專利名稱：：牢固結(jié)合的堿基-修飾的寡核苷酸和人工核酸酶組合的反義藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于含有特定修飾的RNA或DNA堿基、并與具有高度選擇性人工核酸酶活性的有機(jī)鑭系元素復(fù)合物結(jié)合的寡核苷酸類似物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的應(yīng)用在現(xiàn)代醫(yī)療中是極其重要的，并有充分的文獻(xiàn)記載(Uhlmann等,Antisenseoligonucleotides:Anewtherapeuticprinciple.(反義寡核苷酸新的治療原理)ChemicalReviews19卯，90:543-584;Crooke等《反義研究和應(yīng)用》(AntisenseResearchandApplications),CRCPress(1993);Mesmaekar等，"Antisenseoligonucleotides,"(反義寡核苷酸),Acc.Chem.Res.1995，28:366-374;Stein."Theexperimentaluseofantisenseoligonucleotides:aguidefortheperplexed."(反義寡核苷酸的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用疑難指導(dǎo))J.Clin.Invest.2001，108，641-644.)反義多核苷酸與DNA或RNA靶的特異性結(jié)合可以使核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯失活，從而提供控制疾病例如癌癥和病毒感染的機(jī)制。因此，反義寡核苷酸與靶的結(jié)合可用于在各種不同的環(huán)境中改變基因的表達(dá)，從而，例如，干擾病毒生命周期、或癌性細(xì)胞的生長。除了與互補(bǔ)耙核苷酸序列的特異性結(jié)合親和性之外，反義寡核苷酸還應(yīng)當(dāng)滿足治療性目的的要求，包括效能、生物利用度、低毒性和低成本。因?yàn)榫哂刑烊涣姿岫ス羌艿墓押塑账釋怂崦覆环€(wěn)定，并且不容易穿透細(xì)胞膜，因此研究人員嘗試了對多核苷酸骨架進(jìn)行修飾，以改進(jìn)核酸酶抗性和細(xì)胞攝入。因此，希望提供具有增強(qiáng)的核酸酶抗性和細(xì)胞攝入、同時(shí)又保留了它們與核酸的特異性相互作用和/或它們的催化活性的多核苷酸類似物。對于開發(fā)對核酸酶活性具有較高抗性的反義寡核苷酸的化學(xué)修飾，已經(jīng)進(jìn)行了努力(Mesmaekar等，"Antisenseoligonucleotides."(反義寡核苷酸)Acc.Chem.Res.1995,28:366-374.;CrookeST."Progressinantisensetherapeutics."(反義治療學(xué)中的進(jìn)展)Med.Res.Rev.1996;16:319-344)。例如，一種方法(Wang等，"Sugarmodifiednucleosidesandoligonucleotides"(糖修飾的核苷和寡核苷酸)美國專利No.5，681，940;1997年10月28日)提供了各種新的糖修飾的核苷以及相應(yīng)的糖修飾的寡核苷酸，它們在用于反義、診斷或其它目的時(shí)具有優(yōu)于天然的RNA和DNA寡核苷酸的性質(zhì)。各種其它的修飾核苷酸已經(jīng)被提議作為潛在的反義藥物(Iyer,"Reagentsandprocessforsynthesisofoligonucleotidescontainingphosphorodithioateinternucleosidelinkages"(合成含有核苷間二硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸的試劑和方法)，美國專禾廿No.6,117,992;2000年9月12曰；Meyer等，"Oligonucleotidescontainingpyrazolo[3,4-d]pyrimidinesforhybridizationandmismatchdiscrimination"(含有吡唑[3，4-d]嘧啶的寡核苷酸用于雜交和錯(cuò)配分辨)，美國專利No.6,127，121;2000年10月3日；Froehler等，"Enhancedtriple-helixanddouble-helixformationdirectedbyoligonucleotidescontainingmodifiedpyrimidines"(含有修飾嘧啶的寡核苷酸指導(dǎo)的增強(qiáng)三螺旋和雙螺旋的形成)，美國專利No.6,235,887;2001年5月22日；Cook等，"Substitutedpurinesandoligonucleotidecross-linking"(耳又代的嘌呤和寡核苷酸交聯(lián))，美國專利No.6,232,463，2001年5月15日；Short,"Modifiednucleotidesandmethodsusefulfornucleicacidsequencing"(可用于核酸測序的修飾的核苷酸和方法)，美國專利No.6，579,704，2003年6月17日)。降低寡核苷酸的核酸酶存活力的一種有意思的方法是通過引入兩性離子堿基形式進(jìn)行修飾，這對磷酸二酯鍵產(chǎn)生了靜電保護(hù)(Switzer,"Antisenseoligonucleotidescomprising5-aminoalkylpyrimidinenucleotides"(含有5-氨基烷基嘧啶核苷酸的反義寡核苷酸)，美國專利No.5,596,091，1997年1月21日；Switzer，"Antisenseoligonucleotidecontainingcompositionsandmethodofformingduplexes""含有反義寡核苷酸的組合物以及形成雙鏈體的方法)，美國專利No.6,031,086，2000年2月29日)。通過分子模擬和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了某些修飾的嘌呤和嘧啶堿基(例如l-甲基-5-羥基胞嘧啶及其陰離子形式，l-甲基-5-溴尿嘧啶和2-氨基-9-甲基嘌呤)具有兩性離子互變異構(gòu)體，它們與互補(bǔ)的天然核酸堿基牢固地結(jié)合(Suen等，"IdentificationbyUVresonanceRamanspectroscopyofaniminotautomerof5-hydroxy-2'-deoxycytidine,apowerfulbaseanalogtransitionmutagenwithamuchhigherunfavoredtautomerfrequencythanthatofthenaturalresidue2'-deoxycytidine."(通過紫外共振拉曼光譜鑒定5-羥基-2'-脫氧胞苷的亞氨基互變異構(gòu)體，比天然的2'-脫氧胞苷殘基具有高得多的不利的互變異構(gòu)體頻率的強(qiáng)有力的堿基類似物轉(zhuǎn)變誘變劑)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，96:4500-4505.Karelson等，"Quantum-ChemicalModelingoftheTautomericEquilibriaofModifiedAnionicNucleicAcidBases,"(修飾的陰離子核酸堿基的互變異構(gòu)體平衡的量子化學(xué)模擬)，ARKIVOC，2001，3，51-62.)。對于設(shè)計(jì)能夠催化水解核酸的有機(jī)-金屬復(fù)合物也有極大的興趣。(Morrow,"ArtificialRibo皿cleases,"(人工核糖核酸酶)，Adv.I鍾g.Biochem.,1994,9:41-74;Magda，"MetalComplexConjugatesofAntisenseDNAWhichDisplayRibozyme-LikeActivity,"(顯示出類寸以核酶活性的反義DNA的金屬復(fù)合結(jié)合物)，J.Am.Chem.Soc.1997，119:6947-6948.;Komiyama,"Progresstowardssyntheticenzymesforphosphoesterhydrolysis,"(磷酸酯水解的合成酶方面的進(jìn)展)，CurrentOpinioninChemicalBiology,1998，2:751-757.;Hegg，"Towardthedevelopmentofmetal-basedsyntheticnucleasesandpeptidases:arationaleandprogressreportinapplyingtheprinciplesofcoordinationchemistry,"(開發(fā)基于金屬的合成核酸酶和肽酶在配位化學(xué)原理的應(yīng)用中的理論基礎(chǔ)和進(jìn)展報(bào)告)，Coord.Chem,Revs.1998,173:133-165;Trawick等，"InorganicMimicsofRibonucleasesandRibozymes:FromRandomCleavagetoSequence-SpecificChemistrytoCatalyticAntisenseDrugs,"(核糖核酸酶和核酶的無機(jī)模擬物從隨機(jī)裂解到序列特異性化學(xué)到催化性反義藥物)，Chem.Rev.1998,98:939-960.)某些鑭系元素(例如鑭、銪、鈰、釓)的復(fù)合物具有與天然的酶相當(dāng)或甚至更高的磷酸二酉旨酉每活性(BingZhua等，"Binuclearlanthanidecomplexesascatalystsforthehydrolysisofdouble-strandedDNA，"(雙核鑭系元素復(fù)合物作為水解雙鏈DNA的催化劑)Inorg.Chem.Communs.,1999，2:351-353.;Williams等，"StructureandNucleaseActivityofSimpleDinuclearMetalComplexes:QuantitativeDissectionoftheRoleofMetalIons,"(簡單的雙核金屬復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和核酸酶活性金屬離子作用的定量剖分)，Acc.Chem.Res.1999，32:485-493.;H組er等，"DevelopmentofArtificialRibonucleasesUsingMacrocyclicLanthanideComplexes,"(使用大環(huán)鑭系元素復(fù)合物發(fā)展人工核糖核酸酶)，Chimia2000,54:569-573.;Kuzuya等，"ConjugationofVariousAcriditiestoDNAforSite-SelectiveRNAScissionbyLanthanideIon,"(將各種不同的吖啶與DNA結(jié)合用于通過鑭系元素離子進(jìn)行位點(diǎn)選擇性的RNA剪切)，BioconjugateChem.2002,13:365-369.;Canaple等，"ArtificialRibonucleases:EfficientandSpecificinVitroCleavageofHumanc-raf-lRNA,"(人工核糖核酸酶在體外有效和特異性裂解人類c-raf-lRNA)，BioconjugateChem.2002,13:945-951.;Shigekawa等，"Extendedx-rayabsorptionfmestructurestudyonthecerium(IV)-inducedDNAhydrolysis:Implicationtotherolesof4forbitalsinthecatalysis"(對于鈰(IV)誘導(dǎo)的DNA水解的延伸的x-射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)研究4f軌道在催化中的作用的推論)，Appl.Phys.Lett.1999,74:460-462.)提供合成的RNA轉(zhuǎn)酯催化劑的一種可能的方法可以是通過與催化的裂解基團(tuán)連接，產(chǎn)生更有力的反義寡核苷酸，使它們成為有效的、選擇性誘變的抗病毒藥劑(Hall等，"Efficients叫uence-specificcleavageofRNAusingnoveleuropiumcomplexesconjugatedtooligonucleotides",(使用與寡核苷酸結(jié)合的新的銪復(fù)合物對RNA進(jìn)行有效的序列特異性裂解)，Chemistry&Biology,1994,1:185-190;Komiyama，"Sequence-specificandhydrolyticscissionofDNAandRNAbylanthanidecomplex-oligoDNAhybrids",(通過鑭系元素復(fù)合物-寡聚DNA雜合體進(jìn)行DNA和RNA的序列特異性的和水解剪切)，J.Biochem.，1995，118:665-670;Hall等，"Towardsartificialribonucleases:Thesequence-specificcleavageofRNAinaduplex",(關(guān)于人工核糖核酸酶在雙鏈體中進(jìn)行RNA的序列特異性裂解)，Nucl.AcidRes.，1996,24:3522-3526;Hall等，"S叫證ce陽specificcleavageofRNAusingmacrocycliclanthanidecomplexesconjugatedtooligonucleotides:Astructureactivitystudy,"(使用與寡核苷酸結(jié)合的大環(huán)鑭系元素復(fù)合物進(jìn)行RNA的序列特異性裂解結(jié)構(gòu)活性研究)，Nucleosides&Nucleotides,1997,16:1357-1368;Hlner等，"Thesequence-specificcleavageofRNAbyartificialchemicalribonucleases,"(通過人工化學(xué)核糖核酸酶對RNA進(jìn)行序列特異性裂解)，Antisenseandnucleicadddrugdevelopment,1997，7:423-430;Baker等，"Oligonucleotide-europiumcomplexconjugatedesignedtocleavethe5'capstructureoftheICAM陽ltranscriptpotentiatesantisenseactivityincells,"(設(shè)計(jì)用于裂解ICAM-1轉(zhuǎn)錄本的5'-帽結(jié)構(gòu)的寡核苷酸-銪復(fù)合結(jié)合物增強(qiáng)了細(xì)胞中的反義活性)，Nucl.AcidRes.,1999,17:1547-1551;Haner等，"Functionalterpyridine-metalcomplexes,aprocessforthepreparationthereofandoligonucleotideconjugateswithterpyridine-metalcomplexes"(功能性三聯(lián)吡啶-金屬復(fù)合物、其制備方法以及與三聯(lián)吡啶-金屬復(fù)合物結(jié)合的寡核苷酸)，美國專利No.5,925,744，1999年7月20日;Morrow,"MetalcomplexesforpromotingcatalyticcleavageofRNAbytransesterification"(通過轉(zhuǎn)酯作用促進(jìn)RNA的催化裂解的金屬復(fù)合物)，美國專利No.5,684,149，1997年11月4日)。通過將鑭系元素(III)離子與帶有一個(gè)或兩個(gè)吖啶基團(tuán)的寡核苷酸合并，已經(jīng)制備了在一個(gè)或兩個(gè)指定位點(diǎn)選擇性剪切RNA的人工酶。(Kuzuya等，"ConjugationofVariousAcriditiestoDNAforSite-SelectiveRNAScissionbyLanthanideIon，"(將各種不同的吖啶與DNA結(jié)合用于通過鑭系元素離子進(jìn)行位點(diǎn)選擇性RNA剪切)，Bio—ugateChem.2002，13:365-369;Kuzuya等，"SelectiveactivationoftwositesinRNAbyacridine-bearingoligonucleotidesforclippingofdesignatedRNAfragments,"(通過帶有口丫啶的寡核苷酸在RNA中選擇性活化兩個(gè)位點(diǎn)用于切下指定的RNA片段)，J.Am.Chem.Soc.，2004，126:1430-1436.)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及了含有寡核苷酸的化合物，其中寡核苷酸含有修飾的核堿基和/或螯合部分，這增加了它們與互補(bǔ)的核酸的結(jié)合能力并能夠賦予磷酸二酯酶活性。根據(jù)在公開的化合物的寡核苷酸部分中修飾的核堿基數(shù)量的性質(zhì)，化合物與互補(bǔ)的靶核酸的結(jié)合能力與典型的互補(bǔ)寡核苷酸相比可以增加到103-109倍。這種結(jié)合的增強(qiáng)允許使用較低濃度的藥劑用于工業(yè)、預(yù)防、治療或其它目的。此外或可選地，用能夠與金屬離子復(fù)合的螯合基團(tuán)修飾的本發(fā)明化合物的催化活性可以允許使用較低有效濃度的化合物(與之前的反義療法化合物相比)，因?yàn)榛衔锟梢耘c互補(bǔ)鏈復(fù)合，催化磷酸二酯鍵裂解，和與另一條互補(bǔ)鏈重復(fù)這個(gè)過程。本發(fā)明的材料可用于使用或?qū)砜赡苁褂梅戳x核酸的所有各種過程，包括但不限于診斷、治療以及調(diào)節(jié)宿主或病原體的基因表達(dá)。就強(qiáng)烈的結(jié)合力來說，本發(fā)明的材料也可以用作檢測探針，用于檢測和/或定量靶核酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是含有螯合部分和大約5到大約150個(gè)核堿基的寡核苷酸的化合物，其中寡核苷酸還含有至少一個(gè)修飾的核堿基，例如兩性離子互變變構(gòu)體、離子互變變構(gòu)體、巰基核堿基或羥基核堿基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸含有大約io到大約IOO個(gè)核堿基，更優(yōu)選大約10到大約50個(gè)核堿基，最優(yōu)選大約20到大約30個(gè)核堿基。在某些情況下，寡核苷酸具有至少兩個(gè)修飾的核堿基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的核堿基是巰基核堿基和/或羥基核堿基。在某些實(shí)施方案中，羥基核堿基占化合物中核堿基總數(shù)的大約10%到大約20%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，羥基核堿基是5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤或8-羥基鳥嘌呤，和/或巰基核堿基是5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥嘌呤或8-巰基腺嘌呤。本文中使用的螯合部分是化合物中能夠與金屬離子復(fù)合的部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬是鑭系元素，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、軋、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。特別優(yōu)選的金屬是銪和鑭。優(yōu)選的螯合部分是具有選自下式的部分ROOCN丫NCOO—k」HkCOCT、COCTOR,NHHNoooo<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中R是化合物的寡核苷酸部分。W和W可以是氫、CL8烷烴、Cw烯烴、C^炔烴、?；鵆L8烷烴、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、Q.s烷基芳基或CL8垸基雜芳基。W可以是CL8烷基、<:2.8烯烴、C2.8炔烴、芳基、雜芳基、CL8烷基芳基、d.8烷基雜芳基或?；鵔_8烷烴。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，螯合部分是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>，其中W各為2,2,2-三氟乙酰基，R是寡核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)方面是含有本文公開的化合物和可藥用載體的組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物還含有投送介質(zhì)，例如脂質(zhì)體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用本文描述的化合物抑制靶核酸翻譯的方法。例如，這樣的方法包括將靶核酸與本發(fā)明的化合物在允許化合物與靶核酸雜交的條件下進(jìn)行接觸，其中雜交的化合物抑制靶核酸的翻譯。在某些情況下，化合物裂解了靶核酸的鍵。在某些實(shí)施方案中，耙核酸是mRNA。在某些實(shí)施方案中，靶核酸在生物體中，并且接觸包括給生物體施用含有本發(fā)明的化合物和可藥用載體的組合物?；蛘?，在另外的實(shí)施方案中，接觸包括將本發(fā)明的化合物與來自生物體的含有靶核酸的生物樣品進(jìn)行混合。在某些情況下，生物體是人類或動物對象。在具體的實(shí)施方案中，人類或動物對象患有病毒感染、細(xì)菌感染、微生物感染、真菌感染或癌癥。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在生物體中抑制核酸的翻譯的方法，包括推測或測定生物體中的靶核酸的核酸序列，以及給生物體施用含有本發(fā)明的化合物和可藥用載體的組合物。在某些情況下，組合物還含有投送介質(zhì)，例如脂質(zhì)體。在組合物中施用的化合物含有的核苷酸序列與耙核酸的核苷酸序列充分互補(bǔ)，從而與其在生物體中、在足夠允許發(fā)生雜交的情況下進(jìn)行雜交，從而在生物體中抑制核酸的翻譯。在某些情況下，化合物的核苷酸序列與靶核酸的序列的全部或一部分完全互補(bǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使得化合物在足以允許雜交的條件下抑制革巴核酸翻譯的方法，該方法包括(a)測定靶核酸的核苷酸序列；(b)合成含有與寡核苷酸連接的螯合部分的化合物，該寡核苷酸包含的寡核苷酸序列與靶核酸的核苷酸序列的至少一部分互補(bǔ)，并且含有5到150個(gè)核堿基，其中至少一個(gè)核堿基選自5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤的羥基核堿基；以及(c)將化合物與選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、軋、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥的金屬的離子進(jìn)行混合。在某些實(shí)施方案中，螯合部分具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中R是化合物的寡核苷酸部分。R'和RS可以是氫、Q-8垸烴、C2—8烯烴、C2.8炔烴、?；鵆^垸烴、環(huán)烷基、雜環(huán)垸基、芳基、雜芳基、d.8烷基芳基或CL8烷基雜芳基。W可以是C^烷基、(^2.8烯烴、(32.8炔烴、芳基、雜芳基、Q.s烷基芳基、C,.s垸基雜芳基或?；鵆,.8烷烴。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，足以允許雜交的條件是人類的生理?xiàng)l件。除了上述之外，作為附加的方面，本發(fā)明包括了本發(fā)明在任何方面比上面具體提到的變化的范圍更窄的所有實(shí)施方案。例如，盡管為了簡短起見，對本發(fā)明的方面可以通過引用種屬或數(shù)值范圍進(jìn)行描述，但應(yīng)該理解，種屬中的每個(gè)成員和范圍內(nèi)的每個(gè)值或子范圍也旨在作為本發(fā)明的方面。同樣地，本發(fā)明各種不同的方面和特征可以組合，產(chǎn)生也旨在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面。盡管申請人發(fā)明了本文所附的權(quán)利要求的全部范圍，但本文所附的權(quán)利要求并不打算在其范圍內(nèi)涵蓋其他人在現(xiàn)有技術(shù)中的工作。因此，在專利局或其它單位或個(gè)人提請申請人注意權(quán)利要求范圍內(nèi)的法定現(xiàn)有技術(shù)的情況下，申請人保留在適用的專利法規(guī)定下行使修改權(quán)的權(quán)利，以重新界定該權(quán)利要求的主題，將該法定現(xiàn)有技術(shù)或法定現(xiàn)有技術(shù)的明顯變化從該權(quán)利要求的范圍中特別排除出去。通過這樣修改的權(quán)利要求界定的本發(fā)明的變化也旨在作為本發(fā)明的方面。附圖簡述圖1是描繪摻入了0、1、2或3個(gè)羥基鳥嘌呤核酸的寡核苷酸在血清中37。C下的穩(wěn)定性的圖。圖2是描繪與各種不同的互補(bǔ)寡核苷酸溫育后殘留的RNA量的圖。圖3是分析凝膠的照片，顯示了在本文公開的鑭系元素-寡核苷酸復(fù)合物的存在下eGFP的降解。上方的凝膠顯示了與鑭系元素復(fù)合的未修飾的寡核苷酸與mRNA溫育的結(jié)果，下方的凝膠顯示了與鑭系元素復(fù)合的修飾的寡核苷酸與mRNA溫育的結(jié)果。第1道是分子量大小標(biāo)記物；第2和3道顯示了在10寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物存在下的降解；第3和4道顯示了在5寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物存在下的降解；第6道是正義RNA的對照實(shí)驗(yàn)；第7道是反義RNA的對照實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選實(shí)施方案的具體說明本發(fā)明提供了含有螯合部分和寡核苷酸的新化合物，其中寡核苷酸具有用于反義、診斷和其它使用寡核苷酸的方法中的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物包含的反義寡核苷酸具有(a)與天然的核堿基具有高度結(jié)合效能的一個(gè)或多個(gè)修飾的核堿基，以及(b)—個(gè)或多個(gè)螯合部分。這些化合物可以水解寡核苷酸、RNA和/或DNA的磷酸二酯鍵，并可用于反義治療。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物、嵌合物、類似物和同系物的寡聚體或多聚體。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基、糖和共價(jià)的核苷酸間(骨架)鍵構(gòu)成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，這些非天然存在的部分在例如與耙核酸雜交或與互補(bǔ)寡核苷酸相互作用時(shí)，以類似于天然存在的寡核苷酸的方式發(fā)揮作用。這樣的修飾的或取代的寡核苷酸通常比天然的形式更為優(yōu)選，因?yàn)榫哂行枰男再|(zhì)，例如增加細(xì)胞攝入、增加對靶核酸的親和性，以及在核酸酶存在下增加穩(wěn)定性。本發(fā)明的化合物與生物負(fù)體(例如寡核苷酸、RNA或DNA)結(jié)合的效率是通過摻入修飾的核堿基或其它具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類似物來達(dá)到的。本發(fā)明的化合物有至少一個(gè)核堿基具有修飾的核堿基或其它具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類似物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的核堿基是選自5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤的羥基核堿基，或選自5-巰基胞嘧啶、《嘧啶、8-巰基鳥嘌呤和8-巰基腺嘌呤的巰基核堿基。-抓在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸含有5-羥基尿嘧啶陰離子(丄)的一種或多種互變異構(gòu)體形式，5-羥基尿嘧啶陰離子(丄)具有下式(圖解o:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中R是指本發(fā)明的其余化合物。半經(jīng)驗(yàn)性的AMI和PM3以及從頭計(jì)算的SCF和DFT(BLYP/6-31+G(d))計(jì)算的結(jié)果表明，1-甲基-5-羥基尿嘧啶陰離子在溶液中最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體是在5-位上具有完整的OH-基團(tuán)的形式(讓)。因?yàn)樵贜3位置上缺少氫原子，l-甲基-5-羥基尿嘧啶陰離子互變異構(gòu)體lk與腺嘌呤的正常配對不能形成。但是，l-甲基-5-羥基尿嘧啶陰離子的這種互變異構(gòu)體形式(讓)與鳥嘌呤產(chǎn)生了牢固鍵合的復(fù)合物，成為反向沃森-克里克(Watson-Crick)配對(圖解2)。圖解2由于在l-甲基-5-羥基尿嘧啶陰離子邊的C4羰基(靠近氧負(fù)離子)上具有明顯的負(fù)電荷，該配對將比天然的鳥嘌呤-胞嘧啶配對具有明顯更牢固的鍵合。計(jì)算表明鳥嘌呤與l-甲基-5-羥基尿嘧啶陰離子之間的反向沃森-克里克配對比通常的鳥嘌呤-胞嘧啶配對更穩(wěn)定2到4kcal/mo1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包含羥基堿基5-羥基胞嘧啶(2)。5-羥基胞嘧啶(2)陰離子的互變異構(gòu)體形式在圖解3中給出，其中R仍然是指化合物的其余部分。圖解3在l-甲基-5-羥基胞噴啶陰離子的情況下，結(jié)構(gòu)l是在溶液中最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體形式。該陰離子的N-H形式在C2羰基氧原子上具有明顯的負(fù)電荷。結(jié)果，與鳥嘌呤的相應(yīng)配對(圖解4)比通常的鳥嘌呤-胞嘧啶配對具有明顯更牢固的鍵合。圖解4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>AMISCRF計(jì)算預(yù)測出，異常的鳥嘌呤-互變異構(gòu)體2k配對比正常的鳥嘌呤-胞嘧啶沃森-克里克配對更穩(wěn)定5.42kcal/mol。使用PM3參數(shù)化的相應(yīng)計(jì)算差值甚至更大，大約為10.21kcal/mol。因此，這種強(qiáng)烈的鍵合可顯著影響正常的DNA復(fù)制過程，導(dǎo)致突變或甚至細(xì)胞的完結(jié)。這與5-羥基胞嘧啶的實(shí)驗(yàn)觀察相一致，5-羥基胞嘧啶類似5-羥基尿嘧啶，是極其強(qiáng)的誘變劑(Wallace."Biologicalcons叫uencesoffreeradical-damagedDNAbases,"(自由基破壞的DNA堿基的生物學(xué)結(jié)果)FreeRadicalBiologyandMedicine,2002，33:1-14)。但是，在本實(shí)施方案中，非常低濃度的該成分保證了僅僅與特定的標(biāo)題化合物強(qiáng)烈鍵合，而與生物負(fù)體(DNA、RNA)中隨機(jī)互補(bǔ)堿基具有可忽略的非特異性鍵合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，羥基堿基是8-羥基腺嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)體形式(》。該陰離子的相應(yīng)的互變異構(gòu)體形式在圖解5中給出，其中R仍是化合物的其余部分。在9-甲基-8-羥基腺嘌呤的陰離子的情況下，最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體形式是離子化的8-羥基形式h。在該情況下，與尿嘧啶的正常鍵合僅僅受到輕微的影響。但是，計(jì)算表明，中性9-甲基-8-羥基腺嘌呤在溶液中的最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體是兩性離子的形式4，顯示在圖解6中。圖解6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>由于銨基團(tuán)上的正離子電荷，該互變異構(gòu)體與尿嘧啶形成非常強(qiáng)的氫鍵。9-甲基-8-羥基腺嘌呤兩性離子互變異構(gòu)體L與尿嘧啶的配對經(jīng)計(jì)算比正常的腺嘌呤-尿嘧啶配對更穩(wěn)定5.16kcal/mol(AMIMCaSCRF)至U8.41kcal/mol(PM3MCaSCRF)(參考圖解7)。圖解7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>這也與8-羥基腺嘌呤的非常高的誘變活性相一致(Wallace."Biologicalconsequencesoffreeradical-damagedDNAbases,"(自由基破壞的DNA堿基的生物學(xué)結(jié)果)FreeRadicalBiologyandMedicine,2002,33:1-14)。但是，預(yù)期增加的鍵合允許將本發(fā)明的化合物的濃度降低到與僅具有天然核堿基的化合物相比最多5個(gè)數(shù)量級。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了由8-羥基鳥嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)體形式(i)修飾的本發(fā)明的化合物。該陰離子的相應(yīng)的互變異構(gòu)體形式在圖解8中給出，其中R仍指化合物的其余部分。圖解8OQ'在9-甲基-8-羥基鳥嘌呤的陰離子的情況下，最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體形式是離子化的8-羥基形式&，它以與正常的堿基配對相似的能量結(jié)合。但是，中性的9-甲基-8-羥基鳥嘌呤在溶液中最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體，圖解9顯示的兩性離子形式&與胞嘧啶具有非常牢固的鍵合。圖解9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>在本文中使用時(shí)，每種羥基核堿基當(dāng)與相對的核堿基形成穩(wěn)定的氫鍵時(shí)，被認(rèn)為與該核堿基互補(bǔ)。因此，在某些情況下，5-羥基尿嘧啶與腺嘌呤互補(bǔ)，5-羥基胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)，8-羥基腺嘌呤與尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互補(bǔ)，和8-羥基鳥嘌呤與胞嘧啶互補(bǔ)。羥基核堿基與靶核酸的核堿基的其它穩(wěn)定的氫鍵也可以存在，因此，羥基核堿基被認(rèn)為與靶核酸中與其形成穩(wěn)定氫鍵的核堿基互補(bǔ)。修飾的核堿基中的酸性互變異構(gòu)基團(tuán)可以是任何其它的酸性基團(tuán)，例如-SH、-COOH、-S03H等。在示例的實(shí)施方案中，鳥嘌呤和胞嘧啶之間的復(fù)合物(7a)以及8-巰基鳥嘌呤和胞嘧啶的兩性離子形式(7b)的穩(wěn)定化中存在顯著的差別。圖解11<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>使用Jaguar(Jaguar6.5,Schrodinger,LLC,NewYork,NY,2005)，采用6-31G"+基本設(shè)置進(jìn)行DFT(B3LYP)計(jì)算，給出了下面的復(fù)合物穩(wěn)定化能量值7a的-0.038376a.u.vs.7b的-0.073251a.u.，因此推斷出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在后者中存在牢固得多的鍵合。因此，在核苷酸、寡核苷酸和核酸中存在8-巰基鳥嘌呤及等價(jià)的互變異構(gòu)化合物將增加RNA-RNA、RNA-DNA、DNA-DNA、RNA-蛋白和DNA-蛋白氫鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性。這些復(fù)合物的穩(wěn)定性可用于RNAi診斷、反義核苷酸療法、核酸微陣列診斷學(xué)，以及各種利用它們的實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床方法。在表1中，給出了上面討論的化合物通過AMISCRF(s=80)計(jì)算的形成熱AH和相對互變異構(gòu)平衡常數(shù)ApKT。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在本發(fā)明的給定的化合物中羥基核堿基的數(shù)量至少為1個(gè)，但不超過化合物的寡核苷酸部分的核堿基總數(shù)的20%。超過20%的羥基核堿基可導(dǎo)致化合物的不穩(wěn)定，并減少與靶核酸的結(jié)合。優(yōu)選的羥基核堿基的數(shù)量為核堿基總數(shù)的大約10%到大約20%。在本發(fā)明的化合物中存在1個(gè)以上的羥基核堿基的情況下，羥基核堿基可以是相同的或不同的。本發(fā)明的化合物優(yōu)選含有大約5到大約150個(gè)核堿基(即從大約5到大約150個(gè)連接的核苷)。本
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的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明體現(xiàn)的化合物長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101-,102、103、104、105、106、107、簡、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145,,146、147、148、149、和150個(gè)核堿基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的長度為10到100個(gè)核堿基。本
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的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這體現(xiàn)了長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100個(gè)核堿基的化合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的長度為10到50個(gè)核堿基。本
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的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這體現(xiàn)了長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50個(gè)核堿基的化合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的長度為20到30個(gè)核堿基。本
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的普通專業(yè)人員將會認(rèn)識到，這體現(xiàn)了長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個(gè)核堿基的化合物。特別優(yōu)選的化合物是從大約10到大約50個(gè)核堿基的寡核苷酸，更優(yōu)選的是含有大約20到大約30個(gè)核堿基的寡核苷酸。本發(fā)明的化合物還含有螯合部分。螯合部分發(fā)揮金屬配體的功能。它們可以穩(wěn)定地螯合金屬離子。某些金屬-配體復(fù)合物已經(jīng)被顯示在裂解磷酸二酯鍵中有效。將螯合部分整合到具有反義活性的寡核苷酸中，由于降解或裂解靶核酸的一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵的能力，寡核苷酸抑制靶核酸的效能被增加了。因此，本發(fā)明的化合物還包含了能夠螯合金屬離子的螯合部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬離子是鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、禮、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。特別優(yōu)選的是銪或鑭的離子。金屬的離子可以是任何穩(wěn)定離子，例如+1、+2、+3、+4、或+5價(jià)離子。優(yōu)選的離子是La(m)、Eu(III)、Ho(III)和Ce(IV)?？梢钥紤]的螯合部分包括在圖解12中概括的分子式所代表的那些。圖解12<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中R是寡核苷酸的其余部分；Ri選自氫、Cw垸烴、C2-8烯烴、C2-8炔烴、?；鵧.8烷烴、環(huán)垸基、雜環(huán)垸基、芳基、雜芳基、Q—8烷基芳基和d—8垸基雜芳基，f獨(dú)立地選自C,.8垸基、C2—8烯烴、C2.8炔烴、芳基、雜芳基、Q.8烷基芳基、d-8垸基雜芳基和酰基Q—8垸烴，并且RS獨(dú)立地選自氫、Cw垸烴、C2.8烯烴、C2-8炔烴、酰基Ci-8垸烴、環(huán)烷基、雜環(huán)垸基、芳基、雜芳基、Q—8垸基芳基和C,-8烷基雜芳基。術(shù)語"烷基"包括含有指定數(shù)量碳原子的直鏈和支鏈的烴基團(tuán)，典型為甲基、乙基以及直鏈和支鏈的丙基和丁基基團(tuán)。烴基團(tuán)可以含有最多16個(gè)碳原子。術(shù)語"烷基"包括"橋接烷基"，例如CVC,6二環(huán)或多環(huán)烴基團(tuán)，例如降冰片基、金剛烷基、二環(huán)[2.2.2]辛基、二環(huán)[2.2.1]庚基、二環(huán)[3.2.1]辛基和十氫萘基。術(shù)語"垸基"還包含了任選被例如一個(gè)或多個(gè)鹵素原子、一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)硫羥基團(tuán)取代的烷基基團(tuán)。術(shù)語"環(huán)烷基"被定義為環(huán)狀的C3-C8烴基團(tuán)，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基和環(huán)庚基。"雜環(huán)垸基"被定義為與環(huán)烷基相似，只是在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中存在至少一個(gè)雜原子。適合的雜原子包括N、S禾卩O。術(shù)語"烯基"和"炔基"與"烷基"的定義相同，只是分別含有碳-碳雙鍵或碳-碳三鍵。"環(huán)烯基"的定義與環(huán)垸基相似，只是在環(huán)中存在碳-碳雙鍵。術(shù)語"亞垸基"是指具有取代基的垸基基團(tuán)。例如，術(shù)語"Q_3亞垸基芳基"是指含有1到3個(gè)碳原子的垸基基團(tuán)，并被芳基基團(tuán)取代。術(shù)語"卣"或"鹵素"在本文中被定義為包括氟、溴、氯和碘。術(shù)語"芳基"單獨(dú)或組合時(shí)，在本文中被定義為單環(huán)或多環(huán)的芳香基團(tuán)，優(yōu)選為單環(huán)或二環(huán)的芳香基團(tuán)，例如苯基或萘基。除非特別指明，"芳基"基團(tuán)可以是非取代的或被例如一個(gè)或多個(gè)、具體一個(gè)到三個(gè)鹵素、烷基、羥基、C(=0)OR、羥基烷基、烷氧基、烷氧基垸基、鹵代垸基、鹵代垸氧基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、酰胺基、垸硫基、垸基亞硫?；哇酋；〈?。示例性的芳基基團(tuán)包括苯基、萘基、四氫萘基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。術(shù)語"芳基Cw垸基"和"雜芳基Cw垸基"被定義為具有Cw烷基取代基的芳基或雜芳基基團(tuán)。術(shù)語"雜芳基"在本文中被定義為單環(huán)或二環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，含有一個(gè)或兩個(gè)芳香環(huán)并在芳香環(huán)中含有至少一個(gè)氮、氧或硫原子，其可以是非取代的或被例如一個(gè)或多個(gè)、具體一個(gè)到三個(gè)取代基所取代，例如鹵素、烷基、羥基、羥基烷基、垸氧基、垸氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、垸基氨基、?；被?、烷硫基、垸基亞硫酰基和烷基磺?；ｋs芳基基團(tuán)的例子包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、異喹啉基、剛哚基、三唑基、異噻唑基、異噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。術(shù)語"Het"被定義為單環(huán)、二環(huán)和三環(huán)基團(tuán)，含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮和硫的雜原子。"Het"基團(tuán)也可以含有與環(huán)連接的氧代基團(tuán)(K))。Het基團(tuán)的非限制性例子包括1，3-二氧戊環(huán)基、2-吡唑啉基、吡唑垸基、吡咯烷基、哌嗪基、吡咯啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、嗎啉基、thiopholinyl、哌啶基、1，4-二噻烷基和1,4-二噁烷。術(shù)語"羥基"被定義為-OH。術(shù)語"垸氧基"被定義為-OR，其中R是烷基。術(shù)語"烷氧基烷基"被定義為其中氫已經(jīng)被烷氧基取代的垸基基團(tuán)。術(shù)語"(烷基巰基)烷基"的定義與烷氧基烷基相似，只是存在硫原子而不是氧原子。術(shù)語"羥基烷基"被定義為連接有垸基基團(tuán)的羥基基團(tuán)。術(shù)語"氨基"被定義為-NH2，術(shù)語"烷基氨基"被定義為-NR2，其中至少一個(gè)R是垸基，第二個(gè)R是垸基或氫。術(shù)語"?；被?被定義為RC(=0)N-，其中R是烷基或芳基。術(shù)語"烷硫基"被定義為-SR，其中R是烷基。術(shù)語"烷基亞硫?；?被定義為RS02-，其中R是烷基。術(shù)語"垸基磺酰基"被定義為RS03-，其中R是垸基。術(shù)語"硝基"被定義為-N02。術(shù)語"三氟甲基"被定義為-CF3。術(shù)語"三氟甲氧基"被定義為-OCF3。術(shù)語"氰基"被定義為-CN。對含有與金屬離子復(fù)合的螯合部分的本發(fā)明化合物計(jì)算出的核酸酶效能，根據(jù)修飾的核堿基數(shù)量的性質(zhì)，與天然存在的核酸酶相比增加了高達(dá)103-109倍，這允許相應(yīng)地降低有效濃度，并同時(shí)保持了化合物的高特異性。公開的螯合部分可以使用已知的技術(shù)來制備(參見例如Cowan,Curr.Opin.Chem.Biol"5:634-642(2001)禾口Franklin,Curr.Opin.Chem.Biol.,5:201-208(2001))。它們可以附加地和可選地使用容易獲得的材料和己知的保護(hù)基團(tuán)化學(xué)來合成，例如公開在例如Wuts等，Greene'sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,(有機(jī)合成中的格林保護(hù)基團(tuán))第四版(Hoboken，NJ:Wiley-Interscience)2007中。本發(fā)明化合物的其他修改對本發(fā)明化合物的其它修改也被考慮到了。盡管寡核苷酸是本發(fā)明化合物的優(yōu)選形式，但本發(fā)明也包含了其它化合物家族，包括但不限于寡核苷酸類似物和模擬物，例如在本文中描述的那些。正如本
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熟知的那樣，核苷是堿基-糖的組合。核苷的堿基部分通常為雜環(huán)堿基。這樣的雜環(huán)堿基的兩種最常見的類型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進(jìn)一步包含了與核苷的糖部分共價(jià)連接的磷酸基團(tuán)的核苷。對于包含了呋喃戊糖的核苷來說，磷酸基團(tuán)可以連接到糖的2'、3'或5，羥基部分上。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸基團(tuán)將相鄰的核苷彼此共價(jià)連接，形成線性的聚合體化合物。該線性的聚合體化合物的相應(yīng)末端又可以進(jìn)一步連接形成環(huán)狀化合物，但是，一般優(yōu)選線性化合物。此外，線性化合物可以具有內(nèi)部核堿基互補(bǔ)性，因此可以以某種方式折疊產(chǎn)生全部或部分雙鏈的化合物。在寡核苷酸內(nèi)，磷酸基團(tuán)通常被稱為形成了寡核苷酸的核苷間骨架。RNA和DNA的一般鍵或骨架是3'到5'磷酸二酯鍵。修飾的核苷間連鍵(骨架)預(yù)期可用于本發(fā)明的反義化合物的具體例子包括含有修飾的骨架或非天然核苷間連鍵的寡核苷酸。正如在本說明書中定義的那樣，具有修飾的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的和在骨架中不含有磷原子的寡核苷酸。出于本說明書的目的，并且在本
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中有時(shí)被引用時(shí)，在其核苷間骨架中不具有磷原子的修飾的寡核苷酸也可以被認(rèn)為是寡核苷。預(yù)期的其中含有磷原子的修飾的寡核苷酸骨架包括例如具有正常的3，-5，鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基垸基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、磷酰胺酯包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基垸基磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯、硫代垸基膦酸酯、硫代垸基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，它們的2'-5，連接的類似物，以及具有顛倒的極性的類似物，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間連鍵是3'到3'、5'到5'或2'到2'鍵。預(yù)期的具有顛倒的極性的寡核苷酸在最靠近3'-端的核苷酸間連鍵處含有單個(gè)3'到3'鍵，即可以是無堿基的單個(gè)顛倒的核苷殘基(核堿基丟失或在其位置上有羥基)。也包含了各種鹽、混合鹽和游離酸形式。傳授了上述的含磷鍵的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.:3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5，476，925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697禾卩5,625,050，每個(gè)專利在此引為參考。預(yù)期的其中不包含磷原子的修飾的寡核苷酸骨架具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連鍵、混合的雜原子和垸基或環(huán)烷基核苷間連鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連鍵形成的骨架。這些包括了具有嗎啉代連鍵(部分從核苷的糖部分形成)的骨架，硅氧垸骨架，硫化物、亞砜和砜骨架，甲?；?formacetyl)和硫代甲?；羌?，亞甲基甲酰基和硫代甲?；羌?，核糖乙酰基(riboacetyl)骨架，含有烯烴的骨架，氨基磺酸酯骨架，亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，以及其它具有混合的N、O、S和CH2組成部分的骨架。傳授了上述的寡核苷制備的十5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,489,677、5，541，307、5,561,225、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,633,360、5,677,437、5,792,608、表性美國專利包括但不限于U.S.:5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,646,269和5,677,439，每個(gè)專利在此引為參考。修飾的糖和核苷間連鍵-模擬物在另一種預(yù)期的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間連鍵(即骨架)均被新的基團(tuán)所代替。核堿基單位被保留，用于與適當(dāng)?shù)陌泻怂犭s交。一種這樣的化合物、已經(jīng)顯示出具有很好的雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含有酰胺的骨架、特別是氨基乙基甘氨酸骨架所取代。核堿基被保留，并與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合。傳授了PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.:5,539,082、5,714,331禾P5,719,262，每個(gè)專利在此引為參考。關(guān)于PNA化合物的其他教導(dǎo)可以在Nielsen等，Science,1991，254:1497-1500中找到。本發(fā)明的某些實(shí)施方案是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸，和具有雜原子骨架的寡核苷酸，特別是上面參考的美國專利5,489,677中的-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N(CH3)-0-CH2-[被稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2Jt]-0-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯骨架被表述為-0-P-0-CH2-)，以及上面參考的美國專利5,602,240中的酰胺骨架。還考慮到了具有上面參考的美國專利5,034,506中具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的糖修飾的寡核苷酸也可以含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。預(yù)期的寡核苷酸在2'位置上含有下列之一OH;F;O-、S-或N-垸基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中的烷基、烯基和炔基可以是取代的或非取代的C,到Cu)烷基或C2到Cu)烯基和炔基。特別優(yōu)選的是0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m是從1到大約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置上含有下列之一d到Cw低級垸基、取代的低級烷基、烯基、炔基、垸芳基、芳垸基、0-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基垸基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、嵌入劑、改進(jìn)寡核苷酸的藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或改進(jìn)寡核苷酸的藥效動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，以及其它具有類似性質(zhì)的取代基。預(yù)期的修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-0-CH2CH2OCH3，也被稱為2'-0-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta,1995,78，486-504)，即烷氧基烷氧基基團(tuán)。其它預(yù)期的修飾包括2'-二甲基氨氧基乙氧基，艮卩0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，也被稱為2'-DMAOE，在下文的實(shí)施例中描述，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本
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中也稱為2'-0-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-0-CH2-0-CH2-N(CH3)2，也在下文的實(shí)施例中描述。其它預(yù)期的修飾包括2'-甲氧基(2'-0-CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH=CH2)、2'-0-烯丙基(2'-0-CH2-CH=CH2)和2'-氟代(2'-F)。2'-修飾可以在阿拉伯糖(上方)位置或核糖(下方)位置上。優(yōu)選的2'-阿拉伯糖修飾是2'-F。類似的修飾也可以在寡核苷酸的其它位置上進(jìn)行，特別是在3'末端核苷酸上糖的3'位置或2'-5'連接的寡核苷酸中以及5'末端核苷酸的5'位置上。寡核苷酸也可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分來代替呋喃戊糖。講授了制備這樣修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性美國專利包括但不限于U.S.:4,981,957、5，118，800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5，466，786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5，670，633、5,792,747禾P5,700,920，每個(gè)專利在此以其全文引為參考。糖的其它優(yōu)選修飾包括鎖定核酸(LNA)，其中2'-羥基基團(tuán)連接到糖環(huán)的3'或4'碳原子上，從而形成了二環(huán)的糖部分。連鍵優(yōu)選為橋接了2'氧原子和4'碳原子的亞甲基(-CH2-)n基團(tuán)，其中n是l或2。LNA及其制備描述在WO98/39352和WO99/14226中。天然的和修飾的核堿基寡核苷酸也可以包含核堿基(在本
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中通常簡稱為"堿基")修飾或取代。在本文中使用時(shí)，"未修飾的"或"天然的"核堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核堿基包括其它合成的或天然的核堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C《-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿噴啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其它修飾的核堿基包括三環(huán)嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(m-嘧啶[5,4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-封條(G-clamp)例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(311)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶[3',2':4，5]吡咯[2,3-d]嘧啶-2-酮)。修飾的核堿基也可以包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其它雜環(huán)取代的核堿基，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核堿基包括在美國專利No.3,687,808中公開的，在Kroschwitz主編的《聚合物科學(xué)和工程簡明百科全書》第858-859頁(TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,JohnWiley&Sons,1990)中公開的，在Englisch等，AngewandteChemie，InternationalEdition,1991,30:613中公開的，以及在Crooke禾口Lebleu主編的《反義研究和應(yīng)用》第15章第289-302頁(AntisenseResearchandApplications,CRCPress,1993)由Sanghvi公開的那些核堿基。傳授了某些上述的修飾核堿基以及其它的修飾核堿基的制備的代表性美國專利包括但不限于上面提到的U.S.3,687,808，以及U.S.:4，845，205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5，432，272、5，457，187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941，每個(gè)專利在此引為參考，美國專利5,750,692也在此引為參考。結(jié)合物本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾包括將寡核苷酸化學(xué)連接上一個(gè)或多個(gè)增加寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝入的部分或結(jié)合物。這些部分或結(jié)合物可以包括與功能基團(tuán)例如一級或二級羥基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合的結(jié)合物基團(tuán)。本發(fā)明的結(jié)合物基團(tuán)包括螯合部分、嵌入劑、報(bào)告物分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚物的藥效動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，以及增強(qiáng)寡聚物的藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。典型的結(jié)合物基團(tuán)包括膽固醇、脂類、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖咬、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明中增強(qiáng)藥效動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改進(jìn)攝入、增加對降解的抗性和/或加強(qiáng)與耙核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明中增強(qiáng)藥代動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改進(jìn)本發(fā)明化合物的攝入、分布、代謝或分泌的基團(tuán)。代表性的結(jié)合物基團(tuán)被公開在國際專利申請PCT/US92/09196和美國專利6,287,860中，其全部內(nèi)容在此引為參考。結(jié)合物基團(tuán)包括但不限于脂類基團(tuán)例如膽固醇基團(tuán)、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇、脂肪族鏈例如十二垸基二醇或H^—烷基殘基、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-0-十六垸基-消旋-甘油基-3-11-膦酸酯、多胺或聚乙二醇鏈、或金剛垸乙酸、棕櫚酰基部分、或十八胺或己氨基-羰基-氧基膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸也可以與活性藥物物質(zhì)結(jié)合，例如阿司匹林、華法令、苯丁唑酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟滅酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜卓、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺類藥物、抗利尿劑、抗菌劑或抗生素。寡核苷酸藥物結(jié)合物及其制備公開在美國專利申請09/334,130中，在此以其全文引為參考。傳授了這樣的寡核苷酸結(jié)合物的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.:4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5，580，731-5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,0775,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735.4,789,737、4，824，941、4,835,263、4,876,335-5,082,830、5,112,963、5,214,136、5，082，830-5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536-5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203-5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810-5，587，371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928禾B5,688,941，每個(gè)專利在此引為參考。5,580,731、5,591,584、5,486,603、5,512,439、4,667,025、4,762,779、4,904,582、4,958,013、5,112,963、5,214,136、5,272,250、5,292,873、5,451,463、5,510,475、5,574,142、5，585，481、反義抑制本發(fā)明的化合物與靶核酸的雜交一般被稱為"反義"。這樣的雜交可以導(dǎo)致抑制靶核酸的翻譯，在本文中被稱為"反義抑制"。這樣的反義抑制通常是基于寡核苷酸鏈或片段的基于氫鍵的雜交，使得至少一條鏈或片段被裂解、降解或以其他方式使其無效。就此而言，目前優(yōu)選的是靶定特定的核酸分子以及它們的功能以用于這樣的反義抑制。待干擾的DNA功能可以包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。復(fù)制和轉(zhuǎn)錄可以例如來自內(nèi)源的細(xì)胞模板、載體、質(zhì)粒構(gòu)建物或其他。待干擾的RNA功能可以包括例如RNA易位到蛋白翻譯的位點(diǎn)、RNA易位到細(xì)胞內(nèi)遠(yuǎn)離RNA合成位點(diǎn)的位點(diǎn)、從RNA翻譯蛋白、拼接RNA以產(chǎn)生一種或多種RNA、以及涉及到RNA的RNA可以參與或促進(jìn)的催化活性或復(fù)合物形成的功能。在本發(fā)明的背景中，"調(diào)節(jié)"和"表達(dá)的調(diào)節(jié)"是指增加(刺激)或減少(抑制)編碼基因的核酸分子例如DNA或RNA的量或水平。抑制通常是優(yōu)選的調(diào)節(jié)表達(dá)的方式，mRNA通常是優(yōu)選的靶核酸。在本發(fā)明的背景中，"雜交"是指寡聚體化合物的互補(bǔ)鏈配對。在本發(fā)明中，優(yōu)選的配對機(jī)制涉及寡聚體化合物鏈的互補(bǔ)的核苷或核苷酸堿基(核堿基)之間的氫鍵，可以是沃森-克里克、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補(bǔ)的核堿基，通過形成氫鍵而配對。雜交可以在各種不同的條件下發(fā)生。反義化合物是在化合物與靶核酸的結(jié)合干擾了靶核酸的正常功能從而引起活性的損失時(shí)可以特異性雜交的，并且具有足夠程度的互補(bǔ)性以在特異性結(jié)合所需的條件下避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，其中特異性結(jié)合所需的條件即在體內(nèi)分析或治療性處理的情況下的生理?xiàng)l件，在體外分析的情況下的分析條件。在本發(fā)明中，詞組"嚴(yán)緊的雜交條件"或"嚴(yán)緊條件"是指本發(fā)明的化合物將與其靶序列雜交、并且只與最小量的其它序列雜交的條件。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的，在不同情況下不同，在本發(fā)明中，寡聚體化合物與靶序列雜交的嚴(yán)緊條件由寡聚體化合物的性質(zhì)和組成以及研究它們的分析方法所決定。本文使用的"互補(bǔ)"是指寡聚體化合物的兩個(gè)核堿基之間精確配對的能力。例如，如果在寡核苷酸(寡聚體化合物)的某個(gè)位置上的核堿基能夠與靶核酸的某個(gè)位置上的核堿基形成氫鍵，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么寡核苷酸與靶核酸之間形成氫鍵的位置被認(rèn)為是互補(bǔ)的位置。當(dāng)每個(gè)分子中有足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置被可以彼此形成氫鍵的核堿基所占據(jù)，則寡核苷酸與其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補(bǔ)。因此，術(shù)語"可特異性雜交"和"互補(bǔ)"是用于表明足夠數(shù)量的核堿基有足夠程度的精確配對或互補(bǔ)性，使得在寡核苷酸和靶核酸之間可以穩(wěn)定和特異的結(jié)合。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中可以理解的是，反義化合物的序列不需要與它可特異性雜交的靶核酸的序列100%互補(bǔ)。此外，寡核苷酸可以與一個(gè)或多個(gè)片段雜交，使得其間的或鄰近的片段不參與雜交事件(例如環(huán)狀結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。優(yōu)選本發(fā)明的化合物的寡核苷酸部分與靶核酸內(nèi)的靶區(qū)域具有至少70%的序列互補(bǔ)性，更優(yōu)選具有85%或90%的序列互補(bǔ)性，更加優(yōu)選與靶核酸序列內(nèi)它們靶定的靶區(qū)域具有95%的序列互補(bǔ)性。例如，本發(fā)明的化合物，其中化合物的20個(gè)核堿基中18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)，因此將特異性雜交，并代表了90%的互補(bǔ)性。在該例子中，剩余的非互補(bǔ)的核堿基可以與互補(bǔ)的核堿基成簇或分散，不必須彼此連續(xù)或與互補(bǔ)的核堿基相連。這樣，長度為18個(gè)核堿基的化合物，含有的4個(gè)非互補(bǔ)核堿基的側(cè)翼為兩個(gè)與靶核酸完全互補(bǔ)的區(qū)域，該化合物將與靶核酸具有77.8%的總體互補(bǔ)性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。化合物與耙核酸的區(qū)域的百分互補(bǔ)性常規(guī)使用本
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已知的BLAST程序(基本本地比對搜索工具)禾PPowerBLAST程序來確定(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215:403-410;Zhang等，GenomeRes.，1997，7:649-656)。對于本發(fā)明的具有羥基核堿基和/或合成的類似物(例如其它合成的核堿基)的化合物來說，互補(bǔ)性可以通過合成的類似物對具體的靶核酸的核堿基的特異性來估算。盡管反義化合物的優(yōu)選形式是單鏈反義寡核苷酸，但在許多類型中，引入雙鏈結(jié)構(gòu)例如雙鏈RNA(dsRNA)分子，已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)了基因或其相關(guān)基因產(chǎn)物功能的有力和特異的反義介導(dǎo)的降低。這種現(xiàn)象在植物和動物中都發(fā)生，據(jù)認(rèn)為與病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默具有進(jìn)化上的關(guān)聯(lián)。dsRNA可以在動物中引起基因沉默的第一個(gè)證據(jù)來自于1995年在線蟲秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中的工作(Guo等，Cell,1995,81:611-620)。Montgomery等已經(jīng)表明dsRNA的主要干擾作用是轉(zhuǎn)錄后的(Montgomery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998，95:15502-15507)。在秀麗隱桿線蟲中確定的轉(zhuǎn)錄后反義機(jī)制是由暴露于雙鏈RNA(dsRNA)引起的，此后被命名為RNA干擾(RNAi)。該術(shù)語已經(jīng)被廣義化，意指涉及引入dsRNA導(dǎo)致內(nèi)源的耙mRNA水平的序列特異性降低的反義介導(dǎo)的基因沉默(Fire等，Nature,1998,391:806-811)。最近，已經(jīng)顯示出實(shí)際上dsRNAs的反義極性的單鏈RNA寡聚體才是RNAi的有效誘導(dǎo)物(Tijsterman等，Science,2002，295:694-697)。配制本發(fā)明的化合物也可以與其它的分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、包囊、結(jié)合或以其他方式相關(guān)聯(lián)，成為例如脂質(zhì)體、載體、稀釋劑、受體定向分子、口服、直腸、局部或其它制劑，幫助攝入、分布和/或吸收。傳授了這樣的攝入、分布和/或吸收輔助制劑的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.:5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4，426，330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5，264，221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，每個(gè)專利在此引為參考。本發(fā)明的反義化合物涵蓋了任何可藥用的鹽、酉旨、或這些酯的鹽或任何其它化合物，其在給動物包括人類施用后能夠提供(直接或間接地)生物活性代謝物或其殘基。因此，例如，本公開也涉及本發(fā)明化合物的前體藥物和可藥用鹽、這些前體藥物的可藥用鹽以及其它生物等價(jià)物。術(shù)語"前體藥物"是指治療性藥劑，它以無活性的形式制備，在身體或其細(xì)胞內(nèi)通過內(nèi)源的酶或其它化學(xué)物質(zhì)和/或條件轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?即藥物)。具體來說，本發(fā)明的寡核苷酸的前體藥物形式按照Gosselin等在1993年12月9日公布的WO93/24510或Imbach等的WO94/26764和U.S.5,770,713中公開的方法制備成SATE((S乙?；?2-硫代乙基)磷酸酯)衍生物。術(shù)語"可藥用的鹽"是指本發(fā)明化合物的生理上和藥物上可接受的鹽，即保留了母體化合物的所需生物活性并且不對其產(chǎn)生不需要的毒理學(xué)效果的鹽。對于寡核苷酸來說，可藥用的鹽以及它們的應(yīng)用的優(yōu)選例子被進(jìn)一步描述在美國專利6，287，860中，在此以其全文引用。本發(fā)明還包括了含有本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以通過多種方式給藥，這依賴于所需的是局部還是全身性治療以及治療的區(qū)域。給藥可以是局部(包括眼部和粘膜包括陰道和直腸投藥)，肺部、例如通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括使用噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮、口服或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或輸注，或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥。具有至少一個(gè)2'-0-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸據(jù)認(rèn)為特別適用于口服給藥。用于局部給藥的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴物劑、液體和粉末。常規(guī)的藥物載體、水性的、粉末或油狀基料、增稠劑等可能是必需的或需要的。涂層的避孕套、手套等也可能有用?？梢苑奖愕匾詥挝粍┝啃问酱嬖诘谋景l(fā)明的藥物制劑，可以按照制藥工業(yè)中熟知的常規(guī)技術(shù)來制備。這樣的技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑進(jìn)行結(jié)合的步驟。一般來說，通過將活性成分與液體載體或分得很細(xì)的固體載體或二者進(jìn)行均勻或緊密的結(jié)合、然后如果需要的話對產(chǎn)品成型來制備制劑。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能的劑型的任何一種，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物也可以配制成在水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液還可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液也可以含有穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑、泡沫和含有脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可以含有一種或多種穿透增強(qiáng)劑、載體、賦形劑、稀釋劑或其它活性或無活性成分。乳劑通常是一種液體以通常直徑大于0.1pm的液滴形式分散在另一種液體中形成的不均質(zhì)系統(tǒng)。乳劑除了分散相之外可以含有其它成分，以及可以作為在水相、油相中的溶液或本身作為分離的相存在的活性藥物。微乳劑作為本發(fā)明的實(shí)施方案被涵蓋。乳劑以及它們的應(yīng)用在本
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中是眾所周知的，并在美國專利6,287,860中被進(jìn)一步描述，該專利在此以其全文引用。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。用于本發(fā)明中的術(shù)語"脂質(zhì)體"是指由排列成球形雙層或雙層的兩親性脂類構(gòu)成的介質(zhì)。脂質(zhì)體是單層或多層的介質(zhì)，具有從親脂性材料形成的膜和含有要投送的組合物的水性內(nèi)部。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，據(jù)認(rèn)為與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。對pH敏感或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體據(jù)認(rèn)為是捕獲DNA而不是與它復(fù)合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體都已經(jīng)被用于將DNA投送給細(xì)胞，并都可用于投送本發(fā)明的化合物。脂質(zhì)體還包括"立體穩(wěn)定的"脂質(zhì)體，該術(shù)語在本文中使用時(shí)是指含有一種或多種專門的脂類的脂質(zhì)體，該脂類當(dāng)摻入到脂質(zhì)體中時(shí)，相對于缺少該專門的脂類的脂質(zhì)體，將產(chǎn)生循環(huán)壽命增加。立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體的例子是其中脂質(zhì)體的一部分囊泡形成脂類部分含有一種或多種糖脂或者是用一種或多種親水性聚合物、例如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體以及它們的應(yīng)用在美國專利6,287,860中被進(jìn)一步描述，該專利在此以其全文引用。本發(fā)明的藥物制劑和組合物也可以含有表面活性劑。在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中使用表面活性劑在本
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中是熟知的。表面活性劑及其應(yīng)用被進(jìn)一步描述在美國專利6,287,860中，該專利在此以其全文引用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了各種不同的穿透增強(qiáng)劑來實(shí)現(xiàn)核酸、特別是寡核苷酸的有效投送。除了幫助非親脂性藥物跨細(xì)胞膜擴(kuò)散之外，穿透增強(qiáng)劑還增強(qiáng)了親脂性藥物的透過性。穿透增強(qiáng)劑可以被分類歸屬于5個(gè)大類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑，以及非螯合性非表面活性劑。穿透增強(qiáng)劑及其應(yīng)用被進(jìn)一步描述在美國專利6,287,860中，該專利在此以其全文引用。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，通常情況下制劑按照它們的計(jì)劃應(yīng)用、即給藥的途徑來設(shè)計(jì)。優(yōu)選的用于局部給藥的制劑包括其中本發(fā)明的化合物與局部投送劑例如脂類、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑混合的制劑。優(yōu)選的脂類和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油酰磷脂?；鵇OPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂?；字Ｄ憠A)、帶負(fù)電荷的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子的(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。對于局部或其它給藥來說，本發(fā)明的化合物可以包裹在脂質(zhì)體中，或可以與其、特別是陽離子脂質(zhì)體形成復(fù)合物?；蛘撸衔锟梢耘c脂類、特別是陽離子脂類復(fù)合。優(yōu)選的脂肪酸和酯、其可藥用的鹽以及它們的應(yīng)用被進(jìn)一步描述在美國專利6,287,860中，該專利在此以其全文引用。局部制劑在1999年5月20日提交的美國專利申請09/315，298中有詳細(xì)描述，該申請?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖?。用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或顆粒、微顆粒、納米顆粒、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、袋劑、片劑或小片劑?？赡苄枰龀韯?、香味劑、稀釋劑、乳化劑、分散輔助劑或粘合劑。優(yōu)選的口服制劑是其中本發(fā)明的化合物與一種或多種穿透增強(qiáng)劑表面活性劑和螯合劑結(jié)合施用的制劑。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽酸/鹽和脂肪酸以及它們的應(yīng)用被進(jìn)一步描述在美國專利6,287,860中，在此以其全文引用。還優(yōu)選穿透增強(qiáng)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。特別優(yōu)選的組合是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。其它的穿透增強(qiáng)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明的化合物可以以顆粒的形式包括噴霧干燥的顆?；驈?fù)合形成微?；蚣{米顆粒進(jìn)行口服投送。復(fù)合劑以及它們的應(yīng)用被進(jìn)一步描述在美國專利6,287,860中，該專利在此以其全文引用。口服制劑以及它們的制備詳細(xì)描述在美國專利申請09/108,673、09/315,298和10/071,822中，每個(gè)申請?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖?。用于胃腸外、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無菌的水性溶液，其還可以包含緩沖液、稀釋劑和其它適合的添加劑，例如但不限于穿透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它可藥用的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了含有一種或多種本發(fā)明的化合物以及一種或多種通過非反義機(jī)制起作用的其它化療藥劑的藥物組合物。這樣的化療劑的例子包括但不限于癌癥化療藥物例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、阿霉素、表柔比星、依達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、雙-氯乙亞硝脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光輝霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氦芥、甲基環(huán)己基亞硝脲、氮芥子氣、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FudR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙素、紅豆杉醇、長春新堿、長春花堿、依托泊甙(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓?fù)涮婵?、吉西他濱、替尼泊甙、順鉑和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物使用時(shí)，這樣的化療藥劑可以單個(gè)使用(例如5-FU和寡核苷酸)、相繼使用(例如5-FU和寡核苷酸一段時(shí)間，接著是MTX和寡核苷酸)，或與一種或多種其它這樣的化療藥劑組合使用(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放療和寡核苷酸)。抗炎藥，包括但不限于非甾醇抗炎藥和皮質(zhì)類固醇，以及抗病毒藥包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，也可以與本發(fā)明的組合物組合使用。反義化合物與其它非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種或多種組合的化合物可以一起或相繼使用。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種耙定第一種核酸的反義化合物、特別是寡核苷酸，以及一種或多種耙耙定第二種核酸的另外的反義化合物?；蛘撸景l(fā)明的組合物可以含有耙定同一個(gè)核酸靶的不同區(qū)域的兩種或多種反義化合物。大量的反義化合物的例子在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的。兩種或多種組合的化合物可以一起或相繼使用。用藥治療性組合物的制劑以及它們隨后的給藥(用藥)相信是在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)，并可以通過例如劑量-反應(yīng)、毒性和藥代動力學(xué)研究來確定。用藥取決于被治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，持續(xù)幾天到幾個(gè)月的治療過程，或直到達(dá)到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕。對于只能實(shí)現(xiàn)減輕而不能治愈的慢性疾病狀態(tài)或病癥來說，用藥可以無限期地繼續(xù)。最適的用藥方案可以根據(jù)患者體內(nèi)藥物積累的測量值來計(jì)算。普通專業(yè)技術(shù)人員可以容易地確定最適劑量、用藥方法和重復(fù)速率。最適劑量可以根據(jù)個(gè)體寡核苷酸的相對效能而變化，一般情況下可以根據(jù)在體外和體內(nèi)動物模型中被發(fā)現(xiàn)有效的ECso來估算。一般來說，劑量為每公斤體重0.01pg到100g，可以每天、每周、每月或每年給藥一次或多次，或甚至每2到20年一次。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員可以容易地根據(jù)在體液或組織中測量到的藥物滯留時(shí)間和濃度估算重復(fù)速率。在成功治療后，可能希望使患者經(jīng)歷維持治療，以防止疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持性劑量給藥，范圍在每公斤體重0.01pg到100g，每天一次或多次到每20年一次。本發(fā)明化合物的應(yīng)用本發(fā)明化合物可以在體外或體內(nèi)用于修飾細(xì)胞的表現(xiàn)型，或用于限制病原體例如病毒、細(xì)菌、原生生物、支原體物種、衣原體等的增殖，或用于在腫瘤細(xì)胞或特定類型的正常或患病細(xì)胞中誘導(dǎo)發(fā)病。因此，可以給正遭受或處于疾病狀態(tài)的生物體施用化合物。當(dāng)給生物體使用時(shí)，化合物可用于治療多種病原體引起的感染，例如產(chǎn)腸毒素的細(xì)菌、肺炎球菌(Pneumococci)、奈瑟菌屬(Neisseria)生物體、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)生物體和內(nèi)阿米巴?；衔镆部梢杂米髂[瘤細(xì)胞、例如癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性藥劑或細(xì)胞生長抑制劑。化合物可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的功能，例如特異性B細(xì)胞，特異性T細(xì)胞例如輔助性細(xì)胞、抑制性細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(C)和自然殺傷細(xì)胞(NK)。使用本發(fā)明的化合物調(diào)節(jié)免疫功能可用于治療各種不同的疾病例如癌癥和免疫系統(tǒng)疾病。可以對化合物進(jìn)行選擇，以便能夠通過涉及化合物的寡核苷酸與其靶序列結(jié)合的任何機(jī)制來干擾蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。這些機(jī)制可以包括干擾加工、抑制跨核膜的運(yùn)輸、用內(nèi)切核酸酶裂解等?；衔锏墓押塑账峥梢耘c核酸序列互補(bǔ)，例如編碼生長因子、淋巴因子、免疫球蛋白、T細(xì)胞受體位點(diǎn)、MHC抗原、DNA或RNA聚合酶、抗生素抗性、多重藥物抗性(mdr)、參與代謝過程例如氨基酸、核酸等的形成的基因的核酸序列。寡核苷酸可以與包含內(nèi)含子或與開放閱讀框架有關(guān)的側(cè)翼序列的核酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的化合物可用于治療傳染性疾病、癌癥、自身免疫疾病和與器官移植有關(guān)的病癥。在傳染性疾病的治療中，靶核酸序列包括與AIDS、CMV、皰疹、藥物抗性質(zhì)粒和錐蟲有關(guān)的基因。在癌癥治療中，靶核酸序列可以是與癌基因、腫瘤抑制基因和相關(guān)的基因有關(guān)的DNA或RNA。此外，本發(fā)明的化合物也可以靶定與藥物抗性有關(guān)的基因以及它們的基因產(chǎn)物。對于自身免疫疾病的治療來說，化合物可以例如靶定與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、系統(tǒng)性狼瘡和多發(fā)性腦硬化有關(guān)的核酸序列。正如本文公開的那樣，本發(fā)明不限于任何類型的靶基因或核苷酸序列，可用于例如任何生物體或病毒的任何基因。但是為了說明的目的，列出了下面類別的可能的靶基因發(fā)育性基因(例如粘附分子、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子、Wnt家族成員、Pax家族成員、翼狀螺旋家族成員、Hox家族成員、細(xì)胞因子/淋巴因子及其受體、生長/分化因子及其受體、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體)；癌基因(例如ABLl-GenBank登記號No.BC107069;BCLl-GenBank登記號No.NM053056;BCL2-GenBank登記號No.NM181505;BCL6-GenBank登記號No.NM138931;CBFA2-GenBank登記號No.NM001001890;CBL-GenBank登記號No.NM138392;CSF1R-GenBank登記號No.CH471062;ERBA-GenBank登記號No.NM021724;ERBB-GenBank登記號No.NM138573;ERBB2-GenBank登記號No.NM181505;ETS1-GenBank登記號No.NM005238;ETV6-GenBank登記號No.NM002336;FGR-GenBank登記號No.NM153048;FLT-GenBank登記號No.NM004119;FOS-GenBank登記號No.NM001080547;FYN-GenBank登記號No.NM016363;HCR-GenBank登記號No.NM003965;HRAS-GenBank登記號No.NM007069;SOCS6-GenBank登記號No.-NM004232;KRAS-GenBank登記號No.NM176795;LCK-GenBank登記號No.;LYN-GenBank登記號No.NM001042771;MET-GenBank登記號No.NM017956;MDM2-GenBank登記號No.NM022045;MLL-GenBank登記號No.NM012081;MYB-GenBank登記號No.NM014520;MYC-GenBank登記號No.NM032789;MYCL1-GenBank登記號No.NM001033082;MYCN-GenBank登記號No.NM005378;NRAS-GenBank登記號No.NM002524;PIM1-GenBank登記號No.;PML-GenBank登記號No.NM002648;RET-GenBank登記號No.NM020630;SRC-GenBank登記號No.NM016848;TALI-GenBank登記號No.;NM003189;TCL1-GenBank登記號No.NM021966;TLX1-GenBank登記號No.NM005521;以及YES-GenBank登記號No.NM006106);月中瘤抑制基因(例如APC-GenBank登記號No.NM000038;BRCA1-GenBank登記號No.NG005905;BRCA2-GenBank登記號No.NM007305;MADH4-GenBank登記號No.NM005359;MCC-GenBank登記號No.NM022132;NF1-GenBank登記號No.NM017940;NF2-GenBank登記號No.NM181831;RBI-GenBank登記號No.NM000321;TP53-GenBank登記號No.EF432550;以及WT1-GenBank登記號No.NM024426);酶(例如ACC合成酶和氧化酶、ACP去飽和酶和羥化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶、ATP酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、査耳酮合成酶、幾丁質(zhì)酶、環(huán)加氧酶、脫羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、粉粒結(jié)合淀粉合酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、整合酶、菊糖酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、溶菌酶、胭脂氨酸合成酶、章魚堿合成酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷酸酯酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生長調(diào)節(jié)劑合酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、普魯藍(lán)酶、重組酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RUBISCO、拓?fù)洚悩?gòu)酶和木聚糖酶)；病原性微生物的基因(例如假單胞菌屬(Pseudomonas)菌種、大腸桿菌(Escherichiacoli)、瘧原蟲屬(Plasmodium)和衣原體屬(Chlamydia));病原性病毒的基因(例如HIV、肝炎、皰疹、流感、鼻病毒、腺病毒和負(fù)鏈RNA病毒)；商業(yè)化的相關(guān)基因(例如抗體的基因、生長因子基因和激素基因)；動物病毒(例如FMDV-GenBank登記號No.DQ902653和FLV-GenBank登記號No.DQ531584);植物病毒(例如PVY-GenBank登記號No.EF470241;TMV-GenBank登記號No.AB264547;以及CMV-GenBank登記號No.NC002034)。除了結(jié)合核酸之外，本發(fā)明的化合物還可以用于結(jié)合蛋白，包括但不限于配體、受體和/或酶，由此化合物抑制了蛋白的活性。在本發(fā)明中，將反義化合物"靶定"特定的核酸分子可以是多步驟的過程。該過程通常以鑒定其功能將要被調(diào)節(jié)的靶核酸開始。該靶核酸可以是例如其表達(dá)與特定的紊亂或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來自感染性因子的核酸分子。靶定過程通常還包括在靶核酸內(nèi)確定至少一個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)，用于發(fā)生反義相互作用，從而產(chǎn)生所需的效果，例如調(diào)節(jié)表達(dá)。在本發(fā)明中，術(shù)語"區(qū)域"被定義為具有至少一種可鑒定的結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的區(qū)域內(nèi)有區(qū)段。"區(qū)段"被定義為靶核酸內(nèi)區(qū)域的較小部分或子部分。本發(fā)明中使用的"位點(diǎn)"被定義為耙核酸內(nèi)的位置。正如本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的那樣，因?yàn)榉g起始密碼子通常為5'AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)的DNA分子中為5'ATG)，因此翻譯起始密碼子也被稱為"AUG密碼子"、"起始密碼子"或"AUG起始密碼子"。少數(shù)基因具有的翻譯起始密碼子的RNA序列為5'GUG、5'UUG或5'CUG，并且5'AUA、5'ACG禾n5'CUG已經(jīng)被顯示在體內(nèi)有功能。因此，術(shù)語"翻譯起始密碼子"和"起始密碼子"可以包含許多密碼子序列，即使是每種情況下起始的氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中還已知真核和原核的基因可以具有兩個(gè)或多個(gè)可選的起始密碼子，其中的任何一個(gè)在特定的細(xì)胞類型或組織中、或在特定的條件設(shè)置下可優(yōu)選被用于翻譯起始。在本發(fā)明中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"是指在體內(nèi)用于啟動從編碼白介素18的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯的密碼子，不論這樣的密碼子的序列如何。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中還已知基因的翻譯終止密碼子(或"終止密碼子")可以具有三個(gè)序列之一，即5'UAA、5'UAG和5'UGA(相應(yīng)的DNA序列分別為5'TAA、5'TAG和5'TGA)。術(shù)語"起始密碼子區(qū)"和"翻譯起始密碼子區(qū)"是指所述mRNA或基因中的一部分，其包含了從翻譯起始密碼子向任一方向(即5'或3')的大約25到大約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。類似地，術(shù)語"終止密碼子區(qū)"和"翻譯終止密碼子區(qū)"是指所述mRNA或基因中的一部分，其包含了從翻譯終止密碼子向任一方向(即5'或3')大約25到大約50個(gè)連續(xù)的核苷酸。因此，"起始密碼子區(qū)"(或"翻譯起始密碼子區(qū)")和"終止密碼子區(qū)"(或"翻譯終止密碼子區(qū)")是可以用本發(fā)明的反義化合物有效靶定的所有區(qū)域。開放閱讀框架(ORF)或"編碼區(qū)"，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知是指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可以被有效靶定的區(qū)域。在本發(fā)明中，優(yōu)選的區(qū)域是涵蓋了基因的開放閱讀框架(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。其它的靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)(5'UTR)，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知是指mRNA在5'方向上從翻譯起始密碼子開始的部分，因此包含了在mRNA的5'帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)，以及3'非翻譯區(qū)(3'UTR)，在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知是指mRNA在3'方向上從翻譯終止密碼子開始的部分，因此包含了mRNA的翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5'帽位點(diǎn)含有N7-甲基化鳥嘌呤殘基，與mRNA的最靠5'-端殘基通過5'-5'三磷酸酯鍵連接。mRNA的5'帽區(qū)域被認(rèn)為包含了5'帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽位點(diǎn)相鄰的前50個(gè)核苷酸。靶定5'帽區(qū)域也是優(yōu)選的。盡管某些真核mRNA轉(zhuǎn)錄本是直接翻譯的，但很多含有一個(gè)或多個(gè)被稱為"內(nèi)含子"的區(qū)域，它們在翻譯前從轉(zhuǎn)錄本中切除了。剩余的(因此是被翻譯的)區(qū)域被稱為"外顯子"，它們被剪接在一起形成了連續(xù)的mRNA序列。在疾病牽涉異常剪接或疾病中涉及過量生產(chǎn)的特定剪接產(chǎn)物的情況下，靶定剪接位點(diǎn)，即內(nèi)含子-外顯子接點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子接點(diǎn)，可能是特別有用的。由于重排或缺失導(dǎo)致的異常的融合接點(diǎn)也是優(yōu)選的耙位點(diǎn)。通過來自不同基因來源的兩個(gè)(或多個(gè))mRNA的剪接過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本被稱為"融合轉(zhuǎn)錄本"。已知可以使用靶定例如DNA或前mRNA的反義化合物來有效靶定內(nèi)含子。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知可以從DNA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生可選的RNA轉(zhuǎn)錄本。這些可選的轉(zhuǎn)錄本一般被稱為"變異體"。更具體來說，"前mRNA變異體"是從同樣的基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本，它們與從同樣的基因組DNA產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄本的差別在于它們的起始或終止位置，并含有內(nèi)含子和外顯子序列。在剪接過程中切除了一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)或其部分之后，前mRNA變異體產(chǎn)生了較小的"mRNA變異體"。因此，mRNA變異體是加工過的前mRNA變異體，并且作為剪接的結(jié)果，每個(gè)獨(dú)特的前mRNA變異體必定總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變異體。這些mRNA變異體也被稱為"可選的剪接變異體"。如果不發(fā)生前mRNA變異體的剪接，那么前mRNA變異體與mRNA變異體相同。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知變異體可以通過使用可選的信號起始或終止轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生，并且前mRNA和mRNA可以具有一個(gè)以上的起始密碼子或終止密碼子。源于使用可選的起始密碼子的前mRNA或mRNA的變異體被稱為前mRNA或mRNA的"可選的起始變異體"。使用了可選的終止密碼子的轉(zhuǎn)錄本被稱為該前mRNA或mRNA的"可選的終止變異體"。一種特定類型的可選終止變異體是"聚腺苷酸變異體"，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本來自于轉(zhuǎn)錄機(jī)制對"聚腺苷酸終止信號"之一的可選的選擇，由此產(chǎn)生了在獨(dú)特的聚腺苷酸位點(diǎn)處終止的轉(zhuǎn)錄本。在本發(fā)明中，本文描述的變異體的類型也是優(yōu)選的靶核酸。靶核酸上與優(yōu)選的反義化合物雜交的位點(diǎn)在后文被稱為"優(yōu)選的耙區(qū)段"。在本文中使用的術(shù)語"優(yōu)選的靶區(qū)段"被定義為至少是活性反義化合物靶定的靶區(qū)域的5-核堿基部分。盡管不希望被理論束縛，但目前認(rèn)為這些靶區(qū)段代表了靶核酸中允許雜交的部分。盡管在本文中提出了某些優(yōu)選靶區(qū)段的具體序列，但本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，它們用于在本發(fā)明的范圍內(nèi)說明和描述具體的實(shí)施方案。其它優(yōu)選的靶區(qū)段可以由普通的專業(yè)技術(shù)人員來鑒定。長度為5-150個(gè)核堿基的靶區(qū)段，含有選自說明性的優(yōu)選靶區(qū)段內(nèi)的至少5個(gè)連續(xù)核堿基的一段序列，也被認(rèn)為適合用作靶。耙區(qū)段可以包含的DNA或RNA所含有的至少5個(gè)連續(xù)核堿基來自說明性的優(yōu)選靶區(qū)段之一的5'末端(其余的核堿基是同樣的DNA或RNA中連續(xù)的一段，從緊接耙區(qū)段的5'末端上游開始直到DNA或RNA含有大約5到大約150個(gè)核堿基為止)。同樣優(yōu)選的靶區(qū)段由含有來自說明性優(yōu)選靶區(qū)段之一的3'末端的至少5個(gè)連續(xù)核堿基的DNA或RNA代表(其余的核堿基是同樣的DNA或RNA的連續(xù)一段，從緊接耙區(qū)段3'末端的下游開始直到DNA或RNA含有大約5到大約150個(gè)核堿基為止)。本
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的專業(yè)人員在本文說明的優(yōu)選靶區(qū)段的指導(dǎo)下，能夠無需過多的實(shí)驗(yàn)就鑒定其它優(yōu)選的靶區(qū)段。一旦鑒定到一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)后，就合成與靶充分互補(bǔ)、即足夠好并具有足夠特異性的雜交以給出所需的效果的反義化合物，并摻入至少一個(gè)與靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)的序列中的核堿基互補(bǔ)的羥基核堿基，并進(jìn)一步摻入本文描述的螯合部分。然后將反義化合物與金屬離子接觸，使離子與化合物復(fù)合。該產(chǎn)生的化合物然后可用于反義療法機(jī)制中。試劑盒和診斷工具本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療、預(yù)防和作為研究試劑和試劑盒。此外，能夠以極高的特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸，通常被專業(yè)技術(shù)人員用于闡述特定基因的功能或用于辨別生物途徑的各個(gè)成員的功能。對于試劑盒和診斷應(yīng)用來說，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)地或與其它化合物或治療方法組合，作為工具用在差異和/或組合分析中以說明細(xì)胞或組織中表達(dá)的基因的部分或全部互補(bǔ)鏈的表達(dá)模式。作為一個(gè)非限制性的例子，將用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織中的表達(dá)模式與沒有用反義化合物處理的對照細(xì)胞或組織進(jìn)行比較，并分析產(chǎn)生的模式中基因表達(dá)水平的差異，以將它們與例如所研究的基因的疾病相關(guān)性、信號傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能相統(tǒng)屬。這些分析可以在被刺激的或未刺激的細(xì)胞上進(jìn)行，在存在或不存在影響表達(dá)模式的其它化合物的情況下進(jìn)行。在本
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中已知的基因表達(dá)分析方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo，F(xiàn)EBSLett"2000，480:17-24;Celis等，F(xiàn)EBSLett.,2000，480:2-16)、SAGE(基因表達(dá)的連續(xù)分析)(Madden等，DrugDiscov.Today,2000,5:415-425)、READS(消化的cDNAs的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar禾BWeissman，MethodsEnzymol.，1999,303:258-72)、TOGA(總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000，97:1976-81)、蛋白陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis等，F(xiàn)EBSLett.,2000，480:2-16;Jungblut等，Electrophoresis,1999，20:2100-10)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測序(Celis等，F(xiàn)EBSLett"2000，480:2-16;Larsson等，J.Biotechnol,，2000,80:143-57)、差減RNA指紋(SuRF)(Fuchs等，Anal.Biochem.，2000,286:91-98;Larson等，Cytometry,2000，41:203-208)、差減克隆、差異顯示(DD)(Jurecic和Belmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3:316-21)、比較基因組雜交(Carulli等，J.CellBiochem.Suppl.，1998,31:286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going等Gusterson,Eur.J.Cancer,1999,35:1895-904)禾口質(zhì)譜方法(To,Comb.Chem.HighThroughputScreen,2000，3:235-41)。反義的特異性和靈敏性也被本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員用于治療性應(yīng)用。反義化合物已經(jīng)在動物包括人類中的疾病狀態(tài)治療中被用作治療性部分。反義寡核苷酸藥物，包括核酶，已經(jīng)被安全有效地用于人類，有大量的臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確立了反義化合物可以是有用的治療模式，它們可以被構(gòu)造成可用于治療方案中，以治療細(xì)胞、組織和動物，特別是人類。對于治療來說，懷疑患有可以通過調(diào)節(jié)靶核酸的表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病患的對象，優(yōu)選為人類，可以通過施用本發(fā)明的反義化合物來治療。例如，在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，方法包括了給需要治療的對象施用治療有效量的反義化合物的步驟。本發(fā)明的化合物可以通過將有效量的化合物加入到適合的可藥用稀釋劑或載體中來用于藥物組合物中。本發(fā)明的化合物和方法的使用也可以是在預(yù)防上有用的。參考下面的實(shí)施例，本公開的其它方面和詳細(xì)情況將變得更加明顯，這些實(shí)施例的目的是說明性的而不是限制性的。實(shí)施例合成帶有修飾核苷酸的寡核苷酸GCAGCCAAAACGTCCN(SEOIDNO:1)或CCTTCGN(N=5-OH56dC)(SEOIDNO:5)的合成使用與合成5-羥基胞苷5'-二磷酸所述類似的過程合成5-羥基-2'-脫氧胞苷5'-三磷酸。將25mg(45pmo1)dCTP(作為鈉鹽)溶解在200W水中，然后冷卻到4°C。將溴在劇烈混合下緩慢加入到dCTP溶液中，直到出現(xiàn)持續(xù)的黃色。為了除去過量的溴，振蕩下加入7nl環(huán)己烯，然后加入O.lml2,4,6-三甲基吡啶。將乳濁液在37。C溫育大約2小時(shí)，然后用乙醚(4x0.5ml)抽提。將水層在真空下蒸發(fā)，重新溶解在水中，并上樣于DEAE-SephadexA-25柱(大約80ml，HCCV形式)。使用pH7.5-8的三乙基碳酸氫銨(TEAB)的線性梯度(5mM到0.8M)，將含有三磷酸的級份從柱子上洗脫下來。將含有核苷三磷酸混合物的級份合并，用50。/。乙醇蒸發(fā)幾次以除去TEAB。首先使用在pH7.5的20mMTris-HCl緩沖液中從5mMto0.7M的NaCl線性梯度，以及最后使用pH3.5的從5mM到0.7M的磷酸鈉緩沖液線性梯度，在MonoQ柱上將5-OHdCTP進(jìn)一步純化兩次。收集5-OHdCTP的峰，用水稀釋，并重新上樣于DEAEsephadexA-25柱(2.5ml，HCCV形式)。將柱子用0.1M碳酸氫銨清洗以除去鹽，然后用0.6M的碳酸氫銨洗脫5-OHdCTP。通過用50%乙醇重復(fù)地蒸發(fā)來除去碳酸氫銨。5-OHdCTP的產(chǎn)率為大約25-30%。摩爾吸收率^=7700(X,=292nm)](15)被用于計(jì)算5-OHdCTP的量。以修改過的以前描述的方法制備含有單個(gè)內(nèi)部5-OhdC的寡核苷酸。將1至'J2.5nmol的GCAGCCAAAACGTCC(SEQIDNO:2)或CCTTCG(SEQIDNO:3)在65nl緩沖液中于30°C溫育30分鐘，該緩沖液含有100mM二甲胂酸鈉pH7.0、1mMCoCl2、O.lmMEDTA、50|ig/mlBSA、0.1mMDTT、10lpM5-OHdCTP禾B100單位的末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶。然后將從3'-末端以單個(gè)5-OHdCMP延伸的寡核苷酸，在PartisphereSAX柱子(0.4x12.5cm，Whatman)上使用含有25%乙腈的pH6.3的磷酸鈉緩沖液的線性梯度(在60分鐘內(nèi)從5mM到0.5M)進(jìn)行HPLC純化。使用NEP-5柱(Pharmacia)對純化的延伸的寡核苷酸GCAGCCAAAACGTCCN(SEQIDNO:4)或CCTTCGN(SEQIDNO:5)(N=5-0hdC或5-0hdU)進(jìn)行脫鹽。合成稀土金屬復(fù)合物以及它們與寡核苷酸的結(jié)合物材料環(huán)拉胺(cyclam，Aldrich，98%)，4-氯甲基苯甲酸(Aldrich，95%)，三氟乙基乙酸(Aldrich，99%)，N-羥基琥珀酰亞胺(Aldrich，97%)，l-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(Sigma,蛋白測序級)，三氟甲磺酸銪(Aldrich,98%)，三氟甲磺酸鑭(Aldrich,99.999%)，粒度為60-200jim孔徑為4nm的硅膠(AcrosOrganics,USA)，粒度為40-125|im容量為3-4m叫/g的SephadexG-25(Sigma-Aldrich)。合成4-q,4,8.11-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基V苯甲酸在溶解在乙醇水混合物(體積比為5:1)中的環(huán)拉胺(0.913g，4.5mmol)溶液(18ml)中，加入溶解在水性LiOH(53mg在4ml水)中的4-氯甲基苯甲酸(0.157g，0.92mmol)溶液。然后將混合物攪拌并劇烈回流5小時(shí)。然后減壓除去溶劑，將殘余物溶解在13ml水中。然后將獲得的水溶液用氯仿抽提(10次，每次3ml)，并在減壓下將水層濃縮到2ml。通過加入濃鹽酸和乙醇溶液將產(chǎn)物沉淀為白色固體，并通過重結(jié)晶從乙醇/水/HCl中純化，產(chǎn)生0.205g標(biāo)題化合物。根據(jù)LC-MS，4-(l,4,8，ll-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸鹽酸鹽的分析大于95%。合成4-(4,8,11-丁^-(2,2,2-三氟乙?；?-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四-1-基甲基V苯甲酸在用氬氣吹掃的雙頸圓底燒瓶中相繼加入4-(l,4，8,ll-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸(90mg，0.24mmol)、無水甲醇(lml)、無水三乙胺(0.5ml)和三氟乙酸乙酯(1.7ml)。所有下面的步驟都在氬氣氛下進(jìn)行。將混合物攪拌60小時(shí)。在減壓除去溶劑后，將殘余物收集到無水四氫呋喃(5ml)中。將THF溶液過濾，在減壓下除去溶劑。將殘余物在真空中干燥4小時(shí)，產(chǎn)生0.54g油狀化合物。MSm/z623.5M[C24H27F9N405]+1。合成4"4,8,11-1^5-(2,2,2-三氟乙?；?-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四-1-基甲基)-苯甲酸2.5-二氧代吡咯烷-1-基酯含有4-(4,8，11-1^8-(2,2，2-三氟乙?；?-1，4,8，11-四氮雜環(huán)十四-1-基甲基)-苯甲酸(0.54g)的燒瓶用氬氣吹掃，并相繼加入無水THF(1.2ml)、N-羥基琥珀酰亞胺(28mg，0.24mmo1)和l-(3-二甲基氨基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(51.6mg，0.27mmo1)。將該混合物在氬氣下于室溫?cái)嚢?0小時(shí)。然后減壓除去溶劑，將殘余物溶解在最小量的氯仿中，并通過硅膠柱。產(chǎn)物用氯仿:甲醇(50:1)洗脫。在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮和真空干燥后，收集的4-(4，8，11-1^3-(2，2，2-三氟乙?；?-1，4,8，11-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸2，5-二氧代吡咯垸-1-基酯為白色的固體物質(zhì)，產(chǎn)量為70mg。產(chǎn)物的LC-MS光譜證實(shí)了主要級份的質(zhì)量為721[M(C28H30F9N5O7)+l]，給出了質(zhì)量為623的片段[(M-C2F30)+1]。檢測的次要級份(~1%)為MSm/z855.7[M(C38H40F6N6O10)+l]制造4-(4,8,11-1^8-(2,2,2-三氟乙?；?-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四-1-基甲基〗-苯甲酸2.5-二氧代吡咯烷-l-基酯的La和Eu復(fù)合物的一般程序?qū)⒌饶?20(imol)的4-(4,8,11-丁1^-(2,2,2-三氟乙酰基)-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸2,5-二氧代吡咯垸-1-基酯與三氟甲磺酸鑭La(CF3S03)3或Eu(CF3S03)3在無水乙醇(2ml)中的混合物，在氬氣氛下于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后減壓除去溶劑，將殘余物用乙腈(0.5ml)收集。加入乙醚(0.7ml)后，將混合物在冷凍器中保持48小時(shí)，過濾，然后在真空下干燥，產(chǎn)生淡黃色固體的4-(4,8,11-1^8-(2,2,2-三氟乙酰基)-l，4，8，ll-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-l-基酯的La和Eu復(fù)合物。其它配體的合成可以使用已知的合成技術(shù)來制備。參見例如美國專利No.6,984,734、6，127，121和5,684,149，每個(gè)專利在此以其全文引為參考。4-(4,8,1l-Tris-(2,2,2-三氟乙?；?1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四-l-基甲基)-苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-l-基酯的La和Eii復(fù)合物與寡核苷酸的結(jié)合合成了兩種不同修飾的20mer寡核苷酸5'-CTTCTGGCCGTTTACGTCGN-3'(N:5-OH陽C或C)(SEQIDNO:6)。將每種寡核苷酸大約10nmol溶解在300200mM的NaHC03溶液中。然后將獲得的溶液加入到四氮雜大環(huán)的鑭系元素復(fù)合物(0.64mg)在二噁垸(200pL)的溶液中。將獲得的混合物在室溫劇烈攪拌3小時(shí)。然后將混合物通過裝配在磷酸鹽緩沖液(pH6.86)中的SephadexG-25柱子(1.5x5.5cm)。產(chǎn)物用同樣的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集總共15毫升提取物中的最后13毫升，在室溫下將體積真空減小到大約0.5ml。體外活性測量鑭和銪復(fù)合的化合物的活性通過將靶核酸(例如5'-GCGACGTAAACGGCCAGAAG-3，(SEQIDNO:7))的溶液與每種復(fù)合的化合物在模擬人類生理?xiàng)l件(例如溫度和鹽條件)的條件下進(jìn)行混合來測量。將化合物和靶核酸混合并使其相互作用。從混合物取出等份試樣并分析靶核酸的存在或降解。計(jì)算靶核酸的量。靶核酸的降解速度與鑭和銪復(fù)合的化合物的核酸酶活性直接相關(guān)。摻有羥基-核酸的寡核苷酸5'-CTTCTNNCCNTTTACNTCNC-3，(N=G或8-OHG)(SEQIDNO:8)的穩(wěn)定性使用T4多核苷酸激酶將一系列寡核苷酸在多核苷酸鏈的5'-末端用35S-oATP進(jìn)行標(biāo)記。使用PharmaciaPD10凝膠過濾柱將標(biāo)記的寡核苷酸純化并與游離的標(biāo)記35S-oATP分離。寡核苷酸的比活性在0.05-0.2pC一g寡核苷酸之間。將標(biāo)記的寡核苷酸(l-10nM)在pH7.5的5mMHEPES緩沖液中溫育，緩沖液含有100nMKCl和80%胎牛血清，在37。C溫度下溫育指定的時(shí)間。在指定的時(shí)間間隔從反應(yīng)混合物中取出等份試樣，用含有0.05%溴酚藍(lán)、0.05%二甲苯青、7M尿素和0.5xTBE緩沖液的上樣染料稀釋5倍。降解的寡核苷酸使用20%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。從凝膠中切出條帶，使用Wallac微型P閃爍計(jì)數(shù)器對放射活性進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用的方案描述在Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.禾口Sambrook，J.的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》中(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.1082。結(jié)果證實(shí)了在寡核苷酸中摻入羥基核堿基的穩(wěn)定性截然不同(圖1)。圖1中的圖注對應(yīng)于天然寡聚體(SEQIDNO:8，其中所有的N是G)和具有一個(gè)(l-修飾；5，-CTTCTNGCCGTTTACGTCGC-3，；SEQIDNO:9;N=8-OHG)、兩個(gè)(2-修飾；5，-CTTCTNGCCNTTTACGTCGC-3，;SEQIDNO:10;N=8-OHG)和三個(gè)(3-修飾;5，-CTTCTNGCCNTTTACGTCNC-3，；SEQIDNO:11;N=8-OHG)的寡聚物。牢固結(jié)合的互變異構(gòu)體的存在略微增加了相應(yīng)的核酸雙鏈體的熔解溫度。其中所有的N是G的SEQIDNO:8正常雙鏈體的熔解溫度測量為67±2°C。相反，具有兩個(gè)8-羥基鳥嘌呤取代(SEQIDNO:10)的同樣的寡聚體的熔解溫度是71±2°C。使用摻入了8-羥基鳥嘌呤的寡核苷酸進(jìn)行RNA降解制備了"S標(biāo)記的和未標(biāo)記的、編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)的正義和反義RNA，用于RNA降解的體外監(jiān)測。eGFP被克隆到pCR3.1表達(dá)載體中，在兩個(gè)方向正義和反義方向上置于T7RNA聚合酶啟動子的控制之下。使用T7RNA聚合酶"S-標(biāo)記的核糖核苷三磷酸，采用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外合成正義和反義的cGPFRNA。為了進(jìn)行本分析，將等量的35S標(biāo)記的RNA與不同濃度的與eGFP互補(bǔ)的寡核苷酸溫育。寡核苷酸有零個(gè)(SEQIDNO:8)或一個(gè)摻入的8-羥基鳥嘌呤(SEQIDNO:9)。將天然的和修飾的寡核苷酸都與已知具有核糖核酸酶活性的鑭系元素復(fù)合。將RNA與寡核苷酸在37。C保溫1小時(shí)。然后在1%瓊脂糖凝膠電泳上分析RNA。凝膠通過放射自顯影可視化，切下RNA條帶、水解、并用Wallac閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。定量的結(jié)果顯示在圖2中，描繪了仍然殘留的未降解的RNA的量。圖2中的1禾口3柱顯示了將eGFPRNA與分別摻有10nM和5pM8-羥基鳥嘌呤的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物溫育的結(jié)果。圖2的2禾卩4柱顯示將eGFPRNA與分別含有10和5pM天然鳥嘌呤的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物溫育的結(jié)果。圖2的5和6柱呈現(xiàn)了沒有加入寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物的對照實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地顯示出，具有一個(gè)修飾的寡核苷酸與靶eGFPRNA形成了更穩(wěn)定的復(fù)合物，并增加了它的降解(較之1和2柱與3和4柱)。在5^M時(shí)，含有單個(gè)8-羥基鳥嘌呤修飾的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物顯示出了核酸酶活性，而含有天然鳥嘌呤的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物實(shí)際上沒有顯示出核酸酶活性。鑭系元素-寡核苷酸復(fù)合物引起的RNA降解的分析。eGFPRNA與正常的或修飾的20個(gè)核苷酸長的與eGFP互補(bǔ)的寡核苷酸一起溫育。溫育在37。C進(jìn)行1小時(shí)。在該實(shí)驗(yàn)中，使用了未標(biāo)記的RNA，結(jié)果使用1%瓊脂糖凝膠通過電泳進(jìn)行分析。通過溴化乙錠染色使凝膠上的RNA可視化。圖3顯示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。上方的凝膠顯示了與未修飾的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物U,4，8,ll-四氮雜環(huán)十四基銪與SEQIDNO:8的復(fù)合物)保溫后eGFPRNA的降解，下方的凝膠是修飾的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物(1,4，8,11-四氮雜環(huán)十四基銪與SEQIDNO:9的復(fù)合物)，其中寡核苷酸具有單個(gè)變?yōu)榱u基核堿基的修飾。上方和下方凝膠上的道如下l.分子量和核酸大小標(biāo)記物；2.的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物；3.IOmM的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物；4.5/xM的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物；5.5MM的寡核苷酸-鑭系元素復(fù)合物；6.對照(正義RNA);7.對照(反義RNA)。圖3中顯示的結(jié)果表明，具有修飾的寡核苷酸在與鑭系元素的復(fù)合物中更穩(wěn)定和有活性。引用的文獻(xiàn)所有這里列出的文檔以其傳授的材料、方法和程序引為參考。美國專利文獻(xiàn)Cook等，"Substitutedpurinesandoligonucleotidecross-linking"(取代的嘌呤和寡核苷酸交聯(lián))美國專利No.6,232,463，2001年5月15曰。Froehler等，"Enhancedtriple-helixanddouble-helixformationdirectedbyoligonucleotidescontainingmodifiedpyrhnidines"(含有修飾的嘧啶的寡核苷酸指導(dǎo)的增強(qiáng)三螺旋和雙螺旋形成)美國專利No.6,235,887;2001年5月22日。Iyer,"Reagentsandprocessforsynthesisofoligonucleotidescontainingphosphorodithioateinternucleosidelinkages"(合成含有核苷間二硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸的試劑和方法)美國專利No.6,117,992;2000年9月12日。Meyer,Jr.等，"Oligonucleotidescontainingpyrazolo[3,4-D]pyrimidinesforhybridizationandmismatchdiscrimination"(含有吡唑[3，4-D]嘧啶的寡核苷酸用于雜交和錯(cuò)配鑒別)美國專利No.6，127，121;2000年10月3日。Morrow,"MetalcomplexesforpromotingcatalyticcleavageofRNAbytransesterification"(通過轉(zhuǎn)酯作用促進(jìn)RNA的催化裂解的金屬復(fù)合物)美國專利No.5，684，149;1997年11月4日。Short,"Modifiednucleotidesandmethodsusefulfornucleicacidsequencing"(可用于核酸測序的修飾的核苷酸和方法)美國專利No.6,579,704，2003年6月17日。Switzer，"Antisenseoligonucleotidecontainingcompositionsandmethodofformingduplexes"(含有反義寡核苷酸的組合物以及形成雙鏈體的方法)美國專利No.6,031,086，2000年2月29日。Haner等，"Functionalterpyridine-metalcomplexes,aprocessforthepreparationthereofandoligonucleotideconjugateswithterpyridine-metalcomplexes"(功能性三嘧啶-金屬復(fù)合物、其制備方法以及寡核苷酸與三嘧啶-金屬復(fù)合物的結(jié)合物)美國專利No.5,925,744，1999年7月20曰。Switzer,"Antisenseoligonucleotidescomprising5-aminoalkylpyrimidinenucleotides"(含有5-氨基垸基嘧啶核苷酸的反義寡核苷酸)美國專利No.5,596,091，1997年1月21日。Wang等，"Sugarmodifiednucleosidesandoligonucleotides"(糖修飾的核苷和寡核苷酸)美國專利No.5,681,940;1997年10月28日。其它出版物BakerB.F.等，Oligonucleotide-europiumcomplexconjugatedesignedtocleavethe5'capstructureoftheICAM-1transcriptpotentiatesantisenseactivityincells,(被設(shè)計(jì)用于裂解ICAM-1轉(zhuǎn)錄本的5'-帽結(jié)構(gòu)的寡核苷酸-銪復(fù)合結(jié)合物增強(qiáng)了細(xì)胞中的反義活性)Nucl.AcidRes"1999,27:1547-1551.BingZhua等，Binuclearlanthanidecomplexesascatalystsforthehydrolysisofdouble-strandedDNA，(雙核鑭系元素復(fù)合物作為水解雙鏈DNA的催化劑)Inorg.Chem.Communs.，1999，2:351-353.Canaple,L.等，ArtificialRibonucleases:EfficientandSpecificinVitroCleavageofHumanc-raf-1RNA，(人工核糖核酸酶在體外有效和特異性裂解人類c-raf-lRNA)BioconjugateChem.2002，13:945-951.CrookeST.Progressinantisensetherapeutics.(反義療法的進(jìn)展)Med.Res.Rev.1996;16:319-344.Crooke,S.T.禾口Lebleu,B."AntisenseResearchandApplications",(反義研究與應(yīng)用)CRCPress(1993).HeggE丄；Burstyn,J丄；Towardthedevelopmentofmetal-basedsyntheticnucleasesandpeptidases:arationaleandprogressreportinapplyingtheprinciplesofcoordinationchemistry,(開發(fā)基于金屬的合成的核酸酶和肽酶在配位化學(xué)原理的應(yīng)用中的理論基礎(chǔ)和進(jìn)展報(bào)告)Coord.Chem.Revs.1998，173:133-165.Hall,J;HiiskenD;Pieles，U.，Moser，H.E.;HSner，R,Efficientsequence-specificcleavageofRNAusingnoveleuropiumcomplexesconjugatedtooligonucleotides",(使用與寡核苷酸結(jié)合的新的銪復(fù)合物對RNA進(jìn)行有效的序列特異性裂解)Chemistry&Biology,1994，1:185-190.HallJ.;HuskenD.;HanerR.,Sequence-specificcleavageofRNAusingmacrocycliclanthanidecomplexesconjugatedtooligonucleotides:Astructureactivitystudy,(使用與寡核苷酸結(jié)合的大環(huán)鑭系元素復(fù)合物進(jìn)行RNA的序列特異性裂解結(jié)構(gòu)活性研究)Nucleosides&Nucleotides,1997,16:1357-1368,HallJ.;HuskenD.;HanerR.，Towardsartificialribonucleases:Thesequence-speci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中生物體是人類或動物對象。26.權(quán)利要求23的方法，其中接觸包括將化合物與含有靶核酸的生物樣品進(jìn)行混合。27.權(quán)利要求22-26任一項(xiàng)的方法，其中雜交誘導(dǎo)了靶核酸的裂解。28.權(quán)利要求l-18任一項(xiàng)的化合物在制造用于抑制人類或動物對象中靶核酸翻譯的藥物中的應(yīng)用。29.權(quán)利要求22或28的方法或應(yīng)用，其中靶核酸是mRNA。30.權(quán)利要求22-29任一項(xiàng)的方法，其中化合物裂解靶核酸的鍵。31.權(quán)利要求25或28的方法或應(yīng)用，其中人類或動物對象患有病毒感染、細(xì)菌感染、微生物感染、真菌感染或癌癥。32.在生物體中抑制核酸翻譯的方法，包括預(yù)測或測定生物體中靶核酸的核苷酸序列；以及給生物體施用權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)的組合物，其中化合物含有核苷酸序列，其中在生物體的生理?xiàng)l件下，所述化合物與其在生物體中雜交的耙核酸的核苷酸序列充分互補(bǔ)，從而抑制核酸的翻譯。33.權(quán)利要求28-32任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用，其中化合物的核苷酸序列與靶核酸的核苷酸序列的全部或一部分完全互補(bǔ)。34.制造在生物體的生理?xiàng)l件下抑制生物體的核酸翻譯的化合物的方法，包括a)確定靶核酸的核苷酸序列；b)合成含有與寡核苷酸連接的螯合部分的化合物，所述寡核苷酸含有與耙核酸的至少部分核苷酸序列充分互補(bǔ)從而允許發(fā)生雜交的核苷酸序列，其中寡核苷酸含有5到150個(gè)核堿基，并且其中寡核苷酸的至少一個(gè)核堿基是選自5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥嘌呤、8-巰基腺嘌呤、5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤的修飾核堿基；以及c)將所述化合物與金屬離子混合，所述金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、軋、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。35.權(quán)利要求34的方法，其中修飾的核堿基是羥基核堿基，并選自5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥嘌呤。36.權(quán)利要求34或35的方法，其中螯合部分選自下式。其中R是寡核苷酸，W和R3獨(dú)立地選自氫、CL8垸烴、C2-8烯烴、C2V炔烴、?；鵔.s烷烴、環(huán)垸基、雜環(huán)垸基、芳基、雜芳基、d—8垸基芳基和C,.8烷基雜芳基；以及其中R2獨(dú)立地選自d.8垸基、C2-8烯烴、C2-s炔烴、芳基、雜芳基、Cl8焼基芳基、dV烷基雜芳基和?；鵆L8烷烴。37.權(quán)利要求34-36任一項(xiàng)的方法，其中所述條件包括人類生理?xiàng)l件。全文摘要本發(fā)明提供了具有螯合部分和寡核苷酸序列的化合物，其中寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核堿基，例如羥基核堿基。所公開的化合物適合用于反義療法。螯合部分可以與鑭系金屬的離子復(fù)合。這些化合物是有效的核酸翻譯抑制劑，對靶核酸有的結(jié)合親和性增加。本發(fā)明也包含組合物以及使用這些組合物進(jìn)行反義治療的方法。文檔編號A61K31/7115GK101437943SQ200780015898公開日2009年5月20日申請日期2007年4月26日優(yōu)先權(quán)日2006年5月3日發(fā)明者梅伊斯·皮爾維,馬特·薩爾瑪,馬蒂·卡拉爾森申請人:波羅的科技發(fā)展有限公司