專(zhuān)利名稱(chēng)：含萃取物的可攝取的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以下意外發(fā)現(xiàn)錦葵和黃櫨萃取物在攝取后，能夠有效地提高皮膚、泌尿生殖器、血管壁、粘膜組織的彈性以及降低甘油三酯和尿酸水平。
發(fā)明概述 一方面，本發(fā)明提供一種可攝取的組合物，該組合物包含黃櫨萃取物和錦葵萃取物。
另一方面，本發(fā)明提供一種在有需要的哺乳動(dòng)物中提高皮膚、血管壁、泌尿生殖組織或粘膜組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性的方法，該方法包括由該哺乳動(dòng)物攝取包含黃櫨萃取物、錦葵萃取物或其混合物的組合物。
另一方面，本發(fā)明提供一種在有需要的哺乳動(dòng)物中降低甘油三酯水平的方法，該方法包括由該哺乳動(dòng)物攝取包含黃櫨萃取物、錦葵萃取物或其混合物的組合物。
通過(guò)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。
發(fā)明詳述 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的描述，利用本發(fā)明至其全部的范圍。以下的具體實(shí)施方式
僅僅是示例，并不在任何方面限定公開(kāi)內(nèi)容。
除非有限定，在此使用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所述領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常理解一致。同時(shí)在此提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利或其它參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用而被納入本申請(qǐng)。除非另有說(shuō)明，百分比指重量百分比(即％(W/W))。
定義 術(shù)語(yǔ)“提高彈性或結(jié)構(gòu)完整性”指增加組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性，或防止組織彈性或結(jié)構(gòu)完整性損失或延緩其損失，包括但不限于，治療下垂、松弛的組織以及緊致和增強(qiáng)組織，所述組織包括皮膚、粘膜組織、泌尿生殖組織和血管。
彈性或組織結(jié)構(gòu)完整性喪失可能是許多因素導(dǎo)致的結(jié)果，包括但不限于疾病、老化、激素改變、機(jī)械創(chuàng)傷、環(huán)境破壞、或是對(duì)組織施用產(chǎn)品(例如化妝品或藥物)的結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)“降低甘油三酯或尿酸”分別指降低血清甘油三酯(“TG”)或血清和/或尿中的尿酸(“UA”)水平，或防止其水平升高。
體內(nèi)甘油三酯或尿酸水平升高可能是許多因素導(dǎo)致的結(jié)果，包括但不限于疾病、老化、激素改變、環(huán)境破壞、遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)失衡等。
“粘膜組織”指表達(dá)彈性蛋白的組織，部分地由間充質(zhì)細(xì)胞和上皮來(lái)源的細(xì)胞構(gòu)成。粘膜組織的例子包括但不限于陰道、口腔、角膜、鼻腔、直腸和內(nèi)臟彈性組織。內(nèi)臟彈性組織的例子是位于呼吸道、血管壁、胃腸道、尿道、膀胱和生殖道內(nèi)壁的組織。
術(shù)語(yǔ)“泌尿生殖組織”是膀胱、泌尿道和生殖道組織，包括但不限于陰道、陰蒂、外生殖器、子宮、膀胱和尿道。
術(shù)語(yǔ)“管壁”是用于血液或淋巴液全身轉(zhuǎn)運(yùn)的循環(huán)系統(tǒng)管壁，包括但不限于動(dòng)脈和靜脈。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)品”是最終包裝形式的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，包裝是諸如包含組合物的塑料、金屬或玻璃瓶或罐的容器，或用于容納單位劑量的組合物的“泡罩包裝”。產(chǎn)品可還具有其他包裝，例如用于儲(chǔ)存容器的塑料或厚紙板盒子。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品包括指導(dǎo)使用者攝取組合物(例如，出于本文所提及的目的)的說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)可印刷在容器上、標(biāo)簽插片上或任何其他包裝上。
術(shù)語(yǔ)“推廣”指推廣、廣告或營(yíng)銷(xiāo)。推廣的例子包括但不限于產(chǎn)品上 或商店、雜志、報(bào)紙、廣播、電視、英特網(wǎng)等途徑的書(shū)面、視覺(jué)或語(yǔ)言說(shuō)明。這些說(shuō)明的例子包括但不限于“提高皮膚彈性或結(jié)構(gòu)完整性”、“改善皮膚視覺(jué)或觸覺(jué)表現(xiàn)”、“增加皮膚彈性或結(jié)構(gòu)”、“恢復(fù)皮膚彈性或結(jié)構(gòu)”、“治療皮膚松弛下垂”、“提高陰道彈性”、“提高性滿意度”、“增加陰道彈性”、“恢復(fù)陰道彈性”、“增強(qiáng)陰道壁”、“預(yù)防或治療陰道脫垂”、“減少失禁發(fā)作”、“增強(qiáng)膀胱壁”、“改善膀胱順應(yīng)性”、“增強(qiáng)牙齦彈性”、“增加牙齦彈性”、“恢復(fù)牙齦彈性”、“增強(qiáng)肺泡壁彈性”、“增加肺泡壁彈性”、“增強(qiáng)牙齦健康外觀”、“恢復(fù)肺泡壁彈性”、“降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)”、“降低胰腺炎風(fēng)險(xiǎn)”、“降低胰腺炎”、“降低血栓癥風(fēng)險(xiǎn)”、“緩解血栓癥”、“減少C-反應(yīng)性蛋白(CRP)”、“降低收縮期和舒張期血壓”、“緩解組織水腫”、“緩解痛風(fēng)”、“緩解腫瘤溶解綜合征”、“減緩或逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的代謝綜合征”、“減緩或逆轉(zhuǎn)疾病相關(guān)的代謝綜合征”、“提高管壁強(qiáng)度”、“改善脆弱皮膚”、“減少挫傷”和“減少炎癥細(xì)胞外滲”。
如本文所用，“可攝取的組合物”表示預(yù)期該組合物能夠攝取?？蓴z取的組合物劑型的例子包括但不限于片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、溶液劑或混懸劑和滴劑?？蓴z取的組合物不包括預(yù)期將局部應(yīng)用于皮膚或口腔、陰道或直腸腔的組合物。
如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”表示該術(shù)語(yǔ)所描述的成分適合攝取而沒(méi)有異常毒性、不相容性、不穩(wěn)定、刺激性、過(guò)敏反應(yīng)等。
如本文所用，“安全和有效量”指足以誘導(dǎo)所需效應(yīng)但又足夠低以避免嚴(yán)重副作用的萃取物或組合物的量?；衔?、萃取物或組合物的安全有效量將根據(jù)以下因素而變化最終使用者的年齡、健康和環(huán)境接觸，治療的持續(xù)時(shí)間和性質(zhì)，采用的具體萃取物、成分或組合物，所采用的具體藥學(xué)上可接受的載體等。
錦葵萃取物 術(shù)語(yǔ)“錦葵萃取物”指從歐錦葵植物分離的化合物的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物分離自該植物的花。在另一個(gè)實(shí)施方式中，化合物分離自該植物的干花。化合物可通過(guò)物理摘除一株植物，由一個(gè)或多個(gè)植株部分分離得到(例如，全植株、植株的花、種子、根、根莖、莖、果實(shí)和/或葉)，例如研磨植物的花?；衔镆部刹捎帽绢I(lǐng)域公知的萃取方法從植物萃取(例如，用有機(jī)溶劑如C1-C8低級(jí)醇、C1-C8烷基多元醇、C1-C8烷基酮、C1-C8烷基醚、乙酸C1-C8烷基酯和氯仿，和/或無(wú)機(jī)溶劑如水、無(wú)機(jī)酸如鹽酸、無(wú)機(jī)堿如氫氧化鈉)。在一個(gè)實(shí)施方式中，歐錦葵萃取物只包含親水化合物(例如，用親水溶劑如水或乙醇分離的化合物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，歐錦葵萃取物是來(lái)自花的水性萃取物。在一個(gè)實(shí)施方式中，歐錦葵萃取物是取歐錦葵的花，使其干燥成粉末，任選地再重新構(gòu)建至在最終的組合物中的期望濃度并任選地過(guò)濾后得到的水性萃取物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，萃取物在組合物(例如丸劑)中的含量約為0.5-500毫克，具體約為10-250毫克。除非另有說(shuō)明，萃取物的重量指萃取物的干重。
黃櫨萃取物 術(shù)語(yǔ)“黃櫨萃取物”指從黃櫨植物分離的化合物的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，化合物分離自該植物的葉。在另一個(gè)實(shí)施方式中，化合物分離自該植物的干葉?；衔锟赏ㄟ^(guò)物理摘除一株植物，由一個(gè)或多個(gè)植株部分分離得到(例如，全植株、植株的花、種子、根、根莖、樹(shù)皮、樹(shù)木、莖、果實(shí)和/或葉)，例如研磨植物的根?；衔镆部刹捎帽绢I(lǐng)域公知的萃取方法從植物萃取(例如，用有機(jī)溶劑如C1-C8低級(jí)醇、C1-C8烷基多元醇、C1-C8烷基酮、C1-C8烷基醚、乙酸C1-C8烷基酯和氯仿，和/或無(wú)機(jī)溶劑如水、無(wú)機(jī)酸如鹽酸、無(wú)機(jī)堿如氫氧化鈉)。在一個(gè)實(shí)施方式中，黃櫨萃取物只包含親水化合物(例如，用親水溶劑如水或乙醇分離的化合物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，歐錦葵萃取物是來(lái)自葉的水性萃取物。在一個(gè)實(shí)施方式中，黃櫨萃取物是取黃櫨的葉，使其干燥成粉末，任選地再重新構(gòu)建至在最終的組合物中的期望濃度并任選地過(guò)濾后得到的水性萃取物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，萃取物在組合物(例如丸劑)中的含量約為0.5-500毫克，具體約為10-250毫克。除非另有說(shuō)明，萃取物的重量指萃取物的干重。
其他萃取物 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包含一種或多種從選自以下的植物萃取的萃取物母菊(Matricaria chamomilla)、百里香(Thymus vulgaris)、歐百里香(Thymus serpyllum)、熊果(Arctostaphylos uva-ursi)和洋甘菊(Matricariarecutita)。在一個(gè)實(shí)施方式中，萃取物在組合物(例如丸劑)中的含量約為0.5-500毫克，具體約為10-250毫克。除非另有說(shuō)明，萃取物的重量指萃取物的干重。
可攝取的組合物 本發(fā)明中使用的可攝取的組合物涉及適合需要這種治療的哺乳動(dòng)物如人攝取的制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包含安全有效量的(i)歐錦葵萃取物和/或黃櫨萃取物，和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可攝取的組合物每劑型單位如片劑、膠囊、粉末劑、注射劑、一茶匙量等包含如上所述能遞送有效量萃取物的劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述可攝取的組合物每劑型單位如片劑、膠囊、粉末劑、一茶匙量等包含約1毫克到約5克，例如約50毫克到約500毫克，遞送劑量約1毫克/公斤/天到約1克/公斤/天，例如約50到約500毫克/公斤/天。然而，劑型也可根據(jù)患者的需求、治療的疾病的嚴(yán)重性以及所采用的萃取物而變化?？刹捎妹刻旖o藥或周期性給藥。優(yōu)選地，這些組合物的是單位劑量形式，例如片劑、丸劑、膠囊、粉末劑、顆粒劑、溶液劑或混懸劑、和滴劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物是片劑形式，包含1、5、10、25、50、100、150、200、250、500和/或1000毫克萃取物，根據(jù)治療患者的癥狀調(diào)節(jié)劑量。以每天1-4次的給藥方案給予萃取物。優(yōu)選地，組合物可每天一次給藥，或者將全天劑量分成每天兩次、三次或四次給藥。
最佳給藥劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，根據(jù)所采用的具體萃取物、給藥模式、制劑強(qiáng)度、和治療的疾病/病癥的進(jìn)程而變化。此外，與特定治療患者有關(guān)的因素，包括患者年齡、體重、飲食、給藥時(shí)間導(dǎo)致需要調(diào)節(jié)劑量。
包含一種或多種本文所述的本發(fā)明萃取物的可攝取組合物可根據(jù)常規(guī)藥物化合技術(shù)將萃取物與藥學(xué)上可接受的載體充分混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。載體可以是各種形式，取決于制劑的類(lèi)型。因此，對(duì)于液體制劑如混懸劑、酏劑和溶液劑，合適的載體和添加劑包括但不限于水、乙二醇、醇、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、著色劑等；對(duì)于固體制劑如粉末劑、膠囊和片劑，合適的載體和添加劑包括淀粉、糖、稀釋劑、顆粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。也可用諸如糖或腸衣的物質(zhì)對(duì)固體口服制劑進(jìn)行包衣以調(diào)節(jié)主要的吸收部位。
為制備固體組合物如片劑，將原料萃取物與藥學(xué)上可接受的載體如常規(guī)壓片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹(shù)膠，以及其他藥學(xué)上可接受的稀釋劑如水進(jìn)行混合，以形成包含萃取物的均質(zhì)混合物的固體預(yù)配制組合物。這些預(yù)配制組合物是均質(zhì)的描述是指萃取物均勻分散在整個(gè)組合物中，使組合物可容易地再細(xì)分成相等的有效劑量形式如片劑、丸劑和膠囊。然后，固體預(yù)配制組合物再細(xì)分成上述單位劑量形式?？蓪?duì)新組合物的片劑或丸劑進(jìn)行包衣或化合，提供能夠?qū)崿F(xiàn)延長(zhǎng)作用優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者包封前者。兩種組分可由腸衣分離，阻止胃內(nèi)崩解并允許內(nèi)部組分原封不動(dòng)地通過(guò)十二指腸或延遲釋放?？墒褂枚喾N材料作為腸衣或包衣，這些材料包括各種聚合酸，如蟲(chóng)膠、十六醇和醋酸纖維素。
包含本發(fā)明新型組合物的液體劑型包括但不限于水性和/或有機(jī)(例如乙醇)溶液劑、適當(dāng)調(diào)味的糖漿劑、水性混懸劑、調(diào)味的乳劑和酏劑以及類(lèi)似的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。水性混懸劑合適的分散劑或助懸劑包括合成和天然樹(shù)膠如西黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物還包含營(yíng)養(yǎng)成分。合適的營(yíng)養(yǎng)成分可以是植物萃取物、天然和合成分子、礦物質(zhì)和/或其混合物的形式。營(yíng)養(yǎng)成分的例子包括但不限于蛋白質(zhì)、維生素(例如類(lèi)維生素A及各種形式的生育酚)、礦物質(zhì)(例如鋅、鐵或硒)、抗氧化劑(例如抗壞血酸鹽、番茄紅素或胡蘿卜素)、蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸(例如ω-3脂肪酸)、石榴和綠茶的萃取物以及酚類(lèi)化合物如白藜蘆醇。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，采用合適的已知和普遍接受的細(xì)胞和/或動(dòng)物模型的體內(nèi)和體外試驗(yàn)?zāi)軌蝾A(yù)測(cè)萃取物治療或預(yù)防給定疾病的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，根據(jù)臨床和藥物領(lǐng)域公知的方法可完成在在健康患者和/或患有給定疾病或紊亂的患者中的人臨床試驗(yàn)(包括第一次的人臨床試驗(yàn))，劑量范圍和效力試驗(yàn)。
實(shí)施例1-萃取物制備 下面描述了本發(fā)明各種萃取物的制備。如下面的實(shí)施例中所用，萃取物的重量百分比指液體萃取物的重量。
A歐錦葵萃取物制備. 歐錦葵(干燥全花)購(gòu)自印第安納州霍巴特的生物選擇公司(BotanicChoice，Hobart，IN)或保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)。將10克全花置于200毫升冷水中，在密閉容器中煮沸。出現(xiàn)煮沸氣泡后，將容器立即從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后用紗布過(guò)濾萃取物，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
或者，將10克全花加入200毫升冷水中，室溫下將混合物攪拌約1-12小時(shí)來(lái)制備歐錦葵萃取物。然后，如上所述過(guò)濾萃取物。
或者，將10克全花加入200毫升冷水中，然后將混合物在密閉容器中煮沸來(lái)制備歐錦葵萃取物。出現(xiàn)煮沸氣泡后，將容器立即從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)。此后，向萃取物中加入乙醇至最終濃度為占總的混合物體積的約45％。將萃取物在室溫下再繼續(xù)儲(chǔ)存1-12小時(shí)，同時(shí)攪拌。萃取物可直接使用或如上所述過(guò)濾。
或者，如上所述制備歐錦葵萃取物并干燥。在氦燈下完成蒸發(fā)，干燥溫度100℃。然后將所得干燥的花用水重新懸浮至原始濃度(“重新構(gòu)建的歐錦葵”)。過(guò)濾包括使液體通過(guò)0.22微米的濾器(來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司)。采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為1.40％的固體。
B黃櫨萃取物制備 黃櫨全草(干燥全葉)購(gòu)自保加利亞索菲亞的比爾可庫(kù)伯公司(Bilkokoop，Sofia，Bulgaria)。將10克全葉置于100毫升冷水中，在密閉容器中煮沸，沸騰持續(xù)5分鐘。然后立即將容器從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后用紗布過(guò)濾萃取物，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
或者，黃櫨萃取物可通過(guò)干燥如上所述制備的萃取物來(lái)制備。在氦燈下完成蒸發(fā)，干燥溫度100℃。然后將所得干燥的粉末用水重新懸浮至原始濃度(“重新構(gòu)建的黃櫨”)。過(guò)濾包括使液體通過(guò)0.22微米的濾器(來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司)。采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為2.39％的固體。
C母菊萃取物制備 母菊全草(干燥全花)購(gòu)自保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)。洋甘菊全草(干燥全花)購(gòu)自印第安納州霍巴特的生物選擇公司(Botanic Choice，Hobart，IN)。將10克全花置于200毫升冷水中，在密閉容器中煮沸。出現(xiàn)煮沸氣泡后，將容器立即從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后用紗布過(guò)濾萃取物，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
或者，母菊萃取物可通過(guò)干燥如上所述制備的萃取物來(lái)制備。在氦燈下完成蒸發(fā)，干燥溫度100℃。然后將所得干燥的粉末用水重新懸浮至原始濃度(“重新構(gòu)建的母菊”)。過(guò)濾包括使液體通過(guò)0.22微米的濾器(來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司)。采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為2.07％的固體。
D熊果萃取物制備 熊果全草(干燥全葉)購(gòu)自保加利亞索菲亞的比爾可庫(kù)伯公司(Bilkokoop，Sofia，Bulgaria)。將10克全葉置于100毫升冷水中，在密閉容器中煮沸，沸騰持續(xù)5分鐘。然后立即將容器從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后用紗布過(guò)濾萃取物，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
或者，熊果萃取物可通過(guò)干燥如上所述制備的萃取物來(lái)制備。在氦燈下完成蒸發(fā)，干燥溫度100℃。然后將所得干燥的粉末用水重新懸浮至原始濃度(“重新構(gòu)建的熊果”)。過(guò)濾包括使液體通過(guò)0.22微米的濾器(來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司)。采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為3.08％的固體。
E歐百里香萃取物制備 歐百里香全草(干燥的莖)購(gòu)自保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)。將10克全草置于200毫升冷水中，在密閉容器中煮沸。出現(xiàn)煮沸氣泡后，將容器立即從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后將萃取物過(guò)濾通過(guò)紗布，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
或者，歐百里香萃取物可通過(guò)干燥如上所述制備的萃取物來(lái)制備。在氦燈下完成蒸發(fā)，干燥溫度100℃。然后將所得干燥的粉末用水重新懸浮至原始濃度(“重新構(gòu)建的歐百里香”)。過(guò)濾包括使液體通過(guò)0.22微米的濾器(來(lái)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司)。采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為2.38％的固體。
F全草組合萃取物的制備 歐錦葵全草(干燥全花)購(gòu)自保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)或印第安納州霍巴特的生物選擇公司(Botanic Choice，Hobart，IN)。母菊全草(干燥全花)購(gòu)自保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)。洋甘菊購(gòu)自印第安納州霍巴特的生物選擇公司。歐百里香全草(干燥的莖)購(gòu)自保加利亞托巖的拜萊克公司(Bilek，Troyan，Bulgaria)。黃櫨全草(干燥全葉)購(gòu)自保加利亞索菲亞的比爾可庫(kù)伯公司(Bilkokoop，Sofia，Bulgaria)。百里香全草(干燥的莖)購(gòu)自加利福尼亞州蘭喬科多瓦的西部新星植物公司(Starwest Botanicals，Rancho Cordova，CA)。將如表1、2和3所示含量的全草置于250毫升冷水中，在密閉容器中煮沸。出現(xiàn)煮沸氣泡后，將容器立即從熱源取下，加蓋，室溫下儲(chǔ)存約1-12小時(shí)，偶爾攪拌。然后將萃取物過(guò)濾通過(guò)紗布，手動(dòng)擠干多余液體以使萃取物產(chǎn)率最大化。萃取物可直接使用或在真空下通過(guò)22微米的250毫升過(guò)濾器(購(gòu)自明尼蘇達(dá)州羅徹斯特的納吉公司(Nalgene，Rochester，NY))進(jìn)一步過(guò)濾。
采用HR73水分分析器(俄亥俄州哥倫布的梅特勒-托倫脫公司(Mettler-Toledo，Columbus，OH))以30秒的時(shí)間間隔定量蒸發(fā)的水分，測(cè)定如上所述制備的萃取物的干燥組分約為2％的固體。
表1 表2 表3 或者，可分別制備各個(gè)全草萃取物(例如，如實(shí)施例1A-1E中所述)，然后以期望的比例合并在一起(“合并的萃取物”)。
實(shí)施例2-提高彈性蛋白啟動(dòng)子活性 大鼠心臟成肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自弗吉尼亞州馬納薩斯的ATCC。將培養(yǎng)物維持在補(bǔ)充10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英吉生命技術(shù)公司(Invitrogen lifetechnologies，Carlsbad，CA))的達(dá)爾伯克氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM，加利福尼亞州卡爾斯巴德的英吉生命技術(shù)公司(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA))中。
用彈性蛋白啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告子構(gòu)建物(Elp2.2，2.2個(gè)kb的nt-2267到nt+2的彈性蛋白啟動(dòng)子片段，驅(qū)動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因，購(gòu)自威斯康星州麥迪遜的普羅米加公司(Promega，Madison WI))來(lái)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物。DNA通過(guò)Qiagen Maxi柱(加利福尼亞州巴倫西亞的奎阿納公司(Qiagen Valencia，CA))制備。在所有轉(zhuǎn)染中，具有胸苷激酶啟動(dòng)子和Renilla熒光素酶報(bào)告基因(pRL-TK，威斯康星州麥迪遜的普羅米加公司(Promega，Madison WI))的構(gòu)建物用作內(nèi)標(biāo)。將細(xì)胞以4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到24-孔板(紐約州康寧的康寧公司(Corning Incorporated，Corning，NY))，在不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，達(dá)到80-90％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通常，用Lipofectamine2000(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英吉生命技術(shù)公司(Invitrogen life technologies，Carlsbad，CA))以每孔0.8微克DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后一天，用指定濃度的藥劑處理細(xì)胞約48小時(shí)后，裂解細(xì)胞并根據(jù)生產(chǎn)商的方案，用來(lái)自威斯康星州麥迪遜的普羅米加公司的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶分析。簡(jiǎn)言之，采用加利福尼亞州桑尼維爾的分子設(shè)備公司的(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)的分光光度計(jì)LMAX，先測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶活性(表示彈性蛋白啟動(dòng)子活性)，再測(cè)定renilla熒光素酶(內(nèi)標(biāo))。這兩種熒光素酶活性之比(RLU)用于評(píng)價(jià)每種啟動(dòng)子的活性。
用各種劑量的歐錦葵萃取物(實(shí)施例1A)、黃櫨萃取物(實(shí)施例1B)、母菊萃取物(實(shí)施例1C)、熊果萃取物(實(shí)施例1D)、歐錦葵/母菊/歐百里香萃取物(實(shí)施例1F)、歐錦葵/母菊/黃櫨(實(shí)施例1F)或歐錦葵/洋甘菊/百里香萃取物(實(shí)施例1F)處理細(xì)胞，評(píng)價(jià)萃取物誘導(dǎo)彈性蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)的作用。將萃取物加入轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞中，孵育48小時(shí)。如表4所示，觀察到與未處理的細(xì)胞相比，萃取物劑量越高，彈性蛋白啟動(dòng)子活性越高。本實(shí)施例表明，每種萃取物單獨(dú)或組合使用能夠提高彈性蛋白的產(chǎn)生。
表4 實(shí)施例3-免受彈性蛋白酶降解的保護(hù)作用 人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HLE)購(gòu)自密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，St.Louis，MO)，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，加利福尼亞州卡爾斯巴德的英吉生命技術(shù)公司(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA))中以1單位/毫升的濃度重新構(gòu)建。用BODIPY FL染料標(biāo)記的可溶性牛頸部韌帶彈性蛋白購(gòu)自俄勒岡州尤金的分子探針有限公司(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR))，偶聯(lián)時(shí)熒光淬滅，而在彈性蛋白酶消化時(shí)激活。將人白細(xì)胞彈性蛋白酶(0.0625U/ml)、彈性蛋白底物(25μg/ml)和濃度增加的試驗(yàn)化合物在室溫下孵育1小時(shí)。采用來(lái)自加利福尼亞州桑尼維爾的分子設(shè)備公司的(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)的熒光讀板儀，在490nm激發(fā)光和520nm發(fā)射光處測(cè)量熒光每次測(cè)量減去僅有底物的背景熒光。
試驗(yàn)中將根據(jù)實(shí)施例1B制備的兩批黃櫨萃取物進(jìn)行平均，將數(shù)據(jù)與未添加萃取物的對(duì)照進(jìn)行比較。黃櫨萃取物以劑量依賴(lài)性方式抑制HLE活性，如表5所示。低達(dá)0.01％的黃櫨萃取物導(dǎo)致HLE活性降低約60％，而0.1％的萃取物幾乎完全抑制彈性蛋白酶活性。本實(shí)施例表明，黃櫨萃取物能夠保護(hù)彈性蛋白纖維免于破壞和降解。
表5 也評(píng)價(jià)了實(shí)施例1B重新構(gòu)建的黃櫨萃取物的HLE活性(表6)。重新構(gòu)建的黃櫨萃取物能夠以劑量依賴(lài)性方式抑制HLE活性，其活性類(lèi)似于原始黃櫨萃取物(表5)。
表6 實(shí)施例4-免受胰蛋白酶降解的保護(hù)作用 胰蛋白酶(HLE)購(gòu)自密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，St.Louis，MO)，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，加利福尼亞州卡爾斯巴德的英吉生命技術(shù)公司(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA))中以2000單位/毫升的濃度重新構(gòu)建。用BODIPY FL染料標(biāo)記的酪蛋白購(gòu)自俄勒岡州尤金的分子探針有限公司(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR))，偶聯(lián)時(shí)熒光淬滅，而在蛋白酶消化時(shí)激活。將胰蛋白酶(500U/ml)、酪蛋白(10μg/ml)和濃度增加的試驗(yàn)化合物在室溫下孵育2小時(shí)。采用來(lái)自加利福尼亞州桑尼維爾的分子設(shè)備公司的(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)的熒光讀板儀，在485nm激發(fā)光和538nm發(fā)射光處測(cè)量熒光。每次測(cè)量減去僅有底物的背景熒光。
試驗(yàn)中將根據(jù)實(shí)施例1B制備的兩批黃櫨萃取物進(jìn)行平均，將數(shù)據(jù)與未添加萃取物的對(duì)照進(jìn)行比較。黃櫨萃取物以劑量依賴(lài)性方式抑制胰蛋白酶活性，如表7所示。低達(dá)0.02％的黃櫨萃取物導(dǎo)致胰蛋白酶活性降低約35％，而0.1％的萃取物導(dǎo)致胰蛋白酶活性下降約61％。本實(shí)施例表明，黃櫨萃取物能夠保護(hù)阻止免受蛋白酶解破壞和降解，因而維持組織完整性。
表7 實(shí)施例5-免受基質(zhì)金屬蛋白酶降解的保護(hù)作用 人巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶(HME，也稱(chēng)為基質(zhì)金屬蛋白酶-12，MMP-12)和熒光標(biāo)記的底物購(gòu)自明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的R&D系統(tǒng)(R&D systems，Minneapolis，MN))。熒光在底物中淬滅，一旦彈性蛋白酶消化而激活。將HME(100ng/ml)、底物(10μg/ml)和濃度增加的試驗(yàn)化合物在室溫下孵育1小時(shí)。采用來(lái)自加利福尼亞州桑尼維爾的分子設(shè)備公司的(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)的熒光讀板儀，在320nm激發(fā)光和405nm發(fā)射光處測(cè)量熒光。每次測(cè)量減去僅有底物的背景熒光。
試驗(yàn)中將根據(jù)實(shí)施例1B制備的兩批黃櫨萃取物進(jìn)行平均，將數(shù)據(jù)與未添加萃取物的對(duì)照進(jìn)行比較。黃櫨萃取物以劑量依賴(lài)性方式抑制HME活性，如表8所示。低達(dá)0.01％的黃櫨萃取物導(dǎo)致HME活性降低約40％，而0.5％的萃取物幾乎完全抑制HME活性。本實(shí)施例表明，黃櫨萃取物能夠保護(hù)彈性蛋白纖維免于破壞和降解。
表8 在相同的試驗(yàn)中測(cè)試根據(jù)實(shí)施例1A制備的錦葵萃取物，數(shù)據(jù)與不添加萃取物的對(duì)照進(jìn)行比較。錦葵萃取物以劑量依賴(lài)性方式抑制HME活性，如表9所示。低達(dá)0.6％的錦葵萃取物導(dǎo)致HME活性降低約23％，而5％的萃取物抑制HME活性80％。本實(shí)施例表明，錦葵萃取物能夠保護(hù)彈性蛋白纖維免于破壞和降解。
表9 在相同的試驗(yàn)中測(cè)試根據(jù)實(shí)施例1D制備的熊果萃取物，數(shù)據(jù)與不添加萃取物的對(duì)照進(jìn)行比較。熊果萃取物以劑量依賴(lài)性方式抑制HME活性，如表10所示。低達(dá)0.01％的熊果萃取物導(dǎo)致HME活性降低約10％，而0.5％的萃取物抑制HME活性90％。本實(shí)施例表明，熊果萃取物能夠保護(hù)彈性蛋白纖維免于破壞和降解。
表10 實(shí)施例6-通過(guò)可攝取的治療提高小鼠膀胱、皮膚和血管壁中的彈性蛋白纖維網(wǎng)絡(luò) 5周齡的C57BL/6雌性小鼠購(gòu)自紐約州日耳曼敦的塔卡尼格公司 (Taconic Farms(Germantown，NY))。將小鼠飼養(yǎng)在適當(dāng)大小的籠子中，控制籠子中的環(huán)境12小時(shí)白天/12小時(shí)黑夜光周期，自由進(jìn)食和水。將動(dòng)物馴化3周后開(kāi)始試驗(yàn)。給予動(dòng)物特殊的酪蛋白基飲食(低異黃酮含量的5K96，購(gòu)自印第安納州里士滿的試驗(yàn)飼料公司(TestDiet，Richmond，IN)，并在一起飼養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)同步動(dòng)情周期。馴化后，口服給予200毫升實(shí)施例1E(表3)的未過(guò)濾的萃取混合物，每天一次，一周5天(星期一到星期五)。處理12周后的皮膚和膀胱樣品用于組織學(xué)分析。
用可攝取的治療進(jìn)行處理3個(gè)月后，對(duì)膀胱和皮膚樣品進(jìn)行彈性蛋白纖維的組織學(xué)分析。意外地，觀察到與對(duì)照相比(表11)，用萃取物處理的小鼠膀胱和皮膚中彈性蛋白纖維具有以下分級(jí)正常(對(duì)照)-+；稍微增加-++；顯著增加-+++。
表11 可攝取的治療再繼續(xù)兩個(gè)月，對(duì)開(kāi)始處理后22周的膀胱和皮膚樣品進(jìn)行組織學(xué)分析其彈性蛋白纖維。意外地，觀察到與對(duì)照和第12周的結(jié)果相比，用萃取物處理的小鼠的膀胱和皮膚中的彈性蛋白纖維甚至更高。
也評(píng)價(jià)了膀胱區(qū)段內(nèi)的血管周?chē)膹椥缘鞍桌w維。如表12所示，與對(duì)照相比，處理小鼠膀胱血管中及其周?chē)膹椥缘鞍桌w維密度顯著增加。22周處理結(jié)果如表12所示。
表12 實(shí)施例7-可攝取的治療對(duì)全身健康參數(shù)的改善 也測(cè)試了如實(shí)施例6所述處理的小鼠中小鼠血漿甘油三酯和尿酸水平的作用。開(kāi)始處理后3個(gè)月，通過(guò)吸入異氟烷氣體使小鼠鎮(zhèn)靜，心臟穿刺收集血液。如表13所示，與對(duì)照相比，用選定天然萃取物處理的小鼠血清中觀察到甘油三酯水平顯著降低。
表13 測(cè)定如上所述分離的小鼠血清中的尿酸血漿水平。如表14所示，與對(duì)照相比，開(kāi)始處理后12周用選定天然萃取物處理的小鼠血漿中觀察到尿酸水平顯著降低。
可攝取的治療再繼續(xù)2個(gè)月，通過(guò)吸入異氟烷氣體使小鼠鎮(zhèn)靜，心臟穿刺收集血液。如表14所示，與對(duì)照相比，用天然萃取物處理的小鼠血漿中觀察到尿酸水平顯著降低。12周和22周治療的結(jié)果如表14所示。
表14 應(yīng)理解，雖然結(jié)合具體說(shuō)明描述了本發(fā)明，但上述說(shuō)明旨在闡釋而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)所限定。其他方面、優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)也在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種可攝取的組合物，所述組合物包含黃櫨萃取物和歐錦葵萃取物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含母菊萃取物。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
5.一種在有需要的哺乳動(dòng)物中提高皮膚、泌尿生殖組織、血管壁或粘膜組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性的方法，所述方法包括由所述哺乳動(dòng)物攝取包含選自黃櫨萃取物、歐錦葵萃取物的萃取物及其混合物的組合物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括提高皮膚的彈性或結(jié)構(gòu)完整性。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括提高膀胱組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括提高陰道組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性和功能。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括提高血管壁組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性和功能。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述組合物包含黃櫨萃取物和歐錦葵萃取物。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含母菊萃取物。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
14.一種在需要這種處理的哺乳動(dòng)物中降低甘油三酯或尿酸水平的方法，所述方法包括由所述哺乳動(dòng)物攝取包含選自黃櫨萃取物、歐錦葵萃取物的萃取物及其混合物的組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括降低甘油三酯的量。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括降低尿酸的量。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述組合物包含黃櫨萃取物和歐錦葵萃取物。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含母菊萃取物。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含一種或多種選自下組的萃取物熊果萃取物、百里香萃取物、歐百里香萃取物和洋甘菊萃取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含黃櫨萃取物和/或歐錦葵萃取物的可攝取的組合物，及其在提高皮膚、泌尿生殖組織、血管壁或粘膜組織的彈性或結(jié)構(gòu)完整性，和/或降低甘油三酯或尿酸水平中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101460184SQ200780018473
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月23日
發(fā)明者M·塞伯格, V·I·斯通, R·趙, E·布魯寧 申請(qǐng)人:強(qiáng)生消費(fèi)者公司