專利名稱：：大部分為二天線、二唾液酸和非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因因子Ⅶ合成物的制作方法大部分為二天線、二唾液酸和非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物
背景技術(shù)：
：因子VII(FVn)是一種維他命K依賴糖蛋白，在其活化形態(tài)(FVIIa)下參與凝血過程，在存在鈣和組織因子的情況下活化因子x和因子ix。fvii以具有406個氨基酸殘基的單肽鏈形態(tài)分泌，其分子量約為50kDa。FVII包含四個特別的結(jié)構(gòu)域N端Y-羧基域(Gla)、兩個"類表皮生長因子(EGF)"域、以及絲氨酸蛋白酶域。將FVII活化為FVIIa是以精氨酸,52-異亮氨酸153域(精氨酸152-異亮氨酸153)連接的裂解為特征的。因此，F(xiàn)VIIa由具有分子量約為20kDa的具有152個氨基酸的輕鏈、和分子量約為30kDa的具有254個氨基酸的重鏈組成，兩條鏈通過單二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。血漿FVila(FVIIa，p)包含幾種翻譯后修飾前十個谷氨酸被，羧基化，Asp63(天冬氨酸)被部分羥化，Ser52(絲氨酸52)和Ser6o(絲氨酸60)被氧-糖基化，并攜帶葡萄糖(木糖)。-2和巖藻糖成分，分別地，Asn,45(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通過二天線的二唾'液酸化(bisialylated)的復(fù)合聚糖結(jié)構(gòu)而N-糖基化。FVII用于治療表現(xiàn)為因子Vin(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失的血友病病人，以及對于表現(xiàn)出凝血因子的其他缺失的病人，例如，F(xiàn)VII的先天性缺失。FVII還用于腦血管意外的治療。因此有必要獲得注射用FVIIa濃縮物。獲取FVIIa濃縮物的最古老的方法為從通過分餾所獲得的血漿蛋白質(zhì)中提純FVIIa。為這一目的，EP0346241描述了富含F(xiàn)VIIa的餾分的制備，其在吸附后獲得，接著洗提包含F(xiàn)VII、FVIIa以及其他蛋白質(zhì)的血漿蛋白質(zhì)的分餾副產(chǎn)物，即PPSB的預(yù)洗提液(P:凝血素或FII，P-轉(zhuǎn)變加速因子前體或FVII,S-斯圖亞特因子或FX,以及B-抗血友病因子B或FIX),其他蛋白質(zhì)例如為因子4IX(FIX)、X(FX)和II(FII)。這種方法的缺點(diǎn)是獲取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。同樣的，EP0547932描述了基本上不含維他命K依賴因子和FVIII的高純度FVIIa濃縮物的制備過程。通過這一過程獲得的FVII盡管其純度高，但仍表現(xiàn)出殘留的形成血栓活性。這些方法的主要缺點(diǎn)是它們只能獲得低產(chǎn)量的產(chǎn)品。而且，從獻(xiàn)血者采集的血漿的量仍然受到限制。因此，自從二十世紀(jì)八十年代，編碼人體因子VII的DNA被分離出來(Hagend"/.(1986);Proc.Natl.Acad.Sci.USA;Apr83(8):2412-6),并在哺乳動物BHK細(xì)胞(幼倉鼠腎)中進(jìn)行表達(dá)(EP0200421)。申請人提交的專利申請F(tuán)R0604872也描述了FVIIa在轉(zhuǎn)基因動物中的生產(chǎn)。通過這些生產(chǎn)方法獲得的蛋白在病毒或其他致病劑污染方面更為安全。而且，這些方法獲得蛋白具有基本序列，即在不同氨基酸之間的等同于基本人類序列的鏈。然而，人類血漿FVII包含復(fù)雜的翻譯后修飾前十個谷氨酸被Y-羧基化，Asp63(天冬氨酸63)被部分羥化，Ser52(絲氨酸52)和Ser6o(絲氨酸60)被氧-糖基化，并攜帶葡萄并i(木糖)。-2和巖藻糖成分，分別地，Asn^(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通過二天線的二唾液酸化(bisialylated)的復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。特別的，N-聚糖的加入(連接到天冬酰胺的聚糖)對于外源蛋白的蛋白質(zhì)的正確折疊、體內(nèi)體外穩(wěn)定性、生物活性以及藥代動力學(xué)(例如，生物處理能力)尤其重要。因此，全部或部分翻if后修飾的變化4吏得蛋白一方面有失活的危險，另一方面還有致免疫的風(fēng)險。目前，現(xiàn)有的重組或轉(zhuǎn)基因因子VII由于其在不同于人類系統(tǒng)中的表達(dá)，而表現(xiàn)出與人類血漿FVII不同的糖基化，該糖基化能導(dǎo)致針對重組蛋白的抗體的增加，從而導(dǎo)致其效率低于提純自人類血漿的人類FVII。因此，需要獲得治療性或預(yù)防性的FVIIa合成物，其功能性質(zhì)接近于提出自人類血漿的人類FVII,而且其生產(chǎn)方法能滿足該蛋白的大量需求。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明涉及一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物，該合成物的每個因子VII分子含有結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中，與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子VII合成物相比，大部分為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。申請人驚奇的發(fā)現(xiàn)，大部分為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物與具有較低比率的二唾液S吏化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII相比，即與大部分為二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII相比，其生物處理能力(biodisponibility)更強(qiáng)、清除率更低以及穩(wěn)定性更高。因此，與具有較低比率的二唾液酸化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物相比，即與大部分為單唾液酸化結(jié)構(gòu)的重組或轉(zhuǎn)基因FVII合成物相比，本發(fā)明的FVII可以以更低頻率以及以更低的用量提供給病人。生物處理能力指的是分散到血液循環(huán)中并尤其是因此易于到達(dá)出血位點(diǎn)的施加的FVII的百分比。清除率指的是完全純化的理論體積的百分率，即每時間單元不再含有FVII。換句話說，它對應(yīng)于在一時間單元區(qū)間內(nèi)完全不含物質(zhì)的流體的假定量。穩(wěn)定性指的是FVII在其完全有效的指定期間內(nèi)維持其化學(xué)、物理、微生物活性以及生物藥性的能力《二k線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu);〉指的是下列結(jié)構(gòu)A2結(jié)構(gòu)(二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化):唾液酸:半乳糖:N-乙酰葡糖胺(GlcNAc):甘露糖這些聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到由天冬酰胺145(Asnl45)和天冬酰胺322(Asn322)組成的N-糖基化位點(diǎn)。事實(shí)上，本發(fā)明的FVII象人類FVII—樣包含兩個位于145和322位置的N-糖基化位點(diǎn)和兩個位于52和60位置的O-糖基化A-」位點(diǎn)。在一個n-糖基化位點(diǎn)，寡糖鏈連接到一個天冬酰胺(n-連接)。在一個O-糖基化位點(diǎn)，寡糖鏈連接到一個絲氨酸。因此，本發(fā)明的FVII的每個分子包含兩個寡糖N-連接鏈。然而，合成物的FVII分子并不表現(xiàn)出均一的糖基化，即所有的N-連接寡糖鏈不相同。問題在于其為不同聚糖結(jié)構(gòu)的混合物。事實(shí)上，無論是血漿的、重組的還是轉(zhuǎn)基因的，任何FVII都是幾種FVII蛋白的混合物，這些蛋白表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，尤其是糖基化和指定糖形。該糖基化是一翻譯后過程，該翻譯后過程是由細(xì)胞單元通過在不同細(xì)胞分區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)移Fvn蛋白而實(shí)現(xiàn)的。這一生化修飾強(qiáng)烈的修飾了蛋白，最終的蛋白完美的被結(jié)構(gòu)化，并因此具有活性，而且能被有機(jī)體良好的耐受。這一化學(xué)修飾促進(jìn)了蛋白活性的調(diào)節(jié)和定位。因此，對于所有的FVII合成物以及所有的合成物中的N-連接寡糖鏈而言，fvii合成物中的每個聚糖結(jié)構(gòu)或者每個糖的比率能夠被量化。本發(fā)明中，不同聚糖結(jié)構(gòu)的比例并沒有考慮o-糖基化?！禙vn合成物》指的是一種合成物，該合成物中唯一的分子實(shí)體是Fvn,優(yōu)選是被活化了的。合成物中的每個FVII分子表現(xiàn)i相同的基本序列，但是不同分子的糖基化不同。因此，《fvii合成物》指的是具有相同基本序列的分子混合物，特征在于其聚糖結(jié)構(gòu)的含量。本發(fā)明中，術(shù)語《FVn》和《FVII合成物》是等同的。因此，本發(fā)明的內(nèi)容中，"Fvn"指的是fvii分子本身，或者指的是具有上述提到的特征的FVII分子混合物。本發(fā)明的Fvn合成物是一種主要含有二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的FVII合成物。這意味著在合成物的所有N-連接寡糖中，即在所有的連接到因子FVII的N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)中，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)占大多數(shù)。有利的，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于或等于30%、40%、50%、60。/。、70%、80%、90%、或者95%。特別有利的，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于或等于45%。特別有利的，二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率在45-60%之間，優(yōu)選的在50-60%之間。唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以通過HPCE-LIF分析(高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法)和/或NP-HPLC(正相高效液相色譜)確定，通過測量對應(yīng)于不同聚糖的峰的面積而進(jìn)行量化。唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率或者還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法確定。本發(fā)明FVII合成物也能含有少量的二天線、單唾液酸化結(jié)構(gòu)和三天線結(jié)構(gòu)，以及不表現(xiàn)出唾液酸的中性結(jié)構(gòu)?！吨亟M或轉(zhuǎn)基因Fvn》指的是通過基因工程獲得的任何Fvn,即通過細(xì)胞生產(chǎn)的FVII,通過基因重組對該細(xì)胞的DNA進(jìn)行修飾，以使其表達(dá)FVII分子并表現(xiàn)出所述的糖基化特征。因此，通過轉(zhuǎn)錄，接著在細(xì)胞宿主或轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)對編碼FVII的DNA分子進(jìn)行修飾，進(jìn)而獲得本發(fā)明的Fvn。本發(fā)明的重組或轉(zhuǎn)基因Fvn能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的允許在生物系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。更特別的，《重組vn》指的是在人工培養(yǎng)的細(xì)胞系中通過基因重組和表達(dá)獲得的任何FVII。例如，下列的細(xì)胞系BHK(幼倉鼠腎)和即BHKtk-tsl3(CRL10314,WaediterandBaserga,尸rac.7V^/.5W.L/SJ79:1106-1110.1982)、CHO(ATCCCCL61)、COS-1(ATCCCRL1650)、HEK293(ATCCCRL1573;Grahametal.,/Ge".Wro/.36:59-72,1977)、RatHepI(大鼠肝癌；AT(5cCRL1600)、RatHepII(大鼠肝癌；ATtCCRL1548)、TCMK(ATCCCCX139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)以及DUKX細(xì)胞(CHO細(xì)胞系)(UrlaubandChasin,iVoc.A^/.Jcad>SW.77:4216-4220，1980)、3T3纟田胞、Namalwa細(xì)胞、或者適于無血清培養(yǎng)基的BHK細(xì)胞(US6,卯3,06外而且，更特別的，《轉(zhuǎn)基因FVII》指的是通過在動物或者植物活體組織內(nèi)的基因重組和表達(dá)獲得的任何FVII。本發(fā)明的二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率能通過不同方法獲得。特別的，例如，本發(fā)明的FVII在能夠傳授所述的糖基化特征的微生物、細(xì)胞、植物或者動物內(nèi)表達(dá)，所述的糖基化特征即為大部分為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)。更特別的，例如，本發(fā)明的FVII在不能獲得主要為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的FVII合成物的微生物、植物或動物內(nèi)表達(dá)，接著在體外使用一個或多個酶進(jìn)行唾液酸化，以獲得所需的唾液酸化，即二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)成為占大部分，三天線結(jié)構(gòu)成為三唾液酸化結(jié)構(gòu)。例如，由于其良好的性質(zhì)，在合適的條件下，唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以用來在體外作用FVII合成物，以獲得需要的唾液酸化。因此，本發(fā)明的FVII合成物易于通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶對部分唾液酸化的FVII合成物(起始Fvn合成物)進(jìn)行作用獲得。有利的，起始Fvn合成物大部分為二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)。有利的，起始FVII合成物大部分為二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用允許在單唾液酸化結(jié)構(gòu)上^l妄枝一個另外的唾液酸，以將其轉(zhuǎn)換成二唾液酸化結(jié)構(gòu)。有利的，這些二天線、單唾液酸結(jié)構(gòu)在起始Fvn合成物中的比率高于40%,特別有利的，比率高于50%或者60°/。。有利的，起始FVII合成物中二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于20%,或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50。/。。有利的，起始FVII合成物中至少部分唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。優(yōu)選的，起始FVII合成物的所有唾液酸含有a2-6連接。在一特別的實(shí)施例中，如果起始FVII合成物包含太多比率的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，例如高于50%、或者高于60%,就有可能通過使用一個或多個允許對合成物去巖藻糖基化的酶而獲得二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)。例如，k用巖藻糖基酶經(jīng)過一段必須的時間，用+獲得大部分為二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。特別有利的，根據(jù)其低的免疫原性而選擇起始FVII合成物。有利的，起始合成物為專利FR0604872中所描述的FVII合成物，該專利也被視為包含在本申請文件中。有利的，本發(fā)明的FVII是一種多肽，其肽序列可以是天然人類FVII的肽序列，即存在于人類中的與FVII相關(guān)的沒有問題的序列。這樣的序列能夠被編碼，例如通過EP0200421所描述的序列l(wèi)b進(jìn)^"編碼。有利的，本發(fā)明的FVII序列為SEQIDNO:l序列.在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII可以是天然人類FVII的變異體，只要該變異體不比天然FVII更免疫原性。因此，該變異體的肽序列能表現(xiàn)出與天然人類FVII至少70。/。、有利的為至少80%或90%、更有利的為至少99%的同一性，該變異體具有與人類fvii基本相同的生物活性。而且，本發(fā)明的Fvn還指的是經(jīng)過修飾的任何Fvn序列，與天然人類FVii相比，該蛋白的生物活性降低。例如，用于治療或預(yù)防血栓形成的重組失活人類FVII,FFR隱FVIIa(Holst&a/"Eur丄Vasc.Endovasc.Surg"1998Jun,15(6):515-520)。這些FVII為多肽，其氨基酸序列不同于人類FVII的序列，該區(qū)別為一個或多個氨基酸的插入、刪除或替代。本發(fā)明的FVII的生物活性能夠通過使用FVII-缺陷血漿和凝血活酶測量FVII合成物引起血凝的能力而量化，例如US5997864所描述的。生物活性通過與對照樣品相比的凝血時間的減少來表達(dá)，轉(zhuǎn)化為與含有l(wèi)單元(1UFVII活性)/ml血清的標(biāo)準(zhǔn)人類血清對比的《FVn單元》。本發(fā)明的FVII合成物具有接近于血漿FVII的糖基化特征。事實(shí)上，血漿FVII(或者血漿FVII合成物)的主要N-聚糖結(jié)構(gòu)也是二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)。有利的，本發(fā)明的FVII合成物中二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)(巖藻糖基化的和非巖藻糖基化的)的比率高于30%、或者高于40%、或者高于50%。特別有利的，二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率高于60%、或者高于70%、或者高于80%、或者高于90%。特別有利的，二唾液酸化結(jié)構(gòu)(巖藻糖基化的和非巖藻糖基化的)的比率在50%-80%之間，或者在60%-90%之間，優(yōu)選的在70%-85%之間。有利的，本發(fā)明的FVI'I合成物的巖藻糖比率高于20。/。，有利的在26%-50%之間。這一比率相當(dāng)于測得的FVII合成物的所有聚糖結(jié)構(gòu)的巖藻糖比率。這一特征是本發(fā)明的FVII的優(yōu)勢之一。事實(shí)上，商購的重組FVII表現(xiàn)出100%的巖藻糖基化，而血漿FVII的巖藻糖基化比率大約為16。/。。因此，本發(fā)明的Fvn的巖藻糖基化接近于血漿Fvn的巖藻糖基化，這給本發(fā)明的Fvn帶來了無毒的優(yōu)勢。有利的，本發(fā)明的因子VII合成物中至少部分唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。因此，本發(fā)明的FVII合成物的含有a2-6連接的唾液酸的比率不為0。而這在血漿FVII中也含有，相對于商購的重組FVII僅包含含有a2-3連接的唾液酸，這為本發(fā)明的一個優(yōu)勢。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物中所有的唾液酸含有a2-6連接。特別有利的，所有的唾液酸含有a2，6連接，即為所有的唾液酸都通過a2,6連接結(jié)合到半乳糖，而且，特別的至少90。/。的FVn的唾液酸含有a2,6連接。而且，本發(fā)明的FVII合成物包含含有a2-3連接的唾液酸。10事實(shí)上，合成物的FVII的唾液酸中含有a2，6分支是本發(fā)明FVII的優(yōu)勢之一。實(shí)際上，商購的重組FVII的唾液酸僅含有a2,3連接。血漿FVII是這兩種異構(gòu)體的混合物。這樣，血漿FVII含有例如為40%的a2,3異構(gòu)體和60。/。的a2，6異構(gòu)體。然而，由于本發(fā)明的FVII含有更多的a2,6連接，這使得本發(fā)明的FVII更接近于血漿FVII。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物的一些唾液酸含有a2-3連接。因此，本發(fā)明的一個特別實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且含有a2-6連接的唾液酸的比率高于90%。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子VII相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且含有a2-6連接的唾液酸的比率為100%。本發(fā)明的一個特別的實(shí)施例中，合成物的重組或轉(zhuǎn)基因FVII與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，且FVII合成物的巖藻糖比率在20。/。-50%之間。本發(fā)曰月的一個特別的實(shí)施例中，合成物的重組或fe基因Fvn與所有聚糖結(jié)構(gòu)結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的因子vn相比，大部分二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)，所有的唾液酸含有a2-6連接，且FVII合成物的巖藻糖比率在20%-50%之間。有利的，本發(fā)明的Fvn合成物易于通過非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物生產(chǎn)。因此，在這一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII合成物被認(rèn)為為《轉(zhuǎn)基因》。轉(zhuǎn)基因哺乳動物指的是任何非人類哺乳動物，基因改變后用于表達(dá)一外源蛋白，例如兔、山羊、小白鼠、大鼠、牛、馬、豬、昆蟲、綿羊，該列舉為非限制性的。外源蛋白為Fvn,優(yōu)選為人類Fvn。非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物除了表達(dá)Fvn外，還能表達(dá)一外源酶，以對轉(zhuǎn)基因FVII進(jìn)行需要的唾液酸化。由于這個原因，非人類轉(zhuǎn)基因動物能共同表達(dá)編碼Fvn的基因和編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因。本發(fā)明的一特別的實(shí)施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因FVII在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳腺中表達(dá)，并在其奶中生產(chǎn)。由于這個原因，轉(zhuǎn)基因表達(dá)以組織依賴的方式，通過能保證在動物的乳腺中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的啟動子實(shí)現(xiàn)。例如為WAP啟動子(乳清酸蛋白)、酪蛋白啟動子、尤其是(3-酪蛋白或a-酪蛋白啟動子、(3-乳球蛋白啟動子、a-乳if求蛋白啟動子，該列舉是非限制性的。'有利的，本發(fā)明的FVII合成物易于通過轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)，所述合成物還經(jīng)受體外唾液酸化，以使其大部分為二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)。由于兔對朊病毒不敏感，尤其是對可轉(zhuǎn)移的海綿狀亞急性腦病這一主要7>共健康問題不敏感，因而兔是用于生產(chǎn)藥用蛋白的特別有利的物種。而且，兔和人之間的種間屏障也是重要的。相反，人和倉鼠之間的種間屏障的重要性要低，其中倉鼠是生產(chǎn)商購重組FVII的生物系統(tǒng)。括非傳統(tǒng)朊病毒致病劑。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII為在轉(zhuǎn)基因雌兔的乳腺中生產(chǎn)。通過乳腺分泌感興趣的蛋白，允許分泌物進(jìn)入轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，其包含以組織依賴方式對重組蛋白表達(dá)的控制。表達(dá)的組織控制是由于允許蛋白表達(dá)到動物的特定組織的序列而實(shí)現(xiàn)的。這些序列即為啟動子序列以及信號肽序列。驅(qū)動感興趣蛋白在乳腺中表ii的啟動子例如為WAP啟動子(乳清酸蛋白)、酪蛋白啟動子、尤其是p-酪蛋白或a-酪蛋白啟動子、(3-乳球蛋白啟動子、a-乳球蛋白啟動子，該列舉是非限制性的。一個特別有利的方式，在雌兔乳腺中的表達(dá)是在(3-酪蛋白啟動子的控制下進(jìn)行的。在轉(zhuǎn)基因動物奶中生產(chǎn)重組蛋白的方法包括下列步驟包含編碼人類FVII的基因的DNA分子的合成，該基因在天然分泌蛋白到奶中的啟動子的控制下，集成到非人類哺乳動物的胚胎中。該胚胎接著被植入到相同種類的雌性哺乳動物中。一旦從胚胎獲得的哺乳動物生長足夠了，其會分泌乳汁，接著收集奶。奶中包含感興趣的轉(zhuǎn)基因FVII。EP0264166描述了在非人類雌性哺乳動物的奶中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白的例子，其給出的教導(dǎo)可用于本發(fā)明FVII的生產(chǎn)。EP0527063描述了在非人類雌性哺乳動物的奶中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因蛋白的另一個例子，其給出的教導(dǎo)可用于本發(fā)明FVII的生產(chǎn)。含有a2-6連接。一個特別優(yōu)選的方式，所有的唾液酸含有ot2,6連接，尤其是，至少90%的FVII的唾液酸含有oc2,6連接。而且，本發(fā)明的FVII合成物可以包含含有a2-3連才妄的唾液酸。特別有利的，含有a2-6連接的唾液酸的比率高于60。/。、或者高于70%、80%、或者90%。特別的，該比率在60-90%之間。在雌兔中表達(dá)的Fvn合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大部分是非巖藻糖基化的。有利的，這些二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚^"結(jié)構(gòu)在FVII合成物中的比率高于20。/。。有利的，這一比率高于25%、或者高于40%。本發(fā)明的一個實(shí)施例中，本發(fā)明的合成物中FVII的巖藻糖基化比率在20-50%之間。本發(fā)明的另一實(shí)施例中，這一比率低于15%。從雌兔種獲得的轉(zhuǎn)基因FVII包含數(shù)個翻譯后修飾前九個或十個N-端谷氨酸被Y-羧基化，Asp63(天冬酰胺63)被部分羥化，Sers2(絲氨酸52)和Ser6。(絲氨酸60)被氧-糖基化，并分別攜帶葡萄糖(木糖)?！?和巖藻糖成分，Asm45和Asn322主要通過二天線、單唾液酸化的聚糖復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。FR0604872描述了在雌兔乳腺中生產(chǎn)這樣的FVII合成物，'其內(nèi)容并入本教導(dǎo)中。通過轉(zhuǎn)基因哺乳動物在奶中生產(chǎn)FVII可以使用本領(lǐng)域公知技術(shù)來從奶中純化。例如，US6，268，487中描述了從奶中純化感興趣蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)將奶通過具有足夠孔隙度的膜進(jìn)行切向過濾，以形成滯留物和透過物，透過物含有外源蛋白，b)對透過物用利用色鐠的采集裝置進(jìn)行處理，以轉(zhuǎn)移出外源蛋白并獲得一流出物，c)合并流出物和滯留物，d)重復(fù)步驟a)到c)直到分離脂中的FVII、酪蛋白膠粒，并直到FVII應(yīng)被回收至少75%。申請人提交的FR0604864中描迷了另一個從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中生產(chǎn)的Fvn的純化技術(shù)，并引入其內(nèi)容以供參考。對含在轉(zhuǎn)基因動物奶中的Fvn的提取和純化方法(方法A),包含下列步驟a)從奶中提取Fvn,因子vn與所述奶中4丐的有機(jī)和/或無機(jī)鹽和/或復(fù)合物相結(jié)合，通過向奶中加入可溶性鹽來獲得釣化合物沉淀，其陰離子具有能形成所述不溶鈣化合物以用這種方式從所述鹽和/或復(fù)合物中釋放因子vn,因子VII存在于液相中；b)把富含蛋白的液相從鈣化合物沉淀中分離，所述液相再被分離成脂相和含有蛋白的水性非脂相；C)對水性非脂相進(jìn)行親和層析步驟，該步驟使用預(yù)定濃度的基于磷酸鹽的洗脫緩沖液；d)對根據(jù)步驟c)獲得的因子vn洗提液進(jìn)行兩次或三次弱堿性陰離子交換柱的層析步驟，使用適合于對保留在所述柱上的因子vn進(jìn)行連續(xù)洗提的緩沖液。事實(shí)上，申請人驚奇的注意到，即使置于在抗乳血清中天然生產(chǎn)的蛋白啟動子的控制下，例如，在WAP啟動子或(3-酪蛋白啟動子的控制下，F(xiàn)VII仍然易于與奶中的釣離子結(jié)合，并因此易于與酪蛋白膠束結(jié)合。申請人提交的FR0611536中描述了另一個對從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中生產(chǎn)Fvn的純化技術(shù)，并引入其內(nèi)容以供參考。對含在轉(zhuǎn)基因動物奶中的Fvn的提取和純化方法(方法B)，包含下列步驟a)撇清并脫脂所述奶；,b)在能允許所述蛋白保留在所述載體上的pH條件下，將含有所述蛋白的撇清脫脂部分進(jìn)行通過層析載體，該層析載^具有表現(xiàn)出疏水和離子特性的接枝配體；c)蛋白的洗提；d)通過從所述洗提部分中移除奶蛋白，對洗提部分進(jìn)行純化；并且e)回收所述蛋白。當(dāng)通過轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)FVII合成物時，對其進(jìn)行體外唾液酸化，以使二天線、二唾液酸化結(jié)構(gòu)占多數(shù)。在本發(fā)明的一個特別的實(shí)施例中，唾液酸化是通過1"吏用唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的，例如a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(或者(3-D-半乳糖-pi,4-N-乙?；?P-D-氨基葡萄糖-a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)、或者半乳糖(31,3乙酰氨基半乳糖a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者半乳糖-(31,3(4)-乙酰氨基半乳糖-a2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者乙酰氨基半乳糖a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I，這些酶都是商購的。優(yōu)選的，使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種能允許通過a2,6連接轉(zhuǎn)移唾液酸的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。事實(shí)上，有利的，本發(fā)明的FVII合成物具有包含a2-6連接的唾液酸，因?yàn)樵摦悩?gòu)體在血漿FVII中更多。唾液酸化可以4吏用唾液S吏供體底物進(jìn)行，例如，唾液酸或者任何含有一個或多個唾液酸基團(tuán)并易于釋放唾液酸基團(tuán)的分子。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，如果酶為a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，底物為胞苷—5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，該底物在一適合于唾液酸,人唾液酸供體基團(tuán)轉(zhuǎn)移到FVII的反應(yīng)介質(zhì)中，二天線、二唾液酸結(jié)構(gòu)成為主要。該反應(yīng)介質(zhì)可以為基于例如由嗎啉-3-丙磺酸組成的緩沖液，以及基于例如為吐溫的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施例，底物可以在反應(yīng)介質(zhì)中合成，該介質(zhì)中包括胞苷單磷酸(CMP)-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及能使得反應(yīng)發(fā)生的足夠量的二《介金屬陽離子。例如，二價金屬陽離子為鈣離子、鋅離子、鎂離子、鉻離子、銅離子、鐵離子或者鈷離子。無論什么方法應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)FVII合成物的唾液酸化，反應(yīng)總是在足夠的時間和合適的條件下進(jìn)行，以使得二唾液酸化結(jié)構(gòu)增加到足夠以占大多數(shù)。只供參考的是，反應(yīng)可以至少進(jìn)行0.5小時，且尤其是至少5小時，特別有利的是7小時、或者8小時、9小時、甚至10小時。優(yōu)選的，培育在夜間進(jìn)行。特別的，該反應(yīng)進(jìn)行的時間在5小時到12小時之間。有利的，本發(fā)明的合成物的FVII是活化的(FVIIa)。由于這個原因，跟據(jù)FVII(未活化的)代表FVIIa與組織因子的相互作用，F(xiàn)VIIa能表現(xiàn)出凝固能'力高于FVII(未活化的)25-100倍。FVII體'夕卜的活化是通過用二硫鍵連接的兩個鏈中的不同的蛋白酶(FIXa,FXa,FVIIa)對酶原的分裂得到的。FVIIa單獨(dú)表現(xiàn)出非常弱的酶活性，但是和輔因子復(fù)合時，組織因子(TF)通過活化FX和FIX而觸發(fā)凝固過程。FVIIa是負(fù)責(zé)止血的凝固因子，例如在帶有循環(huán)抗體的血友病中。在一特別有利的方式中，本發(fā)明的FVII完全被活化。有利的，本發(fā)明的FVIIa包含數(shù)個翻譯后修飾前九個或十個N-端谷氨酸被Y-羧基化，AspM被部分羥化，Ser52和Ser6()被氧-糖基化，并分別攜帶葡萄糖(木糖)。-2和巖藻糖成分，Asn!45和Asri322主要與二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖復(fù)合結(jié)構(gòu)而被N-糖基化。FVII的活化也能由一體外的方法獲得，例如，通過本發(fā)明的FVII的純化(參見實(shí)施例2)。因此，F(xiàn)VIIa由具有分子量約為20kDa的具有152個氨基酸的輕鏈、和分子量約為30kDa的具有254個氨基酸的重鏈組成，兩條鏈通過單二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。因此，本發(fā)明的FVII是一種活化的FVII,其活性和結(jié)構(gòu)接近于血漿FVII。通過與組織因子(TF)的相互作用，F(xiàn)Vna表現(xiàn)出的凝血凝力高于FVII25-IOO倍。15本發(fā)明的一個實(shí)施例中，F(xiàn)VII能被因子Xa、VIIa、IIa、IXa和XIIa體外活化。本發(fā)明的FVII也能被其自身的純化過程活化。本發(fā)明的另一個目的是使用本發(fā)明的FVII合成物作為藥物。本發(fā)明的另一目的是將根據(jù)本發(fā)明的因子VII合成物用于制備用于治療血友病病人的藥物。出血性創(chuàng)傷的藥物。本發(fā)明的另一目的是將根據(jù)本發(fā)明的因子VII合成物用于制備用于治療由于抗凝藥過量而出血的藥物。本發(fā)明的另一目的是一種含有根據(jù)本發(fā)明的因子VII和賦形劑和/或藥物可接受載體的藥物合成物。本發(fā)明的另一目的是用于制備重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物的方法，該合成物的每個因子VII分子包含連接到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，所述合成物的所有因子VII分子中，二天線、二唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)，包括一唾液酸化步驟，通'過將如上所述的部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或t組因子VII合成物與唾液酸供體底物和唾液酸轉(zhuǎn)移酶在合適的保留唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，經(jīng)過足夠時間和在合適的允許從唾液酸供體底物向FVII轉(zhuǎn)移唾液酸的條件下，所述二唾液酸化結(jié)構(gòu)增長到足夠占大多數(shù)。進(jìn)行反應(yīng)的條件如上和實(shí)施例中所述?！恫糠滞僖核峄分傅氖荈VII合成物的連接到N的聚糖結(jié)構(gòu)未全被二唾液酸化，即有些結(jié)構(gòu)為單唾液酸化。有利的，這些二天線、單唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率高于40%，特別有利的高于50%,或者高于60%。有利的，二天線、單唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的比率高于20%，或者尤其是高于30%、高于40%或者高于50%。有利的，唾液酸轉(zhuǎn)移酶為a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(或者(3"0-半乳糖-(31，4-N-乙酰基-(3-D-氨基葡萄糖-ct2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)、或者半乳糖(31,3乙酰氨基半乳糖a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者半乳糖-(31,3(4)-乙酰氨基半乳糖-a2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或者乙酰氨基半乳糖a2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I。優(yōu)選的，使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一種能允許通過a2，6連接轉(zhuǎn)移唾液酸的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。事實(shí)上，本發(fā)明的FVII合成物具有包含a2-6連接的唾液酸是一種優(yōu)勢，因?yàn)樵摦悩?gòu)體在血漿FVII中更多。唾液酸化能用任何唾液酸供體底物進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，如果酶為a2，6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，底物為刀包苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，該底物在一適合于唾液酸,人唾液酸供體基團(tuán)轉(zhuǎn)移到FVII的反應(yīng)介質(zhì)中，二天線、二唾液酸結(jié)構(gòu)成為主要。反應(yīng)介質(zhì)可以是基于生物兼容的表面活性劑混合物，例如濃度為0.01%到0.2。/。的Tween⑧80或Triton⑧X-100或者上述的混合物，或者濃度為5mM-10mM之間的二4介金屬陽離子，優(yōu)選的例如為Ca"、Mn2+、Mg2+、或Co2+、Ca2+。該反應(yīng)介質(zhì)還能進(jìn)一步包括離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑和/或保持介質(zhì)pH的試劑，例如從40mM到60mM之間不同濃度的二鉀砷酸鈉、嗎啉-3-丙磺酸、Tris和NaCl。pH值典型的為6-7.5之間。反應(yīng)介質(zhì)能進(jìn)一步包含濃度范圍在0.05-0.15mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)。根據(jù)另一實(shí)施例，底物可以在反應(yīng)介質(zhì)中通過向該介質(zhì)中可I入CMP-唾液酸合成酶、唾液酸、CTP(胞苷三磷酸)以及足夠量的二價金屬陽離子而合成，例子如上所述。無論應(yīng)用什么方法來實(shí)現(xiàn)Fvn合成物的唾液酸化，反應(yīng)總是在足夠的時間和合適的條件下進(jìn)行，以使得二唾i酸化結(jié)構(gòu)增加到足夠以占大多數(shù)，如前所定義。當(dāng)方法使用一固定化酶，反應(yīng)時間優(yōu)選在0.5-3小時之間，有利的，溫度在4-37。C之間，優(yōu)選的在4-20。C之間。當(dāng)方法在一間歇反應(yīng)中進(jìn)行，反應(yīng)時間優(yōu)選在l-9小時之間，優(yōu)選的在l-6小時之間，反應(yīng)溫度有利的在4-37。C之間，優(yōu)選的在4-20。C之間。優(yōu)選的，本發(fā)明的方法的目的是提高部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或重組因子VII合成物的生物處理能力。該生物處理能力的提高是通過將所述合成物與唾液酸供體底物、唾液酸轉(zhuǎn)移酶接觸而獲得的，如前所闡述?！短岣呱锾幚砟芰Α分傅氖桥c唾液酸化沒有被修飾的相同的FVII合成物相比，F(xiàn)VII合成物的生物處理能力提高了至少5。/。、或者至少10%、或者有利的至少30%或50%、優(yōu)選的至少80%或90%。在另一特別的實(shí)施例中，在唾液酸化步驟之前，進(jìn)行半乳糖基化步驟。該步驟的目的是在半乳糖-缺陷的結(jié)構(gòu)上接枝半乳糖，半乳糖-缺陷的結(jié)構(gòu)即為FVII的無半乳糖(agalactosylated)和單半乳糖結(jié)構(gòu)，半乳糖被固定到GlcNAc上，并且易于在接下來的唾液酸化步驟中易于固定唾液酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人17員公知的是，該半乳糖基化步驟可以通過使用半乳糖基-轉(zhuǎn)移酶在包含UDP-gal尿苦(5'-二磷酸半乳糖)的反應(yīng)介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)，有利的，部分唾液酸化的FVII合成物的大部分聚糖結(jié)構(gòu)是一復(fù)合的二天線、單唾液酸化型。這些聚糖結(jié)構(gòu)如下圖所示唾液酸半乳牆N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)甘露糖巖藻糖本發(fā)明的一個特別的實(shí)施例中，部分唾液酸化的FVII合成物中還包括二天線非唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)、三天線非唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)、以及二唾液酸化(巖藻糖基化或非巖藻糖基化)的復(fù)合結(jié)構(gòu)。有利的，在部分唾液酸化的FVII的合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大部分聚糖結(jié)構(gòu)是非巖藻糖基化的。有利的，部分唾液酸化的FVII合成物表現(xiàn)出至少部分唾液酸包含a2-6連接，如前所述。優(yōu)選的，方法還包括在唾液酸化步驟之前的，通過轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因FVII合成物的步驟。該步驟也如前所述。該步驟還可以在半乳糖基化步驟之前進(jìn)行。有利的，部分唾液酸化FVII合成物的FVII是活化的?；Y(jié)構(gòu)占大多數(shù)。有利的，唾液酸供體基團(tuán)是胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸，唾液酸轉(zhuǎn)移酶是oi2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。這樣的部分唾液酸化FVII合成物可以是在轉(zhuǎn)基因雌兔的乳腺中生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因FVII合成物。特別有利的，部分唾液酸化的FVII合成物為專利FR0604872中所描述的合成物，該專利的內(nèi)容也被視為包含在本申請文件中。本發(fā)明優(yōu)勢的更多方面將在下列實(shí)施例中描述，這些實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制?？s略語FVII-Tg=FVIIa-Tg:根據(jù)本發(fā)明的活化的轉(zhuǎn)基因FVIIFVII-r=FVIIa-r:商購的重組活化FVIIFVII-p=FVIIa-p:血漿來源的活化的FVII,即/人人類血漿中純化得到的MALDI-TOF:基質(zhì)輔助i敫光解片斤電離-飛4亍時間iffCE-LIF:高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光'ESI-MS:質(zhì)譜-電離《電噴霧》LC-ESIMS:液相色語-質(zhì)譜-電離《電噴霧》NP-HPLC:正相高效液相色譜PNGaseF:肽N-糖普酶FLC-MS:液相色譜-質(zhì)譜圖1:對實(shí)施例1中獲得的FVII合成物的提取與純化圖2'.攜帶N-糖基化位點(diǎn)的肽的去巻積(deconvoltuted)質(zhì)譜ESI圖3:通過PNGaseF對FVII去糖基化之后的HPCE-LIF的電泳圖譜圖例頂端電泳圖FVIIa,p;兩條中央電泳圖語FVII-Tg;底端電泳圖FVIIa，r圖4:用NP-HPLC得到的FVII特征；圖例最上面色鐠圖FVIIa,p;中間色譜圖FVII-Tg;底端色譜圖FVIIa,r圖5:使用MALDI-TOFMS對FVII-Tg的主要聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定圖6:使用MALDI-TOFMS對FVIIa,r的主要聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定圖7:體外再次唾液酸化的HPCE-LIF分析天然FVII-Tg的寡糖圖(底端)；再次唾液酸化后的FVII-Tg的寡糖圖(頂端)圖8:根據(jù)二天線二唾液酸化非巖藻糖基化(A2)的和巖藻糖基化的(A2F)結(jié)構(gòu)隨時間的百分比的FVII-Tg唾液酸化動力學(xué)圖9:在兔中初步PK(藥代動力學(xué))比較研究的結(jié)果轉(zhuǎn)基因非唾液酸化FVII(FVIITgNRs)與轉(zhuǎn)基因唾液酸化FVII(FVIITgRS)比較消除的半對數(shù)曲線具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:在轉(zhuǎn)基因雌兔的奶中生產(chǎn)人類FVII蛋白首先，通過將WAP基因序列引入(在文件Devinoyda/,NucleicAcidsResearch,vol.16,no.16,25August1988,p.8180中描述)到p-polyIII-I載體的多連接子中(在文件Lathe&Gene(1987)57,193-201中描述)而制備質(zhì)粒pl。從質(zhì)粒pl獲得的質(zhì)粒p2，包含兔的WAP基因啟動子和人類FVII的基因。轉(zhuǎn)基因雌兔通過傳統(tǒng)的顯孩t注射技術(shù)(Brinster&a/，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，4438-4442)獲得。包含500份基因拷貝的l-2pl被注入鼠胚胎的雄原核中。包含重組基因的該質(zhì)粒的Not1-Notl片段被顯微注射。之后，胚胎被轉(zhuǎn)移到激素制備的繼承性雌性的輸卵管中。約10%的被操作的胚胎產(chǎn)生幼兔，而2%到5%的被操作的胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的幼兔。轉(zhuǎn)基因的存在通過對提取自兔尾的DNA進(jìn)行Southem轉(zhuǎn)換技術(shù)來顯示。動物血液中以及奶中FVII的濃度通過特異性放射免疫檢測得到計(jì)算。FVII的生物學(xué)活性通過將奶加入到細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)或者兔哺乳動物外植體培養(yǎng)介質(zhì)中而進(jìn)行評估。實(shí)施例2:對獲得的FVII的提取和純化a)FVII的提取取500ml全原奶，用9倍體積的0.25M、pH8.2的磷酸鈉稀釋。室溫下攪拌30分鐘后,對富含F(xiàn)VII的水相在15。C下10000g離心l小時(離心機(jī)SorvallEvolutionRC-6700rev/min-轉(zhuǎn)子SLC-6000)。約835ml的6罐是必需的。離心后，存在三個相在表層的脂相(乳脂)，清澈富含F(xiàn)VII的水性非脂相(主要相)以及剩余的白色固相(不溶性酪蛋白和鈣化合物沉淀)。20通過蠕動泵收集富含F(xiàn)VII的水性非脂相，直至脂相。脂相單獨(dú)回收。固相(沉淀)；波去除。然而，水性非脂相仍然含有非常少量的脂，對其通過一系列過濾器進(jìn)行過濾(PallSLK7002U010ZP-孔徑為1pm的玻璃纖維預(yù)濾器-之后PallSLK7002NXP-孔徑為0.45fmi的尼龍66)。在過濾的最后，脂相通過該過濾系列，奶中的脂肪球被完全截留，且濾出液是清澈的。過濾過的非脂水相接著在超濾膜上進(jìn)行透析(MilliporeBiomax50kDa-0.1m2)以使其與層析相相容。分子量約為50kDa的FVII不濾過該膜，這與奶中的鹽、糖以及肽不同。第一時間內(nèi)，溶液(約5000ml)被濃縮到500ml,接著維持這個恒定體積，通過超濾膜透析以去除電解質(zhì)，并制備用于層析步驟的生物材料。透析緩沖液是0.025M的磷酸鈉緩沖液，pH8.2。含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含F(xiàn)VII-tg的抗乳血清中。該制備物在后繼處理前被保存于-30°C。這步的FVII的總回收率非常令人滿意90%(用磷酸鹽提取91%+透析/濃縮99%)。這一^得到的包含F(xiàn)VII的非脂水相完全清澈，并i于后續(xù)層析步驟。在這一步中，提取了大約93000IU的FVII-Tg。制備的FVII的純度在0.2。/。的級別。b)FVII的純化1.羥磷灰石膠上的層析(親和層析)用BioRad陶資羥磷灰石I型膠(CHT-I)填充Amicon90柱(直徑9cm-橫截面64cm2)。該膠用水性緩沖液A平衡，A由0.025M磷酸鈉和0.04氯化鈉的混合物組成，pH8.0。存于-30。C的所有制備物用水浴在37。C解凍，直到冰塊完全溶解，接著注入到膠上(直線流動速率100cm/h,即105ml/min)。未保留的部分利用緩沖液的通過而去除，直到回到基線(RBL),該緩沖液由0.025M磷酸鈉和0.04M氯化鈉組成，pH8.2。含有FVII-Tg部分用緩沖液B實(shí)施洗提，該緩沖液由0.25M磷酸鈉和0.4M氯化鈉組成，pH8.0。收集洗提部分，直到回到基線。通過波長(X)為280nm處的吸收測量檢測該化合物。該層析可以回收超過90y。的FVI1-Tg,同時去除超過95%的乳蛋白。該特異活性(S.A.)增加了25倍。在這一步，可獲得約85000IU的FVII-Tg,純度為4%。2.1OOkDa切向過濾以及50kDa濃縮/透析前一步驟得到的所有的洗提液在切向才莫式下通過1OOkDa超濾膜(PallOMEGASC100K-0.1m2)過濾。FVII濾過100kDa的膜，同時分子量超過100kDa的蛋白不能濾過。之后，濾過的部分一皮進(jìn)一步濃縮到約500ml體積，接著如前所述，在50kDa的超濾器上透析。透析緩沖液使用0.15M的氯化鈉。在這階段的處理中，產(chǎn)品在進(jìn)行離子交換層析前被保存于-30。C。這一階段可以減少分子量超過100kDa蛋白的量，并且尤其是酶前體。在100kDa膜上的處理可以截留留約50。/。的蛋白，其中為高分子量蛋白，同時濾過95%的FVn-Tg,即濾過82000IU的FVII-Tg。該處理可以減少后續(xù)步驟中的蛋白酶水解的風(fēng)險。3.在Q-S印harose⑧FF上的層析(步驟d)-方法A這在離子交換膠Q-SepharoseFastFlow(QSEF)上進(jìn)行的連續(xù)三步層析是為了對活性成分進(jìn)行純化，以允許將FVn活化為活化FVII(FVIIa),以及最終濃縮并制備為FVII合成物。通過波長(人)為280nm處的吸收測量檢測該化合物。3.1O-SepharoseFF1步-洗提<〈高鉤》用100mlQ-Sepharose⑧FF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.6cm(橫截面5.3cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。保存于-30。C的所有部分在37。C水浴中解凍，直到所有冰塊都溶解。該部分先用平衡緩沖液稀釋到1/2[v/v]，再注入到膠(流速13ml/min,即直線速度150cm/h),未保留部分隨后隨緩沖液的通過去除，直到RBL。對具有低FVn含量的第一蛋白部分用0.05M的Tris和0.15M氯化鈉、pH7.5的緩沖液以9ml/min(即100cm/h)洗提，并隨后被去除。用0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.05M氯化鈣、pH7.5的緩沖液對富含F(xiàn)VII的第二蛋白部分以9ml/min(即100cm/h)洗提。如前所述，對該第二部分在50kDa的超濾器上進(jìn)行透析。透析緩沖液為0.15M的氯化鈉。該部分在第二次通過陰離子交換層析前在夜間被存儲于十4。C。這一步可以回收73%的FVII(即60000IU的FVII-Tg),同時消除80%的結(jié)合蛋白。這一步還使得將FVII活化成FVIIa。3.2O-SepharoseFF2步-洗4是W氐釣》用30mlQ-SepharoseFF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。先對存儲于+4。C的先前的洗提部分(第二部分)進(jìn)行稀釋，再將其注入到膠上(9ml/min,即直線流速100cm/h)。在注入第二部分后，對該膠用平衡緩沖液沖洗以去除不保留的部分，直到RBL。對含有非常高純度FVH的部分用0.05M的Tris、0.05M氯化鈉和0.005M氯化鉤、pH7.5的緩;中液以4.5ml/min(即50cm/h)洗提。約23000IU的FVII-Tg凈皮純化，即12mg的FVII-Tg。這一步可以消除超過95%的結(jié)合蛋白(雌兔奶蛋白)。該純度高于90%的洗提液表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)與功能特征接近天然人類FVII分子。該洗提液在第三次離子交換層析時被濃縮和制備。3.3QSepharoseFF3歩—洗4是《鈉》用10miQ-SepharoseFF膠(GEHealthcare)填充一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱。該膠用0.05M、pH7.5的Tris緩沖液平衡。在注入所述部分后，對該膠用平衡緩沖液沖洗以去除不保留的部分，直到RBL。前一步驟中洗提、純化的部分用注射用純水(PWI)稀釋五倍，然后注入到膠中(流速4.5ml/min,即直線速度50cm/h)。之后，用0.02M的Tris和0.28M氯化鈉、pH7.0的緩沖液以3ml/min(即36cm/h)對FVn-Tg進(jìn)行洗提。純度高于95%的FVII-Tg合成物被制備出來。該產(chǎn)品適于靜脈注射。該方法累積產(chǎn)率為22%,因此每升被處理的奶可以純化出至少20mg的FVn。表A再現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例用于生產(chǎn)純化FVII合成物的方法步驟，并提供了每步獲得的不同產(chǎn)率、純度和特異活性。然后，對FVII-Tg合成物進(jìn)行不同的結(jié)構(gòu)分析，例如下列實(shí)施例所示。實(shí)施例3:通過MS-ESI對糖基化位點(diǎn)和糖肽進(jìn)行表征通過LC-ESIMS(/MS)鑒別FVII-Tg、FVIIa,p(血漿FVII)以及FVIIa,r的N-糖基化位點(diǎn)，通過MALDI-TOFMS進(jìn)行證實(shí)，通過LC-ESIMS對每個位點(diǎn)的不同聚糖的相對比例進(jìn)行確定。圖2描述了包含兩個糖基化天冬酰胺殘基的糖肽的去巻積ESI光譜。通過MALDI-TOF(/TOF)和Edman測序?qū)μ腔稽c(diǎn)的位置進(jìn)行確認(rèn)。對分別表現(xiàn)出N-糖基化位點(diǎn)Asn!45和Asn322的FVna,p的糖肽1]0123-11152]和的質(zhì)譜分析顯示存在二天線的、二唾液酸的、未巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2)(觀察到的含有Asn^的糖肽質(zhì)量5563.8Da)以及巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的帶有Asnl45的糖肽質(zhì)量5709.8Da)。同樣注意到，Asn145存在三天線的、三唾液酸的、未巖藻糖基化(A3)(觀察到的質(zhì)量'6220.0Da)和巖藻糖基化(A3F)(觀察到的質(zhì)量6366.1Da)。對于轉(zhuǎn)基因FVIIa，p，Asnw被A2F、A1F型聚糖所修飾，"A1F"對應(yīng)于其他天線帶有GalNAc端位置的單唾液酸化結(jié)構(gòu)。注意到有聚糖A3F(三天線、三唾液酸化、巖藻糖基化結(jié)構(gòu))的存在。對于FVII-Tg，對分別帶有N-糖基化位點(diǎn)Asnw5和Asn322的FVII-Tg的糖肽和[K3L6-R353]的質(zhì)譜分析顯示存在著二天線的、二唾液酸的、未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(A2)(觀察到的含有Asn!45的糖肽質(zhì)量5563.8Da)和巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的質(zhì)量5709.7Da)。位于Asnw5的大部分寡糖為二天線、單唾液酸、非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1)(觀察到的質(zhì)量5272.3Da)和巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的質(zhì)量5418.7Da)。三天線結(jié)構(gòu)幾乎不存在。需要注意的是在其他天線的端位置沒有帶有GalNAc的單唾液酸化結(jié)構(gòu)存在。關(guān)于ASI1322的主要糖型，可以觀察到不同比例的相同聚糖結(jié)構(gòu)。圖l顯示與Asnw5相比，成熟結(jié)構(gòu)較少(較少天線和唾液酸的)。例如，對于血漿產(chǎn)物，在Asn322上三天線的結(jié)構(gòu)比在Asnw5上出現(xiàn)的少，而對于FVIIa,r和FVII-Tg，則沒有。應(yīng)當(dāng)注意的是，Asnl45和322被100。/。糖基化。雖然是半定量的，這些結(jié)果與通過HPCE-LIF和NP-HPLC獲得的定量數(shù)值是一致的。實(shí)施例4:利用HPCE-LIF對N-聚糖定量在用PNGaseF去糖基化后，通過HPCE-LIF對N-連接寡糖進(jìn)行識別和量化。FVII樣品用外切糖苦酶(唾液酸酶(酶/底物比例為lmIU/10嗎)、半乳糖苷酶、乙酰氨基己糖苦酶(Prozyme試劑盒)、巖藻糖苷酶(酶/底物比例1mU1/10jig)以一定方式處理，以保證對每個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)進(jìn)行識別和量化。所獲得的聚糖用熒光染料標(biāo)記，并根據(jù)其質(zhì)量和電荷進(jìn)行分離。兩個標(biāo)準(zhǔn)(葡萄糖均聚物和寡糖)可以用來識別結(jié)構(gòu)。通過累計(jì)每個峰對所有量化的寡糖的比例而進(jìn)行量化。使用了毛細(xì)管電泳設(shè)備ProteoLabPA800(Beckman-Coulter),其毛細(xì)管為50cmx50jam內(nèi)徑的N-CHO《涂層》(Beckman-Coulter)。還使用了《膠緩沖液-N》(Beckman-Coulter)分離緩沖液。在20。C、電壓為25kV下進(jìn)行遷移20分鐘。通過使用人激發(fā)488nm和入發(fā)射520nm的激光進(jìn)4亍才全測。在同時用唾液酸酶、半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶去糖基化后，根據(jù)"核，，和巖藻糖基化"核，，的峰區(qū)域之間的關(guān)系來計(jì)算巖藻糖基化的比率。FVIIa,p中大部分聚糖為二天線的、二唾液酸化、非巖藻糖基^類型(A2)以及二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化類型(A2F)。FVII-Tg的聚糖結(jié)構(gòu)顯示存在著二天線、單唾液酸、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)類型(A1F，Al)，以及存在著二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的類型(A2F,A2)。在這些不同結(jié)構(gòu)之間，分布不同。FVIIa,r表現(xiàn)出大部分為A2F結(jié)構(gòu)的二天線、唾液酸化的、巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)和二天線、單唾液酸化的、巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1F)對于A2F和A1F結(jié)構(gòu)，可以觀察到與這些結(jié)構(gòu)的通常遷移時間相比的非典型的遷移時間。兩批(A和B)FVII-Tg的聚糖結(jié)構(gòu)(參見圖3-在中間的兩個電泳圖譜)顯示存在著二天線、單唾液酸、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)類型(A1F,Al),以及存在著二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的類型(A2F,A2)。表1.FVII的不同批次的從天然樣品獲得的唾液酸化結(jié)構(gòu)的百分比的匯總百分比兩Ia，pFVII-TgA批FVII國TgB批FVIIa，r天然的A241.919.313.9-25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>不同聚糖結(jié)構(gòu)(表l)的量化分析顯示，對于FVIIa,p,其唾液酸化的結(jié)構(gòu)的主要形態(tài)為約51%的二唾液酸化聚糖(A2和A2F)以及30%三天線的、唾液酸化的、未巖藻糖基化的和巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(G3和G3F)(結(jié)果未顯示)。FVII-Tg(A批和B批)與FVIIa,p相比，較少的被唾液酸化，35%為二天線的、二唾液酸化的結(jié)構(gòu)而只有6%為三天線的，唾液酸化結(jié)構(gòu)(結(jié)果未顯示)。主要結(jié)構(gòu)是單唾液酸化的，其中50。/。具有Al和AlF結(jié)構(gòu)。同樣，F(xiàn)VIIa,r與FVIIa,p相比較少的被唾液酸化，其45%為A2F結(jié)構(gòu)，而僅6%為三天線的、唾液酸化的聚糖(結(jié)果未示出)。沒有發(fā)現(xiàn)FVIIa，r的非巖藻糖基化結(jié)乾，，表2.不同F(xiàn)VII的巖藻糖基化比率<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結(jié)果顯示FVIIa,p巖藻糖基化比例低(16%),對于FVII-Tg,巖藻糖基化的比例從24到42%,而對于FVIIa,r則是100。/。的巖藻糖基化了。實(shí)施例5:利用NP-HPLC對N-聚糖定量通過NP-HPLC對FVIIa,p、FVIIa,r以及FVI1-Tg的N-糖基化進(jìn)行了定性和定量分析(參見圖4)。對蛋白進(jìn)行脫鹽和干燥后，通過本領(lǐng)域公知的方法對該蛋白進(jìn)行變性和簡化。然后，在酶促反應(yīng)中釋放聚糖，并通過乙醇的沉淀進(jìn)行純化。獲得的聚糖用熒光2-氨基苯曱酰胺(2-AB)標(biāo)記。所標(biāo)記的聚糖根據(jù)其親水性通過正相HPLC用4.6x250mm氨基-80柱(Tosohaas)在30。C恒溫下分離。在注入樣品前，對柱用80%乙腈緩沖液平衡。對寡糖用逐漸增加的50mM、pH4.5甲酸銨在等于或大于140分鐘的時間內(nèi)洗提。通過X激發(fā)為330腿和人發(fā)射為420nm熒光測定法進(jìn)行檢測。FVIIa，p的色譜圖顯示主要的聚糖是二天線的、二唾液酸化的類型(A2),其比率為39%。同時觀察到了較低的量的二天線的二唾液酸化的巖藻糖基化形式(A2F)、單唾液酸化形式(Al)、以及三唾液酸化的巖藻糖基化的和未巖藻糖基化的(A3F和A3)形式。對FVII-Tg用NP-HPLC進(jìn)行的分析證實(shí)了存在的主要寡糖是A1類型的，比例高達(dá)27%。A1F、A2和A2F的結(jié)構(gòu)較少，而三天線的結(jié)構(gòu)僅以痕量存在。這顯示FVIIa，p和較少唾液酸化的因子FVII-Tg(B批)之間唾液酸化上的差異。對因子FVIIa,r的同樣的分析表明，主要形式A2F的量為30。/。。存在的A1F的結(jié)構(gòu)較少，而三天線的結(jié)構(gòu)僅以痕量存在。對FVIIa,r的分析同樣表明AlF和A2F結(jié)構(gòu)的保留時間的重要時間延遲，這表明該結(jié)構(gòu)不同于FVIIa,p和FVII-Tg中的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果與那些通過HPCE-LIF'獲得的結(jié)果一致。實(shí)施例6:用MALDI-TOFMS鑒定質(zhì)譜MALDI-TOFMS(基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜)是一種可以精確測量肽、蛋白、聚糖、寡糖以及大部分可電離的聚合物的分子量的技術(shù)。將要分析的肽、蛋白和聚糖與基質(zhì)相混合，基質(zhì)吸收所使用激光的波長。對于肽分析，主要的基質(zhì)是a-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA),對于蛋白分析，是芥子酸(SA),對于寡糖分析，是2,5-二羥基笨曱酸(DHB)。該方法包含用脈沖激光照射基質(zhì)/被分析物的共晶，導(dǎo)致基質(zhì)和被分析物分子的解吸附。在氣相電離后，被分析物分子在飛行時間內(nèi)穿過檢測器。由于質(zhì)量和飛行時間是直接相關(guān)的，檢測后者可以確定目標(biāo)被分析物的質(zhì)量。通過將觀測到的質(zhì)量測量與理論質(zhì)量相比而實(shí)施鑒定?；谒@得的離子碎片在MS/MS模式下進(jìn)行排序。所使用的裝置是BrukerAutoflex2,在TOF和TOF/TOF模式下工作。為了鑒定存在于FVII-Tg和FVIIa,r的聚糖結(jié)構(gòu)，對通過制備型NP-HPLC所獲得的洗提部分進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。27對FVII-Tg進(jìn)行MALDI-TOF分析可以證實(shí)對用NP-HPLC分離的聚糖的鑒定，即大部分單唾液酸化的A1結(jié)構(gòu)和少量的A1F、A2F以及A2類型結(jié)構(gòu)。本研究還可以確定三天線二唾液酸化的和三唾液S吏化的少凄t結(jié)構(gòu)、雜交結(jié)構(gòu)和Man5和Man6-P-HexNAc類型的寡糖(參見圖5)。對FVIIa，r進(jìn)行的MALDI-TOFMS分析表明存在著如圖6所示的聚糖結(jié)構(gòu)。因子FVIIa,r近乎完全巖藻糖基化，而FVII-Tg僅部分巖藻糖基化。大部分聚糖結(jié)構(gòu)是A2F，通過NP-HPLC量化的比率為30。/。。鑒別出二天線單唾液酸化巖藻糖基化結(jié)構(gòu)(A1F)以及在端位置含有GalNAc的其他天線結(jié)構(gòu)，中性二天線巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，在一個和/或兩個天線帶有Hex-NAc-HexNAc部分。還注意到有三天線、三唾液酸化、巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)的存在。非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)以痕量存在。實(shí)施例7:對唾液酸-半乳糖連接的HPCE-LIF分析關(guān)于唾液酸-半乳糖連接("分枝")研究，實(shí)驗(yàn)步驟與在實(shí)施例4中描述的相似。在用PNGaseF去糖基化后，對寡糖用特異性外切唾液酸酶處理，來保證對連接進(jìn)行鑒定和對每個單獨(dú)結(jié)構(gòu)的量化。所使用的唾液酸酶是來自51;朋ww朋/"e(對于a2-3連接有特異性，0.02IU,E/S=0.4m/m)，C/^/hVgera(對a2-3和a2-6連接有特異性，0.04IU,E/S=0.1m/m)以及Awe/ac/e似(可以水解a2-3、a2-6、a2-8和a2-9連接，0.01IU,E/S=0.05m/m)的重組酶。通過分析顯示，F(xiàn)VIIa,r具有二天線、唾液酸化的、巖藻糖基化的聚糖結(jié)構(gòu)，主要是A2F以及二天線的、單唾液酸化的、巖藻糖基化的(A1F)結(jié)構(gòu)。對于這些A2F和A1F結(jié)構(gòu)，可以觀察到與這些結(jié)構(gòu)的通常遷移時間相比的非典型的遷移時間。尤其是，這些唾液酸化的寡糖結(jié)構(gòu)在HPCE-LIF和NP-HPLC中表現(xiàn)出與FVII-Tg相比具有非典型性遷移時間。另一方面，對單糖合成物的分析沒有顯示任何特別的與Neu5Ac不同的唾液酸，而質(zhì)譜工具分析顯示聚糖具有與二唾液酸化類型一致的質(zhì)量。最后，F(xiàn)VIIa，r聚糖的去唾液酸化可以發(fā)現(xiàn)其層析與電泳行為與FVII-Tg的寡糖的相同。因此這些在電泳和層析行為上的差異可用唾液酸的不同分技來解釋。用HPCE-LIF和MS對該假設(shè)通過不同途徑進(jìn)行評估。結(jié)果如表3所示。表3:不同批次的FVII上唾液酸的分枝<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>該結(jié)果顯示在兩種FVII水平上顯著的唾液酸異構(gòu)。事實(shí)上，F(xiàn)VIIa,r的唾液酸包含a2-3連接，而FVII-Tg表現(xiàn)出a2-6分枝。FVIIa,r的聚糖與FVII-Tg相比，在HPCE-LIF和NP-HPLC中行為的差異，與在唾液酸水平上的異構(gòu)差異相關(guān)。實(shí)施例8:FVII-Tg的體外再唾液酸化文獻(xiàn)(ZhangX.&a/,Biochim.Biophys.Acta1998,1425;441-52)提到了糖蛋白更完全的唾液酸化有助于提高體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性。該研究的目的是為了闡述體外唾液酸化的可行性。通過使用(x2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(rat,Spofifofera/ragiperab,S.A之l單位/mg(S.A.:特異活性)，41kDa,Calbiochem)以及底物胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸(Calbiochem)來進(jìn)行再唾液酸化。這兩種試劑由于其不穩(wěn)定性而儲存于-0。C。唾液酸化底物(胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸)和酶a2，6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在夜間37。C下在反應(yīng)緩沖液中混合:所用的反應(yīng)緩沖液是50mM的嗎啉_3-丙磺酸、0.P/。的Tween⑧80、0.1mg/mlBSA(牛血清白蛋白)，pH調(diào)整到7.4(Sigma試劑)。實(shí)驗(yàn)條件如下表4所示。表4:實(shí)驗(yàn)條件匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>天然FVII-Tg的電泳圖i普表明大部分結(jié)構(gòu)為二天線、單唾液酸化A1結(jié)構(gòu)(42%),少量的A2、A2F和A1F結(jié)構(gòu)。天然FVII-Tg例如為實(shí)施例的純化后獲得的(圖7,最下面的圖)。再唾液酸化后(圖7,上面的圖)，存在著的單唾液酸化結(jié)構(gòu)僅6。/。，二唾液酸化結(jié)構(gòu)，尤其是非巖藻糖基化的變得占大多數(shù)(52%)。再唾液酸化前后的聚糖的量化結(jié)果如下表5所示。表5:唾液酸化前后的寡糖結(jié)構(gòu)的量化^^^^天然FVII-Tg再唾液酸化的FVII-TgA219.852.4A2F15.525.1Al42.16.4A1F13.611.6中性的9.04.5唾液酸化(％)91.195.5二唾液酸化比率'35.377.5'轉(zhuǎn)基因FVII的唾液酸化動力學(xué)如圖8所示。該研究表明再唾液酸化的效率為二唾液酸化結(jié)構(gòu)的比率增長了超過100%。實(shí)施例9:對從實(shí)施例8中獲得的轉(zhuǎn)基因非再唾液酸化FVII(FVIITgNRS)與轉(zhuǎn)基因再唾液酸化FVII(FVIITgRS)在兔中的藥代動力學(xué)比較研究。本研究的目的是在新西蘭雄兔中對FVII-TgRS和FVII-TgNRS進(jìn)行藥代動力學(xué)曲線比較研究。試驗(yàn)劑量是每動物200jig/kg，是重組FVII施加到人類的藥物劑量雙倍。在J-4(注射前4天)和J1(注射當(dāng)天)的T0.17h(注射當(dāng)天，注射后10分鐘)、T0.33h(注射當(dāng)天，注射后20分鐘)、Tlh(注射當(dāng)天，注射后l小時)、T3h(注射當(dāng)天，注射后3小時)、T6h(注射當(dāng)天，注射后6小時)、T8h(注射當(dāng)天，注射后8小時)進(jìn)行采血。FVII:Ag的劑量用ELISA方法(Asserachrom試劑盒)測量。兔血液中FVII:Ag的劑量結(jié)果一方面可以用來確定去除曲線，另一方面可以確定藥代動力學(xué)參數(shù)。藥量學(xué)組和實(shí)驗(yàn)組如表6所示。30表6:藥量學(xué)和實(shí)驗(yàn)組<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>NA:沒有應(yīng)用去除曲線如圖9所示。結(jié)果如表7所示。表7:結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>兩組實(shí)驗(yàn)的施加劑量、去除半衰期、平均停留時間(MRT)、最大濃度(Cmax)以及回收率(《回收》)都是可比的。FVII-TgRS表現(xiàn)出的動力學(xué)曲線不同于FVII-TgNRS。對FVII-Tg的再唾液酸化非顯著的提高了半衰期、平均停留時間(MRT)、Cmax以及《回收》。AUC參數(shù)水平(峰面積)、Cl(清除)以及分布體積(Vd)(用血漿濃度除以施加或吸收劑量而獲得)的差異表明從血液循環(huán)中清除FVII-TgRS不重要。FVII-Tg的再唾液酸化提高了產(chǎn)品的生物處理能力大約300/0。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權(quán)利要求1.一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物(FVII)，該合成物的每個因子VII分子含有結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子，與因子VII合成物的結(jié)合到N-糖基化位點(diǎn)的所有聚糖結(jié)構(gòu)相比，大多數(shù)為二天線、二唾液酸、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)。2.根據(jù)權(quán)利要求i所述的合成物，其特征在于二天線、二唾液酸化、巖藻糖基化和非巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的比率高于50%。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的合成物，其特征在于所述合成物的所有因子VII分子中，巖藻糖比率在20°/。-50%之間。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的合成物，其特征在于所述合成物的因子VII中至少部分唾液酸含有(x2-6連接。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成物，其特征在于所述合成物的因子VII的所有唾液酸包含a2-6連接。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成物，，其特征在于所述合成物的因子VII同時包含a2-3連接的唾液酸。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一所述的合成物，其特征在于所述FVII是活化的。8.根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的合成物用作藥物的用途。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療血友病病人的藥物的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療多出血性創(chuàng)傷的藥物的用途。11.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的因子VII的合成物，用于制備治療由于抗凝劑過量而出血的藥物的用途。12.—種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所定義的FVn、和賦形劑和/或藥學(xué)上可接受的載體。13.—種用于制備重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物的方法，該合成物的每個因子vn分子包含連接到n-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，所述合成物的所有因子vii分子中，二天線、二唾液酸聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)，該方法包括一唾液酸化步驟，通過將部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因或重組因子vn合成物與唾液酸供體底物和唾液酸轉(zhuǎn)移酶在合適的能保留唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，經(jīng)過足夠時間和在合適的條件下，以使得唾液酸從唾液酸供體底物向FVII轉(zhuǎn)移，并使得所述的二唾液酸化結(jié)構(gòu)足夠增長到占大多數(shù)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在唾液酸化步驟之前，先進(jìn)行半乳糖基化步驟，用于在半乳糖-缺陷結(jié)構(gòu)上接枝一半乳糖，該半乳糖-缺陷結(jié)構(gòu)表示FVII的無半乳糖和單半乳糖結(jié)構(gòu)。15.根據(jù)權(quán)利要求13和14任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化的FVII的合成物表現(xiàn)出大多數(shù)為二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于所述的部分唾液酸化的FVII的合成物的二天線、單唾液酸化聚糖結(jié)構(gòu)中，大多數(shù)聚糖結(jié)構(gòu)是非巖藻糖基化的。17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化FVII的合成物中至少部分唾液S菱含有a2-6連接。18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任一所述的方法，其特征在于在唾液化步驟之前，還包括通過轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)部分唾液酸化的轉(zhuǎn)基因FVII的合成物的步驟。19.根據(jù)權(quán)利要求13-18中任一所述的方法，其特征在于所述部分唾液酸化的FVII的合成物中的FVII是活化的。20.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一所述的方法，其特征在于所述"唾液酸轉(zhuǎn)移酶是a2,6-(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，唾液酸供體底物是胞苷-5，-單磷酸-N-乙酰-神經(jīng)氨酸。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物，該合成物的每個因子VII分子具有連接到N-糖基化位點(diǎn)的聚糖結(jié)構(gòu)，其中所述合成物的所有因子VII分子中，二天線、二唾液酸化、非巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)占大多數(shù)。本發(fā)明還涉及所述合成物用作藥物的用途，以及用于制備所述合成物的方法。文檔編號A61K38/36GK101495133SQ200780027968公開日2009年7月29日申請日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日發(fā)明者埃馬紐埃爾·諾尼,尼古拉·比奧羅,阿卜杜勒薩塔爾·薩米·什圖魯申請人:Lfb生物科技公司