專利名稱：：在結(jié)腸癌治療中的前胃泌素抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：在66%的病例中，人類結(jié)腸的腫瘤發(fā)生涉及腫瘤抑制劑基因腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)的或在P-連接素基因中的體細(xì)胞突變(由下列參考文獻(xiàn)計(jì)算的平均值(Conlin等人，2005;DeFilippo等人，2002;Huang等人，1996;Johnson等人，2005;Kim等人，2003;Luchtenborg等人，2005;Mikami等人，2006;Morin等人，1997;Powell等人，1992;Rowan等人，2000;Segditsas和Tomli勵(lì)n,2006;Shitoh等人，2004;Smith等人，2002;Sparks等人，1998;S腦weera等人，2006;Takayama等人，2001))。這些突變被認(rèn)為是在散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中發(fā)生的結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件。，c基因中的生殖細(xì)胞突變也響應(yīng)于家族性結(jié)腸息肉病，一種與腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的遺傳綜合癥。這些突變導(dǎo)致粘著連接蛋白P-連接素的細(xì)胞質(zhì)庫的缺陷性調(diào)控，引起Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路的組成性激活。該組成性激活引起諸如c-myc或細(xì)胞周期蛋白Dl的Tcf4目標(biāo)基因的高水平轉(zhuǎn)錄。該通路的另一可能目標(biāo)是編碼前胃泌素激素原的GAST基因。已顯示該基因的轉(zhuǎn)錄在體外(3-連接素/Tcf4復(fù)合體的激活后被增加(Koh等人，2000)。前胃泌素在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用首先在約15年前被提出，當(dāng)前胃泌素在結(jié)直腸腫瘤提取物中被發(fā)現(xiàn)時(shí)(Finley等人，1993;Kochman等人，1992;Nemeth等人，1993)，和當(dāng)前胃泌素的血漿水平被顯示為在約75%的患有結(jié)直腸腫瘤的患者中升高時(shí)，而在對照中未^^測到(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。基于這些觀察，前胃泌素能與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)的理論已經(jīng)在體外和體內(nèi)被研究。研究首先顯示，甘氨酸延長型胃泌素(前胃泌素成熟產(chǎn)物之一)對增殖起陽性效果(Hollande等人，1997;Koh等人，1999;Litvak等人，1999;Singh等人，1994;Stepan等人，1999)。同時(shí)顯示，在肝臟中的前胃泌素的過量表達(dá)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的有絲分裂發(fā)生，而其形成較小的肽在肝臟中不能發(fā)生(wang等人，1996)。所述相同的轉(zhuǎn)基因小鼠被用以證明前胃泌素的過量表達(dá)誘導(dǎo)氧化偶氮曱烷誘導(dǎo)的癌發(fā)生的敏感性(Singh等人，2000)。然而，當(dāng)敲除胃泌素基因也誘導(dǎo)相同的癌發(fā)生敏感性被顯示時(shí)，所述觀測被挑戰(zhàn)(Cobb等人，2002)。然而，前胃泌素的增殖效果被進(jìn)一步在體外用大鼠腸細(xì)胞系IEC6證明(Brown等人，2003)，并在體內(nèi)用受控于fabp啟動(dòng)子的顯示前胃泌素的腸過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中證明(Cobb等人，2004)。然而，所述小鼠模型的主要缺點(diǎn)是，前胃泌素在腸上皮細(xì)胞的分化細(xì)胞中，而不在增殖細(xì)胞中被過量表達(dá)。在2003和2005年，Ottewell等人提供數(shù)據(jù)，其關(guān)于在DNA損傷后，前胃泌素刺激鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞有絲分裂，以及關(guān)于前胃泌素的羧基末端26-氨基酸殘基在體內(nèi)足以對鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中的有絲分裂產(chǎn)生刺激(Ottewell等人，2005;Ottewell等人，2003)。基于主要源自過量表達(dá)試驗(yàn)的這些數(shù)據(jù)，前胃泌素被接受為腸上皮細(xì)胞的"生長因子"。相反，僅有三個(gè)研究在體外和一個(gè)在體內(nèi)設(shè)法耗盡細(xì)胞。在體外，2個(gè)前胃泌素產(chǎn)生細(xì)胞系被胃泌素基因反義轉(zhuǎn)染，顯示在棵鼠中集落形成以及腫瘤植入被缺失(Singh等人，1996)。然而重要的是，沒有論證這些阻斷效果歸屬于哪一個(gè)胃泌素基因產(chǎn)物。更近的研究證明，前胃泌素缺失使穩(wěn)固粘著和緊密連接在腸上皮細(xì)胞中恢復(fù)，使前胃泌素與移植激活相聯(lián)系(Hollande等人，2003)。最后，最終的體外研究專注于甘氨酸延長型胃泌素17(前胃泌素的成熟產(chǎn)物)的作用，因?yàn)樵谘芯恐兴玫募?xì)胞分泌大量所述肽，但是非常少的前胃泌素(Hollande等人，1997)。在體內(nèi)，上述KO小鼠對胂瘤發(fā)生更敏感。重要的是，僅有的報(bào)道(3-連接素/Tcf4復(fù)合體和肽的胃泌素族間的關(guān)系的兩個(gè)研究證明，在體外，僅有Tcf4轉(zhuǎn)錄通路的激活(Koh等人，2000)，特別與Ras相關(guān)(Chakladar等人，2005),引起胃泌素基因啟動(dòng)子的激活和增加基因的轉(zhuǎn)錄。相反，在此處提供的數(shù)據(jù)之前，不知道關(guān)于結(jié)腸中分泌的來自胃泌素基因的肽在(3-連接素/Tcf4通路的異常激活中的真實(shí)特性，沒有報(bào)道提及通過前胃泌素功能的阻斷而逆轉(zhuǎn)所述通路的激活的可能性，以及在人結(jié)直腸癌患者中，在其腫瘤中顯示所述通路激活的那些現(xiàn)有數(shù)據(jù)提供充足的科學(xué)證據(jù)表明，前胃泌素的缺失能逆轉(zhuǎn)通過組成性卩-連接素/Tcf4激活誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生。這樣的凝:據(jù)被提供在下面的本發(fā)明的說明中。胃泌素和前胃泌素胃泌素是典型的腸肽激素，其最初被識(shí)別為胃酸分泌的刺激物。其主要由胃竇的G細(xì)胞并在不同程度上在上部小腸中產(chǎn)生，在結(jié)腸和胰腺中的量非常低。近年來，對肽的胃泌素族在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用的興趣已經(jīng)增加。特別的，大量證據(jù)證明，以前被認(rèn)為是非活性的胃泌素的前體形式(前胃泌素和甘氨酸延長型胃泌素)在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起作用(見上述說明)。胃泌素以各種分子形式出現(xiàn)。人羧基末端酰胺化胃泌素，G17和G34，由101-氨基酸前體分子，前胃泌素原，通過轉(zhuǎn)錄后修飾產(chǎn)生。前胃泌素原被共翻譯轉(zhuǎn)移進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在此信號肽凈皮迅速裂解以產(chǎn)生前胃泌素。前胃泌素隨后被激素原轉(zhuǎn)化酶和羧肽酶E裂解產(chǎn)生具有羧基末端甘氨酸殘基的肽，即G34-Gly，和另外的裂解產(chǎn)生肽G17-Gly。G34-Gly能通過肽酰a-酰胺化單氧酶被轉(zhuǎn)化成羧基末端酰^^化肽G34,并能類似地被裂解以產(chǎn)生G17。G17或Gamide是胃泌素的主要竇形式，具有通常包含少于人體中總分泌肽的10%的非酰胺化前體(前胃泌素、甘氨酸延長型胃泌素)。然而，在處理被損傷的特定臨床情況下，較大部分的非酰胺化胃泌素被分泌。例如，如上所述，前胃泌素的組織和血漿濃度在一些結(jié)直腸癌患者中上升(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。在W09919353中，提出了與胃腸粘膜細(xì)胞增殖的自分泌刺激的過度活躍相關(guān)的狀況的治療方法。所述方法包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物給予有效量的前胃泌素與細(xì)胞內(nèi)胃泌素/CCK-C受體或其他前胃泌素受體的的結(jié)合的拮抗劑的步驟。US61659卯公開了用于治療結(jié)腸癌的方法。結(jié)腸癌對胃泌素的表達(dá)通過反義胃泌素表達(dá)的應(yīng)用而被抑制。在WO2004/089976A中，公開了用于治療與非酰胺化胃泌素的水平上升相關(guān)的狀況的方法和組合物。一方面，所述方法包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物給予有效量的化合物的步驟，所述化合物能抑制高鐵離子與任一或多個(gè)甘氨酸延長型胃泌素17、前胃泌素或前胃泌素衍生肽的結(jié)合，但不能抑制酰胺化胃泌素的活性，并因而抑制非酰胺化胃泌素的活性。提供數(shù)據(jù)以支持以下要求，即抑制高鐵離子與甘氨酸延長型胃泌素17結(jié)合的能力確實(shí)降低其生物活性，但是沒有提供涉及對前胃泌素的生物活性有影響的數(shù)據(jù)。WO2006/032980A關(guān)注保護(hù)前胃泌素結(jié)合分子，其選纟奪性結(jié)合前胃泌素，其中所述分子不與胃泌素17(G17)、胃泌素34(G34)、甘氨酸延長型胃泌素17(G17-Gly)、或甘氨酸延長型胃泌素34(G34-Gly)結(jié)合，特別是對前胃泌素和產(chǎn)生其的雜交瘤細(xì)胞有選擇性的單克隆抗體。一種方法被公開，其用上述抗體在生物流體中定量前胃泌素水平，但是所述要求不被涉及這些抗體在任何生物流體中選擇性檢測前胃泌素的能力任何數(shù)被公開，沒有數(shù)據(jù)支持下述要求，即這些抗體證明改變前胃泌素的生物活性的任何選擇性能力。該文獻(xiàn)僅提供用于建立所述抗體特異性的方法。迄今，治療和/或預(yù)防結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移和腺瘤性息肉病的有效和特異性方式是缺乏的。因此，本發(fā)明的目的是提供改善的方法，用于治療和/或預(yù)防結(jié)直腸癌、轉(zhuǎn)移和腺瘤性息肉病。發(fā)明概述在實(shí)現(xiàn)所述目的中，提供治療和/或預(yù)防緣于P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要其的個(gè)體給予有效量的前胃泌素誘導(dǎo)阻遏卩-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的步驟。本發(fā)明還提供用于治療和/或預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要其的個(gè)體給予有效量的前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的步驟。正是本發(fā)明第一次說明，前胃泌素，而不是任何其他GAST基因的產(chǎn)物的缺失，能通過直接對[3-連接素/Tcf4活性的組成性激活起作用而逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生。所述逆轉(zhuǎn)包括ICAT表達(dá)的調(diào)控，在高前胃泌素的環(huán)境中低，在前胃泌素缺失的環(huán)境中高。當(dāng)ICAT高時(shí)，(3-連4^素/Tcf4活性的組成性激活由于ICAT從Tcf4上截獲P-連接素而極度降低。因此，第一次，證明了前胃泌素的缺失對緣于P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的治療非常有效，以及對顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/1\^-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的治療非常有效。具有低ICAT表達(dá)、組成型P-連接素/Tcf4介導(dǎo)的激活、和高前胃泌素表達(dá)的那些人結(jié)直腸肺瘤、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的人群因此能被選擇用于抗前胃泌素治療。本發(fā)明還涉及一種方法，用于確定患有結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的患者是否對前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的治療有響應(yīng)，包括確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種方法，其將可能對治療方案有響應(yīng)的患者的特定人群的選擇，與結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的治療和/或預(yù)防相結(jié)合。還提供了前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物生產(chǎn)中的用途。還提供了前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物生產(chǎn)中的用途。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種方法來篩選用于治療和/或預(yù)防緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的化合物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要其的個(gè)體給予有效量的前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的步驟。還提供了前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/1\^-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物生產(chǎn)中的用途。典型地，前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞是結(jié)腸細(xì)胞。典型地，前胃泌素分泌細(xì)胞和P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞可以相同。本發(fā)明還提供治療和/或預(yù)防緣于P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要其的個(gè)體給予有效量的前胃泌素誘導(dǎo)阻遏P-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的步驟。典型地，前胃泌素分泌細(xì)胞為結(jié)腸細(xì)胞。還提供了前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防緣于P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物生產(chǎn)中的用途。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，其很少被手術(shù)，或者因?yàn)槠浜茈y接近，或者因?yàn)橥饪魄谐龑χ匕Y患者的存活存在極端的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)轉(zhuǎn)移物在與重要?jiǎng)用}很近的地方生長時(shí)，特別如此。本發(fā)明的治療或者通過完全去除轉(zhuǎn)移體或者至少通過使轉(zhuǎn)移從動(dòng)脈縮退而允許外科切除，誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)移衰退，從而是非常有用的。而且，結(jié)腸癌細(xì)胞中前胃泌素合成的下調(diào)恢復(fù)了結(jié)腸肺瘤細(xì)胞的粘著能力，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移趨勢的降低(Hollande等人，2003)。典型地，治療的轉(zhuǎn)移可以不是外科可切除的。轉(zhuǎn)移可以緣于原發(fā)性瘤，p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路的激活狀態(tài)對其是未知的。典型地，轉(zhuǎn)移起源的原發(fā)性瘤是結(jié)腸腫瘤。個(gè)體，指動(dòng)物或人。組成性激活P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路，指永久的、和非調(diào)控的通路激活，其導(dǎo)致在(3-連接素和Tcf-4間形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，由于缺乏細(xì)胞質(zhì)P-連接素的降解而導(dǎo)致Tcf-4靶基因的轉(zhuǎn)錄提高。卩-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的細(xì)胞的實(shí)例為腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)肺瘤抑制基因突變的細(xì)胞，或|3-連4妻素基因以防止(3-連接素正常降解的方式突變的細(xì)胞。典型地，在對患有結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的患者施用本發(fā)明的治療方法之前，可以進(jìn)行診斷測試以確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或者結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌述預(yù)處理診斷測試，可以確定患者是否對本發(fā)明的治療方法有響應(yīng)。進(jìn)行此類診斷測試在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。典型地，患者血液中的前胃泌素血漿水平可以被確定以僅治療那些在血漿中具有上升的前胃泌素水平的患者。血漿前胃泌素測量也可以被用以測試腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的最終復(fù)發(fā)。貫穿其壽命，結(jié)直腸胂瘤分泌促進(jìn)新血管的發(fā)生的因子(如VEGF)，從而確保腫瘤獲得足夠量的營養(yǎng)以達(dá)到最大生長(Wray等人，2004)。這些新血管的存在也使肺瘤釋放各種因子進(jìn)入血流中，對前胃泌素特別如此。因此，前胃泌素革巴向治療可以包括血漿前胃泌素水平的測量?？蛇x的或另外的，APC基因或(3-連接素基因的突變可以被檢測，或者諸如c-Myc和細(xì)胞周期蛋白Dl的Tcf靶基因的轉(zhuǎn)錄的異常水平可以通過在取自患者的組織切片上為這些標(biāo)記物染色或通過應(yīng)用例如微陣列技術(shù)確定。本發(fā)明還涉及用于確定患有結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的患者是否對前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的治療有響應(yīng)的方法，包括確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于IB-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或者結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞。典型地，確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或者結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/1^-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的步驟，包括測量所述患者的前胃泌素的血漿水平的步驟。另外的或可選的，確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于[3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或者結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的步驟，包括檢測APC基因或P-連接素基因的突變或者Tcf靶基因轉(zhuǎn)錄的異常水平的步驟。典型地，前胃泌素測定可以是時(shí)間分辨熒光測定(TR-IFMA)，如proGRP所述(Nordkmd等人，2007)。該類型測定允許定量的范圍為16ng/1-20,000ng/1，在患有結(jié)直腸腫瘤的患者中測量的前胃泌素血漿水平的范圍內(nèi)的值。兩個(gè)單克隆抗體可以被應(yīng)用，一個(gè)針對前胃泌素的N端，另一個(gè)針對C端。N端抗體可以是生物素?；牟⒂米鞴滔嗫贵w。C端抗體可以用Eu"標(biāo)記并用作示蹤抗體。前胃泌素的表達(dá)的藥劑、抗前胃泌素抗體、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制劑和整合素連接激酶(ILK)的抑制劑.。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的藥劑。典型地，下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的藥劑包含干擾前胃泌素表達(dá)的核酸。是小片段的mRNA的互補(bǔ)鏈。用于設(shè)計(jì)有效的反義分子的方法是公知的(例如見US6165990)，其在技術(shù)人員設(shè)計(jì)能下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的反義分子的能力范圍內(nèi)。下調(diào)前胃泌素的表達(dá)的藥劑的其他實(shí)例為RNA干擾(RNAi)分子，如短干擾RNA(siRNA)和短發(fā)卡狀RNA(shRNA)。RNAi指引導(dǎo)同源雙鏈RNA以特異性靶向基因產(chǎn)物，在本案的前胃泌素中，導(dǎo)致無義或亞等位基因表型。用于設(shè)計(jì)有效的RNAi分子的方法是7>知的(見Hannon和Rossi的綜述，Nature.2004Sep16;431(7006):371-8),這在技術(shù)人員設(shè)計(jì)能下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的RNAi分子的能力范圍內(nèi)。能下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的siRNA的實(shí)例是包含下列序列之一的核酸分子siRNAshPG:有義5，-GAAGAAGCCUAUGGAUGGATT-3，(SEQIDN。27)反義5'-UCCAUCCAUAGGCUUCUUCTT-3，(SEQIDN。28)siRNAsmPG:有義5，-GAAGAGGCCUACGGAUGGTT-3,(SEQIDN。29)反義5，-CCAUCCGUAGGCCUCUUCTT-3，(SEQIDN。30)能下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素的表達(dá)的shRNA的實(shí)例是包含下列序列之一的核酸分子shRNAhPG:有義AGAAGTTTTTT3，(SEQIDN。l)反義CATAGGCTTCTTCGGCC3,(SEQIDN。2)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含siRNA的藥物，包含選自SEQIDN。27、SEQIDN。28、SEQIDN。29和SEQIDN。30的序列之一。典型地，藥物可以包含一對siRNA。siRNA對的實(shí)例為包含SEQIDN°27的第一核酸和包含SEQIDN°28的第二核酸或者包含SEQIDN。29的第一核酸和包含SEQIDN°30的第二核酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含shRNA的藥物，包含選自SEQIDN。l和SEQIDN。2的序列之一。典型地，藥物可以包含一對shRNA。shRNA對的實(shí)例為包含SEQIDN。1的第一核酸和包含SEQIDN°2的第二核酸。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是抗前胃泌素抗體或其生物活性片段或衍生物，其不識(shí)別酰胺化和甘氨酸延長型的胃泌素。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道生產(chǎn)所述特異性抗體的標(biāo)準(zhǔn)方前胃泌素或前胃泌素片段對動(dòng)物進(jìn)行免疫，和通過選擇結(jié)合前胃泌素并且不識(shí)別酰胺化和甘氨酸延長型的胃泌素的抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，前胃泌素片段是對前胃泌素特異的氨基酸序列。所述序列的長度可以包含8-15個(gè)氨基酸。這些序列包含前胃泌素的羧基末端氨基酸殘基或氨基末端氨基酸殘基，其不以胃泌素形式G17和G34-Gly存在。這些序列可以包含激素原轉(zhuǎn)化酶或羧肽酶E的裂解位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其生物活性片段或其衍生物，結(jié)合前胃泌素的羧基末端10-氨基酸殘基或前胃泌素的羧基末端15-氨基酸殘基。前胃泌素的羧基末端10-氨基酸殘基的實(shí)例為FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，抗體生物活性片段或其衍生物結(jié)合前胃泌素的氨基末端40-氨基酸殘基。典型地，抗體生物活性片段或其衍生物可以結(jié)合SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)。所述氨基酸序列是對前胃泌素特異的，其不存在于.胃泌素形式G17、G17-gly、G34和G34-Gly中。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體和其生物活性片段和衍生物的標(biāo)準(zhǔn)方法。其生物活性片段或衍生物，指能夠結(jié)合與抗體相同的表位，在本案中為前胃泌素的表位。抗體片段，特別是Fab片段和保留表位結(jié)合能力和特異性的其他片段也是公知的，其為嵌合抗體，和"人源化"抗體，其中抗體的結(jié)構(gòu)(不決定抗原特異性)區(qū)域被其他種的相似或類似區(qū)域代替。因此，在小鼠中產(chǎn)生的抗體能是"人源化"以降低可以發(fā)生在給予人體的負(fù)面效果。在市場上，若干嵌合抗體現(xiàn)在被接受為治療形式。因此，本發(fā)明包含對前胃泌素特異的抗體的用途，所述抗體包括F(ab')2、F(ab)2、Fab、Fv和Fd抗體片l殳、其中一個(gè)或多個(gè)區(qū)域已經(jīng)被同源人體或非人體部分代替的嵌合抗體。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員也能知道，生物活性抗體衍生物如ScFv片段和二價(jià)ScFv型分子能用重組方法制備。抗體可以用可4全測的標(biāo)記物標(biāo)記，其適于》文射性標(biāo)記，如方文射性碘，或可以是熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將能夠選擇適合的放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種藥物，包含抗體或其生物活性片段或衍生物，其結(jié)合前胃泌素的羧基末端15-氨基酸殘基，或氨基末端40氨基酸殘基。典型地，抗體或其生物活性片段或衍生物結(jié)合FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)或SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)。在健康人體中，前胃泌素包含低于10%的循環(huán)胃泌素，并且沒有與前胃泌素相關(guān)的生理作用。因此，即使不避免，通過用抗體或其生物活性片段或衍生物特異性靶向前胃泌素，治療的副作用被消除。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是PI3K的抑制劑。PI3K的抑制劑是公知的。LY29權(quán)2、渥曼青霉素和櫟精是通常使用的PI3K的抑制劑。例如US2006058321和WO2004052373,公開了PI3K的抑制劑族。反義、RNAi分子、PI3K的顯性負(fù)相(dominant-negative)形式、抗PI3K抗體、其生物活性片段和衍生物也可以被用作PI3K的抑制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是ILK的抑制劑。ILK的抑制劑是公知的。KP-392和QLT-0267是通常使用的ILK的抑制劑。例如，在US6214813中描述了ILK的小分子抑制劑。在US6177273中描述了ILK的反義抑制劑。RNAi分子、ILK的顯性負(fù)相形式和抗ILK抗體、其生物活性片段和衍生物也可以被用作ILK的抑制劑。典型地，本發(fā)明的藥物包含前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑，和藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道適合的載體。用于通過任何期望的途徑給藥的適合的制劑可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如通過參考公知的文獻(xiàn)，如Remington;TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓，藥物科學(xué)和實(shí)踐)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于篩選化合物的方法，所述化合物用于治療和/或預(yù)防緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移，包括如下步驟a)提供[3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)力包；和b)添加欲被篩選的化合物；和c)選4奪誘導(dǎo)ICAT表達(dá)的化合物。在本發(fā)明一可選實(shí)施方案中，提供用于篩選化合物的方法，所迷化合物用于治療和/或預(yù)防緣于p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移，包括如下步驟a)提供前胃泌素敏感細(xì)胞；和b)將前胃泌素添加至含有所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中；和c)添加欲被篩選的化合物；和d)選擇誘導(dǎo)ICAT表達(dá)的化合物。典型地，前胃泌素分泌細(xì)胞或前胃泌素敏感細(xì)力包是結(jié)腸細(xì)胞。前胃泌素敏感細(xì)胞指當(dāng)前胃泌素存在于培養(yǎng)基中時(shí)，(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是激活的細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)的4支術(shù)人員知道實(shí)施這些方法的標(biāo)準(zhǔn)方法。典型地，ICAT表達(dá)可以通過RT-定量PCR確定。以下，本發(fā)明將通過下述實(shí)施例以及附圖被詳細(xì)"i兌明。圖1:在Balbc/棵鼠中前胃泌素缺失降低人CRC細(xì)胞系的腫瘤發(fā)生并抑制APCA14小鼠的腸內(nèi)的原發(fā)性瘤的發(fā)展。(A)柱狀圖顯示在SW480/pgal"和SW480/O4S7^(克隆[l]和[2],表達(dá)或不表達(dá)shRNA非敏感前胃泌素原cDNA(cPG))細(xì)胞中O^rmRNA的定量。結(jié)果被表達(dá)為在SW480/(3gal(力中發(fā)現(xiàn)的百分比水平(*,相比于SW480/a4S7^p<0.05,n=3)。下面的表格為由SW480/(3gal"和SW480/O467^細(xì)胞分泌的前胃泌素、甘氨酸延長型胃泌素和酰胺化胃泌素的RIA定量(pmo1/1/2411)。(B)在BALB/c棵鼠中，當(dāng)皮下注射DLD-l/VO、DLD-1/ASG、SW480/O^T^—」或SW480/(3gaW細(xì)胞后，腫瘤體積隨時(shí)間的發(fā)展。2克隆/細(xì)胞系(4小鼠/克隆)的平均+/-標(biāo)準(zhǔn)誤，(*，相比于DLD-l/VO或SW480/卩gal(。細(xì)胞p<0.05，斯氏t檢驗(yàn)(Student，st-test))。(C-D)3月大的APCA14小鼠用耙向鼠或熒光素酶基因的siRNA治療兩周(9只小鼠/組)。結(jié)果表達(dá)為在回腸(C)或結(jié)腸(D)中胂瘤/健康粘膜的GaW基因表達(dá)間的比率(左圖)，用RT-QPCR定量。在回腸(C)和結(jié)腸(D)中，當(dāng)亞曱基藍(lán)染色后，腺瘤的數(shù)量和大小被定量，并且表達(dá)為每個(gè)尺寸組的腫瘤的總數(shù)(右圖)。siRNA未能降低有大量腸瘤的小鼠中收集的樣品A(C)中的GflW基因表達(dá)的水平。"B，，和"C，，分別對應(yīng)于未患有任何結(jié)腸或回腸腫瘤的小鼠(D)。圖2.前胃泌素刺激人CRC細(xì)胞中的p-連接素/Tcf-4活性。(A)用TOP/FOP熒光素酶報(bào)告基因分析(Morin等人，1997)在未處理的SW480/(3gal(-)和SW480/O467^細(xì)胞(克隆[l]和[2])(黑柱)，或在用5nM重組前胃泌素處理72h的相同細(xì)胞(rPG,淺灰柱)或用shRNA非敏感前胃泌素原cDNA轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞(cPG，深灰柱)中定量Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性。值為四個(gè)類似試驗(yàn)的平均士標(biāo)準(zhǔn)誤(*,相比于SW480/GAS7^細(xì)胞p<0.05)。Tcf-4和脫磷酸(3-連接素的水平在所有這些細(xì)胞中是類似的，如圖S2所示。(B)用或未用5nM前胃泌素處理72h的SW480/pgaP細(xì)J包禾口SW480/GAS7^細(xì)胞中的(3-連接素(綠)、Tcf-4(紅)和DAPI(藍(lán))的單獨(dú)或^隻蓋共焦圖像。對前胃泌素處理的細(xì)胞應(yīng)用較高的放大倍數(shù)以提供部分逆轉(zhuǎn)的更好的可見度。(C)SW480/O4S7^克隆[l]和[2]如A處理或不處理。肌動(dòng)蛋白和由Tcf-4靶基因c-Myc、細(xì)胞周期蛋白-Dl、Sox-9和CLDN1編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平通過免疫印跡法定量，用SW480/(3galW細(xì)胞作為對照(也見附圖S3中的mRNA表達(dá))。值(用作為內(nèi)參的肌動(dòng)蛋白作為標(biāo)準(zhǔn))為三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均士標(biāo)準(zhǔn)誤。斯氏t檢驗(yàn)，相比于SW480/O4ST^細(xì)胞p<0.05(*)。圖3.前胃泌素在體外和體內(nèi)下調(diào)ICAT表達(dá)。(A-B)前胃泌素缺失的SW480/O457^細(xì)胞(克隆[l]和[2])被或未被密碼子優(yōu)化的、shRNA非敏感的前胃泌素原cDNA(cPG)轉(zhuǎn)染。而后ICATmRNA水平相比于SW480/pgal"細(xì)胞用RT-QPCR定量(A)，在用cPG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前(淺灰柱)或后(灰柱)，相比于SW480/(3-gal"(黑柱)，在SW480/04X1^中ICAT蛋白質(zhì)的表達(dá)用免疫印跡法分析(B)。(C)在由顯示前胃泌素的腸特異性過量表達(dá)的小鼠(Tg/Tg)的結(jié)腸上皮得到的組織切片中(Cobb等人，2004),以及在)中，通過免疫組織化學(xué)和熒光免疫染色分析ICAT表達(dá)。條代表40[im。圖4.ICAT重新表達(dá)響應(yīng)于前胃泌素缺失的CRC細(xì)胞中的p-連接素-Tcf-4活性。(A)上圖探測源自SW480/卩gal。和SW480/G^ST^+/-重組前胃泌素(rPG，5nM，72h)的脫磷酸(3-連接素免疫沉淀反應(yīng)的脫磷酸p-連接素、Tcf-4和ICAT。下圖，在2個(gè)獨(dú)立克隆中進(jìn)行的3個(gè)類似試驗(yàn)的定量(相比于SW480/卩gal。和SW480/O4S7^,分別為##p<0.01和*口<0.05，斯氏t檢驗(yàn))。(B)在用或未用5nM前胃泌素處理72h的SW480/PgaP細(xì)胞和SW480/O45T^細(xì)胞中的p-連接素、ICAT和DAPI的單獨(dú)或覆蓋共焦圖像。條代表40(im。(C-D)在SW480/O457^/Luc"和SW480/0^7^/ICATW細(xì)胞中用或未用shRNA非敏感ICATcDNA(+cICAT)的再表達(dá)進(jìn)行Tcf-4焚光素酶報(bào)告基因分析(TOP/FOP)(C)和c-Myc(上)與細(xì)胞周期蛋白Dl(下)mRNA和蛋白質(zhì)的定量(D)。圖5.在鼠和人腫瘤中，ICAT表達(dá)與前胃泌素水平和p-連接素-Tcf-4耙基因表達(dá)呈反相關(guān)性。(A)3月大APCA14小鼠用靶向鼠GAST基因或熒光素酶基因的siRNA處理兩周，如圖1。對腸腺瘤進(jìn)行RNA提取，相對于由相同動(dòng)物0=5)的匹配上皮(Ep)中的表達(dá)，ICATmRNA表達(dá)^皮定量(Ad)。(B)Tcf-4目標(biāo)細(xì)胞周期蛋白Dl、CD44和C-Myc的表達(dá)用源自相同動(dòng)物的腺瘤(Ad)和肉眼可見的完整上皮(Ep)中的蛋白質(zhì)免疫印跡法分析，相比于源自相同基因背景的對照小鼠的腸上皮(見附圖S5的定量)。(C)源自用丄wc或04Sr特異性siRNA處理的APCA14動(dòng)物的腺瘤被石蠟包埋并進(jìn)行c-Myc和ICAT的免疫組織化學(xué)檢測。由回腸中收集的GAST^和丄wc—腺瘤提供代表性圖像。條表示20pm。(D)在23名CRC患者的顯微解剖的腫瘤(黑柱)中的GAST和/C4rmRNA表達(dá)，表示為相對于其各自匹配的健康上皮(白柱)中發(fā)現(xiàn)的量，其被標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)患者為1。值為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均is.e.m。插圖在其回歸曲線和其置信區(qū)間內(nèi)，GAST和/C4r表達(dá)的對數(shù)值彼此作圖。斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)系數(shù)(r)以其顯著性程度(p)被提供。(E)上圖在健康(H)或源自4名CRC患者的腫瘤(T)樣品的前胃泌素免疫印跡(IB)。下圖具有或高(患者4)或低(患者22)的腫瘤前胃泌素表達(dá)的患者的ICAT、c-Myc、claudin-l和CD44的代表性免疫組織化學(xué)(IHC)(在WB中陽性對照為重組前胃泌素(rPG);陽性對照的曝光時(shí)間為20秒，人體樣品的曝光時(shí)間為10分鐘)。類似的IB和IHC結(jié)果由11名受試患者的樣品得到。條代表20iim。圖6.ICAT的阻遏對人CRC細(xì)胞中的前胃泌素的腫瘤促進(jìn)作用是必要的。(A)上圖ICAT的下調(diào)逆轉(zhuǎn)軟瓊脂中前胃泌素缺失的細(xì)胞的下降的生長率，如由SW480/卩ga1。、SW480/G^ST^、SW480/GAS7^/ICAT(-)和SW480/GAS盧/LucO細(xì)胞間的集落大小的顯著差別所示。下圖3個(gè)類似的試驗(yàn)的定量，表達(dá)為每個(gè)克隆十個(gè)隨機(jī)選擇區(qū)域的平均士標(biāo)準(zhǔn)誤。(B)SW480/O45T^/Luc(-)和SW480/O4S/力ICAT"細(xì)胞被注射進(jìn)BALB/c棵鼠的后腿中，定期測量肺瘤生長。4個(gè)克隆的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤，每個(gè)*為相比于SW480/O4S7^/Luc(。細(xì)胞p<0.05,斯氏t檢驗(yàn)。圖7.PI3k/ILK通路的激活對由前胃泌素的ICAT阻遏是必要的。(A)PBk激活對人CRC細(xì)胞中的前胃泌素誘導(dǎo)的ICAT阻遏是必要的。ICATmRNA表達(dá)如前述測量(左)，在用或不用5nM前胃泌素(PG)和/或PI3激酶抑制劑LY-294002(LY)處理的SW480/卩gal(—)和SW480/O^7^細(xì)胞中通過蛋白質(zhì)印跡分析Akt/PKB的磷酸化(右)，如所示的。(B)ILK表達(dá)和活性在前胃泌素缺失的人CRC細(xì)胞中被降低。上圖，ILK表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡)和酶活性(體外髓磷脂堿性蛋白(MBP)的磷酸化)在源自用或未用重組前胃泌素處理(5nM，72h)的SW480/(3galW和SW480/GAS7^細(xì)胞裂解產(chǎn)物的ILK免疫沉淀反應(yīng)后進(jìn)行分析。中圖顯示ILK活性的定量，在校正上述細(xì)胞中的ILK表達(dá)的變化后在三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)中進(jìn)行。在下圖中，ILK目標(biāo)(31-整合素的磷酸化通過用抗磷酸絲氨酸抗體和抗pi-整合素抗體順序探測(31-整合素免疫沉淀反應(yīng)進(jìn)行分析。當(dāng)裂解產(chǎn)物用免疫前兔血漿免疫沉淀反應(yīng)時(shí)，ILK、卩l(xiāng)-整合素和MBP磷酸化從不被^r測(未顯示)。(C)ILK激活對人CRC細(xì)胞中前胃泌素介導(dǎo)的ICAT阻遏是必要的。ICATmRNA的表達(dá)(左圖)和Ser473上的Akt/PKB的磷酸化(右圖)在用或未用顯性負(fù)相ILK(AN-ILK)轉(zhuǎn)染的、和如所示的用或未用5nM外源前胃泌素處理的SW480/(3galO和SW480/G^S7^細(xì)胞中定量。對所有的圖，相比于SW480/卩gal(-)(#)、SW480/GAS盧(*)、或前胃泌素處理的SW480/GAST^(。)會(huì)田月包，p<0.05。圖8.前胃泌素缺失在體外誘導(dǎo)人CRC細(xì)胞分化和凋亡并在體內(nèi)促進(jìn)APCA14小鼠的腸內(nèi)腫瘤分化。(A)在SW480/O46T^而不在SW480/(3galW細(xì)胞的兩個(gè)克隆中顯示PTEN的核定位的代表性實(shí)驗(yàn)。(B)在SW480細(xì)胞中，用耙向GASr或(3-半乳糖芬酶的siRNA轉(zhuǎn)染48h后的Muc-2、腸堿性磷酸酶(ALP)、和嗜鉻粒蛋白A(CgA)mRNA表達(dá)的定量。(C)在SW480CRC細(xì)胞中，當(dāng)用GU5T特異性而非(3-半乳糖苷酶特異性的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的Muc-2表達(dá)和半胱天冬酶(caspase)-3激活。用靶向04Sr(箭)或(3-半乳糖苷酶(箭頭)的若丹明標(biāo)記的siRNA(紅色)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用或未用5nM重組前胃泌素處理。Muc-2表達(dá)(A488，綠)和激活的半胱天冬酶-3(Cy-5，在此用紅色表示)用焚光免疫染色法檢測，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。用DLD-1細(xì)胞得到類似的結(jié)果。條表示20|1111。(D)3月大APCA14小鼠用靶向鼠04ST基因或熒光素酶基因的siRNA處理兩周，如圖1中的。腸腺瘤被石蠟包埋并進(jìn)行產(chǎn)粘液細(xì)胞(Muc2和阿辛藍(lán)(Alcianblue))和參與凋亡通路的細(xì)胞(激活的半胱天冬酶3,黑箭頭)的免疫組織化學(xué)檢測。由回腸中收集的04S7^和丄wc—腺瘤提供代表性圖像。條表示20)im。圖9.將前胃泌素缺失與在APC突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的p-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的降低的激活連接的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。(A)CRC細(xì)胞產(chǎn)生和分泌內(nèi)生前胃泌素，其隨后作用在腫瘤細(xì)胞上以激活PI3激酶和ILK,從而誘導(dǎo)ICAT阻遏和促進(jìn)由APC突變引發(fā)的P-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性的放大。該過程引起靶基因如編碼前胃泌素的基因的最大轉(zhuǎn)錄，因此產(chǎn)生自我放大激活環(huán)。(B)前胃泌素作用的抑制，例如通過GAST基因的siRNA沉默誘導(dǎo)(O)，顯著降低PL3激酶和ILK的活性(②)，引起ICAT的強(qiáng)上調(diào)(③)。這個(gè)小抑制劑與Tcf-4對{3-連接素結(jié)合竟?fàn)幾阋詮?qiáng)下調(diào)肺瘤細(xì)胞中Tcf-4靶基因的轉(zhuǎn)錄(④)。圖10.增加的抗原濃度如所示的被涂在96孔板上(詳細(xì)的，參照"方法"部分)，而后用選擇性抗前胃泌素(1-80)的N-端(上圖)或C-端(下圖)末端的抗體卵享育。受試的抗原是用于產(chǎn)生抗體(上圖SWKPRSQQPDAPLGT,下圖FGRRSAEDEN)、酰胺化胃泌素17、甘氨酸延長型胃泌素17、前胃泌素的C端側(cè)肽(SAEDEN)、和鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)的初始免疫原，其在免疫過程期間被用作載體蛋白。當(dāng)用二級抗體和OPD底物孵育后，結(jié)果表示為492nm直接讀數(shù)。圖11.SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞用對照抗體或直接抗前胃泌素的C端或N端末端的抗體(1/5000稀釋)處理30小時(shí)，如方法部分中所述。細(xì)胞裂解后，ICAT、c-Myc和細(xì)胞周期蛋白Dl的mRNA表達(dá)用RT-qPCR定量。結(jié)果表示為在用C端(灰柱)或N端(白柱)前胃泌素抗體處理的細(xì)胞和用對照抗體處理的細(xì)胞中的表達(dá)間的比率，其中每個(gè)基因表達(dá)水平被定為1的值(在此用橫軸表示)。圖Sl.用對鼠045T基因選擇性的siRNA處理兩周后，前胃泌素在APqA14小鼠的腺瘤中的過量表達(dá)和促炎癥反應(yīng)的缺乏。(A)在健康腸粘膜和3.5月大APCA14小鼠的腺瘤中的酰胺化和甘氨酸延長型胃泌素水平，用放射性免疫分析定量。(B)在健康腸粘膜和用Lmc或045T基因特異性siRNA處理的3.5月大APCA14小鼠中的腺瘤蛋白提取物(50嗎)中的代表性前胃泌素免疫印跡，相比于相同基因背景的對照'』、鼠(NoRIA普遍可用于定量鼠前胃泌素)。膠片被曝光30min。柱狀圖，在每組4個(gè)動(dòng)物的結(jié)腸和回腸中收集的腺瘤中的PG的定量，表示為相對于C57/BL6動(dòng)物的結(jié)腸和回腸。(對于每個(gè)腸片段，相比于C57/BL6#或APCA14Lwc"*中各自的值，p<0.05)。(C)Colo-26鼠CRC細(xì)胞和年青小鼠結(jié)腸(YAMC)細(xì)胞用直接抗鼠(m04SrsiRNA)或人(hGL45TsiRNA)046T序列的siRNA轉(zhuǎn)染，046JmRNA的表達(dá)用RT-QPCR定量。(D)總結(jié)了用丄w或GASTsiRNA處理的小鼠中的血漿IL-6(黑)和TNFa(白)的水平的散點(diǎn)圖。在所述兩組間未觀測到顯著差異，其中兩者的細(xì)胞因子的水平都反映炎癥的缺乏。圖S2.前胃泌素，而非酰胺化或甘氨酸延長型胃泌素，刺激CRC細(xì)胞中的P-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性。(A)(上圖)Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性用TOP/FOP熒光素酶報(bào)告基因分析(31)在DLD-l/VO、DLD-1/ASG(克隆[1]和[2])、SW480/卩gal(-)和SW480/GAST(-)(克隆[1]和[2])細(xì)胞中定量。值為4個(gè)類似實(shí)驗(yàn)的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤。脫磷酸(3-連接素(中圖)和Tcf-4(下圖)的水平在所有這些細(xì)胞系中是類似的，如通過免疫印跡所示的(用肌動(dòng)蛋白作為上樣對照)。(B)人酰胺化胃泌素(CCK-B)受體mRNA通過RT-PCR在源自用CCK-B受體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的樣品中檢測，而未在DLD-1和SW480細(xì)胞中或在陰性對照(沒有逆轉(zhuǎn)錄的COS-7/CCK-B)中檢測。圖S3.Tcf-4乾基因c-Myc、細(xì)胞周期蛋白Dl、Sox-9和CLDN1的mRNA表達(dá)私CRC細(xì)胞中的前胃泌素調(diào)控。SW480/O^盧克隆[l]和[2]用5nM前胃泌素(rPG)處理72h或者用密碼子優(yōu)化的、shRNA非敏感前胃泌素原cDNA(cPG)轉(zhuǎn)染。Tcf-4靶c-Myc、細(xì)l包周期蛋白Dl、Sox9和claudin-l(—列Tcf-4靶基因可用于(9))的mRNA表達(dá)用RT-QPCR定量，使用SW480/(3galW細(xì)胞作為對照。值為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均士標(biāo)準(zhǔn)誤。斯氏t檢驗(yàn)，相比于SW480/GAS7^)細(xì)胞p<0.05(*)。圖S4.CRC細(xì)胞中的ICAT表達(dá)的實(shí)^節(jié)。ICATmRNA(A)和蛋白質(zhì)水平(B)在用或未用對照shRNA(SW480/O^7^/Luc",灰柱)或?qū)CAT選擇性的shRNA(SW480/GAS7^/ICATO細(xì)胞，黑柱)轉(zhuǎn)染的前胃泌素缺失的CRC細(xì)胞(SW480/O4S7^，白柱)的兩個(gè)克隆中定量，以及在用密碼子優(yōu)化的、shRNA非4文感的ICATcDNA(+c.ICAT)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的SW480/G"AS7^)/ICAT(-)細(xì)胞中定量(深灰柱)。(相比于SW480/GAS7^)/Luc(-)")，或相比于SW480/Gy^7^/ICAT(-)(#)p<0.05，斯氏t檢驗(yàn)，n=3)圖S5.源自APCA14小鼠的腸腺瘤中的Tcf-4把基因的升高的表#靶向前胃泌素的siRNA處理后被降低。3月大的APCA14小鼠用靶向鼠a^r基因或熒光素酶基因的siRNA治療兩周，如圖i。對腸腺瘤進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，Tcf-4靶細(xì)胞周期蛋白Dl(上)、c-Myc(中)和CD"(下)的表達(dá)在源自相同動(dòng)物的腺瘤(Ad)和肉眼可見的完整上皮(Ep)中的蛋白質(zhì)免疫印跡后被定量，相比于源自相同基因背景的對照小鼠的腸上皮(代表性免疫印跡在圖5B中顯示)。值表示為4只動(dòng)物/組的腺瘤的平均土sem。對每個(gè)腸片段，相比于C57/BL6-或APCA14Z^c"*中各自的值p〈0.05。圖S6.用于結(jié)腸樣品的激光捕獲顯孩i切割的患者群。(A)激光捕獲顯微切割前(初始的)和后(顯微切割的)，典型的健康和腫瘤結(jié)腸組織的代表性顯微照片。(B)用于確定GAST和/C4r基因表達(dá)水平的患者群的特征，包括依據(jù)TNM分類的其肺瘤的病理評分。腫瘤定位表示為PC(近側(cè)結(jié)腸)、MC(中間結(jié)腸)、DC(末端結(jié)腸)、乙狀結(jié)腸、或直腸。提供了手術(shù)時(shí)的轉(zhuǎn)移(MS)、后期的轉(zhuǎn)移(M)、和死亡患者(DC)，以下列代碼(0:否；1:是)圖S7.P13k抑制SW480/pgal"細(xì)胞中Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性的藥理學(xué)抑制作用。SW480/pgalW細(xì)胞用或未用10pMLY294002處理，Tcf-4活性如上所述被定量。值為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均士標(biāo)準(zhǔn)誤。斯氏U企驗(yàn)，相比于未處理的SW480/Pgal。細(xì)胞p<0.05(*)。實(shí)施例實(shí)施例1在下述說明中，所有未給出詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。概述背景和目的p-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的異常激活表示結(jié)直腸癌發(fā)生的起始事件，在結(jié)腸隱窩中將平衡由分化轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋?。在此，我們評估被所述復(fù)合體的靶基因編碼的內(nèi)生前胃泌素是否接著能調(diào)控APC突變的細(xì)胞中的(3-連接素/Tcf-4活性，我們分析了局部前胃泌素缺失對體內(nèi)腸肺瘤生長的影響。方法GAST基因的永久或暫時(shí)RNA沉默在人腫瘤細(xì)胞和攜帶雜合Apc突變(APCA14)的小鼠中被誘導(dǎo)，其過量表達(dá)前胃泌素而不是酰胺化或甘氨酸延長型胃泌素。結(jié)果通過對腫瘤細(xì)胞中的組成性(3-連接素/Tcf-4活性的顯著抑制，內(nèi)生前胃泌素產(chǎn)物的缺失強(qiáng)烈降低體內(nèi)腸腫瘤生長。所述效果被P-連接素和Tcf-4的抑制劑(ICAT)的重新表達(dá)介導(dǎo)，其源自前胃泌素缺失的細(xì)胞中的整合素連接激酶(ILK)的下調(diào)。因此，ICAT下調(diào)與前胃泌素過量表達(dá)和人結(jié)直腸腫瘤中的Tcf-4靶基因激活相關(guān)，在有腫瘤傾向的、前胃泌素過量表達(dá)的小鼠的結(jié)腸上皮中檢測ICAT阻遏。在APCA14小鼠中，siRNA介導(dǎo)的前胃泌素缺失不僅降低了腸腫瘤的大小和數(shù)量，而且增加了保留腺瘤中的杯狀細(xì)胞譜系分化和細(xì)胞凋亡。結(jié)論:因此，內(nèi)生前胃泌素的缺失通過促進(jìn)ICAT表達(dá)而在體內(nèi)抑制APC突變的CRC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生，因此抵消了Tcf-4的活性。前胃泌素把向策略提供結(jié)直腸癌的分化治療的令人興奮的前景。介紹近年來，針對通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化降低腫瘤發(fā)展的各種策略已經(jīng)被開發(fā)，在動(dòng)物模型和人類患者中提供了非常有前途的結(jié)果。特別的，全反式視黃酸的應(yīng)用已經(jīng)證明在急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療中非常有用(Lallemand-breitenbach等人，2005;wang和chen，2000)，被認(rèn)為是在促使晚期曱狀腺癌中的腫瘤分化上有前途的方法(Coelho等人，2005)。在腸道中，在調(diào)節(jié)兩個(gè)主要的涉及細(xì)胞增殖和分化的控制的通路的藥劑已經(jīng)被寄予巨大期望，即Notch級聯(lián)和Wnt/卩-連接素/Tcf-4通路(Radtke和Clevers，2005;vanES和Clevers，2005)。然而，由于Notch和Wnt激活之間的調(diào)整的相互作用對腸隱窩的穩(wěn)態(tài)是必要的，針對直接靶向結(jié)腸腫瘤中的這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方法可能對全部腸道生理有反作用。理想地，此類策略將大大受益于識(shí)別目標(biāo)的能力，所述目標(biāo)在腫瘤細(xì)胞中被選擇性激活，或被強(qiáng)烈刺激，而在周圍組織中缺乏或未被激活。在腸腫瘤細(xì)胞中被特異性激活的目標(biāo)中，部分處理的胃泌素基因(GAS7)產(chǎn)物，如甘氨酸延長型胃泌素和前胃泌素，為肺瘤生長的選擇性靶向提供令人興奮的前景。實(shí)際上，GAST基因本身是Tcf-4和K-Ras的目標(biāo)(Chakladar等人，2005;Koh等人，2000),在結(jié)直腸癌中常常被激活并起協(xié)同作用的兩個(gè)通路(Janssen等人，2006)，以及這些GAST衍生的肽似乎通過腫瘤細(xì)胞上的自分泌/副分泌環(huán)刺激增殖(Hollande等人，1997;Hollande等人，2003)。Ggly的增殖效果在最近幾年被發(fā)現(xiàn)(Seva等人，1994)以及更近的，前胃泌素顯示刺激增殖(Ottewdl等人，2005;Singh等人，2000)并調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞/細(xì)胞粘著和遷移(Hollande等人，2003;Hollande等人，2005)。另外，用具有G^5T基因的靶向刪除的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)不一致結(jié)果。實(shí)際上，所述刪除強(qiáng)烈增強(qiáng)了由化學(xué)致癌物，氧化偶氮曱烷，誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生(Cobb等人，2002)，反之，其引起APC+^in小鼠的基因背景中的息肉數(shù)量的下降(Koh等人，2000)。然而，所述文獻(xiàn)提供很少有關(guān)治療消弱這些肽減慢或逆轉(zhuǎn)先前存在的肺瘤的生長的功能的潛力的信息。關(guān)鍵是，前胃泌素以顯著量由幾乎80%的人結(jié)直腸肺瘤和腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌，而其分泌在生理狀態(tài)下基本上降至檢測水平之下(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)。因此，由于Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成性激活代表散發(fā)性CRC，以及腺瘤性息肉病的遺傳狀態(tài)的特點(diǎn)(Fodde等人，2001),并且由于046T基因自身是Tcf-4的目標(biāo)，我們研究前胃泌素是否能接著調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)v!PC突變的腫瘤發(fā)生，以及靶向前胃泌素是否能表示降低結(jié)直腸腫瘤的生長的相關(guān)策略。我們顯示了RNA干擾介導(dǎo)的前胃泌素缺失能抑制由體內(nèi)APC基因的突變誘導(dǎo)的腫瘤生長。而后我們證明所述抑制反映前胃泌素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的(3-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性的水平的能力，盡管其組成性激活被^PC突變引發(fā)。(3-連接素和Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的重新表達(dá)對抑制(3-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄通路和降低前胃泌素缺失的腫瘤細(xì)胞中的腫瘤發(fā)生起作用，.而ICAT的阻遏在前胃泌素過量表達(dá)小鼠結(jié)腸粘膜、和在人體和小鼠腸腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。最后，用GAST特異性siRNA治療，不僅將體外的人體CRC細(xì)胞，而且將攜帶j/c基因的雜合突變的d、鼠的前胃泌素分泌腸腺瘤向杯狀細(xì)胞譜系的終末分化誘導(dǎo)。結(jié)果#f泌,凝關(guān)逆脊由謬/^M尸C臾寬謬尋^^f4長為評估針對先前存在的腫瘤中的選擇性靶向內(nèi)生前胃泌素的策略是否能拮抗體內(nèi)Tcf-4促進(jìn)的腫瘤生長，我們使用源自結(jié)直腸細(xì)胞系SW480的Balbc/棵鼠異種移植物(Morin等人，1997)，以及原發(fā)性腸腫瘤發(fā)生的小鼠模型，APCA14(Colnot等人，2004)。類似于在大多數(shù)人體結(jié)直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)的(Korinek等人，1997)，所述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂蠥PC突變和因此顯示(3-連接素/Tcf-4通路的組成性激活。對照SW480/pgaP和DLD-l/VO細(xì)胞顯示出表達(dá)高前胃泌素水平但是只有很少酰胺化和甘氨酸延長型的胃泌素(表1)。在Balbc/棵鼠中經(jīng)過7周的皮下注射，所述細(xì)胞產(chǎn)生巨大腫瘤(圖1B)。相反，當(dāng)前胃泌素分泌被直接抗基因的短發(fā)卡RNA(shRNA)的穩(wěn)定表達(dá)下調(diào)時(shí)，在同樣時(shí)間間隔內(nèi)形成腫瘤的能力被大大降低(SW480/ySO4S7^細(xì)胞。圖1A-B)。注射前述的(Hollande等人，2003)特征為表達(dá)反義GU5T基因cDNA的DLD-1結(jié)直腸癌細(xì)胞后，得到類似的結(jié)果(圖1B)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>接著，我們證明了用APCA14小鼠在與病理學(xué)更相關(guān)的環(huán)境中，前胃泌素抑制降低了先前存在的腸腫瘤的生長。這些動(dòng)物具有類似于在人類家族性腺瘤性息肉病和散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)的Jpc基因的截短的突變。它們也部分概括了在這些患者中發(fā)現(xiàn)的腸道上皮細(xì)胞顯型，由于它們在回腸中發(fā)展原發(fā)性肺瘤，而且比APCmin+〃模型有更多結(jié)腸腫瘤(Colnot等人，2004)。三月大^PCA14小鼠常常在回腸和結(jié)腸中顯示多個(gè)腺瘤(數(shù)據(jù)未顯示)，前胃泌素水平，而不是酰胺化或甘氨酸延長型胃泌素的那些，被發(fā)現(xiàn)在這些腺瘤中升高(圖Sl)。因此這些動(dòng)物提供給我們理想的體內(nèi)模型以特定地研究前胃泌素調(diào)節(jié)Tcf-4促進(jìn)的腫瘤生長的作用。用直接抗鼠基因的siRNA(JPCA14/a^7^)進(jìn)行兩周的每日治療，之前顯示對小鼠細(xì)胞有效(圖Sl),其誘導(dǎo)腸腺瘤中GL46T基因和前胃泌素表達(dá)的降低，相比于在用熒光素酶特異性siRNA(APCA14/丄")治療后發(fā)現(xiàn)的(圖1C-D，以及S1)。與降低046T表達(dá)相關(guān)，腫瘤大小的顯著降低在APCA14/OiS7^動(dòng)物的腸內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，相比于對照(卡方(Chi隱squareJ,p<0.0001，每組n=9)。所述降低在回腸中特別顯著(圖1C)，但是類似的趨勢在結(jié)腸中是明顯的，盡管由于位于所述區(qū)域的肺瘤的量較少的原因而未達(dá)到顯著(費(fèi)希爾(Fischer's)精確試驗(yàn)，p^.228)(圖1D)。另外，在腸腫瘤的總數(shù)的20%降低在全部APCA14/O^T^小鼠中被發(fā)現(xiàn)，相比于對照動(dòng)物。特別的，所述降低在APCA14/0457^組的兩個(gè)動(dòng)物中是劇烈的，在此回腸或結(jié)腸被發(fā)現(xiàn)無腫瘤。相反，GAST特異性siRNA治療不能下調(diào)相同組的一只小鼠的GAST基因水平，所述動(dòng)物顯示與對照組中發(fā)現(xiàn)的那些類似的腫瘤數(shù)量和大小(圖1C)。因此，盡管siRNA介導(dǎo)的前胃泌素產(chǎn)生的下調(diào)效率在APCA14/04S7^動(dòng)物間有變化，在顯示降低的前胃泌素水平的小鼠中，腫瘤大'J、和數(shù)量恒定下降?？傊?，這些結(jié)果顯示，前胃泌素分泌對APC突變的人CRC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生是必要的，以及在體內(nèi)抑制前胃泌素產(chǎn)生的治療強(qiáng)烈降低概括早期腺瘤性息肉病和人體結(jié)直腸癌發(fā)生的小鼠模型中的腫瘤生長。^T必^謬蘆爿PC克賞^#^^敘逸尹#/-遂凝#/化/一脊虞活無水乎由于我們顯示了靶向前胃泌素抑制了兩個(gè)不同突變的腸腫瘤模型中的肺瘤生長，我們假定所述效果是由于前胃泌素調(diào)節(jié)P-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的活性水平的能力，其已知被J尸C突變組成性激活。所述活性，通過熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄(TOP/FOP)被定量(Korinek等，1997)，在對照細(xì)胞(SW480/(3gal")中實(shí)際上升，但在前胃泌素缺失的克隆中被顯著抑制(圖2A),沒有(3-連接素或Tcf-4水平的可發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)(圖S2)。在之前建立的(Hollande等人，2003)表達(dá)反義04STcDNA的DLD-1細(xì)胞中得到類似的結(jié)果(圖S2)。用5nM重組前胃泌素治療，以及用通過在SW480/O^7^克隆中的密碼子優(yōu)化的、shRNA非敏感的前胃泌素原構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)生的內(nèi)生前胃泌素治療，我們發(fā)現(xiàn)熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄恢復(fù)很強(qiáng)的水平，證實(shí)前胃泌素能刺激所述轉(zhuǎn)錄通路(圖2A)。另外，熒光免疫染色顯示與SW480/GAS7^細(xì)胞中的Tcf-4和脫磷酸(3-連接素的細(xì)胞核數(shù)量的顯著降低相關(guān)的p-連接素/Tcf-4活性的降低，所述細(xì)胞用5nM重組前胃泌素的治療部分地恢復(fù)(3-連接素和Tcf-4的核間隔化(圖2B)。類似的，一些Tcf-4耙基因(c-myc、細(xì)胞周期蛋白Dl、Sox-9和claudin-l)的表達(dá)(Blache等人，2004;vandeWetering等人，2002)在前胃泌素缺失后被強(qiáng)烈下調(diào)，并被前胃泌素的重表達(dá)或用重組肽治療顯著刺激(圖2C和S3)。相反，用酰胺化或甘氨酸延長型胃泌素17、或用酰胺化胃泌素(CCK-B)受體拮抗劑L365、260治療，不影響所述細(xì)胞中的(3-連接素/Tcf-4活性(圖S2)，表明胃泌素的簡短處理形式不能模擬所述細(xì)胞中的前胃泌素對(3-連接素/Tcf-4活性的調(diào)節(jié)。上述數(shù)據(jù)清晰地證明，由SW480CRC細(xì)胞產(chǎn)生的前胃泌素刺激(3-連接素/Tcf-4復(fù)合體的活性。其也顯示阻斷前胃泌素產(chǎn)生導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)錄通路的強(qiáng)抑制，盡管」戶C突變的細(xì)胞中其的組成性激活。/-遂接#和化/-￥^^斧/浙aC47^C遞過^T泌^介爭/-遽凝,/Tc/"承^^錄，種#子矛^。由于所用的CRC細(xì)胞中爿尸C基因的突變狀態(tài)，以及由于Tcf-4和(3-連接素的核間隔化在前胃泌素缺失的細(xì)胞中被顯著改變(圖2A)，我們假定降低的P-連接素/Tcf-4活性是由于(3-連接素與另一個(gè)其伙伴的相互作用的增加引起的。所述伙伴之一，ICAT((3-連接素和Tcf-4的抑制劑)，近來被認(rèn)為是這兩種蛋白間結(jié)合的直接抑制劑(Tago等人，2000)，并且當(dāng)在DLD-1和SW480細(xì)胞中過量表達(dá)時(shí)，響應(yīng)于降^^的增殖和上升的細(xì)胞死亡(Sekiya等人，2002)。前胃泌素減少誘導(dǎo)SW480/O4S7^細(xì)胞中的ICATmRNA和蛋白質(zhì)的強(qiáng)烈表達(dá)(圖3A和B)，而另一個(gè)|3-連接素的接合伙伴，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)未受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。ICAT的重新阻遏被shRNA非敏感前胃泌素原cDNA的重表達(dá)誘導(dǎo)(圖3A和B)，以及當(dāng)用5nM重組前胃泌素治療后被誘導(dǎo)(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，相比于在其野生型同窩出生者中發(fā)現(xiàn)的，ICAT表達(dá)在顯示人前胃泌素的組織特異性腸過量表達(dá)(Tg/Tg)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Cobb等人，2004)的結(jié)腸上皮中弱的多(圖3C)。由于用所述小鼠表達(dá)的前胃泌素是突變的并因而對加工酶不敏感(Cobb等人，2004)，該結(jié)果證明全長前胃泌素也能下調(diào)體內(nèi)的ICAT表達(dá)。因此，內(nèi)生前胃泌素能阻遏體外和體內(nèi)的ICAT表達(dá)，CRC細(xì)胞中的前胃泌素減少足以誘導(dǎo)所述抑制劑的強(qiáng)重新表達(dá)。因此，我們研究了ICAT是否真的是涉及CRC細(xì)胞中的前胃泌素調(diào)節(jié)(3-連接素/Tcf-4的分子目標(biāo)。應(yīng)用免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)前胃泌素缺失的SW480/G^S7^細(xì)胞中的脫磷酸(3-連接素和ICAT間的結(jié)合顯著增加(圖4A),平行出現(xiàn)這兩個(gè)蛋白的細(xì)胞質(zhì)共定位(圖4B)。相反，Tcf-4與脫磷酸(3-連接素的免疫共沉淀的量相比于SW480/(3-g"/W顯著降低(圖4A)。接著，當(dāng)用重組前胃泌素處理SW480/O4S7^細(xì)胞后，p-連接素被再次優(yōu)選與Tcf-4接合，而與ICAT的接合以及兩個(gè)蛋白質(zhì)的定位被降低(圖4A-B)。為了確定前胃泌素缺失的細(xì)胞中的ICAT重表達(dá)是對p-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性的抑制的功能響應(yīng)，我們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒驅(qū)動(dòng)的shRNA表達(dá)，實(shí)驗(yàn)性地防止SW480/GAS7^細(xì)胞中的ICATmRNA和蛋白質(zhì)的重新表達(dá)(圖S4)。我們發(fā)現(xiàn)，P-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的激活在得到的SW480/O457^/ICATW細(xì)胞中被恢復(fù)(圖4C),其也顯示增加的Tcf-4靶基因表達(dá)(圖4D)。接著，所述增加通過SW480/GU57^/ICAT"細(xì)胞中的密碼子優(yōu)選形式的ICATcDNA的過量表達(dá)被防止(圖4C、4D和S4)，證明在該過程中ICAT的特異性。所述結(jié)果表明，ICAT表達(dá)水平的調(diào)節(jié)是前胃泌素調(diào)節(jié)(3cat/Tcf-4活性的主要分子事件。在體內(nèi)，低ICAT水平(圖5A和5C)以及Tcf-4靶基因的高表達(dá)(圖5B-C，和圖S5)在APCA14動(dòng)物的前胃泌素過量表達(dá)腸腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。相反，ICAT表達(dá)在由用0457^特異性siRNA治療的小鼠中收集的腺瘤中顯著增加(圖5A-C)，伴隨Tcf-4靶基因的強(qiáng)阻遏。令人感興趣的是，當(dāng)相比于GAS7^動(dòng)物時(shí)，在APCA14/丄i/^M、鼠的肉眼可見健康上皮中的細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和CD44的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)上升，表明單個(gè)4^等位基因的突變足以部分地增加APCA14腸中的靶基因表達(dá)，前胃泌素減少對降低所述癌癥前期調(diào)節(jié)中的Tcf-4活性已經(jīng)有效(圖5B和圖S5)。另夕卜，由23名患有CRC的患者得到的顯微切割人結(jié)腸腫瘤以及匹配的健康樣品中的mRNA水平在78%的被研究患者(18/23)的腫瘤中不同程度的增加(圖5D,上圖)，而ICAT表達(dá)在相應(yīng)的腫瘤樣品中被下調(diào)(圖5D,下圖)。在全部增加的a45T基因表達(dá)和ICAT阻遏間發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)r=-0.46,p=0.027)，確證體內(nèi)的ICAT的前胃泌素誘導(dǎo)阻遏的相關(guān)性(圖5D,插圖)。該相關(guān)性通過源自低(例如患者22)或高(例如患者4)前胃泌素表達(dá)的患者的樣品的免疫組織化學(xué)被證實(shí)，顯示ICAT被阻遏，在表達(dá)高前胃泌素水平的腫瘤中對Tcf-4靶基因的免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，而這些表達(dá)模式在具有低前胃泌素的腫瘤中被逆轉(zhuǎn)(圖5E)。在源自全部11名用免疫組織化學(xué)測試的患者的CRC樣品中得到類似結(jié)果，所述相關(guān)性反映了體外觀察到的ICAT水平和p-連接素/Tcf-4活性之間的反相關(guān)性?？傊?，這些結(jié)果證明，盡管J戶C突變的細(xì)胞中p-連接素/Tcf-4復(fù)合體的組成性激活，所述通路的活性能通過體內(nèi)或體外的抑制劑ICAT的重表達(dá)用前胃泌素減少抑制。就我們所知，這些結(jié)果也提供ICAT的激素調(diào)節(jié)的第一次證明，其為在先描述為腫瘤抑制基因(Daniels和Weis,2002)的卩-連接素連接Tcf-4的小型抑制劑(Tago等人，2000)。/C4r《這W徙復(fù)喊應(yīng)f由oc敘敏f的;T眾泌,減,滲導(dǎo)的摩詢^^掀'生由于結(jié)腸胂瘤發(fā)生中的f3-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性的組成性激活起的基本作用，以及由于我們的結(jié)果表明ICAT重表達(dá)響應(yīng)于前胃泌素缺失的腫瘤細(xì)胞中的降低的Tcf-4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，我們還研究了ICAT阻遏作為前胃泌素的肺瘤促進(jìn)活性的基本成分在體外和體內(nèi)的作用。在體外，ICAT在SW480/O457^/ICATW細(xì)胞中重表達(dá)的抑制被發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了其在軟瓊脂生長分析中的非停泊性生長的能力，達(dá)到類似于在SW480/f3-Gal"細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平(圖6A)。在體內(nèi)，在BALB/c棵鼠中注射后，SW480/O4S7^/ICAT(-)細(xì)胞形成腫瘤的能力比SW480/O4S7^/Luc(-)細(xì)胞高很多(圖6B),類似于SW480/p-Gal"細(xì)胞C見圖1B)?？傊?，這些結(jié)果清晰地證明，源自CRC細(xì)胞中的內(nèi)生前胃泌素的ICAT的阻遏對所述激素原的胂瘤促進(jìn)活性起作用。關(guān)鍵是，其也顯示由前胃泌素減少誘導(dǎo)的ICAT重新表達(dá)足夠強(qiáng)以誘導(dǎo)P-連接素/Tcf-4活性的顯著抑制，并從而降低體外和體內(nèi)的腫瘤生長。整合,遽接激雜時(shí)褲腐乾然殍3-浚雜介導(dǎo)^浚話喊應(yīng)^由f;^眾必,W/C471/^遽希/-遂疾,/7b/"遞蕃謬,。由于前胃泌素近來被顯示在體外(Hollande等人，2003)和體內(nèi)(Ferrand等人，2005)激活腸細(xì)胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PBK)通路，我們測定該酶的激活是否對SW480細(xì)胞中的前胃泌素誘導(dǎo)的ICAT阻遏和p-連接素/Tcf-4活性的刺激是否是必要的。首先，我們發(fā)現(xiàn)用選擇性PI3k抑制劑LY294002孵育SW480/pgalW細(xì)胞足以誘導(dǎo)ICAT的表達(dá)(圖7A),并降低卩-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性(圖S7)，因此揭示了先前未知的所述兩種通路間的聯(lián)系。相反，分別用10(iMPP2或1|iMPD98059對Src或ERK1/2通路的藥理學(xué)抑制，不會(huì)影響ICAT表達(dá)或P-連接素/Tcf-4活性(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，LY294002消除了用重組前胃泌素治療SW480/GAS7^克隆誘導(dǎo)的ICAT下調(diào)(圖7A)，顯示P13k激活對前胃泌素的ICAT阻遏是必要的。因此，Akt/PKB的絲氨酸473-磷酸化，一種PI3k的下游目標(biāo)，在前胃泌素缺失的SW480/O457^細(xì)胞中顯著降低，但是在用5nM重組前胃泌素孵育后被恢復(fù)(圖7A)。Akt/PKB的Ser473已知是整合素連接激酶(ILK)的直接磷酸化目標(biāo)(Delcommenne等人，1998)。為了確定ILK激活是否是前胃泌素和ICAT的阻遏之間的遺漏的分子連接，我們首先評估了ILK的表達(dá)和/或活性是否被SW480細(xì)胞中的前胃泌素調(diào)節(jié)。ILK的表達(dá)和活性在SW480/O^ST^細(xì)胞中都顯著降H該抑制在用5nM重組前胃泌素處理后被部分逆轉(zhuǎn)(圖7B)。這些結(jié)果由顯示整合素pi的絲氨酸磷酸化中劇烈下降的數(shù)據(jù)確證，其為SW480/a467^克隆中的一個(gè)下游目標(biāo)(Mulrooney等人，2000)(圖7B)。另夕卜，我們發(fā)現(xiàn)，顯性負(fù)相ILK(DN-ILK)的瞬時(shí)表達(dá)，其被確定阻遏Akt/PKB磷酸化，能誘導(dǎo)SW480/(3gal。細(xì)胞中的ICAT表達(dá)(圖7C)，表明該酶涉及調(diào)控ICAT基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這些SW480/(3gal"/DN-ILK細(xì)胞中的P13k的藥理學(xué)抑制不再增加ICAT表達(dá)，表明在ICAT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中，兩種酶涉及相同的通路，或冗余通路(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，ICATmRNA和蛋白質(zhì)的阻遏以及Akt/PKB的上升的磷酸化，其用重組前胃泌素處理前胃泌素缺失的SW480/GAS7^細(xì)胞誘導(dǎo)，通過ILK的顯性負(fù)相介導(dǎo)的抑制而被預(yù)防(圖7C)。相反，SW480/O4S盧細(xì)胞中的shRNA介導(dǎo)的ICAT阻遏(如圖S4所示)不改變ILK表達(dá)或活性(數(shù)據(jù)未顯示)，確定ICAT位于前胃泌素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游。這些結(jié)果清晰地證明，P13k和ILK的激活對CRC細(xì)胞中的ICAT的前胃泌素介導(dǎo)的阻遏起作用。粉必。由于Wnt/p-連接素/Tcf-4通路被認(rèn)為對保持腸隱窩底部的細(xì)胞的干細(xì)胞/祖細(xì)胞表型是必要的，并且被普遍視為細(xì)胞增殖和分化的分子開關(guān)(Radtke和Clevers,2005;vandeWetering等人，2002)，我們接著確定在前胃泌素減少的CRC細(xì)胞中，該通路的下調(diào)是否能驅(qū)動(dòng)這些細(xì)胞分化。由于其最近被描述為細(xì)胞分化的早期啟動(dòng)子的作用(Chung和Eng,2005)，我們首先分析了PTEN(從染色體10中刪除的磷酸酶和張力蛋白同源物)在穩(wěn)定的SW480/O457^克隆中的定位。與其在SW480/Pga^細(xì)胞中的主要細(xì)胞質(zhì)定位明顯相反，PETN基本上在SW480/GAS7^克隆的核中被發(fā)現(xiàn)(圖8A)，被認(rèn)為與其在細(xì)胞分化中的作用相關(guān)的定位(Lian和DiCristofano,2005)。由于開發(fā)穩(wěn)定的前胃泌素缺失的克隆的方法被期望為選擇最少分化和非凋亡的細(xì)胞，用若丹明標(biāo)記的直接抗GAsr或p-半乳糖苷酶基因的siRNA寡聚核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，與終末分化的腸細(xì)胞譜系相關(guān)的基因表達(dá)在SW480細(xì)胞中被定量。杯狀細(xì)胞特異性基因Muc-2的表達(dá)中的顯著誘導(dǎo)在SW480/O4S7^;而不在SW480/p-galW細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，沒有可檢測的編碼嗜鉻粒蛋白A(在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá))或腸上皮細(xì)胞特異性堿性磷酸酶的基因的改變(圖8B)。最后，G^S7^細(xì)胞中的半胱天冬酶-3激活的發(fā)現(xiàn)，和對激活的半胱天冬酶-3陽性的細(xì)胞也為Muc2陽性的發(fā)現(xiàn)(圖8C)，表明在體外促進(jìn)其凋亡之前，前胃泌素減少能將CRC細(xì)胞分化成分泌譜系。用重組前胃泌素處理48小時(shí)逆轉(zhuǎn)這些表型(圖8C),而酰胺化和甘氨酸延長型胃泌素沒有效果(未顯示)。用GASr特異性siRNA低聚核苷酸轉(zhuǎn)染的DLD-1細(xì)胞得到類似的結(jié)果(未顯示)。因此前胃泌素減少能使CRC細(xì)胞在體外終末分化和凋亡。另外，我們設(shè)法證明體內(nèi)前胃泌素水平的降低也足以誘導(dǎo)(3-連接素/Tcf-4通路的組成性激活誘導(dǎo)的腸腫瘤的分化。從用熒光素酶或a4sr特異性siRNA處理的APCA14小鼠中收集的樣品的免疫組織化學(xué)(見圖1)，證明相比于對照，APCA14/0457^動(dòng)物的殘余的小腸和結(jié)腸腺瘤顯示Muc-2和阿辛藍(lán)陽性細(xì)胞數(shù)量的大量增加(圖8D)，符合在相同樣品中增加ICAT表達(dá)和降低c-Myc表達(dá)(見圖5A-C)。最后，雖然對激活的半胱天冬酶3染色的細(xì)胞在對照動(dòng)物中非常稀少，其數(shù)量被發(fā)現(xiàn)在APCA14/a^7^動(dòng)物的腺瘤中強(qiáng)烈上升(圖8D)。這些結(jié)果證明，siRNA介導(dǎo)的G^ST基因的下調(diào)能使胂瘤細(xì)胞在體內(nèi)終末分化和凋亡。APCA14小鼠發(fā)展的腸腺瘤未表達(dá)甘氨酸延長型或酰胺化型胃泌素。由于通過用產(chǎn)生抗重組前胃泌素的多克隆抗體免疫印跡從未發(fā)現(xiàn)高分子量的處理中間體，以及由于全長重組前胃泌素顯示在體外調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞分化，我們斷定，在GAST特異性siRNA處理之后，腫瘤細(xì)胞分化和降低的腫瘤生長主要由于全長前胃泌素濃度的降低。討論本發(fā)明提供證明，阻斷前胃泌素的產(chǎn)生會(huì)顯著抑制人CRC細(xì)胞的"組成性"(3-連接素/Tcf-4轉(zhuǎn)錄活性，降低其體外非停泊性生長以及在棵鼠中形成腫瘤的能力，并且促進(jìn)其分化和凋亡。前胃泌素減少導(dǎo)致"P-連接素和Tcf-4的抑制劑"(ICAT)的重表達(dá)，其為一種最初在非洲蟾蜍中鑒定的并顯示抑制(3-連4妄素與Tcf-4的相互作用的小肽(Gottardi和Gumbiner,2004;Tago等人，2000)。另夕卜，在基因表達(dá)已經(jīng)在先被關(guān)閉的細(xì)胞中，用重組前胃泌素處理下調(diào)的ICAT和增加的P-連接素/Tcf-4活性，確認(rèn)了慢性前胃泌素分泌與CRC細(xì)胞中保持高水平的所述通路的激活有關(guān)。在此顯示的慢性前胃泌素分泌與ICAT阻遏之間的關(guān)聯(lián)的生理學(xué)相關(guān)性的強(qiáng)調(diào)在體內(nèi)通過在患有CRC的16名患者的圖中的結(jié)直腸腫瘤中顯示所述兩個(gè)事件之間的緊密相關(guān)性的結(jié)果，以及通過證明ICAT表達(dá)在易患腫瘤的、前胃泌素過量表達(dá)的小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞中被下調(diào)(Cobb等人，2004)。所述數(shù)據(jù)與之前觀察的一致，即前胃泌素促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展，并提供在胃泌素不足的APCmin+、鼠中觀察到的腺瘤的數(shù)量和大小的強(qiáng)烈下降的分子解釋(Koh等人，2000)。而且，相比于類似背景的野生型小鼠，由GAS基因的無效突變的小鼠的胃壁細(xì)胞中的靶基因的表達(dá)分析，顯示20%的分化表達(dá)基因也已知是Wnt和Myc的耙基因，強(qiáng)調(diào)了所述信號通路之間的關(guān)聯(lián)(Jain等人，2006)。眾所周知的，雖然有文獻(xiàn)很好地證明了CRC中增加的前胃泌素表達(dá)(Ciccotosto等人，1995;Konturek等人，2002;Siddheshwar等人，2001;VanSolinge等人，1993)，在本發(fā)明中描述的ICAT阻遏與僅有的有關(guān)所述領(lǐng)域的在先報(bào)道(Koyama等人，2002)相矛盾。所述矛盾是由于Koyama等人報(bào)道的ICAT增加的表達(dá)是用半定量RT-PCR在非顯微切割組織上測量的。我們的結(jié)果，使得直接比較健康粘膜和腫瘤中的上皮來源的細(xì)胞的ICAT表達(dá)，顯示更一致的所述ICAT作為腫瘤抑制劑的作用。實(shí)際上，前胃泌素介導(dǎo)的ICAT阻遏顯示對腫瘤生長是必要的，因?yàn)樵谇拔该谒販p少的CRC細(xì)胞中新合成的ICAT被顯示與Tcf-4竟?fàn)幗Y(jié)合(3連接素，導(dǎo)致Tcf-4的轉(zhuǎn)錄活性下降并降低肺瘤發(fā)生，符合關(guān)于所述肽的在先報(bào)道數(shù)據(jù)(Sekiya等人，2002)?；謴?fù)能力，雖然不完全，ICAT的阻遏以及通過用外生前胃泌素處理的f3-連接素/Tcf-4通路的激活，贊同由膜受體介導(dǎo)的自分泌/副分泌環(huán)的存在。涉及通過前胃泌素的卩連接素/Tcf-4活性的ICAT介導(dǎo)調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的分析使我們識(shí)別CRC細(xì)胞中P連接素/Tcf-4和PI3激酶/ILK通路之間的新連接物。實(shí)際上，PI3k的藥理學(xué)抑制和ILK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯性負(fù)相誘導(dǎo)的中斷增加ICAT表達(dá)并防止所述肽的前胃泌素介導(dǎo)的阻遏。Tan等人的在先結(jié)果(Tan等人，2001)證明，ILK的抑制通過snail的阻遏抑制了卩連接素-Tcf/Lef依賴性轉(zhuǎn)錄，從而在APC突變的人結(jié)腸癌細(xì)胞中的膜上增加上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)和恢復(fù)P連接素。本發(fā)明的結(jié)果表明，甚至在非融合細(xì)胞中，其(3連接素的膜恢復(fù)是低的，前胃泌素介導(dǎo)的ILK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能通過ICAT表達(dá)的調(diào)控調(diào)節(jié)卩連接素/Tcf-4活性。最后，我們的結(jié)果也顯示，拮抗前胃泌素功能的藥劑提供新的治療選擇，以支持現(xiàn)有的結(jié)直腸癌的外科方法。在此呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，前胃泌素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制能提供用于結(jié)腸癌治療的可選的特異性治療。由于前胃泌素看起來僅由腫瘤而不由健康上皮分泌，所述策略抵消常見的APC突變的效果并降低(3連接素/Tcf-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)閉物的激活至生理學(xué)水平，從而促進(jìn)正常隱窩完整性的保留。方法細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)M結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD1和SW480在補(bǔ)充了10。/。胎牛血清(Eurobio，LesUlis,法國)、1%的L-谷氨酸和青霉素/鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中37。C維持。材料下列一抗被使用小鼠抗-脫磷酸卩連接素(clone8E4;AG.Scientific),小鼠抗卩連接素和抗上皮細(xì)胞4丐粘蛋白(TransductionLaboratories)、山羊抗Tcf隱4(SantaCruzBiotechnology)、兔抗ICAT(DrC.Gottardi贈(zèng)送；(Gottardi和Gumbiner，2004))、多克隆抗PTEN(Upstate)、兔抗磷酸絲氨酸(Zymed)、用于蛋白質(zhì)印跡的(CellSignaling)和用于免疫沉淀反應(yīng)的(Upstate)兔抗ILK、小鼠抗整合素(31(Chemicon)、兔抗-Akt、抗-Ser473磷酸化Akt、抗激活的半胱天冬酶3(CdlSignaling),抗-Muc2單克隆抗體(Neomarkers)。人組織收集16名患者的結(jié)腸腫瘤和組織學(xué)正常上皮(if又自顯著遠(yuǎn)離腫瘤處)的樣品，在依據(jù)法國政府規(guī)章和地方委員會(huì)方針切除后，由病理學(xué)家得到。得到所有患者的知會(huì)同意。組織樣品在液氮中保存直到進(jìn)一步使用。組織切片、顯微切割和RNA制備組織切片用液氮冷凍的腫瘤樣品制備，進(jìn)行蘇木精/曙紅染色以評估其質(zhì)量、組織中的^^向、和上皮含量。(3連接素、Tcf-4、c-myc和ICAT的熒光免疫檢測在接近用于顯微切割的切片的切片上進(jìn)行。激光捕獲顯微切割(LCM)在4-6個(gè)切片每樣品上用產(chǎn)自Arctums的PixCellIIe顯微切割儀(Alphelys，Plaisir，法國)進(jìn)行。下列激光束設(shè)置被應(yīng)用265mV，45mWh，15jam直徑，18ms。顯《效切割的組織而后直接收集在RNA裂解緩沖液中，RNA用RNAeasyMicrokit(Qiagen，Courtaboeuf，法國)依據(jù)制造商的說明書制備?；厥盏腞NA的質(zhì)量和數(shù)量用RNApicoLabchips(AgilentTechnologies,PaloAlto，力口利-畐尼亞)^平估。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃泌素基因反義和對照cDNA向DLD1細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染在(Hollande等人，2003)中說明。為了產(chǎn)生前胃泌素shRNA,下列低聚核苷酸被克隆至pSilencer載體(Ambion)中并轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中有義5，-GAAGAATT-3，CSEQIDN。l)禾口反義5,-AATTAAAAAACTTCTTCGGATACCTACCTTCTCTTGAATCCATCCATAGGCTTCTTCGGCC3'(SEQIDN。2)。用于產(chǎn)生對照shRNA的(3-半乳糖苷酶低聚核苷酸為有義5，GCGTCTGGCCTTTTTTTGGAAA3，(SEQIDN。3);反義5'AGCTTTTCGCGTCTGGCCTTGG3，(SEQIDN。4)。5xl04細(xì)胞/孔被接種并用500ng的pSilencer/前胃泌素-shRNA或pSilencer/(3-半乳糖苷酶-shRNA、50ng的pCDNA-3、和5[il/孔的Exgen500(Euromedex)轉(zhuǎn)染24h。用新霉素(500ng/(il)進(jìn)行選擇。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染ICAT或熒光素酶shRNA到SW480/GAS(_)細(xì)胞中，用于ICAT(有義5，GATCCGGATGGGATCAAACCTGACATTTTCAAGAGAAATGTCAGGTTTGATCCCATCTTTTTTG3,(SEQIDN。5)AAAATGTCAGGTTTGATCCCATCCG3'(SEQIDN。6))、和熒光素酶(有CCTTAATCTTTTTT3'(SEQIDN。7),和反義5'AATTGATTAAGGCCCAGCTCTCTTGAAAAGCTGGGCCCTTCTTAATGTCG3'(SEQIDN。8))的shRNA低聚核苷酸被克隆至pSIREN-retroQ(Clontech)中。雙向包裝細(xì)胞系(ONX;DrGarryNolan,StanfordUniversity,Stanford,加利福尼亞)如Pear等人所述的被轉(zhuǎn)染(Pear等人，1993)。含有病毒的培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染后48hr被移除并以1500rpm離心5分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。目標(biāo)細(xì)胞(2.105/孔，在6孔板中)在聚凝胺(8嗎/ml)存在下用含有病毒的2ml離心培養(yǎng)基感染。感染的細(xì)胞用嘌呤霉素(5嗎/ml)處理以選擇陽性克隆。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前一天，SW480細(xì)胞在24孔板中接種(5><104細(xì)胞/孔)。依據(jù)制造商的說明書，細(xì)胞用100pmol的若丹明標(biāo)記的04S特異的或P半乳糖苷酶特異的shRNA，和5ial/孔的Exgen500(Euromedex)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48hr或72hr后，細(xì)胞被裂解(用于免疫印跡和PCR)或在1%的的多聚曱醛中固定用于免疫染色。阿辛藍(lán)染色轉(zhuǎn)染后72hr，蓋玻片上的細(xì)胞用PBS洗滌并用阿辛藍(lán)(在3%醋酸中，10g/l)孵育30min。用水沖洗細(xì)胞后，蓋玻片被固定在mowiol中的載玻片上并在4。C下保存直到使用。RT-定量PCR在37。C下，2.5jig總RNA用DNAseRQ1(Promega)預(yù)處理30min,用于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(/"wYragen)的逆轉(zhuǎn)錄。定量PCR用LightCyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreenI^式劑盒(RocheDiagnostics,Meylan,法國)進(jìn)行，條件如下肌動(dòng)蛋白在95°C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95°C10秒、58°C6秒、72°C11秒。熔解曲線95°C0秒、68。C30秒、95°C0秒和在40。C下冷卻2分鐘；c-myc、ILK、嗜鉻粒蛋白A和GAPDH擴(kuò)增在95°C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增70。C10秒、58°C6秒、72°C13秒。熔解曲線為95°C0秒、80。C30秒、95。C0秒和40。C下冷卻2分鐘。前胃泌素、Muc-2、ALP和ICAT擴(kuò)增在95°C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增70。C10秒、95。C6秒、72。C11秒。熔解曲線為95°C0秒、80°C30秒、70。C0秒和40°C下冷卻2分鐘。用于選擇基因的擴(kuò)增的引物為GAPDH-有義5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3，(SEQIDN。9)反義5'GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3，(SEQIDN。10);肌動(dòng)蛋白-有義5'CGGGAATCTGCGTGACAT3，(SEQIDN。ll);反義5'AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3，(SEQIDN。12);ILK-有義5'ATGACTGCCCGAATTAGCATG3，(SEQIDN。13);反義5'GCTACCCAGGCAGGTGCATA3，(SEQIDN。14);ICAT-有義5'GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3，(SEQIDN。15);反義5'GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3，(SEQIDN。16);c-myc-有義5，CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3，(SEQIDN。17);反義5TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3，(SEQIDN。18);人前胃泌素-有義5'AGAGGATCCAAATGCAGCGACTATGTGTGTATG3，(SEQIDN。19);反義5，GGCGAATTCCTAGGATTGTTAGTTCTCATCCTCAG3'(SEQIDN。20);Muc-2-有義5TGGGTGTCCCTCGTCTCCTACA3,(SEQIDN。21);反義5'TGTTGCCAAACCGGTGGTA3，(SEQIDN。22);堿性磷酸酶-有義5，CTCCAACATGGACATTGACG3，(SEQIDN。23)反義5，CAGTGCGGTTCCACACATAC3，(SEQIDN。24);嗜4各粒蛋白A-有義5'ATCACCGCLACTGCCACCACCA3，(SEQIDN。25);反義5，CACCTTAGTGTCCCCTTTTGTCATAGGGCT3，(SEQIDN。26)。軟瓊脂集落形成分析lxlO5細(xì)胞被重懸浮在補(bǔ)充10%胎牛血清、1%谷氨酸和青霉素/鏈霉素的DMEM-F12中的0.2%瓊脂中，并鋪在含有固化的底層的6-cm培養(yǎng)皿中(生長培養(yǎng)基中0.5%瓊脂)。鋪板8天后，細(xì)胞用0.02%的結(jié)晶紫染色，集落的大小和數(shù)量在顯微鏡下定量。所有克隆被一式三份接種，每個(gè)計(jì)數(shù)十個(gè)區(qū)域。體內(nèi)研究體內(nèi)實(shí)-驗(yàn)依照法國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究方針(DirectiondesServicesV&6rinaires，Minist6rede1，Agriculture,AgreementN°B34-172-27)進(jìn)4亍，并執(zhí)行實(shí)驗(yàn)瘤形成中的動(dòng)物福利UKCCCR方針。2xl0^田胞被皮下注射進(jìn)6周大無胸腺BALB/c-nu/nu(棵)鼠中。其后定期跟蹤腫瘤生長(估計(jì)的腫瘤體積K長x寬x厚)/2)。APCA14小鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)，隨機(jī)分為兩組。第一組(11=9)用每曰一次的250|ig/kg的抗鼠O^SrmRNA的siRNA腹腔^會(huì)藥治療。對照小鼠(n二9)用類似計(jì)量的抗熒光素酶siRNA治療。(圖S7在線上的siRNA序列)。SiRNA設(shè)計(jì)并入3，突出物，并且不含5，UGUGU3，序列，以在體內(nèi)最小化促炎癥反應(yīng)響應(yīng)和降解(Judge等人，2005;Marques等人，2006)。處理IO天后，挑選小鼠，其血液被收集，腸被切除。腸和結(jié)腸的腺瘤評分在(Colnot等人，2004)中描述。健康腸粘膜的樣品，以及腸和結(jié)腸腺瘤，被置于4%PFA和石蠟封裝，或在液氮中冷卻，用于蛋白質(zhì)印跡、IHC或RNA提耳又。血漿^皮制備并用FACS分析系統(tǒng)(BectonDickinson)分析IL-6和TNFct。熒光素酶報(bào)告基因分析用于測量TCF/LEF-1轉(zhuǎn)錄活性的實(shí)驗(yàn)方案之前被描述(Morin等人，1997)。簡言之，細(xì)胞用500ng的TCF/LEF-1報(bào)告基因(pTOP-FLASH)，或?qū)φ蛰d體(pFOP-FLASH)以及用25ngpCMV-Renilla轉(zhuǎn)染。熒光素酶活性用雙熒光素酶寺艮告基因分析系統(tǒng)(Promega)定量，并相對于Renilla活性標(biāo)準(zhǔn)化。熒光免疫染色熒光免疫染色如在先所述的進(jìn)行(Hollande等人，2003)。而后載片用具有40倍油浸鏡頭的激光掃描LEICAsp2共焦顯微鏡觀察。石蠟組織切片上的免疫化學(xué)石蠟組織切片由轉(zhuǎn)基因?yàn)槿薌AS基因(Tg/Tg)或者野生型同窩出生者的FVB/N小鼠制備(Cobb等人，2004)。脫蠟和水合后，切片用過氧化物酶在室溫下預(yù)處理20分鐘。抗原用在10mMTris-1mMEDTA,pH9中煮沸20分鐘的樣品回收。載片被冷卻至室溫，并用PBS+0.05%BSA中的抗體在4。C下孵育過夜。在所有情況下，Envision+kit(DAKO)被用作二級試劑。染色用DAB(Sigma)顯影，載片用蘇木精或核堅(jiān)牢紅(NuclearFastRed)復(fù)染并固定。蛋白質(zhì)裂解、免疫沉淀反應(yīng)、SDS-PAGE和Western免疫印跡蛋白質(zhì)裂解、免疫沉淀反應(yīng)和免疫印跡如在先所述的進(jìn)行(Hollande等人，2003)。蛋白質(zhì)用ECLPlus(AmershamBiosciences)顯像，用ImageJ1.32J(NIH，Bethesda,MD)通過密度計(jì)量學(xué)定量條帶。免疫復(fù)合體激酶分析反應(yīng)通過每個(gè)試管添加含有0.5(ig的ATP(250mMATP,1(iCi[Y-32p]ATP)的25jil的激酶緩沖鹽(50mMHepespH7.0，ImMMnCl2,1mM原釩酸鈉，2mMNaF，5(ig髓磷脂堿性蛋白(Sigma))起始，并在30°C下孵育20分鐘。反應(yīng)通過添加10|il的4x樣品緩沖鹽終止。試管在lOOOOg下離心1分鐘，蛋白質(zhì)溶解在14%SDS-page凝膠中。底物的磷酸化通過放射自顯影術(shù)顯像(Marotta等人，2003)。放射性免疫分析細(xì)胞上清液中的GAS基因產(chǎn)物前胃泌素、甘氨酸延長型胃泌素(G-gly)和酰胺化胃泌素(G-NH2)用放射性免疫分析定量，如在先所述的(Hollande等人，1997)。統(tǒng)計(jì)分析所有的統(tǒng)計(jì)分析用SASversion9.1forWindows(Cary,NC,USA)進(jìn)行。斯氏t檢驗(yàn)被應(yīng)用以確定用或未用重組前胃泌素處理的對照和前胃泌素減少的細(xì)胞間的差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。為了確定人腫瘤中的GAS1和ICAT基因表達(dá)間的相關(guān)性，在確定皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)(r)前，用其自然對數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化變量。實(shí)施例2抗前胃泌素選擇性抗體逆轉(zhuǎn)ICAT表達(dá)上的前胃泌素阻遏和誘導(dǎo)c-myc表達(dá)的下降。介紹本實(shí)施例說明了兩種獨(dú)立產(chǎn)生的抗前胃泌素的多克隆抗體的特征，目的為證明其選擇性識(shí)別全長前胃泌素(l-80)肽而不是可能存在于人血液中的加工過的肽，如酰胺化胃泌素、甘氨酸延長型胃泌素、和六氨基酸C端側(cè)肽(CFTP)。體外用ELISA分析進(jìn)行該表征。下述第二步是證實(shí)前胃泌素對ICAT表達(dá)和p連接素/Tcf4活性的作用能通過選擇性抗體被阻斷。為了證明被稱為前胃泌素抗體的中和活性，我們應(yīng)用人SW480結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞，其具有apc基因突變并由于組成性卩連接素/Tcf4活性而顯示內(nèi)生前胃泌素分泌。這些細(xì)胞分泌大量前胃泌素的能力和酰胺化和甘氨酸延長型胃泌素的非常低的水平在表1中說明。這些細(xì)胞用兩個(gè)不同多克隆抗體單獨(dú)處理，一個(gè)針對前胃泌素的N端序列，另一個(gè)針對C端序列。N端序列為SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN°32)C端序列為FGRRSAEDEN(SEQIDN°31)結(jié)果-抗體選擇性抗體的選擇性用在方法部分描述的ELISA試驗(yàn)評估。結(jié)果(圖IO)顯示，兩個(gè)多克隆抗體都選擇性地識(shí)別前胃泌素和用作其產(chǎn)物的免疫原的各自的肽。其不與甘氨酸延長型胃泌素、酰胺化胃泌素或C端側(cè)肽(CTFP)(序列SAEDEN)結(jié)合，另一個(gè)肽衍生自前胃泌素的突變過程并在人體血清中被發(fā)現(xiàn)(SmithKA,Gastroenterology2006)。-前胃泌素抗體的中和活性前胃泌素抗體抑制由前胃泌素對ICAT阻遏并誘導(dǎo)p連接素/Tcf4復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性的降低的能力在SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞在針對前胃泌素(l-80)的N端或C端末端的兔多克隆抗體存在下被孵育30小時(shí)，兩者都以1/5000稀釋，相比于用相同濃度的非特異性兔多克隆抗體處理的細(xì)胞，ICATmRNA表達(dá)被強(qiáng)烈增加而c-Myc和細(xì)胞周期蛋白Dl的那些被顯著降低。c-Myc和細(xì)胞周期蛋白Dl是卩連接素/Tcf4轉(zhuǎn)錄活性的識(shí)別目標(biāo)，其表達(dá)的降低被認(rèn)為是P連接素/Tcf4活性降低的結(jié)果(圖11)。結(jié)論這些結(jié)果證明，在體外，ICAT表達(dá)的前胃泌素抑制能被其與選擇性抗體的結(jié)合逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致組成性(3連接素/Tcf4活性的抑制。本發(fā)明因此提供下述概念的第一次證明，即前胃泌素抗體能一皮用于阻斷通過ICAT和(3連接素/Tcf4活性發(fā)生的前胃泌素的肺瘤發(fā)生前效果。方法ELISA抗原以所示濃度被稀釋在PBS中，100fil被涂在多吸附(multisorb)96孔板于4°C下過夜。次日，孔用200)il的PBS/Tween1%洗滌3次，在22°C下于2小時(shí)內(nèi)添力口100|il的阻斷溶液(PBS/Tween1%/BSA0.1%)。當(dāng)用PBS/1%Tween再洗滌3次后，一抗在阻斷溶液中稀釋，在22。C下于2小時(shí)內(nèi)添加100iil至孔中?？贵w濃度在圖中顯示。二抗在相同的阻斷緩沖液中稀釋，洗滌3次后，在22。C下于2小時(shí)內(nèi)添加100(il至孔中。最后，孑L再次用PBS/Tween1%洗滌，在22。C下于20分鐘內(nèi)添加100piOPD溶液底物。反應(yīng)用50fil的H2S044N停止，在492nm處讀取。細(xì)胞培養(yǎng)和用前胃泌素選擇性抗體處理CRC細(xì)胞系SW480被維持在37。C下的補(bǔ)充了10。/。的胎牛血清(Eurobio，LesUlis，法國)、1%的L谷氨酸和青霉素/《連霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中。SW480細(xì)胞被鋪在含有10%FBS、1%抗生素和1%谷氨酸的DMEM中的6孔板(200000細(xì)胞/孔)中，在37°C和5%C02下放置生長一夜，而后血清饑餓24小時(shí)。次日早晨，培養(yǎng)基用不含F(xiàn)BS,含有對照或前胃泌素選擇性多克隆抗體的1/5000稀釋液代替，而后在37°C和5%C02下孵育。含有抗體的培養(yǎng)基12小時(shí)后被更新。30小時(shí)后，細(xì)胞用PBS洗滌，用RNA提耳又試劑盒裂解緩沖液裂解。RNA制備和RT-定量PCRRNA用RNeasyProtectMinikit(QiagenFranceSA,91974Courtaboeuf，法國)由SW480細(xì)胞制備?；厥盏腞NA的質(zhì)量和數(shù)量用RNApicoLabchips(AgilentTechnologies,PaloAlto，力口利福尼亞)評估。對于逆轉(zhuǎn)錄，源自每個(gè)樣品的2.5fig的總RNA用DNAseRQ1(Promega)在37°C下預(yù)處理30分鐘，用M-MLV(InVitrogen)孵育。定量PCR用每個(gè)樣品2|il的cDNA進(jìn)行，使用LightCyclerFastStartDNAMasterPlusSYBRGreenI試劑盒(RocheDiagnostics)。GAPDHmRNA的表達(dá)被應(yīng)用以計(jì)算RNA負(fù)荷量。定量PCR的循環(huán)條件-對于c-myc和GAPDH的擴(kuò)增在95。C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95°C10秒、60°C6秒、72°C13秒。熔解曲線為95。C0秒、80°C30秒、95。C0秒和40。C下冷卻2分鐘。-對于ICAT的擴(kuò)增在95°C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95°C10秒、60。C6秒、72°C11秒。熔解曲線為95°C0秒、80°C30秒、70°C0秒和40°C下冷卻2分鐘。-對于細(xì)胞周期蛋白Dl的擴(kuò)增在95°C下變性10分鐘，經(jīng)過50個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95°C10秒、70°C6秒、72。C11秒。熔解曲線為95°C0秒、80。C30秒、95。C0秒和40。C下冷卻2分鐘。用于對人序列的定量PCR的引物GAPDH-有義5'GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA3，(SEQIDN033)GAPDH-反義5,GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3'(SEQIDN。34)ICAT-有義5，GCTCTGGTGCTTTAGTTAGG3，(SEQIDN。35)ICAT-反義5,GCACTTGGTTTCTTTCTTTTC3'(SEQIDN036)c-Myc-有義5'CGTCTCCACACATCAGAGCACAA3，(SEQIDN。37)c-Myc-反義5TCTTGGCAGCAGGATAGTCCTT3，(SEQIDN。38)CyclinDl陽有義5,陽CCGTCCATGGGGAAGATC-3，(SEQIDN。39)CyclinDl-反義5，-ATGGCCAGCGGGAAGAC-3，(SEQIDN。40)實(shí)施例1和2的概括總結(jié)第一次，提供了充分和必要的數(shù)據(jù)證明人結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的前胃泌素缺失逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生，因?yàn)槠湔T導(dǎo)具有組成性卩連接素/Tcf4活性的細(xì)胞的分化和凋亡。這些效果是前胃泌素特異性的。這在體外的兩種細(xì)胞系(DLD-1和SW480)以及體內(nèi)被植入棵鼠和模擬人體腫瘤發(fā)生的小鼠模型體內(nèi)的所述相同的細(xì)胞系中顯示。實(shí)際上，在所述小鼠模型(APCA14)中，叩c基因具有引起(3連接素/Tcf4通路激活的突變，小鼠自發(fā)地發(fā)展腺瘤和腺癌。這些小鼠在體內(nèi)用靶向前胃泌素mRNA的siRNA治療。這導(dǎo)致肺瘤發(fā)生的逆轉(zhuǎn)，分化和凋亡引起腫瘤衰退?？梢姡鲋委燂@著抑制組成性卩連接素/Tcf4活性。因此，正是第一次，由甲c基因突變引起的胂瘤發(fā)生顯示被逆轉(zhuǎn)。在分子水平上可見，前胃泌素的缺失具有抗腫瘤作用，因?yàn)槠湔T導(dǎo)ICAT的重表達(dá)，其為13連接素/Tcf4轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)生抑制劑。在人體結(jié)直腸癌中，我們第一次證明了(3連接素/Tcf4通路的過度活躍、胃泌素基因表達(dá)的高水平和ICAT表達(dá)的低水平之間的相關(guān)性事件。另外，前胃泌素的過量表達(dá)本身顯示在Tcf4靶基因水平升高的腫瘤樣品中。在自發(fā)出現(xiàn)的APCA14小鼠的腸腺瘤中，我們還發(fā)現(xiàn)高水平的前胃泌素(而沒有甘氨酸延長型胃泌素和酰胺化胃泌素)和低ICAT表達(dá)。所這些數(shù)在用胃泌素基因選擇性siRNA處理后被逆轉(zhuǎn)。最后，提供的數(shù)據(jù)證明阻斷前胃泌素的作用也能用不結(jié)合甘氨酸延長型胃泌素或胃泌素的特異地針對前胃泌素的抗體獲得。siRNA、shRNA或靶向前胃泌素的抗體誘導(dǎo)ICAT的表達(dá)以及阻斷和逆轉(zhuǎn)與組成性(3連接素/Tcf4活性相關(guān)的結(jié)腸腫瘤發(fā)生的用途的概念的證據(jù)和足夠的科學(xué)數(shù)據(jù)因此被提供。參考文獻(xiàn)遍及所述應(yīng)用，各種參考文獻(xiàn)描述了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。這些參考文獻(xiàn)的公開在此通過引用并入本公開。Blache,R，M.vandeWetering，I.Duluc，C.Domon,RBerta,J.N.Freund,H.Clevers,andP.Jay.2004.SOX9isanintestinecrypttranscriptionfactor,isregulatedbytheWntpathway,andrepressestheCDX2andMUC2genes(SOX9是一種腸隱窩轉(zhuǎn)錄因子，通過Wnt通路調(diào)節(jié)，并阻遏CDX2和MUC2基因).JCellBiol.166:37-47.Brown,D.，U.Yallampalli,A.Owlia,andRSingh.2003.pp60c-SrcKinasemediatesgrowtheffectsoftheflill-lengthprecursorprogastrin1-80peptideonratintestinalepithelialcells,invitro(在體夕卜，pp60c-Src;效酵介導(dǎo)全長前體前胃泌素1-80肽對大鼠腸上皮細(xì)胞的生長作用).Endocrinology.144:201-11.C.hakladar，A.,A.Dubeykovskiy，LJ.Wojtukiewicz,J.Pratap,S.Lei,andT.C.Wang.2005.SynergisticactivationofthemurinegastrinpromoterbyoncogenicRasandbeta-catenininvolvesSMADrecruitment(通過致癌Ras和(3連接素對鼠胃泌素啟動(dòng)子的協(xié)同激活涉及SMAD補(bǔ)充).BiochemBiophysResCommun.336:190-6.Chung,J.H.,andC.Eng.2005.Nuclear-cytoplasmicpartitioningofphosphataseandtensinhomologuedeletedonchromosome10(PTEN)differentiallyregulatesthecellcycleandapoptosis(在染色體10上刪除的石粦酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)的核質(zhì)間隔差別地調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡).CancerRes.65:8096-100.Ciccotosto，G.D.,A.McLeish，K丄Hardy,andA.Shulkes.1995.Expression,processing,andsecretionofgastrininpatientswithcolorectalcarcinoma(胃泌素在患有結(jié)直腸癌的患者中的表達(dá)、加工和分泌).Gastroenterology.109:1142-53.Cobb,S.，T.Wood,J.Ceci,A.Varro,M.Velasco,andP.Singh.2004.Intestinalexpressionofmutantandwild-typeprogastrinsignificantlyincreasescoloncarcinogenesisinresponsetoazoxymethaneintransgenicmice(突變和野生型前胃泌素的腸表達(dá)顯著增加響應(yīng)于轉(zhuǎn)基因小鼠中的氧化偶氮曱烷的結(jié)腸癌發(fā)生).Cancer.100:1311-23.Cobb，S.，T.Wood,LTessarollo,M.Velasco,R.Given,A.Varro，N.Tarasova，andP.Singh.2002.Deletionoffunctionalgastringenemarkedlyincreasescoloncarcinogenesisinresponsetoazoxymethaneinmice(功能性胃泌素基因的刪除顯著增加響應(yīng)于小鼠中的氧化偶氮曱烷的結(jié)腸癌發(fā)生).Gastroenterology.123:516-30.Coelho,S.M.,M.Vaisman,andD.P.Carvalho.2005.Tumourre-differentiationeffectofretinoicacid:anoveltherapeuticapproachforadvancedthyroidcancer(視黃酸的肺瘤再分化作用用于晚期曱狀腺癌的新治療方法).CurrPharmDes.11:2525-31.Colnot，S.,M.Niwa-Kawakita,G.Hamard,C.Godard,S.LePlenier，C.Houbron，B.Romagnolo,D.Berrebi，M.Giovannini，andC.Perret.2004.Colorectalcancersinanewmousemodeloffamilialadenomatouspolyposis:influenceofgeneticandenvironmentalmodifiers(在豸斤的家力矣十生月泉瘤寸生息肉病的小鼠模型中的結(jié)直腸癌基因和環(huán)境修飾劑的影響).LabInvest.84:1619-30.Daniels,D丄.，andW.I.Weis.2002.ICATinhibitsbeta-cateninbindingtoTcf/Lef-familytranscriptionfactorsandthegeneralcoactivatorp300usingindependentstructuralmodules(應(yīng)用獨(dú)立的結(jié)構(gòu)才莫式，ICAT抑制(3連接素結(jié)合Tcf/Lef族轉(zhuǎn)錄因子和普通共激活因子p300).MolCell.10:573-84.Delcommenne,M.,C.Tan,V.Gray,L.Rue，J.Woodgett,andS.Dedhar.1998.Phosphoinositide-3-OHkinase-dependentregulationofglycogensynthasekinase3andproteinkinaseB/AKTbytheintegrin-linkedkinase(通過整合素連接激酶，糖原合成酶激酶3和蛋白質(zhì)激酶B/AKT的磷酸肌醇-3-OH激酶依賴性調(diào)節(jié)).ProcNatlAcadSciUSA.95:11211-6.Ferrand，A.,C.Bertrand，G.Portolan,G.Cui,J.Carlson,L.Pradayrol,D.Fourmy,M.Dufresne,T.C.Wang,andC.Seva.2005.Signalingpathwaysassociatedwithcolonicmucosahyperproliferationinmiceoverexpressinggastrinprecursors(與小鼠過量表達(dá)胃泌素前體中的結(jié)腸粘膜過量增殖相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路).CancerRes.65:2770-7.Finley，G.G.，R.A.Koski,M.F.Melhem,J.M.Pipas,andA丄Meisler.1993.Expressionofthegastringeneinthenormalhumancolonandcolorectaladenocarcinoma(正常人結(jié)腸和結(jié)直腸腺癌中的胃泌素基因的表達(dá)).CancerRes.53:2919-26.Fodde,R.,R.Smits，andH.Clevers.2001.APC，signaltransductionandgeneticinstabilityincolorectalcancer(結(jié)直腸癌中的APC、信號傳導(dǎo)和基因不穩(wěn)定性).NatRevCancer.1:55-67.Gottardi，C丄，andB.M.G腿bi紙2004.RoleforICATinbeta-catenin-dependentnuclearsignalingandcadherinfunctions(ICAT在P連接素依賴性核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及鈣粘著蛋白功能中的作用).AmJPhysiolCellPhysiol.286:C747-56.Hollande,R,A.Imdahl,T.Mantamadiotis,G.D.Ciccotosto,A.Shulkes,andG.S.Baldwin.1997.Glycine-extendedgastrinactsasanautocrinegrowthfactorinanontransformedcoloncellline(甘氨酸延長型胃泌素作為非轉(zhuǎn)基因結(jié)腸細(xì)胞系中的自分泌生長因子的作用).Gastroenterology.113:1576-88.Hollande,F.,D丄Lee，A.Choquet,S.Roche,andG.S.Baldwin.2003.Adherensjunctionsandtightjunctionsareregulatedviadifferentpathwaysbyprogastrininepithelialcells(粘著連接和緊密連接通過上皮細(xì)胞中的前胃泌素的不同通路被調(diào)節(jié)).JCellSci.116:1187-97.Hollande,F.,A.Shulkes，andG.S.Baldwin.2005.Signalingthejunctionsingutepithelium(在腸上皮細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連接).SciSTKE.2005:pel3.Jain,R.N.，C.S.Bmnkan，C,S.Chew,andL.C.Samuelson.2006.Geneexpressionprofilingofgastrintargetgenesinparietalcells(壁纟田月包中的胃泌素革巴基因的基因表達(dá)分析).PhysiolGenomics.24:124-32.Janssen，K.R，P.Alberici,H.Fsihi,C.Gaspar,C.Breukel,P.Franken,C.Rosty,M.Abal，F(xiàn).ElMarjou,R.Smits,D.Louvard，R.Fodde,andS.Robine.2006.APCandOncogenicKRASAreSynergisticinEnhancingWntSignalinginIntestinalTumorFormationandProgression(APC禾口致癌KRAS在腸腫瘤形成和發(fā)展中的增強(qiáng)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中是協(xié)同的).Gastroenterology.131:1096-109.Judge,A.D.,V.Sood，J.R.Shaw,D.Fang，K.McClintock,and1.MacLachlan.2005.Sequence-dependentstimulationofthemammalianinnateimmuneresponsebysyntheticsiRNA(通過合成siRNA的哺乳動(dòng)物先天免疫響應(yīng)的序列依賴性刺激).NatBiotechnol.23:457-62.Kochman,M丄.，J.DelValle,C丄Dickinson,andC.R.Boland.1992.Post-translationalprocessingofgastrininneoplastichumancolonictissues(在新生人體結(jié)腸組織中的胃泌素的翻i奪后加工).BiochemBiophysResCommun.189:1165-9.Koh,T丄，C丄Bulitta，J.V.Fleming,G丄Dockray，A,Varro,andT.C.Wang.2000.Gastrinisatargetofthebeta-catenin/TCF-4growth-signalingpathwayinamodelofintestinalpolyposis(在腸息肉病的才莫型中胃泌素是P連接素/Tcf-4生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的目標(biāo)).JClinInvest.106:533-9.Koh，T丄，G.J.Dockray，A.Varro，R丄Cahill,C.A.Dangler,J.G.Fox,andT.C.Wang.1999.Overexpressionofglycine-extendedgastrinintransgenicmiceresultsinincreasedcolonicproliferation(甘氛酸延長型胃泌素在轉(zhuǎn)基因小鼠中的過量表達(dá)引起結(jié)腸增殖的增加).JClinInvest.103:1119-26.Konturek,P.C.,W.Bielanski,S丄Konturek,A.Hartwich,RPierzchalski，M.Gonciarz，K.Marlicz,T.Starzynska,M.Zuchowicz,Z.Darasz，丄P.Gotze，J.F.Rehfeld,andE.G.Hahn.2002.Progastrinandcyclooxygenase-2incolorectalcancer(結(jié)直腸癌中的前胃泌素和環(huán)氧化酶2).DigDisSci.47:1984-91.Korinek,V.，N.Barker,P丄Morin，D.vanWichen，R.deWeger，K.W.Kinzler,B.Vogelstein，andH.Clevers.1997.Constitutivetranscriptionalactivationbyabeta-catenin-TcfcomplexinAPC-/-coloncarcinoma(APC-/-結(jié)腸癌中[3連接素-Tcf復(fù)合體的組成性轉(zhuǎn)錄激活).Science.275:1784-7.Koyama,T"K.Tago，T.Nakamura，S.Ohwada,Y.Morishita,J.Yokota,andT.Akiyama.2002.Mutationandexpressionofthebeta-catenin-interactingproteinICATinhumancolorectaltumors(人體纟吉直腸腫瘤中的(3連接素相互作用蛋白ICAT的突變和表達(dá)).JpnJClinOncol.32:358-62.Lallemand-Breitenbach,V.，J.Zhu,S.Kogan,Z.Chen，andH.deThe.2005.Opinion:howpatientshavebenefitedfrommousemodelsofacutepromyelocyticleukaemia(觀點(diǎn)患者如何從急性早幼粒細(xì)胞白血病的小鼠模型中受益).NatRevCancer.5:821-7.Lian,Z.，andA.DiCristofano.2005.Classreunion:PTENjoinsthenuclearcrew(愈合類PTEN結(jié)合核成員).Oncogene.24:7394-400.Litvak,D.A.,M.R.Hellmich,K.Iwase,B.M.Evers,J.Martinez,M.Amblard，andC.M.Townsend，Jr.1999.JMV1155:anovelinhibitorofglycine-extendedprogastrin-mediatedgrowthofahumancoloncancerinvivo(JMV1155:在體內(nèi)人結(jié)腸癌的甘氨酸延長型前胃泌素介導(dǎo)的生長的新抑制劑).AnticancerRes.19:45-9.Marotta，A.,K.Parhar,D.Owen,S.Dedhar，andB.Salh.2003.Characterisationofintegrin-linkedkinasesignallinginsporadichumancoloncancer(散發(fā)性人結(jié)腸癌中的整合素連接激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的表征).BrJCancer.88:1755-62.Marques,J.T.,T.Devosse，D.Wang,M.Zamanian-Daryoush,P.Serbinowski,R.Hartmann,T.Fujita，M.A.Behlke，andB.R.Williams.2006.Astructuralbasisfordiscriminatingbetweenselfandnonselfdouble-strandedRNAsinmammaliancells(區(qū)分哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自身或非自身雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)).NatBiotechnol.Morin,P丄,A.B.Sparks,V.Korinek,N.Barker,H.Clevers,B.Vogelstein,andK.W.Kinzler.1997.Activationofbeta-catenin-Tcfsignalingincoloncancerbymutationsinbeta-cateninorAPC(源自(3連4妻素或APC突變的結(jié)腸癌中的P連接素-Tcf信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活).Science.275:1787-90.Mulrooney，J.,K.Foley,S.Vineberg,M.Barreuther,andL.Grabel.2000.Phosphorylationofthebetalintegrincytoplasmicdomain:towardanunderstandingoffunctionandmechanism((31整合素纟田月包質(zhì)區(qū)的石壽酸4匕功能和機(jī)理的理解).ExpCellRes.258:332-4l.Nemeth,J.,B.Taylor,S.Pauwels，A.Varro，andG.J.Dockray.1993.Identificationofprogastrinderivedpeptidesincolorectalcarcinomaextracts(衍生自結(jié)直腸癌提取物中的肽的前胃泌素的鑒定).Gut.34:90-5.NordlundMS,FermerC，NilssonO,WarrenDJ,andE.Paus.2007.ProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodiesforImmunoassayoftheLungCancerMarkerproGRP(用于肺癌標(biāo)i己物proGRP的免疫分沖斤的單克隆抗體的產(chǎn)生和表征).TumourBiol.28(2):100-10.Ottewell,RD.,A.Varro，G.J.Dockray，C.M.Kirton，A丄Watson,T.C.Wang,R.Dimaline,andD.M.Pritchard.2005.COOH-terminal26-aminoacidresiduesofprogastrinaresufficientforstimulationofmitosisinmurinecolonicepitheliuminvivo(前胃泌素的羧端26-氨基酸殘基在體內(nèi)足以刺激鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中的有絲分裂).AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.288:G541-9.Ottewell,RD.，A丄Watson,T.C.Wang,A.Varro，G.J.Dockray，andD.M.Pritchard.2003.ProgastrinstimulatesmurinecolonicepithelialmitosisafterDNAdamage(當(dāng)DNA損害后，前胃泌素刺激鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的有絲分裂).Gastroenterology.124:1348-57.Pear,W.S.,G.P.Nolan,ML.Scott,andD.Baltimore.1993.Productionofhigh-titerhelper-freeretrovirusesbytransienttransfection(通過瞬日寸轉(zhuǎn)染產(chǎn)生高效《介無輔助逆轉(zhuǎn)錄酶病毒).ProcNatlAcadSciUSA.90:8392-6.Radtke，F(xiàn).,andH.Clevers.2005.Self-renewalandcancerofthegut:twosidesofacoin(腸的自恢復(fù)和癌癥石更幣的兩面).Science.307:1904-9.Sekiya,T.，T.Nakamura，Y.Kazuki,M.Oshimura,K.Kohu,K.Tago,S.Ohwada,andT.Akiyama.2002.OverexpressionofIcatinducesG(2)arrestandcelldeathintumorcellmutantsforadenomatouspolyposiscoli,beta-catenin,orAxin(Icat的過量表達(dá)請導(dǎo)腺瘤性結(jié)腸息肉病、(3連接素、或洋蟲膠的胂瘤細(xì)胞突變體中的G(2)阻滯和細(xì)胞死亡).CancerRes,62:3322-6.Seva，C.,C.J.Dickinson,andT.Yamada.1994.Growth-promotingeffectsofglycine-extendedprogastrin(甘氨酸延長型前胃泌素的生長促進(jìn)作用).Science.265:410-2.Siddheshwar,R.K.,J.C.Gray,andS.B.Kelly.2001.Plasmalevelsofprogastrinbutnotamidatedgastrinorglycineextendedgastrinareelevatedinpatientswithcolorectalcarcinoma(前胃)必素而不是醜胺1"匕胃；必素或甘氛酉交延長型胃泌素的血漿水平在患有結(jié)直腸癌的患者中上升).Gut.48:47-52.Singh,P.，A.Owlia,A.Varro,B.Dai，S.Rajaraman,andT.Wood.1996.Gastringeneexpressionisrequiredfortheproliferationandtumorigenicityofhumancoloncancercells(人體結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生需要胃泌素基因表達(dá)).CancerRes.56:4111-5.Singh,P"M.Velasco,R.Given,A.Varro，andT.C.Wang.2000.Progastrinexpressionpredisposesmicetocoloncarcinomasandadenomasinresponsetoachemicalcarcinogen(前胃；必素表達(dá)4吏小鼠i"頃向于口向應(yīng)4匕學(xué)至丈癌物的結(jié)腸癌和A泉瘤).Gastroenterology.119:162-71.Singh，P"Z.Xu,B.Dai,S.Rajaraman,N.Rubin,andB.Dhruva.1994.Incompleteprocessingofprogastrinexpressedbyhumancoloncancercells:roleofnoncarboxyamidatedgastrins(由人體纟吉腸癌纟田月包表達(dá)的前胃；必素的不完全加工非羧酸酰胺化胃泌素的作用).AmJPhysiol.266:G459-68.Stepan，V.M.，MSawada,A.Todisco,andC丄Dickinson.1999.Glycine-extendedgastrinexertsgrowth-promotingeffectsonhumancoloncancercells(甘氨酸延長型胃泌素在人體結(jié)腸癌細(xì)胞中起生長促進(jìn)作用).MolMed.5:147-59.Tago，K.,T.Nakamura,M.Nishita,J.Hyodo,S.Nagai,Y.Murata，S.Adachi,S.Ohwada，Y.Morishita,H.Shibuya,andT.Akiyama.2000.InhibitionofWntsignalingbyICAT,anovelbeta-catenin-interactingprotein(通過ICAT，一種新的(3連接素相互作用蛋白，的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制).GenesDev.14:1741-9.Tan,C.,P.Costello,J.Sanghera,D.Dominguez,J.Baulida,A.G.deHerreros,andS.Dedhar.2001.Inhibitionofintegrinlinkedkinase(ILK)suppressesbeta-catenin-Lef/Tcf-dependenttranscriptionandexpressionoftheE-cadherinrepressor,snail,inAPC-/-humancoloncarcinomacells(在APC-A人體結(jié)腸癌細(xì)胞中，整合素連接激酶(ILK)的抑制作用阻止了P連接素-Lef/Tcf依賴性轉(zhuǎn)錄以及上皮細(xì)胞鈣粘蛋白阻遏物snail的表達(dá))，Oncogene.20:133-40.vandeWetering，M.,E.Sancho,C.Verweij,W.deLau，I.Oving，A.Hurlstone，K.vanderHorn,E.Batlle，D.Coudreuse,A.RHaramis,M.Tjon-Pon-Fong，RMoerer，M.vandenBorn,G.Soete，S.Pals，M.Eilers,R.Medema，andH.Clevers.2002.Thebeta-catenin/TCF-4compleximposesacryptprogenitorphenotypeoncolorectalcancercells(P連接素/Tcf匿4復(fù)合體在結(jié)直腸癌細(xì)胞上施加隱窩起源顯型).Cell.111:241-50.vanEs,J.H.,andH.Clevers.2005.NotchandWntinhibitorsaspotentialnewdrugsforintestinalneoplasticdisease(Notch和Wnt承卩制齊寸作為腸瘤性疾病的潛在新藥物).TrendsMolMed.11:496-502.VanSolinge,W.W"F.C.Nielsen,L.Friis-Hansen,U.G.Falkmer,andJ.F.Rehfeld.1993.Expressionbutincompletematurationofprogastrinincolorectalcarcinomas(在結(jié)直腸癌中前胃泌素的表達(dá)但不完全成熟).Gastroenterology.104:1099-107.Wang,T.C.,T丄Koh,A.Varro,R丄Cahill，C.A.Dangler,J.G.Fox,andG.J.Dockray.1996.Processingandproliferativeeffectsofhumanprogastrinintransgenicmice(在轉(zhuǎn)基因小鼠中的人體前胃泌素的加工和增殖作用).JClinInvest.98:1918-29.Wang,Z.Y"andZ.Chen.2000.Differentiationandapoptosisinductiontherapyinacutepromyelocyticleukaemia(急性早幼粒纟田胞白血病中的分化和凋亡i秀導(dǎo)治療).LancetOncol.1:101-6.WrayC.J.，RiloH丄.,andS.A.Ahmad.2004.Coloncancerangiogenesisandantiangiogenictherapy(結(jié)腸癌血管生成和抗血管生成治療).ExpertOpinInvestigDrugs.13(6):631-41.權(quán)利要求1.前胃泌素誘導(dǎo)阻遏β-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和β-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物制造中的用途。2.前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑在用于治療和/或預(yù)防緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病和轉(zhuǎn)移的藥物制造中的用途。3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的細(xì)胞是腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)腫瘤抑制劑基因和/或J3-連接素基因是突變的細(xì)胞。4.如權(quán)利要求1-3的任一權(quán)利要求所述的用途，其中前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑選自下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素表達(dá)的藥劑、抗前胃泌素抗體、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制劑和整合素連接激酶(ILK)的抑制劑。5.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素表達(dá)的藥劑。6.權(quán)利要求5所述的用途，其中所述下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素表達(dá)的藥劑是包含選自SEQIDN°27、SEQIDN。28、SEQIDN°29和SEQIDN。30的序列之一的siRNA。7.權(quán)利要求5所述的用途，其中下調(diào)結(jié)腸細(xì)胞中的前胃泌素表達(dá)的藥劑是包含選自SEQIDN°l和SEQIDN°2的序列之一的shRNA。8.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是抗前胃泌素抗體或其生物活性片段或衍生物，其不識(shí)別酰胺化或甘氨酸延長型胃泌素17和胃泌素34。9.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述抗體或其生物活性片段或衍生物與前胃泌素的羧基末端15-氨基酸殘基結(jié)合。10.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述抗體或其生物活性片段或衍生物與FGRRSAEDEN(SEQIDN。31)結(jié)合。11.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述抗體或其生物活性片段或衍生物與前胃泌素的氨基末端40-氨基酸殘基結(jié)合。12.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述抗體或其生物活性片段或衍生物與SWKPRSQQPDAPLGT(SEQIDN。32)結(jié)合。13.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是PI3K的抑制劑。14.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑是ILK的抑制劑。15.—種藥物，包含權(quán)利要求8-12的任一權(quán)利要求定義的抗體或其生物活性片段或衍生物。16.—種藥物，包含權(quán)利要求6定義的siRNA或權(quán)利要求7定義的shRNA。17.用于篩選化合物的方法，所述化合物用于治療和/或預(yù)防緣于卩-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移，包括如下步驟a)提供p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)"包；和b)添加翁:一皮篩選的化合物；和c)選擇誘導(dǎo)ICAT表達(dá)的化合物。18.用于篩選化合物的方法，所述化合物用于治療和/或預(yù)防緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移，包括如下步驟a)提供前胃泌素敏感細(xì)胞；和b)將前胃泌素添加至含有所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中；和c)添加欲被篩選的化合物；和d)選^H秀導(dǎo)ICAT表達(dá)的化合物。19.用于確定患有結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移的患者是否對前胃泌素誘導(dǎo)阻遏(3-連接素與Tcf-4結(jié)合的抑制劑(ICAT)的抑制劑的治療有響應(yīng)的方法，包括確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和P-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的步驟，包括測量所述患者的前胃泌素的血漿水平的步驟。21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述確定結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否緣于p-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路是組成性激活的前胃泌素分泌細(xì)胞，或結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移是否顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和(3-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的步驟，包括測定APC基因或(3-連接素基因的突變或Tcf靶基因轉(zhuǎn)錄異常水平的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及前胃泌素誘導(dǎo)阻遏ICAT的抑制劑，其用于治療和預(yù)防顯示前胃泌素分泌細(xì)胞和β-連接素/Tcf-4-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通路為組成性激活的細(xì)胞的結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病或轉(zhuǎn)移。文檔編號A61K45/00GK101460196SQ200780019015公開日2009年6月17日申請日期2007年5月21日優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日發(fā)明者多米尼克·州博特,弗雷德里克·霍蘭德,朱莉·潘尼奎恩,納塔莉·德勞內(nèi),菲利普·杰伊,讓-弗朗索瓦·保爾高克斯申請人:國立醫(yī)學(xué)與健康研究所;國家科研中心;蒙彼利埃第一大學(xué)