羊抗-TH (1 : 200; Pel-Freez, Rogers, Arkansas),羊抗-AADC (1 : 200; Chemicon, Temecula, CA)、鼠抗-DAT (1 : 1000; Chemicon)或兔抗-5-羥色胺(HT) (1 : 3000; Diasorin, Stillwater, MN)。 然后使用抗-"氨基丁酸(GABA) (1 : 5000; Sigma)沉淀所述蛋白。用PBS洗滌后，用熒光標(biāo)記的二抗在含2。/。NDS或NGS的PBS中室溫下孵育蓋玻 片30分鐘，所述二抗如Alexa Fluor 488 (綠色)或Alexa Fluor 568(紅色)-標(biāo) 記的驢/山羊IgG (1 : 500; Molecular Probes, OR)。在PBS中沖洗3x10分鐘 后，然后利用Gel/Mount (Bi0meda Corp., Foster City, CA)將蓋玻片裝到載玻 片上?？墒褂醚b有氪、氪/氬和氦激光器的Leica TCS/NT共聚焦顯微鏡檢 查細(xì)胞?？筛鶕?jù)在Chung等，Eur. J. Neurosci., 16:1829-1838, 2002描述的實(shí) 驗(yàn)設(shè)計(jì)或其修改版計(jì)數(shù)細(xì)胞。
實(shí)施例4.多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分化
對(duì)于體外ES細(xì)胞分化，我們使用5階段方法，其在本領(lǐng)域已知(見(jiàn)，如, Lee等，Nat. Biotechnol. 18:675-679, 2000)且用于分辨ES細(xì)胞發(fā)育進(jìn)展的 每個(gè)階段。根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法(見(jiàn)，如，Deacon等，Exp. Neurol., 149:28-41: 1998,和Chung等，Stem Cells, 20:139-145, 2002)繁殖和保持小鼠胚泡衍生 的ES細(xì)胞系D3和Jl。產(chǎn)生小鼠ES細(xì)胞為在如下組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中非 翁附細(xì)菌皿上四天的胚狀體(EB):添加有2mM L-谷氨酰胺、0.001%卩-巰基乙醇、lx非必需氨基酸(全部來(lái)自Invi加gen)和10% FBS (Hyclone)的 DMEM。然后所述EB鋪板到黏附組織培^mi表面。在培養(yǎng)24小時(shí)后，在 無(wú)血清ITSFn培養(yǎng)基中實(shí)行選擇巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。選擇十天后，通過(guò)如下 擴(kuò)增巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)由胰蛋白酶消化離解所述細(xì)胞和隨后在補(bǔ)充有層 粘連蛋白(lpg/ml)和基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) (10 ng/ml) (Invitrogen)的N2培養(yǎng)基中鋪于聚L-鳥(niǎo)氨i^/纖連蛋白涂層的蓋玻片上。 通過(guò)從包含層粘連蛋白的N2培養(yǎng)基撤去bFGF來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞分 化。為了觀察阿莫地喹(4E)效果，我們加入每個(gè)2^M4E化合物到在ES 衍生神經(jīng)元階段第五天的ES衍生神經(jīng)元持續(xù)四天的一段時(shí)間。
細(xì)胞在lxPBS的4%的低聚曱醛中固定，裝到玻璃載玻片上且用包括 抗-TH (Pelfreeze)和抗-卩-微管蛋白III (Covance)的初級(jí)抗體染色(圖10A 到10B)。使用合適的Alexa488-和Alexa555-標(biāo)記的第二抗體(Molecular Probes )和4，,6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染色來(lái)顯4象。
其它實(shí)施方案
在以上說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用并
28入。所述本發(fā)明方法和體系的各種調(diào)整和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是 明顯的，而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。盡管已結(jié)合具體實(shí)施方案描述了 本發(fā)明，但應(yīng)理解，所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵抻谶@些具體實(shí)施方 案。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)Jt或:技術(shù)人員明顯的、用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各 種調(diào)整預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其它的實(shí)施方案在權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1. 一種用于治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法，其包括如下步驟(a)確定患者是否具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森??；和(b)如果所述患者具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森病，則施用足以治療或抑制帕金森病發(fā)展的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物給所述患者。
2. —種治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法，其包括如下步驟(a) 確定患者是否具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森?。缓?b) 如果所述患者具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森病，則施用足以激活所述患者細(xì)胞中Nurrl的量的7-氯-4-氨基會(huì)啉化合物給所述患者。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述化合物為阿莫地喹。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述化合物為格拉非寧。
5. —種試劑盒，其包括(a) 7-氯-4-氨基喹啉化合物；和(b )有關(guān)施用所述化合物到被診斷具有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展帕金森病的患者的說(shuō)明書(shū)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述化合物為阿莫地喹。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述化合物為格拉非寧。
8. —種用于引起體外千細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括使所述體外干細(xì)胞與以足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化的量存在的7-氯-4-氨基奮啉化合物接觸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述千細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物為阿莫地喹。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述化合物為格拉非寧。
12. —種用于治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法，其包括如下步驟(a) 注射包括千細(xì)胞的組合物到患者腦中；和(b) 接著步驟(a),施用足以誘導(dǎo)所述干細(xì)胞分化的量的7-氯-4-氨基奮啉化合物給所述患者。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述千細(xì)胞為人胚胎千細(xì)胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述化合物為阿莫地喹。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述化合物為格拉非寧。
16. —種用于治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法，其包括注射包含干細(xì)胞和7-氯-4-氨基喹啉化合物的組合物到患者腦中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述干細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述化合物為阿莫地喹。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述化合物為格拉非寧。
20. —種藥物組合物，其包括(a) 干細(xì)胞；和(b) 7-氯-4-氨基唾啉化合物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述千細(xì)胞為人胚胎千細(xì)胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述化合物為阿莫地p奎。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述化合物為格拉非寧。
24. —種用于識(shí)別在帕金森病中作治療用途的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a) 用包含Nurrl基因結(jié)構(gòu)域的第一質(zhì)粒和包含可操作連接到報(bào)告基因的啟動(dòng)子的第二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞；(b) 以候選化合物接觸所述細(xì)胞；(c) 測(cè)定所得到的所述報(bào)告基因的表達(dá)水平；和(d)將所迷水平與對(duì)照值比較，其中，如果所述水平比所述對(duì)照值高至少20%,則識(shí)別所述候選化合物為在帕金森病中作治療用途的化合物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在步驟(c)之前培養(yǎng)在步驟(b)中產(chǎn)生的混合物18小時(shí)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞為SK-N-BE(2)C細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一質(zhì)粒和所述第二質(zhì)粒的摩爾比率為0.1到10。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第二質(zhì)粒包括酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子的100個(gè)磁基。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述第二質(zhì)粒包括酪氨酸鞋化酶啟動(dòng)子的2,600個(gè)堿基。
30. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述報(bào)告基因是螢火蟲(chóng)熒光素酵。
31. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第一質(zhì)粒包括可操作性連接到所述Nurrl基因結(jié)構(gòu)域的GAL4 DNA結(jié)合域，且其中所述笫二質(zhì)粒包括可操作性連接到所述報(bào)告基因的GAL4結(jié)合位點(diǎn)。
32. —種用于識(shí)別在帕金森病中作治療用途的化合物的方法，所述方法包括如下步驟(a) 提供(i )能夠產(chǎn)生多巴胺的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和(ii )利用權(quán)利要求24所述方法識(shí)別的化合物；(b) 以所述化合物接觸所述細(xì)胞；(c) 測(cè)定所得到的酪氨酸羥化酶或多巴胺的表達(dá)水平；和(d) 將所述水平與對(duì)照值比較，其中，如果所述水平比所述對(duì)照值高至少20%,則識(shí)別所述化合物為在帕金森病中作治療用途的化合物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述測(cè)定包括使用實(shí)時(shí)PCR定量酪氨酸羥化酶。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所迷的方法，其中所述測(cè)定包括使用HPLC分析定量多巴胺。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述測(cè)定包括使用免疫染色定量酪氨酸鞋化酶。
全文摘要
本發(fā)明特征為通過(guò)施用7-氯-4-氨基喹啉化合物如阿莫地喹或格拉非寧治療或抑制帕金森病發(fā)展的方法和試劑盒。干細(xì)胞也在本發(fā)明方法中有用，且可與7-氯-4-氨基喹啉化合物分開(kāi)或一起施用。本發(fā)明進(jìn)一步特征為識(shí)別在治療或抑制帕金森病發(fā)展中有用的另外化合物的方法。
文檔編號(hào)A61K31/4706GK101466380SQ200780012800
公開(kāi)日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者金天炯, 金德中, 金洸秀 申請(qǐng)人:麥克萊恩醫(yī)院