專利名稱：：轉(zhuǎn)染具有基因沉默活性的寡核苷酸的組合物及其生物和治療應(yīng)用的制作方法轉(zhuǎn)染具有基因沉默活性的寡核苷酸的組合物及其生物和治療應(yīng)用本發(fā)明涉及離體或者體內(nèi)輸送寡核苷酸尤其是導(dǎo)致RNA干擾(RNAi)的小干擾RNA(此后命名為siRNA)到培養(yǎng)的真核細(xì)胞的手段、組合物和方法。RNA干擾(RNAi)是在mRNA水平有效讓基因沉默的技術(shù)(Fire,1999)(Tuschl等，1999)，提供序列特異性的mRNA降解并抑制蛋白產(chǎn)生(Yang等，2000)(Zamore等，2000)(Hammond等，2000)(Parrish等，2000)。由于短dsRNA活性序列的可預(yù)測設(shè)計(jì)和對(duì)特異mRNA的耙向性，RNAi是一種卓有成效的生物化學(xué)方法。已經(jīng)證明當(dāng)利用輸送載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)時(shí)，siRNA在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效沉默外源或者內(nèi)源基因(Elbashir等，2001)。小干擾RNA是短雙鏈RNA(dsRNA)，長度優(yōu)選從19到29個(gè)核苷酸(參見專利WO0244321,WO01/075164A3，EP20010985833和參考文獻(xiàn)(Siolas等,2005)(Kim等,2005))，尤其是19-23個(gè)核苷酸，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中具有RNAi活性(Parrish等，2000)(Elbashir等，2001)(Tuschl，2001)。當(dāng)與不配對(duì)的3'突出端堿基配對(duì)時(shí)，短dsRNA的作用是指導(dǎo)序列特異性的mRNA降解。最有效的短dsRNA由兩條21個(gè)核苷酸長的鏈組成，它們?nèi)绱伺鋵?duì)使得dsRNA的兩端存在1-3個(gè)、尤其是2個(gè)核苷酸的3'突出(Elbashir等，2001)。RNAi的成功依賴于dsRNA的長度、序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞輸送系統(tǒng)。與反義或者核酶技術(shù)相比，對(duì)于siRNA的基因表達(dá)抑制來說靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)不是很強(qiáng)的限制因素。許多siRNA序列對(duì)于給定的mRNA靶是有效的。因此，siRNA雙鏈的穩(wěn)定性和生物利用率以及dsRNA被輸送到細(xì)胞尤其是細(xì)胞質(zhì)的量仍然是有效沉默的限制性因素，而siRNA的靶可及性則不是。許多輸送系統(tǒng)可用于將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。目前，市場上已經(jīng)有用于siRNA輸送的基于陽離子脂質(zhì)-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的非病毒載體，例如Oligofectamin，TRANSIT-TKO，LipofectAmine2000，SiGuide，RNAiFect，HiperFect或者jetSi。與基于陽離子聚合物的系統(tǒng)相反，陽離子脂質(zhì)顯示在早期內(nèi)體破裂以及與磷脂酰絲氨酸形成復(fù)合物后在細(xì)胞質(zhì)釋放核酸(Zdphati和Szoka,1996)。非病毒載體系統(tǒng)有利地包括基于陽離子脂質(zhì)或者聚合物或者肽的輸送試劑。所述非病毒系統(tǒng)是至少包括一種輸送試劑和其他組分的制劑，所述其他組分用于穩(wěn)定所述制劑、靶向細(xì)胞、組織或者器官或者提高轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明描述一類新的非病毒轉(zhuǎn)染劑，其屬于陽離子脂質(zhì)，尤其適合于小的寡核苷酸的轉(zhuǎn)染。特別是小分子與寡核苷酸的特異相互作用促使我們設(shè)計(jì)一類新的轉(zhuǎn)染劑。許多分子結(jié)合雙鏈寡核苷酸(dsON)。根據(jù)結(jié)合模式它們可以被分成三類1)在堆積堿基對(duì)之間的插入，例如奎吖因或者溴化乙啶；2)就像從聚胺類精胺或者亞精胺觀察到的與寡核苷酸骨架上雜原子的靜電和H-鍵相互作用，3)小溝結(jié)合劑(MGB):延伸的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，填充DNA的深小溝，主要通過范德華和H-鍵相互作用而相互作用。這類寡-雜環(huán)分子最好的例子就是抗生素紡錘菌素(包含N-甲基吡咯的寡肽)和其類似物偏端霉素A(Cho和Rando，2000)。核糖核苷酸螺旋顯示一些獨(dú)特的特征當(dāng)仍然存在插入的可能性時(shí)，范德華和靜電結(jié)合模式優(yōu)選在深的大溝發(fā)生，有時(shí)在淺的大溝。特別地，三咪唑結(jié)合劑例如AR-1-144,其被設(shè)計(jì)為含咪唑的紡錘菌素類似物(Yang等，1999)，吸引了我們的注意。這里鳥嘌呤N2氨基與并行的Im/Im對(duì)形成分叉氫鍵(Yang等，1999)。所述分子的其余部分看起來在小溝內(nèi)具有更高的疏水性相互作用，如母體分子偏端霉素A所示(Yang等,1999)。雙苯并咪唑染料Hoechst33258同樣是一種已知的小溝結(jié)合劑，它對(duì)DNA的AT富集序列顯示選擇性。它還在"凸起(bulge)"區(qū)結(jié)合認(rèn)A，在那里它正好適合由連續(xù)堿基對(duì)形成的口袋，就像在TARRNA中一樣(Dassonneville等,1997)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將感興趣的寡核苷酸與特異的兩親性陽離子分子組合可以獲得高效的轉(zhuǎn)染，所述兩親性陽離子分子作為小分子脂質(zhì)體與中性共脂質(zhì)(co-lipids)穩(wěn)定地配制。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用作轉(zhuǎn)染劑的新分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用于轉(zhuǎn)染的這些分子的組合物。另一個(gè)目的是提供所述兩親性分子的合成途徑和有效純化方法。根據(jù)另一個(gè)目的，本發(fā)明涉及在培養(yǎng)物和體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及用作用于誘導(dǎo)對(duì)一或多種靶蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用的藥物組合物的組合物，所述靶蛋白導(dǎo)致或者參與遺傳疾病。本發(fā)明還涉及治療患有這類疾病的患者的方法。根據(jù)本發(fā)明，所述用作寡核苷酸轉(zhuǎn)染組合物、更特別地用于RNA干擾的試劑的新分子包括能夠結(jié)合寡核苷酸的陽離子部分，所述陽離子部分與親脂性部分結(jié)合使分子可以穿過細(xì)胞膜的脂雙層。因此本發(fā)明涉及式(I)所示的兩親性陽離子分子其中-X是N-R,、S或者O，Ri是Cl-C4烷基或者羥基化的C3-C6烷基，-112和113相同或者不同，代表H或者C1-C4烷基，或者R2和R3連接到一起形成飽和的或者不飽和的5元或6元的環(huán)或者雜環(huán)，-E是C1-C5烷基間隔基，-R4和Rs相同或者不同，代表飽和的或者不飽和的、線性的或者分支的C10-C36烴或者氟垸鏈，所述鏈任選包括C3-C6環(huán)垸基，-A—是生物相容的陰離子。當(dāng)R2和R3連接到一起時(shí)形成的雜環(huán)是不飽和或者飽和的5元或6元雜環(huán)，包括C和作為雜原子的N、S或者O。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，式(I)中的R4和Rs是C14-C36烴基，E是Cl-C4烷基間隔基。在優(yōu)選的組中，R4和Rs是相同的。在有利的分子中，R4和R5是C18烷基，E是C1烷基。在其他有利的分子中，R4和Rs是C16垸基，E是C4垸基。R4R5A①8在另一個(gè)優(yōu)選的組中，R4和Rs是不同的。在感興趣的分子中，R4和Rs分別是C18和C17垸基，E是C2烷基。在其他感興趣的分子中，R4和Rs分別是C32和C18烷基，E是C1垸基。優(yōu)選地，在上述組中，R2和R3是H或者共同形成芳環(huán)，尤其是苯并基，或者雜環(huán)例如吡啶基或者吡嗪基。特別地，X是N-RpR,例如是甲基?；蛘?，X是S或者O。有利地，平衡離子A—是Cl—或者0H"。本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)染具有基因沉默活性的寡核苷酸的組合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及組合物，其中上述限定的兩親性分子與中性共脂質(zhì)一起配制，所述中性共脂質(zhì)在延長的儲(chǔ)存期是穩(wěn)定的。合適的共脂質(zhì)是磷脂?；?乙醇胺，例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，脂-PEG綴合物或者膽固醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及沒有添加共脂質(zhì)的活性兩親性分子，尤其是具有分支的R4或者R5的那些分子。本發(fā)明更具體地涉及轉(zhuǎn)染組合物，所述組合物除了與中性脂質(zhì)一起配制的兩親性分子部分外，還至少包括一種產(chǎn)生所需生物學(xué)作用的寡核苷酸。本發(fā)明因此提供一種適于向活細(xì)胞導(dǎo)入dsON(ds二雙鏈；ON^寡核苷酸)特別是siRNA的非病毒輸送系統(tǒng)。可以利用合適的基團(tuán)分別穩(wěn)定所述寡核苷酸或者siRNA以防止降解，所述基團(tuán)選自嘌呤核苷酸，用修飾的類似物例如脫氧核苷酸取代的嘧啶核苷酸，和/或修飾的核苷酸類似物例如糖-或者骨架修飾的核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸。寡核苷酸序列可以含有脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或者核苷酸類似物(Verma和Eckstein,1998)，例如甲基膦酸酯(Miller,1991)、嗎啉代二氨基磷酸酯(morpholinophosphorodiamidate)、硫代磷酸酯(Zon和Geiser,1991)、PNA(Jepsen和Wengel，2004)、LNA、2'烷基核苷酸類似物(K騰ck,2003)。本發(fā)明還涉及獲得式(I)所示分子的方法，包括通過在甲醇/水/酸中自反應(yīng)介質(zhì)中選擇性沉淀而純化中性形式的式(I)所示兩親性分子和將其向鹽衍生物轉(zhuǎn)化的步驟。有利地，式(I)所示分子的合成方法包括-建立一個(gè)分支長鏈，其烴部分通過標(biāo)準(zhǔn)的C-C偶聯(lián)方法獲得，所述偶聯(lián)方法例如對(duì)酯或者醛的Grignard偶聯(lián)反應(yīng)所述。合成的疏水性部分含有伯醇或者仲醇，如式IV所示HO-E-R4(R5)(IV)-通過轉(zhuǎn)化成式(V)MsO-E-R4(R5)所示的甲基磺酰衍生物和/或其他典活化衍生物例如鹵代衍生物來活化醇功能團(tuán)；-在特定條件下將所述活化衍生物尤其是甲基磺酰衍生物與式(VI)所示的雜環(huán)反應(yīng)R2NR3(VI)其中X是N-R1、S或者O獲得(I)R3R5A或者在特定條件下將所述甲基磺酰衍生物(v)與式(vn)所示的雜環(huán)反應(yīng)獲得式(vni)所示的雜環(huán)R4R5(VIII)在所述式中，取代基是按照上文式(I)所限確定的。當(dāng)X表示-N-R1時(shí)，所述方法還包括X的烷化步驟，例如用碘甲垸甲基化N。通過將醇HO-E-R4(R5)(IV)轉(zhuǎn)化成它的甲基磺酯對(duì)其進(jìn)行活化。有利地在像吡啶這樣的溶劑中制備高濃度的醇懸浮液，以便與甲基磺酰氯反應(yīng)。優(yōu)選通過以下方式向磺酸衍生物Ms-0-E-R4(R5)添加雜環(huán)在大約50-100。C的溫度有利的在大約8(TC加熱反應(yīng)混合物。有利地通過特異性沉淀方法從反應(yīng)混合物純化所述兩親性分子以及實(shí)現(xiàn)其向生物相容性鹽形式的轉(zhuǎn)化。這類沉淀包括用甲醇加水的混合物稀釋，然后利用酸HA控制酸化產(chǎn)生相應(yīng)A—鹽(I)的沉淀物。所述沉淀也可以用其他的醇/水混合物來完成，例如異丙醇/水混合物，它們用酸性水溶液酸化以便得到相應(yīng)的鹽，例如用鹽酸酸化得到鹽酸鹽。通過將共脂質(zhì)和式(I)所示的衍生物溶于有機(jī)溶劑并將該溶液注入水中制備脂質(zhì)體。合適的有機(jī)溶劑是乙醇。所獲于水中的脂質(zhì)體制劑有利地具有大約110nm的大小，其大小分布較窄。然后合適的siRNA或者寡核苷酸與所述脂質(zhì)體制劑復(fù)合。如實(shí)施例顯示，本發(fā)明的分子對(duì)于將寡核苷酸特別是siRNA輸送到培養(yǎng)的真核細(xì)胞是特別有效的系統(tǒng)。本發(fā)明因此還涉及用介導(dǎo)基因沉默的寡核苷酸尤其是誘導(dǎo)RNAi的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，包括向細(xì)胞導(dǎo)入如上文限定的組合物。所述組合物在非常低的siRNA濃度尤其是在納摩和低至皮摩的siRNA濃度下持續(xù)很多天提供選擇性和高內(nèi)源性的基因沉默功效。如此獲得的高基因沉默通過許多耙得到例證，例如熒光素酶、人GAPDH、人核纖層蛋白A/C或者鼠波形蛋白基因，并且沒有副作用或者脫靶(off-target)作用或者細(xì)胞毒性。所述方法可以在培養(yǎng)的真核細(xì)胞(粘附或者非粘附細(xì)胞)中使用，用于功能基因組學(xué)、靶確認(rèn)或者體內(nèi)或者離體治療應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)染方案可以在血清存在的條件下實(shí)施本發(fā)明的方法。當(dāng)進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染(reversetransfection)方案時(shí)，本發(fā)明的方法尤其可用于介導(dǎo)siRNA或者寡核苷酸的基因沉默或者HTS應(yīng)用。有利地，上述限定的組合物能夠誘導(dǎo)對(duì)一或多種靶蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，所述靶蛋白導(dǎo)致或者參與遺傳疾病。本發(fā)明因此還涉及上文限定的轉(zhuǎn)染組合物用作藥物。所述組合物有利地采用適于通過口服、全身或者局部途徑給藥的形式，并且可以與藥學(xué)上可接受的惰性載體組合。ii所述組合物尤其可用于癌癥、病毒感染或者寄生蟲感染的治療。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在下列實(shí)施例中給出，參考圖1至10，它們分別代表圖1:通過用制劑MONI/DOPE(lmM/lmM，乙醇中)轉(zhuǎn)染GL3LucsiRNA，A549-GL3Luc細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶基因(pGL3)的選擇性和有效RNA干擾。用GL3LucsiRNA轉(zhuǎn)染(以24孔組織培養(yǎng)板形式)穩(wěn)定表達(dá)所述熒光素酶基因的A549-GL3Lu細(xì)胞，所述GL3LucsiRNA濃度范圍從100-2000pM，并與2(^1由MONI/DOPE(lmM/lmM，乙醇中)組成的等摩爾制劑復(fù)合。作為非特異性的siRNA對(duì)照，與GL2熒光素酶序列匹配的siRNA在相同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，利用細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的蛋白含量(蛋白的mg數(shù))歸一化后，熒光素酶活性可以表示為相對(duì)光單位(RelativeLightUnit,RLU)。圖2:通過用制劑MONBI/DOPE(lmM/2mM，乙醇中)轉(zhuǎn)染GL3LucsiRNA，A549-GL3Luc細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的熒光素酶基因(pGL3)的選擇性和有效RNA干擾。用GL3LucsiRNA轉(zhuǎn)染(以24孔組織培養(yǎng)板形式)穩(wěn)定表達(dá)所述熒光素酶基因的A549-GL3Lu細(xì)胞，所述GL3LucsiRNA濃度范圍從250-5000pM，并與2pl由MONBI/DOPE(lmM/2mM，乙醇中)組成的制劑復(fù)合。作為非特異性的siRNA對(duì)照，與GL2熒光素酶序列匹配的siRNA在相同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，利用細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的蛋白含量(蛋白的mg數(shù))歸一化后，熒光素酶活性可以表示為相對(duì)光單位(RLU)。圖3:通過用制劑MONI/DOPE(lmM/lmM，乙醇中)轉(zhuǎn)染GL3LucsiRNA沉默熒光素酶基因(pGL3)，甚至皮摩水平的siRNA也是有效的。用GL3LucsiRNA轉(zhuǎn)染(24孔板)穩(wěn)定表達(dá)所述熒光素酶基因的A549-GL3Lu細(xì)胞，所述siRNA濃度范圍從10-5000pM并與由MONI/DOPE(lmM/lmM，乙醇中)組成的等摩爾制劑復(fù)合。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，根據(jù)未轉(zhuǎn)染的A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平計(jì)算GL3熒光素酶沉默效率，所述內(nèi)源性熒光素酶水平被細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白含量歸一化。圖4:粒徑的DLS測量顯示脂質(zhì)體的相對(duì)單分散群，大小為100+/-10nm0按照上文描述，在milliQ水中制備1毫摩兩親性分子與不同濃度DOPE的脂質(zhì)體制劑。利用Zetamaster(MalvernInstrument,Orsay，F(xiàn)rance)通過光散射確定這些脂質(zhì)體制劑的粒徑，參數(shù)如下取樣時(shí)間，30s;每個(gè)樣品測量3次；介質(zhì)粘度，1.0CP;介質(zhì)折射率(RI)，1.335;RI顆粒，1.47;溫度25°C，633nm激光波長。從于水中的lmMMONI和1.5mMDOPE(脂質(zhì)體在5"C保存1個(gè)月后的穩(wěn)定性)脂質(zhì)體制劑獲得該圖顯示的粒徑測量。測量重復(fù)三次。圖5:S31用于水中的制劑MONI/DOPE(lmM/2mM)和許多商品化siRNA轉(zhuǎn)染試齊囀染GL3LucsiRNA，比較它們對(duì)熒光素麟因(pGL3)的沉默效率。用與2^1于水中的脂質(zhì)體制劑復(fù)合的GL3LucsiRNA以及許多商品化轉(zhuǎn)^i式劑轉(zhuǎn)染(24孑L板)穩(wěn)定敏熒光素麟因的A549-GL3Luc細(xì)胞，戶誠siRNA濃度范圍從l-10000pM，所述脂質(zhì)體制劑由于乙醇中的MONl/DOPE(lmM/2mM)組成。按照制造商推薦的最佳劍牛施用商品化轉(zhuǎn)魁式劑(參見材料和方法)。保溫48h后檢測熒光素麟因敏。實(shí)驗(yàn)重MH次，根據(jù)未轉(zhuǎn)染的A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平計(jì)算GL3熒光素酶沉默效率，臓內(nèi)源性熒光素酶水平被細(xì)臓解產(chǎn)物的蛋白含量歸一化。圖6:用于水中的MOM/DOPE制劑(lmM/2mM)轉(zhuǎn)染siRNA后，不同細(xì)lfi^中的有效GAPDH基因沉默。用與于水中的制劑MONMX)PE(lmM/2mM)復(fù)合的GAPDHsiRNA轉(zhuǎn)染粘附HeLa、Caski和SiHA細(xì)胞以及非粘附K562和THP-1細(xì)胞。保溫48h后通過分支DNA分析測量GAPDHmRNA7K平。作為非特異性的對(duì)照，與無辦列(核纖層蛋白A/C)匹配的SNA在相同條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)重IH次，根據(jù)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的內(nèi)源性GAPDH7jC平計(jì)算GAPDH沉默效率。圖7:MONI/DOPE制劑在3T3細(xì)胞中介導(dǎo)有效的波形蛋白基因沉默。利用與MONI/DOPE制劑復(fù)合的波形蛋白siRNA轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，所述siRNA濃度范圍從20nM-lnM。保溫48h后通過Western印跡測定波形蛋白水平。還檢測了GAPDH蛋白作為細(xì)胞裂解物中蛋白水平的對(duì)照。圖8:脂質(zhì)體MONI/DOPE制劑在HeLa細(xì)胞中介導(dǎo)有效的核纖層蛋白A/C基因沉默。在包含血清的培養(yǎng)基中(24孔板)利用與2pl于水中的脂質(zhì)體制劑復(fù)合的核纖層蛋白A/CsiRNA(5nM)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，所述脂質(zhì)體制劑由于乙醇中的MONI/DOPE(lmM/2mM)組成。轉(zhuǎn)染后48h通過免疫熒光染色檢測核纖層蛋白A/C蛋白，并利用顯微鏡觀察(C和D)，將其與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行比較(A和B)。圖9:與于水中的制劑MONI/DOPE(lmM/2mM)復(fù)合的siRNA的反向轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)選擇性和高效的基因沉默。將于5(^1無血清培養(yǎng)基中稀釋的GL3LucsiRNA與1^1于水中的由MONI/DOPE(lmM/2mM)組成的制劑復(fù)合(在96孔組織培養(yǎng)板中，n=6)5分鐘。然后，每孔添加于125nl含有血清中的10000個(gè)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的A549-GL3Luc細(xì)胞。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)。作為非特異性siRNA對(duì)照，與GL2熒光素酶序列匹配的siRNA在相同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)，熒光素酶活性可以表示為相對(duì)光單位(RLU)，其用細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的蛋白含量(蛋白的mg數(shù))歸一化。根據(jù)未轉(zhuǎn)染的A549-GL3Luc細(xì)胞的內(nèi)源性熒光素酶水平計(jì)算GL3熒光素酶沉默效率(圖3B)，所述內(nèi)源性熒光素酶水平用細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的蛋白含量歸一化。圖10:與于水中的制劑MONI/DOPE(lmM/2mM)復(fù)合的siRNA的反向轉(zhuǎn)染有效的使MCF-7細(xì)胞的內(nèi)源性GAPDH沉默。利用100pM至10nM濃度范圍的siRNA和1^1脂質(zhì)體MONI/DOPE制齊U，使用優(yōu)化的siRNA反向轉(zhuǎn)染步驟沉默MCF-7細(xì)胞的GAPDH基因。轉(zhuǎn)染后48h通過QuantiGeneBranchedDNA分析來檢測GAPDHmRNA水平。作為非特異性對(duì)照，與無關(guān)序列(核纖層蛋白A/C)匹配的siRNA在相同條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(每個(gè)條件11=6)的內(nèi)源性GAPDH水平計(jì)算GAPDH沉默效率。材料和方法化學(xué)物和寡核苷酸寡核苷酸由Eurogentec(Belgium)化學(xué)合成和PAGE純化。寡核苷酸在95。C在lx退火緩沖液(50mM醋酸鉀，50mM醋酸鎂)(Eurogentec)中退火2分鐘，然后在室溫下保溫2-4小時(shí)。HiperFect和SilentFect試劑分別購自14Qiagen和BioRad(美國)。TransIT-TKO和Saint-Red試劑分別購自MirusCorporation和Synvolux。GAPDHSMARTpool⑧試劑購自Dharmacon。使用的SiRNA雙鏈:GL3LucsiRNA雙鏈(SEQIDN°l和SEQIDN。2)3,-(dT)2GAAUGCGACUCAUGAAGCU-5，GL2LucsiRNA雙鏈(SEQIDN°3禾口SEQIDN°4)5，-CGUACGCGGAAUACUUCGA(dT)2-3，3，-(dT)2GCAUGCGCCUUAUGAAGCU-5，波形蛋白siRNA雙鏈(SEQIDN°5和SEQIDN。6)5，-GAAUGGUACAAAUCCAAGdTdT-3'3，-dTdTCUUACCAUGUUUAGGUUC-5'核纖層蛋白A/CsiRNA雙鏈(SEQIDN°7和SEQIDN°8)5'陽CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3'3，陽dTdTGACCUGAAGGUCUUCUUGU-5'所有的化學(xué)試劑和原始材料均購自Sigma-Aldrich(France),在使用前都沒有進(jìn)行純化。溶劑購自SDS-CarloErba(France)。用二苯甲酮鈉干燥二乙酸并蒸餾。專用于Grignard試劑的鎂屑(Magnesiumturnings)購自FisherScientific(France)。二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)購自Fluka(Sigma-Aldrich)。化學(xué)名稱縮寫MONI兩親性分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)MO細(xì)HE，CHEMBHETHE訓(xùn)Ci7H35f5'K、Cl、C18H31-甲基-3-(l陽十八烷基-十九垸基-)-3&咪唑-1-総氯化物1隱甲基-3-(l沖八垸基-十九烷基-)-3}1-苯并咪唑-卜錄氯化物1-(2-十七烷基-二十垸基-)隱3-甲基-3H-咪唑-l-鎗氯化物3-(2-十七烷基-二十垸基-)-3-甲基-3H-苯并咪唑-l-鎗氯化物3-(2-十七垸基-二十垸基-)-噻唑-3-鏠氯化物1-(4-十六烷基-二十垸基-)-3-甲基-3H-咪唾-l-鎗氯化物《分支咪唑鎗兩親性分子》1-甲基-3-(l沖八烷基-5-十四烷基-十九烷基-)-3H-咪唑-l-錄氯化物MONI的合成二級(jí)長鏈醇19-羥基三十七烷S3的合成:18n37HO芳香部分間隔基E側(cè)鏈R4/R5R4R5甲基-3H-咪唑総C1相同C18(線性)C18(線性)甲基-3H-苯并咪唑-l-C1相同C18(線性)C18(線性)4公翻甲基-3H.咪唑総C2不同C18(線性)C17(線性)甲基國3H-C2不同CI8(線性)C17(線性)苯并咪唑-l-4公勤3噻唾-3-鍋C2不同CJ8(線性)C17(線性)甲基-31^-咪唑鐵C4相同C16(線性)a6(線性)甲基-3H-C1不同C32(分支)C18(線性)咪唑錄c18H37c37H760;MW=537.00將鎂屑(583mg,24毫摩,MW-24.31)加入配備有制冷柱的烘干雙頸反應(yīng)器。用注射器將先前溶于無水二乙醚(20ml，用二苯甲酮鈉蒸餾)的l-碘代十八烷(7.608mg，20毫摩，MW-380.39)滴加到金屬屑中。在添加期間，用風(fēng)扇(吹風(fēng)機(jī))輕微加熱反應(yīng)物，以便保持乙醚的恒定回流。當(dāng)反應(yīng)混合物變成淺灰色時(shí)，有機(jī)鎂試劑(Grignard試劑)開始形成。在碘代烷溶液添加完成后，將反應(yīng)器置于油浴中1小時(shí)來加熱反應(yīng)混合物以保持乙醚回流，促進(jìn)碘代烷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的Grignard試劑。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫；在20°C向Grignard試劑滴加溶于無水蒸餾二乙醚(25ml)的甲酸乙酯(444.5mg，6毫摩，MW=74.04)。在添加時(shí)只輕微加熱反應(yīng)物。室溫下攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)以便完成該長鏈Grignard試劑與酯的偶聯(lián)反應(yīng)。將反應(yīng)物倒入冰甲醇(200g+100ml)并用濃鹽酸酸化至酸性pH。過濾所得固體，并用甲醇和丙酮洗滌，真空干燥。用二氯甲洗滌時(shí)固體將形成聚結(jié)物，然后其在四氫呋喃(THF)中溶解和重結(jié)晶1.5g粗醇在6(TC溶于250mlTHF。該溶液在仍然熱的時(shí)候在真空下經(jīng)過濾紙盤過濾。向?yàn)V液中添加丙酮(200ml)以沉淀終產(chǎn)物仲醇，所述仲醇被濾出并用丙酮洗滌。將這種通過THF/丙酮沉淀的純化方法應(yīng)用于全部的粗醇?？偣仓苽浜图兓?.18g醇，相當(dāng)于5.9毫摩(MW^537.00)。根據(jù)消耗的碘代烷，反應(yīng)產(chǎn)率是60%(根據(jù)甲酸乙酯是98%)。通過^NMR譜分析終產(chǎn)物19-羥基三十七烷的特征來證實(shí)其純度。19-羥基三十七烷S3的分析CDC13中的1H-NMR(質(zhì)子核磁共振)0.90ppm(三重峰，J=7.0Hz，6H，兩條鏈的末端甲基)；1.27ppm(大的多重峰，64H，脂肪烷基鏈的CH2);1.Mppm(寬的多重峰，4H，醇(3位的CH2);1.58ppm(來自羥基和痕量水的寬信號(hào))；3.60ppm(多重峰，1H，醇a位的CH)。9-十八垸基-十九垸基甲磺酸酯S4的合成(=通過甲磺?；罨俅?:C38H7803S;MW=615.09在100ml反應(yīng)器中的45ml無水吡啶中制備仲醇懸浮液(2.42g，4.5毫摩)(高濃度是正確轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵)。用注射器向反應(yīng)器中少量添加3.5ml甲磺酰氯(5.15g，45毫摩)。反應(yīng)混合物不用特別加熱，所以可以在室溫下完成添加。當(dāng)接觸甲磺酰氯時(shí)，白色懸浮液變成淡黃色。l小時(shí)后反應(yīng)物變得更均勻，并且變成米色。24小時(shí)后反應(yīng)物變成深褐色。將反應(yīng)混合物倒入250ml甲醇，其中產(chǎn)物以及沒有反應(yīng)的醇將沉淀。17通過過濾分離該沉淀物，并用甲醇洗滌，真空干燥。將所述固體溶于500ml二氯甲烷，其中只有甲磺?；漠a(chǎn)物是可溶的；可以用紙濾掉其余沒有反應(yīng)的醇。完全蒸發(fā)掉二氯甲垸后得到終產(chǎn)物9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯，產(chǎn)率為69。/。(1.63g;2.65毫摩:MW=615.09)。通過&NMR譜分析其特征。9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯的分析CDC13中的1H-NMR(質(zhì)子核磁共振)0.90ppm(三重峰，J=7.0Hz，6H，兩條鏈的末端甲基)；l"ppm(大的多重峰，60H，脂肪烷基鏈的CH2);MOppm(先前信號(hào)內(nèi)的寬多重峰，4H，甲磺酸酯Y位的CH2);1.69ppm(寬的多重峰，4H，甲磺酸酯卩位的CH2);3.01ppm(單峰，3H，甲磺酸酯的CH3);4.72ppm(五重峰，J=6.1Hz，1H，甲磺酸酯a位的CH)。l-甲基-3-(l-十八垸基沖九垸基)-3H-咪唑-l-鎗氯化物^MONI)的合成、Nl/Ci8H37UN、\c18h37cr;C41H81C1N2;MW=637.55該反應(yīng)是仲碳原子上芳香堿對(duì)甲磺酸的直接取代。因?yàn)榉磻?yīng)緩慢，所以用大大過量的甲基咪唑作為溶劑。將9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯(1.63g，2.65毫摩；MWil5.09)加入頂部裝有制冷柱的100ml反應(yīng)器。添加80ml甲基咪唑，甲磺酸酯形成懸浮液。將反應(yīng)物在80'C加熱6天。然后所述反應(yīng)混合物變成橙黃色和均勻的。冷卻至室溫后，將所述反應(yīng)混合物倒入更大的燒瓶，用150ml甲醇溶解。該混合物經(jīng)過紙過濾。用80ml甲醇洗滌濾液。小的不溶部分主要是未反應(yīng)的甲磺酸酯，這可以通過NMR分析證實(shí)。在純化前將該濾液分成三等分以便于處理。100ml混合物用600ml甲醇溶解，再次經(jīng)過紙過濾。然后添加300ml水。所述混合物仍然是均勻的，然后通過添加少量濃鹽酸逐步酸化，并控制pH。持續(xù)添加直到pH降至2-3。該混合物在室溫下靜置形成凝膠狀沉淀物。為了促進(jìn)沉淀，將混合物置于5'C18小時(shí)。將最終的懸浮液倒在濾紙上，用醇混合物(700ml甲醇，包含lml濃鹽酸的300ml無菌水)洗滌所獲固體，并再次過濾。對(duì)剩余的甲醇相使用相同的步驟。20采用這種方法獲得了517mg粗制3-[9-(十八烷基)十九烷基]-l-甲基-3H-咪唑鎿氯化物。NMR譜監(jiān)測顯示該固體被甲基咪唑輕微污染。使用第二純化步驟。將所述固體溶于70ml甲醇并在6(TC攪拌，然后將甲醇溶液從剩余固體中倒出。用溫甲醇再次洗滌該固體殘?jiān)?。所述不溶部分不同于NMR譜顯示的產(chǎn)物。將甲醇溶液與之前已經(jīng)用0.2ml濃鹽酸酸化的60ml無菌水混合。該溶液在室溫下形成凝膠，置于5t:18h以完成沉淀。所述膠狀溶液經(jīng)過紙過濾。所述干燥固體重新溶于等分甲醇和二氯甲烷(250ml)的混合物，然后溶于純的二氯甲烷(250ml)。溶劑蒸發(fā)后獲得481mg白色固體。對(duì)剩余的反應(yīng)混合物重復(fù)該步驟兩次(2.26毫摩；85%產(chǎn)率；MW=637.55)。NMR分析顯示沒有先前的雜質(zhì)，并且對(duì)所述終產(chǎn)物的元素微量分析證實(shí)其純度。分析MONI在CDC13中的iH-NMR(質(zhì)子核磁共振)0.90ppm(三重峰，J=6.9Hz，6H，兩條鏈的末端甲基)；1.09ppm(多重峰；咪唑鑰環(huán)Y，2H);1.27ppm(大的多重峰，62H，脂肪烷基鏈的CH2);1.85ppm(多重峰，4H，咪唑鐺卩位的CH2);4.18ppm(單峰，3H，咪唑縐環(huán)上的甲基)；7.02ppm(單峰，1H，咪唑鑰的C4H或者C5g);7.13ppm(單峰，1H，咪唑鎿的C5H或者C4g);11.17ppm(單峰，1H，咪唑錄的C2H)。CDC13中的間接13C-NMR(DEPT135;DEPT90):CH和CH3是(-);CH2是(+)123.1ppm(-)(咪唑錄的C2);119.2ppm(-)(咪唑鑰的C4和5);62.8ppm(-)(咪唑鎗N3上的甲基)；36.9ppm(-)(咪唑鑰Nl上的CH);35.5ppm(+)(月旨肪鏈的C);31.9ppm(+)(月旨肪鏈的C);29.72ppm(+)(脂肪鏈的C);29.67ppm(+)(脂肪鏈的C);29.65ppm(+)(脂肪鏈的C);29.60ppm(+)(脂肪鏈的C);29.53ppm(+)(脂肪鏈的C);29.38ppm(+)(脂肪鏈的C);29.35ppm(+)(月旨肪鏈的C);29.15ppm(+)(脂肪鏈的C);25.94ppm(+)(脂肪鏈的C);22.71(+)(脂肪鏈的C);14.15ppm脂肪鏈的CH3末端基團(tuán))。MONI的紅外吸收(IR)光譜吸光度峰值的特征在于其波長(cm")和相應(yīng)的吸光度，被分為強(qiáng)(s)、中(m)或者弱(w):3130(m);3035(s);2955(s);2920(s);2850(s);1570(s);1560(m);1470(s);1430(w);1375(w);1160(s);750(w);725(m)。該IR吸收譜符合l-乙基-3-甲基咪唑鑰氯化物的報(bào)告譜，與其化學(xué)結(jié)構(gòu)一致。實(shí)施例2:l-甲基-3-fl-十八烷基-十九烷基)-3H-苯并-咪唑-l-鑰氯化物(MONBI〗的合成在0.6毫摩苯并咪唑存在的條件下，將溶于7ml的甲基-乙基酮(MEK)的9-(十八垸基)十九烷基甲磺酸酯(0.1毫摩)加熱3天。在溶劑蒸發(fā)后，利用甲醇/二氯甲垸梯度通過硅膠層析法純化粗產(chǎn)物。分離0.015毫摩中性Nl取代的苯并咪唑產(chǎn)物，所述產(chǎn)物在MEK中用大大過量的碘甲烷甲基化并加熱1天。所述甲基化反應(yīng)是定量的，在利用甲醇/二氯甲烷梯度通過硅膠層析法純化后獲得10mgMONBI。MONBI在CDC13中的1H-NMR(質(zhì)子核磁共振)0.89ppm(三重峰，J=6.9Hz，6H，兩條鏈的末端甲基)；1.27ppm(大的多重峰，64H,脂肪烷基鏈的CH2);2.1ppm(大的多重峰，4H,苯并咪唑錄氮卩位的CH2);4.39ppm(單峰，3H，苯并咪唑鎗環(huán)N3上的甲基)；4.65ppm(與苯并咪唑鐵Nl連接的CH);7.72ppm(多重峰，4H，苯并環(huán)質(zhì)子)；11.37ppm(單峰，1H，苯并咪唑鎿的C2H)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>向含有15mlTHF(用二苯甲酮鈉蒸餾過)的100ml烘干反應(yīng)器中添加二異丙胺(2.56ml;1.85g;18.26毫摩;MW=101.19)，并在氬氣中冷卻至-78'C滴加11.4ml丁基鋰(于THF中1.6M;18.26毫摩)，在-78。C攪拌10分鐘然后加熱至Ot:，以形成LDA試劑。在O'C向所述反應(yīng)混合物中滴加于20mlTHF中的十九垸酸(2.5g;8.37毫摩；MW=298.51)。添加L2ml干DMPU(1,246g;9.72毫摩；MW=128.18)，加熱至室溫以形成二價(jià)陰離子中間物。在-5。C通過添加l-碘十八烷(3.15g;8.28毫摩；MW-380.4)實(shí)現(xiàn)選擇性的C烷化。反應(yīng)在室溫下持續(xù)18小時(shí)。必^6tw^-甲義.將反應(yīng)混合物倒入100ml冰水中，并添加4ml濃鹽酸進(jìn)行酸化。通過減壓蒸發(fā)溶劑THF;利用乙酸乙酯萃取所述混合物并用Na2S04(無水)干燥。減壓濃縮所述有機(jī)相，在丙酮中重結(jié)晶所獲固體產(chǎn)生白色粉末(4.271g;7.75毫摩，在下一步中無需進(jìn)一步純化即可使用)。羧酸Yl的分析TLC分析RiK).5;溶劑溶于庚烷的20%乙酸乙酯；檢測香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)。iH-NMR(CDCb)&(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，62H，烴鏈的CH2);1.50(大的多重峰，2H，酸卩位的CH2);1.63(大的多重峰，2H，酸(3，位的CH2);2.38(多重峰，1H，酸a位的CH)。2-十七垸基-二十烷-l-醇(Y2)的合成酸Yl(847mg;1.537毫摩；\￥=550.98)溶于20ml無水THF(用二苯甲酮鈉蒸餾過)。在(TC滴加于THF中的BH3溶液(于THF中1M;10ml;10毫摩)。通過TLC分析(溶劑于庚垸中的10%乙酸乙酯)篩選所述反應(yīng)物。反應(yīng)平穩(wěn)進(jìn)行2天。將所述反應(yīng)混合物注入100ml甲醇以沉淀醇(1.135g粗產(chǎn)物)。硅膠層析(梯度于庚垸中的乙酸乙酯6。/。-10。/。)產(chǎn)生518g純的Y2(62%)。醇Y2的分析TLC:Rf=0.4;溶劑于庚烷中的10%乙酸乙酯；通過香草醛/硫酸(藍(lán)色)(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。iH-NMR(CDC13)S(ppm):0.90(J=6.8Hz三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，66H，烴鏈的CH2);1.46(大的多重峰，1H，醇|3位的CH);3.56(J=5.5Hz，雙峰，2H，醇a位的CH2)。甲磺酸2沖七垸基酯(Y3)的合成溶于10mlCH2C12(用CaH2蒸餾過)的醇Y2(600mg;1.11毫摩；MW-537.0)被冷卻至0°C。向所述反應(yīng)混合物中添加甲磺酰氯(0.5ml;740mg;6.46毫摩；MW=114.55)，并在0。C滴加lml三乙胺(728mg;7.19毫摩；MW=101.19)，室溫下攪拌。通過TLC分析證實(shí)所述反應(yīng)在2小時(shí)后完成。減壓濃縮所述反應(yīng)混合物，并用甲醇洗滌固體以去除過量的試劑。過濾獲得的固體通過NMR分析證實(shí)是純的，相當(dāng)于570.6mgY3(0.928毫摩；82.9%產(chǎn)率)。甲磺酸酯Y3的分析TLC:Rf=0.6;溶劑于庚烷中的50%二氯甲垸；通過香草醛/硫酸(深藍(lán)色斑點(diǎn))(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。NMR^(CDC13)S(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，66H，烴鏈的CH2);1.72(多重峰，1H，甲磺酸酯卩位的CH);3.01(單峰，3H，甲磺酸酯的CH3);4.10(J=5.5Hz，雙峰，2H，甲磺酸酯a位的CH2)。l-(2沖七烷基-二十烷基)-3-甲基-3H-咪唑-l-鎗氯化物(HEIC)的合成在80°C甲磺酸酯Y3(150mg;0.243毫摩；MW=615.09)和N-甲基咪唑(200mg;2.43毫摩；MW=82.10)于2-丁酮(10ml)中加熱5天。TLC分析允許檢測甲磺酸酯的轉(zhuǎn)化。必湮；通過降低壓力從反應(yīng)混合物中去除溶劑。所獲粗產(chǎn)物溶于12ml異丙醇，經(jīng)過紙過濾以去除未反應(yīng)的甲磺酸酯，然后用8ml純水稀釋。所述混合物用鹽酸酸化至pH=2。在5X:兩親性分子沉淀為鹽酸鹽。按照關(guān)于其他感興趣兩親性分子的描述，通過使用異丙醇-水混合物、酸化、然后利oC38H7803S;MW=615.09C41H81C1N2;MW=637.55用甲醇-水混合物可以極大地促進(jìn)HEIC分子的沉淀。在14000rpm離心((TC15分鐘)獲得產(chǎn)物。通過硅膠柱層析法(于二氯甲垸中的甲醇梯度)純化所獲沉淀物，獲得66mg純的HEIC，相當(dāng)于0.103毫摩(產(chǎn)率42%)。兩親性分子HEIC的分析TLC:Rf=0.25;溶劑于二氯甲垸中的10%甲醇；通過碘蒸氣檢測(MerckTLC板硅膠60F254)。iH國NMR(CDC13)5(ppm):0.89(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，66H，烴鏈的CH2);1.88(多重峰，1H，咪唑錄(3位的CH);4.16(單峰，3H,甲基咪唑鎿的CH3);4.20(^7.2Hz,雙峰，2H，甲基咪唑錄a位的CH2);7.14(單峰，1H，甲基咪唑鐵的CH);7.34(單峰，1H，甲基咪唑鐵的CH);10.74(單峰，1H，甲基咪唑鐺的CH)。"C-匪R:dept135(CDC13)5(ppm):CH和CH3產(chǎn)生負(fù)峰(-)檢測到CH2是正峰(+)deptl35檢測不到季碳139.2((畫),甲基咪唑鎿的C);122.9((-)，甲基咪唑鐺的C);121.5((-)，甲基咪唑鎗的C);54.04((+),咪唑鎗a位的C));38.8((-),甲基咪唑鐵的甲基C);36.8((-),咪唑鑰p位的C);31.9(+);30.8(+);29.7(+);29.2(+);26.2(+);22.7(+)(烴鏈上的不同C);14.1(-)，烴鏈的C末端甲基。實(shí)施例4:HEMB的合成在287mg苯并咪唑(2.43毫摩；MW=118.14)存在的條件下，溶于10ml2-丁酮的甲磺酸酯Y3(150mg;0.243毫摩；MW=615.09)在8(TC加熱23天。通過TLC分析檢測所述偶聯(lián)反應(yīng)物，檢測到甲磺酸酯Y3的緩慢轉(zhuǎn)化。減壓蒸發(fā)溶劑后獲得的粗固體通過硅膠柱層析法(于二氯甲垸中的甲醇苯并咪唑l-(2沖七烷基二十烷萄-lH-苯并咪唑(Bl)的合成:TLC:Rf=0.65;溶劑于二氯甲烷中的5°/。甲醇；UV檢測和/或碘蒸氣(MerckTLC板硅膠60F254)。iH-NMR(CDC13)5(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H,兩條烴鏈的末端CH3);1.25(大的多重峰，66H,烴鏈的CH2);1.89(多重峰，1H,苯并咪唑(3位的CH);4.1(J=7.2Hz，雙峰，2H，苯并咪唑a位的CH2);7.32(多重峰，2H，芳香環(huán)系統(tǒng)中的CH=CH);7.41(多重峰，1H，芳香環(huán)系統(tǒng)中的CH);7.84(多重峰，1H,芳香環(huán)系統(tǒng)中的CH);7.93(單峰，1H,苯并咪唑環(huán)中的CH)。3-(2-十七垸基-二十垸基)-l-甲基-3H-苯并咪唑-l-鑰氯化物(HEMB)的合向Bl(19.1mg;0.0299毫摩，MW=637.12)添加溶于15ml2-丁酮的碘代甲烷(0.5ml;7.85毫摩；MW=141.94)，并在6(TC加熱24小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑后獲得24.1mg粗產(chǎn)物。為了轉(zhuǎn)化成氯鹽，將所述固體溶于2.8ml甲醇，并用1.2mlHCl(18。/。)酸化。所述氯鹽在5。C形成沉淀物，通過離心(14000rpm，20分鐘)分離。利用于二氯甲烷中的甲醇梯度通過硅膠柱層析法進(jìn)一步純化所述殘?jiān)?，產(chǎn)生17.7mg的純產(chǎn)物HEMB(0.0257毫摩；86%產(chǎn)率)。兩親性分子HEMB的分析TLC:Rf^0.2;溶劑于CH2C12中的10%甲醇；UV檢測和/或碘蒸氣(MerckTLC板硅膠60F254)。1H-NMR(CDCI3)5(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);U6(大的多重峰，66H,烴鏈的CH2);(多重峰，1H，甲基苯并咪唑鐵(3位的CH);4.35(單峰，3H，甲基苯并咪唑鐺的CH3甲基)；4.49(J=7.2Hz，雙峰，2H,甲基苯并咪唑鑰a位的CH2);7.73(多重峰，4H，芐基部分的CH=CH);11.43(單峰，1H，咪唑鐵部分的CH)。13C-RMN:dept135(CDC13)5(ppm):CH和CH3顯示為負(fù)峰(-)。CH2產(chǎn)生正峰(+)。Dept135不顯示季原子。127.1((-)，苯并部分的2C);112.8((-)，苯并部分的C);113.0((-)，苯并部分的C);51.9((+)，甲基咪唑鐵部分a位的C);38.1((-)，甲基咪唑鐵部分的CH3);33.7((-)，甲基咪唑鎗卩的C);31.9(+);31.2(+);29.7(+);26.3(+);22.7(+):烴鏈的C;14.1((-),烴鏈的末端甲基)實(shí)施例5:HET的合成將溶于15ml無水DMPU的甲磺酸酯Y3(560.6mg;0.911毫摩；MW=615.09)與682.5mg碘化鈉(4.55毫摩，MW-149.85)在7(TC—起加熱20小時(shí)。所述反應(yīng)混合物用10ml水稀釋，并用二乙醚萃取3次。所述有機(jī)相用MgS04干燥，過濾，減壓去除溶劑。利用庚烷通過硅膠柱層析法純化所獲固體，得到360.5mg純的Tl(0.557毫摩；61.1%產(chǎn)率)。碘代烷T1的分析TLC:R^0.95;溶劑庚烷；通過香草醛/硫酸(藍(lán)色斑點(diǎn))(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。1H-NMR(CDC13)5(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，6H,兩條鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，66H,烴鏈的CH2);2.01(多重峰，1H，碘代卩位的CH);3.28(J=4.5Hz,雙峰，2H，碘代a位的CH2)。3-(2-十七烷基-二十烷基)-噻唑-3-鎗氯化物(HET)的合成向于10ml2-丁酮的Tl(136.9mg;0.211毫摩，MW=646.9)溶液中添加噻唑(180mg;2.11毫摩；MW=85.13)，并在80。C加熱所述反應(yīng)混合物27天。減壓蒸發(fā)溶劑，將粗固體溶于甲醇；過濾掉未反應(yīng)的碘代烷。向甲醇溶液18-碘甲基-三十六垸(Tl)的合成:C40H78C1NS;MW=640-57中添加稀釋的鹽酸(5ml4%HC1到10ml的MeOH溶液)，置于5°C以沉淀兩親性分子，通過14000rpm(30分鐘)離心收集。利用于二氯甲垸中的甲醇梯度通過硅膠柱層析法進(jìn)一步純化所述粗產(chǎn)物。陽性級(jí)分產(chǎn)生21mg純的HET(0.033毫摩；15%產(chǎn)率)。兩親性分子HET的分析TLC:Rf=0.4;溶齊lj:于二氯甲烷中的10%甲醇；通過碘蒸氣檢測(MerckTLC板硅膠60F254)。力-NMR(CDCb)S(ppm):0.89(J=6.7Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，66H,烴鏈的CH2);2.03(多重峰，1H，噻唑卩位的CH);4.67(J=7.4Hz，雙峰，2H，噻唑a位的CH2);8.22(J=1.2Hz，J，=3.7Hz,雙二重峰，1H，噻唑環(huán)的CH);8.40(J，=3.7Hz，J"=2.5Hz,雙二重峰，1H,噻唑環(huán)的CHC);10.82(小的雙二重峰，1H,噻唑環(huán)的CH)。13C-NMR:dept135(CDC13)5(ppm):CH和CH3顯示負(fù)峰(-)。CH2產(chǎn)生正峰(+)。160((-)，噻唑環(huán)的C);136.7((-),噻唑的C);127.3((-)，噻唑的C);60.7((+),噻唑a位的C);39.4((-)，噻唑卩位的C);32.2(+),30.7(+)，29.8(+),29.7(+),29.7(+)，29.6(+),29.5(+),29.4(+),26.1(+)，22.7(+),烴鏈的C;14.1((-),烴鏈的C末端甲基)。實(shí)施例6:HEMI的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>4沖六垸基-二十烷-l，4-二醇(Ll)的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>向頂部配有制冷柱的烘干雙頸頸反應(yīng)器中添加金屬鎂屑(1.618g;66.6毫摩；MW=24.31)，并置于氬氣中。然后向鎂屑中滴加溶于10ml無水二乙醚的碘代十六垸(19.55g;55.48毫摩；MW=352.34)，同時(shí)加熱回流30分鐘。再加熱所述反應(yīng)混合物60分鐘，其變成淺灰色，提示Grignard試劑的形成。在0。C向所述有機(jī)鎂試劑中滴加溶于5ml無水二乙醚的丁內(nèi)酯(800mg;9.29毫摩；MW=86.09)。加熱所述反應(yīng)物至室溫并攪拌18小時(shí)。必運(yùn)，將所述反應(yīng)混合物倒入200g碎冰中，所述水相通過添加濃鹽酸酸化。用CH2Cl2萃取所獲混合物，再用純水洗滌所述有機(jī)相。減壓濃縮所述有機(jī)層并干燥。將所獲固體溶于溫的THF。當(dāng)冷卻濃縮的混合物時(shí)，不溶性的副產(chǎn)物沉淀。THF蒸發(fā)后，所獲固體在溫的丙酮中重結(jié)晶。所述二醇選擇性地沉淀。獲得4.357g純的二醇Ll，基于丁內(nèi)酯的產(chǎn)率相當(dāng)于87%。二醇Ll的分析TLC:Rf=0.35;溶劑于庚烷中的30%乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。^畫NMR(CDCb)S(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，6H,烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，56H,烴鏈的CH2);1.45(大的多重峰，4H，叔醇卩位的ch2);1.55(多重峰，2h,伯醇y位的ch2);1.66(多重峰，2h,伯醇卩位的CH2);3.68(J=6Hz，三重峰，2H，伯醇a位的CH2)。4-十六烷基-二十-3-烯-l-醇(L2)的合成在50mg對(duì)甲苯磺酸(0.29毫摩；MW472)存在的條件下，在13(TC加熱溶于100ml二甲苯的醇Ll(1.5g;2.78毫摩；MW=538.97)50分鐘。利用于庚烷中的乙酸乙酯10%混合物通過硅膠層析法純化烯醇產(chǎn)生202.4mg的烯醇L2，相當(dāng)于0.389毫摩異構(gòu)體(14%產(chǎn)率)。主要的副產(chǎn)物是5元環(huán)醚(1.177g,2.2毫摩，79%)。烯醇L2的分析TLC:Rf=0.52和0.54(不同異構(gòu)體的2個(gè)斑點(diǎn))；溶劑于庚烷中的20%乙酸乙酯；利用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。4-十六烷基-二十烷-l-醇(L3)的合成c36h720;mw=520.96C36H740;MW=522.97在1個(gè)大氣壓的氫中，溶于5ml乙酸乙酯的烯醇L2(202.4mg,0.389毫摩，MW-520.96)用60mg炭上鈀(10%Pd/C)氫化3天。通過TLC分析檢測所述轉(zhuǎn)化。過濾去除催化劑，通過蒸發(fā)溶劑以定量產(chǎn)率獲得純的醇L3。醇L3的分析TLC:R^0.52;溶劑于庚烷中的20%乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。1H-RMN(CDC13)S(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H,烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，63H,在烴鏈上)；1.56(多重峰，2H，醇|3位的CH2);3.68(J=6.7Hz,三重峰，2H,醇功能團(tuán)a位的CH2)。4-十六烷基-二十烷基甲磺酸酯(L4)的合成通過連續(xù)添加0.24ml甲磺酰氯(355mg;3.1毫摩；MW^114.55)和0.48ml三乙胺(346mg;3.42毫摩；MW^01.19)將溶于10ml二氯甲烷(用氫化鈣蒸餾過)并冷卻至0。C的醇L3(165.2mg;0.316毫摩；MW^522)甲磺?；?。在室溫下4小時(shí)后，溶劑被蒸發(fā)，用甲醇洗滌所述固體以萃取過量的試劑和三乙胺鹽，產(chǎn)生119mgL4(0.198毫摩；63.6%產(chǎn)率)。甲磺酸酯L4的分析TLC:Rf=0.6;溶劑于庚垸中的50%CH2C12;用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。^-NMR(CDC13)5(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，63H,在烴鏈上)；1.73(多重峰,2H,甲磺酸酯(3位的CH2);3.02(單峰，3H，甲磺酸酯的CH3);4.22(J=6.6Hz，三重峰，2H,甲磺酸酯(x位的CH2)。l-(4-十六烷基-二十垸基)-3-甲基-咪唑-l-鎗氯化物(HEMI)的合成C16H33Wcf9C4oH79N2C1;廳=623.52在162.5mg甲基咪唑(1.98毫摩；MW二82.10)存在的條件下，將溶于10ml2-丁酮的甲磺酸酯L4(119mg;0.197毫摩；MW=601.06)在8(TC加熱6天。通過TLC分析(甲磺酸酯消失)檢測反應(yīng)。0C37H7603S;MW=601.06必湮.*減壓蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物溶于甲醇，并通過過濾將其與未反應(yīng)的甲磺酸酯分離?？扇苄圆糠秩苡?7ml甲醇，添加8ml3.7M鹽酸。在5'C保存時(shí)兩親性分子沉淀。在O"C以14000rpm離心分離所述固體，沉淀得到170.6mg粗產(chǎn)物。硅膠層析法純化(于二氯甲垸中的甲醇梯度1%-15%)產(chǎn)生純的產(chǎn)物，產(chǎn)率為43%(53mg;0.085毫摩)。兩親性分子HEMI的分析TLC:R一0.28;溶齊lj:于CH2C12中的10%甲醇；用碘蒸氣(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。^-NMR(CDCb)S(ppm):0.87(J=6,8Hz,三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.23(大的多重峰，63H,在烴鏈上)；1.85(多重峰，2H,甲基咪唑鎗(3位的CH2);4.12(單峰，3H,甲基咪唑鐺的CH3);4.27(J=7.4Hz，三重峰，2H，甲基咪唑鎗a位的CH2);7.28(單峰，1H,甲基咪唑鑰環(huán)的CH);7.49(單峰，1H,甲基咪唑鐺環(huán)的CH);10.65(單峰，1H，甲基咪唑鑰環(huán)的CH)。13C-NMR:dept135(MeOD-4d)S(ppm):CH和CH3產(chǎn)生負(fù)峰(-)。檢測到CH2為正峰(+)。deptl35檢測不到季碳。136.5((-)，甲基咪唑鐵的C);123.6((-)，甲基咪唑鎗的C);122.3((-),甲基咪唑鐺的C);49.8((+)，咪唑鐺a位的C));36.9((-)，甲基咪唑鐺的甲基-C);35.1((畫)，側(cè)鏈分支點(diǎn)的C;33.0(+);31.7(+);30.0(+);29.7(+);29.4(+);29.35(+);29.3(+)，29.1(+);27.2(+);26.2(+);22.4(+)(烴鏈上不同的C);13.2(-),烴鏈的C末端甲基。實(shí)施例7:BIA的合成:C"H之9BIA5-十四烷基-十九烷基-l，5-二醇(Wl)的合成C14H290Hc33H6802;MW=496.89在30分鐘內(nèi)將溶于120ml二乙醚(用二苯甲酮鈉蒸餾過)的l-溴十四垸(44.58g;160.8毫摩；MW二277.28)滴加至4.7g鎂屑(193.3毫摩；MW=24.31)，同時(shí)加熱回流?；亓鞒掷m(xù)1小時(shí)，然后將溫度降低到5°C，再滴加溶于20ml二乙醚的戊內(nèi)酯(4.024g;40.2毫摩；MW=100.12)。在室溫下攪拌所述反應(yīng)混合物16小時(shí)以完成反應(yīng)。必遛；將所述反應(yīng)混合物倒入500ml碎冰中，用濃鹽酸酸化，并用二氯甲烷萃取。將蒸發(fā)有機(jī)層后獲得的固體溶于溫的THF，這可以將其與不溶性的副產(chǎn)物分離。THF蒸發(fā)后的可溶性組分在溫的丙酮中重結(jié)晶，產(chǎn)生17.6g的純二醇Wl(35.4毫摩；基于戊內(nèi)酯是88.1%)。二醇W1的分析TLC:Rf=0.27;溶齊l」于庚垸中的30%乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。"H-NMR(CDC13)S(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，6H,烴鏈的末端CH3);1.27(大的多重峰，50H，烴鏈的CH2);1.42(大的多重峰，6H，叔醇卩位的CH2);1.59(多重峰，2H，伯醇(3位的CH2);3.68(J=6.4Hz，J，=5.3Hz,三重峰的雙峰,2H,伯醇a位的CH2)。C33H660;MW=478.88將溶于200ml甲苯的二醇Wl(5g;10.1毫摩；MW-497)與137.6mg對(duì)甲苯磺酸加熱回流2.5小時(shí)。利用于庚烷中的乙酸乙酯梯度(5%至10%)通過硅膠柱層析法純化減壓蒸發(fā)溶劑后獲得的粗固體。獲得2.25g純的烯醇W2(異構(gòu)體的混合物)(47.1毫摩；46.5%產(chǎn)率)。烯醇W2的分析TLC:Rf=0.44;Rf'=0.48;溶齊^于庚垸中的20%乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。^-NMR(CDC13)S(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H,烴鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，48H,烴鏈的CH2);1.4-1.6(大的多重峰，2H，醇卩位的CH2);2.00(多重峰，6H，烯丙基位的CH2);3.66(J=6.4Hz,三重峰，2H,伯醇a位的CH2);5.13(J-7.0Hz，三重峰，1H,乙烯位的CH)。5-十四烷基-十九烷-l-醇(W3)的形成在1個(gè)大氣壓的氫氣中，溶于12ml乙酸乙酯的烯醇異構(gòu)體W2(2.207g,4.6毫摩)用炭上鈀(Pd/C10%,400mg)氫化。經(jīng)過紙過濾并減壓蒸發(fā)掉溶劑后可以定量獲得純的醇(2.045g,4.25毫摩，92.4%產(chǎn)率)。醇W3的分析TLC:Rf=0.38;溶劑于庚烷中的20%乙酸乙酯；用香草酸/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。iH國RMN(CDC13)5(ppm):0.90(J=6.8Hz，三重峰，6H，烴鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，57H，在烴鏈上)；1.56(多重峰，2H,醇p位的CH2);3.67(J=6.6Hz，三重峰，2H,醇功能團(tuán)a位的CH2)。5-十四垸基-十九醛(W4)的形成C"H29C33H660;MW=478.88通過連續(xù)添加284mg草酰氯和之前于20ml無水二氯烷中并冷卻至C33H680;MW=480.89-78°C的265^1DMSO來制備Swem試劑。5分鐘后添加醇W3(900mg;1.869毫摩；MW=480.88)，并將其置于-78。C30分鐘;添加lml無水三乙胺(用氫化鈣蒸餾過)。將所述反應(yīng)混合物加熱至室溫30分鐘。必遝.-所述反應(yīng)混合物用30ml水急冷，并用二氯甲烷萃取3次。用1°/。鹽酸和5%碳酸鈉水溶液洗滌有機(jī)相。用無水硫酸鈉干燥所述有機(jī)層，并過濾。利用于庚垸中的乙酸乙酯梯度(3%至5%)通過硅膠層析法進(jìn)一步純化溶劑蒸發(fā)后獲得的粗制醛，產(chǎn)生658mg純的醛(1.375毫摩,73.5%產(chǎn)率)。醛(W4)的分析TLC:RfN).32;溶劑于庚垸中的5%乙酸乙酯；用于水中的0.5%KMn04作為噴霧劑(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。iH-RMN(CDC13)5(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，6H,烴鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，57H，在烴鏈上)；1.62(多重峰，2H,醛p位的CH2);2.42(J=7.3Hz,三重峰，2H,醛功能團(tuán)a位的CH2);9.79(單峰，醛的CHO)。15-十四烷基-三十七烷-19-醇(W5)的形成在20分鐘內(nèi)將溶于10ml二乙醚(用二苯甲酮鈉蒸餾過)的1-碘代十八烷(2.044g;5.37毫摩；MW二380.40)滴加至196mg鎂屑(8.064毫摩；MW=24.31)，同時(shí)加熱回流。回流持續(xù)1小時(shí)，然后將溫度降低到5°C，再滴加溶于20ml二乙醚的醛W4(426mg;0.89毫摩；MW-478.88)。在室溫下繼續(xù)攪拌18小時(shí)以完成反應(yīng)。必湮將所述反應(yīng)混合物倒入100ml碎冰中，用濃鹽酸酸化，并用二氯甲烷萃取3次。將蒸發(fā)有機(jī)層后獲得的固體溶于溫的THF;結(jié)晶后通過過濾可以分離副產(chǎn)物。THF蒸發(fā)后，粗制固體在溫的丙酮中重結(jié)晶，并利用乙酸乙酯庚垸梯度(1%至5%)通過硅膠層析法純化，得到293mg(0.4毫摩；基于醛產(chǎn)率為45%)。醇(W5)的分析TLC:Rf=0.37;溶劑于庚烷中的10°/。乙酸乙酉旨；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。力-NMR(CDCb)S(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，9H,烴鏈的末端C5iH104O;MW=733.37CH3);1.28(大的多重峰，89H，在烴鏈上)；1.43(大的多重峰，4H，仲醇p位的CH2);3.61(多重峰，1H,伯醇a位的CH2)。甲磺酸l沖八烷基-5沖四烷基十九酯(W6)的合成溶于20mlCH2C12(用CaH2蒸餾過)的醇W5(435.8mg;0.594毫摩；MW^733.37)被冷卻至0°C。向所述反應(yīng)混合物中添加甲磺酰氯(0.46ml;680.7mg;6.43毫摩；MW=114.55)，并在0。C滴加0.9ml三乙胺(661mg;6.53毫摩；MW=101.19)，所述混合物在室溫下再攪拌20小時(shí)。溶劑蒸發(fā)后，所述殘?jiān)眉状枷礈?，并通過過濾分離，產(chǎn)生純的甲磺酸酯(450.5mg;0.515毫摩；93%產(chǎn)率)。甲磺酸酯W6的分析TLC:Rf=0.59;溶齊lj:于庚烷中的50%二氯甲烷；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。^-NMR(CDC13)S(ppm):0.90(J=5.6Hz,三重峰，9H，烴鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，89H,在烴鏈上)；1.69(大的多重峰，4H，甲磺酸酯卩位的CH2);3.01(單峰，3H，甲磺酸酯的CH3);4.72(多重峰，1H,甲磺酸酯a位的CH)。《分支咪唑鑰兩親性分子》(BIA)(l-甲基-3-(l-十八烷基-5-十四垸基-十九垸基)-3H-咪唑-l-総氯化物)的合成在221.6mg甲基咪唑(2.7毫摩;MW二82.10)存在的條件下，將溶于10ml2-丁酮的甲磺酸酯W6(224mg;0.27毫摩；MW=811.46)在8(TC加熱6天。通過TLC分析(甲磺酸酯消失)檢測反應(yīng)。必遝，減壓蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物溶于甲醇，并通過過濾將其與未反應(yīng)的甲磺酸酯分離?？扇苄圆糠秩苡?7ml甲醇，添加8ml水。所述甲醇溶液用濃鹽酸酸化至pH:2。在-2(TC保存時(shí)兩親性分子沉淀。在O"C以14000rpm離C52H106O3S;MW=811.4634心分離所述固體，沉淀得到220mg粗產(chǎn)物。硅膠層析法純化(于二氯甲垸中的甲醇梯度1%-12%)產(chǎn)生純的產(chǎn)物，產(chǎn)率為43%(198.7mg;0.238毫摩)。BIA的分析TLC:Rf=0.33;溶齊U:于二氯甲烷中的10°/。甲醇；用碘蒸氣(MerckTLC板硅膠60F254)檢測。力畫NMR(CDCl3)5(ppm):0.90(J=6.8Hz,三重峰，9H，烴鏈的末端CH3);1.28(大的多重峰，89H，在烴鏈上)；1.84(大的多重峰，4H，咪唑鎗卩位的CH2);4.18(單峰，3H,咪唑鎗的CH3);4.44(五重峰，J=5.6Hz，1H，咪唑鐵a位的CH);7.15(單峰，1H，咪唑鎿環(huán)的CH);7.33(單峰，1H，咪唑鑰環(huán)的CH);11.19(單峰，1H，咪唑錄環(huán)的CH)。13C-NMR:dept135(CDC13)S(ppm):CH和CH3產(chǎn)生負(fù)峰(-)。檢測到CH2為正峰(+)。deptl35檢測不到季碳。138.7((陽)，甲基咪唑鎗的C);123.0((畫)，甲基咪唑総的C);119.3((-),甲基咪唑鎗的C);62.8((-),咪唑鐺a位的C));37.2((-),烴鏈的CH),36.7((-),甲基咪唑鐺的甲基-C);35.9(+);35.4(+);33.5(+);33.4(+);33.3(+);31.9(+);30.1(+);29.7(+);29.65(+);29.6(+);29.5(+);29.4(+);29.1(+);26.65(+);26.6(+);25.9(+);23.2(+);22.7(+):(烴鏈的不同C);14.1((-)，烴鏈的C末端甲基)兩親性分子的質(zhì)量分析<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>分子溶于甲醇(0.1mg/ml);直接注入；通過BmkerHCTultra裝置的電噴ESI+MassAnalysis檢測。從l-甲基-3-(l-十八垸基-十九烷基)-3H-咪唑-l-鎗氯化物(MONI)和DOPE制備脂質(zhì)體利用DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)作為共脂質(zhì)形成脂質(zhì)體。通過超聲水浴的溫和超聲處理，將6.3mgMONI與不同量的DOPE—起溶于lml乙醇。將這種濃的醇溶液注入9ml無菌水。所獲溶液是澄清并且稍帶藍(lán)色的。該溶液用超聲儀(BioblockScientific)超聲處理，11W2秒脈沖，5分鐘。所獲脂質(zhì)體大小為大約110nm，其尺寸分布較窄。它們在5"C的保存條件下是穩(wěn)定的，大小沒有增加也沒有沉淀。在下列MONI制劑中，選擇濃度恒定為lmM的兩親性分子與不同毫摩爾量的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)組合。為了清楚起見，將它們簡化為MONI(l+n)，n是DOPE的毫摩爾濃度。兩親性分子MONI，但也包括本發(fā)明的其他兩親性分子，尤其是實(shí)施例2到7的那些分子，可以與共脂質(zhì)DOPE—起非常容易的溶于乙醇。正如脂質(zhì)體制劑一樣，在存在不同摩爾比例的DOPE時(shí)濃度為lmM的兩親性分子最利于比較它們各自的生物活性。這些醇溶液與脂質(zhì)體制劑一樣進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過動(dòng)態(tài)光散射測量粒徑按照上述，在milliQ水中制備1毫摩兩親性分子與不同濃度DOPE的脂質(zhì)體制劑。利用Zetamaster(MalvernInstrument,Orsay,France)通過光散射確定這些脂質(zhì)體制劑的粒徑，參數(shù)如下取樣時(shí)間，30s;每個(gè)樣品測量3次；介質(zhì)粘度，1.0cP;介質(zhì)折射率(RI)，1.335;RI顆粒，1.47;溫度25°C，633nm激光波長。NMR實(shí)驗(yàn)利用CarexSA(Illkirch，F(xiàn)rance)的Bruker400MHz分光光度計(jì)記錄畫R譜。元素分析(C、H、N)和紅外光譜學(xué)最終產(chǎn)物的元素分析和紅外光譜學(xué)(Vertex70inKBr)在斯特拉斯堡的"InstitutCharlesSadronUPR22，，完成。質(zhì)量分析在FacultyofPharmacyinIllkirch(IFR85,ULP，UniversityLouisPasteur,Strasbourg)的HCTultra裝置(Bruker，F(xiàn)rance)上通過電噴射離子化法(ESI+)完成質(zhì)量分析。細(xì)胞培養(yǎng)K562(人慢性髓性白血病，CCL-243)和THP-1(人外周血單核細(xì)胞白血病，TIB-202)細(xì)胞在RPMI-1640(Eurobio)中生長，所述RPMI-1640添加有10。/。胎牛血清(FBS，Perbio)、2mMglutamax(Eurobio)、100單位/ml青霉素(Eurobio)、100嗎/ml鏈霉素(Eurobio)。HeLa(人宮頸上皮腺癌，CCl-2)、Caski(人宮頸癌)、SiHa(人宮頸鱗狀癌，HTB-35)、MCF-7(人乳腺上皮腺癌，HTB-2"細(xì)胞在MEM(Eurobio)中生長，所述MEM添加有2mMglutamax、Earle'sBSS、1.5g/L碳酸氫鈉、O.lmM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素和10%FBS。NIH-3T3(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，CRL-1658)細(xì)胞在DMEM(Eurobio)中生長，所述DMEM添加有4mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/l葡萄糖、抗生素(Peni/Strepto)和腦FBS。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL3Luc質(zhì)粒(Clontech)后獲得穩(wěn)定表達(dá)GL3熒光素酶(SV40元件控制下的北美螢火蟲(/^orim^p,afc)熒光素酶)的A549(人肺癌，ATCCN。CCL-185)細(xì)胞。A549-GL3Luc細(xì)胞在RPMI-1640中生長，所述RPMI-1640添加有10%胎牛血清、2mMglutamax、100單位/ml青霉素、100)ig/ml鏈霉素和0.8pg/mlG418(Promega)。所有的細(xì)胞均在37°C5%C02的濕潤環(huán)境中維持。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)24孔組織培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，將2.5><104個(gè)細(xì)胞種入24孔組織培養(yǎng)板的lml含10%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前，制備siRNA/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將所需量的siRNA稀釋到lOOpl無血清培養(yǎng)基中。用渦旋振蕩器混合所述溶液10秒。然后，向siRNA溶液中添加0.5^1至3|il的基于兩親性分子的制劑。用渦旋振蕩器混合最終的混合物10秒，在室溫下靜置10分鐘。然后，每孔添加100W復(fù)合物溶液，并在37'C保溫所述板。96孔組織培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，將lxl(^個(gè)細(xì)胞種入96孔組織培養(yǎng)板的0.15ml含0.150%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前，制備siRNA/轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物。將所需量的siRNA稀釋到20^1無血清培養(yǎng)基中。用渦旋振蕩器混合所述溶液10秒。然后，向siRNA溶液中添加0.5^1至3]al的基于兩親性分子的制劑。用渦旋振蕩器混合最終的混合物10秒，在室溫下靜置10分鐘。然后，每孔添加20ial復(fù)合物溶液，并在37'C保溫所述板。96孔組織培養(yǎng)板中的反向轉(zhuǎn)染首先制備siRNA/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將所需量的siRNA稀釋到5(^1無血清培養(yǎng)基中，并將其添加到96孔組織培養(yǎng)板的孔中。然后，向siRNA溶液中添加0.5|al至3^1的基于兩親性分子的制劑。在室溫下將所述板置于定軌搖床5分鐘。然后，在96孔組織培養(yǎng)板的每孔125^1含10%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基中添加"104個(gè)細(xì)胞，然后所述板在37。C繼續(xù)保溫。轉(zhuǎn)染試劑的比較(以24孔組織培養(yǎng)板形式)對(duì)于HiperFect試劑，將所需量的siRNA稀釋到30(^1無血清培養(yǎng)基中(實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次)。然后，向siRNA混合物中添加9pl轉(zhuǎn)染試劑。用渦旋振蕩器混合所述溶液10秒，在室溫下靜置10分鐘。轉(zhuǎn)染前，去除完全培養(yǎng)基并用每孔0.5ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基替換。每孔添加100微升轉(zhuǎn)染溶液。對(duì)于SilentFect試劑，將所需量的siRNA稀釋到75pl無血清培養(yǎng)基中(實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次)。將SilentFect試劑(2.25jxl)稀釋到75pl無血清培養(yǎng)基，并將所述溶液添加到siRNA的稀釋溶液中，然后混合，在室溫下靜置20分鐘。轉(zhuǎn)染前，去除完全培養(yǎng)基，用每孔0.5ml含10。/。血清的完全培養(yǎng)基替換。每孔添加50微升轉(zhuǎn)染溶液。因?yàn)橛^察到細(xì)胞毒性，所以去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用每孔lml含10%血清的完全培養(yǎng)基替換。對(duì)于Saint-Red試劑，將所需量的siRNA稀釋到75^1HBS中(實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次)。將Saint-Red試劑(lnMsiRNA為0.42pl)稀釋于75^1HBS，并將所述溶液添加到siRNA的稀釋溶液中，然后混合，在室溫下靜置15分鐘。然后，將600^1無血清培養(yǎng)基添加到轉(zhuǎn)染溶液中。在添加到細(xì)胞前，去除完全培養(yǎng)基并用每孔0.5ml含10%血清的完全培養(yǎng)基替換，然后每孔添加250^1轉(zhuǎn)染溶液。對(duì)于TransIT-TKO，將所述試劑(6pl)稀釋于150)il無血清培養(yǎng)基，并混合所述溶液，在室溫下靜置15分鐘。向轉(zhuǎn)染試劑稀釋溶液中添加所需量的siRNA。輕輕混合溶液并在室溫下靜置15分鐘。在添加到細(xì)胞前，去除完全培養(yǎng)基并用每孔0.25ml含10%血清的完全培養(yǎng)基替換。每孔添加50微升轉(zhuǎn)染溶液。保溫24h后，去除培養(yǎng)基，用0.5ml含10。/。FBS的完全培養(yǎng)基替換。對(duì)于所有的轉(zhuǎn)染方案，所述板還在37。C繼續(xù)保溫48h。熒光素酶和蛋白分析利用商品化試劑盒(Promega,France)測量熒光素酶基因表達(dá)。在去除完全培養(yǎng)基后，用lmlPBS溶液洗滌3次。然后，每孔添加100pllx裂解緩沖液，板在室溫下保溫30分鐘。收集裂解產(chǎn)物，并在14000g離心5分鐘。在注射100^1熒光素溶液后對(duì)5^1裂解物進(jìn)行熒光素酶分析。利用光度計(jì)(LB960，Berthold,France)通過超過10秒的積分來監(jiān)測發(fā)光(RLU)。結(jié)果表示為利用BCA分析(Pierce，F(xiàn)rance)測定的每mg細(xì)胞蛋白積分超過10秒的光單位(RLU)。mRNA水平的測量通過對(duì)全細(xì)胞裂解物進(jìn)行的并且不需要靶擴(kuò)增的QuantiGeneBranchedDNA分析(GenoSpectra)測定信使RNA水平。轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞用lmLPBSlx(Cambrex)洗滌，并在50°C0.6mLlxGenospectra裂解緩沖液中裂解30分鐘。然后，將板在-8(TC保存至少30分鐘。將裂解物解凍，并向捕獲板中添加2-20pl裂解物。向板中添加10^1裂解工作試劑(對(duì)于48個(gè)反應(yīng)，通過添加25^1CE(captureextender)、25^1LE(labelextender)和25jilBL(封閉探針)和425|il3x裂解混合物制備裂解工作試劑，全部化合物均購自Genospectm)并利用lx裂解混合物補(bǔ)足體積至100^1。用蓋子將板覆蓋并在50'C保溫16h。板用300^1lx洗滌緩沖液(Genospectra)洗滌3次，每孔添加100^1Amplifier工作溶液(0.116|11amplifier稀釋于116^1Amplifier稀釋劑，均購自Genospectra)。板在50。C保溫1小時(shí)。用lx洗滌緩沖液洗滌3次后，每孔添加100pl標(biāo)記探針工作試劑(LabelProbeWorkingReagent)(0.116pl標(biāo)記探針稀釋于116(ilAmplifier稀釋劑，均購自Genospectra)并在50。C保溫1小時(shí)。然后用lx洗滌緩沖液洗滌板3次，每孔添加100^1底物工作試劑(SubstrateWorkingReagent)(0.348(il10%十二垸基硫酸鋰溶于116^1底物，均購自Genospectra)。保溫30分鐘后，用分光光度計(jì)(Berthold)測量每孔的發(fā)光。SDS-PAGE和Western印跡分析轉(zhuǎn)染后，用lmlPBSlx(Cambrex)洗滌細(xì)胞，每孔再用10(^1胰蛋白酶/EDTA(Euromedex)進(jìn)行胰蛋白酶消化。添加含10%血清的0.5mL完全培養(yǎng)39基終止胰蛋白酶作用。將一式三份的孔集中，離心，用lxPBS洗滌沉淀。離心后，沉淀在4'C在100^1RIPA緩沖液(50mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，lmMEDTA，1%TritonX-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS)中裂解20分鐘。用渦旋振蕩器勻漿所述裂解物，并在14000rpm離心5分鐘。通過BCA試劑盒(Pierce)測定蛋白含量。將5嗎蛋白上樣于10%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(Millipore)。利用1/3000稀釋的豚鼠抗波形蛋白多克隆抗體(RDI)檢測波形蛋白表達(dá)。用小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Ambion)檢測GAPDH用于歸一化蛋白水平。按照制造商的說明書，利用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗豚鼠或者抗小鼠抗體和BioRad的AmplifiedOpti-4CN底物試劑盒顯色免疫活性蛋白。免疫熒光染色轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)回收培養(yǎng)基。用含1°/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液洗滌細(xì)胞。在4"C用甲醇溶液(甲醇/丙酮1/1，冷卻至-2(TC)透化和固定細(xì)胞15分鐘。再用lmlPBS-BSAl。/。洗滌細(xì)胞兩次，然后在4。C用含l。/。山羊血清的lmlPBS保溫細(xì)胞15分鐘以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再用lmlPBS-BSAl。/。洗滌細(xì)胞。在50^11PBS和50^1小鼠抗核纖層蛋白A/C抗體(IgG1型，ResearchDiagnosticInc，F(xiàn)landers,NJ)存在的條件下，在4。C保溫細(xì)胞1小時(shí)。用lmlPBS-BSA1%洗滌細(xì)胞兩次。細(xì)胞在4'C在PBS中保溫1小時(shí)，所述PBS含偶聯(lián)熒光素的抗小鼠IgG的山羊抗體(Calbiochem,LaJolla，CA)。然后再用lmlPBS-BSAl。/。洗滌細(xì)胞，最終每孔添加lmlPBS-BSA1%。通過熒光顯微鏡(ECLIPSETE2000-S，Nikon)觀察免疫染色。結(jié)果作為內(nèi)源性報(bào)道基因的靶模型，使用穩(wěn)定表達(dá)GL3熒光素酶的A549細(xì)胞(SV40元件控制下的北美螢火蟲熒光素酶)。明確定義和常用的siRNA(化學(xué)制備的)以及SEQIDN。l和2的序列特異性GL3LucsiRNA(由與GL3LucmRNA匹配的19個(gè)核苷酸的短dsRNA組成，包括2個(gè)脫氧核糖核苷酸(dT)的3'突出)用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。制備于乙醇中的lmM陽離子兩親性分子MONI組合lmM中性磷脂DOPE的制劑。然后將于無血清培養(yǎng)基(10(^1)中稀釋的siRNA與2ialMONI/DOPE制劑(lmM/lmM，于乙醇中)復(fù)合。向在含血清的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞添加所得的轉(zhuǎn)染復(fù)合物溶液，最終細(xì)胞暴露于濃度為100-2000pM的siRNA(圖1)。轉(zhuǎn)染48h后通過標(biāo)準(zhǔn)發(fā)光分析確定沉默效率，所述分析經(jīng)過細(xì)胞裂解物蛋白含量歸一化。當(dāng)用2000pMsiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性(表示為RLU/mg蛋白)被抑制達(dá)到90%。在相同條件下，當(dāng)細(xì)胞用無關(guān)序列GL2LucsiRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性不受影響，證實(shí)了這是一種序列特異性的RNA干擾。向細(xì)胞單獨(dú)添加相同濃度(100-2000pM)的GL3LucsiRNA時(shí)也沒有顯示熒光素酶活性的抑制(未顯示)。于乙醇中制備ImM基于MONBI分子的陽離子兩親性分子組合2mMDOPE的第二制劑。使用2^1這種制劑與GL3LucsiRNA(濃度范圍從250pM-5nM)在無血清培養(yǎng)基中復(fù)合，并將所獲溶液添加到A549-GL3Luc細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后通過測量熒光素酶活性評(píng)估沉默效率。利用250pMsiRNA觀察到顯著的熒光素酶抑制(70%)，而用5nMsiRNA轉(zhuǎn)染更達(dá)到90%的熒光素酶抑制(圖2)。當(dāng)在相同的轉(zhuǎn)染條件下使用無關(guān)序列GL2LucsiRNA時(shí)，熒光素酶水平不受影響，證實(shí)了利用GL3LucsiRNA獲得選擇性沉默。如圖2所示，當(dāng)利用制劑MONI/DOPE轉(zhuǎn)染時(shí)，基因沉默在siRNA的皮摩范圍都是有效的。1000和100pM時(shí)熒光素酶基因沉默分別是95%和80%。當(dāng)分別轉(zhuǎn)染25和10pMsiRNA時(shí)，仍然觀察到50和20%的沉默(圖3)。通過在乙醇或者水中混合陽離子兩親性分子和中性磷脂DOPE制備基于咪唑鐵兩親性衍生物例如MONI或者M(jìn)ONBI的制劑。對(duì)于脂質(zhì)體制品，兩親性分子首先與DOPE溶于乙醇，提供10x濃縮液。然后，將該溶液注射到IO倍體積的水中并立即混合。然后用超聲儀對(duì)所獲溶液進(jìn)行超聲。通過動(dòng)態(tài)光散射測定形成脂質(zhì)體的粒徑，顯示平均大小為100nm，多分散性低(圖4)。在4。C保存該脂質(zhì)體制劑，發(fā)現(xiàn)其隨時(shí)間是穩(wěn)定的(數(shù)周至數(shù)月)，并且沒有聚集形成(l個(gè)月，如圖4所示)。我們制備了許多脂質(zhì)體制齊U，顆粒平均大小為100+/-10nM，突出顯示了這種脂質(zhì)體制備方法的實(shí)用性。將MONI/DOPE脂質(zhì)體制劑與許多上一代的專門用于將siRNA輸送入細(xì)胞的商品化轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行比較(圖5)。轉(zhuǎn)染條件參照制造商的方案，這些條件描述于"材料和方法"。使用的siRNA濃度范圍從lpM-10nM。41Saint-Red和TransIT-TKO試劑顯示最低的沉默效率(在lnm低于50%)。HiperFect和SilentFect試劑在100pM-10nM的siRNA范圍內(nèi)顯示較好的沉默效率，但它們在siRNA的最低濃度(10pM-lpM)下是完全無效的。在所有被檢測的siRNA濃度下MONI/DOPE轉(zhuǎn)染系統(tǒng)均優(yōu)于所有其他被檢測的轉(zhuǎn)染試劑。在10pM仍然觀察到顯著的基因沉默，大約50%。為了證實(shí)MONI/DOPE制劑介導(dǎo)有效內(nèi)源性基因沉默的功效，我們在各種細(xì)胞系包括粘附和非粘附細(xì)胞中靶向了GAPDH基因。我們選擇SMARTpoolTechnologies(Dharmacon)的GAPDHsiRNA，其提供一組耙向相同mRNA上多個(gè)位點(diǎn)的4種siRNA，可確保有效的敲低(knockdown)。轉(zhuǎn)染后48h利用QuantiGenebDNA技術(shù)(Genospectra)在mRNA水平評(píng)價(jià)基因沉默。向所有被檢測的細(xì)胞(HeLa、Caski、SiHa、MCF-7、K562和THP-1)中添加單獨(dú)的GAPDHSMARTpool⑧試劑在250pM-10nM的濃度范圍在mRNA水平不能提供有效的敲低。當(dāng)用脂質(zhì)體MONI/DOPE制劑(l/2mM)轉(zhuǎn)染時(shí)，在250pM-10nM的siRNA濃度下，GAPDHSMARTpoo媳試劑顯示高效的GAPDHmRNA敲低，對(duì)于粘附細(xì)胞超過80%(HeLa、Caski、SiHa和MCF-7)(圖6)。作為選擇性的對(duì)照，添加核纖層蛋白A/CsiRNA，但其對(duì)GAPDHmRNA水平?jīng)]有影響。此外，當(dāng)利用脂質(zhì)體MONI/DOPE制劑和低濃度(5-20nM)siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)于非粘附細(xì)胞K562和THP-1也獲得了選擇性和有效的GAPDH沉默(圖6)。其他內(nèi)源性基因也被用作RNA干擾的靶，包括波形蛋白和核纖層蛋白A/C基因。通過鼠成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞波形蛋白基因的western印跡(圖7)和人HeLa細(xì)胞核纖層蛋白A/C基因的免疫熒光染色(圖8)在蛋白水平確定沉默效率。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均顯示在低siRNA濃度(l-5nM)下，利用脂質(zhì)體MONI/DOPE制劑(l/2mM)轉(zhuǎn)染siRNA48h后對(duì)這兩種高豐度蛋白的高沉默效率。核纖層蛋白A/C實(shí)驗(yàn)還證實(shí)所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞均含完全消除靶基因表達(dá)的生物活性siRNA(圖8)。轉(zhuǎn)染方案最初被用于在含血清培養(yǎng)基存在的條件下在24孔組織培養(yǎng)板中生長的粘附和非粘附細(xì)胞的有效siRNA輸送。還檢測了其他細(xì)胞培養(yǎng)支持物，例如6孔板、T25和T75培養(yǎng)瓶，對(duì)于用脂質(zhì)體MONI/DOPE(l/2mM)制劑轉(zhuǎn)染的濃度范圍為100pM-10nM的siRNA，顯示基因沉默效率〉80%。在96孔組織培養(yǎng)板中利用反向轉(zhuǎn)染方案說明了適合HTS條件的siRNA輸送能力。經(jīng)過優(yōu)化后，提出一種常規(guī)有效的方案。首先向孔中添加用25^1無血清培養(yǎng)基稀釋的siRNA。然后，每孔添加lpl脂質(zhì)體MONI/DOPE(1/2mM)制劑。混勻后，將板在室溫放置10分鐘以便轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。然后向孔中添加用125^1含血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞(10000個(gè)細(xì)胞/孔)，將板在37'C繼續(xù)保溫48h。當(dāng)siRNA濃度^lnM時(shí)，A549GL3Luc細(xì)胞的熒光素酶基因沉默超過80%，并且當(dāng)轉(zhuǎn)染無關(guān)的GL2LucsiRNA時(shí)，不存在熒光素酶抑制證明了選擇性(圖9)。皮摩水平的siRNA沉默也是顯著的(>50%，圖9)。在優(yōu)化的反向siRNA轉(zhuǎn)染方案后，對(duì)于濃度為100pM和5nM的siRNA，MCF-7細(xì)胞中選擇性GAPDH沉默效率分別為70-90%(圖IO)。在下表2中列出了關(guān)于通過用基于式(I)所示兩親性陽離子分子的制劑轉(zhuǎn)染GL3LucsiRNA的熒光素酶基因(pGL3)沉默的結(jié)果。由兩親性陽離子分子/DOPE(lmM/2mM，于10%乙醇和水中)組成的制劑與siRNA復(fù)合，并轉(zhuǎn)染A549-GL3Luc細(xì)胞。保溫48h后檢測熒光素酶基因表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，利用對(duì)照GL2-LucsiRNA并用細(xì)胞裂解物的蛋白含量歸一化，根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶水平計(jì)算GL3熒光素酶沉默效率。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>參考文獻(xiàn)Cho，J.，andR.R.Rando.2000.SpecificbindingofHoechst33258tosite1thymidylatesynthasemRNA.7Vwc/e/c28:2158-63.Dassonneville,L,F.Hamy，P.Colson,C.Houssier,andC.Bailly.1997.BindingofHoechst33258totheTARRNAofHIV-1.Recognitionofapyrimidinebulge-dependentstructure.iVwc/e/d,A25:4487-92.Elbashir,S.M.，J.Harborth,W.Lendeckel，A.Yalcin，K.Weber，andT.Tuschl.2001.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.TV^we.411:494-8.Elbashir,S.M.，W.Lendeckel,andT.Tuschl.2001.RNAinterferenceismediatedby21-and22-nucleotideRNAs.Ge腦Dev.15:188-200.Fire,A.1999.RNA-triggeredgenesilencing.15:358-63.Hammond,S.M.,E.Bernstein,D.Beach，andG.J.Hannon.2000.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.胸騰.404:293-6.Jepsen，J.S.,andJ.Wengel.2004.LNA-antisenserivalssiRNAforgenesilencing.CWrZ)rwgZfecovDew/.7:188-94.Kim，D.H.,M.A.Behlke,S.D.Rose,M.S.Chang,S.Choi,andJ丄Rossi.2005.SyntheticdsRNADicersubstratesenhanceRNAipotencyandefficacy.iVaf歷o/ec/mo/.23:222-6.Kurreck，J.2003.Antisensetechnologies.Improvementthroughnovelchemicalmodifications.五wrJ5/oc/zem.270:1628-44.Miller,■RS.1991.Oligonucleosidemethylphosphonatesasantisensereagents.(^19.9:358-62.Parrish,S.，J.Fleenor,S.Xu，C.Mello,andA.Fire.2000.FunctionalanatomyofadsRNAtrigger:differentialrequirementforthetwotriggerstrandsinRNAinterference.Afo/CW/.6:1077-87.Siolas,D.,C.Lerner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