專利名稱：修飾的腺病毒六鄰體蛋白和其應(yīng)用的制作方法
修飾的腺病毒六鄰體蛋白和其應(yīng)用
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及可用于免疫原性方案的修飾的腺病毒六鄰體蛋白。
腺病毒是雙鏈DNA病毒，基因組大小約為36千堿基(kb)，由于能夠 在多種耙組織中實(shí)現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)移以及較大的轉(zhuǎn)基因容量，它被廣泛用于 基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用。通常，腺病毒的E1基因缺失，被取代為由所選啟動子、感 興趣基因cDNA序列和聚A信號組成的轉(zhuǎn)基因盒，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組病毒。
腺病毒的形態(tài)特征是由三種主要蛋白和許多群體小蛋白VI、 VIII、 IX、 nia和Iva2組成的二十面體殼體，這三種主要蛋白是六鄰體(II)、五鄰體基 質(zhì)(III)和突結(jié)纖維(knobbed fibre)(IV)[W.C. Russell ，丄Ge" Kiro/.， 81:2573-2604 (2000年11月)]。病毒基因組為線性雙鏈DNA，末端蛋白共 價(jià)連接于含有末端反向重復(fù)(ITR)的5'末端。病毒DNA與高堿性蛋白VII 和稱為mu的小肽密切相連。另一種蛋白V與此DNA-蛋白質(zhì)包裝在一起， 并通過蛋白VI提供與殼體的結(jié)構(gòu)連接。該病毒也含有病毒編碼的蛋白酶， 這種蛋白酶是加工某些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生成熟的感染性病毒所必需的。
腺病毒在基因遞送和疫苗方案中的應(yīng)用已有報(bào)道。已報(bào)道可使用重組 腺病毒將分子遞送至宿主細(xì)胞。參見美國專利6，083，716，它描述了兩種黑 猩猩腺病毒Cl和C68(Pan9)的基因組。也參見國際專利公開號WO 02/33645，它描述了由黑猩猩腺病毒SAd22/Pan5、 Pan6、 Pan 7以及猿腺病 毒SV1、 SV25和SV39的基因組構(gòu)建的載體；還參見國際專利公開號WO 04/16614，它描述了雜交腺病毒載體和由猿腺病毒SA18構(gòu)建的載體。
先前己提出各種腺病毒修飾。
這類修飾包括向腺病毒纖維蛋白中插入[Curiel， D.T.， Ann N Y Acad Sci.， 886:158-71 (1999)];向五鄰體蛋白中插入以便耙向[Einfeld， D.A.等， J Virol. 73:9130-6) (1999)];向腺病毒蛋白IX中插入以便靶向[Dmitriev，1.P.等(2002) P7n /. 76:6893-9 (2002)]和修飾腺病毒六鄰體以便靶向 [Vigne， E.等， /73:5156-61 (1999); Latta, Martine等的美國公開的專 利申請?zhí)朥S2003143209]，以及插入抗原性表位。
更具體說，Crompton等[(1994) J Gen Virol. 75:133-9 (1994)]報(bào)道過將 外來肽插入人腺病毒血清型2(HAdV-2)的六鄰體蛋白中。參照Roberts等 [Roberts等(l986)， Science. 232:1148-51]報(bào)道的HAdV-2結(jié)構(gòu)，作者用攜帶 脊髓灰質(zhì)炎病毒決定簇的17氨基酸肽取代HAdV-2六鄰體的17個(gè)氨基酸 (281-297)?，F(xiàn)在，進(jìn)行這種取代的六鄰體區(qū)域被認(rèn)為是P片層元件卩7和 (38之間的DE1環(huán)[Rux JJ等(2003) J Virol.77:9553-66]。
Vigne等(如上所述)在人腺病毒血清型5(HAdV-5)中再現(xiàn)了 Crompton等 (1994)的工作，該血清型屬于與HAdV-2相同的血清學(xué)亞組，并與其緊密相關(guān)。 更具體說，Vigne等將肽插入HAdV-5六鄰體中與Crompton等所述相同的位置 上(根據(jù)HAdV-2六鄰體與HAdV-5六鄰體的蛋白質(zhì)比對)。Vigne等用脊髓灰 質(zhì)炎病毒肽以及整聯(lián)蛋白-靶向配體取代14個(gè)HAdV-5六鄰體殘基(269-281)。
腺病毒六鄰體高變區(qū)已被描述為不同血清型之間序列明顯不同的區(qū)域 (Crawford-Miksza和Schnurr DP)。 15種腺病毒六鄰體蛋白的分析揭示出含 有血清型特異性殘基的七種高變區(qū)的位置和結(jié)構(gòu)(J. Virol. 1996 70:1836-44; Rux等，2003)。
需要另一種將分子遞送給宿主細(xì)胞的方法。
發(fā)明概述
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有含修飾的腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病 毒。該腺病毒具有包含六鄰體蛋白的修飾殼體，其中至少在腺病毒六鄰體 蛋白的高變區(qū)1和/或高變區(qū)4中發(fā)生缺失，外源性分子就插入該缺失位點(diǎn) 中。
在另一方面，本發(fā)明提供一種改變腺病毒載體特異性的方法。該方法 包括提供具有含有本文所述修飾的腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，其 中異源靶向氨基酸序列插入其高變區(qū)的至少一個(gè)缺失位點(diǎn)中。
另一方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)對腺病毒載體遞送的免疫原性分子的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟向?qū)ο筇峁┍景l(fā)明具有含修飾的腺病 毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，所述腺病毒還含有編碼殼體中包裝的免疫 原性分子的核酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，其包含具有含修飾的腺' 病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，該修飾的腺病毒六鄰體蛋白的功能缺失 高變區(qū)中含有外源性免疫原或抗原。
又一方面，本發(fā)明提供一種自啟式免疫原性組合物，其包含具有含修 飾的腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，該修飾的腺病毒六鄰體蛋白的功 能缺失高變區(qū)1和/或高變區(qū)4中含有異源的免疫原或抗原。這種腺病毒攜 帶的表達(dá)盒中還包含第二種免疫原或抗原。
下述發(fā)明詳述容易地表現(xiàn)出本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡要說明


圖1是將攜帶六鄰體編碼區(qū)的人腺病毒5型基因組(HAdV-5)亞克隆到 質(zhì)粒pNEB193(購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs))產(chǎn)生的 pNEBAsc的質(zhì)粒圖。
圖2A是(p)SRAd5eGFP的質(zhì)粒圖，它是含有天然腺病毒六鄰體和綠色 熒光蛋白標(biāo)記基因的El和E3-缺失的HAdV-5載體的分子克隆。
圖2B是pH5sCD4eGFP的質(zhì)粒圖，它是含有HAdV-5主鏈和突變六鄰 體的質(zhì)粒分子克隆，所述突變六鄰體含有SARS冠狀病毒的突起蛋白的CD4 表位。
圖2C是pH5sCD8eGFP的質(zhì)粒圖，它是含有El、 E3-缺失的HAdV-5 基因組和突變六鄰體的質(zhì)粒分子克隆，所述突變六鄰體含有SARS冠狀病 毒的突起蛋白的CD8表位。
圖2D是pH5-2F5eGFP的質(zhì)粒圖，它是含有El、 E3-缺失的HAdV-5 基因組和突變六鄰體的質(zhì)粒分子克隆，所述突變六鄰體含有HIV 2F5表位 區(qū)。
圖2E是pH5-hexBspeEI的質(zhì)粒圖，它是含有El、 E3-缺失的HAdV-5
基因組和突變六鄰體的質(zhì)粒分子克隆，所述突變六鄰體不含插入物。圖3是含有猿腺病毒SAdV-23(是舊命名法命名的Pan6或C6); SAdV-22(是舊命名法命名的SAd22/Pan5或C5); SAdV-24(是舊命名法命名 的Pan7或C7);和SAdV-25 (是舊命名法命名的C68)的高變區(qū)(HVR)1 、 2、 3、 4、 5、 6和7的腺病毒六鄰體蛋白部分的比對。顯示了這些序列中HVR 的位置，其中相對于所示各序列編號。在SAdV-23中，該片段是SEQ ID NO:3的氨基酸131-495，在SAdV-22中，該片段是SEQ ID NO:4的氨基酸 131-486;在SAd24中，該片段是SEQ ID NO:5的氨基酸131-485;在SAd25 中，該片段是SEQ ID NO:6的氨基酸131-486;在hAd5中，該片段是SEQ ID NO:2的氨基酸131-509。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供修飾的腺病毒六鄰體蛋白。這種修飾的腺病毒六鄰體蛋白 的至少一個(gè)高變區(qū)部分或完全缺失。修飾的腺病毒六鄰體蛋白中可以插入 一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選擇的外源性分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，將外源性分子插 入至少一個(gè)高變區(qū)1或高變區(qū)4缺失位點(diǎn)中，限制條件是該外源性分子 不衍生自腺病毒?；蛘?，修飾的腺病毒六鄰體蛋白的指定缺失區(qū)中可不含 任何插入物。
修飾的腺病毒六鄰體蛋白可用于產(chǎn)生腺病毒殼體和/或感染性腺病毒 顆粒。因此，本文所用的修飾的腺病毒殼體指含有本文所述的修飾的腺病 毒六鄰體蛋白的腺病毒殼體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明修飾的腺病毒殼體可以為空，即，不含病毒基 因組和/或表達(dá)盒。這種修飾的腺病毒殼體可配制在以蛋白質(zhì)遞送的組合物中。 或者，這種修飾的腺病毒殼體可配制在以適合宿主細(xì)胞表達(dá)的載體遞送的組合 物中。
在另一實(shí)施方式中，以具有修飾腺病毒殼體的腺病毒顆粒的形式產(chǎn)生修飾 的腺病毒殼體，其中包裝有一種或多種遞送給細(xì)胞的異源分子。除非另有說明， 本文所用的修飾的腺病毒載體指這類腺病毒顆粒。
在人腺病毒亞組C中鑒定到高變區(qū)l(HVRl)和高變區(qū)4(HVR4)。這些 區(qū)域的結(jié)構(gòu)以及腺病毒亞組C基因組中其它高變區(qū)，即HVR2、 HVR3、HVR4、 HVR5、 HVR6和HVR7的結(jié)構(gòu)尚不明確。為方便起見，在SEQID NO:l中復(fù)制出人腺病毒血清型2六鄰體蛋白。為方便起見，在SEQ ID NO:2 中復(fù)制出人腺病毒血清型5六鄰體蛋白。
如果不希望受理論束縛，本發(fā)明者相信本發(fā)明修飾的腺病毒六鄰體蛋 白是有利的，因?yàn)椴煌俨《镜牧忬wHVR區(qū)域的長度和序列明顯不同， 從而產(chǎn)生能夠耐受插入不同長度的各種分子的彈性構(gòu)建物。因此，本發(fā)明 提供能夠插入用于耙向和提高免疫應(yīng)答的各種異源分子的高度彈性構(gòu)建 物。
術(shù)語"功能性"指行使其天然功能(但未必與天然產(chǎn)物水平相同)的產(chǎn)物 (如蛋白質(zhì)或肽)。術(shù)語"功能性"也可指編碼產(chǎn)物并可由其表達(dá)所需產(chǎn)物的基 因。"功能性缺失"指破壞產(chǎn)物行使其天然功能的能力的缺失。
如本文所用，本文用于描述HVR的缺失可包括消除構(gòu)成該六鄰體蛋白 的HVR的所有或一部分氨基酸序列。例如，對于45個(gè)氨基酸的HVR(如 Ad2或Ad5的HVRl)，可產(chǎn)生1-45個(gè)氨基酸的缺失，例如可產(chǎn)生l-5個(gè)， 至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)或更多個(gè)氨基酸的缺失。 在一個(gè)實(shí)施方式中，保留天然高變區(qū)中N末端的至少一個(gè)氨基酸和C末端 的至少一個(gè)氨基酸。
如本說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語"包括"和"含有"和其變形 形式，包括"包含"、"含"等其它形式指包含其它組分、元素、數(shù)值、 步驟等。術(shù)語"由...組成"和其變體則不包含其它組分、元素、數(shù)值、步驟 等。
在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的腺病毒殼體中HVR1和/或HVR4有缺失。 在另一實(shí)施方式中，修飾的腺病毒殼體的這兩個(gè)區(qū)域中一個(gè)或兩個(gè)含修飾， 而另一所選HVR，如HVR2、 HVR3、 HVR5、 HVR6或HVR7中也可含有 修飾。
根據(jù)HAdV-2[SEQ ID NO:l， R. J. Roberts等，X cow""sws ^《wewce/or Ae "&"oWn^-2 ge"ome(腺病毒-2基因組的共有序列)，1-51頁，刊于W. Doerfler (編)Adenovirus DNA(腺病毒DNA). Martinus Nijhoff Publishing(馬 丁內(nèi)斯出版社)，波士頓]的殘基編號方案，高變區(qū)l位于HAdV-5[SEQ ID NO:2]和HAdV-2[SEQ ID NO:l]中六鄰體蛋白的殘基139-167或殘基147-162 內(nèi)。根據(jù)相同的編號方案，高變區(qū)4位于HAdV-2六鄰體蛋白的殘基222-271 中。參見例如圖3的示范性比對，提供了其相對于自身的編號方案的其它 腺病毒的HVR位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種比對如何進(jìn)行。
根據(jù)這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難利用不同腺病毒序列的六鄰體序 列的比對確定相應(yīng)高變區(qū)，所述腺病毒序列包括人腺病毒亞組C中的血清 型或在腺病毒亞組C以外的血清型的腺病毒序列。幾種腺病毒序列和其高 變區(qū)位置的比對參見例如，Crawford-Miksza和Schnurr ，同上，和Rux JJ ， 等(2003)，同上。不難從已經(jīng)描述過的其它人或非人序列中選擇其它合適的 腺病毒序列。
如本文所述，用各種從公共渠道獲得或購得的多序列比對程序 (Multiple Sequence Alignment Programs)進(jìn)行比對，例如可通過互聯(lián)網(wǎng)Web 服務(wù)器獲得的"Clustal W"進(jìn)行比對。或者，也可使用載體NTI實(shí)用程序。 還有許多本領(lǐng)域已知的算法也可用于測量核苷酸序列同一性，包括包含在
上述程序中的算法。作為另一個(gè)實(shí)例，可使用GCG6.1版中的程序FastaTM 來比較多核苷酸序列。FastaTM可得出查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區(qū) 域的比對和序列同一性百分比。例如，可使用GCG6.1版提供的FastaTM及 默認(rèn)參數(shù)(字長為6和用于計(jì)分矩陣的NOPAM系數(shù))來確定核酸序列之間的 序列同一性百分比，該程序此處引用作為參考?？刹捎孟嗨瞥绦蜻M(jìn)行氨基 酸比對。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員可視需要改變設(shè)置，但通常這些程序都以默 認(rèn)設(shè)置使用?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員也可釆用能夠象上述算法和程序一樣 得出同一性水平或進(jìn)行比對的其他算法和計(jì)算機(jī)程序。
合適的腺病毒可獲自位于美國弗吉尼亞州瑪納薩斯(Manassas， Virginia ， US)的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，各種學(xué)術(shù)和商業(yè)來源，或可參考文獻(xiàn)中公開或獲自數(shù) 據(jù)庫(如GenBank等)的序列用已知技術(shù)合成所需區(qū)域。合適腺病毒的例子 包括但不限于人腺病毒血清型2[序列公開于R丄Roberts等，A consensus s叫uence for the adenovirus-2 genome(腺病毒-2基因組的共有序列)，1-51頁， 刊于W. Doerfler (編)Adenovirus DNA(月泉病毒DNA). Martinus NijhoffPublishing(馬丁內(nèi)斯出版社)，波士頓]，血清型3、血清型4[HAdV-4基因 組序列參見S. Jacobs等，J Ge" K>o/ 85 (2004) ， 3361-3366 ， GenBank/EMBL/DDBJ登錄號AY487947],血清型5[序列公開于R. Kinlock 等，1984， Adenovirus hexon: sequence comparison of subgroup C serotypes 2 and 5(腺病毒六鄰體亞組C血清型2和5的序列比較). /歷o/. C/zem. 259:6431-6436〗，AVI和AV6 [P. Pring-Akerblom和T. Adrian, 1993, F/ /， 144:117-121]，血清型7、 12[序列公開于J. Sprengel等， / K>o/， 68:379-389 (1994)]，血清型40 [序列公開于C I Toogood等，■/ Ge" K,>o/， 70:3203-3214 (1989)]，還包括目前鑒定的人血清型[參見例如Horwitz， "Adenoviridae and Their Replication"(腺病毒科和其復(fù)制)，干iJ于 Virology(病毒學(xué))第2版，第1679-1721頁(19卯)](可以在所需細(xì)胞中培養(yǎng))。 已知能感染非人靈長動物(如黑猩猩、獼猴、短尾猴和其它猿猴物種)或其它 非人哺乳動物，并能在所需細(xì)胞中生長的相似腺病毒均可用于本發(fā)明載體 構(gòu)建物。這類血清型包括但不限于黑猩猩腺病毒SAd22/Pan5 [VR-591]、 SAd23/Pan6 [VR-592]、 Sad24/Pan7 [VR-593]和SAd25/C68 [Pan9， GenBank 登錄號AF394196)和美國專利號6，083，716];和猿腺病毒，包括但不限于SV1 [VR-195]; SV25 [SV-201]; SV35; SV15; SV-34; SV-36; SV-37,和狒狒 腺病毒[VR-275]等。已描述過SAd22/Pan5 (也稱為C5)、 SAd23/Pan 6 (也稱 為C6)、 SAd24/Pan 7 (也稱為C7)、 SV1、 SV25禾q SV39的序列[公開于2003 年6月5日的WO 03/046124，也于2005年3月31日公開為 US-2005-0069866-A1]，納入本文作參考。也參見國際專利公開號WO 04/16614，其描述雜交腺病毒載體和由猿腺病毒SA18構(gòu)建的載體。本發(fā)明 重現(xiàn)了 SAd22/Pan5 [SEQ NO: 4]、 SAd23/Pan6 [SEQIDNO: 3]、 SAd24/Pan7 [SEQ ID NO:5]、 SVl [SEQ ID NO:10]、 SV25 [SEQ ID NO:7]、 SV39 [SEQ ID NO: 8]和SA18 [SEQIDNO: 9]的六鄰體蛋白的序列。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)理解，不難選擇衍生自其它腺病毒毒株的相當(dāng)區(qū)域，并用于本發(fā)明以 替代這些血清型或與其聯(lián)用。
使用這些技術(shù)時(shí)，也可鑒定到其它腺病毒序列中的類似于HVR1禾口/ 或HVR4的高變區(qū)，或在腺病毒亞組C中鑒定到其它HVR。除這些修飾外，本發(fā)明修飾的腺病毒六鄰體還含有對一個(gè)或多個(gè)其它高變區(qū)(HVR)的修飾。
在一個(gè)實(shí)施方式中，在所選HVR中進(jìn)行功能性缺失，而不將任何分子 插入其中。這可滿足多種原因的需要，例如在殼體的另一個(gè)HVR或其它部 分中容納較大插入物。這種功能性缺失的腺病毒六鄰體蛋白可用于產(chǎn)生腺 病毒顆粒，以及其它應(yīng)用。
在另一實(shí)施方式中，修飾的腺病毒六鄰體蛋白含有插入HVR缺失位點(diǎn) 的外源性分子。這類外源性分子可用于改變修飾的腺病毒六鄰體蛋白(或病 毒顆粒形式的含有該蛋白的殼體或空)的靶點(diǎn)、改變修飾的腺病毒殼體的免 疫原性和/或誘導(dǎo)對外源性氨基酸序列或免疫交叉反應(yīng)性分子的免疫應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方式中，插入腺病毒六鄰體蛋白的外源性分子是長度為至 少兩個(gè)、至少四個(gè)、至少八個(gè)、至少十個(gè)、至少十五個(gè)、至少二十個(gè)、至 少二十五個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的外源性氨基酸序列，在野生型腺病毒氨 基酸序列中的功能等同位置，或者更具體說是準(zhǔn)備工程改造的野生型病毒 組分蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)其完整序列。在某些實(shí)施方式中，外源性氨基酸序列 也可以是天然情況下不存在的非天然序列，即合成的或者人工設(shè)計(jì)或制備 的多肽。應(yīng)理解，在編碼六鄰體蛋白的核酸分子中，外源性分子可以是編 碼所需氨基酸序列的核酸序列的形式。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述外源性分子是用于靶向的氨基酸序列。本文 所用術(shù)語"靶向序列"是用作指導(dǎo)修飾腺病毒的信號的特定氨基酸序列。因 此，在一個(gè)實(shí)施方式中，可修飾腺病毒殼體，以結(jié)合衍生該修飾腺病毒的 天然(野生型)病毒不會結(jié)合的所需靶細(xì)胞，或者可修飾該腺病毒殼體以使其 具有比野生型病毒更有限的結(jié)合特異性，換言之，只結(jié)合野生型病毒結(jié)合 的廣泛耙細(xì)胞類型中所選或特定的靶細(xì)胞亞組或類型。在另一方案中，腺 病毒保持了一些結(jié)合其原始靶點(diǎn)的能力，其結(jié)合其它靶點(diǎn)的能力由外源性 氨基酸序列提供。因此改變該病毒的趨向性。因此，"改變趨向性"指修 飾病毒的靶細(xì)胞結(jié)合特異性改變、或不同于產(chǎn)生該修飾病毒的野生型病毒。
有用的外源性分子的例子包括例如，帶正電的氨基酸(如，賴氨酸殘基 或半胱氨酸殘基)，細(xì)胞因子如干擾素和白介素；淋巴因子；膜受體，如病 原體(病毒、細(xì)菌或寄生物)，優(yōu)選HIV病毒(人體免疫缺陷病毒)識別的受體；凝血因子如因子VIII和因子IX;抗肌萎縮蛋白；胰島素；直接或間接參與 細(xì)胞離子通道的蛋白質(zhì)，如CFTR(囊性纖維化病跨膜電導(dǎo)率調(diào)節(jié)物)蛋白； 反義RNA，或能夠抑制病原體基因組中存在的致病性基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活
性的蛋白質(zhì)，或能夠抑制表達(dá)失調(diào)的細(xì)胞基因，如癌基因活性的蛋白質(zhì)(或
其編碼基因)；抑制酶活性的蛋白質(zhì)，如al-抗胰蛋白酶或病毒蛋白酶抑制 劑；經(jīng)突變損害其生物學(xué)功能的致病性蛋白質(zhì)變體，例如，能夠與天然蛋 白競爭結(jié)合耙序列，從而防止HIV激活的HIV病毒tat蛋白的反式顯性變 體；提高宿主細(xì)胞免疫力的抗原性表位；I類和II類主要組織相容性復(fù)合物 蛋白，以及這些基因的誘導(dǎo)蛋白；抗體；編碼免疫毒素的基因；毒素；生 長因子或生長激素；細(xì)胞受體和其配體；腫瘤抑制物；參與心血管病的蛋 白質(zhì)，包括但不限于癌基因；生長因子包括但不限于成纖維細(xì)胞生長 因子(FGF)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和神經(jīng)生長因子(NGF); e-nos，腫瘤
抑制基因，包括但不限于Rb(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)基因；脂蛋白脂肪酶；超 氧化物歧化酶(SOD);過氧化氫酶；氧和游離基清除物；載脂蛋白；和pai-l(纖 溶酶原激活物抑制劑-l);細(xì)胞酶或病原體產(chǎn)生的酶；自殺基因；激素，T 細(xì)胞受體(表位)，抗體表位，親和體(affibody)和從各種蛋白質(zhì)文庫中鑒定的配體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞表面受體的配體是該外源性分子。合適配體 的例子包括例如抗體，或抗體片段或衍生物、單鏈抗體(ScFv)、單結(jié)構(gòu)域 抗體和抗體的最小識別單位，如Fv片段的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？捎煽贵w的 抗原-結(jié)合位點(diǎn)或抗原結(jié)合或識別區(qū)獲得或產(chǎn)生此種氨基酸序列，此種抗體 可以是天然或合成抗體。
在另一實(shí)施方式中，病毒蛋白是該外源性分子。例如，對某些核苷類 似物(如阿昔洛韋或更昔洛韋)而言，HSV-1 TK酶的親和力高于細(xì)胞TK酶。
在另一實(shí)施方式中，該外源性分子是免疫原。"免疫原性"分子可包括 誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、抗體應(yīng)答或二者的分子。疫苗分子包括誘導(dǎo)免疫應(yīng)答 的分子，這些免疫應(yīng)答能保護(hù)性對抗進(jìn)一步的病原體感染和/或保護(hù)性對抗 疾病或其它病癥的癥狀。抗原指能夠誘導(dǎo)體液(抗體)免疫應(yīng)答的分子。
一般地，免疫原性分子能誘導(dǎo)對特定病毒、生物體(如細(xì)菌、真菌、酵母)或其它源(如腫瘤)或交叉反應(yīng)性生物體或源產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。然而， 在某些實(shí)施方式中，可能需要利用通過提高免疫應(yīng)答而誘導(dǎo)非特異性免疫 調(diào)節(jié)應(yīng)答的免疫原性分子。例如，這類分子可用作疫苗方案的初次給藥或 用作佐劑，這取決于是在需要免疫應(yīng)答對抗的分子之前給藥或是一起給藥。
合適的免疫原包括例如T細(xì)胞表位(如CD4或CD8表位)、抗體表位，
或肽、多肽、酶或其它衍生自細(xì)菌、真菌、酵母和/或病毒的片段。合適的 免疫原來源包括本文所述免疫原性轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物等。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難 預(yù)見到其它免疫原。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供經(jīng)修飾含有一個(gè)或多個(gè)外源性分子的 修飾的腺病毒六鄰體蛋白。利用一個(gè)以上外源性分子時(shí)，這些分子可能相 同。在另一實(shí)施方式中，這些外源性分子可能不同。例如，修飾的腺病毒 六鄰體蛋白可以在一個(gè)區(qū)域含有修飾天然靶向的外源性分子，在另一個(gè)區(qū) 域含有修飾天然中和表位和/或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的外源性分子。在另一個(gè)實(shí)例 中，修飾的腺病毒六鄰體蛋白可含有一種以上類型的外源性免疫原。本領(lǐng) 域技術(shù)人員了解可獨(dú)立選擇的合適外源性分子的許多其它組合。本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)理解也了解，某些分子可同時(shí)用作靶向分子和免疫原。
本領(lǐng)域熟知制備這類外源性分子(如氨基酸序列)和將它們引入病毒或 病毒組分的技術(shù)是，并在文獻(xiàn)中已有廣泛描述。因此，例如，不難獲得制 備或構(gòu)建能夠表達(dá)為本發(fā)明修飾病毒或病毒組分的遺傳序列的分子生物學(xué) 或遺傳工程技術(shù)。例如，可修飾編碼病毒組分蛋白的核酸分子或核苷酸序 列，以引入編碼外源性氨基酸序列的核苷酸序列，例如編碼含有腺病毒蛋 白的全部或一部分和外源性氨基酸序列的融合蛋白的核苷酸序列。
可能方便地或必須通過"接頭"序列的方式將任何這類額外或外部基序
或特征慘入病毒。本領(lǐng)域已知通過連接于接頭序列摻入DNA或氨基酸序列 的這種構(gòu)建技術(shù)，這屬于蛋白質(zhì)/遺傳工程領(lǐng)域的技術(shù)常識。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明利用含外源性分子的修飾的腺病毒殼體來 產(chǎn)生感染性腺病毒顆粒，這種腺病毒顆?？珊袛y帶所需分子的表達(dá)盒。 表達(dá)盒攜帶的分子適合編碼用于誘導(dǎo)對該產(chǎn)物或其交叉反應(yīng)性分子的免疫 應(yīng)答的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)例中，該實(shí)施方式能夠?qū)⑿揎椀南俨《練んw用作表達(dá)盒遞送 分子的佐劑。在另一個(gè)實(shí)例中，該實(shí)施方式能夠?qū)⑿揎椀南俨《練んw用作 表達(dá)盒遞送分子的自啟式構(gòu)建物。
修飾的腺病毒載體
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有修飾的腺病毒殼體的組合物。 本文所用的修飾的腺病毒殼體指含有如本文所述修飾的腺病毒六鄰體蛋 白的腺病毒殼體。此外，修飾的腺病毒殼體可含有其它修飾。這類其它修飾可 包括六鄰體蛋白或其它殼體蛋白，如纖維蛋白或五鄰體中的其它修飾。例如，
修飾的腺病毒六鄰體還可含有按照納入本文作參考的美國專利5,922,315所述 改變的六鄰體蛋白。在這種方法中，腺病毒六鄰體的至少一個(gè)環(huán)區(qū)域被另一腺 病毒血清型的至少一個(gè)環(huán)區(qū)域代替。也描述了其它合適修飾[2004年9月2日 公開的美國公開專利申請?zhí)?0040171807]?；蛘呋虼送猓揎椀臍んw可能與另 一分子，如脂質(zhì)、融合蛋白相連。
在一個(gè)方面，本發(fā)明組合物含有修飾的腺病毒載體。除非另有說明，本文 所用修飾的腺病毒載體指含有修飾的腺病毒殼體并且殼體中包裝有將一種或 多種異源分子遞送給細(xì)胞的表達(dá)盒的腺病毒顆粒。如本文所述和本領(lǐng)域技術(shù)人 員所知，可由各種不同腺病毒獲得或產(chǎn)生腺病毒載體所用的腺病毒組分。因?yàn)?腺病毒基因組的兩條鏈上含有開放閱讀框，所以本文在許多情況下指出各種區(qū) 域的5，和3'端，以避免在特定開放閱讀框和基因區(qū)域之間混淆。因此，本文中 指出腺病毒基因組的"左"和"右"端時(shí)，是指以本領(lǐng)域常規(guī)方式的示意圖形式描 述時(shí)的約36 kb腺病毒基因組的端點(diǎn)[參見例如，Horwitz， "Adenoviridae and Their Replication"(腺病毒科和其復(fù)制)，VIROLOGY(病毒學(xué))，第2版，1679-1721 頁(1990)]。因此，本文所用的腺病毒基因組"左端"指以線性形式示意性描述該 基因組時(shí)位于該示意圖最左端的腺病毒基因組部分。 一般地，左端指從圖上單 元0開始并向右延伸以至少包含5'末端反向重復(fù)(ITR)的基因組部分，不包含 編碼結(jié)構(gòu)基因的基因組內(nèi)部區(qū)域。本文所用的腺病毒基因組"右端"指以線性 形式示意性描述該基因組時(shí)位于該示意圖最右端的腺病毒基因組部分。 一般 地，腺病毒基因組右端指以圖上單元36為終點(diǎn)并向左延伸以至少包含3TTR 的基因組部分，不包含編碼結(jié)構(gòu)基因的基因組內(nèi)部區(qū)域。"小基因"指所選異源基因和驅(qū)動基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中翻譯、轉(zhuǎn)錄和/或表 達(dá)所必需的其它調(diào)控元件的組合。
一般地，設(shè)計(jì)腺病毒載體，以使該小基因位于所選腺病毒基因的天然 存在區(qū)域中含有其它腺病毒序列的核酸分子內(nèi)。如果需要，可將該小基因 插入現(xiàn)有基因區(qū)域中，以破壞該區(qū)域的功能?；蛘?，可將該小基因插入部 分或完全缺失的腺病毒基因的位點(diǎn)內(nèi)。例如，可使該小基因位于可選擇的
位點(diǎn)，如功能性E1缺失位點(diǎn)或功能性E3缺失位點(diǎn)等中。術(shù)語"功能性缺
失"指通過突變或修飾去除或損傷足夠量的基因區(qū)域，以使該基因區(qū)域不
再能夠通過基因表達(dá)產(chǎn)生功能性產(chǎn)物。如果需要，可去除整個(gè)基因區(qū)域。 在本申請的其它地方討論用于破壞或缺失基因的其它合適位點(diǎn)。
例如，為了產(chǎn)生用于產(chǎn)生重組病毒的載體，該載體可含有該小基因和 腺病毒基因組的5'端或腺病毒基因組的3'端，或同時(shí)含有腺病毒基因組的 5'和3'端。腺病毒基因組的5'端含有包裝和復(fù)制所必需的5'順式元件；即 5'末端反向重復(fù)(ITR)序列(用作復(fù)制起點(diǎn))和天然5'包裝增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域(含有 包裝線性Ad基因組所需序列和El啟動子的增強(qiáng)子元件)。腺病毒基因組的 3'端包含包裝和殼體化所必需的3'順式元件(含有ITR)。重組腺病毒適合含 有5'和3'腺病毒順式元件，小基因位于5'和3'腺病毒序列之間。任何本發(fā) 明腺病毒載體也可含有其它腺病毒序列。
如上所述獲得用于構(gòu)建本文所述載體的病毒序列、輔助病毒(如果需要)和 重組病毒顆粒，以及其它載體組分和序列。用腺病毒序列的DNA序列構(gòu)建載 體和用于制備這類載體的細(xì)胞系。
可利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生形成本發(fā)明載體的核酸序列修飾，包括 序列缺失、插入和其它突變，這些內(nèi)容屬于本發(fā)明范圍。
根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解用于選擇轉(zhuǎn)基因、克 隆和構(gòu)建"小基因"，并將其插入病毒載體的方法。
轉(zhuǎn)基因是編碼感興趣的多肽、蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物，并與其側(cè)接的載體 序列異源的核酸序列。核酸編碼序列以允許轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、翻 譯和/或表達(dá)的方式操作性地與調(diào)節(jié)組分相連。轉(zhuǎn)基因序列的組成取決于所得到的載體的用途。例如 一類轉(zhuǎn)基因序列包含報(bào)道序列，該序列在表達(dá) 后產(chǎn)生可檢測的信號。這種報(bào)道序列包括但不限于編碼以下物質(zhì)的DNA序
列(3-內(nèi)酰胺酶、P-半乳糖苷酶(LacZ)、堿性磷酸酶、胸腺激酶、綠色熒光 蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶、膜結(jié)合蛋白(如CD2、CD4、 CD8)、流感血凝素蛋白和本領(lǐng)域熟知的存在高親和力抗體或可通過常規(guī)方 法產(chǎn)生所述抗體的其他物質(zhì)，以及含有膜結(jié)合蛋白的融合蛋白，該膜結(jié)合 蛋白適當(dāng)?shù)嘏c血凝素或Myc等物質(zhì)的抗原標(biāo)記區(qū)融合。當(dāng)這些編碼序列與 驅(qū)動其表達(dá)的調(diào)節(jié)元件相關(guān)聯(lián)時(shí)，可提供由常規(guī)方法檢測的信號，所述常 規(guī)方法包括酶法、放射顯影法、比色法、熒光法或其他光譜測定、熒光激 活細(xì)胞分選測定與免疫測定，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫 測定(RIA)和免疫組織化學(xué)。例如當(dāng)標(biāo)記序列是LacZ基因時(shí)，通過測定 卩-半乳糖苷酶的活性來檢測攜帶信號的載體的存在。
當(dāng)轉(zhuǎn)基因是GFP或螢光素酶時(shí)，攜帶信號的載體可用光度計(jì)通過顏色 或光的產(chǎn)生來觀測。然而，理想地，轉(zhuǎn)基因是編碼具有生物或醫(yī)藥用途的 產(chǎn)物的非標(biāo)記序列，所述產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)、肽、RNA、酶或催化性RNA。 所需RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖體RNA、催化性RNA和反義RNA。 有用的RNA序列的一個(gè)例子是消除靶核酸序列在經(jīng)處理的動物中表達(dá)的 序列。
可將轉(zhuǎn)基因作為癌癥治療劑或疫苗用于治療，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，和/或 達(dá)到預(yù)防性疫苗目的。本文所用的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答指分子(如基因產(chǎn)物)誘導(dǎo)針 對該分子的T細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明還包括使用多種轉(zhuǎn)基 因。在某些情況下，可采用不同的轉(zhuǎn)基因編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的各個(gè)亞基，或 編碼不同的肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)編碼蛋白質(zhì)亞基的DNA很大時(shí)這尤其適合，所 述蛋白質(zhì)例如免疫球蛋白、血小板衍生的生長因子或抗肌萎縮蛋白。為使 細(xì)胞產(chǎn)生多亞基蛋白質(zhì)，用各自含有各不同亞基的重組病毒感染細(xì)胞?；?者，蛋白質(zhì)的不同亞基可由同一轉(zhuǎn)基因編碼。在這種情況下，單個(gè)轉(zhuǎn)基因 包含編碼各亞基的DNA，而各亞基的DNA由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES) 隔開。當(dāng)編碼每個(gè)亞基的DNA較小時(shí)，例如編碼亞基的DNA與IRES的 總體積小于5千堿基對(5kb)時(shí)，這尤其適合。作為IRES的替代，DNA可用編碼在翻譯后階段自我切割的2A肽的序列隔開。參見，例如M丄.
Donnelly等，,Fz>o/.， 78(第一部分)13-21(1997年1月)；Furler， S.等人，Ge"e T77er， 8(11): 864-873(2001年6月)；Klump H.等人，Ge"e T7^r， 8(10): 811-817(2001年5月)。該2A肽明顯小于IRES，使得其非常適合用 于當(dāng)空間成為制約因素的時(shí)候。然而，選定的轉(zhuǎn)基因可編碼任何生物活性 產(chǎn)物或其他產(chǎn)物，例如研究所需的產(chǎn)物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的選擇不限制本 發(fā)明。
除了以上就小基因而言的主要元件以外，載體還包含必需的常規(guī)控制 元件，所述常規(guī)控制元件以允許轉(zhuǎn)基因在以下所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、翻譯和/ 或表達(dá)的方式操作性地與轉(zhuǎn)基因相連，所述細(xì)胞為本發(fā)明產(chǎn)生的質(zhì)粒載體 轉(zhuǎn)染或病毒所感染。本文的"操作性相連"的序列包括與感興趣的基因毗連 的表達(dá)控制序列和反式(/" ^m》作用或在遠(yuǎn)端控制感興趣基因表達(dá)的控制 序列。
表達(dá)控制序列包括適宜的轉(zhuǎn)錄起始子、終止子、啟動子和增強(qiáng)子序列；有 效的RNA加工信號，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信號；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA 的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(即Kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序 列；以及在需要時(shí)增強(qiáng)編碼產(chǎn)物分泌的序列。許多表達(dá)控制序列，包括天然、 組成型、調(diào)節(jié)型和/或組織特異性啟動子是本領(lǐng)域已知并可利用的。
組成型啟動子的例子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒ROUS肉瘤病毒
(RSV)LTR啟動子(任選連有RSV增強(qiáng)子)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(任選 連有CMV增強(qiáng)子)[參見，例如Boshart等，Ce〃， 41: 521-530(1985)]、 SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、(3-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶 (PGK)啟動子和EFla啟動子(英杰公司(Invitrogen))。
調(diào)節(jié)型啟動子能控制基因表達(dá)，并可由外源提供的化合物、環(huán)境因素 (例如溫度)、或特定生理狀態(tài)誘導(dǎo)、激活、抑制或"關(guān)閉"，所述生理狀態(tài) 例如急性期、細(xì)胞的特定分化狀態(tài)或僅在正在復(fù)制的細(xì)胞中。調(diào)節(jié)型啟動 子和可調(diào)節(jié)系統(tǒng)可從多種商業(yè)來源獲得，包括但不限于英杰公司、克隆泰克公司(Clontech)和阿利雅得公司(Ariad)。已知的還有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員 易于選擇的其他系統(tǒng)。例如，誘導(dǎo)型啟動子包括鋅誘導(dǎo)型綿羊金屬硫蛋白 (MT)啟動子和地塞米松(Dex)-誘導(dǎo)型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子。其 它調(diào)節(jié)型系統(tǒng)包括T7聚合酶啟動子系統(tǒng)[WO 98/10088];蛻皮激素昆蟲啟 動子[No等，ZVoc. Jcad C7&4， 93:3346-3351 (1996)]，四環(huán)素-抑 制性系統(tǒng)[Gossen等，尸亂淑/.園，89:5547-5551 (1992)]，四 環(huán)素-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Gossen等，Sc/ewce， 268:1766-1769 (1995)，也參見Harvey 等，C"m Op/". C/zem. 5/o/.， 2:512-518 (1998)]。其它系統(tǒng)包括FK506 二聚 體、采用甘珀二醇(castradiol)的VP16或p65、聯(lián)苯酚米勒甾酮(murislerone)、 RU486-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Wang等，脂.腸,ec/z. ， 15:239-243 (1997)和Wang等， G麼77zer.， 4:432-441 (1997)]和雷帕霉素-誘導(dǎo)型系統(tǒng)[Magrosei等，J. C/,,". /m^"， 100:2865-2872 (1997)]。 一些調(diào)節(jié)型啟動子的有效性隨時(shí)間提高。 在這種情況下，可通過將多個(gè)阻抑物以串聯(lián)形式插入，如通過IRES將TetR 與另一個(gè)TetR連接，來提高這種系統(tǒng)的有效性?；蛘撸梢栽诤Y選所需功 能之前等待至少3天?？赏ㄟ^已知方式提高所需蛋白的表達(dá)，以提高該系 統(tǒng)的有效性。例如，使用土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中使用了轉(zhuǎn)基因的天然啟動子。當(dāng)需要轉(zhuǎn)基因的表 達(dá)模擬天然表達(dá)時(shí)，可優(yōu)選天然啟動子。當(dāng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)必須以時(shí)間或發(fā) 育方式調(diào)節(jié)、或以組織特異性的方式調(diào)節(jié)或響應(yīng)特定的轉(zhuǎn)錄剌激時(shí)，可使 用天然啟動子。在另外的實(shí)施方案中，也可使用其他天然表達(dá)控制元件， 例如增強(qiáng)子元件、聚腺苷酸化位點(diǎn)或Kozak共有序列以模擬天然表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因的另一實(shí)施方案包含操作性連接于組織特異性啟動子的轉(zhuǎn)基 因。例如，如果需要在骨骼肌中表達(dá)，應(yīng)該使用在肌肉中有活性的啟動子。 這包括編碼以下產(chǎn)物的基因的啟動子骨骼P-肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、 抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然啟動子的合成肌肉啟動子 (參見:Li等，Ato. 5/o&c/z. ， 17: 241-245(1999))。己知的組織特異性啟動 子的實(shí)例有肝特異性的(白蛋白，Miyatake等，J K>o/., 71: 5124-32(1997); 乙肝病毒核心啟動子，Sandig等，Gewe77^廣，3: 1002-9(1996):甲胎蛋白 (AFP)， Arbuthnot等，//纖.G匿77ze" 7: 1503-14(1996))、骨的骨親丐蛋白(Stein等，Mo/. BZo/.' 24: 185-96(1997));骨唾液蛋白(Chen等，
7 w.' 11: 654-64(1996))、淋巴細(xì)胞特異性的(CD2， Hansal等， / /mmw"o/. 161: 1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細(xì)胞受體鏈)、神經(jīng)元特 異性的(例如神經(jīng)元-特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Andersen等，Ce〃. Afo/. A^woWo/., 13: 503-15(1993))、神經(jīng)絲輕鏈基因(Piccioli等，/Voc. 7W^/.」cc^. Sc/.，美國，88: 5611-5(1991))，以及神經(jīng)元-特異性vgf基因(Piccioli等， 臉卿"，15: 373-84(1995)))等。
任選地，攜帶編碼有治療用途或免疫原性產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的載體還可含 有可選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因，例如編碼遺傳霉素抗性、潮霉素抗性或嘌 吟霉素(purimycin)抗性等的序列。這種可選擇的報(bào)道基因或標(biāo)記基因(優(yōu)選 位于有待包裝到病毒顆粒中的病毒基因組之外)，例如氨芐青霉素抗性，可 用來指示細(xì)菌細(xì)胞中存在質(zhì)粒。載體的其他成分可包括復(fù)制起點(diǎn)?？赏ㄟ^ 常規(guī)方法選擇這些和其他啟動子與載體元件，許多這種序列可獲得[參見例 如Sambrook等人，以及本文引用的參考文獻(xiàn)]。利用本文提供的技術(shù)和序 列，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)產(chǎn)生這些載體。
這些技術(shù)包括如教科書中所述的常規(guī)cDNA克隆技術(shù)[Sambrook等， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，紐約]、使 用腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列、聚合酶鏈反應(yīng)和提供所需核苷酸序 列的任何合適方法。
產(chǎn)生修飾的腺病毒顆粒
至少，攜帶表達(dá)盒的修飾的腺病毒載體含有復(fù)制和病毒顆粒殼體化所 必需的腺病毒順式元件，該順式元件側(cè)接于異源基因。即，該載體含有腺 病毒的順式作用的5'末端反向重復(fù)(ITR)序列(用作復(fù)制起點(diǎn))，天然5'包裝/ 增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域(含有包裝線性Ad基因組和El啟動子增強(qiáng)子元件所必需的序 列)、異源分子和5'ITR序列。參見例如，可容易地使納入本文作參考的美 國專利6,203,975中描述的"最小"人Ad載體制備技術(shù)適應(yīng)重組猿腺病毒。 任選地，修飾(如重組)腺病毒含有多于上述最小腺病毒序列的序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，腺病毒的Ela或Elb基因發(fā)生功能性缺失，任選攜帶其它突變，如溫敏型突變或其它基因的缺失。在其它實(shí)施方式中，需要在重
組腺病毒中保持完整的Ela和/或Elb區(qū)。這種完整的E1區(qū)可位于腺病毒基因 組的天然位置中，或置于天然腺病毒基因組的缺失位點(diǎn)(如E3區(qū))中。
在用于將基因遞送給人(或其它哺乳動物)細(xì)胞的腺病毒載體的構(gòu)建中， 可將一系列腺病毒核酸序列用于該載體。例如，可由形成一部分重組病毒 的腺病毒序列中清除全部或一部分腺病毒延遲早期基因E3。相信E3的功 能與重組病毒顆粒的功能和產(chǎn)生無關(guān)。也可構(gòu)建至少E4基因的ORF6區(qū)域 缺失，更需要整個(gè)E4區(qū)缺失(因?yàn)樵搮^(qū)域的功能冗余)的修飾的腺病毒載體。 本發(fā)明另一種載體的延遲早期基因E2a中含有缺失。也可在腺病毒基因組 的晚期基因Ll-L5中產(chǎn)生缺失。相似地，中間基因IX和IVa2中的缺失可 用于一些目的?？梢栽谄渌Y(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)腺病毒基因組中產(chǎn)生其它缺失。 上述缺失可單獨(dú)使用，即，用于本發(fā)明的腺病毒序列可僅在一個(gè)區(qū)域中含 有缺失。或者，可以任何組合形式使用能有效破壞其生物學(xué)活性的整個(gè)基 因或其部分的缺失。例如，在一種示范性載體中，腺病毒序列可缺失E1基 因和E4基因，或El、 E2a和E3基因，或El禾卩E3基因，或El、 E2a和 E4基因，缺失或不缺失E3，等等。如上所述，這類缺失可與其它突變，如 溫敏型突變聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。
可以在丟失的病毒感染力和腺病毒顆粒繁殖所需的腺病毒基因產(chǎn)物存在 下培養(yǎng)缺少任何必需腺病毒序列(如Ela、 Elb、 E2a、 E2b、 E4 ORF6、 Ll、 L2、 L3、 L4和L5)的腺病毒載體。可以在一種或多種輔助構(gòu)建物(如質(zhì)?；虿《?或 包裝宿主細(xì)胞的存在下培養(yǎng)腺病毒載體，從而提供這些輔助功能。參見例如， 納入本文作參考的1996年5月9日公布的國際專利申請W096/13597中描述 的"最小"人Ad載體的制備技術(shù)。
不管修飾腺病毒只含有最小Ad序列，或者含有只有E1和/或E3區(qū)中 功能性缺失的整個(gè)Ad基因組，在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的病毒含有衍生自 人或猿腺病毒的殼體?；蛘撸谄渌鼘?shí)施方式中，本發(fā)明方法中可采用假 型腺病毒。這種假型腺病毒利用腺病毒殼體蛋白，其中包裝攜帶與初始腺 病毒殼體來源不同的腺病毒序列的核酸分子。可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 方法產(chǎn)生這些腺病毒。,薪勵(lì)瘋毒
因此，根據(jù)用于攜帶小基因的病毒載體的腺病毒基因含量，可能需要 輔助腺病毒或非復(fù)制型病毒片段來提供足夠的猿腺病毒基因序列，以便產(chǎn) 生含有該小基因的感染性重組病毒顆粒。有用的輔助病毒含有腺病毒載體 構(gòu)建物中不存在和/或轉(zhuǎn)染載體的包裝細(xì)胞系不表達(dá)的所選腺病毒基因序 列。在一個(gè)實(shí)施方式中，該輔助病毒是復(fù)制缺陷型病毒，除上述序列外還 含有各種腺病毒基因。這種輔助病毒宜與El表達(dá)細(xì)胞系聯(lián)用。
輔助病毒也可形成聚陽離子偶聯(lián)物，如Wu等， / 5fo/. CAem.， 264:16985-16987 (1989); K丄Fisher和J.M. Wilson, 299:49 (1994年4月i日)所述。輔助病毒可任選地含有第二種報(bào)道小基因。本領(lǐng)
域已知許多這類報(bào)道基因。輔助病毒上的報(bào)道基因不同于腺病毒載體上的 轉(zhuǎn)基因，這種報(bào)道基因的存在使得能夠獨(dú)立監(jiān)測Ad載體和輔助病毒。用第 二種報(bào)道物區(qū)分純化后得到的重組病毒和輔助病毒。
為了產(chǎn)生任一上述基因中發(fā)生缺失的修飾腺病毒(Ad)，如果缺失基因 區(qū)域的功能是病毒復(fù)制或感染所必需的，必須通過輔助病毒或細(xì)胞系，即 補(bǔ)充或包裝細(xì)胞系向該重組病毒提供該功能。在許多情況下，可利用表達(dá) 人E1的細(xì)胞系反式補(bǔ)充Ad載體。這特別有利，因?yàn)椋捎诒景l(fā)明Ad序 列和目前可得的包裝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的人Ad El序列之間的差異，使用現(xiàn)有含 人E1的細(xì)胞能防止在復(fù)制和產(chǎn)生過程中產(chǎn)生能夠復(fù)制的腺病毒。然而，在 某些情況下，可能需要利用表達(dá)El基因產(chǎn)物的細(xì)胞系產(chǎn)生El缺失的腺病 毒。已經(jīng)描述過這類細(xì)胞系。參見例如，美國專利6,083,716。
如果需要，可利用本文提供的序列產(chǎn)生至少在所選母體細(xì)胞系表達(dá)所用的 啟動子轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)來自合適親本來源或反式補(bǔ)充腺病毒來源的腺病毒El 基因的包裝細(xì)胞或細(xì)胞系。調(diào)節(jié)型或組成型啟動子可用于此目的。本說明書中 其它地方詳細(xì)描述了這類啟動子的例子。選擇親本細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)任何所需的 AdSAd22/Pan5、 Pan6、 Pan7、 SV1、 SV25或SV39基因的新細(xì)胞系。如果不 受限制，這類母體細(xì)胞系可以是HeLa[ATCC登錄號CCL2]、 A549 [ATCC登 錄號CCL 185]、 HEK293、 KB [CCL 17]、底特律(Detroit)[如底特律510， CCL72]和WI-38 [CCL 75]細(xì)胞等。這些細(xì)胞系均可獲自位于弗吉尼亞州瑪納薩斯 (Manassas， Virginia)20110-2209大學(xué)大道10801號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection)。其它合適的親本細(xì)胞系可獲自其它來源。
這類表達(dá)El的細(xì)胞系可用于產(chǎn)生腺病毒El缺失型載體。此外或或者， 本發(fā)明提供表達(dá)一種或多種猿腺病毒基因產(chǎn)物，如Ela、Elb、E2a和/或E4 ORF6 的細(xì)胞系，可利用與產(chǎn)生重組猿病毒載體所用方法基本相同的方法構(gòu)建。這類 細(xì)胞系可用于反式補(bǔ)充編碼這些產(chǎn)物的必需基因中缺失的腺病毒載體，或提供 包裝輔助依賴性病毒(如腺伴隨病毒)所必需的輔助功能。本發(fā)明制備宿主細(xì)胞 涉及諸如裝配選定的DNA序列等技術(shù)。可使用常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)這種裝配。這種 技術(shù)包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等的著作中的cDNA和基因組 克隆、使用腺病毒基因組的重疊寡核苷酸序列，結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、合成方 法以及提供所需核苷酸序列的其他合適方法。
在另一個(gè)替代方式中，通過腺病毒載體和/或輔助病毒反式提供必需腺病 毒基因產(chǎn)物。在這種情況下，合適的宿主細(xì)胞可選自各種生物體，包括原核(例 如細(xì)菌)細(xì)胞和真核細(xì)胞，包括昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。特別 適合的宿主細(xì)胞選自任何哺乳動物物種，包括但不限于，A549、 WEHI、 3T3、 10Tl/2、 HEK 293細(xì)胞或PERC6(這二者均表達(dá)功能性腺病毒El) [Fallaux， FJ 等，(1998)， T/ww 7Tzw， 9:1909-1917]、 Saos、 C2C12、 L細(xì)胞、HT1080、 HepG2以及衍生自哺乳動物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和倉鼠的原代成纖 維細(xì)胞、肝細(xì)胞和成肌細(xì)胞細(xì)胞。選擇細(xì)胞的哺乳動物來源和哺乳動物細(xì)胞的 類型(即成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等)不限制本發(fā)明。
3.瘋毒厥教游邀裝浙謝應(yīng)系游轉(zhuǎn)燊
通常，當(dāng)通過轉(zhuǎn)染遞送含有小基因的載體時(shí)，通常將約5嗎-100嗎 DNA、優(yōu)選約10i!g-50嗎DNA遞送給約1 X 104-1 X 1013個(gè)細(xì)胞、優(yōu)選約1 乂105個(gè)細(xì)胞。然而，可根據(jù)諸如所選載體、遞送方法和所選宿主細(xì)胞等因 素調(diào)整宿主細(xì)胞與載體DNA的相對量。
該載體可以是本領(lǐng)域已知或上述任何載體，包括裸DNA、質(zhì)粒、噬菌 體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、附加體、病毒等?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知或上述任何方式， 包括轉(zhuǎn)染和感染將載體引入宿主細(xì)胞中。 一個(gè)或多個(gè)腺病毒基因可穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組，作為附加體穩(wěn)定表達(dá)，或者瞬時(shí)表達(dá)?；虍a(chǎn)物 可全部瞬時(shí)表達(dá)，包含在附加體上或穩(wěn)定整合；或者， 一些基因產(chǎn)物可穩(wěn) 定地表達(dá)，而另一些瞬時(shí)表達(dá)。此外，各腺病毒基因的啟動子可彼此獨(dú)立 地選自組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或天然腺病毒啟動子。啟動子可由生 物體或細(xì)胞的特定生理狀態(tài)調(diào)節(jié)(即分化狀態(tài)或復(fù)制或靜息細(xì)胞)或由(例如) 外源添加因子調(diào)節(jié)。
也可使用技術(shù)人員已知和本說明書中討論的技術(shù)將這些分子(如質(zhì)粒 或病毒)引入宿主細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，采用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)，如CaP04
轉(zhuǎn)染或電穿孔。
用常規(guī)技術(shù)將所選腺病毒DNA序列(以及轉(zhuǎn)基因和其它載體元件)組裝 到各種中間質(zhì)粒中，并用該質(zhì)粒和載體產(chǎn)生重組病毒顆粒。這些技術(shù)包括 如教科書中所述的常規(guī)cDNA克隆技術(shù)[Sambrook等，同上]、使用腺病毒 基因組的重疊寡核苷酸序列、聚合酶鏈反應(yīng)和提供所需核苷酸序列的任何 合適方法。采用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如CaP04沉淀技術(shù)。所用的 其它常規(guī)方法包括病毒基因組的同源重組、測定瓊脂覆蓋層中的病毒空斑、 測定信號產(chǎn)生的方法等。
例如，在構(gòu)建和組裝含所需小基因的病毒載體后，在體外輔助病毒的 存在下將該載體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中。在輔助和載體序列之間發(fā)生同源重 組，這使得載體中的腺病毒轉(zhuǎn)基因序列能夠被復(fù)制并包裝到病毒顆粒殼體 中，產(chǎn)生重組病毒載體顆粒。目前產(chǎn)生這類病毒載體的方法是基于轉(zhuǎn)染的 方法。然而，本發(fā)明不限于這類方法。
得到的重組修飾腺病毒可用于將所選轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到所選細(xì)胞中。
使歷俊像游蘼癆毒載體
本發(fā)明修飾的腺病毒載體可用于在體外、離體和體內(nèi)條件下向人或獸 類對象(包括非人靈長動物、非猿靈長動物和其它哺乳動物)轉(zhuǎn)移基因。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本文所述的修飾腺病毒載體可用作體外產(chǎn)生異源 基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)載體。例如，用修飾的腺病毒感染或轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞系， 以常規(guī)方式培養(yǎng)，使修飾的腺病毒由由啟動子表達(dá)基因產(chǎn)物。然后，用己 知的常規(guī)蛋白質(zhì)分離和回收方法回收培養(yǎng)物中的基因產(chǎn)物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明修飾的腺病毒載體提供可將所選轉(zhuǎn)基因體 內(nèi)或離體遞送至所選宿主細(xì)胞的有效基因轉(zhuǎn)移載體。例如，本發(fā)明修飾的 腺病毒載體可用于遞送治療性或免疫原性分子，如上所述。在一個(gè)實(shí)施方
式中，治療或疫苗方案包括重復(fù)遞送重組腺病毒載體。這類方案一般包括 遞送病毒殼體不同的一系列病毒載體?？筛淖兠看魏罄m(xù)給藥的病毒殼體， 或者在預(yù)先選擇的特定血清型殼體給藥次數(shù)(如一次、兩次、三次、四次或 更多次)后改變。因此，方案可包括遞送Ad與第一殼體、遞送Ad與第二殼 體和遞送Ad與第三殼體。在其它實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可選 擇單獨(dú)采用本發(fā)明修飾的Ad殼體、與另一殼體聯(lián)用、或與其它Ad血清型 聯(lián)用的方案。任選地，這類方案可包括給予Ad與非人靈長動物腺病毒、人 腺病毒或人工(如)嵌合血清型(如本文所述)的殼體。該方案的各階段可包括 用單獨(dú)Ad血清型殼體進(jìn)行一系列注射(或其它遞送途徑)，然后用另一種 Ad血清型殼體進(jìn)行一系列注射?；蛘?，本發(fā)明修飾的Ad載體可用于涉及
其它非腺病毒介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)，包括其它病毒系統(tǒng)、非病毒遞送系統(tǒng)、蛋 白質(zhì)、肽和其它生物活性分子的方案。
以下章節(jié)關(guān)注于可通過本發(fā)明修飾的腺病毒殼體(如蛋白質(zhì)形式)或修 飾的腺病毒載體遞送的示范性分子。
在一個(gè)實(shí)施方式中，按照己公開的基因治療方法將本文所述修飾的Ad 載體給予人?？蓪y帶所選轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明病毒載體給予患者，優(yōu)選懸浮 于生物相容性溶液或藥學(xué)上可接受的遞送載體。合適的載體包括無菌鹽水。 已知是藥學(xué)上可接受的載體且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它水性和非水性 等滲無菌注射溶液以及水性和非水性無菌混懸液均可用于此目的。
給予足量的修飾腺病毒載體，以提供所需的生理作用。常規(guī)和藥學(xué)上 可接受的給藥途徑包括但不限于直接遞送至視網(wǎng)膜和其它眼內(nèi)遞送方法、 直接遞送至肝、吸入、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、直 腸、口服、眼內(nèi)、耳蝸內(nèi)和其它胃腸道外給藥途徑。如果需要，可根據(jù)轉(zhuǎn) 基因或病癥來組合后調(diào)節(jié)給藥途徑。給藥途徑主要取決于所治療疾病的特 性。
病毒載體的劑量主要取決于以下因素，例如治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此可依患者而改變。例如，治療有效的病毒載體的成
人或獸用劑量通常為約100 mL載體，其中病毒顆粒的濃度為約1 x
106-1 x 1015個(gè)顆粒，約1 x IO"-I x 1013個(gè)顆粒，或約1 x 109-lx 1012個(gè)顆粒。 劑量范圍取決于動物大小和給藥途徑。例如，適用于肌肉內(nèi)注射的人用或 獸用劑量(約80 kg動物)約為一個(gè)部位1 x 109-5 x 1012個(gè)顆粒/毫升。任選地， 可遞送至多個(gè)給藥部位。在另一個(gè)例子中，適用于口服制劑的人用或獸用 劑量可以約為1 x IO"-I x 1015個(gè)顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)給藥途徑、 該重組載體的治療或疫苗應(yīng)用調(diào)節(jié)這些劑量?？杀O(jiān)測轉(zhuǎn)基因或免疫原的表 達(dá)水平，或循環(huán)抗體水平，以確定給藥頻率。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難了解測 定給藥頻率時(shí)間選擇的其它方法。
A洽疔絲分f
在一個(gè)方面，修飾的腺病毒六鄰體蛋白可含有一種或多種治療性轉(zhuǎn)基 因插入物，以促進(jìn)靶向和/或用于本文所述的治療方案。在另一方面，本發(fā) 明修飾的腺病毒載體可通過包裝攜帶一種或多種治療性轉(zhuǎn)基因。
轉(zhuǎn)基因編碼的有用的治療性產(chǎn)物包括激素與生長因子和分化因子，包括但 不限于胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激 素釋放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素 (hCG)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒細(xì)胞集落 刺激因子(GCSF)、促紅細(xì)胞生產(chǎn)素(EPO)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、堿性成 纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子 (EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGFa)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素生長 因子I和II(IGF-I和IGF-II)、轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的任一個(gè)(包括TGF、活 化素、抑制素)、或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)BMP1-15中的任一個(gè)、生長因子 中的調(diào)蛋白/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/ ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一個(gè)、神 經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NT-3和 NT-4/ 5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)、 neurturin、聚集蛋白、腦信號蛋白/瓦解蛋白家族的任一個(gè)、導(dǎo) 蛋白-1和導(dǎo)蛋白-2、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、肝配蛋白、頭蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸羥化酶。其他有用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，包括但不限于
細(xì)胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1到IL-25(包 括，例如IL-2、 IL-4、 IL-12和IL-18)、單核細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白、白血病 抑制因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子和干 擾素、干細(xì)胞因子、flk-2/flt3配體。免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的基因產(chǎn)物也可用于本 發(fā)明。這些產(chǎn)物包括但不限于免疫球蛋白IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE、嵌 合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、單鏈 T細(xì)胞受體、I類和II類MHC分子，以及經(jīng)改造的免疫球蛋白和MHC分子。 有用的基因產(chǎn)物還包括補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，例如補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、膜輔因子蛋白 (MCP)、衰變加速因子(DAF)、 CR1、 CF2禾卩CD59。
其他有用的基因產(chǎn)物包括激素受體、生長因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、調(diào) 節(jié)蛋白質(zhì)和免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的任一種。本發(fā)明包括膽固醇調(diào)節(jié)受體，包括低密 度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體， 用于調(diào)節(jié)脂質(zhì)的蛋白質(zhì)，包括例如載脂蛋白(apo) A和其同種型(如ApoAI)、 apoE和其同種型(包括E2、 E3禾卩E4)、 SRB1、 ABC1和清除受體。本發(fā)明也包 括以下基因產(chǎn)物例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質(zhì)激素受體和 雌激素受體、維生素D受體和其他核受體。
此外，有用的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄因子，例如>"、/cw、 max、 mad、血清 應(yīng)答因子(SRF)、 AP-1、 AP2、 m如、MyoD和肌細(xì)胞生成蛋白、含ETS-盒的蛋 白質(zhì)、TFE3、 E2F、 ATF1、 ATF2、 ATF3、 ATF4、 ZF5、 NFAT、 CREB、 HNF-4、 C/EBP、 SP1、 CCAAT-盒結(jié)合蛋白、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1)、 Wilms腫瘤蛋 白、ETS-結(jié)合蛋白、STAT、 GATA-盒結(jié)合蛋白，例如GATA-3和翼狀螺旋蛋 白的叉頭蛋白家族。
其他有用的基因產(chǎn)物包括氨甲酰合成酶I、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨基琥 珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯 丙氨酸羥化酶、a-l抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、胱硫醚 卩-合成酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰-CoA羧化酶、 甲基丙二酰CoA變位酶、戊二酰-CoA脫氫酶、胰島素、(3-葡糖苷酶、丙酮酸 羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)序列和抗肌萎縮蛋白基因cDNA序列。其它有 用的基因產(chǎn)物包括用于治療A型血友病的基因產(chǎn)物(如因子VIII和其變體，包 括任選地通過接頭(junction)操作性連接的異源二聚體的輕鏈和重鏈)和B-結(jié)構(gòu) 域缺失的因子VIII，參見美國專利6,200,560和6，221,349]和用于治療B型血友 病的基因產(chǎn)物(如因子IX)。
其他有用的基因產(chǎn)物包括非天然存在的多肽，例如具有非天然存在的氨基 酸序列的嵌合或雜交多肽，所述非天然存在的氨基酸序列含有插入、缺失或氨 基酸取代。例如，經(jīng)單鏈改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其他 類型的非天然存在的基因序列包括反義分子和催化性核酸，例如核酶，可用于 降低耙點(diǎn)的過表達(dá)。
降低和/或調(diào)節(jié)基因表達(dá)對治療以細(xì)胞過度增殖為特征的過度增殖性疾 病，例如癌癥和銀屑病，尤其理想。靶多肽包括，與正常細(xì)胞相比，僅在過度 增殖細(xì)胞中產(chǎn)生或在過度增殖細(xì)胞中以更高水平產(chǎn)生的多肽。靶抗原包括癌基 因和易位基因編碼的多肽，所述癌基因編碼的多肽例如myb、 myc、 fyn，所述 易位基因編碼的多肽如bcr/abl、 ras、 src、 P53、 neu、 trk禾卩EGRF。除了作為 靶抗原的癌基因產(chǎn)物，用于抗癌治療和保護(hù)性治療方案的靶多肽包括B細(xì)胞淋 巴瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體的可變區(qū)，在某些些實(shí) 施方案中，它們也用作自身免疫疾病的靶抗原。其他腫瘤相關(guān)多肽也可用作靶 多肽，例如在腫瘤細(xì)胞中處于較高水平的多肽，包括單克隆抗體17-1A所識別 的多肽和葉酸結(jié)合多肽。
其他合適的治療性多肽和蛋白質(zhì)包括通過賦予抗自身免疫相關(guān)靶的廣譜 基礎(chǔ)保護(hù)性免疫應(yīng)答來治療患自身免疫疾病和紊亂的個(gè)體的多肽和蛋白，所述 自身免疫相關(guān)靶包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生"自我"定向抗體的細(xì)胞。T細(xì)胞介導(dǎo)的 自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、 Sj6gren氏綜合 征、結(jié)節(jié)病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié) 炎、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、韋格納肉芽 腫病、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病均以結(jié)合內(nèi)源性抗原并引發(fā)自身免 疫疾病相關(guān)炎性級聯(lián)反應(yīng)的T細(xì)胞受體(TCR)為特征。
本發(fā)明修飾的腺病毒載體特別適合需要多種腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因遞送的治療方案，例如，包括再次遞送相同轉(zhuǎn)基因的方案或包括遞送其它轉(zhuǎn)基因的組 合方案。這類方案可包括給予修飾的腺病毒載體，然后再次給予來自相同血清 型腺病毒的載體。特別想要的方案包括給予本發(fā)明修飾的腺病毒載體，其中在 第一次給藥中遞送的病毒載體血清型與隨后一次或多次給藥中所用的病毒載 體血清型不同。例如，治療方案包括給予修飾的腺病毒和重復(fù)給予一種或多種 血清型相同或不同的修飾腺病毒。在另一個(gè)例子中，治療方案包括給予腺病毒 載體，然后重復(fù)給予與第一次遞送的腺病毒載體血清型不同的本發(fā)明修飾的腺 病毒載體，在先給藥步驟中還任選給予與該載體血清型相同、或優(yōu)選不同的另 一種載體。這些方案不限于遞送用本發(fā)明嵌合血清型構(gòu)建的腺病毒載體。但是， 這些方案可容易地利用其它腺病毒血清型載體(修飾或未修飾)，這些載體可以 是人工、人或非人靈長動物或其它哺乳動物來源，可與一種或多種本發(fā)明嵌合 載體聯(lián)用。本申請其它地方討論了這類血清型的例子。另外，這些治療方案可
包括同時(shí)或依次遞送本發(fā)明修飾的腺病毒載體與非腺病毒載體、非病毒載體和 /或各種其它有治療用途的化合物或分子。本發(fā)明不限于這些治療方案，本領(lǐng)域 技術(shù)人員明白這些治療方案的各種變形。 Z被微縫層遂送
如前所述，修飾的腺病毒六鄰體蛋白本身可經(jīng)修飾而包含所選肽、多肽或 蛋白質(zhì)，這些肽、多肽或蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)對所選免疫原的免疫應(yīng)答。這類修飾的 腺病毒六鄰體蛋白本身可用于產(chǎn)生用于靶向、用作佐劑和/或用于誘導(dǎo)特定免疫 應(yīng)答的腺病毒殼體。在另一實(shí)施方式中，用這類修飾的腺病毒殼體產(chǎn)生包裝有 合適的表達(dá)盒或小基因的病毒顆粒。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明修飾的腺病毒載體還含有包裝在修飾腺 病毒殼體中的編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因，這些肽，多肽或蛋白質(zhì)能誘導(dǎo) 對所選免疫原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的這類修飾腺病毒可提供自啟作用、佐劑作
用和/或可能在誘導(dǎo)對載體表達(dá)的插入異源蛋白的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或抗體方
面高度有效。
本發(fā)明腺病毒也可用作免疫原性組合物。重組腺病毒可用作任何免疫原的 預(yù)防性或治療性疫苗，只要已經(jīng)鑒定到對誘導(dǎo)其免疫應(yīng)答至關(guān)重要且能夠限制
該病原體傳播的抗原，并可獲得其cDNA。這類疫苗(或其它免疫原性)組合物配制在合適的遞送載體中，如上所述。 通常，免疫原性組合物的劑量在上述治療組合物的劑量范圍內(nèi)?？杀O(jiān)測所選基 因的免疫水平，以確定對加強(qiáng)免疫的需求(如果有)。評估血清中的抗體效價(jià)后， 可能需要任選的加強(qiáng)免疫。
任選地，可配制本發(fā)明疫苗組合物，以含有其它組分，包括例如佐劑、 穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這類組分。合適佐 劑的例子包括但不限于脂質(zhì)體、明礬、單磷酰脂質(zhì)A和任何生物學(xué)活性因
子，如細(xì)胞因子、白介素、趨化因子、配體和其優(yōu)化組合?？赏ㄟ^(例如) 質(zhì)粒或病毒載體在體內(nèi)表達(dá)所述的某些生物活性因子。例如，這類佐劑可
與編碼抗原的初免DNA疫苗一起給藥，以便相對于只用編碼該抗原的DNA 疫苗初免后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答提高抗原特異性免疫應(yīng)答。
以"免疫原性量"給予腺病毒，該量為在給藥途徑中能夠有效轉(zhuǎn)染所需細(xì)胞 并提供足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的所選基因表達(dá)水平的腺病毒量。提供保護(hù)性免疫 時(shí)，認(rèn)為該腺病毒是用于防止感染和/或疾病復(fù)發(fā)的疫苗組合物。
例如，免疫原可選自各種病毒科。需要免疫應(yīng)答來抵御的病毒科的實(shí)例包 括小RNA病毒科，其包括導(dǎo)致約50%普通感冒病例的鼻病毒屬；腸病毒屬， 其包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和人腸病毒(例如甲肝病毒)； 以及口瘡病毒屬，其主要在非人動物中導(dǎo)致口蹄疫。在小RNA病毒科內(nèi)，靶 抗原包括VP1、 VP2、 VP3、 VP4禾BVPG。另一病毒科包括杯狀病毒科，其包 括諾沃克病毒群體，它是流行性胃腸炎的重要病原體。另一種有望用于靶抗原 在人或非人動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的病毒科是披膜病毒科，該科包括甲型病毒 屬，該甲型病毒屬包括辛德畢斯病毒、羅斯河病毒、和委內(nèi)瑞拉、東部和西部 馬腦炎病毒和風(fēng)疹病毒屬，包括風(fēng)疹病毒。黃病毒科包括登革熱、黃熱、日本 腦炎、圣路易斯腦炎和蜱媒性腦炎病毒。其他靶抗原可從丙型肝炎或冠狀病毒 科產(chǎn)生，其中包括許多非人病毒，例如感染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性 胃腸病毒(豬)、豬凝lL性腦脊髓炎病毒(豬)、貓感染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠 狀病毒(貓)、狗冠狀病毒(狗)和可導(dǎo)致普通感冒和/或非-甲型、乙型或丙型肝 炎的人呼吸冠狀病毒。此外，人冠狀病毒包括突發(fā)性急性呼吸道綜合征(SARS) 的推定病原體。在冠狀病毒科內(nèi)，靶抗原包括El(也稱為M或基質(zhì)蛋白)、E2(也稱為S或突起蛋白)、E3(也稱為HE或血凝素-依爾替糖)、糖蛋白(并非所有冠 狀病毒中都有)或N(核衣殼)。其它抗原可靶向彈狀病毒科，包括水皰病毒屬(例
如皰疹口炎病毒)和狂犬病病毒屬(例如狂犬病)。在彈狀病毒科內(nèi)，適當(dāng)?shù)?br> 抗原可源于G蛋白或N蛋白。包括出血熱病毒例如馬爾堡和埃博拉病毒的絲 狀病毒科可能是合適的抗原來源。副黏病毒科包括1型副流感病毒、3型副流 感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、 4型副流感病毒、新城疫病毒(雞)、牛瘟病毒、麻疹病毒(其包括麻疹和犬瘟熱)， 以及肺病毒(其包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒被分在正黏病毒科內(nèi)，并且是 抗原(例如HA蛋白、Nl蛋白)的合適來源。布尼亞病毒科包括布尼亞病毒屬 (加利福尼亞腦炎，拉克羅斯腦炎)、白蛉熱病毒屬(裂谷熱)、漢坦病毒屬(普馬 拉是hemahagin熱病毒)、內(nèi)羅畢病毒屬(內(nèi)羅畢綿羊病)和各種未命名的銀環(huán)蛇 病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙熱病毒的抗原來源。呼腸孤 病毒科包括呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬(其導(dǎo)致兒童急性腸胃炎)、環(huán)狀病毒屬 和科羅拉多蜱熱病毒屬(科羅拉多蜱熱病毒屬、Lebombo病毒屬(人)、馬變性腦 病病毒屬、藍(lán)舌病病毒屬)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒科包括致腫瘤RNA病毒亞科，該亞科包括人和獸醫(yī)疾病，例 如貓白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亞科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、 貓免疫缺陷病毒、犬感染性貧血病毒和泡沫病毒亞科)。在慢病毒中，已經(jīng)描 述且不難選擇許多合適抗原。
合適的HIV和SIV抗原的實(shí)例包括但不限于gag、 pol、 Vif、 Vpx、 VPR、 Erw、 Tat、 Nef和Rev蛋白，及其各種片段。例如，Env蛋白的合適片段可包 括其任何亞基，如gpl20、 gpl60、 gp41或其較小片段，如，長度至少約為8 個(gè)氨基酸的片段。相似地，可選擇tat蛋白的片段。[參見美國專利5,891,994 和美國專利6,193,981 。]還參見，在D.H.Baroueh等，Wro/.， 75(5):2462-2467(2001年3月)禾卩R.R.Amara等，Sc/ewce， 292:69-74(2001年4 月6日)中所描述的HIV和SIV蛋白。在另一個(gè)例子中，可利用HIV和/或SIV 免疫原性蛋白質(zhì)或肽形成融合蛋白或其它免疫原性分子。參見例如，2001年 8月2日公開的WO 01/54719和1999年4月8日公開的WO 99/16884所述的 HIV-1 Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本發(fā)明不限于本文所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。此外，已經(jīng)描述過對這些蛋白的各種修飾，本領(lǐng)域
技術(shù)人員不難進(jìn)行這些修飾。參見，例如在美國專利5,972,596中描述了修 飾的gag蛋白。另外，任何所需的HIV和/或SIV免疫原均可單獨(dú)或聯(lián)合遞送。 這類組合可包括由一種載體或多種載體表達(dá)。任選地，另一種聯(lián)合遞送可包括 遞送一種或多種表達(dá)的免疫原與遞送一種或多種蛋白質(zhì)形式的免疫原。下面更 詳細(xì)地討論這種聯(lián)合。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亞科(BKU和JCU病毒)和乳頭瘤病毒亞科(與 癌癥或乳頭瘤的惡性進(jìn)展有關(guān))。腺病毒科包括導(dǎo)致呼吸疾病和/或腸炎的病 毒(EX、 AD7、 ARD、 O.B.)。細(xì)小病毒科包括貓細(xì)小病毒(貓腸炎)、貓全白細(xì) 胞減少病病毒、狗細(xì)小病毒和豬細(xì)小病毒科。皰疹病毒科包括皰疹病毒亞科， 該亞科包括單純皰疹病毒屬(HSVI、 HSVII)、水痘病毒屬(假狂犬病、水痘 帶狀皰疹)；以及卩皰疹病毒亞科，該亞科包括巨細(xì)胞病毒屬(HCMV，鼠巨 細(xì)胞病毒屬)；和Y皰疹病毒亞科，該亞科包括淋巴潛伏病毒屬、EBV(伯基 特淋巴瘤)、傳染性鼻氣管炎病毒屬、馬雷克病病毒屬和細(xì)長病毒屬。痘病 毒科包括脊椎動物痘病毒亞科，包括正痘病毒屬(天花和牛痘病毒)、副痘病毒 屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬和昆蟲痘病毒亞科。 嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒?？赡苁呛线m抗原來源的一種未分類病毒是丁 型肝炎病毒。其他的病毒來源包括鳥感染性粘液囊病病毒和豬呼吸和生殖綜合 征病毒。甲型病毒科包括馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
本發(fā)明病毒也可攜帶用于免疫人或非人動物抗其他病原體的免疫原，所述 病原體包括感染人和非人脊椎動物的細(xì)菌、真菌、寄生微生物或多細(xì)胞寄生蟲， 或來自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的病原體。細(xì)菌病原體的例子包括致病性革蘭陽性球 菌，包括肺炎雙球菌；葡萄球菌；和鏈球菌。致病性革蘭陰性球菌包括腦膜炎 球菌、淋球菌。致病性腸革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌科；假單胞菌屬、不動桿 菌屬和?？暇鷮?；類鼻疽假單孢菌屬；沙門菌屬；志賀菌屬；嗜血桿菌屬莫 拉菌屬；杜克雷嗜血桿菌(Z/.^c^y/X其導(dǎo)致軟下疳)；布魯桿菌；野兔熱弗朗 西絲菌(/^^/^^ ^to^M&)(其導(dǎo)致兔熱病)；耶爾森菌屬(巴斯德菌屬)；念珠 狀鏈桿菌和螺菌屬；革蘭陽性桿菌，其包括單核細(xì)胞增多李斯特菌；紅斑丹毒 絲菌；白喉棒狀桿菌(Coo^e^"w/ww fi^/z^en'a)(白喉)；霍亂；炭疽桿菌(A朋Ara^)(炭疽)；多諾萬病(腹股溝肉芽腫)和巴爾通體病。致病性厭氧菌引 起的疾病包括破傷風(fēng)；肉毒中毒；其它梭菌??；結(jié)核?。宦轱L(fēng)?。缓推渌种?桿菌病。致病性螺旋體疾病包括梅毒；密螺旋體病雅司病、品他病和地方性 梅毒；以及鉤端螺旋體病。較高致病性細(xì)菌和致病性真菌導(dǎo)致的其他感染包括 放線菌病；諾卡菌病；隱球菌病、芽生菌病、組織胞漿菌病和球孢子菌病；念 珠菌病、曲霉病和毛霉?。绘咦咏z菌??；副球孢子菌病、石樣真菌病、球擬酵 母病、足分枝菌病和著色真菌??；以及皮真菌病。立克次體感染包括斑疹傷寒 熱、落磯山斑疹熱、Q熱和立克次氏體痘。支原體和衣原體感染的實(shí)例包括 支原體肺炎、性病性淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和圍產(chǎn)期衣原體感染。致病性真核細(xì) 胞包括致病性原生動物和蠕蟲，并且由其產(chǎn)生的感染包括阿米巴病、瘧疾、 禾!j什曼病、錐蟲病、弓開》體病、卡氏月市囊蟲(尸"ewmoqy幼's cfln'"〃)、 Trichans、 鼠弓形體(7bxo/7/a^m" go &/)、巴貝蟲病、賈第蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血 吸蟲病、線蟲、吸蟲(trenjatode)或吸蟲(fluke)感染和絳蟲(;絳蟲)感染。
這些生物體和/或其產(chǎn)生的毒素中有許多已被疾病控制中心[(CDC)，健康 與人類服務(wù)部(Department of Heath and Human Services),美國]認(rèn)定為是可用于 生物攻擊的物質(zhì)。例如，某些此類生物物質(zhì)包括目前分類為A類物質(zhì)的炭 疽桿菌C6""7/w a威mc/s)(炭疽)、肉毒梭菌(C7oW"W謂6幽/Z"謂)及其毒素 (肉毒桿菌毒素)、鼠疫耶爾森菌(^^>^;^/&)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔 熱弗朗西絲菌CF>am'"http://a w/a"朋/力(兔熱病)和病毒性出血熱[絲狀病毒(例 如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)和沙粒病毒[例如拉沙病毒、馬丘博病毒]; 目前分類為B類物質(zhì)的伯內(nèi)特科克斯立克次體(0^&/& Z)wmem')(Q熱)、布 魯桿菌(布魯桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(5wr狄oWe〃'a /^//&)(鼻疽)、假 鼻疽伯克霍爾德氏菌(5w^o/cfen'a ;wez^oma〃e0(類鼻疽)、蓖麻(W/c/ww commwm'力及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、產(chǎn)氣莢月莫梭菌(C7oW〃Wwm / er/r/"gew) 及其毒素(s毒素)、葡萄球菌0^^/^/ococc^)及其毒素(腸毒素B)、鸚鵡熱 衣原體(C7z/awj^/" ;w"ta"')(鸚鵡熱)、水上安全威脅(water safety threat)(例 如霍舌L弧菌(歸"o c/ o/erae)、 小隱孢子蟲(O，，o"W扁/wv調(diào))、斑 疹傷寒熱(普氏立克次體(i /c/zeto/a ; oM^zeh'0和病毒性腦炎(甲型病毒，例 如委內(nèi)瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎)；以及目前分類為C類物質(zhì)的Nipan病毒和漢坦病毒。此外，其他如此分類或不同分類的生物體也可 能在將來可被鑒定和/或用于這種目的。容易理解的是，本文所述的病毒載體 和其他構(gòu)建體可用于傳遞來自這些生物體的抗原、病毒、其毒素或其他副產(chǎn)物， 這可預(yù)防和/或治療這些生物物質(zhì)引起的感染或其他不良反應(yīng)。
施用本發(fā)明的載體來遞送抗T細(xì)胞可變區(qū)的免疫原引發(fā)包括細(xì)胞毒性淋 巴細(xì)胞(CTL)在內(nèi)的免疫應(yīng)答來消除T細(xì)胞。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，己鑒 定了參與該疾病的數(shù)種特定T細(xì)胞受體(TCR)可變區(qū)。這些TCR包括V-3、 V_14、 V-17和Va-17。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的核酸序列將引發(fā) 以參與RA的T細(xì)胞為目標(biāo)的免疫應(yīng)答。在多發(fā)性硬化癥(MS)中，已鑒定了參 與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR包括V-7和Va-lO。因此，遞送 編碼這些多肽中至少一種的核酸序列將引發(fā)以參與MS的T細(xì)胞為靶點(diǎn)的免疫 應(yīng)答。在硬皮病中，已鑒定了參與該疾病的數(shù)種特定TCR可變區(qū)。這些TCR 包括V-6、 V-8、 V陽14和Va-16、 Va-3C、 Va-7、 Va-14、 Va-15、 Va-16、 Va陽28 和Va-12。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的嵌合腺病毒將引發(fā)以參與硬 皮病的T細(xì)胞為目標(biāo)的免疫應(yīng)答。
3.逮送萬法
可監(jiān)測所選基因的治療水平或免疫力水平，以確定對加強(qiáng)免疫的需求(如 果有)。評估血清中的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，或任選評估血清中的抗體效價(jià)后，可 能需要任選的加強(qiáng)免疫。任選地，可以單獨(dú)給藥或各種聯(lián)合給藥方案來遞送本 發(fā)明腺病毒載體，例如，與包括其它成分的方案或療程聯(lián)用或在初免-加強(qiáng)方 案中遞送。本領(lǐng)域已經(jīng)描述過各種方案，不難進(jìn)行選擇。
例如，初免-加強(qiáng)方案可包括給予DNA(如質(zhì)粒)載體，以使免疫系統(tǒng)對第 二種或再次加強(qiáng)給予傳統(tǒng)抗原，如蛋白質(zhì)或攜帶編碼這種抗原的序列的重組病 毒產(chǎn)生免疫力。參見例如，納入作參考的2000年3月2日公開的國際專利公 開號WO 00/11140?；蛘撸庖叻桨缚砂ńo予本發(fā)明修飾的腺病毒載體以加 強(qiáng)對攜帶抗原或蛋白質(zhì)載體(病毒或DNA載體)的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)替換方 式中，免疫方案包括給予蛋白質(zhì)后用編碼抗原的載體加強(qiáng)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在方案中初免和加強(qiáng)對所選抗原的免疫應(yīng) 答的方法，所述方法包括遞送本發(fā)明修飾的腺病毒載體。這種方案可包括遞送攜帶所選免疫原的質(zhì)粒DNA載體和/或由初免和/或加強(qiáng)載體表達(dá)多種蛋白。參 見例如，R.R. Amara， 5W匿，292:69-74 (6 April 2001)，其描述了表達(dá)用于 對HIV和SIV產(chǎn)生免疫應(yīng)答的蛋白亞基的多種蛋白方案。例如，初免時(shí)通過 一種轉(zhuǎn)錄物或多種轉(zhuǎn)錄物遞送Gag、 Pol、 Vif、 VPX和Vpr和Env、 Tat和Rev。 或者，在一種構(gòu)建物中遞送SIV Gag、 Pol和HIV-1 Env。國際專利公開號WO 99/16884和WO 01/54719描述了其它方案。
然而，初免-加強(qiáng)方案不限于HIV的免疫或遞送這些抗原。例如，初免可 包括遞送第一載體，然后用第二載體或含有蛋白質(zhì)形式的該抗原的組合物加 強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)例中，初免-加強(qiáng)方案可提供針對產(chǎn)生該抗原的病毒、細(xì)菌或其 它生物體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在另一個(gè)所需實(shí)施方式中，初免-加強(qiáng)方案提供 可用檢測所治療病癥的存在的常規(guī)試驗(yàn)測定的療效。
初免組合物可依劑量依賴性方式給予身體的不同部位，這取決于所需免疫 應(yīng)答靶向的抗原。本發(fā)明不受注射量或部位，或藥物載體的限制。另外，該方 案可包括初免和/或加強(qiáng)步驟，各步驟可包括每小時(shí)、每天、每周、每月或每年 給予的單次給藥或劑量。例如，該哺乳動物可接受載體中含有約10 pg-50 pg 質(zhì)粒的一個(gè)或兩個(gè)劑量。DNA組合物的所需用量約為1 pg-10，000嗎DNA載 體。劑量可以在約1-1000 pg DNA/kg對象體重的范圍中變化。宜根據(jù)哺乳動 物的種類和條件選擇遞送量或遞送部位。
本文描述了適合將該抗原遞送給哺乳動物的載體的劑量單位?？赏ㄟ^懸浮 或溶解于藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體如等滲鹽水；等滲鹽溶液或本領(lǐng)域技
術(shù)人員已知用于這類給藥中的其它制劑中，制備給藥載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員了 解合適的載體，載體的種類主要取決于給藥途徑?？砂凑丈鲜鐾緩綄⒈景l(fā)明組 合物給予哺乳動物，例如在采用可生物降解的生物相容性聚合物的緩釋制劑中 遞送，或用微團(tuán)、凝膠和脂質(zhì)體原位(on-site)遞送。任選地，本發(fā)明初免步驟 也包括給予初免組合物、合適量的佐劑，如本文所述。
優(yōu)選地，將初免組合物給予哺乳動物對象約2-27周后，給予加強(qiáng)組合物。 用有效量的含有或能夠遞送與初免DNA疫苗所給抗原相同的抗原的加強(qiáng)組合 物給予該加強(qiáng)組合物。該加強(qiáng)組合物由衍生自同一病毒來源(如本發(fā)明腺病毒 序列)或另一來源的重組病毒載體組成?；蛘?，"加強(qiáng)組合物"可以是含有與初免DNA疫苗編碼抗原相同，但為蛋白質(zhì)或肽形式的抗原的組合物，該組合物能
誘導(dǎo)該宿主的免疫應(yīng)答。在另一實(shí)施方式中，該加強(qiáng)組合物含有編碼抗原的
DNA序列，例如載體，如熟知的細(xì)菌或病毒載體，所述DNA序列在指導(dǎo)其在 哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的控制下。對加強(qiáng)組合物的主要要求是該組 合物的抗原是與初免組合物編碼抗原相同的或能交叉反應(yīng)的抗原。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明修飾的腺病毒載體也適合用于各種免疫和 治療方案。這類方案可包括本發(fā)明腺病毒載體與不同血清型殼體的Ad載體 同時(shí)或依次遞送的方案，本發(fā)明腺病毒載體與非Ad載體同時(shí)或依次遞送的 方案，本發(fā)明腺病毒載體與蛋白質(zhì)、肽和/或其它有生物活性的治療或免疫 原性化合物同時(shí)或依次遞送的方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解這些應(yīng)用。
因此，本發(fā)明提供用于各種治療和疫苗方案的免疫原性組合物，該組 合物含有本發(fā)明修飾的腺病毒六鄰體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的腺 病毒六鄰體可以空修飾腺病毒殼體(即含有修飾腺病毒六鄰體，但其中沒有 包裝任何遞送給靶細(xì)胞的小基因的的腺病毒殼體)的形式遞送給對象。在另 一實(shí)施方式中，可利用在靶細(xì)胞中表達(dá)此種六鄰體的載體。在另一實(shí)施方 式中，將攜帶小基因的修飾的腺病毒顆粒遞送給對象。
此種修飾的腺病毒顆粒的修飾殼體中可含有靶向序列。然而，此種修 飾的腺病毒顆?？蓸?gòu)成自啟式免疫原性組合物的基礎(chǔ)。在腺病毒殼體中的 外源性氨基酸序列是免疫原，且殼體中也包裝有編碼免疫原的核酸序列時(shí)， 可制備這類自啟式組合物。如本文所述，殼體蛋白中的免疫原和殼體中包 裝的分子所含的免疫原可能相同，可誘導(dǎo)對相同病毒或生物體的免疫應(yīng)答。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明自啟式腺病毒顆粒的殼體中可含有能誘導(dǎo)非特 異性免疫應(yīng)答的免疫原，且包裝有誘導(dǎo)對所選細(xì)胞類型、分子或生物體的 特異性或交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答的所述第二種免疫原。
實(shí)施例
以下實(shí)施例為說明性，不應(yīng)將本發(fā)明限制于這些說明性實(shí)施方式。 本發(fā)明者已經(jīng)證明，可產(chǎn)生含有六鄰體(HVR1區(qū)，定義如Rux等(2003)， 同上所述)的25個(gè)氨基酸缺失(ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK， SEQID NO: ll)的活腺病毒突變體。
本發(fā)明者還證明，可將編碼所需肽序列(在本例中，肽序列
-EQELLELDKWASLW, SEQ ID NO: 12-對應(yīng)于據(jù)報(bào)道攜帶HIV中和表位 的HIV包膜蛋白區(qū)段)的外源性DNA節(jié)段插入缺失位點(diǎn)。
實(shí)施例l: HAdV-5六鄰體的插入誘變
用于突變六鄰體DNA序列，以使其編碼外來肽序列的克隆步驟如下
將攜帶六鄰體編碼區(qū)的HAdV-5基因組的Ascl片段亞克隆到質(zhì)粒 pNEB193(購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs))中，產(chǎn)生 pNEBAsc (見圖1)。
在六鄰體上進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))誘變，以便在插入位點(diǎn)上產(chǎn)生新的 Spel位點(diǎn)。PCR誘變產(chǎn)生Spel位點(diǎn)的詳情見下。
反應(yīng)1禾n 2的PCR模板是pNEBAsc(含有克隆到質(zhì)粒pNEB193中的六 鄰體區(qū)的Ad5 Ascl片段)。合并反應(yīng)1和2的產(chǎn)物，用作反應(yīng)3的模板。PCR 酶是Tgo聚合酶。所有三個(gè)反應(yīng)的循環(huán)如下94°-30秒，45。-60秒，72°-60秒，循環(huán)40次。
在反應(yīng)1中，用弓l物"5hexl"(GACCGCCGTTGTTGTAACCC， SEQ ID NO: 13)和"反向It" (GTTGTCATCGTCCACTAGTCCCTCTTCTTCTAGG TTTATTTCAAG ， SEQ ID NO: 14)擴(kuò)增713 bp片段。
在反應(yīng) 2 中， 用引物"正向 rt" (GGACTAGTGGACGATGACAACGAAGACGA， SEQ ID NO: 15)和"反向 rt" (ATGGTTTCATTGGGGTAGTC ， SEQ ID NO: 16)擴(kuò)增259 bp片段。
在反應(yīng)3中，用引物"5hexl"和"反向rt"將反應(yīng)1和反應(yīng)2產(chǎn)生的片段 連接起來，得到951 bp產(chǎn)物。用Blpl切割連接的951 bp產(chǎn)物；用得到的 518 bp片段替換pNEBAsc的天然Blpl片段，得到pNEBAscSpe。這會將含 有Spel位點(diǎn)的GGACTAGTG [SEQ ID NO: 15的nt 1-9](編碼氨基酸GLV) 插入六鄰體氨基酸序列的EEE和DDD之間(aa弁149和150之間)。
將編碼所需肽序列的合成DNA片段插入Spel位點(diǎn)。該方法的詳情如下。使寡聚物"CD4 top，，(CTAGGCTGCTACGGCGTGAGCGCCACCAAG CTGGGG， SEQ ID NO: 18)和"CD4 bot，， (CTAGCCCCAGCTTGGTGG CGCTCACGCCGTAGCAGC, SEQ ID NO: 19)—起退火后，將SARS冠狀 病毒的突起蛋白的Balb/c小鼠CD4表位插入pNEBAscSpe的Spel位點(diǎn)中， 得到pNEBAscSpe-突起CD4。這會將GLGCYGVSATKLGLV (SEQ ID NO: 20)放入六鄰體的EEE和DDD之間(aa弁149和150之間)。
為了插入SARS冠狀病毒的突起蛋白的Balb/c小鼠CD8表位，將寡聚 體"CD8 top" (CTAGGGACCAGCACCGGCAACTACAACTACAAGTACC GCTACCTGCGCCACGGCAAGCTGCGCCCCGGG， SEQ ID NO: 21)禾口"CD4 bot，， (CTAGCCCCAGCTTGGTGGCGCTCACGCCGTAGCAGC ， SEQ ID NO: 22) —起退火后，插入pNEBAscSpe的Spel位點(diǎn)中，得到pNEBAscSpe-突起CD8。這會將氨基酸序列GLGTSTGNYNYKYRYLRHGKLRPGLV (SEQ ID NO: 23)放入六鄰體的EEE和DDD之間(aa存149禾P 150之間)。
用含有插入外來序列的六鄰體的質(zhì)粒分子克隆替換El和E3缺失的 HAdV-5載體的含天然六鄰體的質(zhì)粒分子克隆(pSRAd5eGFP)，產(chǎn)生攜帶突 變六鄰體的新質(zhì)粒分子克隆(分別是pH5sCD4和pH5sCD8)。
在六鄰體上進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))誘變，以便在插入位點(diǎn)上產(chǎn)生新 的BspEI限制性酶切位點(diǎn)。PCR誘變產(chǎn)生BspEl位點(diǎn)的詳情見下。
pNEBAsc(含有克隆到質(zhì)粒pNEB193中的六鄰體區(qū)的Ad5 Ascl片段) 是反應(yīng)1和2的模板。合并反應(yīng)1和2的產(chǎn)物，用作反應(yīng)3的模板。
PhusionTM高保真PCR試劑盒購自NEB，按照生產(chǎn)商說明書使用。所 有三個(gè)反應(yīng)的循環(huán)是98°-5秒，55°-15秒，72°-60秒，循環(huán)25次。
在反應(yīng)1中，用引物"5hexl"(GACCGCCGTTGTTGTAACCC， SEQ ID NO:24)禾口反向BspSOE(CGTGAGTTCCGGAAGTAGCAGCTTCATCCCATT CG， SEQ ID NO: 25)擴(kuò)增678 bp片段。在反應(yīng)2中，用正向引物 BspSOE(TGCTACTTCCGGAACTCACGTATTTGGGCAGGCG ， SEQ ID NO: 26)和5hex4 (GGAAGAAGGTGGCGTAAAGG， SEQ ID NO: 27)擴(kuò)增 1379 bp片段。
在反應(yīng)3中，用引物5hexl和5hex4將反應(yīng)1和2得到的片段連接在一起，用Rsrll+Avrll切割2037 bp產(chǎn)物；將得到的1908 bp片段連接到 pNEBAsc/Rsrll+Avrll 中 產(chǎn) 生 pNEBAscBspEI 。 使 編 碼 ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK [SEQ ID NO: 1 l]的75 bp缺失，并將含 BspEI位點(diǎn)的TCCGGA(編碼SG的SEQ ID NO: 27的nt 71-3)插入六鄰體序列中。
將編碼所需肽序列的合成DNA片段插入Bspel位點(diǎn)中。該方法的詳情 如下。為了將HIV 2F5表位區(qū)插入pNEBAscBspEl中，使寡聚體'2F5 top，
GT， SEQ ID NO: 28)和'2F5 bot' CCCGGACCACAGGCTGGCCCACTTG TCCAGCTCCAGCAGCTCCTGCTCG, SEQ ID NO: 17)退火，并插入BspEI 位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒 pNEBAsc 2F5 。 使氨基酸序列 ALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK (SEQ ID NO: ll)代替上面產(chǎn)生的25
個(gè)氨基酸缺失。
用含有缺失或插入外來序列的六鄰體的質(zhì)粒分子克隆替換缺失El和 E3的HAdV-5載體的含天然六鄰體的質(zhì)粒分子克隆(pSRAd5eGFP)，產(chǎn)生攜 帶突變六鄰體的新型質(zhì)粒分子克隆(分別是pH5hexBspel和pH5 2F5)。
將攜帶突變六鄰體的新質(zhì)粒分子克隆(用Pad線性化)轉(zhuǎn)染到HEK 293 細(xì)胞中，以便用突變六鄰體產(chǎn)生感染性重組HAdV-5載體。
如本文所述，此種含有修飾六鄰體蛋白的新HAdV-5載體可用于多種應(yīng)用。
本說明書中引用的所有出版物都在此處引用作為參考。盡管參考特別 優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解的是可作出改進(jìn)而不脫離本發(fā) 明的精神。這些改進(jìn)應(yīng)落入所附權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種腺病毒，其具有殼體，所述殼體含有修飾的腺病毒六鄰體蛋白，所述修飾的腺病毒六鄰體蛋白在腺病毒六鄰體蛋白的至少一個(gè)高變區(qū)中含有缺失且所述高變區(qū)中插有外源性分子，所述至少一個(gè)高變區(qū)選自高變區(qū)1和高變區(qū)4構(gòu)成的組，限制條件是所述外源性氨基酸序列不是腺病毒序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述高變區(qū)是高變區(qū)1。
3. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述高變區(qū)是高變區(qū)4。
4. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述六鄰體蛋白含有一 個(gè)以上缺失。
5. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述缺失包括部分缺失。
6. 如權(quán)利要求5所述的腺病毒，其特征在于，所述缺失包括所述天然 卨變區(qū)中的至少25個(gè)氨基酸。
7. 如權(quán)利要求5所述的腺病毒，其特征在于，保留所述大然高變區(qū)中 N末端的至少一個(gè)氨基酸和C末端的至少一個(gè)氨基酸。
8. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述修飾的腺病毒六鄰 體蛋白中插有一個(gè)以上外源性分子。
9. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述外源性氨基酸序列 的長度為5-45個(gè)氨基酸殘基。
10. 如權(quán)利要求9所述的腺病毒，其特征在于，所述外源性氨基酸序 列的長度約為25個(gè)氨基酸殘基。
11. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述外源性氨基酸序 列包含耙向序列。
12. 如權(quán)利要求11所述的腺病毒，其特征在于，所述靶向序列選自細(xì) 胞受體的配體或抗體表位或其片段。
13. 如權(quán)利要求11所述的腺病毒，其特征在于，所述靶向序列選自雙 特異性抗體、抗-纖維突結(jié)Fab或抗-受體抗體。
14. 如權(quán)利要求1所述的腺病毒，其特征在于，所述外源性氨基酸序 列包含免疫原性氨基酸序列。
15. 如權(quán)利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述免疫原性氨基酸 序列是T細(xì)胞表位。
16. 如權(quán)利要求15所述的腺病毒，其特征在于，所述T細(xì)胞表位是中 和表位。
17. 如權(quán)利要求16所述的腺病毒，其特征在于，所述免疫原分子是 HIV蛋白的抗原。
18. 如權(quán)利要求17所述的腺病毒，其特征在于，所述氨基酸序列來自 選自tat蛋白或包膜蛋白的HIV蛋白。
19. 如權(quán)利要求17所述的腺病毒，其特征在于，所述外源性氨基酸序 列是EQELLELDKWASLW， SEQIDNO: 12。
20. 如權(quán)利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述抗原性氨基酸序 列是抗體表位。
21. —種改變腺病毒載體特異性的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求 1所述具有含修飾腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒的步驟，所述修飾的腺 病毒六鄰體蛋白包含插入所述高變區(qū)缺失中的靶向序列。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述靶向氨基酸序列選 自細(xì)胞受體的配體或抗體表位或其片段。
23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，將帶正電的氨基酸序列 插入所述缺失位點(diǎn)中。
24. —種提高對腺病毒載體遞送的免疫原性分子的免疫應(yīng)答的方法， 該方法包括以下步驟向?qū)ο筇峁?quán)利要求1所述具有含修飾腺病毒六鄰 體蛋白的殼體的腺病毒，所述腺病毒還含有編碼殼體中包裝的免疫原性分 子的核酸分子。
25. 如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的腺病毒在制備藥物中的應(yīng)用。
26. —種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求1所述具有含修飾腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，其 中所述外源性氨基酸序列是免疫原。
27. —種自啟式免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求1所述具有含修飾腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒，其中所述外源性氨基酸序列是第一種免疫原性氨基酸序列；所述腺病毒還包含編碼第二種免疫原性氨基酸序列的核酸序列。
28. 如權(quán)利要求27所述的自啟式免疫原性組合物，其特征在于，所述 第一種免疫原性或抗原性氨基酸序列和所述第二種免疫原性或抗原性氨基 酸序列相同。
29. 如權(quán)利要求27所述的自啟式免疫原性組合物，其特征在于，所述 第一種免疫原性或抗原性氨基酸序列和所述第二種免疫原性或抗原性氨基 酸序列不同并且誘導(dǎo)對相同病毒或生物體的免疫應(yīng)答。
30. 如權(quán)利要求27所述的自啟式免疫原性組合物，其特征在于，所述 第一種免疫原性或抗原性氨基酸序列誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答，所述第二種 免疫原性或抗原性氨基酸序列誘導(dǎo)對病毒或生物體的免疫應(yīng)答。
31. 如權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的自啟式免疫原性組合物在制備 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改變腺病毒載體特異性的方法。該方法包括提供具有含修飾的腺病毒六鄰體蛋白的殼體的腺病毒。修飾的腺病毒具有殼體，殼體中含有六鄰體高變區(qū)1和/或高變區(qū)4中有缺失且其中插有外源性分子的六鄰體蛋白。
文檔編號A61K39/12GK101437538SQ200780015004
公開日2009年5月20日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日
發(fā)明者J·M·威爾森, R·索米特拉 申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會