專利名稱：：預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適用于預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的化合物。更具體說，本發(fā)明涉及適用于預(yù)防性治療和減輕哮喘和/或特應(yīng)性的化合物。
背景技術(shù)：
：糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用于預(yù)防性治療哮喘和其他變態(tài)反應(yīng)性疾病。糖皮質(zhì)激素結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)，從而激活GR。然后活化的GR結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件并上調(diào)抗炎蛋白如脂皮質(zhì)蛋白的基因。誘生消炎蛋白脂皮質(zhì)蛋白進(jìn)而抑制磷脂酶A2，從而減少變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)(如前列腺素和白三烯)的產(chǎn)生。《3:^:及應(yīng)與^^反應(yīng)絲疾剪..嚴(yán)教虔狄洽#》0〃ergy爿〃erg/cZ)/5^os^5;77zeMe由"&附aw/77zera/ew^s,/丄Z)ew6wz-g編，i/腦aw/"c(CA類伊廁公司，7bto而,A/7'&/z/e/mer瀞皮廣激#對炎藍(lán)瓶敏游^^與其在哮凝^游洽#應(yīng)^有關(guān)活化的GR的另一個主要作用是下調(diào)多種物質(zhì)，包括細(xì)胞因子和趨化因子如白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。已經(jīng)證明，糖皮質(zhì)激素抑制細(xì)胞因子(尤其是IL-5)產(chǎn)生的能力是其有效治療變態(tài)反應(yīng)性疾病，尤其是哮喘和特應(yīng)癥的主要原因。而且，特別感興趣的是磷酸二酯酶同工酶(PDE's)，更具體是PDE4的抑制劑用作抗哮喘藥，因為證據(jù)表明這些酶在動物和人體中均能起抗炎劑和支氣管擴(kuò)張劑的作用。Com)'o丄5e/WaJ,Carafe/w/，Z/e"w五，Morc/〃o五.，錄^^艨/廠在支氣,祭漲^游/^^游砑究，包教乂支氣,游發(fā)究(7"ve^g加'o"/"toAem/eo/份.丄尸/zarmco/.'7993,/朋，562-568。因為其顯著的支氣管收縮作用，白三烯在變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究中也非常感興趣的。白三烯的支氣管收縮作用比組胺和前列腺素高約1000-倍以上。白三烯位于肥大細(xì)胞細(xì)胞膜磷脂雙層中的花生四烯酸的副產(chǎn)物。哮喘發(fā)作期間，花生四烯酸轉(zhuǎn)化為五種白三烯。這種轉(zhuǎn)化通過酶，即5-脂肪氧合酶(5-LO)介導(dǎo)，首先將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為5-羥基過氧二十碳四烯酸(5-HPETE)，然后再轉(zhuǎn)化為白三烯A4(LTA4)，白三烯A4是其他四種白三烯的前體。在哮喘發(fā)作期間產(chǎn)生的五種白三烯中，半胱氨酰類白三烯(LTC4、LTD4和LTE4)是最強(qiáng)效的支氣管收縮劑?！篹c(9，SW"/w76erD,5-^,奢合艨辨煮義稱游洽;^"手虔(77^ra;7eM"c/or5-/;(poxyge"Gwe,"勵"o^，尸/w77waco/ogy朋d77ierapew"c51，200<5,m7W-77S。在該過程中，白三烯生物合成抑制劑起著重要的作用，因為它可抑制5-LO的作用，從而抑制支氣管收縮性白三烯的最終合成。因此，可通過給予需要的患者糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合化合物，PDE抑制劑和/或5-LO抑制劑來操控上述途徑。近年來，大多數(shù)情況下這可通過給予患有變態(tài)反應(yīng)性疾病或變態(tài)反應(yīng)的患者(如哮喘或特應(yīng)癥患者)甾體化合物來實現(xiàn)。由于疾病治療過程中與甾體化合物有關(guān)的許多有害的副作用的存在，因而需要具有甾體化合物和含甾體制劑相關(guān)有益性能的非甾體化合物。在慢性炎癥疾病，如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和牛皮癬中，一些細(xì)胞因子募集活化的免疫和炎癥細(xì)胞到病損部位，從而擴(kuò)大和保持炎性狀態(tài)。這些活化細(xì)胞產(chǎn)生許多其他炎癥介質(zhì)。該惡性循環(huán)可通過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制療法得到抑制，但對于慢性炎癥疾病不是根治方法。轉(zhuǎn)錄因子在免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，一種普遍存在的尤其重要的轉(zhuǎn)錄因子是核因子-kb(NF-kB)。NF-kB是人免疫應(yīng)答的中心介質(zhì)，調(diào)節(jié)各種促炎和炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-8(IL-8)和TNF-a、以及編碼環(huán)氧合酶II、一氧化氮合酶、免疫受體、細(xì)胞粘附分子、或急性期蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄。在變態(tài)反應(yīng)性哮喘患者的臨床研究中，患者白介素-8(IL-8)血漿水平升高。O^W"I,^"厲f-/c5^"^^^^像f^"房^,^游/^^(772era/eo/肌c/ear/actor-/c5/"cyo&"eM^ramWo,《.，Go",K"a/.2000.;3SM4P激艨源貧乂支氣,丄皮潘應(yīng)/^全rTV尸a-、/￡-/a-^7誘導(dǎo)游WAT五S浙GM-CSF/^主(^3SM4尸A"a^"gw/a&s—/a-,—朋d尸^4i^WwcediL47V7E5"awdGM"-C戸dwc"owty五.浙份ow",Z.炎,疾瘋0游/MM4尸尺信號存導(dǎo)級廣及應(yīng)^3SM4尸《s/gwaZ/wgcascades/"y/ammator;;d/seas^.Afo/ecw/arAfed/c/we7bc/ay.5,'439-"7.i/o/afew，7V,S.，Cfl"e》MC.，Cam6nV/ge,丄.M,5ar"e^浙7Vewtow,W.爿5W^^應(yīng)護(hù)/C4M-7表^";^/^度7V尸-k5傻腐絲游(704^-/ex;mw/ow^5/oc/zew/價,277,7S5-7W。因此，哮喘和炎癥疾病的治療中抑制NF-kB，導(dǎo)致趨化因子如IL-8下調(diào)是有益的。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了適用于預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的羞科族(Zingiberaceae)植物的有機(jī)溶劑萃取物或精油。姜科族植物包括求洲美花姜虜W。towocMW、z//^m^Xflfemp/^/a)、賽考基姜/^"C7ewA:ovKS^a)浙/或莽考基投姜慮WewA:ow^e〃")。有機(jī)溶劑萃取物或精油可從選自下組的植物獲得安賽座求洲美花姜神Wp/o"oc/n7tAya^/n'op,c"51)，謝,潛豐^y/夷花姜辨^S7p/zo"ocMt^爐a/e"sW,安莽皮賽考基投姜^VC7e"^owsh'e〃flaef/n'op/cflO。優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑萃取物或精油包含式1的化合物作為活性成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(1)(4a-S,5R，8a-R或4a-R,5S,8a-S)式1化合物的化學(xué)名(IUPAC)是4，4&，5，9-四氫-3，5,83-三甲基萘并[2,3-15]呋喃-8-酮。式1化合物可采用其外消旋混合物形式或立體異構(gòu)體之一的形式。變態(tài)反應(yīng)性疾病的例子是哮喘和特應(yīng)癥。通常，有機(jī)溶劑萃取物或精油能夠結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)，誘導(dǎo)脂皮質(zhì)蛋白產(chǎn)生，和/或抑制磷脂酶A2，和/或減少前列腺素和/或白三烯的產(chǎn)生。有機(jī)溶劑萃取物或精油具有抗-支氣管收縮活性，還可下調(diào)細(xì)胞因子和趨化因子試劑如白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。有機(jī)溶劑萃取物或精油可抑制人免疫應(yīng)答的NF-kB中心介質(zhì)，下調(diào)各種促炎和炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子白介素-8(IL-8)的轉(zhuǎn)錄。有機(jī)溶劑萃取物或精油可通過以下方法獲得，該方法包括從姜科族植物的植物材料制備萃取物，和分離具有抗變態(tài)反應(yīng)性疾病活性的餾份，所述萃取物包含的活性成分具有抗變態(tài)反應(yīng)性疾病活性。所述方法可包括以下步驟對所述植物安^^皮求///美花姜/^的濕潤根莖或根或研磨的(ground)植物樣品進(jìn)行萃取，或通過空氣干燥或烘箱干燥來干燥植物的根莖和/或根，然后將所述根莖和/或根研磨成粉末。萃取物的制備過程包括用有機(jī)溶劑如二乙醚、二異丙基醚、叔丁基甲基醚、叔丁基乙基醚、乙酸乙酯或乙酸芐基酯進(jìn)行萃取?；钚猿煞挚赏ㄟ^萃取技術(shù)進(jìn)行萃取，所述萃取技術(shù)包括蒸汽蒸餾和/或用溶劑/溶劑分配和/或色譜分離技術(shù)來純化萃取物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了適合在預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的方法中使用的物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括上述萃取物作為活性成分，所述方法包括給予對象有效劑量的所述物質(zhì)或組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了適合在預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的方法中使用的物質(zhì)或組合物，該物質(zhì)或組合物包括式1的化合物作為活性成分，所述方法包括給予對象有效劑量的所述物質(zhì)或組合物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了適合在預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的方法中使用的式l的化合物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上述有機(jī)溶劑萃取物或精油在制備具有抗變態(tài)反應(yīng)性疾病活性的藥物中的應(yīng)用。變態(tài)反應(yīng)性疾病的例子是哮喘和特應(yīng)癥。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了適用于預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病的組合物，所述組合物包含有效量的所述萃取物、所述式l的化合物或所述精油中的一種。所述萃取物和萃取物的組合物可以是適用于哺乳動物對象，尤其是人的形式。萃取物可以是有機(jī)溶劑萃取物和/或精油或其組合的形式。本發(fā)明涉及上述有機(jī)溶劑萃取物、精油或式1的化合物在下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體，抑制磷脂酶A2，下調(diào)變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)如前列腺素和白三烯，下調(diào)細(xì)胞因子如IL-4和IL-5，抑制磷酸二酯酶4，抑制5-脂肪氧合酶或白三烯生物合成，和抑制導(dǎo)致IL-8下調(diào)的NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答特異性活性中的應(yīng)用。更具體說，本發(fā)明提供了至少一種選自姜科族植物的植物萃取物在制備適用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物中的應(yīng)用。所述至少一種植物選自求/^美花姜屌、經(jīng)姜鳳賽考基姜虜和賽考基投姜虜以及安賽座求洲美花姜氛謝,微層花姜#、安蕃皮Z/Z蕃姜氛艦潛Z//襲餅、意遂腐*姜神、安賽座賽考基姜柳安碰蕃考基控姜#。萃取物可包含選自具有式1結(jié)構(gòu)的化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物作為活性成分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(1)(4a-S，5R，8a-R或4a-R，5S，8a-S)變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。萃取物可以是蒸汽蒸餾至少一種植物的植物材料獲得的精油?？蛇x地，萃取物也可以是通過用有機(jī)溶劑萃取至少一種植物的植物材料獲得的有機(jī)溶劑萃取物。有機(jī)溶劑可以是醚，選自二乙醚、二異丙醚、叔丁基甲基醚、叔戊基甲基醚和叔丁基乙基醚?？蛇x地，有機(jī)溶劑也可以是酯，選自乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸芐基酯。植物材料可從植物根部或根莖獲取。本發(fā)明涉及適合在治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病中使用的組合物，該組合物包含至少一種選自姜科族植物的萃取物。所述至少一種植物如上所述。萃取物如上所述。變態(tài)反應(yīng)性疾病可選自哮喘和特應(yīng)癥，植物材料可從植物的根或根莖獲取。本發(fā)明涉及至少一種選自姜科族植物的萃取物在制備適用于實現(xiàn)以下一種或多種作用的藥物中的應(yīng)用，所述作用包括下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體，抑制磷脂酶A2，下調(diào)變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)，下調(diào)細(xì)胞因子，抑制磷酸二酯酶4，抑制5-脂肪氧合酶或白三烯生物合成，和抑制NF-KB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答特異性活性。所述變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)可選自前列腺素和白三烯。細(xì)胞因子可選自IL-4、IL-5和IL-8。所述至少一種植物如上所述。萃取物如上所述。變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。植物材料可從植物的根或根莖獲取。本發(fā)明還涉及選自式1化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物在制備適用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物中的應(yīng)用(1)(4a-S，5R,8a-R或4a-R，5S，8a-S)所述變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。本發(fā)明還涉及治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的方法，該方法包括給予需要治療的人或動物治療有效量如上所述的萃取物、組合物或選自式1的化合物。所述變態(tài)反應(yīng)性疾病如上所述?，F(xiàn)在將通過例子的方式，參考示意性圖表來描述本發(fā)明。圖1顯示了用于萃取式1化合物的方案的流程圖。圖2顯示了式1化合物對Con-A誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性介質(zhì)釋放的抑制曲線。圖3顯示了DMSO標(biāo)準(zhǔn)對照對Con-A誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性介質(zhì)釋放的抑制曲線。圖4顯示了式1化合物對NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的抑制或濃度反應(yīng)曲線，所述曲線經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。圖5顯示了環(huán)孢菌素A陽性對照對NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的抑制或濃度反應(yīng)曲線。圖6顯示了式1化合物和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)對照品聯(lián)用對IL-i介質(zhì)釋放的抑制曲圖7顯示了式1化合物和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)對照品聯(lián)用對IL-5介質(zhì)釋放的抑制曲線，其中式l化合物的抑制曲線經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。圖8顯示了包含式1化合物的二乙醚萃取物對NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的抑制或濃度反應(yīng)曲線，所述曲線經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化。圖9顯示了環(huán)孢菌素A陽性對照對NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的抑制或濃度反應(yīng)曲線。具體實施例方式本發(fā)明的植物萃取物或餾份可通過從安^^皮求溯/姜花姜辨濕潤的根莖、根或研磨的植物樣品萃取來制備，或者通過空氣干燥或烘箱干燥植物的根莖和/或根，然后將所述根莖和/或根研磨成粉末來制備。其活性成分可通過萃取技術(shù)來萃取，該技術(shù)包括蒸汽蒸餾和溶劑萃取?；衔锟赏ㄟ^利用溶劑/溶劑分配和/或色譜分離技術(shù)從萃取物或餾份中分離單獨的化合物來進(jìn)行進(jìn)一步的精制。這些技術(shù)在下面所示實施例中更詳細(xì)地描述。實施例1:植物材料的水浸液與分餾見圖1所示，制備諸如葉、根莖或根的植物材料的浸液14。將1升去離子沸水(如2所示)加入22.08g經(jīng)烘箱干燥(60。C)的研磨根莖中(如10所示)，偶爾攪拌靜置1小時。將水過濾并去除固體11，水相用500ml二乙醚萃取4次(如16所示)。將每次萃取所得萃取物進(jìn)行合并、干燥、過濾，并于25'C的溫度下在水浴中通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式去除溶劑(如18所示)，得到119mg含醚組分20(WG13A)，稱為有機(jī)餾份。液-液分配期間形成固體22形式(WG13D)的中間層。獲得約107mg固體22，保持分離。將水層凍干(如24所示)，得到2.52g固體材料26(WG13B)，稱為水相餾份。式l的化合物存在于有機(jī)餾份中，可用薄層色譜法進(jìn)行鑒別。然后用柱色譜法進(jìn)一步純化該化合物。實施例2:植物材料的有機(jī)溶劑萃取與實施例1的方法不同，同樣參考圖1，將1升二乙醚加入22.08g經(jīng)烘箱干燥的(6(TC)研磨根莖中，偶爾攪拌靜置1小時。將醚組分過濾并在低真空下小心蒸發(fā)，產(chǎn)生約1.5g干燥的萃取物34(WG-I-101或WG-I-58A)。利用薄層色譜法進(jìn)行鑒定，式l的化合物存在于有機(jī)溶劑萃取物中。實施例3:有機(jī)溶劑萃取物的分餾將上述水相萃取或有機(jī)溶劑萃取過程得到的二乙醚萃取物通過快速色譜法(硅膠)進(jìn)行進(jìn)一步的純化，如30所示，采用乙酸乙酉旨-己烷(l:9，v/v)作為洗脫液，得到式1的倍半萜類物質(zhì)WG13C或WG-I-94B，如32所示。精油通過蒸汽蒸餾安~#座漆^//美花姜#植物的根莖和/或根來獲取。精油主要成分的化學(xué)組成如下表1所示。主要成分的鑒別通過聯(lián)用氣相色譜-質(zhì)譜法和Kovats指數(shù)技術(shù)來實現(xiàn)。式1的倍半萜類物質(zhì)在蒸汽蒸餾過程期間所得精油與冷凝物的界面處形成結(jié)晶。隨后使精油冷卻至4"C以下，式l的化合物即從油中結(jié)晶出來。表1:精油化學(xué)組成(表1所列化合物的IUPAC命名參見表20)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例4:蒸汽蒸餾將約600g新鮮根莖和/或根用水洗滌并空氣干燥。從根莖分離新鮮的根。將根碾碎，并將根莖切成厚約2-3mm的切片。在蒸汽蒸餾裝置中將根和切片的根莖進(jìn)行蒸汽蒸餾3小時。在分液漏斗中收集l升冷凝物。用去離子水將冷凝器中形成的結(jié)晶沖下并通過垂熔玻璃漏斗過濾。該結(jié)晶包含式1的化合物。將分液漏斗冷凝物中精油和水的混合物在室溫下靜置16小時。通過引流冷凝物和用垂熔玻璃漏斗過濾得到表面上的包含式1化合物的結(jié)晶。獲得總共480mg式1的化合物。式1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定基于該化合物高場&和13C核磁共振(NMR)頻譜數(shù)據(jù)的詳細(xì)研究。化合物表征過程的第一階段是鑒別屬于孤立自旋系統(tǒng)的^NMR信號。這可采用COSY-45序列，通過二維(2D)('HH)相關(guān)光譜學(xué)方法來實現(xiàn)。從偶合的"CNMR頻譜以及采用DEPT序列脈沖獲得的質(zhì)子解偶的CH、CH2和CH3亞-頻譜推導(dǎo)出13CNMR頻譜中包含多個不同共振。這種"C共振部分歸因于2D^C/H)化學(xué)位移實驗中帶質(zhì)子碳原子與特定共振的相關(guān)性。由2-D遠(yuǎn)程"C-^HM七學(xué)位移實驗(HMBC)得出序列信息，以及四元碳原子的信號，如下表2、3和4所示表2:式1化合物在CD2C^中的&(500畫z)NMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*可互換表3:式1化合物在CD2C17中的13C(125,8MHz)NMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>參考表3:1.式l化合物的質(zhì)譜m/z230(M");215(M+-CH3);187(-CO);83(基峰)。2.旋光度0=+108.8°(c=1.0，CH2C12)3.熔點89-90°C表4:2D遠(yuǎn)程13C-"H1化學(xué)位移實驗(HMBO<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由(1H,1H)偶合常數(shù)等級以及下表5所示同核1H-{1H}n.O.e實驗的結(jié)果得到式1化合物的相關(guān)立體化學(xué)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(1)(4a-S,5R,8a國R或4a-R,5S,8a-S)表5:由同核1H-Umn.O.e實驗得到的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>生物試驗與抑制性研究本文提供的生物化學(xué)試驗結(jié)果以化合物抑制特異性結(jié)合或活化的百分率表示。試驗過程在Cidlowski，J.A.和Cidlowski，N.B.，薪皮^:激#對潛養(yǎng)游/^丄0S3欲應(yīng)^薪皮質(zhì)激素受體游源^7貪帶(Kegw/。"o"o/g/wcoco^coWrece;fo"tyg/wcocw"co/oils/"cw/Zwre(i/feZ^a5"3ce〃s」.Endocrinology109:1975-1982，1981中描述，將其內(nèi)容納入本文作為參考。該試驗特異性測量活性糖皮質(zhì)激素在糖皮質(zhì)激素受體下調(diào)過程中的能力。因而認(rèn)為應(yīng)答性試驗化合物具有類似于活性糖皮質(zhì)激素的活性。表6(下表)顯示了篩檢合并的有機(jī)醚餾份(圖1中稱為WG-I-13A)、水相餾份(圖1中稱為WG小13D)和不溶性餾份(圖1中稱為WG小13D)所得到的結(jié)果。合并餾份稱為WG小5AB+WG-I-5C，見圖1所示。由表6可見，濃度100ng/ml的合并餾份(WG-I-5AB+WG-I-5C)在HeLaS3(人上皮樣宮頸癌)細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合試驗中觀察到顯著活性(6iy。抑制)。該試驗測量[SH]地塞米松與人糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將HeLaS3細(xì)胞懸浮在改良的HEPES緩沖液中，pH7.2。表6:合并餾份WG-I-5AB+WG5C(不溶性餾份、二乙醚和水相萃取物的混合物)的生物試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*ca二西方菱背響尾蛇(crotalusatrox);;11=試管數(shù)25。C下，將細(xì)胞(lx106)與6nM卩H]地塞米松一起孵育120分鐘。在20地塞米松的存在下測定非特異結(jié)合。過濾膜并洗滌三次，對濾膜計數(shù)以確定[3司地塞米松特異性結(jié)合。篩檢10pM時各化合物的活性?；诒?的結(jié)果，合并餾份(WG-I-5AB+WG-I-5C)能有效結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)位點。此外，在人U937細(xì)胞中進(jìn)行的磷酸二酯酶PDE4酶試驗觀察到與該合并餾份有關(guān)的顯著活性。抑制作用提示合并餾份(WG-I-5AB+WG-I-5C)具有支氣管擴(kuò)張作用。對于PDE4試驗，采用從人U-937前單核細(xì)胞(pronocyticcell)部分純化的PDE4。將試驗化合物和/或運載體與0.2pg酶和含0.01[3H]cAMP的1pMcAMP在Tris緩沖液pH7.5中3(TC下孵育20分鐘。煮沸2分鐘終止反應(yīng)，加入10mg/ml蛇毒核苷酸酶并在3(TC進(jìn)一步孵育IO分鐘，所得AMP轉(zhuǎn)化為腺苷。未水解的cAMP結(jié)合于AGI-X2樹脂，閃爍計數(shù)法定量水相中存留的[3印腺苷。100^M下篩檢化合物。使用IBMX(3-異丁基-l-甲基黃嘌呤)作為標(biāo)準(zhǔn)參比試劑。確定了所有合并餾份具有活性特異性之后，采用上述糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合試驗和磷酸二酯酶PDE4酶試驗，分別對有機(jī)醚餾份(WG-I-13A)、水相餾份(WG-I-13B)以及有機(jī)層和萃取層界面處的不溶性餾份(在圖1中稱為WG-I-13D)進(jìn)行生物分析。這些試驗所得結(jié)果在下表7、8和9中顯示。萃取物濃度100pg/ml時，采用糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合試驗(77e/。抑制)，以及磷酸二酯酶PDE4酶抑制實驗(57%抑制)觀察到有機(jī)醚萃取物(WG小13A)的抑制活性增加。水相餾份(WG-I-13B)或不溶性界面餾份(WG13D)沒有觀察到顯著活性。表7:WG13B(水相萃取物)的抑制性生物試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表8:WG小13A(二乙醚萃取物〗的抑制性生物試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>11=試管數(shù)表9:WG小13D(不溶性餾份)的抑制性生物試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>nH式管數(shù)有機(jī)餾份20(WG-I-13A)采用LC-MS(聯(lián)用液相色譜-質(zhì)譜)得到的化學(xué)指紋圖譜并沒有提示存在甾體類化合物。有機(jī)餾份的分餾導(dǎo)致分離得到具有化學(xué)表征和鑒別為式1的倍半萜類化合物的主要化合物(圖1中稱為WG-I-13C)。篩檢該倍半萜類化合物的活性，同樣采用上述的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合試驗和磷酸二酯酶PDE4酶試驗。這些試驗的結(jié)果如下表10所示。表10:WG-I-13C(化合物l)的抑制性生物試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>n:試管數(shù)純化合物濃度100pg/ml下，磷酸二酯酶PDE4酶試驗觀察到較低的非顯著性活性(35%抑制)，而糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合試驗觀察到104%活性。這提示倍半萜類化合物本身在支氣管擴(kuò)張中并不是起最重要的作用，在本發(fā)明的植物萃取物中，存在的其他化合物具有支氣管擴(kuò)張作用。糖皮質(zhì)激素結(jié)合試驗中倍半萜類化合物的IC5。值測定為50.3]iM，如下表11所示。表11:測定倍半萜類化合物n)的ICw值<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>nH式管數(shù)白介素-5(IL-5)是變態(tài)反應(yīng)性疾病中釋放的一種主要介質(zhì)，在細(xì)胞試驗中測定式1的倍半萜類化合物對白介素-5(IL-5)釋放的抑制作用，抑制曲線分別見圖6和圖7所示。這些生物試驗所得結(jié)果如下表13所示。對于人IL-5介質(zhì)釋放試驗，在培養(yǎng)箱中將試驗化合物與伴刀豆球蛋白A(ConA)(10ng/ml)-刺激的人外周血單核白細(xì)胞(PBMNL)在生長培養(yǎng)液RPMI-1640(pH7.4)中37'C孵育過夜。使用夾心法ELISA試劑盒定量測定條件培養(yǎng)液中IL-5細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平。10、1、0.1、0.01和0.001pM下篩檢化合物。將這些相同的濃度并行應(yīng)用于獨立的處理組細(xì)胞，并評價只觀察到顯著的釋放抑制作用時可能的化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。用地塞米松作為標(biāo)準(zhǔn)參比試劑。此外，用式1的化合物進(jìn)行Con-A細(xì)胞毒性試驗，其抑制曲線見圖2所示。對于ConA-誘導(dǎo)的介質(zhì)釋放/細(xì)胞毒性試驗，在伴刀豆球蛋白A(ConA，20pg/ml)的存在下，將試驗化合物和/或運載體與人外周血單核白細(xì)胞的懸浮液(PBMNL，1x105/孔)在RPMI緩沖液(pH7.4)中37。C下5%C02中孵育過夜。加入Alamar藍(lán)反應(yīng)試劑，37"C下孵育細(xì)胞16小時?；罴?xì)胞能攝取Alamar藍(lán)并發(fā)射熒光。采用SpectraFluorPlus平板讀數(shù)儀測定熒光強(qiáng)度，530nm處激發(fā)，590nm處發(fā)射。與運載體處理的對照組相比，熒光強(qiáng)度降低50%或更多(50%)提示存在顯著的細(xì)胞毒性。10、1、0.1、O.Ol和0.001pM下篩檢化合物。用地塞米松作為標(biāo)準(zhǔn)參比試劑。上述試驗的對照分析(使用DMSO)的結(jié)果見圖3所示。表13:倍半萜類化合物n)對介質(zhì)釋放的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>ANT=拮抗劑白介素-5(IL-5)介質(zhì)釋放的抑制試驗中，化合物的IQo為16.1pM。各實驗中使用100nM濃度的活性化合物，白介素-5(IL-5)介質(zhì)釋放抑制試驗觀察到93%的抑制。進(jìn)行上述生物試驗時觀察到活性化合物的細(xì)胞毒性有限，如表14所示，見IQo與EC^值。雖然介質(zhì)釋放試驗期間觀察到具有部分細(xì)胞毒作用，但純的式1化合物的效力是因為其能有效結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)位點。表14:倍半萜類(l)的細(xì)胞毒性概況<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>ANT-拮抗劑；r^試管數(shù)如實施例2所述通過蒸汽蒸餾干燥的根莖獲得精油，采用5-脂肪氧合酶(5-LO)試驗和磷酸二酯酶PDE4試驗進(jìn)行篩檢，以確定其抑制作用。5-LO試驗觀察到99%抑制，而磷酸二酯酶PDE4試驗則觀察到73%抑制，提示精油具有支氣管擴(kuò)張作用，可用于抑制5-脂肪氧合酶的作用。所得結(jié)果也可參見上述表12。實施例5以類似于實施例1的方式制備二乙醚萃取物。將植物安^^豐浙/夷^"姜辨的根莖進(jìn)行洗滌，切片，4(TC烘箱干燥，然后研磨成粉。將1升去離子沸水加入25.0g烘箱干燥的研磨根莖中，偶爾攪拌靜置l小時。將水過濾并用二乙醚(4x500ml)萃取。從水層分離醚層，合并，干燥(MgS04)，過濾，于25。C的溫度下在水浴中通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式除去溶劑。得到215mg有機(jī)萃取物。對該二乙醚萃取物進(jìn)行測試。采用LC-MS(聯(lián)用液相色譜-質(zhì)譜)，對從水相萃取物(參見上述實驗過程)制備的二乙醚餾份作化學(xué)指紋測定表明存在主要化合物，即式l的倍半萜類。用乙酸乙酯-己烷(l:9，v/v)作為洗脫液，快速色譜法(硅膠)純化二乙醚萃取物，得到式1的倍半萜類化合物。實施例6:NF-kB轉(zhuǎn)錄生物學(xué)試驗進(jìn)行試驗并使用參比標(biāo)準(zhǔn)品作為各個試驗的內(nèi)標(biāo)，以確保所得結(jié)果的有效性。試驗過禾呈在LenardoMJ，BaltimaoreD.JLe朋nioM7，5a/"則ore^/VF-k5.'^誘導(dǎo)游多^^h^f〃邀恭待弄絲基^^虔^4;/e/o^c^'co//"c/wc/We"■wwespec折cco"^o/」.Ce〃.5&'227-2"，W卵W游i^"述，游其力吝謝乂本jt歸參考。在NF-kB轉(zhuǎn)錄試驗中評價從研磨植物直接制備的二乙醚萃取物(圖l)(WG-I-94B)的抗炎特性(方案如下所述)。觀察到顯著的抑制活性，試驗中濃度一直到100pg/mL，IQo的估計值為14.3ng/mL(參見下表15)而沒有細(xì)胞毒性。試驗中用環(huán)孢菌素A作為參比化合物(IC5o為0.0608^M)(參見下表15)。抑制作用和細(xì)胞毒性結(jié)果如表16所示，濃度反應(yīng)曲線見圖8和9所示?；谶@些結(jié)果，認(rèn)為二乙醚萃取物能有效抑制NF-kB。表15:醚萃取物(WG-I-58A)対NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答細(xì)胞試驗中觀察到顯著的抑制活性而沒有細(xì)胞毒性作用，而能抑制引起哮喘炎癥途徑的各種促炎和炎癥介質(zhì)的釋放。表16:二乙醚萃取物(WG小58A)對NF-kb轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞毒性和抑制作用，劑量反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>ANT^措抗劑；11=試管數(shù)實施例7:化合物1對NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用1.實驗方法將安^^##/夷^"姜辨植物的新鮮根莖和根(300g)用水洗滌并空氣干燥。從根莖分離新鮮的根。將根碾碎并將根莖切成厚約2-3mm的切片。將根和根莖在蒸汽蒸餾裝置中進(jìn)行蒸汽蒸餾3小時。用去離子水沖洗冷凝器中形成的結(jié)晶并通過垂熔玻璃漏斗過濾。該結(jié)晶的結(jié)構(gòu)見圖l所示(樣品編號WG-I-94B)。使分液漏斗冷凝物中精油和水的混合物在室溫下靜置18小時。通過引流冷凝物取下表面上得到的包含式1化合物的結(jié)晶并用垂熔玻璃漏斗過濾?？偣搏@得240mg結(jié)晶。對結(jié)晶進(jìn)行測定。式lWG-I國94B2.生物學(xué)試驗在臺灣MDS藥物公司(MDSPharma)進(jìn)行試驗，每次試驗采用參比標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)以確保所得結(jié)果的有效性。在NF-kB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答試驗以及相應(yīng)的NF-kB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的細(xì)胞毒性試驗中評價式1化合物的抗炎特性(參見附件I的方案)。NF-kB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答試驗中，100pM時化合物導(dǎo)致>100%抑制，同一濃度下沒有明顯的細(xì)胞毒性。表明該化合物對NF-kB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的抑制作用不是由于普遍的細(xì)胞毒性。該試驗計算的IQo為15.6|xg/mL，用環(huán)孢菌素A作為參比化合物(IC5o為0.0608^M)。結(jié)果和濃度反應(yīng)曲線如附件II所示。基于這些結(jié)果，認(rèn)為式1的化合物能有效抑制NF-KB。3,有益特性在體外試驗中評價從安^^豐,/夷^"妾神分離的倍半萜類化合物在慢性炎癥疾病如哮喘中所起的中心作用。在NF-kB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)答試驗中觀察到顯著的抑制活性而沒有細(xì)胞毒性作用。因此，可使用化合物(從新鮮制備的根和根莖蒸汽蒸餾分離的)來抑制NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的特異性活性，從而抑制引起哮喘炎癥途徑的各種促炎和炎癥介質(zhì)的釋放。NF-kB是炎癥主要調(diào)節(jié)因子，因而在藥物開發(fā)中是吸引人的靶標(biāo)。實施例8:轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，NF-kB(人)29試驗數(shù)量:361000介紹在靜息細(xì)胞中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的胞質(zhì)部位與抑制亞單元IkB結(jié)合；IkB的這種結(jié)合可有效掩蔽NF-icB的P50和P65亞基上存在的核位置序列，防止核易位。顯然，一旦剌激細(xì)胞，可激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致IicB多肽中的關(guān)鍵絲氨酸殘基磷酸化，于是NF-kB-IkB夏合物解寓，IkB快速降解，未掩蔽的核位置信號允許NF-icB易位到核內(nèi)而激活特定基因的轉(zhuǎn)錄。已知NF-kB能調(diào)節(jié)活化白細(xì)胞產(chǎn)生的許多促炎和凝血酶原因子。NF-kB是炎癥主要調(diào)節(jié)因子，因而在藥物開發(fā)中是吸引人的靶標(biāo)。旌采用以反應(yīng)元件-lacZ報告基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞，其中卩-半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄由NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點所介導(dǎo)。在0.5pMA23187和50ng/mlPMA(12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽)的存在下，將試驗化合物和/或運載體與細(xì)胞(1.5x1()6/ml)在RPMI-1640pH7.4中37°C下孵育4小時。通過FDG(熒光素二-P-D-吡喃半乳糖苷)向熒光素的轉(zhuǎn)化來測定試驗化合物-誘導(dǎo)的(3-半乳糖苷酶活性。在SpectroFluorPlus平板讀數(shù)儀上讀取熒光強(qiáng)度。與10pM環(huán)孢菌素A相比，熒光強(qiáng)度降低50%或更多(》50%)表明顯著的抑制活性。在10、1、0.1、0.01和0.001下篩檢化合物。以相同的濃度并行應(yīng)用于不同的處理組細(xì)胞，只有當(dāng)觀察到顯著的刺激或抑制作用時評價化合物可能誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(目錄#361100)。參比數(shù)據(jù):抑制劑ICso(nM)*環(huán)孢菌素A50*表示所用的標(biāo)準(zhǔn)參比試劑<表17:試驗結(jié)果-化合物1(WG-I-94B)的細(xì)胞毒性和效力(轉(zhuǎn)錄應(yīng)答)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*批次表示在相同試驗中并行測試的化合物J部分可溶的體外測試溶劑命表示該項符合顯著性標(biāo)準(zhǔn)Ag二激動劑；ant,拮抗劑；Resp.^應(yīng)答；ND-未進(jìn)行試驗測定；R-附注實施例9:醚萃取物在哮喘大鼠體內(nèi)模型中的作用背景存在的許多細(xì)胞因子已知是炎癥介質(zhì)，參與哮喘疾病過程。當(dāng)吸入致病因子如變應(yīng)原時，支氣管上皮細(xì)胞被激活而產(chǎn)生某些促炎細(xì)胞因子(白介素，縮寫為IL)，尤其是趨化因子IL-8。從過去體外試驗的結(jié)果，選擇合適的動物模型來確定安^^豐辨/夷^"姜^e物的二乙醚萃取物(WG-I-101)的抗哮喘和抗過敏活性。實驗方法將植物安^^求W/夷^"姜神的根莖進(jìn)行洗滌，切片，4(TC烘箱干燥，然后研磨成粉。將5升二乙醚加入110.40g烘箱干燥的研磨根莖中，偶爾攪拌靜置1小時。將二乙醚過濾并用二乙醚(4x2L)萃取。合并醚層，干燥(MgS04)，過濾，并于3125"C的溫度下在水浴中通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式除去溶劑。得到1.075g有機(jī)溶劑萃取物。對該二乙醚萃取物進(jìn)行測試(樣品編號WG-I-lOl)。生物學(xué)試驗在臺灣MDS藥物公司進(jìn)行試驗，每次試驗采用參比標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)以確保所得結(jié)果的有效性。.采用的生物學(xué)試驗是肺部、抗原/脂肪氧合酶代謝產(chǎn)物試驗，并用體內(nèi)試驗評價安賽皮非洲美花姜種植物二乙醚萃取物的可能活性。(1)試驗物質(zhì)和給藥模式將WG-I-101懸浮在0.5%CMC/0.1%吐溫80中。每天兩次，連續(xù)3天口服給予劑量500mg/kg的試驗物質(zhì)，試驗當(dāng)天用卵白蛋白攻擊前1小時加入額外的最終劑量。給藥體積為10ml/kg。該制劑總結(jié)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>(a)此試驗基于視覺觀察S:可溶；I:不溶ppt:沉淀(b)Y:將式I化合物置于棕色試管或小瓶中，或覆蓋鋁箔(c)TR:室溫；15°C~30'C下制備和儲存規(guī)定整個試驗期間的溫度，低于或高于室溫。(2)動物使用由臺灣國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(NationalTaiwanUniversityCollegeofMedicine)提供的雄性DH(Dunkin-Hartley)衍生豚鼠。動物的空間分配如下3只豚鼠45x23x21cm。每個籠子經(jīng)高壓滅菌。使用之前，實驗室將所有動物保持在受控的溫度(22°-24°(:)和濕度(60%-80%)環(huán)境中，12小時/白天黑夜循環(huán)持續(xù)至少一周。自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)實驗飼料(PMI營養(yǎng)國際有限公司(PMINutritionInternational，Inc.),美國)和RO水。一般地根據(jù)實驗動物護(hù)理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(國家學(xué)術(shù)出版社(NationalAcademyPress)，華盛頓，D.C.，1996))進(jìn)行包括飼養(yǎng)、實驗、處理動物等的所有工作。(3)旌使用5只重400±50g(最后那天)的DH衍生雄性豚鼠。用戊巴比妥納(50mg/kgIP，需要時再給予15mg/kgIP)麻醉動物。將通過水浴水流保持在37'C的鋁板置于試驗動物身體下面以維持體溫。氣管插管，采用嚙齒動物通氣機(jī)(哈佛，美國)進(jìn)行人工通氣(IOml/kg，50呼吸/分鐘)。經(jīng)插管側(cè)臂，使用氣動脈沖換能器(美國納可生物系統(tǒng)公司(NarcoBiosystem，USA))測量氣管內(nèi)壓力(ITP)。頸動脈插管(PE50,美國克雷亞當(dāng)斯公司(ClayAdams,USA))，用StathemP23xL換能器(美國VS公司(Viggo-Spectramed，USA))測量血壓，由導(dǎo)線IIECG獲得心率。在第1天和第8天IP注射卵白蛋白(0.5ml/動物)和Al(OH)3(1mg/0.5ml/動物)來致敏豚鼠。然后，在第19和23天之間用15pg/kgof卵白蛋白(IV)攻擊動物，將支氣管肺阻塞記錄為ITP的升高程度。每天2次，連續(xù)3天，口服給予500mg/kg試驗物質(zhì)，試驗當(dāng)天給予額外的最終劑量，然后在最終劑量后一小時，用"混合"的吲哚美辛(10mg/kg)、美吡拉敏(2mg/kg)和普萘洛爾(100pg/kg)靜脈內(nèi)注射動物(1ml/kg)，5分鐘后再用卵白蛋白攻擊。在運載體處理的動物中，抗原攻擊導(dǎo)致的支氣管阻塞反應(yīng)(ITP升高)，是完全氣管阻塞測得最大可能支氣管阻塞的45-85%。與運載體處理的對照動物相比，認(rèn)為對卵白蛋白誘導(dǎo)的支氣管阻塞的抑制率達(dá)到50%或更高(250%)具有顯著性差異。用5ml磷酸緩沖鹽水灌注2次之后，回收支氣管肺泡灌洗液。卵白蛋白攻擊后用ELISA測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)上清液中的TNF-a、IL-1(3和IL-8。單向ANOVA分析后Dunnett's檢驗，對運載體對照組和試驗化合物處理組進(jìn)行比較。認(rèn)為P<0.05具有顯著性。(4)體內(nèi)試驗結(jié)果該試驗結(jié)果總結(jié)在表18中，顯示與運載體處理的對照組相比，二乙醚萃取物(WG-I-101)對卵白蛋白誘導(dǎo)的急性氣道阻塞具有適度抑制作用(19n/。)(表18)。(認(rèn)為"0%抑制具有顯著性)表18:豚鼠體內(nèi)試驗結(jié)果試驗弁570000肺，抗原/脂肪氧合酶代謝產(chǎn)物，豚鼠氣管內(nèi)壓力(ITP)5處理途徑刑量AITP1(tnN(-)卵白蛋白(+)卵白蛋白l運載體10ml/kg025.2PO1(0.5%CMCbidx3和qdxl209.6/0.1%吐溫80)09.04010.2025.2X土SEM015.8±3,8PT#1083892500mg/kg06.6PO1(CIR-235)(WG-l-bidx3和qdxl2012.0101)(粗制二乙醚植物萃取物)3016.84015.6013.2X±SEM012.8±1.8菲尼酮(Phenidone)30mg/kg04.8IV1qdxl201.801.2400.600.6X±SEM01.8±0.8用美吡拉敏2mg/kg，吲哚美辛10mg/kg和普萘洛爾0.1mg/kg預(yù)處理先前已致敏的麻醉和人工通氣豚鼠5分鐘；口服給藥3天后記錄動脈血壓(BP，mmHg)，心率(HR，搏/分鐘)和氣管壓力(TP，cmH20)。長期給藥結(jié)束時，記錄高于最初基線6cmH20的抗原(卵白蛋白15pg/kglV)-誘導(dǎo)的氣管內(nèi)壓力(ITP)的升高，作為支氣管阻塞的指標(biāo)。根據(jù)公式[氣管內(nèi)壓力升高(運載體處理組)]-[氣管內(nèi)壓力升高(試驗物質(zhì)處理組)/[氣管內(nèi)壓力升高(運載體處理組]x100。/。，計算抑制百分率(％)。1.AITP:超過對應(yīng)的基線值的ITP變化；(-)卵白蛋白在卵白蛋白攻擊前對單獨的運載體或試驗物質(zhì)的反應(yīng)；(+)卵白蛋白卵白蛋白攻擊后反應(yīng)的變化。2.%對照對試驗物質(zhì)的ITP反應(yīng)，以運載體處理對照對卵白蛋白(15嗎/kgIV)的ITP反應(yīng)的百分比表示(100%)。3.與運載體處理的對照相比，認(rèn)為對卵白蛋白誘導(dǎo)的支氣管阻塞的抑制作用為50%或更高(250%)是顯著的。制備WG-I-101-處理組的支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣品，測定卵白蛋白攻擊后的TNF-a、IL-lp和IL-8。單向ANOVA后作Dunnett，s檢驗，對運載體對照與試驗化合物處理組進(jìn)行比較。PO.05認(rèn)為具有顯著性差異。WG-I-101導(dǎo)致豚鼠卵白蛋白攻擊后IL-8產(chǎn)生相對于對照的顯著抑制(P0.05)，但對TNF-a和IL-1卩分泌沒有顯著性作用。結(jié)果如表19所示。表19:細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果處理運載體途徑PO劑量10ml/kgN1TNF-a(pg/ml)1.44IL-l(J(pg/ml)2.07IL-8濃投(Pg/ml)0.25BAL回收體積(ml)4.5(0.5%CMC/bidx3qdxl212.942.0626.877.20.1%吐溫80)310.970.4228.535.0411.934.3929.896.253.072.423.854,5X8.072.2717.88SEM2.410.636.510.5PT#1083892PO500mg/kg17.432.080.006.4(CIR-235)(WG-1-101)bidx3218.420.710.007.2qdxl312.434.220.007.3413.441.850.007.359.680.230.00菲尼酮IV30mg/kgXSEM112.281.8612.031.820.693.100.00*0.003.637.10.27.8qdxl27.00.241.227,53.790.460.007.548.962.250.008.256.330.000.007.8XSEM7.621.381.210.620.97*0.717.80.1制備WG-1-101處理組的支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣品，測定卵白蛋白攻擊后的TNF-a、IL-1(3和IL-8。分別用TNF-a、IL-ip和IL-8的ELISA試劑盒來測定每個樣品的TNF-a、IL-ip和IL-8水平。單向ANOVA后作Dunnett's檢驗，對運載體對照和試驗化合物處理組之間進(jìn)行比較。P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。實施例IO:肺，抗原/脂肪氧合酶代謝產(chǎn)物試驗數(shù):570000方法用戊巴比妥鈉(50mg/kgi.p,，需要時再加15mg/kgi.p.)麻醉每組5只重250±50g的雄性DH豚鼠，然后給予氯化琥珀酰膽堿(2mg/動物i.p.)以防止自發(fā)呼吸。體溫維持在37-38'C。在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行氣管插管并用哈佛嚙齒動物呼吸機(jī)給豚鼠通氣。通過連接于P23IDStatham換能器的插管側(cè)臂記錄氣管內(nèi)壓力。呼吸速率設(shè)定為50次/分鐘，每次體積(約1ml/100g)足以產(chǎn)生6cmH20的基線氣管壓力。從頸動脈插管監(jiān)測平均動脈壓，從導(dǎo)線II設(shè)置的胸電極獲取心率。頸靜脈插管，靜脈內(nèi)給予體積lml/kg的運載體或藥物。通過抗原攻擊預(yù)先致敏的動物激活脂肪氧合酶并產(chǎn)生白三烯。第1天注射卵白蛋白和A1(0H)3(0.5嗎和1mg，體積分別為0.5ml/動物i.p.)致敏豚鼠，第8天用同樣劑量的卵白蛋白和Al(OH)3加強(qiáng)，第19和23天之間用卵白蛋白(50pg/kgi.v.)攻擊以實現(xiàn)誘導(dǎo)的最大氣道阻塞，表現(xiàn)為氣管壓力升高(cmH20)。并且，氣管壓力升高可能與呼吸系統(tǒng)僵硬增加有關(guān)?？陲旵SIR化合物預(yù)處理動物兩天。試驗當(dāng)天，麻醉30分鐘前給予動物CSIR化合物，手術(shù)持續(xù)15分鐘。給予CSIR后60分鐘給予卵白蛋白攻擊。給予試驗物質(zhì)前5分鐘，靜脈內(nèi)給予吲哚美辛(IOmg/kg)、美吡拉敏(2mg/kg)和普萘洛爾(0.1mg/kg)預(yù)處理動物這是一種"混合"制劑，能夠抑制環(huán)氧合酶產(chǎn)物(血栓素等)的產(chǎn)生及拮抗組胺和P-腎上腺素能受體。在運載體處理的對照動物中，抗原攻擊導(dǎo)致的氣道收縮反應(yīng)是氣管阻塞時可能的最大氣道收縮的45-85%。在5只豚鼠中，卵白蛋白攻擊前5分鐘靜脈內(nèi)給予陽性標(biāo)準(zhǔn)品菲尼酮(30mg/kg)。認(rèn)為與運載體處理的對照動物相比，誘導(dǎo)的氣道阻塞抑制率為50%或更高p50)是顯著的。參考數(shù)據(jù):化合物MEDmg/kgi.v。阿托品>10色甘酸鈉>100LY-17188330NDGA10菲尼酮*30索必它0.1茶堿50*采用的標(biāo)準(zhǔn)參比試劑LY-171883=1[2-羥基-3-丙基-4-[4-(lH-四唑-5-基)丁氧基]苯基]乙酮；NDGA=去甲二氫愈創(chuàng)木脂酸注意試驗物質(zhì)在該模型系統(tǒng)中具有活性表明可能能夠抑制體內(nèi)脂肪氧合酶的活性和/或拮抗受體激活產(chǎn)生的白三烯。因此，希望將該模型系統(tǒng)的結(jié)果與獲自以下結(jié)果進(jìn)行比較比較環(huán)氧合酶抑制以確定酶抑制的特異性；比較白三烯D4拮抗作用以確定相對于脂肪氧合酶抑制，試驗物質(zhì)對酶終末產(chǎn)物受體激活的作用；以及比較抗膽堿能活性和/或抗組胺H,和H3活性以確定對受體拮抗作用和/或支氣管擴(kuò)張作用的選擇性。表20:上文表1所示化合物的IUPAC命名<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>本發(fā)明的萃取物是從天然形式分離的非甾體組分，具有與常用于預(yù)防性治療變態(tài)反應(yīng)性疾病如哮喘和特應(yīng)癥的甾體組分相同的作用模式。此外，本發(fā)明式1的倍半萜類化合物具有白三烯調(diào)節(jié)劑活性，能抑制炎癥介質(zhì)和白三烯的作用。以精油形式應(yīng)用時，萃取物具有組合效果，通過支氣管擴(kuò)張，抑制白三烯生物合成以及下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體而減輕哮喘和變態(tài)反應(yīng)炎癥。此外，包含本發(fā)明式1倍半萜類化合物的二乙醚萃取物在NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答細(xì)胞試驗中具有顯著的抑制活性而沒有細(xì)胞毒作用。因此，二乙醚萃取物可用于抑制NF-kB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的特異性活性，從而抑制引起哮喘炎癥途徑的各種促炎和炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子白介素-8(IL-8)的釋放。此外，包含本發(fā)明式1倍半萜類化合物的二乙醚萃取物對引起哮喘炎癥途徑的IL-8炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用。本發(fā)明對總體預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病如哮喘有效，增加了控制這些疾病的有用手段。對于本說明書的目的減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病和哮喘具體限定為對象處在無需進(jìn)行常規(guī)治療的無癥狀階段。此緩解階段比采用常規(guī)治療控制諸如哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病所獲得的時間要長。申請人還認(rèn)為，有機(jī)溶劑萃取物、干燥根莖、精油或單一式1的化合物形式的本發(fā)明，可單獨使用或聯(lián)用，或作為組合物使用，提供了使用甾體抗炎藥如糖皮質(zhì)激素來長期預(yù)防性治療和減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病，尤其是哮喘和特應(yīng)癥的替代方式。申請人已知的作用于糖皮質(zhì)激素受體水平的市售試劑通常是甾體類型，長期使用存在許多有害的副作用。本發(fā)明的化合物、衍生物、組合物和產(chǎn)物是非甾體類型，意外地發(fā)現(xiàn)也能有效作用于糖皮質(zhì)激素受體(GR)水平。權(quán)利要求1.至少一種選自姜科族植物的植物萃取物在制備適用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求i所述的應(yīng)用，其特征在于，所述至少一種植物選自^M花姜鳳///蕃姜羼、賽考基姜虜或莽考基控姜鳳3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述至少一種植物選自^^求,/美花姜#、^,/,求洲美花姜神、安蕃皮z/z荼姜氛^,塔z/z襲姜神、邀廳襲姜#、安賽皮賽考慕差淑安蕃皮蕃孝微姜#。4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物包含選自式1化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物作為活性成分，所述式l化合物的結(jié)構(gòu)如下(1)(4a國S，5R,8a-R或4a-R,5S,8a-S)。5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物是通過蒸汽蒸餾所述至少一種植物的植物材料而獲得的精油。7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物是用有機(jī)溶劑萃取所述至少一種植物的植物材料而獲得的有機(jī)溶劑萃取物。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的醚二乙醚、二異丙醚、叔丁基甲基醚、叔戊基甲基醚或叔丁基乙基醚。9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的酯乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸芐基酯。10.如權(quán)利要求6-9中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物材料從所述植物的根或根莖獲得。11.一種適合在治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病中使用的組合物，所述組合物包含至少一種選自KiM植物的植物萃取物。12.如權(quán)利要求ll所述的組合物，其特征在于，所述至少一種植物選自t洲夷花姜厲、z/z襲姜虜、莽考基姜虜或莽考基投姜鳳13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述至少一種植物選自皇莽皮扁美花姜神、浙,搭求洲美花姜摔、安蕃皮^華姜#、應(yīng)潛z/z紊姜氛體,敲姜神、安賽皮賽考基姜淑安賽座蕃考基控姜神。14.如權(quán)利要求11-13中任一項所述的組合物，其特征在于，所述萃取物包含選自式1化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物作為活性成分，所述式l化合物的結(jié)構(gòu)如下(1)(4a-S，5R,8a-R或4a-R，5S，8a-S)。15.如權(quán)利要求11-14中任一項所述的組合物，其特征在于性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。16.如權(quán)利要求11-15中任一項所述的組合物，其特征在于通過蒸汽蒸餾所述至少一種植物的植物材料而獲得的精油。17.如權(quán)利要求11-15中任一項所述的組合物，其特征在于，所述變態(tài)反應(yīng)，所述萃取物是，所述萃取物是用有機(jī)溶劑萃取所述至少一種植物的植物材料而獲得的有機(jī)溶劑萃取物。18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的醚二乙醚、二異丙醚、叔丁基甲基醚、叔戊基甲基醚或叔丁基乙基醚。19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的酯乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸芐基酯。20.如權(quán)利要求11-19中任一項所述的組合物，其特征在于，所述植物材料從所述植物的根或根莖獲得。21.至少一種選自MMM植物的植物萃取物在制備適用于實現(xiàn)以下一種或多種作用的藥物中的應(yīng)用，所述作用包括下調(diào)糖皮質(zhì)激素受體、抑制磷脂酶A2、下調(diào)變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)、下調(diào)細(xì)胞因子、抑制磷酸二酯酶4、抑制5-脂肪氧合酶或白三烯生物合成、或抑制NF-KB轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的特異性活性。22.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，所述變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)選自前列腺素和白三烯。23.如權(quán)利要求21或22所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子選自IL-4、IL-5或IL-8。24.如權(quán)利要求21-23中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述至少一種植物選自^洲美花姜屌、Z/Z^姜虜、賽考基姜虜或賽考基控姜虜。25.如權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其特征在于，所述至少一種植物選自安賽座輔/美花姜氛艦潛謂美花婦、安賽皮///*姜辨、謝麼塔Z/Z襲姜神、蘆絲,///襲姜#、安賽皮賽考基姜淑安賽皮賽考翻姜秋26.如權(quán)利要求21-25中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物包含選自式l化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物作為活性成分，所述式l化合物的結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)(4a-S，5R，8a-R或4a-R,5S,8a-S)。27.如權(quán)利要求21-26中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。28.如權(quán)利要求21-27中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物是通過蒸汽蒸餾所述至少一種植物的植物材料而獲得的精油。29.如權(quán)利要求21-27中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述萃取物是用有機(jī)溶劑萃取所述至少一種植物的植物材料而獲得的有機(jī)溶劑萃取物。30.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的醚二乙醚、二異丙醚、叔丁基甲基醚、叔戊基甲基醚或叔丁基乙基醚。31.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑是選自以下的酯乙酸甲酯、乙酸乙酯和乙酸芐基酯。32.如權(quán)利要求21-31中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物材料從所述植物的根或根莖獲得。33.選自式1化合物、其立體異構(gòu)體的化合物及其立體異構(gòu)體的混合物在制備適用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述式1化合物的結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>34.如權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，其特征在于，所述變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。全文摘要本發(fā)明提供了至少一種選自姜科族植物的植物萃取物在制備適用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的藥物中的應(yīng)用。所述植物任選地選自非洲美花姜屬、山柰姜屬、賽考基姜屬或賽考基拉姜屬，以及安賽皮非洲美花姜種、納麗塔非洲美花姜種、安賽皮山柰姜種、納麗塔山柰姜種、意絲麗山柰姜種、安賽皮賽考基姜種或安賽皮賽考基拉姜種。所述變態(tài)反應(yīng)性疾病選自哮喘和特應(yīng)癥。文檔編號A61P27/14GK101432009SQ200780015295公開日2009年5月13日申請日期2007年2月28日優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日發(fā)明者E·瓦迪瓦拉,G·福切爾,L·G·J·阿克曼,M·M·范德莫維,R·M·霍拉克,V·J·馬哈拉杰申請人:Csir公司