專利名稱：：用于治療黃病毒感染的方法、分子及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒學(xué)、生物技術(shù)和制藥工業(yè)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)或阻斷登革病毒(DV)感染的方法，其基于阻斷該病毒與其細(xì)胞受體的相互作用。登革病毒(DV)使用oc2-巨球蛋白受體(A2MR)來(lái)用于其進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，并且它可以使用a2-巨球蛋白(A2M)作為用于促進(jìn)其與這種受體的相互作用的栽體蛋白。本發(fā)明確定了與人A2M的直接相互作用的存在，并且定義了參與這種相互作用的該病毒的E蛋白的區(qū)域。此外，本發(fā)明定義了衍生自E蛋白的肽，其干擾該病毒與其細(xì)胞受體A2MR的相互作用，并且抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞被該病毒的感染。因此，這些分子構(gòu)成了用于預(yù)防和治療由DV感染引起的疾病的潛在藥理學(xué)試劑。現(xiàn)有技術(shù)El登革病毒(DV)屬于黃病毒科(/7a72V/W&e)，黃病毒屬(Flavivirus,FV)。存在遺傳上相關(guān)但^皮識(shí)別為不同血清型的4類DV(DV1、DV2、DV3和DV4)(〃e/c/a7f.丄和尸i^/2al/.AJi^CT力ede/7gi/e#/cro6/o/.Aer.義'J7^"—J夕f)。4種血、清型之間的全基因組序列同源性的程度為約70%。由一種病毒血清型毒林引起的首次感染賦予針對(duì)由屬于同種血清型的毒株引起的后繼感染的長(zhǎng)效免疫，但不針對(duì)屬于其余血清型的毒林。由異種血清型引起的繼發(fā)感染是常見(jiàn)的，并且與該疾病的嚴(yán)重得多的癥狀的出現(xiàn)相關(guān)7c力/7c^re/2t力e/^///p/n'/iesa/7dr力a//3/7^.rra/3S尸力7^'c/a/2;y/7又'74^Ki"J)。因此，當(dāng)開(kāi)發(fā)針對(duì)DV的疫苗時(shí)，必須保證它提供針對(duì)所有4種血清型的保護(hù)。然而，由于甚至在相同血清型的毒林之間所發(fā)現(xiàn)的抗原變異的程度，有時(shí)由一種毒抹感染引起的抗體針對(duì)相同血清型的第二種毒株的感染也可能不具有保護(hù)性，因此使有效、安全且低成本的疫苗的開(kāi)發(fā)變成主要挑戰(zhàn)。因此，具有抗病毒活性的分子的使用代表了對(duì)于疫苗接種的有吸引力的治療備選方案。DV病毒粒子的復(fù)制循環(huán)從其進(jìn)入宿主細(xì)胞開(kāi)始。在哺乳動(dòng)物宿主中，病毒粒子使用受體介導(dǎo)的胞吞作用機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞(化ser.，SwzM/ers.戶Z.和^ci:e/sf.V.廣J夕《夕,尸/a7_z>/rwse/3t7y//2f0ciz/ti/red7W;。在內(nèi)體中產(chǎn)生的pH下降觸發(fā)了病毒粒子上不可逆的構(gòu)象變化，這誘導(dǎo)其與內(nèi)體膜的融合及其解裝配(M/i:力opa^/a/&,fi/力刀A./.和Wc^57Z7a刀/7Cf2〃^5",爿5^ri/cti/ra//ers;ec^/reoff力e如此釋放到細(xì)胞質(zhì)中的病毒基因組被翻譯成單個(gè)多蛋白，其由病毒和細(xì)胞的蛋白酶進(jìn)行伴翻譯和翻譯后加工。新病毒粒子的裝配在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面上發(fā)生，其中結(jié)構(gòu)蛋白和基因組RNA分子進(jìn)入腔內(nèi)并繼續(xù)通過(guò)高爾基復(fù)合體。病毒粒子以在細(xì)胞內(nèi)嚢泡中的成熟病毒顆粒形式離開(kāi)高爾基復(fù)合體，所述細(xì)胞內(nèi)嚢泡的內(nèi)容物通過(guò)胞吐作用而釋放到纟田月包夕卜玉不境中()1/i/ir/o/7Si/力7a/51.,/w/w/./.和Aoi^/z/a/2/2&("2〃^5j#/croW.又."-")。DV進(jìn)入宿主細(xì)胞依賴于其與細(xì)胞表面上的特異性受體分子的相互作用。已鑒定了許多表面分子，關(guān)于它們存在支持它們參與病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞的證據(jù)，它們因此被視為推定的病毒受體。在實(shí)驗(yàn)上，導(dǎo)致病毒感染的DV-細(xì)胞相互作用的初始步驟已分成通過(guò)與表面分子相互作用的病毒吸附的笫一階段，這可以于4'C發(fā)生；以及另一個(gè)階段，在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生受體介導(dǎo)的胞吞作用，并且其需要于37。C溫育細(xì)胞作為先決條件(^邱5X，Zee戶Z,C力e/#K"e刀Z/,hoa,i7/《CCfJ夕夕i^J/7a/y^7soTt力este;7S7/2yo/Fed//Ze/7gwey/rwse/7"http://Wo力o"ce"sr/ro7og//Z57.'""7)。這些階段涉及病毒包膜蛋白的不同區(qū)域和細(xì)胞表面的不同分子(柳，Aoe力r/gde/2gi/e7/ri/sjg/yco/7rofe//2aref力e/so5^e/77c/e/7t6/ocirer51o/在迄今為止已鑒定的對(duì)于這個(gè)過(guò)程而言重要的表面分子之中有蛋白聚糖(C力e/尺，71.，兄A，F(xiàn)ro/mz//.兄，^i:o/./.,Z/z力arc^兄/.和larir51W.fJ夕夕7j"e/7gi/er/rws/'"/ecf^/e/e/7C^0/7e/7e/o;e/rc^e//762./2d//7《tofai^efce7//epara/2w/尸"e.J;《W-》77),其已被提出參與了病毒顆粒在細(xì)胞表面上的集中以便它們與其他特異性的高親和力受體的后續(xù)相互作用(i^/s^st/&及，#e//2z尸,J.,》srre〃丄".和joeAr/g/.77.廣j/e/2gueWru51.'/so/ecw/ar6as2.so尸ce/7e/2tr/a刀d/af力oge/2es/^Z5"—27/i/刀eP7e/7/2a,爿usfr/'a.「acc//2e.2又'《WU"。與CD14相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)也已被描述為巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中的可能受體(C力e/2f.C.,ra/^義7.#A7/^C.C.a"夕y^s"er/a/C"K一cfe/7e/7^e/^/z/ec/a/22、瓜/K/ro/.7義.夕^5^—2^57)。暫時(shí)蜂皮提議為DV受體的其他分子是GRP78/Bip(//'i^/acTa邁ro/7^rec力和5^/"/7r0fe//^0/7Ve/6^/i//za/2_/2>erce/7s，//2fer7/r0/0^7.47.'J7〃一J7J;/e/es-Ze//.,C力ayez-i^//刀as5*.,#ed//L2F.和"e/j/2ge/蔬9r2W.27義'"/7-^5<57)和層粘連蛋白受體(7力ep;7a"7C.#rece;^0i"./P7ro/.27《；72<$"47—7Vo尸.〃.，/o/^和Cardosa#/.f之。。JJ7Vod2'邁e/^/0/za/K0尸5/irerea/s/a/ff//n'/2rece;7f0r/'/zfera2.0/3wa7力dei3gweF/russerot/pes厶2J.P7r。//.么'。DC-SIGN蛋白在DV病毒粒子進(jìn)入未成熟的樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程中起著非常重要的作用。然而，這種蛋白質(zhì)看起來(lái)同樣參與了病毒顆粒在細(xì)胞表面上的集中而不是其胞吞作用(7^wa"ee"27力/及，T.,6^3"<///-戶/;767770^,7>i//ff//7e//er，尸/z2le/.，K，#丄,尸afts/2a;7a/77asaf￡,Saraso/z^af力，汐/nZ.57e/z7/z7a/7A，Sc力/e"';^er&和船ro"'c力A(^。W;ZC-i76^ce//s./.J夕7.'》2J—《ZP;y^p^rro—5^i3c力ez&，^/f/we/er，爿邁araJ,ScApra/^z0，尸/esc力/,,P7re/7z/er7Z.，e5^e/2fia7/orf力e/jr0dwcf/7e2./2尸ecO.0/2o/*Aw/77a/7de/zf/r/f/cce7/s1^7柳W〃"o一ce"-de".Fe"e/7^;e"Vwses.We/.《.7"-72《；Zozac力尸r，5wr/e/g力Z,5Ysro/o///，jVa7arro—5^/7C力ez凡"arr/agwe/，K/re//z/er7Z，Ae/Pespres尸,Jre/7za/2s—Aye/s^ec/osF,/z7o/eci/7eJ—^Ta662'/7g"on—Z/^egr/"廣/C一5767V"9—/sefZ/.afed/脅/C力e瓜，..。DV和其他FV的包膜蛋白(E)在與細(xì)胞受體結(jié)合、膜融合和病毒10粒子裝配中起著基礎(chǔ)作用。因此，它構(gòu)成了關(guān)于宿主范圍和毒力以及關(guān)于保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)的主要決定因素之一(^e/z^尸.Z甜-"《；層/sK,&,C/e腳"".和〃ar"'濯C.fiW"Far/a67eswr/"aceep/帥es/'/7^ec/y"""ri/"wre7WJ-"W)。分子量為53-54kDa的這種蛋白質(zhì)是DV結(jié)構(gòu)多肽中最保守的，其在不同F(xiàn)V中在其氨基酸序列方面具有40%的同一性(yl/wir力o/7a^/a/^.,iTw力/7兄/.和Woss邁a/2"#C廣2。0iVjsfrwc"ra//7er57ec"Vef力e/7s"'rws///ec/c7e.#/c_ro6/o/.義'i7)。X射線晶體學(xué)(#0^/2、F.,&，C/e范e/7"/.和v7arr/s0/7C.f2〃〃J9」//ga/7t/—6//7^///^pociref//t力ede/7gwe7/ri/s和電子4氐溫顯孩i術(shù)研究(A/.，Z力a/^r.,iOM/Z7a/7/2,C.，尸7e^eKK.，Cor7er/.,Ze/zc力e51A.，/0/7esC.71.，yl/i/ir力0/7ad力7ajr5".,C力//7/^/7尸.A.,57rawssA&,5ai:erT.51.和5Y/"ai^s/.〃.廣20^j揭示出，以類似于其他FV的方式，DV的E蛋白在成熟病毒粒子表面上以二聚體形式存在。E蛋白的N-末端胞外域由整個(gè)分子的大約500個(gè)氨基酸殘基中的80%形成。其余殘基構(gòu)成跨膜區(qū)，其使該蛋白質(zhì)錨定在位于病毒周圍的脂質(zhì)包膜上。在E蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在12個(gè)嚴(yán)格保守的Cys殘基，它們參與6個(gè)二硫橋的形成(r.和re/7g/erGf"《7j^7a/7"、f力ecf/s"7/7力/6fes;7rese/7f//7f力e頂e/z76ra/2eprofe//2o/f力e/Ke5^，〃w7ira//"e7"7".,/a/r/邁//e/.,5Yraw5^/.〃#5Yraw^A.C7W,7<57-7M),所述二硫橋在這種分子的抗原表位的形成中起著非常重要的作用(ioe力r^/.71.，Ko/peAA,5^w/res/.'〃"W丄A，形成E蛋白的可溶性胞外域的多肽鏈折疊成3個(gè)結(jié)構(gòu)域折疊片的中央結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域I);延長(zhǎng)的二聚化區(qū)域(結(jié)構(gòu)域II);和第三個(gè)、免疫球蛋白樣區(qū)域(結(jié)構(gòu)域III)(We//7.力，^//z尸.Z和她/2^//2f力et/e/2gwey/rwse/77e/o/7e^7/co/rote//7.尸rocvVaf/JcadSc/"".嵐.6銜-譜7)。DV的E蛋白的結(jié)構(gòu)域III結(jié)構(gòu)域III(DIII)在E蛋白中具有主要的功能重要性。逃避中和抗體的突變體，以及改變病毒表型的突變(例如減毒突變或決定毒力的突變)位于這個(gè)結(jié)構(gòu)域的上表面和側(cè)表面。DIII存在于每個(gè)E蛋白單體的C-末端區(qū)域上，且包含氨基酸294-392。這個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成病毒粒子上的最突出區(qū)域，其中它暴露了其側(cè)面并且位于5X和3X對(duì)稱軸周圍，所述對(duì)稱軸的每一個(gè)具有60個(gè)DIII分子(/y力/i./.,Z力a/^,…Woss/z/a/m,C，尸/e^7e卩5.K,Corner/.,^e/7C力esf.,/o/zesC.7.，M/ir力opsc^/a/&，0/;則/7尸.A,57rawssi1.&，"ai:err.51.尸or尸/ay/「/ri/51Orga/7/za〃0/7，他fwra〃0/2,a/^FiAS/o/.6W/.7服.7〃-加。DIII的結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白的恒定區(qū)。它由具有2個(gè)反平行的P折疊的P桶形成，所述P折疊中的一個(gè)由A、B、(y、D和E鏈組成，和另一個(gè)由C、F和G鏈組成。DIII的三級(jí)結(jié)構(gòu)在很大程度上取決于在所有FV中都是嚴(yán)格保守的2個(gè)Cys殘基之間所形成的單個(gè)二^l橋的存在。這個(gè)橋的還原減少或消除了被對(duì)于Dili特異的中和抗體的結(jié)合。獲自E蛋白和DV病毒粒子的結(jié)構(gòu)分析以及直接實(shí)驗(yàn)的大量數(shù)據(jù)表明，DIII是E蛋白中與細(xì)胞受體相互作用的區(qū)域的一部分(#w^//,^s/e力V7;/aoCZ,r/刀^CGC力s"《W("20〃4JeA^er/a///27(/7ed/刀ser0^Fpe一s/7ec/尸/c6//2(///7gfo/posgiz/fo"of/77a/zwa7/a/7/F2'r0/.7《.'J7《一《《/Cr//7ioe力r/g/7Y20^，f^77co/7rofe//7aref力e/zosfe/77c/e/U67ociersofr/rwsa&oi77"'w7&ce/7義/K/ro/.7乂.776夕—7J/77"7//er尸，cr/t/ca/尸orf力e2'/z/ecf/'7/0^a//seroO^es.'/"s/g力f/"fof力e/7ei/fra/2'zaf范ec力a/7/^yz7/,e/r/ro7.廣《9.'7(《J一夕2)。關(guān)于DIII的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究也已使用了合成肽。例如，包括DV2的DIII的GP鏈的肽386-397凈皮3H5中和性單克隆抗體所識(shí)別，所述3H5中和性單克隆抗體已知干擾該病毒與細(xì)胞的結(jié)合并且抑制紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集(ioe力W《/r,W，/e7/yWC"夕夕《,#0/2oc/0/73/s/2"'60cf7^3/7/7//7gf力ee/7re/0/7e^7/co/7rCe//7Cf力ede/^z;e2y/rws,/a/a/ca246..J77—2《)。寸旦是,E蛋白的這個(gè)區(qū)域中的幾個(gè)突變對(duì)于3H5的結(jié)合不是有害的("'ra則"i;(rada/zo#,￥e/7y，Za/67fJ#wtaf/o/7a7a/7a/j^2'so/"aprc^e//2./37onoc/o/7a/a/7f2'60ciyres/sfa/^Zi"A7/Z^"A^c力/邁eraye義力/6i7refi^/ced/z/owse"ei/rop^Yw/e/zce.r/y</c^7,J夕夕f，224:437-45)，然而，殘基E383、P384和G385的突變?nèi)∠诉@種結(jié)合。還已顯示，相應(yīng)于F-G環(huán)和G鏈的部分的肽380-389可以阻斷DIII與蚊子細(xì)胞的相互作用，但是不阻斷與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相互作用(//,〃".e力,，r麵g釘，faoa，C力，/fT2,油e^e駕/yT/a/Mzs/Za;ce/"./P7roA7《,J7《-《《)。另一方面，相應(yīng)于AP鏈的來(lái)自DV1的肽306-314被4E11中和抗體所識(shí)別(7%w///erAZa/Xre戶f2膨,#a"http://7go/ade/^/e".rws"eWrW/z//^ep"o/ecn./7ca//orf力e/'/7/ect/F/7/o尸a//sero07^esz/"s/g/^//7tof力e/ei^ra7/zaf2.0/2/z7ec/a//s/7/Ce/zK/ro人《2f《,.'/《《5—夕2)。當(dāng)以高濃度(約500MM)進(jìn)行使用時(shí)，這種肽能夠抑制Vero細(xì)胞中的病毒感染。cc2-巨球蛋白(A2M)人A2M屬于a巨球蛋白家族，其成員共享這樣的特征，即能夠結(jié)合廣泛范圍的肽、蛋白質(zhì)和顆粒，從而充當(dāng)脊推動(dòng)物的血漿和組織中的體液防線。在脊推動(dòng)物和無(wú)脊推動(dòng)物的循環(huán)中，以及在鳥(niǎo)類和爬行動(dòng)物的蛋白中存在人A2M同系物(K廣J^p力a人A2M是由各180kDa的4個(gè)亞基形成的糖蛋白，從而形成720kDa的同四聚體。這種蛋白質(zhì)在不同的細(xì)胞類型例如肺成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中合成。每個(gè)亞基存在5個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)1)"誘鉺"區(qū)，其由25個(gè)氨基酸的區(qū)域組成，該區(qū)域位于每個(gè)亞基中部，并且?guī)缀蹩梢员辉醋栽撋锘蛭⑸锏娜魏螜C(jī)制類別的蛋白酶所切割；2)在半胱氨酸和谷氨酰胺的側(cè)鏈之間所形成的硫酯鍵，其可以通過(guò)高溫，通過(guò)小親核體例如伯胺、還原劑或水的存在進(jìn)行切割；3)受體結(jié)合位點(diǎn)，其包含每個(gè)亞基的138個(gè)C-末端氨基酸，并且其僅在切割疏酯鍵后暴露；4)位于"誘斜"區(qū)前20個(gè)氨基酸處的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合位點(diǎn)；和5)2112+-結(jié)合位點(diǎn)。人A2M抑制參與廣泛范圍的生物學(xué)過(guò)程的大量蛋白水解酶，所述生物學(xué)過(guò)程例如為纖維蛋白溶解、凝固、消化、免疫應(yīng)答和侵入性組織生長(zhǎng)。蛋白酶對(duì)"誘斜，，區(qū)的切割誘導(dǎo)A2M中的構(gòu)象變化，這與硫酯鍵的水解緊密偶聯(lián)，由此A2M使蛋白酶陷入其新構(gòu)象內(nèi)。這種過(guò)程的凈結(jié)果是A2M阻止大底物接近蛋白酶的活性位點(diǎn)。這種構(gòu)象變化還暴露出該四聚體的每個(gè)亞基中的受體結(jié)合區(qū)，并因此A2M-蛋白酶復(fù)合物通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而從循環(huán)中被快速清除(^/2/w5X，萬(wàn)a76erjf，VwMardr/，？/zzo5T廣J夕》J，丄/ga/7d6//2cT/'/^，丄2":。除了其作為蛋白水解調(diào)節(jié)劑的作用外，由于其結(jié)合許多不同分子并在胞吞途徑的不同階段時(shí)釋放這種負(fù)載物的能力，A2M還參與許多過(guò)程。已將A2M作為載體蛋白的功能與從胞吞途徑到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用和涉及或不涉及抗原呈遞機(jī)制的降解相關(guān)聯(lián)(戶/zzoSa/yafore「,Cr0/2〃a/3/7ef//zz則/7eres;o/7se頂o^;/afora/;力a-2與A2M的化學(xué)相互作用的性質(zhì)已發(fā)現(xiàn)是所負(fù)載的肽或蛋白質(zhì)的最終細(xì)胞目的地的關(guān)鍵決定因素。可i^的相互作用允許這些負(fù)載物于在胞吞途徑的早期階段中與復(fù)合物解離后呈現(xiàn)出生物學(xué)作用，而不可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽通常到達(dá)溶酶體區(qū)室，在那里它們被降解(肋H力r.""-")。a2-巨球蛋白受體A2M受體(A2MR)也稱為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP1)或CD91,其已與眾多極其重要的生理學(xué)作用相關(guān)聯(lián)，例如脂質(zhì)代謝、止血、溶酶體酶的激活和神經(jīng)傳遞。A2MR是由與跨膜85kDap鏈非共價(jià)鍵合的細(xì)胞外500kDaa鏈形成的異二聚體。a鏈包含具有2、8、10和11個(gè)補(bǔ)體樣的富含Cys的配體結(jié)合位點(diǎn)的4個(gè)聚簇(cluster)。在每個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)聚簇后存在由富含Cys的區(qū)域和YWTD結(jié)構(gòu)域形成的EGF-樣結(jié)構(gòu)域。P鏈的胞質(zhì)尾巴具有2個(gè)NPxY基序，其被參與信號(hào)傳導(dǎo)和胞吞作用的銜接蛋白質(zhì)所識(shí)別(Verz/,i7Wci^a/^//^.(^^^JZAP;a歷""/尸w2"/o/a/sca卩e/7gera/2"/^2///^rece/7to八/C7/"T/7e".7服.77夕-W)。A2MR識(shí)別至少30種屬于不同蛋白質(zhì)家族的不同配體，所述蛋白質(zhì)家族包括脂蛋白、蛋白酶、蛋白酶-抑制劑復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、細(xì)菌毒素、病毒和幾種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。旨在詳述這些分子與AMR的相互作用的特征的研究已揭示出，31個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)的存在提供了受體識(shí)別這樣廣泛多樣的配體的能力，每個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)呈現(xiàn)了獨(dú)特的相互作用表面。因此，與受體的高親和力相互作用涉及與幾種配體結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)結(jié)合。人A2MR還識(shí)別來(lái)自其他物種的配體，其中具有與對(duì)于內(nèi)源性配體所展示的那些類似的親和常數(shù)。發(fā)明詳述病毒與其細(xì)胞受體的相互作用是感染性的首要決定因素。獲得阻斷病毒-受體相互作用的化合物可以導(dǎo)致開(kāi)發(fā)出有效的抗病毒藥物。在DV的情況下，已顯示，在病毒血癥和疾病的嚴(yán)重度之間存在高度相關(guān)性。因此，獲得能夠減少受感染患者中的病毒栽量的有效抗病毒藥物對(duì)于控制疾病的嚴(yán)重形式而言是非常有吸引力的策略。然而，基于阻斷病毒-受體相互作用的DV抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)由于缺乏對(duì)于介導(dǎo)病毒胞吞作用的受體的身份、相互作用的性質(zhì)和用于識(shí)別的決定因素的了解而受到阻礙。本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)DV2毒抹Jamaica的E蛋白的Dili(Seq.ID.1)可以與來(lái)自人血漿的A2M(Seq.ID.2)形成可逆結(jié)合的復(fù)合物，以及借助于抗受體抗體或竟?fàn)幮耘潴w來(lái)阻斷A2MR受體(Seq.ID.3)可以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DV感染。前者暗示，在這種情形中，A2M作為從病毒到A2MR受體的載體蛋白，并從而充當(dāng)了病毒通過(guò)由這種受體介導(dǎo)的胞吞作用而進(jìn)入細(xì)胞的途徑之一。A2M及其受體A2MR遍及不同組織和生物地廣泛分布，在其中已發(fā)現(xiàn)了這些蛋白質(zhì)的同系物。這2種分子(A2M和A2MR)由祖先蛋白質(zhì)家族進(jìn)化而來(lái)。因?yàn)樵诿總€(gè)家族成員之間存在高度的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列同源性，所以這些分子作為DV受體的活性可能存在于廣泛多樣的細(xì)胞類型和生物中。此外，考慮到LDL受體家族的不同成員的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的高度相似性，可以推斷在DV和屬于這個(gè)家族的其他受體之間存在相互作用。例如，鼻病毒的次要家族的成員使用LDL受體家族的不同成員作為細(xì)胞受體；在這種情況下，它們是低密度脂蛋白受體、極低密度脂蛋白受體和LRP1(〃oZ"er尸，Crwe/^erger見(jiàn)fofra"i:/#，lac力sf仏#weff//7ge_r#,fi/ec力7er/廣7夕夕4j〃e/z^erst力e/ovcfe/2S/'f///poprofe//7receptor尸s/z7////zzet/Zafece//e/7fr7s/77//or-grow;7c咖/770"co/dpa'rws.戶rocJcadiW厶'仏'7《W-W)。已知與其受體相互作用的這個(gè)病毒家族的表面蛋白質(zhì)能夠以各種親和力與靈長(zhǎng)類和鼠類細(xì)胞的LDL受體家族的成員結(jié)合，并且已確定此類相互作用介導(dǎo)病毒進(jìn)入這些細(xì)胞類型中。在不同F(xiàn)V的E蛋白之間也存在高度的結(jié)構(gòu)和序列同源性，因此其他FV可以使用A2MR或LDL受體家族的其他受體。黃病毒屬包括超過(guò)70種病毒，其中許多是強(qiáng)力的人病原體。由黃病毒感染引起的疾病的特征在于發(fā)熱癥狀，其可以具有出血表現(xiàn)、腦炎和肝并發(fā)癥。除了DV的4種血清型外，對(duì)于人健康具有重要性的該屬的其他令人注目的成員是黃熱病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒和西尼羅河病毒?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個(gè)目的是基于干擾病毒與A2MR受體的相互作用來(lái)阻斷細(xì)胞的DV感染的方法。備選地，可以通過(guò)干擾與人A2M的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)DV感染。在這個(gè)情況下，干擾與所述受體或與A2M的相互作用意指減少或增加這種相互作用。相互作用的減少將在非常早的階段時(shí)中止病毒感染，因?yàn)椴《緦⒉贿M(jìn)入細(xì)胞；另一方面，增加或增強(qiáng)這種相互作用將阻止在內(nèi)體酸化開(kāi)始時(shí)釋放被胞吞的病毒，從而影響膜融合事件和病毒RNA的釋放。這兩種類型的干擾對(duì)于中和其他病毒的感染性是有效的。可以通過(guò)與在這個(gè)事件中所牽涉的兩個(gè)表面(E蛋白的相互作用表面或A2MR受體的相互作用表面)中的任一個(gè)表面相互作用的分子來(lái)干擾DV與細(xì)胞的結(jié)合。同樣地，可以通過(guò)使用結(jié)合人A2M與病毒蛋白質(zhì)的相互作用表面的分子來(lái)干擾DV與細(xì)胞的結(jié)合。特別地，本發(fā)明顯示了，稱為受體相關(guān)蛋白(Receptor-AssociatedProtein)(其在下文中將稱作RAP)的蛋白質(zhì)(其構(gòu)成了A2MR的天然配體之一)以及針對(duì)該受體的抗體能夠抑制Vero細(xì)胞的DV感染。因此，用于干擾DV與A2MR受體的相互作用的試劑可以由從天然來(lái)源純化的或借助于重組DNA技術(shù)獲得的受體配體組成；或者可以由該受體的經(jīng)純化的可溶性變體組成，所述變體包含其細(xì)胞外部分(位于在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列中的殘基20-4419之間的區(qū)域)或仍能夠與DV結(jié)合的衍生自這個(gè)部分的片段。優(yōu)選地，此類片段將包含相應(yīng)于這種受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的區(qū)段(位于在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的殘基25-66、或70-110、或852-892、或893-933、或934-973、或974-1013、或1014-1053、或1060-1099、或1102-1142、或1143-1182、或2522-2563、或2564-2602、或2603-2641、或2642-2690、或2694-2732、或2733-2771、或2772-2814、或2816-2855、或2856-2899、或2902-2940、或3332-3371、或3372-3410、或3411-3450、或3451-3491、或3492-3533、或3534-3572、或3573-3611、或3612-3649、或3652-3692、或3693-3733、或3739-3778之間的區(qū)域)。干擾試劑也可以由為了這個(gè)目的而開(kāi)發(fā)的合成配體組成。后者的例子將是基于由本發(fā)明所提供的信息并使用本領(lǐng)域已知的方法而開(kāi)發(fā)的合成肽?；谛畔W(xué)的方法已成為用于藥物設(shè)計(jì)的有力工具。這些方法具有能夠評(píng)估大量化合物的優(yōu)點(diǎn)，因此極大節(jié)省了時(shí)間和實(shí)驗(yàn)工作。這比女和配體的三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。幫助定義任何反應(yīng)性分子中的相互作用表面的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在這個(gè)情形中也是非常寶貴的幫助?？紤]到基于分子對(duì)接的用于藥物開(kāi)發(fā)的計(jì)算技術(shù)方面的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明中所描迷的關(guān)于A2M及其受體A2MR在DV進(jìn)入細(xì)胞中的作用的發(fā)現(xiàn)提供了關(guān)于實(shí)際篩選抑制這種相互作用的化合物(其作為潛在的抗病毒藥物)的實(shí)驗(yàn)的靼標(biāo)，或?qū)е缕溟_(kāi)發(fā)。E蛋白的胞外域和DV病毒粒子的三維結(jié)構(gòu)是可獲得的。此外，介導(dǎo)A2M與A2MR結(jié)合的結(jié)構(gòu)域以及LDL受體家族成員的各種配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)也是可獲得的。另一方面，本發(fā)明還定義了參與DV與其細(xì)胞受體的相互作用的氨基酸，并且提供了關(guān)于這種相互作用的結(jié)構(gòu)決定子的信息。因此，用于獲得可以干擾DV與A2MR受體相互作用的合成肽的序列和/或小分子的結(jié)構(gòu)的一種方法可以是使用理論方法，其涉及使用一種或幾種計(jì)算機(jī)建模方法，和DIII以及A2MR受體的任何配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型。使用用于計(jì)算機(jī)建模的這些方法中的任何一種，并且基于關(guān)于DIII結(jié)構(gòu)的空間坐標(biāo)，可以建立形成反平行P發(fā)夾的多肽鏈的主鏈的模型，所述反平行P發(fā)夾包括有在2條鏈之間的連接鏈中的P轉(zhuǎn)角。此外，可以如此建立所述多肽的側(cè)鏈的模型，即使得這些鏈的化學(xué)身份及其構(gòu)象導(dǎo)致能量上有利的原子接觸。還可以用計(jì)算機(jī)來(lái)探究序列空間，和肽的構(gòu)象空間，側(cè)^:的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，以及使用模型的能量評(píng)估作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇最有利的側(cè)鏈，這預(yù)示著對(duì)于肽-蛋白質(zhì)相互作用具有更高的親和力。DIII與A2MR受體的一種和/或幾種配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用模型的坐標(biāo)可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法(使用X射線衍射和/或NMR技術(shù))，或通過(guò)使用計(jì)算機(jī)建模來(lái)獲得。還可以使用分子對(duì)接的計(jì)算方法，以重現(xiàn)相應(yīng)于FGP發(fā)夾(其來(lái)自不同黃病毒的E蛋白的DIII)的肽和A2MR受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的原子細(xì)節(jié)。同樣地，可以從分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇出重現(xiàn)了這種相互作用的特征的那些化合物，其因此構(gòu)成了用于阻斷黃病毒感染的有希望的抑制劑。19其他干擾試劑可以通過(guò)使用抗體或抗體片段來(lái)獲得，所述抗體或抗體片段是通過(guò)本領(lǐng)域可用的任何方法而選擇出的，例如通過(guò)選擇噬菌體展示抗體文庫(kù)。在后面一種情況下，所述可以有益于獲得針對(duì)參與DV-A2MR或DV-A2M相互作用的區(qū)域的特異性應(yīng)答。在針對(duì)A2MR或A2M的相互作用的區(qū)域的應(yīng)答的情況下，所述選擇必須允許區(qū)分這種相互作用的干擾和這些分子的生理學(xué)功能性的干擾。本發(fā)明的目的還是基于使用干擾A2MR受體的表達(dá)的試劑來(lái)阻斷細(xì)胞的DV感染的方法。通過(guò)使用現(xiàn)有技術(shù)中可獲得的方法來(lái)開(kāi)發(fā)抗病毒藥物，可以推導(dǎo)出，一個(gè)例子將是使用暫時(shí)減少或消除A2MR受體表達(dá)的短干擾RNA(siRM)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于預(yù)防或治療由DV感染引起的疾病的方法，其包括施用有效量的具有抗病毒活性的分子，所述分子干擾DV與細(xì)胞受體的相互作用，其中所述細(xì)胞受體是A2MR細(xì)胞受體。根據(jù)關(guān)于藥物制劑的目前規(guī)章在可接受的條件下配制的、具有抗病毒活性的分子可以在感染前或在疾病的癥狀出現(xiàn)后(具有關(guān)于DV感染的確證性實(shí)驗(yàn)室診斷)以有效劑量進(jìn)行施用?？梢栽诒┞队贒V感染的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域之前，作為預(yù)防性藥物來(lái)使用具有針對(duì)DV的抗病毒活性的分子。DV感染的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域是這樣的地理區(qū)域，即其已知具有用于傳播DV的載體即^尹蚊(Jedes),并且其中正在發(fā)生任何DV血清型的可檢測(cè)的流4亍。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用于預(yù)防和/或治療由DV引起的疾病的方法；其包括使用干擾病毒與人A2M的相互作用的試劑。本發(fā)明還涉及用于預(yù)測(cè)特定的細(xì)胞類型對(duì)于DV感染的易感性的方法。這種預(yù)測(cè)可以通過(guò)測(cè)試編碼A2MR受體的基因的存在來(lái)進(jìn)行，其中術(shù)語(yǔ)"基詞"包括參與該多肽鏈產(chǎn)生的DNA區(qū)段，以及在前和在后的區(qū)域以及在編碼序列(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。該方法包括使用長(zhǎng)度為20-50個(gè)堿基對(duì)的多核苷酸，所述多核苷酸與編碼A2MR受體的基因序列上所選擇的靶區(qū)域雜交并在下文中將稱為探針，所述雜交在允許檢測(cè)與該探針具有80-95%序列同一性的20雜交靶的條件下進(jìn)行。用于達(dá)到更高嚴(yán)緊性(即，僅檢測(cè)出與探針具有95%或更高序列同一性的區(qū)域)的操作程序是本領(lǐng)域眾所周知的。用于雜交的探針可能能夠確定該基因是否編碼仍保留了DV受體的所有功能性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括已開(kāi)發(fā)用于干擾DV與其受體的相互作用的分子的用途，所述用途為用于評(píng)估特定細(xì)胞類型對(duì)于DV感染的易感性。該方法涉及檢測(cè)細(xì)胞表面上的A2MR蛋白。例如，該方法可能包括使用識(shí)別A2MR受體的抗體、或該受體的配體、或與該受體相互作用的合成肽，將它們與待測(cè)試的細(xì)胞一起溫育，這之后借助于現(xiàn)有技術(shù)中的任何目前技術(shù)(例如焚光團(tuán)輔助流式細(xì)胞術(shù))來(lái)檢測(cè)其與細(xì)胞表面的結(jié)合。在可以用于這個(gè)實(shí)施方案的配體中包括A2M和RAP。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括用于評(píng)估特定細(xì)胞類型對(duì)于DV感染的易感性的方法，其基于A2MR蛋白的檢測(cè)。該方法涉及獲得包含全部細(xì)胞蛋白質(zhì)或亞細(xì)胞部分的制劑。將事先通過(guò)在丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳而分開(kāi)或未分開(kāi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并借助于特異性識(shí)別這種分子的抗體來(lái)檢測(cè)A2MR受體的存在，隨后檢測(cè)所結(jié)合的抗體。備選地，將包含經(jīng)轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜在包含該受體的配體之一(例如A2M或RAP)的溶液中進(jìn)行溫育，并且隨后檢測(cè)所結(jié)合的配體。本發(fā)明還涉及用于篩選和鑒定保護(hù)不受DV感染的化合物的方法，其包括測(cè)定所評(píng)估的化合物阻斷DV與A2MR受體的相互作用的能力。基于這種原理的方法可以使用這樣的制劑，所述制劑包含DV病毒粒子，或備選地包含DV的E蛋白的胞外域，或包含含有所述蛋白質(zhì)的DIII的重組蛋白質(zhì)。該方法涉及將A2MR受體連同包含DV和待評(píng)估其阻斷能力的化合物的制劑一起進(jìn)行溫育，隨后評(píng)估所結(jié)合的病毒的量，并將其與在受試化合物不存在下所結(jié)合的病毒的量進(jìn)行比較。所述檢測(cè)優(yōu)選地通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行使用結(jié)合或固定在固相上的受體，添加在溶液中的病毒粒子和所評(píng)估的化合物的混合物。A2MR制劑可以由從天然來(lái)源純化出的樣品組成，其中A2MR受體優(yōu)選地占樣品的蛋白質(zhì)總含量的至少75%。天然來(lái)源的一些例子是細(xì)胞/組織勻漿物、或來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物上清液、或人血漿。AWR制劑還可以由包含受體的a鏈或其片段的重組蛋白質(zhì)組成，其保留了作為DV受體的功能性。本發(fā)明還包括用于篩選和鑒定可以保護(hù)不受DV感染的化合物的方法，其基于測(cè)定所評(píng)估的化合物阻斷DV與人A2M的相互作用的能力。基于這種原理的方法可以備選地使用DV的E蛋白的胞外域、或包含所述分子的DIII的重組蛋白質(zhì)。為了評(píng)估被篩選的化合物的活性，將所評(píng)估的物質(zhì)與A2M進(jìn)行溫育，并且評(píng)估其干擾與DV、或E蛋白的胞外域、或E蛋白的DIII的相互作用的能力。附圖描述圖1.經(jīng)純化的DIIIE2J制劑的表征。(A)將45)igDIIIE2J力口載到C4反相柱上。色譜法運(yùn)行于37'C下進(jìn)行，其中使用配備有2個(gè)泵和控制器的高效液相色諳系統(tǒng)。蛋白質(zhì)的洗脫通過(guò)下列方式來(lái)達(dá)到以0.8mL/分鐘的流速施加在0.1%(v/v)三氟乙酸中的10-60%(v/v)乙腈線性梯度，并在226認(rèn)處進(jìn)行檢測(cè)。(B)通過(guò)15。/。SDS-PAGE的分析。泳道l:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。泳道2:12]ug經(jīng)純化的DIIIE2J制劑，其在非還原性樣品緩沖液中作1:1稀釋。蛋白質(zhì)條帶根據(jù)由〃ewires力ci7e刀,/,和"ei772'cir，兄,廣7夕《iV.57邁//y/7e^邁et力c^//or述的方法進(jìn)行染色。圖2.通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)測(cè)定DIIIE2J的分子量和二硫橋的形成。(A)從經(jīng)克隆的DNA區(qū)段預(yù)測(cè)的氨基酸序列。(B)從該蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)期的平均質(zhì)量，其中假定N-末端甲硫氨酸未被去除(Met1)或被去除(Ala2)。RCM:從Ala2開(kāi)始的并且在每個(gè)半胱氨酸殘基中摻入了碘乙酰胺的蛋白質(zhì)的預(yù)期的平均質(zhì)量。(C)DIIIE2J的解巻積的(deconvolved)質(zhì)i普。天然的從rp-HPLC收集的未修飾的蛋白質(zhì)。+IAA:于25。C與硪乙酰胺溫育30分鐘的蛋白質(zhì)。+DTT+IAA:于37。C與10mMDTT溫育2小時(shí)，隨后于25。C與碘乙酰胺溫育30分鐘的蛋白質(zhì)。圖3.使用鼠類和人抗體的用于分析DIIIE2J的抗原性的斑點(diǎn)印跡法。所述行包括用于使硝酸纖維素膜敏化的不同制劑，而所述列代表了不同抗體制劑的排列。C+:通過(guò)蔗糖-丙酮法(67ari:e".和Casa/s1/.f7^i"《j.rec力/z/《i/es/or力e/Z7agg7yf/刀afiona/zd/.7>o/7.7:JW-i7J)從經(jīng)顱內(nèi)接種的0F1乳鼠的腦勻漿物中獲得的血清型2病毒抗原的制備物。C—:通過(guò)蔗糖-丙酮法加工的、來(lái)自未接種的0F1乳鼠的腦勻漿物。圖4.抗-DV2抗體對(duì)于與色譜凝膠共價(jià)固定的DIIIE2J的識(shí)別。制劑于25。C溫育30分鐘。未結(jié)合的部分通過(guò)低速離心來(lái)去除，并且凝膠用PBSpH7.4，0.1%Tween-20充分洗滌。圖5.證明A2M和DIIIE2J的直接結(jié)合，其中這兩種蛋白質(zhì)處于溶液中。(A)在直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)中使用的經(jīng)純化的人A2M的制劑的品質(zhì)分析。在變性、非還原條件下的SDS-PAGE(10%)。泳道l:用考馬斯藍(lán)染色。泳道2:使用多克隆抗-人A2M制劑(Sigma，USA)的Western印跡法免疫鑒定。(B-F):用于分離不同種類的凝膠過(guò)濾運(yùn)行的色譜圖譜。自始至終使用在NaHPO,50mMpH7.0，300mMNaCl緩沖液中平衡的Superdex200HR10/30柱。運(yùn)行以0.4mL/分鐘的流速進(jìn)4亍，并在280nm處進(jìn)行監(jiān)控。將樣品以200juL的體積進(jìn)行加載。(A)100jigDIIIE2J。(B)70ng未激活的A2M。(C)于25。C與70pg未激活的A2M溫育1小時(shí)的100ngDIIIE2J。(D)70A2M_MeNH2。(E)于25。C與70|igA2M—Me冊(cè)2溫育1小時(shí)的100|ngDIIIE2J。在每個(gè)色鐠圖中，箭頭標(biāo)示出了被收集用于隨后的SDS-PAGE分析的級(jí)分。星號(hào)標(biāo)示出了相應(yīng)于洗脫1個(gè)總柱體積的時(shí)間。(G):在從不同色鐠運(yùn)行中收集的級(jí)分之中存在的蛋白質(zhì)種類的12.5%SDS-PAGE分析。從每次運(yùn)行中收集的樣品用丙酮進(jìn)行沉淀。將所述蛋白質(zhì)沉淀物重懸浮于15mL樣品緩沖液中并進(jìn)行電泳。相應(yīng)的色鐠圖的字母以及所加載的樣品的描述在每個(gè)泳道的頂端處標(biāo)示出。箭頭標(biāo)明了在凝膠中DIIIE2J條帶的位置。圖6.通過(guò)Biacore測(cè)量的DIIIE2J和A2M的直接結(jié)合。在注射下列物質(zhì)之時(shí)和之后獲得的響應(yīng)曲線(B)針對(duì)DV血清型2的中和性單克隆抗體(3H5)和針對(duì)所有FV的中和性單克隆抗體(4G2);(C)通過(guò)用DV1和DV2進(jìn)行免疫接種而獲得的多克隆小鼠抗體制劑，以及經(jīng)過(guò)匯集未用病毒免疫接種的小鼠血清而獲得的樣品(免疫前血清)；和(D)A2M稀釋物，以0.3pMol/L至3jiMol/L的濃度。所述運(yùn)行在PBSpH7.4上于25。C進(jìn)行。不同稀釋度的A2M以5uL/分鐘的流速加載20分鐘。響應(yīng)表示為共振單位(RU)，其對(duì)于不含固定的蛋白質(zhì)的通道的非特異性結(jié)合(小于5%)進(jìn)行了校正。圖7.A2M和RAPR13抑制DIIIE2J與Vero細(xì)胞的結(jié)合。將預(yù)固定的細(xì)胞與熒光素化的蛋白質(zhì)一起進(jìn)行溫育，并且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量由于熒光素化的配體與細(xì)胞的結(jié)合而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)代表了從最少20000個(gè)細(xì)胞收集的數(shù)據(jù)。(A)A2M和RAPR13與細(xì)胞的結(jié)合。所描繪的值相應(yīng)于在該測(cè)定法中每個(gè)點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度的值減去用未處理的細(xì)胞而獲得的值。(B)和(C)在非熒光素化的配體存在或不存在下，使細(xì)胞與熒光素化的DIIIE2J進(jìn)行溫育，其中在每種情況下使用所指明的摩爾比。從用熒光素化的DIIIEU+所述蛋白質(zhì)的混合物進(jìn)行溫育的細(xì)胞和用熒光素化的DIIIEU進(jìn)行溫育的細(xì)胞之間的平均熒光強(qiáng)度之比計(jì)算出結(jié)合％。圖8.重組RAP對(duì)于Vero細(xì)胞的DV2毒林S168(H感染的影響。將處于90%匯合的Vero單層與不同稀釋度的RAPRH或BSA于"。C預(yù)溫育1小時(shí)，隨后添加感染復(fù)數(shù)為1的病毒制備物，并于37。C再次溫育1小時(shí)。在去除未結(jié)合的病毒后，添加補(bǔ)充有非必需氨基酸、1%FCS和1%CMC的MEM培養(yǎng)基，并且使細(xì)胞于37。C溫育5天。通過(guò)用萘酚24藍(lán)黑染色單層來(lái)顯現(xiàn)裂解噬斑。所述測(cè)定法在24孔平板中進(jìn)行，其中對(duì)于該測(cè)定法的每個(gè)點(diǎn)使用一式兩份。圖9.A2MR受體(SEQID.3，在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的LRP1-人)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多重序列比對(duì)。該比對(duì)使用ClustalX應(yīng)用軟o尸prc^ressiye邁i/7f/;7/ese《ue/7ces7/《/7邁e/^f/rowg力segwe/cec力o/ce.^c/"We義W,4d7J-"《"來(lái)進(jìn)行。箭頭標(biāo)明了屬于配體結(jié)合斑片(ligandbindingpatches)的殘基。該圖的較下部分顯示了"保守程度/殘基"的示意圖。圖10.DV的E蛋白的DIII的三維結(jié)構(gòu)模型。(A)DV1;(B)DV2;(C)DV3;和(D)DV4。在DIII表面上的帶正電的斑片(patch)是帶陰影的，并且以2種灰度色調(diào)顯現(xiàn)暗灰色，位于相應(yīng)于由A、B、C'、D和E鏈所定義的P折疊的表面上的斑片；和亮灰色，位于相應(yīng)于或鄰近于FGP發(fā)夾的表面上的斑片(參見(jiàn)圖10A)。圖11.基于FGP發(fā)夾，用于阻斷DV感染的肽的設(shè)計(jì)。(A)DV2的DIII的三維結(jié)構(gòu)的示意圖。該示意圖強(qiáng)調(diào)了二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。(B)4種DV血清型的E蛋白的DIII的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的結(jié)構(gòu)疊合。該模型以關(guān)于不同病毒血清型的變化的灰度色調(diào)來(lái)呈現(xiàn)。(C)和(D)分別為肽HDIII2CL和HDIII3CL的三維結(jié)構(gòu)才莫型。圖12.(A)被設(shè)計(jì)為模擬DIII表面上的不同區(qū)域的肽的序列。殘基編號(hào)相應(yīng)于以登錄號(hào)P07564可從Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)(AW/,//隨.e6/.ac.〃ir/脂'卿roQ獲得的DV血清型2毒抹Jamaica1409的E蛋白的序列。帶下劃線的殘基不存在于E蛋白中，而是在設(shè)計(jì)過(guò)程中引入的。半胱氨酸殘基用于通過(guò)二疏橋來(lái)限制肽的結(jié)構(gòu)可動(dòng)性。(B)在Western印跡測(cè)定法中中和抗體3H5對(duì)于肽HDIII2Cs的識(shí)別。將50ugBSA-肽綴合物和20ng重組蛋白質(zhì)PD5在12.5%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳(在變性條件下)，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。在封閉后，將膜與mAb3H5的稀釋物(30ng/mL)于"。C溫育2小時(shí)。用抗小鼠IgG-過(guò)氧化物酶綴合物來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體，并且使用化學(xué)發(fā)光來(lái)使印跡顯現(xiàn)。(C)用10jig所述蛋白質(zhì)和所述肽的每種變體平行地使2片硝酸纖維素膜敏化。一片膜與濃度為30jig/mL的mAb3H5進(jìn)行溫育，和第二片膜與來(lái)自用HDIII2Cs-KLH綴合物進(jìn)行免疫的小鼠的血清混合物進(jìn)行溫育。結(jié)合的抗體的檢測(cè)在與在Western印跡測(cè)定法中相同的條件下進(jìn)行。RCM:還原的且脲基甲基化的蛋白質(zhì)/肽。圖13.抗-HDIIIE2Cs血清對(duì)于該病毒的識(shí)別。(A)將用DV2感染的或未感染的Vero細(xì)胞的勻漿物在10%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。在封閉后，使膜與下述抗體制劑進(jìn)行溫育(A.A)30)ag/mL的mAb3H5，(A.B)1/100稀釋的、來(lái)自用HDIIIE2Cs-KLH綴合物進(jìn)行免疫的小鼠的免疫前血清，和(A.C)1/100稀釋的、來(lái)自用5劑HDIIIE2Cs-KLH綴合物進(jìn)行免疫的小鼠的血清。(B)使用來(lái)自用不同DIII肽進(jìn)行免疫的小鼠的血清所進(jìn)行的"S-DV2的免疫沉淀。使用(在第5劑之后)來(lái)自用肽-KLH綴合物進(jìn)行免疫的小鼠的血清混合物的1/100稀釋物。泳道1.抗pepDIII-1血清；泳道2.抗HDIIIE2Cs血清；泳道3.抗pepDIII-2血清；泳道4.免疫沉淀緩沖液，不含樣品；和泳道5.與DV2反應(yīng)的人血清混合物。圖14.從用肽-KLH綴合物進(jìn)行免疫的小鼠獲得的血清對(duì)于PD5蛋白的識(shí)別。多孔平板用0.5jug/孔的來(lái)自不同變體的總蛋白質(zhì)進(jìn)行包被未修飾的(unmod.);還原的且脲基曱J^f匕的(RCM);和脲基曱基化的且沒(méi)有事先還原其二硫橋(CM)。將1:100稀釋的、來(lái)自每個(gè)組的血清混合物在PBS-TpH7.4中于37。C溫育2小時(shí)。在這兩種測(cè)定法中，使用抗小鼠IgG-HRP綴合物(1:1000稀釋的)來(lái)進(jìn)行顯色，其中使用H202/OPD作為過(guò)氧化物酶的底物。在20分鐘后通過(guò)添加2.5Mol/LH2SO,來(lái)終止酶促反應(yīng)，并且在492run處測(cè)量吸光度。關(guān)于所述肽的序列以及它們所包含的DV的DIII區(qū)域的數(shù)據(jù)可以在圖9和11中找到。圖15.DV的E蛋白的DIII區(qū)域的呈現(xiàn)，所述區(qū)域包括在所設(shè)計(jì)的肽中。所呈現(xiàn)的序列是相應(yīng)于DV1的Dili(DIII-DV1)和DV2的Dili(DIII-DV2)的氨基酸299-318和359-397(DV2的序列編號(hào))的那些序列。Jy^/7e/^是在文獻(xiàn)中被報(bào)道為由mAb3H5所識(shí)別的表位的一部分的肽(7>/rafra"/7a;70/^r，C力ai7^rsi35,尸wtoairW,a/7〃6od/.Ce/e.〃《7"-J。)。在原始序列中不存在但在設(shè)計(jì)過(guò)程中引入的另外氨基酸以灰色字體表示。2個(gè)半胱氨酸殘基用于引入可以限制該肽的構(gòu)象自由度的二硫橋。引入N-末端賴氨酸以用于允許該肽與載體蛋白的共價(jià)綴合，并且包括p-丙氨酸殘基作為間隔物。在帶陰影的框中所包括的是在文獻(xiàn)中在先前研究中使用的線性肽的序列，DV2-1、DV1-1、DV2-2、DV2-3(腸g//，化/e力#7，f麵g#/，/ao6X，jf2./3g6T,匚/a/7gVf力/e,ter"a/reg2'0/do/Ha/;/K/ro人7》..J7《一《《)和P'1(r/^/Z/er/7,"e/za/7《e/G#，#e《ref尸，/0ws/2J,Zew6e/K，￥az/e/C,丄a/a/e戶「2〃^j^i3/7/7//7g0/ad/e/2gwe7/'rws/7ewtra_//z//2ge/7/fc77ecr/^2.ca//orf力ey//ecf/y/f/0/a/7seroO7es1..//2s/g/^//2^of力e/2ei^ra//zaf7o/2/z7ec力a/7/^/Ce/Wro/.《2《>>.'7《《J一")。在DIII結(jié)構(gòu)上由所述肽所跨越的區(qū)域的三維呈現(xiàn)(以黑色突出顯示)在該圖的底部。圖16.肽HDIII2CL和HDIII3CL與來(lái)自人外周血的白細(xì)胞表面的結(jié)合。將通過(guò)紅細(xì)胞裂解而分離的細(xì)胞用PBSpH7.4、1。/。牛血清白蛋白(BSA)、0.01。/。NaN3、1mMCaCl2、1mMMgCh進(jìn)行洗滌，并用在PBSpH7.4中的1%低聚甲醛進(jìn)行固定。在洗滌后，使細(xì)胞與肽稀釋物于4。C在PBSpH7.4，1%BSA中溫育30分鐘。采用流式細(xì)胞術(shù)并使用鏈霉抗生物素蛋白-FITC綴合物來(lái)檢測(cè)肽的結(jié)合。細(xì)胞對(duì)照固定的未用肽或綴合物處理的細(xì)胞。圖17.抑制DV1和DV2對(duì)于Vero細(xì)胞的感染。(A)具有處于大約90%匯合的單層的6孔平板與在MEM培養(yǎng)基中的肽稀釋物于3rC溫育30分鐘。隨后添加DV1毒林WestPac74或DV2毒林S16803的稀釋物以獲得100個(gè)裂解噬斑/孔的平均值，并且將平板與病毒/肽混合物于37。C溫育30分鐘。在溫育后，將細(xì)胞洗滌2次，添加補(bǔ)充有非必需氨基酸、1%胎牛血清、1%CMC的MEM培養(yǎng)基，并最后于37。C在C02氣氛下溫育5天。(B)所述肽在100pMol/L時(shí)的抑制效應(yīng)。NRpep:無(wú)關(guān)肽。關(guān)于肽J〃J/7e;^、pepDIII-l、HIII2CL和HIII3CL的序列以友它們?cè)贒V的DIII上所跨越的區(qū)域的數(shù)據(jù)可以從圖11中獲得。抑制百分比的計(jì)算在"材料和方法"中描述。(C)通過(guò)使用不同濃度的所述肽來(lái)抑制DV2感染。通過(guò)用萘酚藍(lán)黑染色來(lái)顯現(xiàn)病毒噬斑。細(xì)胞對(duì)照未處理的細(xì)胞。病毒對(duì)照與該病毒溫育的細(xì)胞，但沒(méi)有肽。對(duì)于這兩種肽，在22-45iLiMol/L的濃度時(shí)獲得50y。的抑制。圖18.相應(yīng)于涉及人和動(dòng)物健康的FV的FGP發(fā)夾的殘基的多重序列比對(duì)。(YFV)黃熱病毒、(WNV)西尼羅河病毒、(JAE)日本腦炎病毒、(TBE)蜱傳腦炎病毒、(KUNJ)庫(kù)京病毒(Kunjinvirus)、(POW)玻瓦散病毒、(LAN)蘭加特病毒、(MVE)墨累山谷腦炎病毒和(SLE)圣.路易腦炎病毒。圖19.與所述肽的同時(shí)溫育對(duì)于A2M和RAPR13與Vero細(xì)胞表面的結(jié)合的影響。在不同濃度的HIII2CL和J^5pe/^存在下，將熒光素化的A2M和RAP13蛋白與預(yù)固定的Vero細(xì)胞于4。C溫育30分鐘，以便達(dá)到所示的肽/蛋白質(zhì)摩爾比。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的配體。圖20.與A2M的預(yù)溫育對(duì)于Vero細(xì)胞的DV感染的影響。將病毒制備物與蛋白質(zhì)在25。C預(yù)溫育1小時(shí)(A和C)或預(yù)溫育所示的時(shí)間(B),所述蛋白質(zhì)即激活的A2M(A2Mact)、未激活的A2M(A2Mnoact)和無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(NR)。將所述蛋白質(zhì)與病毒的混合物加入至處于90%匯合的Vero細(xì)胞的單層中，并于37。C溫育1小時(shí)。對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行洗滌以去除未結(jié)合的病毒。接下來(lái)，添加補(bǔ)充有非必需氨基酸、1%FBS、1%CMC的MEM培養(yǎng)基，并且使細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中于37。C溫育5天。為了顯現(xiàn)病毒噬斑，使用萘酚藍(lán)黑對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行染色。所述28實(shí)驗(yàn)在24孔平板中進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)一式兩份地進(jìn)行。圖21.在使用固定的A2M的親和色i昝法中純化AWR受體的色譜圖譜(A)，和從所述色譜中洗脫出的級(jí)分的SDS-PAGE分析(B)。使用5-15%丙烯酰胺梯度凝膠。與不同色謙級(jí)分的預(yù)溫育對(duì)于Vero細(xì)胞的DV2感染的影響(C)。病毒噬斑數(shù)目減少中和測(cè)定法如圖20中所述進(jìn)行。(D)在通過(guò)顱內(nèi)接種神經(jīng)適應(yīng)性DV2而誘導(dǎo)的Balb/C小鼠腦炎模型中的保護(hù)測(cè)定法。圖22.在通過(guò)顱內(nèi)接種神經(jīng)適應(yīng)性DV2而誘導(dǎo)的Balb/C小鼠腦炎模型中的保護(hù)測(cè)定法。PepNRGAGs結(jié)合性由與糖胺聚糖結(jié)合的片段和與DV的E蛋白無(wú)關(guān)的序列形成的肽。實(shí)施例材料和方法變性蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)根據(jù)由Laemmli描述的標(biāo)準(zhǔn)條件(丄ae/M/i,KJ.,f7夕7。,.^"ei"/o;j力a^57V.iV"訂e"7;^^-M"來(lái)使用聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)樣品在樣品緩沖液(1%SDS，0.3MTris-HCl，pH6.8)中進(jìn)行稀釋。對(duì)于在還原條件下的分析，遵循相同的操作程序，但向樣品緩沖液中添加P-巰基乙醇至2mM的終濃度，并且使樣品于95°C加熱2分鐘。以20mA在0.25MTris-HCl，1.92M甘氨酸緩沖液(pH8.3)和1%SDS中進(jìn)行電泳運(yùn)行。使用關(guān)于用考馬斯藍(lán)或銀進(jìn)行染色的標(biāo)準(zhǔn)方法。想要用于隨后將通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析的蛋白質(zhì)的電泳分離的凝膠根據(jù)關(guān)于無(wú)戊二醛的銀染色的操作程序進(jìn)行染色，這與質(zhì)i普法分沖斤是相容的(5^eyc力e/2iro，丄，f^7//H,￥，Kor化0.7Ma72/2,脫，("J夕夕f,.j/2a/.M.'《j"。-《J《)。Western印跡法在通過(guò)電泳分離后，在水下轉(zhuǎn)移池中將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至0.45jimHybond—ECL^肖酸纖纟焦素膜(Amersham，UK)(7bH^y"A,iYae/e///7/70//ac/y7a/z/dege/fo/7ifroce//w_/oses力eefs..procedurea/7dso/z/es;/〃ca"o/^.尸roc.#3〃.Jcatf.Sc/.76;"J7—。在轉(zhuǎn)移后，用在PBSpH7.4,0.1%Tween-20中的5%(w/v)脫脂乳通過(guò)于25。C在恒定搖動(dòng)下溫育1小時(shí)來(lái)對(duì)膜進(jìn)行封閉。此后，將它們與在PBSpH7.4，0.1。/。Tween-20，5%脫脂乳中稀釋的相應(yīng)抗體于4。C溫育過(guò)夜。在用大量的PBSpH7.4,0.1%Tween-20進(jìn)行洗滌后，隨后將膜與合適的過(guò)氧化物酶綴合物(取決于從中獲得抗體的物種)于25。C溫育l小時(shí)。在所有情況下，綴合物從Amersham(UK)或Sigma(USA)獲得。用于顯現(xiàn)具有反應(yīng)性的條帶的過(guò)氧化物酶底物在各自的圖的說(shuō)明中指出。斑點(diǎn)印跡法2片硝酸纖維素膜用等摩爾量的DIIIE2J和BSA于2^C敏化1小時(shí)。2片膜都包括DV血清型2的病毒抗原制備物及其相應(yīng)的陰性對(duì)照，以作為抗體的抗病毒反應(yīng)性的對(duì)照。膜在恒定搖動(dòng)下于"'C在包含50/o脫脂乳的PBS，0.1%Tween-20中封閉1小時(shí)。與不同抗體制劑的溫育在PBS,0.01%Tween-20、5%脫脂乳中于25。C進(jìn)行2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，膜用PBS,0.01%Tween-20充分洗滌，并且在鼠類抗體的情況下與抗小鼠IgG-過(guò)氧化物酶綴合物(Amersham，UK)進(jìn)行溫育，或?qū)τ谌藖?lái)源的抗體而言與抗人IgG-過(guò)氧化物酶綴合物(Sigma,USA)進(jìn)行溫育，在兩種情況下均于25。C溫育1小時(shí)。在第二次充分洗滌膜后，采用ECLWesternBlottingAnalysisSystem(Amersham,UK),用CP-GPLUS(AGFA,Belgium)膠片在FBXC810放射自顯影箱(FisherBiotech,USA)中對(duì)膜進(jìn)行顯影。所述膠片在用于放射自顯影膠片的自動(dòng)處理機(jī)中進(jìn)行顯影(Hyperprocessor，Amersham，UK)。在色譜凝膠中固定蛋白質(zhì)將10mg等分試樣的純化的蛋白質(zhì)逆0.1Mol/LNaHC03pH8.3，0.5Mol/LNaCl進(jìn)行透析。蛋白質(zhì)與色譜凝膠的偶聯(lián)通過(guò)與1mL經(jīng)CNBr激活的Sepharose(Amersham,UK)于25。C溫育2小時(shí)來(lái)達(dá)到。未偶聯(lián)的蛋白質(zhì)通過(guò)在500xg下離心5分鐘而從凝膠中去除。通過(guò)比較反應(yīng)之前和之后溶液的蛋白質(zhì)濃度來(lái)評(píng)估偶聯(lián)效率。在所有情況下，大約95%的蛋白質(zhì)被固定。測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度使用基于雙金雞寧酸的試劑盒(Pierce,USA)，并根據(jù)制造商關(guān)于在96孔平板中實(shí)施測(cè)定法的說(shuō)明，來(lái)進(jìn)行用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定法。標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同稀釋度(0.025-2mg/mL)的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma,USA)來(lái)制備。在cm5芯片上的共價(jià)固定cm5芯片(Biacore，Sweden)用于DIIIE2J和LRP1蛋白的共價(jià)固定。于25。C，以5pL/分鐘的流速，并使用HBS(Biacore,Sweden)作為運(yùn)行緩沖液來(lái)施行所述固定。芯片的表面通過(guò)加載35iaL0.2Mo1/L^乙基-#，-(3-二乙基氨基-丙基)碳二亞胺(EDC)和0.05Mo1/L羥基琥珀酰亞胺(NHS)來(lái)激活。此后，將溶解于10mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中的蛋白質(zhì)加載到該系統(tǒng)中。在固定結(jié)束時(shí)，將35pLlM乙醇胺(pH8)加載到該系統(tǒng)中，以便封閉任何剩余的、游離的、經(jīng)活化的基團(tuán)。在每種情況下，待用作陰性對(duì)照的通道僅接受用EDC:NHS溶液的激活注射以及用乙醇胺的封閉，其中使用相同的流速和注射體積。結(jié)果使用BIAevaluationver.4.1程序(Biacore，Sweden)來(lái)進(jìn)行分析。31通過(guò)質(zhì)語(yǔ)法進(jìn)行分析用配備有Z-噴射電霧化電離源的、具有八角形幾何形狀的混合型質(zhì)譜儀QT0F-2TM(Micromass，UK)來(lái)獲得質(zhì)譜。用于獲得和加工質(zhì)謙的軟件是MassLinx，ver.3.5(Waters,USA)。使用MaxEntropyver.3.0(Micromass，UK)來(lái)對(duì)胰蛋白酶消化肽段混合物的ESI-MS語(yǔ)進(jìn)行解巻積。所使用的鑒定軟件是MASCOT和SeqTag。DV2,基因型Jamaica的E蛋白的Dili(DIIIE2J)的獲得通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得DV2的E蛋白的結(jié)構(gòu)域III，其中在大腸桿菌(^c力eWc力/aco7/)中表達(dá)編碼這種多肽的基因片段。為了這個(gè)目的，使用亞磷酰胺法(Sea"cage,Ze〃ei^〈"W9,W,7《")來(lái)合成具有序列CATATGGCCATGGACAAACTACAGCTC(SEQID.19)和CTCGAGGCCGATGGAACTTCCTTT(SEQID.20)的兩種寡核苷酸，其在5，末端中分別攜帶有限制酶I和J力oI的識(shí)別序列(在序列中以加下劃線表示)。使用這兩種寡核苷酸，并使用包含DV2毒林Jamaica1409的基因組的前2469個(gè)核苷酸的p30-VD2質(zhì)沭立("ew&7F,A7/me/i見(jiàn)7>e/^P7ro/o^r,「""J,WJ，作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出編碼E蛋白的DIII的DNA片段(S"i:/Sc力ar尸51，尸a/oo/a尸，f5，Aor/6T，^r/7c力〃j，j/72^e//zyV,jfi!nz/邁af/ca邁/7/y/7caf/on0/*使用來(lái)自Amersham，UK的pM0SBlue平端克隆試劑盒(RPN5110)，將該片段克隆到pMOSBlue載體中，然后通過(guò)來(lái)下列方式來(lái)進(jìn)行純化才艮據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)用酶#cTeI和J力oI(PromegaBenelux,b.v.，TheNetherlands)消化所得到的質(zhì)粒，隨后在具有低凝膠化溫度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(5^邁6rooi:,/./尸r/"c力，i".尸./la"/an、71.#o/eci//sr670/7//^.'JZa6ors"/y;l/a;2wa/廣7夕《夕人Co/d5^r/"g#ar6orZa^ra/^/yFori:，)。然后，在由制造商指定的條件下，使用T4廳連接酶(P腦egaBenelux,b.v.，TheNetherlands)將該片段連接到經(jīng)同樣消化的pET22b+質(zhì)粒(NovagenInc.，USA)中。根據(jù)Sambrook等人(5^/z76rooir,W"c/f尸，la//a〃s71,5>r//gVar6orZs6oratorT尸ress/7夕《夕)，將獲4尋的〉'昆合物轉(zhuǎn)4匕至'J大腸桿菌菌林XL-lBlue(5"http://ocir柳，F(xiàn)er/^/7t/ezA'"e由一e51渭7/力中，并且通過(guò)限制性分析來(lái)篩選在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后獲得的菌落中存在的所得到的質(zhì)粒。幾種重組質(zhì)粒的序列通過(guò)自動(dòng)化Sanger測(cè)序來(lái)進(jìn)4亍驗(yàn)證，并且選擇出其序列匹配預(yù)期序列的代表性分子并命名為pET-iDIIIE2—J(SEQID.21)。這種質(zhì)粒在大腸桿菌中在T7啟動(dòng)子控制下編碼DV血清型2毒林Jamaica1409的E蛋白的Dili的細(xì)胞內(nèi)合成。命名為DIIIE2J(SEQID.22)的所獲得的蛋白質(zhì)在其C-末端上包含具有6個(gè)連續(xù)組氨酸的序列，其被引入作為用于促進(jìn)該蛋白質(zhì)通過(guò)固定化金屬親和層析(IMAC)&0"￡7力/70人J,7-7)進(jìn)4亍純4匕的標(biāo)簽。為了純化DIIIE2J,將pET-iDIIIE2-J質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(^a邁6層ir/,fori:,^y丄'Co/di^r7y^"〃ar6orLs6orafOTy尸ress/J夕《夕)至ij大腸桿菌菌抹BL21(DE3)中(57wd/er,F.丄M/Ta〃."We33f.'")，并將徹底分開(kāi)的菌落用于接種50raL補(bǔ)充有50Mg/mL氨節(jié)青霉素的LuriaBertani培養(yǎng)基(LBA)。培養(yǎng)物于30°C在350r.p.m.下生長(zhǎng)12小時(shí)，然后用于以在620nm下0.05的起始光密度來(lái)接種1LLBA培養(yǎng)基，其隨后于28。C生長(zhǎng)8小時(shí)直至指數(shù)后期，并且通過(guò)添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)。生長(zhǎng)在相同條件下繼續(xù)另外5小時(shí)。經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物于4'C在5000xg下離心30分鐘，并且將所得到的生物量重懸浮于30mLPBS中，并在弗氏壓碎器上以1500kg/cm2施行3個(gè)循環(huán)來(lái)進(jìn)行破裂。在將勻漿物于4'C在10000xg下離心30分鐘后，將包含以內(nèi)含體形式的所述蛋白質(zhì)的沉淀物溶解在30mLPBS，6M鹽酸胍中，并且通過(guò)以100ng/mL的蛋白質(zhì)終濃度在PBS/10mM咪唑中進(jìn)行稀釋來(lái)重折疊DIIIE2J。使用N卜NTA瓊月旨糖(QiagenBeneluxB.V.，TheNetherlands)通過(guò)固定化金屬親和層析(5^/irowh'，A(""《J，戶wW/7ca〃o"profe//^rre"ds^/ofec//o厶J，7-7)來(lái)純4匕重4斤疊的DIIIE2J。在結(jié)合后，通過(guò)順次用在PBSpH7.4，0.3Mol/LNaCl中的50、100和300raMol/L咪唑溶液作為緩沖液洗滌柱來(lái)洗脫蛋白質(zhì)。如通過(guò)使用ImageJver.1.35d軟件(yas6a/^K,A〃/;/2/力.gor//y/)的光密度分析常規(guī)操作對(duì)于經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的在變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行數(shù)字圖像分析所評(píng)估的，所獲得的蛋白質(zhì)具有等于或高于90%的純度。人A2M的純化從380mL人血漿中純化出人A2M，所述人血漿通過(guò)合并來(lái)自30至40歲的健康供體的血漿樣品而獲得。使血漿于4。C逆去離子水(頻繁更換)透析72小時(shí)。不溶性物質(zhì)通過(guò)在10000xg下離心30分鐘來(lái)分離。使上清液逆PBSpH6進(jìn)行透析，并加載到XK50/30柱(Amersham，UK)中，所述柱中填充有65mLChelatingSepharoseFastFlow(Amersham，UK),其事先加載有Zn2+并用PBSpH6平衡。柱隨后用PBSpH6進(jìn)行洗滌直至洗出液在280nm處的吸光度減少至基線水平，并用10mMol/L乙酸鈉緩沖液pH5,150mMNaCl洗脫下結(jié)合的蛋白質(zhì)。使用具有300kDa的MWCO的膜通過(guò)超濾來(lái)濃縮洗脫下的蛋白質(zhì)，然后以2niL/分鐘的流速加載到填充有Superdex200(Amersham，UK)并用PBSpH7.8平衡的凝膠過(guò)濾柱(26x51cm)中。載具有最高分子量的級(jí)分中蛋白質(zhì)的存在通過(guò)Western印跡測(cè)定法來(lái)進(jìn)行檢查，其中使用多克隆抗人A2M抗體制劑(Sigma,USA)。通過(guò)與200mMol/L甲胺在50raMol/L磷酸鈉，150mMol/LNaCl,pH7.4中進(jìn)行溫育來(lái)達(dá)到經(jīng)純化的A2M的激活。使獲得的A2M-MeNH2逆50mMol/L磷酸鈉，0.5Mol/LNaClpH7.8進(jìn)行充分透析。重組人LRPAPl(RAP)蛋白的獲得通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)獲得稱為"LRPAPl"或在科學(xué)文獻(xiàn)中更通常稱為"RAP"的"與LRP1受體相關(guān)的人蛋白質(zhì)"，其中在大腸桿菌中表達(dá)編碼這種分子的基因片段。為了這個(gè)目的，使用由Chomczynsky和Sacchi所描述的方案rC力o邁cz/z^ir/，尸./Sacc//,義(^夕《7jZ力/oc/a/7afe—/7力e刀o/—c力7oro尸(77Z7ej^racf/on./4/7<s/j^2'ca/S/oc力e邁2'WiT7";U"，從人單核細(xì)胞細(xì)胞系THP-1(7^fyc力2'/a，S.，.fa/z7s6e,，7a/wagi/c//,尺/f06a7as力/，F(xiàn).，'fo/2/70,r./aci/fe邁w70c/f/c7ei/A(5/z7/ace/////7e廣71/7尸-7^,/.Career.'77"中純化出總RNA;并且使用隨機(jī)六聚體，采用來(lái)自Perkin-Elmer(USA,N808-0143)的GeneAmpRNAPCRCoreKit將該RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過(guò)PCR從cDNA擴(kuò)增出LRPAPl(RAP)蛋白的基因(Sa/i:/,A，'Sc力ar/;&/尸"oo/ls，,'A/〃or",《7:/^r7/c力，《力./Jr/力e/邁,義f7夕》i",f"z//z7af/ca/s;/y/7caf/0/7o尸其中使用GeneAmpRNAPCRCoreKit(Perkin-Elmer，USA，N808-0143)以及寡核苷酸CATATGTACTCGCGGGAGAAGAACCAG(SEQID.23)和CTCGAGTCAGAGTTCGTTGTGC(SEQID.24)，其在5'末端上分別攜帶有限制酶；W/eI和J力oI的識(shí)別序列(在序列中以加下劃線表示)，其事先通過(guò)亞磷酰胺化學(xué)(5ea"cage5X,Car"Mers#〃，Ze〃er;y,〃術(shù),，"，7《J夕)來(lái)合成。使用pGEM-TVectorSystem1Kit(PromegaBeneluxb.v.，TheNetherlands,A3600)將擴(kuò)增出的片段克隆到pGEM-T栽體(PromegaBeneluxb.v.,TheNetherlands)中，然后通過(guò)來(lái)下歹li方式來(lái)進(jìn)4亍純化在由制造商指定的條件下用y^el和/力o1(PromegaBenelux,b.v.，TheNetherlands)進(jìn)行消化，隨后在具有低凝膠化溫度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(5^/z/^ooA/./尸r/"c力，A尸.，'船/2/a"、71.C/0/22'/2g..爿Za6orafoiyyl/a/2ua/r2夕《夕人Co/dS/r2'/2g^ar6or^6orafOTT戶rew，〃W)。然后，在由制造商指定的條件下，使用T4DM連接酶(PromegaBenelux,b.v.，TheNetherlands)將該片段連接到事先用^/eI和J力oI消化的pET28a+質(zhì)粒(NovagenInc.，USA)中。才艮才居Sambrook等人(Sa/z^rooir/,尸r/"c力f尸，#a/3/a"s71.c7o///7^v爿7a6orafor/2z7s/2ua人^e『fori:,y5^..Co/di>r//g《ar60rZa60raf(r/戶ress/7夕《夕)，將反應(yīng)'J昆合物轉(zhuǎn)4匕至'j大腸桿菌菌林XL-lBlue(^/"oclIW,尸e/72d/^ez/#,5"力orf/#S/o"由/力,，7/J;""J中，并且通過(guò)限制性分析來(lái)篩選來(lái)自在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后獲得的菌落的質(zhì)粒。幾種所得到的重組質(zhì)粒的序列通過(guò)自動(dòng)化Sanger測(cè)序來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，并且選擇出匹配預(yù)期序列的代表性克隆并命名為pET-RAP(SEQ.ID.25)。這種質(zhì)粒在大腸桿菌中在T7啟動(dòng)子控制下編碼人LRPAP1(RAP)蛋白的細(xì)胞內(nèi)合成。命名為RAPR13(SEQID.26)的重組蛋白質(zhì)在N-末端上包含具有6個(gè)連續(xù)組氨酸的標(biāo)簽，以用于該蛋白質(zhì)的隨后的通過(guò)固定化金屬親和層析(IMAC)(i7;/i:op^ir/,廣2夕《jV尸"r/Z7ca〃o"o/pro^//^6//yl^C.A/Wec力/20人J，7-7)的純化，所述標(biāo)簽通過(guò)凝血酶切割位點(diǎn)而與該蛋白質(zhì)的其余部分相分開(kāi)。為了純化RAPR13,將pET-RAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(5^邁6rooir/，F(xiàn)r/"c力f尸，^SX'Co/c〃ar6orl36or"arr戶re^/J夕《iO到大腸桿菌菌才朱BL21(DE3)中(5Ywc/er，尺K和及丄lo/Ta"."We6acter/c^力age77jyV^/^///serssetod/recfse7ect2'卩e力2'g力一/e卩e/ez;res^^0/20/c/o/ze^^3/7es.〃/.#0人"/o人J《義J("J夕《(5V.'J—J^)，并將徹底分開(kāi)的菌落用于接種在1L錐形瓶中的補(bǔ)充有100pg/mL卡那霉素的50mLZYM5052培養(yǎng)基的培養(yǎng)物(iYud/er,尸.^M",尸rofei/2/7roo^/ct/of7ai^o—2'/2f/i/cf//2力/g力de/2s/0^<s/air//2gcw/ti/res.尸rWe/./7^Tres".o/a/2dA/r/ZVca〃o""廣JJ.'207)，隨后將其在28。C和350r.p.m下溫育16小時(shí)。將經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物于4'C在5000xg下離心30分鐘，并且將所得到的生物量重懸浮于30mLPBS中，并在弗氏壓碎器上以1500kg/cr^施行3個(gè)循環(huán)來(lái)進(jìn)行破裂。在將所得到的勻漿物于4'C在10000xg下離心30分鐘后，使用Ni-NTA瓊脂糖((/age"^e/e/i/;rAK，77e#e^eW<3/7&)通過(guò)固定化金屬親和層沖斤(5W/lop^i:i,f.廣7夕《iV戶i/r2./7ca〃ozo/pro"http://^67/^4C7Ye/2C^^orec力/70/.J，卜從上清液中純化出蛋白質(zhì)，其中使用在PBS/0.3MNaCl中10-300mM咪唑的線性梯度作為用于洗脫的運(yùn)行緩沖液。如通過(guò)使用ImageJver.1.35d軟件(RasbandW.,http:〃rsb.info,nih.gov/ij/)的光密度分析常規(guī)操作對(duì)于經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行數(shù)字圖像分析所評(píng)估的，所獲得的蛋白質(zhì)具有等于或高于90%的純度。肽合成4吏用Fmoc/tBu策略(Asra/2/，&和J/err277e/t/,W.萬(wàn).//(范f力e邁^c."〃夕〃乂7Jd7-7WJ)，通過(guò)在Fmoc-AM-MBHA樹(shù)脂上的固相合成來(lái)獲得所述肽。通過(guò)用DIC/H0Bt進(jìn)行激活來(lái)偶聯(lián)氨基酸，其中通過(guò)茚三酮測(cè)定法來(lái)監(jiān)控偶聯(lián)反應(yīng)的完成(h"er,，Co/e"o〃，兄丄.，"oss/z^er，C.".尸./.Ji7a/^/oc力e邁.J4廣7570y^i^—J夕《)。通過(guò)用TFA/EDT/H20/TIS(94%/2.5%/2.5%/1。/。)溶液進(jìn)行處理來(lái)使經(jīng)合成的肽與樹(shù)脂分開(kāi)，用乙醚進(jìn)行沉淀，并凍干72小時(shí)。通過(guò)用DMS0進(jìn)行氧化來(lái)達(dá)到經(jīng)形成二硫橋的肽環(huán)化(J/^re^".，F(xiàn).，5^/e'，爿.，#w3SO/7，#C.,Ferrer，和Aara"/,C，戶ei7/7/z^to",//2Wo/ecw/arS/o/o^r,^c^Ofra,#/，7夕夕(夕J一76夕)。在戶斤有情況下，肽通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行純化，并且將經(jīng)收集的級(jí)分獨(dú)立地通過(guò)分析型RP-HPLC進(jìn)行分析。通過(guò)合并具有等于或高于99%的色譜純度的級(jí)分而獲得每種肽的最終制劑。所述肽的最終制劑的分子量通過(guò)ESI-MS質(zhì)讒法來(lái)進(jìn)行,驗(yàn)證。關(guān)于熒光素化的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的結(jié)合的測(cè)定法通過(guò)來(lái)自健康供體的總血液樣品的紅細(xì)胞裂解來(lái)獲得外周血單核細(xì)胞，所述血液樣品通過(guò)靜脈穿刺而收集在BDVacutainerK3EDTA小瓶中。以2ral/100ja1血液的比例向血液中加入裂解溶液(0.3Mol/LNH4C1，20mMol/LK跳，20juMol/LNa2EDTA),然后將樣品于25。C溫育大約15分鐘，其中以3分鐘的間隔搖動(dòng)樣品。通過(guò)冷卻至4'C來(lái)終止反應(yīng)，并且通過(guò)在350xg下離心5分鐘來(lái)將細(xì)胞與裂解溶液相分開(kāi)。在去除上清液后，細(xì)胞用PBSpH7.4，10/。牛血清白蛋白(BSA)，0.01%NaN"1mMCaCh，1mMMgCl2進(jìn)行洗滌。在經(jīng)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞的情況下，無(wú)需使用蛋白酶，通過(guò)與PBSpH7.4，5mMEDTA于37。C溫育IO分鐘，并輕輕敲擊錐形瓶外部，來(lái)使它們與培養(yǎng)瓶的表面分開(kāi)。38將如上所述經(jīng)收集和洗滌的細(xì)胞在固定溶液(PBSpH7.4，2%低聚甲醛、0.01%NaN3，1mMCaCh，1mMMgCl2)中于4°C溫育30分鐘，然后通過(guò)于4'C在350xg下離心5分鐘來(lái)去除固定溶液。所述測(cè)定法通過(guò)如此來(lái)進(jìn)行在總體積IOOjaL的熒光素化的蛋白質(zhì)的每種稀釋物(在PBSpH7.4,1%BSA,1raMCaCl2，lmMMgCh中進(jìn)行稀釋)中于4。C將1x105細(xì)胞溫育1小時(shí)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)包括具有未處理的細(xì)胞的對(duì)照。在溫育后，將細(xì)胞洗滌2次，并再次在固定溶液中溫育。熒光強(qiáng)度在PASIII儀器(Partec，Germany)上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行定量。關(guān)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的值由關(guān)于最低限度20000個(gè)細(xì)胞的測(cè)量進(jìn)行計(jì)算。在Vero細(xì)胞中的病毒感染的抑制讓Vero細(xì)胞在24孔平板中生長(zhǎng)至大約90%匯合，并用不含F(xiàn)CS的MEM培養(yǎng)基洗滌2次。隨后，根據(jù)該測(cè)定法的目的，添加包含蛋白質(zhì)或抗體的稀釋物并于37'C溫育1小時(shí)。在溫育后，以0.1的感染復(fù)數(shù)添加病毒，隨后于37。C繼續(xù)溫育1小時(shí)。在第二次溫育結(jié)束時(shí)，通過(guò)洗滌來(lái)去除未結(jié)合的病毒，并將細(xì)胞在高密度培養(yǎng)基(補(bǔ)充有非必需氨基酸、1%FCS、1%羧甲基纖維素的MEM)中于37。C溫育5天，以便促進(jìn)裂解噬斑的出現(xiàn)。通過(guò)用在0.15Mol/L乙酸鈉中的0.1%萘酚藍(lán)黑進(jìn)行染色來(lái)顯現(xiàn)噬斑。在每次測(cè)定法中的每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)使用2次重復(fù)，并且進(jìn)行3次獨(dú)立的測(cè)定。抑制百分比根據(jù)下式來(lái)進(jìn)行計(jì)算100x噬斑數(shù)目對(duì)照病毒噬斑數(shù)目在通過(guò)顱內(nèi)接種DV而誘導(dǎo)的Balb/C小鼠腦炎模型中的保護(hù)測(cè)定生將12只成年Balb/C小鼠(20g的平均體重)的組進(jìn)行麻醉，通過(guò)顱內(nèi)注射致死劑量的DV2來(lái)進(jìn)行接種，并且每天進(jìn)行觀察，共21天。肽與病毒的混合物以相同方式進(jìn)行接種。所接種的樣品的體積是實(shí)施例1用于分離結(jié)合DV的Dili的蛋白質(zhì)的親和基質(zhì)的獲得為了制備具有DIII作為用于分離人血漿蛋白質(zhì)(其作為DV的潛在受體)的配體的親和基質(zhì)，克隆包含DV2的E蛋白的殘基Met289-Gly4。。(SEQID.No.22)的重組蛋白質(zhì)DIIIE2J,并在大腸桿菌中表達(dá)。在IMAC后，如通過(guò)蛋白質(zhì)電泳所評(píng)估的，獲得的制劑具有高純度，而銀染色僅揭示出不含可檢測(cè)的污染物的主要條帶(圖IB)。為了排除在電泳期間可能與DIIIE2J共遷移的污染物的可能存在，通過(guò)反相色語(yǔ)法(rp-HPLC)來(lái)分析該制劑。將80jugDIIIE2J的等分試樣加載到C4反相柱(4.6x250mm)(J.T.Baker,USA)中。所獲得的色譜圖(圖1A)僅具有單重峰，這證實(shí)了該制劑的高度同質(zhì)性。Dili具有大量由中和抗體所識(shí)別的地形表位(topographicalepitope),并且在所有這些情況下，已顯示，抗體識(shí)別在還原Dili的2個(gè)半胱氨酸之間的二硫橋后被取消(Aoe力Wg/r,W，^7/coprc^ei/2f力ede/7gwe2y/rws,/a歷a/caP7ro7c>g72皁d".'2《)。為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)的分子量和證實(shí)二硫橋的存在，將通過(guò)rp-HPLC純化的DIIIE2J的等分試樣進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。如可從圖2中看出的，DIIIE2J制劑的主要種類具有13515.00Da的質(zhì)量，如果通過(guò)大腸桿菌甲硫氨酰-氨肽酶(MAP)從該分子上去除N-末端Met,那么這與預(yù)期值相差1.32Da(圖2B)。該結(jié)果證實(shí)，N-末端Met已通過(guò)MAP而從DIIIE2J制劑中均一地去除，但質(zhì)量的差異并不能夠證實(shí)二硫橋的存在或不存在。為了進(jìn)一步檢查二疏橋的狀態(tài)，將經(jīng)rp-HPLC純化的DIIIE2J的等分試樣分成具有相同體積的2個(gè)級(jí)分。所述級(jí)分之一用二硫蘇糖醇進(jìn)行還原，這之后這2個(gè)級(jí)分都通過(guò)用碘乙酰胺進(jìn)行處理而烷基化，隨后進(jìn)行ESI-MS分析。結(jié)果顯示，烷化劑僅在事先用二硫蘇糖醇處理的那個(gè)級(jí)分中摻入，這由增加的13631.QDa的質(zhì)量而得到證明，該質(zhì)量與關(guān)于還原的且脲基曱基化的種類的預(yù)期值僅相差1.2Da。僅經(jīng)歷烷基化無(wú)事先的還原的那個(gè)級(jí)分具有與未處理的蛋白質(zhì)相同的質(zhì)量(13515.OODa)，這證實(shí)了DIIIE2J的制劑不具有游離的巰基，以及該分子的2個(gè)Cys殘基鍵合形成DIII的特征性二硫橋。在斑點(diǎn)印跡測(cè)定法中進(jìn)行該蛋白質(zhì)的抗原表征。如可從圖3中看出的，DIIIE2J被鼠類抗-DV血清強(qiáng)烈結(jié)合，這顯示出顯著的對(duì)于同種血清型的特異性(圖3)。該蛋白質(zhì)還被來(lái)自在不同流行病學(xué)背景下被病毒感染的人的血清所識(shí)別。這個(gè)結(jié)果證明，所述DIIIE2J制劑重現(xiàn)了在完整的病毒顆粒情況下存在的結(jié)構(gòu)元件。為了用作親和色謙配體，重要的是確定固定的DIIIE2J是否能夠重現(xiàn)在病毒表面的情形中它所參與的相互作用。為了這個(gè)目的，將DIIIE2J固定在Sepharose4B上，并且就與最初針對(duì)完整的病毒顆粒而產(chǎn)生的抗體的結(jié)合來(lái)進(jìn)行測(cè)試。將20jaLDIIIE2J親和樹(shù)脂的等分試樣在結(jié)合緩沖液(PBSpH7.4,0.1%Tween-20)中進(jìn)行平衡，并與在結(jié)合緩沖液中稀釋的抗體樣品于25。C溫育30分鐘(在每個(gè)步驟中，通過(guò)在500xg下離心5分鐘來(lái)去除添加的溶液)。用結(jié)合緩沖液充分洗滌樹(shù)脂后，通過(guò)在20mMGlypH2.5中以及在SDS-PAGE(還原條件)樣品緩沖液中順次溫育來(lái)洗脫經(jīng)結(jié)合的抗體。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果證明，固定的重組蛋白質(zhì)能夠特異性地結(jié)合通過(guò)用整個(gè)病毒粒子進(jìn)行免疫接種而獲得的抗體(圖4)，這證實(shí)它模擬了暴露在病毒粒子上的Dili的相互作用表面，并因此它可以用作用于分離潛在的病毒受體的配體。實(shí)施例2人A2M與DV2的E蛋白的DIII直接相互作用在人血漿中細(xì)胞受體的可溶性片段的存在是廣泛已知的。另一方面，還已知向培養(yǎng)基中添加血清對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞被DV感染的效率具有顯著f》響(A^s力/W,yya/sfeaf/5^,#cCweC.廣J夕7J」r/r^w.//7尸eW義.。因此，為了篩選DV的潛在細(xì)胞受體，決定嘗試從人血漿中分離對(duì)于E蛋白的DIII具有親和力的蛋白質(zhì)。從30-40歲的、沒(méi)有可檢測(cè)的針對(duì)該病毒的抗體的健康供體中獲得的血漿樣品通過(guò)于56。C溫育1小時(shí)來(lái)滅活，并且通過(guò)離心(5000xg，IO分鐘)從溶液中去除沉淀的蛋白質(zhì)。將上清液貯存于-8(TC直至使用。與DIII結(jié)合的蛋白質(zhì)的分離通過(guò)親和色譜法來(lái)進(jìn)行。將4份如上所述進(jìn)行加工的人血漿與I份IOOmMHEPESpH6,1.75MNaCl,25mMCaCh,5mMMgCl2相混合，并以10cm/h的流速加載到填充有DIIIE2J親和樹(shù)脂的柱(l.5cm直徑x1.2cm高度)中。將樣品在這些條件下在柱上于25。C再循環(huán)另外4小時(shí)，然后用100個(gè)柱體積的20mMHEPES緩沖液(pH6)，0.35MNaCl，5mMCaCl"lmMMgCl2充分洗滌柱。另外，用20mMHEPES緩沖液pH6，0.5MNaCl，5mMCaCl"1mMMgC12洗滌柱。結(jié)合的蛋白質(zhì)的洗脫通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行將10mMGlypH2.5加載到柱中，并用UV檢測(cè)器監(jiān)控洗出液在280nm處的吸光度。為了鑒定在洗出液中存在的蛋白質(zhì)種類，將100^iL等分試樣的經(jīng)收集的級(jí)分用10%三氯乙酸進(jìn)行沉淀，重懸浮于20jaL樣品緩沖液中，并經(jīng)歷SDS-PAGE。切出蛋白質(zhì)條帶，并用胰蛋白酶進(jìn)行消化，隨后進(jìn)行洗脫的蛋白質(zhì)的ESI-MS分析。檢查對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)條帶所獲得的質(zhì)譜，并且使具有最高強(qiáng)度的信號(hào)片段化，以獲得關(guān)于所述肽的序列信息。在所有情況下，經(jīng)測(cè)序的肽相應(yīng)于人血漿蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化片段(表l)。表1.在使用固定的DIIIE2J進(jìn)行的親和色語(yǔ)法的洗出液中鑒定出的蛋白質(zhì)的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>1:基于通過(guò)ESI-MS分析獲得的數(shù)據(jù)，通過(guò)MASCOT(戶erh'/^"見(jiàn)尸a;/j//2/de/2f//7cat/on67searcA/zzgse《i;e/cec^fa6asesi/s/zg/Z7as5157ecfro/zetryf/ecti"o/7力ores/512〃..Ji"^57-(57)鑒定的蛋白質(zhì)在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。除了參與與固定的配體直接地、特異性地相互作用的蛋白質(zhì)之外，在親和色鐠法的洗出液中存在與這種結(jié)合無(wú)關(guān)的其他分子。白蛋白(Q645G4，表l)以及IgM和IgG免疫球蛋白(P04220和P01834，表的常見(jiàn)污染物，這^能是由于其在人血漿中的高豐度，、i人血漿中它們的存在濃度對(duì)于白蛋白可以為大約35mg/mL,對(duì)于IgG可以為12-15mg/mL和對(duì)于IgM可以為5mg/mL。免疫球蛋白的存在還可以通過(guò)在人血漿的某些抗體中存在與DIIIE2J的交叉反應(yīng)性來(lái)解釋，所述抗體實(shí)際上是對(duì)于其他抗原特異的。在經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)的那組內(nèi)存在A2M(P01023，表l;Seq.ID.2)被認(rèn)為是特別令人感興趣的。已知A2M充當(dāng)其他分子的載體蛋白，這可以導(dǎo)致由其A2MR細(xì)胞受體(Seq.ID.3)介導(dǎo)的胞吞作用。此外，在色謙法洗出液中還存在這樣的蛋白質(zhì)，其可能不參與與固定的配體的直接相互作用，并且可能是與其他經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)所形成的三元復(fù)合物的一部分，所述其他經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)的確結(jié)合該配體(^2W'/^C，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>低。為了確定A2M的分離是否是由于與DIIIE2J的直接相互作用，在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中將100jug等分試樣的在PBSpH7.4中的后面一種蛋白質(zhì)與100mg未激活的或激活的(通過(guò)曱胺處理)人A2M進(jìn)行溫育?；旌衔镏械鞍踪|(zhì)的摩爾濃度如下對(duì)于DIIIE2J為1.4x10Hmol/L，和對(duì)于人A2M的2種變體為7xl(T7Mol/L。將反應(yīng)體系于37。C溫育1小時(shí)，然后以0.4mL/分鐘的流速加載到事先用50mMNaHP0,緩沖液(pH7.0)/300mMNaCl平衡的10/30Superdex200HR凝膠過(guò)濾柱中(圖5E和F)。在加載經(jīng)混合的蛋白質(zhì)之前，通過(guò)使用純化的蛋白質(zhì)實(shí)施色譜運(yùn)行，對(duì)于DIIIE2J和A2M中的每一種分別建立洗脫圖譜和保留時(shí)間(圖5B-D)。在所有情況下，將從每次運(yùn)行收集的級(jí)分用丙酮進(jìn)行沉淀，并通過(guò)15%SDS-PAGE進(jìn)行分析，使與每個(gè)級(jí)分的總體積的比率保持恒定(1/5)。圖5G證明了DIIIE2J與A2M的2種變體之間復(fù)合物的形成，這通過(guò)高分子量級(jí)分中出現(xiàn)相應(yīng)于DIIIE2J的條帶而表現(xiàn)出來(lái)。這個(gè)結(jié)果構(gòu)成了A2M和DV包膜蛋白的DIII之間的物理相互作用的第一個(gè)證據(jù)。實(shí)施例3通過(guò)Biacore來(lái)測(cè)定DIIIE2J和A2M之間的相互作用的親和常數(shù)為了估計(jì)DIIIE2J和人A2M之間的相互作用的強(qiáng)度，根據(jù)在"材料和方法"中所描述的操作程序，將1600RU的DIIIE2J共價(jià)固定在CM5芯片上(通道1，圖6A)(Biacore，Sweden)。在初步實(shí)驗(yàn)期間(圖6B和C)，可以證實(shí)芯片表面上存在有固定的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)暴露出在病毒顆粒的情形中也是暴露的其表面區(qū)域。這種證實(shí)通過(guò)測(cè)量經(jīng)固定的分子與經(jīng)過(guò)用DV進(jìn)行免疫接種而獲得的抗體制劑的特異性相互作用來(lái)達(dá)到。特別地，與3H5單克隆抗體的結(jié)合(圖6C)證明了地形表位的正確暴露和形成，這依賴于DIII的2個(gè)半胱氨酸殘基之間的二硫橋的存在。通過(guò)加載濃度為0.3)iMol/L-3nMol/L的A2M,可以確定這2種蛋白質(zhì)之間的相互作用是可飽和的以及可逆的(圖6D)。所獲得的締合和解離曲線使得能夠計(jì)算出，該相互作用具有1(T7Mol/L的量級(jí)的表觀Kd。這個(gè)值可能表示在整個(gè)病毒粒子的情況下存在具有高得多的親合力的相互作用，其中DIII作為多重拷貝圍繞對(duì)稱軸排列，并因此其中有利于與寡聚蛋白質(zhì)例如A2M的多點(diǎn)結(jié)合。該相互作用是可逆的這一事實(shí)證實(shí)了這樣的可能性，即A2M可以充當(dāng)用于DV進(jìn)入其宿主細(xì)胞的載體蛋白。實(shí)施例4A2MR受體的天然配體抑制DIII與Vero細(xì)胞的結(jié)合和病毒感染RAP是LRP1的天然分子伴侶。這種蛋白質(zhì)控制LRP1的活性，這可能通過(guò)介導(dǎo)構(gòu)象變化來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述構(gòu)象變化阻止這種受體的各種配體的結(jié)合和/或內(nèi)在化(^erz/,6"o7o^"http://77Z,iYr/cir/a/zd#o"rowTfJ夕一ir/aprofe/'//wodw/a6//7cf//7go尸//>a/7^y&/o^de""7///poprc^e/"rece;^or-re/"edprofe//2/W/A<92—/zacro《/06i////7rece;^Oi"/^/o/C力e瓜i^&'i72J2—《)。因jt匕，RAP構(gòu)成了理想配體以用于獲得關(guān)于LRP1參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DV的胞吞作用的證據(jù)。Vero細(xì)胞系已廣泛用于研究DV與其細(xì)胞受體的相互作用的性質(zhì)。這些細(xì)胞對(duì)于4種病毒血清型的感染是高度易感的。它們構(gòu)成了用于評(píng)估針對(duì)DV的抗病毒活性的特別有利的工具，因?yàn)樗鼈兛梢栽跍y(cè)量裂解噬斑形成的抑制的測(cè)定法中使用。由于這種細(xì)胞系衍生自猴腎細(xì)胞(力ffW//隨.a,并且在測(cè)定法中使用的A2MR受體的配體是人來(lái)源的，因此初步和必需的步驟是確證RAPR13和A2M-Me冊(cè)2蛋白質(zhì)與Vero細(xì)胞的結(jié)合。為此，使這些蛋白質(zhì)焚光素化，并且使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)量其與Vero細(xì)胞表面的結(jié)合。這2種分子在這種細(xì)胞系中顯示出濃度依賴性的和可飽和的結(jié)合行為(圖7A)。在這種初次實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)下列方式來(lái)確定RAPR13是否能夠抑制A2M-MeNH2與Vero細(xì)胞的結(jié)合使預(yù)固定的細(xì)胞與熒光素化的A2M—MeN仏和RAPR13或人重組EGF(作為對(duì)照)的混合物于4'C溫育30分鐘，其中使用以IOO倍摩爾過(guò)量的未標(biāo)記的蛋白質(zhì)。獲得的結(jié)果證明了對(duì)于在RAPR13存在下與A2M-MeNH2進(jìn)行溫育的細(xì)胞而言出現(xiàn)熒光的減少，這與在重組人EGF存在下與A2M-MeNH2進(jìn)行溫育的樣品相反(圖7B)。這些結(jié)果確證，A2M—Me仰2和RAPR13均以特異性和功能性的方式與Vero細(xì)胞中的A2MR受體結(jié)合。關(guān)于感染抑制的測(cè)定法在接種有處于大約90%匯合的Vero細(xì)胞單層的24孔平板上進(jìn)行。調(diào)整病毒的稀釋度以獲得大約20個(gè)裂解噬斑/孔。當(dāng)在添加病毒之前將細(xì)胞與RAPR13蛋白或與針對(duì)A2MR受體的多克隆抗體制劑進(jìn)行預(yù)溫育時(shí)，該測(cè)定法的結(jié)果顯示出裂解噬斑數(shù)目的顯著減少(表2)。當(dāng)將細(xì)胞與BSA或與針對(duì)無(wú)關(guān)抗原的抗體制劑進(jìn)行預(yù)溫育時(shí)，沒(méi)有顯著的減少。表2.通過(guò)A2MR受體的天然配體或通過(guò)抗-受體抗體來(lái)抑制Vero細(xì)胞的感染的測(cè)定法蛋^#術(shù)譜肪術(shù)RAPR1365766075BSA7———a-A2MR82909085a-NR5-——1.結(jié)果表示3次獨(dú)立測(cè)定的平均值。在該測(cè)定法中使用的病毒毒林是DV1的WestPac74，DV2的S16803，DV3的CH53489和DV4的TVP360。蛋白質(zhì)RAP13和BSA在該測(cè)定法中以100pg/mL的濃度使用。a-A2MR:通過(guò)用A2MR受體進(jìn)行免疫接種而獲得的抗體。a-NR:通過(guò)用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫接種而獲得的抗體。這兩種抗體制劑以1/100的稀釋度進(jìn)行使用。類似地，借助于裂解噬斑減少測(cè)定法可以顯示出，用RAPR13蛋白質(zhì)對(duì)于DV2而獲得的感染抑制依賴于在實(shí)驗(yàn)中使用的蛋白質(zhì)濃度(圖8)。這個(gè)結(jié)果構(gòu)成了A2MR受體參與了介導(dǎo)DV進(jìn)入其靶細(xì)胞中的強(qiáng)有力證據(jù)o實(shí)施例5結(jié)構(gòu)上受約束的、地形的(topographical)合成肽的設(shè)計(jì)盡管在FV與宿主細(xì)胞的結(jié)合中Dili所發(fā)揮的基本作用是廣泛公認(rèn)的，但不存在關(guān)于DIII-衍生的合成肽具有抑制DV感染的潛在活性(在nM或幾jiM范圍內(nèi))的報(bào)道。幾個(gè)原因解釋了這種情況l)用合成肽來(lái)模擬整個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)決定子并不重要，因?yàn)閰⑴c蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的表面斑片通常是地形的，其由在三維結(jié)構(gòu)上緊密地定位但沿著蛋白質(zhì)序列分開(kāi)的殘基組成；2)通常，這些相互作用斑片是相當(dāng)大的，其面積從數(shù)百到幾千人2。這個(gè)量級(jí)大于小肽的總表面；3)肽在溶液中具有柔韌的結(jié)構(gòu)，這暗示在采用對(duì)于與其結(jié)合伙伴的相互作用而言生物學(xué)上相關(guān)的結(jié)構(gòu)后，將會(huì)存在構(gòu)象熵的相當(dāng)大的喪失，47并因此，肽-蛋白質(zhì)復(fù)合物的親和力將明顯低于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的親和力；4)肽在溶液中可以采取相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象，但這些構(gòu)象可能不同于由肽在其天然蛋白質(zhì)情形中所采用的構(gòu)象；5)病毒與其蛋白質(zhì)受體的結(jié)合可能涉及多點(diǎn)相互作用并因此將具有大親合力，因?yàn)椴《颈砻婢哂卸鄠€(gè)對(duì)稱的Din拷貝。這對(duì)于關(guān)于該受體而言所述病毒和所述肽之間的竟?fàn)幵斐筛叩哪芰科琳?。在關(guān)于A2MR受體與其天然配體之間的相互作用的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究期間所獲得的數(shù)據(jù)已顯示了在A2MR配體表面上的堿性殘基聚簇和/或Lys/Arg側(cè)鏈所發(fā)揮的重要作用。這是A2M(SEQID.2)的Lysl370和銅綠假單胞菌(戶5"e油歷麵5"ae考//7,)的夕卜毒素A的Lys57的情況，它們?nèi)绻ㄟ^(guò)定點(diǎn)誘變而被改變，則導(dǎo)致配體與受體的結(jié)合的顯著下降(ha/2^/e/o"cS，Va/7萬(wàn)Z,6^/2/'as(^MJV<2//7力32—瓜3<7/"6^706:////76/ocirs6//7d/i7gfof力e7cw^e/2^/t/4J《.'Z—15，^e￡/eir//2cT7>s/z/eC》，Z^r^nra7sirafoe//尸，AascAire7￥，#dee#，尸27zGera/d"，￥cIa7"A廣20d」及e/7/7ed爿a/d//s/7/2'caf2'o/s/orf力e/zo/eci/7ar/Z7ec力a/is邁tOAr/c/t/Wo/.《Z-J7)。類似地，其他研究已表明了apoE蛋白的由殘基136-150形成的堿性聚簇以及Argl72的重要(ia〃we;^F，"〃2-柳。另一方面，A2MR受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和一般地，LDL受體家族的所有成員的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特征在于，由于存在可以與相互作用配體上的堿性殘基有利地相互作用的暴露的保守酸性殘基，因而在配體結(jié)合表面上具有顯著陰性的靜電勢(shì)。例如，VLDL受體片段和人鼻病毒2(屬于鼻病毒的次要群)之間的復(fù)合物的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)顯示了病毒衣殼的VP1蛋白的LYS224與該受體的殘基ASP139和GLUl"之間的緊密相互作用(Ke/^a^yervY，尸/"/，We/f力邁a7er見(jiàn)MserA,5/aas"f2〃^/，J一ra/sfrwcfureo/a^row;力w邁a/7rA/"oy/rf/s6c>w/7f/foa/Vag邁eWofce77i/7arrec一orprofe//7.i7ri/"W77;W夕-W)。另外，VP1的Lys224的脂肪族側(cè)鏈與該受體結(jié)構(gòu)域的Trpl32相互作用，所述Trpl32雖然在A2MR的所有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中不是嚴(yán)格保守的，但是它是這個(gè)位置上最常見(jiàn)的氨基酸(在31個(gè)結(jié)構(gòu)域中的20個(gè)結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)，而Leu在4個(gè)結(jié)構(gòu)域中、Phe在3個(gè)結(jié)構(gòu)域中、Arg在2個(gè)結(jié)構(gòu)域中以及Lys和Ser各僅在1個(gè)結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn))(圖9)。表3顯示了A2MR受體的配體結(jié)合斑片，其由在結(jié)構(gòu)上等價(jià)于VLDL受體中的Trpl32、ASP135、GLU137和ASP139的位置來(lái)定義。表3.A2MR受體中的配體結(jié)合斑片岸一個(gè)戎差絲長(zhǎng)《P2P4Al256642W45D48E50D52A27011041R90N93V95D97A385289241W871D874D876D878A489393341W912D915D917D919A593497340W953D956D958D960A6974101340W994D997D999D1001A71013105341W1032D1035D1037D1039A810.60109940W1080D1083D1085D1087A91102114241W1123D1126D1128D1130A101143118240K1164D1167N1169D1171All2522256342L2542D2545V2547H2549A122564260239L2583N2586A2588D2590A132603■264139S2622N2625F2627D2629-A142642269049W2671D2674A2676D2678A152694273.239W2713D2716E2718D2720A162732277140W2751D2754S2756D2758A172772281443W2792D2795D2797D2799A182816285540F2835D2838D2840D2842A192856289944W2876D2879E2881D2783A202902294039L2922N292SG2927D2929A213332337140W3351D3354E3356D3358A22372341039F33913394D3396D3398A233411345040F2431N2434N2438A243451349141W3471D3474D3476D3478A253492353342W3512D3515E3517D3519A263534357239W3553D3556D3558D3560A273573361139W35'92D3595D3597D3599A283611364939W3630D3633D3635D3637A293652369241W3671D3674E3576D3678A303693373341R3714D3717T3619N3621A313739377840L3759N3762F3764D37661.該表中的編號(hào)相應(yīng)于人A2MR的序列(SEQIDNo.3)。結(jié)構(gòu)域在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中人A2MR受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的名稱。第一個(gè)殘基和最后一個(gè)殘基該受體的不同配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)和最后一個(gè)殘基的位置。長(zhǎng)度(aa):配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸總數(shù)目。Pl-4:形成配體結(jié)合斑片的殘基?？紤]到Lys/Arg殘基，和一般地，靜電電荷在與LDL受體家族的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用中的重要性，因而檢查了在DV1-4的相應(yīng)50Dili三維結(jié)構(gòu)模型的所暴露的上表面和側(cè)表面中荷電殘基的定位。對(duì)于這種分析，使用DV2和DV3的E蛋白的結(jié)構(gòu)(在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的條目為loan和luzg)作為模板，以用于構(gòu)建DV1和DV4的E蛋白的3D結(jié)構(gòu)才莫型，其中使用MODELLER程序(A5^/y,r.Z.Ww7t/e/人s;a〃a/re"ra/""./.Z《'77夕-《7J)?！┛诳蓮膱D10中看出的，存在相應(yīng)于在4種血清型中保守的賴氨酸側(cè)鏈的4個(gè)表面斑片。除了由DV1、2和4的Lys310(在DV3中為L(zhǎng)ys308)所定義的斑片外，其余斑片在它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)中的定位水平上不是嚴(yán)格保守的，而是在它們?cè)诘鞍踪|(zhì)表面上的地形位置方面是嚴(yán)格保守的。這可能是由于在該蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)中在鄰近位置處的相關(guān)突變的出現(xiàn)，以及由于賴氨酸側(cè)鏈的柔韌性。這些斑片中的2個(gè)位于暴露的表面上，相應(yīng)于由鏈A、B、。、D和E所限定的P折疊(圖11A)，而其余斑片位于側(cè)/上表面中，相應(yīng)于或鄰近于FGP發(fā)夾。DIII表面上的4個(gè)保守賴氨酸斑片中的至少一個(gè)，和特別地，位于FGP發(fā)夾的暴露表面上或與FGP發(fā)夾的暴露表面鄰近的2個(gè)斑片，與表3中定義的A2MR受體的配體結(jié)合斑片有利地相互作用。為了設(shè)計(jì)可以抑制FV感染的基于DIII的肽，選擇Ser376-Trp391區(qū)段(DV2的殘基編號(hào))作為出發(fā)點(diǎn)。這個(gè)區(qū)段包含F(xiàn)GP發(fā)夾，其將745A2的總面積暴露于溶劑，并且是在成熟病毒粒子結(jié)構(gòu)的情形中仍暴露的結(jié)構(gòu)域的上/側(cè)表面的一部分。已報(bào)道，這個(gè)區(qū)域中的幾個(gè)突變影響阻斷病毒與細(xì)胞相互作用的中和抗體的結(jié)合，或影響病毒表型。這個(gè)區(qū)段的主鏈的結(jié)構(gòu)在可得的DV2和DV3的E蛋白晶體學(xué)結(jié)構(gòu)之間是保守的(圖11B)。這個(gè)結(jié)構(gòu)保守還包括F-G環(huán)，其具有在殘基Glu383-Gln386(根據(jù)SEQID1的殘基編號(hào))之間的II型P轉(zhuǎn)角。FG區(qū)段主鏈的結(jié)構(gòu)保守也可應(yīng)用于DV1和DV4，因?yàn)榭紤]到相應(yīng)序列之間的相似性程度，加上這些病毒的E蛋白的3D模型之間的結(jié)構(gòu)相似性，其分別通過(guò)基于DV2和DV3坐標(biāo)的同源性建模而獲得(圖11B)。圖11(C和D)顯示了基于DV2和DV3的FG發(fā)夾而設(shè)計(jì)的合成肽51HDIII2CL和HDIII3CL的一級(jí)結(jié)構(gòu)和3D才莫型。所述合成肽包括2個(gè)半胱氨酸，一個(gè)在N-末端處和另一個(gè)在C-末端處。如由這些肽的三維結(jié)構(gòu)模型所表明的，這些殘基可以形成在結(jié)構(gòu)上與P發(fā)夾結(jié)構(gòu)相容的二硫橋(圖11C和D)。在這些模型中，半胱氨酸的oc碳相隔5.7A，這是二硫橋的通常距離。經(jīng)由二硫橋的環(huán)化通過(guò)減少其主鏈的構(gòu)象熵來(lái)促成該肽的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化。該設(shè)計(jì)允許在該肽的F和G鏈的主鏈之間形成6個(gè)氫鍵，從而進(jìn)一步增加了它的穩(wěn)定性(圖C和D)。殘基4和6(鏈F)以及殘基13、15和17(鏈G)是疏水性的，并且朝向發(fā)夾的相同面，這保證了它們之間有利的疏水性相互作用。F^鏈的殘基4-6在P碳上分叉，并且特征在于對(duì)于釆取P/延伸結(jié)構(gòu)的高傾向。肽HDIII3CL(SEQID.7)包括殘基Lysll和Lysl4，相應(yīng)于DIII的2個(gè)賴氨酸斑片，其構(gòu)成了用于與A2MR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的有利相互作用的推定位點(diǎn)。肽HDIII2CL(SEQID.5)僅具有由Lysl4形成的1個(gè)斑片；而HDIII1CL(DV1，SEQID.6)具有2個(gè)斑片，和HDIII4CL(DV4，SEQID.8)沒(méi)有。此外，設(shè)計(jì)了環(huán)肽HDIII2Cs(Seq.ID.4)和pepDIII-l,分別相應(yīng)于DV2的E蛋白的序列11e379-Lys388和Gly381-Gln386(圖12A)。這2種肽包括在N-和C-末端處的半胱氨酸以用于經(jīng)由二石危橋的其環(huán)化，所述二硫橋在結(jié)構(gòu)上與天然蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)相容。肽HDIII2Cs類似于肽HDIII2CL,但僅包括F和GP鏈的一部分。另一方面，肽pepDIII-1僅包4舌F-G環(huán)。實(shí)施例6肽HDIII2Cs重現(xiàn)了DV2的DIII的地形表位為了評(píng)估m(xù)Ab3H5對(duì)于肽HDIII2Cs的識(shí)別，制備肽-BSA綴合物并通過(guò)用這種抗體的Western印跡法進(jìn)行分析(圖UB)。重組蛋白質(zhì)PD5用作這種測(cè)定法的陽(yáng)性對(duì)照。這種蛋白質(zhì)由DV2的E蛋白的DI11(殘基286-426)形成，所述Dili與腦膜炎奈瑟球菌(#e"ser/a/ze/2/i^/OV")的石克辛酰胺脫氬酶(P64k)的C-末端融合。PD5已作為疫苗候選物進(jìn)行了評(píng)估，并且能夠引起保護(hù)性免疫應(yīng)答，如通過(guò)在小鼠和猴的感染模型中的病毒攻擊所評(píng)估的(^r/z/cTa丄.，/ot/r/^/ez兄，Z.,i7/K<3兄,Z〃/we/^爿.，C力/"esC.,Zo/ezC.,Ci/z/wdn#,和67//77e/761fjJf/e/^i/e—2f/7Fe/o/7e尸ra^z/e/7f//^ei^ede/a6/e51s尸w7cf/c力a/2'/M7w/7eresponseaga2'/7sff力ey/rws/刀/s/ce./F/w7^e^oc^.7":^/—力，這證明這種蛋白質(zhì)展示出該病毒的這個(gè)區(qū)域的關(guān)鍵表位。單克隆抗體3H5通過(guò)用DV2制劑進(jìn)行免疫接種來(lái)獲得(&/2"7#(^e/c力a/5J，/#,^ra/c^;^，/a/iy/z7/7/efJ夕47JF/rwsw51//2^/z7(9/70c/o"a/<s"f/6otf7esJ/Z7/fro;yt/isd"7^.7j..i^《-J",并且以血清型-特異的方式識(shí)別在DIII上的表位(依賴于二硫橋的存在)。這種抗體有效地中和血清型2的病毒。公開(kāi)的數(shù)據(jù)表明，在這種mAb的中和活性和其抑制病毒與其細(xì)胞受體結(jié)合的能力之間存在高度相關(guān)性(7/2/2/s見(jiàn)，治's^/ai:J，"a/ai:"7f力e力w/z/a/2/^i/fra/yzi'/^"a/7f/60c^re57o/seags//25^c/e/3gi/ey/ri/sOTe2/#ecT.Wro/.C"7-〃)。這種抗體對(duì)于肽HDIII2Cs的特異性識(shí)別證明，該肽重現(xiàn)了具有極大功能重要性的Dili表面的地形表位。用于表征地形肽的工具之一是抗-肽血清的獲得和表征。為了收集支持下述假設(shè)的另外證據(jù)所設(shè)計(jì)的肽重現(xiàn)了該病毒中E蛋白的等價(jià)區(qū)域的抗原特征，使用HDIII2Cs-KLH綴合物作為免疫原而開(kāi)始免疫接種方案。該方案包括給10只BalbC小鼠皮下施用5劑HDIII2Cs-KLH綴合物。經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的血清的抗-肽滴度(1/2700)通過(guò)使用間說(shuō)明書(shū)第48/55頁(yè)接ELISA測(cè)定法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，其中用HDIII2Cs包被平板并比較免疫血清的反應(yīng)性與其免疫前對(duì)照的反應(yīng)性。為了評(píng)估肽HDII12Cs是否能夠引起構(gòu)象依賴性抗體應(yīng)答，施行斑點(diǎn)印跡測(cè)定法，其中將2片硝酸纖維素膜用PD5蛋白和肽HDIII2Cs(未修飾的或者還原的且脲甲基化的)進(jìn)行敏化(圖12C)。該測(cè)定法證明，在其二硫橋喪失后，關(guān)于血清對(duì)于PD5和該肽的識(shí)別的信號(hào)強(qiáng)度均減少。該測(cè)定法還證明，該肽被mAb3H5所識(shí)別，并且這種信號(hào)在該肽的還原和脲曱基化后喪失。最后，在Western印跡測(cè)定法中評(píng)估了抗-肽血清對(duì)于通過(guò)感染Vero細(xì)胞而獲得的病毒的識(shí)別，及其免疫沉淀35S—DV2的能力。在Western印跡中，抗-HDIII2Cs血清識(shí)別在與由mAb3H5所識(shí)別的條帶相同位置上的條帶，相應(yīng)于E蛋白的分子量(圖13A)。在與免疫前血清進(jìn)行溫育的膜上不存在信號(hào)，這證明經(jīng)由抗-肽應(yīng)答所介導(dǎo)的識(shí)別是特異性的。最后，抗-HDIII2Cs血清能夠免疫沉淀DV2的E蛋白(圖13B)。獲得的結(jié)果證明，HDIII2Cs肽模擬了DV2的E蛋白的DIII的二硫橋依賴性表位，以及通過(guò)二硫橋而施加給該肽的構(gòu)象限制對(duì)于在用這種抗原免疫接種后獲得的抗體應(yīng)答具有顯著影響。因此，肽的環(huán)化對(duì)于正確模擬這種表位的結(jié)構(gòu)是必需的。實(shí)施例7肽HDIII2CL是比肽HDIII2Cs更佳的表位結(jié)構(gòu)模擬物開(kāi)始免疫接種方案，以便確定肽HDIII2CL是否能夠引起比肽HDIII2Cs更佳的應(yīng)答，基于在病毒顆粒上的這種抗原區(qū)域的構(gòu)象特征來(lái)進(jìn)行評(píng)估。所述免疫接種方案還包括肽HDIII2Cs和pepDin-1(圖12A)。與先前方案相類似地，這個(gè)實(shí)驗(yàn)使用肽-KLH綴合物作為抗原，并且遵循實(shí)施例6中描述的相同的按劑量給藥和免疫接種途徑。所得到的抗-肽血清在間接ELISA測(cè)定法中進(jìn)行測(cè)試，其中以354種變體形式用PD5和P64k包被平板未修飾的、脲曱基化的、和還原的/脲甲基化的?？?HDIII2Cs和抗-HDIII2CL血清以構(gòu)象依賴性方式識(shí)別PD5蛋白，如由與還原的且脲曱基化的變體相比較而言當(dāng)使用未修飾的蛋白質(zhì)時(shí)具有更高的反應(yīng)性所證明的(圖14)。然而，二硫橋喪失對(duì)于該蛋白質(zhì)被抗-HDIII2CL血清的識(shí)別的影響高于抗-HDIII2Cs血清，并且更好地再現(xiàn)了對(duì)于通過(guò)用病毒制劑免疫接種小鼠而獲得的抗-DV2血清所看到的效應(yīng)(圖14)。這個(gè)結(jié)果顯示，導(dǎo)致獲得肽HDII12CL的再設(shè)計(jì)達(dá)到了在病毒情形中在DIII的這個(gè)區(qū)域中存在的構(gòu)象的更佳呈現(xiàn)。實(shí)施例8相應(yīng)于FG轉(zhuǎn)角的地形肽展示出針對(duì)DV的4種血清型的廣譜抑制用肽HIII2CL和HIII3CL來(lái)施行測(cè)定法(圖IIC、IOD和15)，以便估計(jì)它們模擬D111與細(xì)胞表面分子的相互作用的能力。該測(cè)定法使用生物素化的肽，以便促進(jìn)有助于借助于鏈霉抗生物素蛋白-FITC綴合物在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中來(lái)檢測(cè)它們。圖16描述了直方圖，其顯示了在與不同稀釋度的肽HIII2CL和HIII3CL以及無(wú)關(guān)肽(0.3-0.02mg/ml)進(jìn)行溫育后，細(xì)胞中焚光的行為。結(jié)果顯示，這兩種肽都以濃度依賴性方式結(jié)合細(xì)胞表面(圖16)，這暗示了該相互作用是特異性的。由肽HIII3CL所產(chǎn)生的直方圖中的移動(dòng)顯著大于由HIII2CL所產(chǎn)生的那種。這個(gè)結(jié)果表明，肽HIII3CL建立具有更高親和力的相互作用，這與下列事實(shí)相一致在這種分子中存在對(duì)于與A2MR受體相互作用而言可能重要的2個(gè)賴氨酸殘基(Lysll和Lysl4，圖10C和11D)，而在肽HIII2CL中它們之一不存在(Lysll，圖IOB和11C)。DIII具有E蛋白的暴露表面的最可變區(qū)域之一。事實(shí)上，這個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗原特征之一是，針對(duì)這個(gè)區(qū)域所獲得的抗體主要是血清型特異小生6勺(voe力r/g7T，Ao7i/zWJ，fe7//A6YJ夕夕《J^W3oc/o/2a/a/^/6ocT//a鵬/caK/ro/o^r2":W7-2《)。然而，在用不同DV血清型的抑制測(cè)定法期間，所述肽展示出廣語(yǔ)抑制活性，其有效抑制同種以及異種血清型的毒抹的感染(表3)。實(shí)際上，在測(cè)定濃度(0.1mg/ml)下，除了關(guān)于DV3的肽HIII4CL外，在其余測(cè)定點(diǎn)處均觀察到高于50%的抑制。表3.所設(shè)計(jì)的肽對(duì)于DV的4種血清型的抑制庶緒術(shù)紹則HDIII1CL++++HDIII2CL++++隨II3CL++++HDIII4CL+++/-+HDIII2Cs-一—一一—-—所顯示的結(jié)果相應(yīng)于在Vero細(xì)胞上施行的病毒噬斑數(shù)目減少測(cè)定法。肽以0.1mg/ml的濃度使用。所述符號(hào)表示與其中在未用所述肽進(jìn)行事先處理的情況下將細(xì)胞與病毒進(jìn)行溫育的對(duì)照相比較，在所述實(shí)驗(yàn)條件下病毒噬斑數(shù)目減少的程度。(+)50%或更高的減少，(+/-)噬斑數(shù)目的10-50%的減少，(-)噬斑數(shù)目的小于10%的減少。圖17呈現(xiàn)了另外的結(jié)果，其證實(shí)了所述肽針對(duì)同種和異種血清型的強(qiáng)有力的抑制活性。肽HDIII2CL達(dá)到了針對(duì)其同種血清型(DV2)病毒的60%的感染抑制，和針對(duì)DV1的80%的感染抑制(圖17B)。此外，肽HDIII3CL以與肽HDIII2CL相同或比其更高的效能抑制DV2感染(圖17C)。在這兩種測(cè)定法(圖17B和C)中，肽HDIII2CL和HDIII3CL具有比其余所測(cè)試的肽(3H5pept、NR3pep和pepDIII-l)明顯更佳的效應(yīng)?；谠诓煌現(xiàn)V的E蛋白之間的結(jié)構(gòu)相似性，設(shè)計(jì)了相應(yīng)于對(duì)于動(dòng)物和人健康重要的其他FV的相同DIII區(qū)域的肽(圖18):黃熱病毒56(Seq.ID.10)、西尼羅河病毒(Seq.ID.11)、日本腦炎病毒(Seq.ID.12)、蜱傳腦炎病毒(Seq.ID.13)、庫(kù)京病毒(Seq.ID.14)、玻瓦散病毒(Seq.ID.l5)、蘭加特病毒(Seq.ID.I6)、墨累山谷腦炎病毒(Seq.ID.17)和圣.路易腦炎病毒(Seq.ID.I8)。實(shí)施例9肽HDIII2CL改變A2MR和RAPR13與A2MR受體的相互作用為了獲得與A2MR受體的相互作用的直接證據(jù)，研究了所設(shè)計(jì)的肽之一對(duì)于A2MR的天然配體與Vero細(xì)胞的結(jié)合的影響。該測(cè)定法用熒光素化的A2M和RAPR13來(lái)進(jìn)行，其中測(cè)量在濃度增加的肽HDIII2CL存在下它們與Vero細(xì)胞的結(jié)合。與細(xì)胞結(jié)合的蛋白質(zhì)的量通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)估計(jì)，其中使用重組人EGF(rhEGF)作為該實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，因?yàn)橐阎猇ero細(xì)胞在其表面上表達(dá)EGF受體(Co;//,r/7e/&reKer51/67(3/Yag/He/^at/o/zo/*t力e邁2'foc力o/3ffr/a//zetvori:.j邁/腳"'o/Ce"腳"'o/.縱.C術(shù)-")。圖19顯示了肽HDIII2CL的存在如何增加與表面結(jié)合的A2M和RAPR13的量，然而，其對(duì)于rhEGF的結(jié)合沒(méi)有影響。用作該測(cè)定法的對(duì)照的肽3H5pept的存在不產(chǎn)生在與表面結(jié)合的RAPR13的量方面的變化。這些結(jié)果表明，肽HDIII2CL對(duì)于A2M和RAPR13與其細(xì)胞受體的相互作用的影響對(duì)于這些分子而言是特異性的。然而，觀察到的效應(yīng)是配體與細(xì)胞的結(jié)合增加而不是減少這一事實(shí)暗示，所述肽不結(jié)合與這些分子相同的在該受體上的位點(diǎn)。在那種情況下，觀察到的效應(yīng)可以歸因于由所述肽的結(jié)合所觸發(fā)的構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化有利于A2M或RAPR13的結(jié)合。通過(guò)由不同配體的結(jié)合所介導(dǎo)的別構(gòu)效應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)配體的相互作用是可能的，其中考慮到呈遞出這種受體的多個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(/，^Wci^a/K/("Ja^//w/zct/o/za/sca7e/7gera/2(Zsig/2a/2'/2greceptor.///jyesL7級(jí)'77夕K)。事實(shí)上，這種相同機(jī)制被用于解釋RAP對(duì)于A2MR配體的結(jié)合和/或內(nèi)在化的抑制，所述A2MR配體實(shí)際上結(jié)合與在A2MR結(jié)構(gòu)中由RAP所占據(jù)的那些結(jié)構(gòu)域明顯遠(yuǎn)離的A2MR結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例10激活的A2M對(duì)于DV感染的抑制由與病毒的溶液中相互作用所介導(dǎo)為了獲得DV與A2M的相互作用的進(jìn)一步證據(jù)，在Vero細(xì)胞感染抑制測(cè)定法中使用該蛋白質(zhì)的2種變體，即激活的和未激活的。將病毒制劑與激活的A2M的溶液進(jìn)行溫育，所述激活的A2M的濃度高于由這種蛋白質(zhì)變體所達(dá)到的生理學(xué)濃度。將等摩爾濃度的未激活的A2M和無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)的溶液用作陰性對(duì)照。在圖20A中觀察到，將病毒與濃度增加的激活的AM進(jìn)行預(yù)溫育以劑量依賴性方式阻斷了病毒感染。非常有趣的結(jié)果是在Vero細(xì)胞中抑制50%病毒感染的激活的A2M的濃度與對(duì)于激活的A〗M與DIIIE2:r蛋白的相互作用所測(cè)定的親和常數(shù)(kD10—'mol/L，參見(jiàn)實(shí)施例3和圖6D)相一致。這個(gè)結(jié)果暗示，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，感染的抑制是由激活的A2M與病毒的相互作用介導(dǎo)的，而不是由于竟?fàn)幗Y(jié)合細(xì)胞表面上的A2MR。激活的A2M還抑制Vero細(xì)胞的DV血清型1和3感染(圖20C)。為了證實(shí)感染的抑制是由于病毒與激活的A2M的溶液中相互作用，在與細(xì)胞進(jìn)行溫育之前將該蛋白質(zhì)的2種變體與病毒制劑溫育增加的時(shí)間間隔。圖20B中的結(jié)果顯示，抑制效應(yīng)依賴于溫育時(shí)間，這與由該蛋白質(zhì)與病毒顆粒的直接相互作用所介導(dǎo)的抑制相一致。有趣的是，對(duì)于長(zhǎng)于30分鐘的溫育時(shí)間，未激活的A2M使病毒感染增加高達(dá)50%。這個(gè)結(jié)果暗示，在溫育期間產(chǎn)生的少量的激活的A2M能夠增加感染效率。事實(shí)上，這種情況更好地反映了什么才是關(guān)于病毒與A2M在體內(nèi)的相互作用的實(shí)際生理學(xué)情況，其中由于A^R在清除AZM-蛋58白酶復(fù)合物方面的高效率，激活的A2M以痕量進(jìn)行循環(huán)(z/r,f力e/o^de/^/'f///poprofe/"rece/^or尸a邁7/ySi/^^esfed6/f力e/VcT/"/;7"e油cj^05"/sr"es./"/o/C/e瓜，..7《,-7卿(5"/7/rerf(c/fes//r/yo邁ed'sfed6/f力e7otrde/7S2'0"http:///70/rc^e2'/7rece;^or—re/afed;7rofe//2./^2.o/C力ey77.27夕.'。實(shí)施例11純化的A2MR抑制DV對(duì)Vero細(xì)胞的感染還研究了可溶性A2MR是否能夠抑制DV感染。為此，從健康供體的人血漿中純化出該受體的ot鏈，其中這種蛋白質(zhì)已知以3.7-10.8jag/mL^;濃度進(jìn)^t循環(huán)((w//7/7Gr/邁s/e/戶^Za/f尸，ra;7/7ery1/，^/o/27么'2"W-WJ)。300mL冷凍人血漿的樣品通過(guò)離子交換色譜法進(jìn)行預(yù)分級(jí)，其中使用填充有DE-52(Whatman,UK)并用Tris50mM，60mMNaCl，lmMEDTApH6平衡的柱。所述級(jí)分通過(guò)濃度增加的NaCl的階式梯度(stepgradient)來(lái)進(jìn)行洗脫，并且通過(guò)用生物素化的配體(即MeNH卜A2M和RAPR13)的配體印跡分析就A2MR的存在來(lái)進(jìn)行測(cè)試。使用鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶綴合物來(lái)檢測(cè)生物素化的配體的結(jié)合。將包含受體的級(jí)分逆緩沖液Tris50mM,120mMNaClpH7.4,ImMCaCI"0.05%Tween20進(jìn)行透析，并加栽到含固定的MeNH卜A2M的柱中，所述MeNH卜A2M是由LDLR家族成員中的A2MR唯一地識(shí)別的配體。在洗脫受體之前，柱用僅包含0.5MNaCl的平衡緩沖液進(jìn)行充分洗滌。關(guān)于A2MR的特異性洗脫，使用緩沖液Tris50mM，0.5MNaClpH6,10mMEDTA，0.05%Tween20(圖21A)。將來(lái)自親和色鐠法的不同級(jí)分逆PBSpH7.4，1mMCaCh進(jìn)行透析，并通過(guò)經(jīng)0.2jiM進(jìn)行過(guò)濾來(lái)滅菌。SDS-PAGE分析顯示出在2個(gè)級(jí)分(即用0.5MNaCl洗脫的級(jí)分，和相應(yīng)于用于A2MR洗脫的特異性條件的級(jí)分)中的區(qū)別性的蛋白質(zhì)條帶模式。后一個(gè)級(jí)分顯示出遷移至與A2MR的a鏈的分子量(400-500kDa)相一致的位置處的單個(gè)蛋白質(zhì)條帶(圖21B)。在DV2-噬斑減少中和測(cè)定法中在Vero細(xì)胞中評(píng)估這些親和色i普法級(jí)分。為此，將包舍100個(gè)感染性病毒顆粒的病毒制劑與不同級(jí)分以25pg/mL的蛋白質(zhì)濃度于25。C預(yù)溫育1小時(shí)。接下來(lái)，將病毒加入至Vero細(xì)胞單層中，并允許感染于37。C發(fā)生45分鐘。此后去除病毒/蛋白質(zhì)混合物，用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并且最后將細(xì)胞在高密度培養(yǎng)基中于37。C溫育5天。這個(gè)測(cè)定法的結(jié)果顯示，使用相應(yīng)于用于該受體的特異性洗脫的條件的級(jí)分有效地中和DV2感染(圖21C)。這個(gè)級(jí)分還在由致死劑量的DV2的顱內(nèi)感染所誘導(dǎo)的小鼠腦炎模型中展示出顯著的保護(hù)效應(yīng)(圖21D)。事實(shí)上，該保護(hù)水平類似于通過(guò)將病毒與有效的中和性mAb4G2(25網(wǎng)/mL)進(jìn)行預(yù)溫育所獲得的保護(hù)水平。實(shí)施例12肽HDIII3CL在小鼠模型中保護(hù)小鼠免于登革腦炎將登革腦炎的小鼠模型用于研究肽HDIII3CL保護(hù)不受DV2感染的潛能。12只小鼠的組用與15i!g和1.5jig肽HDIII3CL相組合的致死劑量的DV2進(jìn)行接種。作為陰性對(duì)照，使用這樣的肽，所述肽的組成為具有已知的糖胺聚糖結(jié)合活性的14個(gè)氨基酸的片段，隨后為與DV包膜蛋白無(wú)關(guān)的序列的16個(gè)氨基酸的片段。陰性對(duì)照肽以與肽HDIII3CL的最高劑量等摩爾的量進(jìn)行使用。另一個(gè)組用相同的病毒制劑(但與25ng/mL的mAb4G2進(jìn)行預(yù)溫育)進(jìn)行接種以作為保護(hù)的陽(yáng)性對(duì)照。如在圖22中可以觀察到的，對(duì)于用最高劑量的肽進(jìn)行接種的而言，肽HDIII3CL能夠保護(hù)56%的小鼠。相應(yīng)于1.5ug肽/動(dòng)物的組顯示出與肝素結(jié)合肽相似的保護(hù)水平，與用單獨(dú)的病毒進(jìn)行接種的組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異，如通過(guò)Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)(時(shí)序檢驗(yàn))所評(píng)估的。連同這種肽在體內(nèi)模型中能夠抑制DV感染的這一證據(jù)一起，肽異種血清型感染的能力。權(quán)利要求1.用于阻斷黃病毒感染的方法，其包括干擾病毒包膜蛋白與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的α2-巨球蛋白受體，或與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.2的α2-巨球蛋白的相互作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述黃病毒是登革病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒、西尼羅河病毒、庫(kù)京病毒、玻瓦散病毒、蘭加特病毒或圣路易腦炎病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中所述病毒蛋白質(zhì)的序列與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.1的序列具有至少60%的同源性。4.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中用于所述病毒的受體的序列的片段為下列片段之一位于在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的氨基酸殘基25-66、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中用于所述病毒的受體的序列的片段與下列片段中的任一個(gè)具有至少60%的同源性位于在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的氨基酸殘基25-66、或70-110、或852-892、或893-933、或934-973、或974-1013、或1014-1053、或1060-1099、或1102-1142、或1143-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中用于所述病毒的載體蛋白的序列與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID,2的序列具有至少60%的同源性。7.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾病毒包膜蛋白與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的相互作用的試劑是抗體，或所述受體的竟?fàn)幮耘潴w，或在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.26的序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾病毒包膜蛋白與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的相互作用的試劑通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)重組DNA技術(shù)，或從天然來(lái)源獲得。9.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾所述病毒與所述受體的相互作用的試劑是在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的肽中的任何肽。10.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾病毒相互作用的試劑是權(quán)利要求9中所描述的肽中任一種肽的化學(xué)修飾形式。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述肽具有由下式描述的化學(xué)結(jié)構(gòu)Nt-C1-F2—F3-F4-F5—F6-T7—T8-T9—T10-T11-T12-G13—G14-G15-G16—G17-C18-Ct，其中，Nt:是任選的N-末端延伸，與末端氨基共價(jià)鍵合的化學(xué)基團(tuán)，乙酰化，曱基化，肽，聚乙二醇，?；?；Cl:半胱氨酸(與C18處的另一個(gè)半胱氨酸形成二硫橋)，通過(guò)酰胺鍵與在位置C18處的谷氨酸/天冬氨酸(賴氨酸)的側(cè)鏈共價(jià)連接的賴氨酸(谷氨酸/天冬氨酸)；F2:絲氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸F3F4F5F6T7T8T9酪氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸；異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸；異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；甘氨酸；纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸;甘氨酸、谷氨酸；T10:谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、脯氨酸；Tll:賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷T12:谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸；T13:異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、笨丙氨酸、蘇氨酸；T14:賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸；T15:亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、組氨酸；T16:天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺；T17:色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；C18:半胱氨酸(與Cl處的另一個(gè)半胱氨酸形成二硫橋)，通過(guò)酰胺鍵與在位置Cl處的谷氨酸/天冬氨酸(賴氨酸)的側(cè)鏈共價(jià)連接的賴氨酸(谷氨酸/天冬氨酸)；Ct:是任選的C-末端延伸，與末端羰基共價(jià)鍵合的化學(xué)基團(tuán)，乙酰化，曱基化，肽，聚乙二醇，?；?。12.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中阻斷感染的試劑干擾在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.1的序列與一個(gè)或多個(gè)被定義為在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的配體結(jié)合斑片的殘基的相互作用。13.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求6、7、8、9、10和11的干擾病毒相互作用的試劑是藥物組合物的有效成分。14.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中所述病毒與所述受體的相互作用的所述干擾包括阻斷在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的蛋白質(zhì)的表達(dá)。15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中起干擾作用的試劑是干擾RNA的片段。16.根據(jù)權(quán)利要求7、8、9、10、11和12的干擾病毒相互作用的試劑的用途，所述用途為用于確定細(xì)胞和/或生物對(duì)于登革病毒感染的易感性。17.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾所述病毒與所述受體的相互作用的試劑通過(guò)下列方式獲得a)將在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的病毒受體與包含在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.1的病毒包膜蛋白和阻斷性化合物的制劑一起進(jìn)行溫育;b)定量與所述受體結(jié)合的所述病毒包膜蛋白；c)與在所述阻斷性化合物不存在下與所述受體結(jié)合的病毒包膜蛋白的量進(jìn)行比較。18.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾所述病毒與所述受體的相互作用的試劑通過(guò)下列方式獲得a)在反平行P發(fā)夾類型的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象中使用具有根據(jù)權(quán)利要求9和10的序列的肽的三維結(jié)構(gòu)模型的原子坐標(biāo)，所述反平行P發(fā)夾包括在p鏈之間的連接環(huán)中的卩轉(zhuǎn)角；b)使用在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的序列的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的三維結(jié)構(gòu)模型的原子坐標(biāo)，其已經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了確定或通過(guò)計(jì)算方法進(jìn)行了建模；c)分子對(duì)接的計(jì)算程序，其允許重現(xiàn)在18a中描述^結(jié)柄與在18b中描述的結(jié)構(gòu)的相互作用的原子細(xì)節(jié)；d)將18c的計(jì)算對(duì)接程序用于從分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇重現(xiàn)了在18c中描述的相互作用的特征的那些化合物作為病毒感染的阻斷劑。19.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾所述病毒包膜蛋白與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.2的序列的相互作用的試劑是抗體、或oc2-巨球蛋白的配體、或肽。20.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中干擾所述病毒包膜蛋白與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.2的序列的相互作用的試劑通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)重組DNA技術(shù)，或從天然來(lái)源獲得。21.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求17和16的干擾病毒相互作用的試劑是藥物組合物的有效成分。22.根據(jù)權(quán)利要求17和18的干擾病毒相互作用的試劑的用途，所述用途為用于確定生物對(duì)于登革病毒感染的易感性。23.根據(jù)權(quán)利要求9的肽，其在序列表中被標(biāo)識(shí)為Seq.ID.4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，其中所述肽是干擾所述病毒與所述細(xì)胞受體的相互作用的試劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23的肽，其中所述肽是干擾所述病毒與在序列表中標(biāo)識(shí)為Seq.ID.3的細(xì)胞受體的相互作用的試劑。25.根據(jù)權(quán)利要求23和24的肽，其中所述肽是具有抗病毒性質(zhì)的藥物組合物的有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及用于阻斷細(xì)胞的登革病毒感染的方法，所述方法包括干擾病毒包膜蛋白與細(xì)胞受體的直接或借助于載體蛋白的相互作用，以及涉及相關(guān)用途，其中所述細(xì)胞受體是α2-巨球蛋白受體，其也稱為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白或CD91，并且所述載體蛋白是人α2-巨球蛋白。文檔編號(hào)A61K39/00GK101472606SQ200780022485公開(kāi)日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年4月26日優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日發(fā)明者A·M·馬丁鄧恩,A·卡夫拉萊斯里科,A·姆薩池奧拉薩,A·桑切斯普恩特,G·R·帕德龍帕洛馬雷斯,G·奇內(nèi)亞圣地亞哥,H·E·加雷佩雷斯,L·J·岡薩雷斯洛佩斯,M·薩里亞努涅斯,N·弗萊塔斯薩拉薩爾,O·吉羅拉克魯斯,O·雷伊斯阿考斯塔,P·G·托萊多馬約拉,V·A·貝薩達(dá)佩雷斯,V·韋爾塔加林多申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心