專利名稱：：編碼艱難梭菌毒素a和毒素b受體結(jié)合域的密碼子優(yōu)化dna分子及其使用方法編碼艱難梭菌毒素A和毒素B受體結(jié)合域的密碼子優(yōu)化DNA分子及其4吏用方法本申請(qǐng)要求2006年6月8日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/812,489的優(yōu)先4又，其ilL明書以全文方式引入于此作為參考。本發(fā)明是在國家衛(wèi)生研究院(NationalInstituteofHealth)項(xiàng)目基金第5K08AI58747-03號(hào)的政府資助下完成的。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：艱難梭菌(C7a^rWMWd)是一種革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，其臨床表現(xiàn)包括腹瀉、，I膜性結(jié)腸炎、敗血病和死亡。從定殖(colonization)到感染和疾病復(fù)發(fā)的過程反映出并沒有建立起有效的抗體反應(yīng)來對(duì)抗由該細(xì)菌釋》文的毒素。對(duì)于^艮難4炎菌相關(guān)疾病的常^見療法包括停止最初的抗生素治療并給予滅滴靈(metronidazole)或萬古霉素(vancomycin)。然而，滅滴靈和萬古霉素都有特定的缺點(diǎn)。萬古霉素是美國食品藥品管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration,USFDA)糸匕〉隹的口眷一療法，其與革蘭氏陽性病原體抗性的選^f奪相關(guān)，而滅滴靈似乎對(duì)嚴(yán)重的艱難梭菌疾病卻沒有萬古霉素有效。兩種藥劑都不能預(yù)防在中止治療之后艱難梭菌感染的復(fù)發(fā)，這種情況與較差的抗毒素免疫反應(yīng)相關(guān)并且可能非常^^以治療。因此，對(duì)于治療和預(yù)防艱難梭菌相關(guān)疾病，還需要新的更為有效的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種含有編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明-提供了一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)抗艱難4炎菌毒素A的抗體的方法。該方法包括向哺乳動(dòng)物給予有效量的本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于降低人體內(nèi)患有艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括向人體給予有效量的本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。(與后面的一段相同)在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在需要其的人體內(nèi)治療艱難梭菌感染的方法，該方法包括向人體內(nèi)給予有效量的本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。在另一方面，本發(fā)明提供了一種含有編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。200在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)抗艱難梭菌毒素A的抗體的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物給予有效量的本發(fā)明要求^呆護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于降^[氐人體內(nèi)含有艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括向人體內(nèi)給藥有效量的本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。(與前面的一,殳相同)在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在需要其的人體內(nèi)治療艱難梭菌感染的方法，該方法包括向人體內(nèi)給予有效量的本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子，該DNA分子結(jié)合于載體中。。圖1是艱難-陵菌毒素A的氨基酸序列(基因庫登記號(hào)(GenBankAccessionno.)CAA63564，SEQ.ID.NO.:1)。艱難梭菌毒素A的受體結(jié)合域位于1839-2710氨基酸殘基處(SEQ.ID.NO.:2)。圖2是艱難梭菌毒素A的氨基酸序列(基因庫登記號(hào)A37052,SEQ.ID.NO.:3)。艱難梭菌毒素A的受體結(jié)合域位于1839-2710氨基酸殘基處(SEQ.ID.NO.:4)。圖3是艱難梭菌毒素A的氨基酸序列(基因庫登記號(hào)AAA23283,SEQ.ID.NO.:5)。艱難梭菌毒素A的受體結(jié)合域位于1839-2710氨基酸殘基處(SEQ.ID.NO.:6)。10圖4是艱難梭菌毒素A的氨基酸序列(基因庫登記號(hào)P16154,SEQ.ID.NO.:7)。艱難梭菌毒素A的受體結(jié)合域位于1839-2710氨基酸殘基處(SEQ.ID.NO.:8)。圖5是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:9),其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的^f匡內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。圖6是艱難梭菌毒素A的抗原決定基(表位，epitope)的氨基酸序歹ll(SEQ.ID.NO.:10)。圖7是含有編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核香酸序列(SEQ.ID.NO.:9)并且另外含有Kozak序列、tPA前導(dǎo)序列和五coRI限制位點(diǎn)的DNA分子(SEQ.ID.NO.:11)，其中根據(jù)表1,所述核苦酸序列的每一種氨基酸殘基至少約100/。的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難沖炎菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的〗吏用率。圖8是含有編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:9)并另外含有Kozak序列和EcoM限制位點(diǎn)的DNA分子(SEQ.ID.NO.:12),其中才艮據(jù)表l，所述核苦酸序列的每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖9是天然存在的艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:13)。該序列是基因庫登記號(hào)M30307位于5515-7914的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:14)。圖IO是含有本發(fā)明要求保護(hù)的"tPA-TxA-RBD"DNA分子的質(zhì)粒的示意圖。圖11是在BALB/c小鼠中測(cè)定的艱難梭菌毒素A的血清IgG抗體滴定度。小鼠采用以下之一進(jìn)行免疫pVAX(每后肢肌肉注射25pg);TxA-RBD(每后月支月幾肉注射25|ag);tPA-TxA-RBD(每后肢肌肉注射25|ug);TxA-RBD(每后月支電穿孔強(qiáng)化(EP)月幾肉注射25|ag);或tPA-TxA-RBD(每后肢電穿孔強(qiáng)化(EP)肌肉注射25|ag)。這些小鼠在第0周和第2周進(jìn)行注射。免疫之后6星期對(duì)小鼠取血樣，并在第8周用艱難梭菌毒素A對(duì)抗(激發(fā)，challenge)?？贵w滴定度通過ELISA測(cè)定。圖12是艱難梭菌毒素B的氨基酸序列(基因庫登記號(hào)P18177,SEQ.ID.NO.:15)。艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域位于1755-2367氨基酸殘基處(SEQ.ID.NO.:16)。圖13是天然存在的艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:17)。該序列是基因庫登記號(hào)X53138位于5263-7101的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:18)。圖14是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:19),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核酸殘基位置的基因組成沖亥酸殘基4立置l-6是iWzel限制〗立點(diǎn)(GCTAGC);核酸殘基位置5-13是Kozak序歹'J(GCCGCCACC);核酸殘基位置14-16是ATG起始位點(diǎn)；核酸殘基位置17-22是^w//1限制位點(diǎn)(GGATCC);核酸殘基位置23-1861是毒素B受體結(jié)合域；核酸殘基位置1862-1867是i限制位點(diǎn)(GAATTC)。12圖15是質(zhì)粒"TxA-RBD"和"tPA-TxA-RBD"的示意圖。圖16是含有編碼^艮難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:19)并且另外含有tPA前導(dǎo)序列的DNA分子(SEQ.ID.NO.:20),其中根據(jù)表l,所述核苷酸序列的每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖17是質(zhì)并立"TxB-RBD"和"tPA-TxB-RBD"的示意圖。圖18是在BALB/c小鼠中測(cè)定的艱難梭菌毒素B的血清IgG抗體滴定度。該小鼠釆用以下之一進(jìn)行免疫pVAX(每后肢肌肉注射25|iig);TxB-RBD(每后月支肌肉注射25|ug);tPA-TxB-RBD(每后肢肌肉注射25|ug);TxB-RBD(每后肢電穿孔強(qiáng)化(EP)肌肉注射25|ug);或tPA-TxB-RBD(每后肢電穿孔強(qiáng)化(EP)肌肉注射25pg)。免疫之后6星期對(duì)小鼠取血樣，并在第8周用艱難梭菌毒素B對(duì)抗。抗體滴定度通過ELISA測(cè)定。圖19是5^艮難才炎菌毒素A對(duì)抗之后采用pVAX載體(EP)、tPA-TxA-RBD(IM)、tPA-TxA-RBD(EP)、TxA-RBD(IM)或TxA-RBD(EP)給藥的BALB/c小鼠存活曲線圖。300ng從VPI10463菌林中純化的活性艱難梭菌毒素A,在100|aL滅菌鹽水中通過腹膜內(nèi)注射》于動(dòng)物-進(jìn)4亍只于#元。圖20是艱難沖炎菌毒素B對(duì)抗之后采用pVAX載體(EP)、TxB-RBD(IM)或TxB-RBD(EP)給藥的BALB/c小鼠存活曲線圖。400ng從VPI10463菌株中純化的活性艱難梭菌毒素B,在50jaL滅菌鹽水中通過對(duì)尾靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)注射而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行對(duì)抗。13圖21是在BALB/c小鼠中測(cè)定的艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B的血清IgG抗體滴定度。該小鼠采用以下之一進(jìn)行免疫pVAX(每后月支月幾肉注射25pg);TxA-RBD(每后月支月幾肉注射25)ag);TxB-RBD(每后月支月幾肉注射25pg);或TxA-RBD和TxB-RBD("TxA-TxB")(每后肢肌肉注射25|ug)。這些小鼠在第0周和第2周進(jìn)行注射。免疫之后6星期對(duì)小鼠取血樣，并在第8周用艱難梭菌毒素A或毒素B進(jìn)行對(duì)抗?？贵w滴定度通過ELISA觀'J定。圖22是用艱難梭菌毒素A和毒素B進(jìn)行對(duì)抗之后的BALB/c小鼠存活曲線圖。該小鼠采用以下之一進(jìn)行免疫pVAX(每后肢月幾肉注射25ng);TxA-RBD(每后月支月幾肉注射25);TxB-RBD(每后肢肌肉注射25|^g);或TxA-RBD和TxB-RBD的組合("TxA-TxB")(每后月支月幾肉注射每種質(zhì)粒25|ag)。4姿所述實(shí)施毒素對(duì)抗。圖23是在倉鼠中測(cè)定的艱難梭菌毒素A和B的血清IgG抗體滴定y復(fù)。倉鼠采用以下之一通過電穿孔-強(qiáng)化(ep)月幾肉注射進(jìn)^亍免疫pVAX(每后月支注射lOOjig);TxA-RBD(每后月支注射lOOpg("高劑量，，))；TxA-RBD(每后肢注射11|ag("低劑量"))；TxB-RBD(每后肢注射100|^g("高劑量"))；或TxB-RBD(每后肢注射llpg("低劑量"))。免疫之后10星期對(duì)倉鼠取血樣，并通過ELISA測(cè)定4元體滴定度。圖24是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:21)，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A乂十應(yīng)的才匡內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:21含有2619個(gè)核苷酸，其中位置l-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中位置4-267表示框圖25是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:22),其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約20%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:22含有2619個(gè)核苷酸，其中位置l-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置154-681表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖26是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:23),其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約30%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的才匡內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:23含有2619個(gè)核香酸，其中位置l-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置667-1458表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖27是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:24)，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約40%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的才匡內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:24含有2619個(gè)核苷酸，其中位置1-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置769-1824表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。15圖28是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:25),其中才艮據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約50%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:25含有2619個(gè)核苷酸，其中位置l-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置31-1350表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖29是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:26)，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約60%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的^f醫(yī)內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:26含有2619個(gè)核苷酸，其中位置1-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸/f立置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的4立置415-1998表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖30是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:27)，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約70%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:27含有2619個(gè)核苷酸，其中位置l-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置226-2073表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖31是編碼艮難4發(fā)菌毒素A受體結(jié)合域的核普酸序列(SEQ.ID.NO.:28),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約80%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A16對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:28含有2619個(gè)核苷酸，其中位置1-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置193-2112表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖32是編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:29),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約90%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:29含有2619個(gè)核苷酸，其中位置1-2619對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。圖中的位置16-2391表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素A的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖33是編碼艱難;陵菌毒素B受體結(jié)合域的核苷S吏序列(SEQ.ID.NO.:30)，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:30含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核香酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置1075-1260表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖34是編碼艮難4炎菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:31),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約20%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:31含有1839個(gè)核苦酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置16-387表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖35是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:32),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約30%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.TD.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:32含有1839個(gè)核普酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核苷酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置145-372表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖36是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:33)，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約40%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:33含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)(X53138的核香酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置325-1098表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖37是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:34)，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約50%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:34含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的沖盆苦酸4立置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的^f立置448-1377表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。18圖38是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:35),其中才艮據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約60%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:35含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核苷酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置676-1836表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖39是編碼艮難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:36),其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約70%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的才匡內(nèi)密石馬子具有更高的4吏用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:36含有1839個(gè)核苦酸，其中位置卜1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核普酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置196-1497表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖40是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:37),其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約80%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。核苦S臾序列SEQ.ID.NO.:37含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置22-1509表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。圖41是編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:38),其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約90%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B19對(duì)應(yīng)的沖匡內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:38含有1839個(gè)核苷酸，其中位置1-1839對(duì)應(yīng)于基因庫登記號(hào)X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。圖中的位置70-1743表示框內(nèi)密碼子，根據(jù)表1其在人類基因組中比艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。具體實(shí)施例方式DNA分子在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種含有編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域(RBD)的核香酸序列的修飾的DNA分子(modifiedDNAmolecule)。艱難梭菌毒素A天然存在的受體結(jié)合域的核苷酸序列如圖9所示(SEQ.ID.NO.:13)。艱難梭菌毒素A的氨基酸序列如圖14所示(分別為SEQ.ID.NO:1,3,5和7)。艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的氨基酸序列在SEQ.ID.NO:2，4,6和8中列出。在另一方面中，本發(fā)明提供了一種含有編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域(RBD)的核苷酸序列的DNA分子。艱難梭菌毒素B天然存在的受體結(jié)合i或的核普酸序列如圖14所示(SEQ.ID.NO.:17)。艱難梭菌毒素B的氨基酸序列如圖12所示(SEQ.ID.NOs:15)。艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的氨基酸序列在SEQ.ID.NO:15中列出。在另一方面，本發(fā)明提供了一種含有編碼艱難梭菌毒素A和毒素B受體結(jié)合域的核香酸序列的DNA分子。該DNA分子包含編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約10%的沖匡內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率，并且該DNA分子還包含編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。此處所用的術(shù)語"DNA分子"是指脫氧核糖核苷酸《連。術(shù)語"DNA分子"等同于"DNA鏈"，或"DNA",或"DNA聚合物"，或"DNA序列"。"重組DNA分子"是指由借助分子生物學(xué)技術(shù)連才妄到一起的DNA片^殳構(gòu)成的DNA分子。艱難梭菌毒素A和毒素B是主要的艱難梭菌毒性因子。毒素A和毒素B是較大(250-31OkDa)的多肽，其結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)功能域。兩種毒素的N-端結(jié)構(gòu)域含有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。中心結(jié)構(gòu)域是疏水區(qū)，這對(duì)于毒素的跨細(xì)胞膜遷移來說是很重要的。毒素的C-端結(jié)構(gòu)域，此處稱為受體結(jié)合域，主要負(fù)責(zé)與表達(dá)在靶細(xì)胞表面上的受體結(jié)合?？捎糜诒景l(fā)明DNA分子中的核苷酸序列包括編碼艱難梭菌毒素A或艱難梭菌毒素B的全長受體結(jié)合域的那些序列?？捎糜诒景l(fā)明要求保護(hù)的DNA分子的編碼艱難梭菌毒素A全長受體結(jié)合域的核苦酸序列的一個(gè)實(shí)例在SEQ.ID.NO.:9中列出(圖5)。編碼艱難才炎菌毒素B全長受體結(jié)合i或的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)例在SEQ.ID.NO.:19中列出(圖14)。如此處所用，術(shù)語"編碼艱難梭菌毒素A或艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列"包括它們的片段。艱難梭菌毒素A或毒素B受體結(jié)合域片段的氨基酸最小數(shù)量為約44個(gè)氨基S臾，優(yōu)選約50個(gè)氨基酸，而更優(yōu)選約60個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子的核苷酸序列中，核苦酸的最小凄t目是約132個(gè)核苦酸，優(yōu)選約150個(gè)核普酸，而更優(yōu)選約180個(gè)核普酸。21艱難梭菌毒素A或毒素B受體結(jié)合域片段的氨基酸最大數(shù)量為至多約870個(gè)，約860個(gè)，約850個(gè)或約840個(gè)氨基酸。因此，在本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子的核苷酸序列中核苷酸的最大數(shù)目為約2610個(gè)4亥苷酸，約2580個(gè)4亥普S吏，約2550個(gè)核苦S臾或約2520個(gè)核苦酸。艱難梭菌毒素A和毒素B受體結(jié)合域的獨(dú)特特征是存在21-、30-或50-氨基酸殘基的4炎菌重復(fù)寡肽(clostridialrepeatoligopeptide)。毒素A受體結(jié)合域的序列含有3038個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。在毒素B受體結(jié)合域的序列中，大約有1924個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。例如，在SEQ.ID.NO.:5(圖3)中艱難梭菌毒素A在以下氨基酸殘基處含有梭菌重復(fù)寡肽1810-1829;1851-1870;1872-1891:1923-19422057-20762191-22102325-23442459-24781943-19622077-20962211-22302346-23652480-24991964-19832098-21172232-22512367-23862501-25201985-20042119-21382252-22712388-24072552-25712006-20252140-21592305-23242439-24582572-25912593-2612;2643-2662;2663-2682;2685-2704<在SEQ.ID.NO.:15(圖12)中艱難梭菌毒素B在以下氨基酸殘基處含有4炎菌重復(fù)寡月太1832-1851;1853-1872;1875-1894;1925-1944;1966-1985;1986-2005;2006-2025;2056-2075;2076-2096;2098-2117;2118-2137;2138-2157;2208-2230;2232-2251j2252-2271;2272-2291;2322-2341;2342-2361。編碼艱難梭菌毒素A或艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域片段的核苷酸序列可以編碼梭菌重復(fù)寡肽。編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域片段的核苷酸序列，可以編碼最少1個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、2個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、5個(gè)梭菌重復(fù)寡肽，10個(gè)梭菌重復(fù)寡肽或15個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域片段的核苦酸序列，可以包括艱難梭菌毒素A的所有梭菌重復(fù)寡肽的最大數(shù)量，約35個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、約25個(gè)梭菌重復(fù)寡肽或約15個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域片段的核苦S吏序列，可以編碼最少1個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、2個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、5個(gè)梭菌重復(fù)寡肽、10個(gè)梭菌重復(fù)寡肽或15個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域片段的核苷S吏序列，可以包括艱難梭菌毒素B的所有梭菌重復(fù)寡肽的最大數(shù)目，約20個(gè)重復(fù)的梭菌重復(fù)寡肽、約15個(gè)梭菌重復(fù)寡肽或約IO個(gè)梭菌重復(fù)寡肽。編碼艱難一炎菌毒素A或艱難一炎菌毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列，可以包括位于梭菌重復(fù)寡肽末端之外的核香酸。另外，編碼艱難梭菌毒素A或艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域片段的核苦酸序列，可以包括位于梭菌重復(fù)寡肽末端之外的核苷酸。例如，在一種實(shí)施方式中，核苦g吏序列^尤選編石馬在SEQ.ID.NO.:10(圖6)中列出的含有表位的艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的片段。該表位的氨基酸序列也示出在SEQ.ID.NO.:5(圖3)中的殘基2098-2141處。該表位的氨基酸序列包括艱難梭菌毒素A的兩個(gè)梭菌重復(fù)寡肽，位于SEQ.ID.NO.:5(圖3)中的殘基2098-2117和殘基2119-2138處。SEQ.ID.NO.:5中的殘基2118和2139-2141代表包含在？艮難沖炎菌毒素A受體結(jié)合域片段之內(nèi)的位于梭菌重復(fù)寡肽末端之外的殘基。因此，該表位的對(duì)應(yīng)核苷g臾序列包括位于梭菌重復(fù)寡肽末端之外的核苷酸。在SEQ.ID.NO.:13(圖9)和SEQ.ID.NO.:9(圖5)中位置778-909處的核苷酸，編碼在SEQ.ID.NO.:10(圖6)示出的氨基酸序列中所列出的表位。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，核苦S臾序列編碼含有在SEQ.ID.NO.:7(圖4)氨基酸殘基2456-2710處的表位的艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的片段。在SEQ.ID.NO.:13(圖9)中的最后762個(gè)核苷酸編碼SEQ.ID.NO.:7的位置2456-2710處的氨基酸殘基。在本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子中，根據(jù)表1(下文為使用率)，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。表1:人類密碼子使用表。數(shù)字表示在人類基因組中每種密碼子的使用百分率(percentusage)。氛丞酸密碼子'人類基因組中的使用率PHE(F)TTC20.417.4LEU(L)CTGCTCCTTTTGTTACTA39.919.713.112.87.67.1ILE(I)ATCATTATA20.915.87.4MET(M)AUG22.1VAL(V)GTGGTCGTTGTA28.314.511.07.1SER(S)AGCTCCTCTTCAAGTTCG19.417.715.112.212.14.524<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>例如，如果SEQ.ID.NO.:13(圖9)中的框內(nèi)密碼子之一是TTG,其在人類基因組中的使用率為12.8并編碼氨基酸亮氨酸，那么可用于DNA分子的核苷酸序列中對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子可以用對(duì)于亮氨酸具有更高使用率的任何密碼子來代替。那些對(duì)于亮氨酸使用率超過12.8的密碼子是CTG、CTC和CTT。本發(fā)明的DNA分子中的每一種氨基酸殘基優(yōu)選至少約20%，更優(yōu)選至少約30%,更加優(yōu)選至少約40%,最優(yōu)選至少約50%的框內(nèi)密碼子，比具有SEQ.ID.NO.:13的？艮難沖炎菌毒素A或具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。對(duì)于為核苦酸序列中每一種氨基酸所選擇的框內(nèi)密碼子，適宜的至少約50%、更加適宜至少約75%、且最適宜100%為具有最高-使用率的密碼子。艱難梭菌毒素A和艱難梭菌毒素B的野生型核酸序列具有約30。/o的鳥噤呤(G)和胞嘧啶(C)含量。利用在人體內(nèi)具有較高使用率的密碼子通常會(huì)導(dǎo)致GC含量的增加。在一種實(shí)施方式中，可用于DNA分子中的核酸序列包括比艱難梭菌毒素A或毒素B相應(yīng)的野生型密碼子具有更高GC含量的密碼子。優(yōu)選地，核苦酸序列的GC含量為至少約40%、更4尤選至少約50%、而最伊匸選至少約60%。通過本領(lǐng)域中#支術(shù)人員已知的任何方法都能夠合成該核香酸序列。例如，該核普酸序列可被分成一定長度的寡核苷酸(例如，100個(gè)核苦酸)。該寡核苷酸可i殳計(jì)具有互補(bǔ)的懸掛區(qū)域(hangingregion),并結(jié)合至固相基質(zhì)。寡核普酸能夠經(jīng)由其重疊區(qū)域成組地進(jìn)4亍雜交并共價(jià)連接以4是供最終的核苷酸序列?？商?也，可委才乇商業(yè)7>司，侈'B口BlueHeronBiotechnology,Inc.,Bothell,WA(華盛頓)來合成沖亥普酸序列。本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子可選地包括一個(gè)或多個(gè)附加核苷酸。任何核苷酸都可加入到上述DNA分子中。附加核苦酸可加入到編碼艱難梭菌毒素A或毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列的5'或3'端。對(duì)于附加核苦酸凄t目沒有上限。一4S:而言，向DNA分子中加入不超過約10,000個(gè)核苷酸，優(yōu)選不超過約5,000個(gè)核苷酸，更優(yōu)選不超過約3,000個(gè)核香酸，更加優(yōu)選不超過約1,000個(gè)核苦酸。26在一種實(shí)施方式中，附加核苷酸包括前導(dǎo)序列的基因。本文中所使用的術(shù)語"基因"是指編碼所給氨基酸序列的核酸序列。前導(dǎo)序列包括分泌信號(hào)和信號(hào)肽序列。前導(dǎo)序列通常加入到編碼艮難4炎菌毒素A或毒素B受體結(jié)合域的核苷酸序列的5'端。可用于前導(dǎo)序列的核香酸序列的一個(gè)實(shí)例包括tPA等的信號(hào)肽。在另一種實(shí)施方式中，附加核苦酸包括Kozak序列。Kozak序列優(yōu)選包括核芬酸序列ACCATGG和(GCC)RCCATGG，其中R是噤呤(A或G)。本發(fā)明要求保護(hù)的含有Kozak序列和艱難梭菌毒素A受體結(jié)合i或核苦酸序列的DNA分子的一個(gè)實(shí)例，如圖8(SEQ.ID.NO.:12)所示。在該實(shí)施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:12中列出的序列。本發(fā)明要求保護(hù)的含有Kozak序列和^艮難4臾菌毒素B受體結(jié)合域核苦酸序列的DNA分子的一個(gè)實(shí)例，如圖14(SEQ.ID.NO.:19)所示。在該實(shí)施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:19中列出的序列。本發(fā)明要求保護(hù)的含有Kozak序列、tPA信號(hào)肽基因和艮難才炎菌毒素A受體結(jié)合域核苷S吏序列的DNA分子的一個(gè)實(shí)例，如圖7(SEQ.ID.NO.:ll)所示。在該實(shí)施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:11中列出的序列。本發(fā)明要求保護(hù)的含有Kozak序列、tPA信號(hào)肽基因和艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域核苦酸序列的DNA分子的一個(gè)實(shí)例，如圖16(SEQ.ID.NO.:20)所示。在該實(shí)施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:20中列出的序列。27在另一種實(shí)施方式中，附加核苷S臾可包含任何細(xì)菌序列或非細(xì)菌序列基因。例如，細(xì)菌序列可來自病原或非病原細(xì)菌。細(xì)菌的實(shí)例包4舌大腸桿菌(￡.co//)、分4支桿菌(iV^co^tcfe〃'w附)、鏈J求菌(5^取OCOCCW51)等。非細(xì)菌序列可來自病毒(例如，HIV、CMV、HBV、HCV等)和獲自免疫細(xì)胞(例如，CD4+細(xì)胞)的表位。在另一種實(shí)施方式中，附加核苷酸包^:聚腺苷酸尾(polyAtail)。聚腺苷酸尾通常加入到編碼艱難梭菌毒素A或毒素B受體結(jié)合i或的4t苦酸序列的3'端。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明要求-隊(duì)護(hù)的DNA分子結(jié)合至載體中。例如，載體可用于復(fù)制或擴(kuò)增DNA分子，或用于表達(dá)編碼的蛋白。載體可以包含染色體DNA序列、非染色體DNA序列和合成的DNA序列的片段。該載體可以是{壬<可重組載體。重組載體具有復(fù)制起點(diǎn)，,人該復(fù)制起點(diǎn)引發(fā)載體和引入DNA分子的復(fù)制。重組載體的實(shí)例包括質(zhì)粒、粘粒和噬菌體。質(zhì)粒是典型的能夠自發(fā)復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子。一般而言，質(zhì)粒含有細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)所需的信息，例如啟動(dòng)子、Kozak序列、甲硫氨酸起始點(diǎn)、聚腺苷酸尾。質(zhì)粒的實(shí)例包括pVAXTM和pUC。pVAXTM可從英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen,Carlsbad，Calif)商購獲得。pUC可從紐英倫生物才支術(shù)有卩艮^^司(NewEnglandBioLabs,Ipswich，MA)商購獲4f。28載體可以進(jìn)一步包括可選#"的標(biāo)記，例如藥物抗性標(biāo)記、可檢測(cè)的基因標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)和/或方便對(duì)插入的DNA分子進(jìn)行操作的多個(gè)克隆位點(diǎn)，這在本領(lǐng)域中已眾所周知。藥物抗性標(biāo)記的實(shí)例包括四環(huán)素、氨千西林和卡那霉素?？蓹z測(cè)的基因標(biāo)記的實(shí)例包括P-半乳糖苷酶和乳糖Z。多個(gè)克隆位點(diǎn)通常是含有一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)的DNA片段。限制位點(diǎn)的實(shí)例包^舌5"w/ZI、丑coiI、Pstl位點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)一般是DNA復(fù)制開始的DNA序列。一般而言，復(fù)制起點(diǎn)富含AT。對(duì)艮難4炎菌毒素A或毒素B產(chǎn)生抗體的方法在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艱難梭菌毒素A抗體的方法。在另一方面，本發(fā)明^是供了一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生？艮》1M菱菌毒素B4元體的方法。在這兩種實(shí)施方式中，該方法包括向哺乳動(dòng)物給予有效量的上述結(jié)合至載體中的DNA分子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艱難梭菌毒素A和毒素B的抗體的方法。該方法包括向哺乳動(dòng)物纟合予有效量的上述含有編碼艱難一炎菌毒素A和毒素B受體結(jié)合域的核苦酸序列的DNA分子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了另一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艱難才炎菌毒素A和毒素B4元體的方法。該方法包纟舌向哺乳動(dòng)物纟合予有效量的上述編碼7艮難梭菌毒素A受體結(jié)合域的DNA分子和上述編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分別或組合《合予哺乳動(dòng)物。29DNA分子-載體復(fù)合物能夠纟會(huì)予任何哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包才舌，例如，人類、狒狒和其4&靈長類動(dòng)物、以及寵物如狗和貓、實(shí)-驗(yàn)室動(dòng)物如大鼠和小鼠、以及家畜如馬、羊和牛。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體能夠進(jìn)行純化、固定到固體載體上作為艱難4炎菌的探針?？商娲兀摽贵w能夠作為治療組合物給予人體。在一種實(shí)施方式中，該哺乳動(dòng)物是人類。DNA分子-載體復(fù)合物能夠在任何時(shí)候作為治療組合物給予人體。例如，DNA分子-載體復(fù)合物能夠在人體潛在暴露于艱難梭菌或感染艱難^^菌之前或之后纟會(huì)予人體。降低艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的方法在另一方面，本發(fā)明提供了降低人體內(nèi)感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法。任何人都有感染艮難4炎菌的風(fēng)險(xiǎn)。一^:而言，7艮難梭菌感染是醫(yī)院病原菌。因此，具有感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的人的實(shí)例包括那些醫(yī)院或類醫(yī)院環(huán)境(hospital-likesetting)中的患者或者即^1尋成為醫(yī)院或類醫(yī)院環(huán)境中患者的人。類醫(yī)院環(huán)境的實(shí)例包括療養(yǎng)院(nursinghome)、生活輔助機(jī)構(gòu)(assistedlivingfacility)等。具有感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的人的其他實(shí)例包括那些已進(jìn)行、正在進(jìn)行或即將進(jìn)行灌腸術(shù)、胃管插入術(shù)以及胃腸道手術(shù)的人。正常腸菌類發(fā)生改變的人也具有感染艱難梭菌的風(fēng)險(xiǎn)。例如，使用抗生素如青霉素、氨千西林、氯林肯霉素和頭孢菌素可以改變正常腸菌類而增加感染^艮難^炎菌的風(fēng)險(xiǎn)。另外，艱難梭菌也與使用諸如氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺和阿霉素的化合物進(jìn)4于化學(xué)療法的患者的疾病有關(guān)。正在進(jìn)4亍或即將進(jìn)行這種化學(xué)療法的患者也是具有感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的人的實(shí)例。艮難沖炎菌感染的常見并發(fā)癥是反復(fù)性疾病(recurrentdisease)或復(fù)發(fā)性疾病(relapsingdisease)。疾病復(fù)發(fā)在臨床上可表現(xiàn)為抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)、抗生素相關(guān)性腸炎(AAC)、或偽膜性腸炎(PMC)。復(fù)發(fā)一次的患者更可能再次復(fù)發(fā)。因此，具有或曾經(jīng)具有反復(fù)性或復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染的患者是具有該風(fēng)險(xiǎn)的人的實(shí)例。降低人體感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括向人體內(nèi)給予有效量的上述結(jié)合至載體中的DNA分子。在另一個(gè)方面，降低人體感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括向人體內(nèi)給予有效量的上述結(jié)合至載體的對(duì)于毒素A的DNA分子和結(jié)合至載體的對(duì)于毒素B的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分開或者組合^會(huì)予人體。在另一方面，降低人體感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法包括向人體內(nèi)給予有效量的上述含有編碼艱難梭菌毒素A和毒素B兩種毒素的受體結(jié)合域的核苷酸序列的DNA分子。DNA分子-載體復(fù)合物能夠在人潛在暴露于艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)之前的任何時(shí)候進(jìn)行給藥。例如，DNA分子-載體復(fù)合物可以在潛在暴露于艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)的前一天、前兩天、優(yōu)選前一個(gè)星期、更優(yōu)選前兩個(gè)星期、更加優(yōu)選前一個(gè)月以及更加優(yōu)選前兩個(gè)月或更長時(shí)間進(jìn)^f于纟合藥。風(fēng)險(xiǎn)降低的程度通常因人而異，其取決于諸如給予的DNA分子的用量、致病因素(例如，醫(yī)院環(huán)境、改變常失見腸菌類的因素等)的因素。感染艱難梭菌的風(fēng)險(xiǎn)通常可以降低至少約10%、更常見降31低至少約25%,更常見地降低至少約50%，甚至更常見降低至少約75%,而且更常見地降低至少約90%。最佳情況是感染艱難梭菌的風(fēng)險(xiǎn)完全消除。治療》艮71M炎菌感染的方法另一個(gè)方面中，提供了一種在需要其的人體內(nèi)治療艱難梭菌感染的方法。感染艱難梭菌的任何人都需要根據(jù)本發(fā)明要求保護(hù)的方法進(jìn)行治療。通常，需要治療的人是由內(nèi)科醫(yī)師或臨床醫(yī)生診斷患有艱難梭菌感染的人。用于治療人體內(nèi)艱難梭菌感染的方法包括向人體內(nèi)給予有效量的上述結(jié)合至載體中的DNA分子。在另一方面，用于治療人體內(nèi)艱難梭菌感染的方法包括向人體內(nèi)給予有效量的上述結(jié)合至載體的對(duì)于毒素A的DNA分子和結(jié)合至載體中的3于于毒素B的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分開或者組合鄉(xiāng)合予人體。在另一方面，用于治療人體內(nèi)？艮難梭菌感染的方法包括向人體給予有效量的上述含有編碼艱難梭菌毒素A和毒素B兩種毒素的受體結(jié)合域的核苷酸序列的DNA分子。DNA分子-載體復(fù)合物可以在^艮難才炎菌感染期間的任何時(shí)4,美進(jìn)行給藥。優(yōu)選在感染艱難梭菌后盡快給予DNA分子-載體復(fù)合物。例如，本發(fā)明要求保護(hù)的DNA分子-載體復(fù)合物在感染后約一個(gè)月內(nèi)給藥，優(yōu)選在約兩星期內(nèi)給藥，更優(yōu)選在約一星期內(nèi)給藥，甚至更優(yōu)選約內(nèi)給藥Cwm(9//".A^/.7Tzw.，2003,5:10-19和Liu等，尸A^S,2004,101:14567-14571。含有DNA分子的質(zhì)粒的實(shí)例如圖IO所示。32本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的任何方法可以用于給予DNA分子-載體復(fù)合物。例如，DNA分子-載體復(fù)合物可腸內(nèi)或非腸道多會(huì)藥如,爭(zhēng)脈注射、肌肉注射、作為可注射的溶液或懸浮液進(jìn)行皮下注射、或腹膜內(nèi)注射。例如，DNA分子-載體復(fù)合物可以通過體內(nèi)電穿《L方式纟合藥。簡(jiǎn)而言之，體內(nèi)電穿孔涉及在注射DNA分子-載體復(fù)合物時(shí)向人體組織同時(shí)施加電月永沖。一4殳而言，通過體內(nèi)電穿孔l會(huì)藥能夠增加細(xì)胞攝入DNA分子-載體復(fù)合物的量?？商娲?，DNA分子-載體復(fù)合物可以通過DNA生物噴射器(biojector)給藥。簡(jiǎn)而言之，生物噴射器是無針頭注射技術(shù)，通過促使懸浮于液體中的化合物高速穿過緊貼(holdagainst)皮膚的微孔(tinyorifice)而發(fā)揮作用。生物噴射器能夠遞送肌肉或皮下注射物。生物噴射器能夠從BiojectMedicalTechnologies(Inc，Tualatin,Oregon)商購獲得。用于給予DNA分子-載體復(fù)合物的另一種方法是借助于基因槍。通過基因槍對(duì)基因進(jìn)行體內(nèi)給藥，已在Frelin等777^.，2004，11:522-533中披露。關(guān)于通過基因槍進(jìn)行體內(nèi)給藥的相關(guān)部分以引用方式結(jié)合于此作為參考。基因4色可以從Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA商購獲4尋。DNA分子-載體復(fù)合物以可在人體內(nèi)有歲文地產(chǎn)生抗體或者導(dǎo)致免疫反應(yīng)的量進(jìn)行給藥。DNA分子-載體復(fù)合物的實(shí)際有效量將根據(jù)例如4吏用的編碼受體結(jié)合域的具體核苦酸序列、質(zhì)粒、給藥方式、給藥的具體位置以及接受治療的對(duì)象(例如年齡、性別、尺寸等)而變化。這種有效量可在臨床前和臨床試驗(yàn)期間由內(nèi)科醫(yī)師和臨床醫(yī)生容易地確定。33DNA分子-載體復(fù)合物可在合適的藥物載體中進(jìn)行配制。在本i兌明書中，正如本領(lǐng)i或中的才支術(shù)人員所理解的是，藥物載體應(yīng)理解為4某介物(vehicle)或賦形劑的同義詞。載體的實(shí)例包括淀粉、乳液(或奶，milk)、糖、某些類型的粘土、凝膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸4美或鈣、滑石、才直物油脂或才直物油、初W交和乙二醇。DNA分子-載體復(fù)合物能夠配制成含有一種或多種以下物質(zhì)的組合物穩(wěn)定劑、表面活性劑，優(yōu)選非離子表面活性劑、以及可選的鹽和/或緩沖劑。例如，穩(wěn)定劑可以是氨基酸，例如甘氨酸；或寡糖，例如蔗糖、四聚糖(tetralose)、乳糖或葡聚糖。可替代地，穩(wěn)定劑可以是糖醇，例如甘露醇；或它們的組合。優(yōu)選穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的組合占DNA分子-載體復(fù)合物重量的約0.1wt約10wt%。表面活性劑優(yōu)選為非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯。合適的表面活性劑的一些實(shí)例包括吐溫20、吐溫80;聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙二醇，如約0.001%(w/v)至約10%(w/v)的PluronicF-68。鹽或緩沖劑可以是任何鹽或緩沖劑。合適的鹽包括，例如，氯化鈉或氯化鉀。合適的緩沖劑包括，例如，碳酸氬鈉或碳酸氳鉀、石粦酸二氫鈉或^粦酸二氫鉀。優(yōu)選緩沖劑將DNA分子-載體復(fù)合物配制物的pH值維持在約5.5至約7.5的范圍內(nèi)。鹽和/或緩沖劑對(duì)于4巴重量克分子滲透壓濃度維持在適于給藥的水平內(nèi)也是有益的。優(yōu)選鹽或緩沖劑以約150mM約300mM的大致等滲壓濃度存在。DNA分子-載體復(fù)合物可以配制成可另外含有一種或多種常規(guī)添加劑的組合物。這些添加劑的一些實(shí)例包括增溶劑，例如甘油；抗氧化劑，例如笨扎氯銨(季銨化合物的混合物，稱為"季銨化物(quart)"、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉劑，例如嗎啡衍生物；或等滲壓劑等，例如上述那些。為了進(jìn)一步預(yù)防氧化或其他變質(zhì)腐敗，組合物可以在氮?dú)庀聝?chǔ)存于用不可滲透的塞子密封的小瓶。實(shí)施例實(shí)》包例1纟元體的產(chǎn)生無內(nèi)毒素質(zhì)粒制備物乂人AldevronInc，F(xiàn)argoND獲得。質(zhì)粒在無菌鹽水中稀釋成100lag/50pL濃度的鹽水。分成5組小鼠，每組中3只BALB/c小鼠(CharlesRiverLaboratories)并只于它們注射DNA。組1注射pVAXTM載體；組2僅注射TxA-RBD，標(biāo)準(zhǔn)的肌肉(IM)注射；組3注射tPA-TxA-RBD，IM注射；組4僅注射TxA-RBD,IM電穿孔；組5注射tPA-TxA-RBD,IM電穿孔。在第0周和第2周用100|ag/50nL(100|ugin50|aL)的鹽水在右后肢接種。在接種前(第0周)和研究結(jié)束(第6周)時(shí)抽血并分離血清。血清的分析通過ELISA進(jìn)行，采用商購的毒素A作為高蛋白結(jié)合性Costar板上的結(jié)合抗原，采用商購的抗小鼠辣根-過氧化物酶(HRP)作為第二抗原。ELISA采用DAKO顯影系統(tǒng)進(jìn)行顯影。圖11顯示了TxA-RBD和tPA-TxA-RBD者P是免疫原性的。單獨(dú)使用TxA-RBD比tPA-TxA-RBD提供的IgG反應(yīng)要高10倍。對(duì)于兩種質(zhì)粒，電穿孔都將IgG反應(yīng)提高了100倍。實(shí)施例2TxA-RBD和tPA-TxA-RBD質(zhì)粒的質(zhì)粒設(shè)計(jì)以下質(zhì)粒采用標(biāo)準(zhǔn)克隆^支術(shù)構(gòu)建(Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989))。對(duì)與艱難梭菌菌林VPI10463毒素A蛋白相應(yīng)的全長氨基酸序列(基因庫登記號(hào)AAA23283,參見圖3)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并識(shí)別與位于該蛋白的羧基-末端第三位的假定受體結(jié)合域相應(yīng)的殘基(圖16A)。RBD氨基酸序列在計(jì)算機(jī)中(/ww7/co)使用人細(xì)胞中最常用的密石馬子反壽爭(zhēng)i奪(back-translated)成豸斤的基因序列(http:Vwww.entelechon.com/)。A^d卩艮制序列、Kozak序列和曱石克氨酸起始位點(diǎn)占才居了SEQ.ID.NO.:12(圖8)中的116石成基乂于。優(yōu)-f匕的基因由SEQ.ID.NO.:12(圖8)的23~2641石成基對(duì)構(gòu)成。最后，將限制序列包含在3'末端，并將S"m別限制位點(diǎn)引入SEQ.ID.NO.:12(圖8)的位置17-22中，以允"i午以后的f務(wù)飾。然后將該基因遞交-進(jìn)4亍商業(yè)合成(BlueHeronBiotechnology,Seattle,WA)?；虿迦肫?皮消化(tV/^1/Eco尺1，NewEnglandBiolabs)而結(jié)合到商購載體中，即pVAX丁m(Invitrogen，Carlsbad，CA),其是滿足美國食品和藥品監(jiān)督局關(guān)于用于人的準(zhǔn)則的質(zhì)粒。消化插入片段CSam//l/Eco7l),并將其插入具有事先定位的組織纖溶酶原激活子(tPA)序列以及上述iWd、Kozak和ATG起始密碼子(圖16B)的pVAXTM載體中。在進(jìn)行限制性消化并采用T4連接酶(Roche)連接過夜之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10化學(xué)上適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通過在補(bǔ)充有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)平板上進(jìn)行涂板選擇出陽性克隆。通過限制性消化和DNA測(cè)序來馬僉"i正基因插入物(GeneWiz,NorthBrunswick,NJ)。兩種質(zhì)粒(TxA-RBD和tPA-TxA-RBD)僅僅在ATG起始密碼子之后是否存在tPA前導(dǎo)序列方面有所不同。實(shí)施例3TxA-RBD的體外表達(dá)293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前裂解24h并在12孔培養(yǎng)皿內(nèi)以5乂105個(gè)細(xì)胞/孔的濃度在具有10%的惰性FBS(v/v)(Gibco)和1%青霉素36-鏈霉素(Gibco)的DMEM中進(jìn)行涂板。在涂板24h后，根據(jù)廠商的i兌明書，采用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Calsbad，CA)，用2|iig質(zhì)粒DNA、TxA-RBD、TxB國RBD、tPA-TxA-RBD、tPA-TxB-RBD或pVAXTM-GFP(作為陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染細(xì)月包。轉(zhuǎn)染后48h,收集上清液和/或細(xì)月包溶解產(chǎn)物。在免疫印跡之前以22，000xg離心30min來澄清上清液。才羊品在進(jìn)行分沖斤前4諸存于-20。C下。采用InvitrogenSureLock系統(tǒng)，根據(jù)廠商的建議來實(shí)施免疫印跡。筒而言之，將32.5jaL的樣品力口入到12|uLNuPAGELDS加樣緩沖液和5jliL還原劑中并在10min內(nèi)力。熱到70。C。樣品在200V恒定電壓下在10°/。BisTris月交(Invitrogen,Carlsbad,CA)中進(jìn)4亍電穿孔。將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜并在封閉緩沖液(5%奶粉、磷酸鹽緩沖液中(PBS)的0,5%牛清蛋白(Gibco))中封閉2h。膜在4°C下用初始抗體(primaryantibody)(山羊多克隆抗毒素A(ListBiologicalLaboratories,Inc.)1:2000在去于閉纟爰沖液中i咅養(yǎng)過夜。然后，用沖洗緩沖液(PBS,含0.05%的TweenTM,Sigma)沖洗膜，按照指示的稀釋度向封閉緩沖液中加入辣根-過氧化物酶(HRP)-偶耳關(guān)的抗山羊二抗(1:8000)(SigmaInc.,St.Louis，MO)并^f呆才爭(zhēng)lh。如上對(duì)月莫進(jìn)行沖洗，并采用AmershamECL顯影系統(tǒng)(GEHealthcare,Piscataway，NJ)進(jìn)行顯影。實(shí)施例4動(dòng)物接種和艱難梭菌毒素對(duì)抗為了實(shí)施免疫原性研究，獲得6-8周大的近親繁殖BALB/c小鼠(每組6只小鼠)和遠(yuǎn)親雜交的CD-l、Swiss-Webster小鼠(每組5只小鼠)(馬薩諸塞州，威爾明頓，查理斯河實(shí)驗(yàn)室)并在洛克菲勒大學(xué)(RockefellerUniversity)的實(shí)-驗(yàn)室的動(dòng)物研究中心(LaboratoryAnimalResearchCenter)進(jìn)4亍々司養(yǎng)。戶斤有的步芬聚者卩是才安照洛克菲勒大學(xué)的動(dòng)物護(hù)理和^吏用委員會(huì)(AnimalCareandUseCommittee)糸匕準(zhǔn)的方案進(jìn)4亍實(shí)施的。得到用于接種的無內(nèi)毒素(<100IU)的質(zhì)粒DNA(AldevronInc.,Fargo,ND)。5組小鼠(每組5-10只)在第0周和第2周用50昭質(zhì)粒DNA(分為兩份劑量)通過標(biāo)注的注射器肌肉注射(IM)或電穿孔強(qiáng)化(EP)肌肉注射遞送到每一個(gè)后肢進(jìn)行接種。對(duì)于艱難梭菌毒素A對(duì)抗實(shí)驗(yàn)，組1^義注射pVAXTM;組2注射TxA-RBD(IM);組3注射tPA-TxA-RBD(IM);組4注射TxA-RBD(EP);而組5注射tPA-TxA-RBD(EP)。參見圖11。對(duì)于艱難梭菌毒素B對(duì)抗實(shí)驗(yàn)，組l僅注射pVAXTM;組2注射TxB-RBD(IM);組3注射tPA-TxB-RBD(IM);組4注射TxB-RBD(EP);而組5注射tPA-TxB-RBD(EP)。參見圖18。在對(duì)抗毒素前，在注射6周后獲取血清用于進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。在對(duì)抗艱難梭菌毒素A(圖19)和對(duì)抗艱難梭菌毒素B(圖20)后90h內(nèi)監(jiān)控動(dòng)物癥狀或死亡情況。實(shí)施例5抗毒素ELISAIgG滴定度用在1MNaHC03緩沖液中的0.5pg純化的完全(whole)艱難梭菌毒素A或0.5|ag純化的完全艱難梭菌毒素B涂覆96-孔高蛋白結(jié)合性聚苯乙烯EIA4反(Costar9018,CorningInc.,Coming,NY),在4。C下過夜。第二天，用封閉緩沖液(PBS-T,5Q/。奶粉w/v,0,5%牛血清清蛋白w/v)封閉l.5h。以指示的稀釋度一式兩份地加入從實(shí)施例4的方案中獲得的血清樣品，并在37。C下培養(yǎng)2h。用沖洗緩沖液(PBS-0.05%吐溫20tm)沖洗板5次，并用石咸性磷酸酶(AKP)偶聯(lián)的大鼠抗小鼠二抗(I:IO，OOO，在封閉緩沖液中)培養(yǎng)lh。采用AMPAKELISA顯影試劑盒4艮據(jù)廠商i兌明書(DAKOCorporation,Carpinteria,CA)對(duì)板進(jìn)行顯影。在490nm下測(cè)定^反孔的光密度(DynexTechnologies,Chantilly,Va)。端點(diǎn)抗體滴定度表明最后稀釋4勿(thelastdilution)的又又向稀釋(reciprocaldilution)才是供了比在實(shí)施的最低稀釋度下的血清對(duì)照O.D.值高2倍的O.D.值。參見圖11、18、21和23。實(shí)施例6TxB-RBD和tPA-TxB-RBD質(zhì)粒的質(zhì)粒i殳計(jì)以下質(zhì)粒采用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)構(gòu)建(Sambrook，etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989》。對(duì)與艱難梭菌菌林VPl10463的毒素B蛋白相應(yīng)的全長氨基酸序列(基因庫登記號(hào)P18177，參見圖12)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并識(shí)別與占據(jù)該蛋白羧基-末端第三位的假定受體結(jié)合域相應(yīng)的殘基(圖17)。RBD氨基酸序列在計(jì)算機(jī)中(/"w7/co)使用人細(xì)胞中最常用的密碼子反轉(zhuǎn)i,成新的基因序列(http:Vwww.entelechon.com/)。A7zd限制序列、Kozak序列和曱硫氨酸起始位點(diǎn)占據(jù)SEQ.ID.NO.:19(圖14)的116堿基對(duì)。優(yōu)化的基因由SEQ.ID.NO.:19(圖14)的23-1861堿基對(duì)構(gòu)成。最后，五co^l限制序列包含在3'端，S"w/iYl限制位點(diǎn)引入到SEQ.ID.NO.:19(圖14)的17-22位置，以容許以后的《奮飾。然后，一奪該基因遞交進(jìn)4亍商業(yè)合成(BlueHeronBiotechnology,Seattle:WA)。基因插入片段被消化(Md/Eco招，NewEnglandBiolabs)而結(jié)合到商購載體中，即pVAXTM(lnvitrogen,Carlsbad,CA)，其是滿足美國食品和藥品監(jiān)督局關(guān)于用于人的準(zhǔn)則的質(zhì)粒。消化插入片l殳(5aw//l/￡:co/l),并將其插入具有事先定位的組織纖溶酶原激活子39(tPA)序列以及上述A^d、Kozak和ATG起始密碼子(圖17)的pVAXTM載體中。在進(jìn)行限制性消化并采用T4連接酶(Roche)連接過夜之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10化學(xué)上適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌細(xì)胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通過在補(bǔ)充有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)平板上進(jìn)行涂板選擇出陽性克隆。通過限制性消化和DNA測(cè)序來驗(yàn)證.基因插入物(GeneWiz,NorthBrunswick,NJ)。兩種質(zhì)粒(TxA-RBD和tPA-TxA-RBD)僅僅在ATG起始密碼子之后是否存在tPA前導(dǎo)序列方面有所不同。實(shí)施例7組合疫苗免疫原性方案BALB/c小鼠，每組5只，用編碼pVAXTM、TxA-RBD、TxB-RBD或TxA-RBD和TxB-RBD組合物(此處稱為"TxA-TxB")的DNA在第0周和第2周進(jìn)行接種。才姿照以下劑量4是4共DNA:pVAX、TxA-RBD和TxB-RBD以50(ag/100|il的無菌鹽水在兩后月支間分開注射。關(guān)于TxA-TxB共遞送，對(duì)于每種DNA質(zhì)粒(即TxA-RBD質(zhì)粒和TxB-RBD質(zhì)粒)，將DNA調(diào)制為50昭/50pd無菌鹽水，然后，進(jìn)行混合，從而在單次注射中4是供每種質(zhì)粒的濃度為50ng/100pl。在用氯胺酮/甲苯噻溱通過腹膜內(nèi)注射進(jìn)行鎮(zhèn)靜后，通過眼球后穿弟'J(retro-orbitalpuncture)q欠集血才羊。才艮據(jù)先前在實(shí)施例5中所述的方案進(jìn)行ELISA,參見圖21中的結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)開始后8星期，用在100juL無菌鹽水中的300ng純化艱難梭菌毒素A通過腹膜內(nèi)(IP)注射對(duì)抗(激發(fā))動(dòng)物，接著每12h監(jiān)看癥狀或死亡情況。結(jié)果參見圖22。在還存在的動(dòng)物中用在50juL無菌鹽水中的400ng純化的艱難梭菌毒素B通過靜脈注射進(jìn)行對(duì)抗，接著每12h監(jiān)看癥狀或死亡情況。結(jié)果參見圖22。實(shí)施例8倉鼠免疫原性實(shí)-瞼倉鼠(敘利亞金黃倉鼠，每組5只)用pVAXTM、TxA-RBD或TxB-RBD接種。所有接種采用電穿孔(EP)-強(qiáng)化肌肉注射，按照IchorMIDicalSystems,Inc.指示采用3.0mmTriGrid-EP分析來進(jìn)4亍。TxA-RBD或TxB-RBD以兩種劑量沖是供1)200ng/100|il無菌鹽K在兩后月t間分開注射或2)22jug/25juL無菌鹽K注射單個(gè)后月支。動(dòng)物在第0周和第4周注射，通過眼球后穿刺采集血清以進(jìn)行抗-毒素ELISA。在動(dòng)物上實(shí)施的所有步驟都是都是按照洛克菲勒大學(xué)方案進(jìn)行實(shí)施。96-孔高蛋白結(jié)合性聚苯乙烯EIA板(Costar9018,CorningInc.,Corning,NY)用在PBS中的50ng純化的完全艱難梭菌毒素A或50ng純化的完全艱難梭菌毒素B涂覆，在4。C下過夜。第二天，用封閉緩沖液(PBS-T、5%奶粉w/v、0.5%牛血清清蛋白w/v)封閉1.5h。在封閉緩沖液中經(jīng)過一系列稀釋后一式兩份地加入血清樣品，并在37°C下培養(yǎng)2h。用沖洗姿爰沖液(PBS-0.05%吐溫20)沖洗々反5次，并用AKP-偶^:的抗倉鼠二抗培養(yǎng)lh。41采用AMPAKELISA顯影試劑盒根據(jù)廠商的說明書(DAKOCorporation,Carpinteria,CA)對(duì)才反子進(jìn)4亍顯影。在490nm下測(cè)定一反孔的光密度(DynexTechnologies,Chantilly,Va)。參見圖23。端點(diǎn)抗體滴定度表明最后稀釋物的雙向稀釋(reciprocaldilution)提供了比在實(shí)施的最低稀釋度下的血清對(duì)照O.D.值高2倍的O.D.值。權(quán)利要求1.一種包括編碼艱難梭菌毒素A受體-結(jié)合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10％的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中每一種氨基酸殘基至少約20%的所述框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中每一種氨基酸殘基至少約30%的所述沖匡內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中每一種氨基酸殘基至少約40%的所述框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中每一種氨基酸殘基至少約50%的所述*1內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少為40%。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少為50%。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少為60%。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中所述序列在SEQ.ID.NO.:9中列出。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中所述分子進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)附力口核苷酸。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的分子，其中所述附加核苦酸包括前導(dǎo)序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中所述分子結(jié)合至載體中。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子，其中所述載體是質(zhì)粒。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分子，其中所述質(zhì)粒是pVAX。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分子，其中所述質(zhì)粒是pUC。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子，其中所述序列編碼所述艱難梭菌毒素A的受體結(jié)合域的片段。17.—種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艱難梭菌毒素A抗體的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物給予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子包括編碼所述艱難才炎菌毒素A受體—結(jié)合域的核苦酸序列，其中才艮據(jù)表i,每一種氛基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。18.根據(jù)斥又利要求17所述的方法，其中所述結(jié)合至載體中的分子通過肌肉注射進(jìn)行給藥。19.根據(jù)4又利要求17所述的方法，其中所述結(jié)合至載體中的分子通過體內(nèi)電穿孔進(jìn)行給藥。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述結(jié)合至載體中的分子通過DNA生物噴射器進(jìn)行給藥。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,通過基因槍進(jìn)行給藥。22.23.24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,SEQ.ID.NO.:9中列出。25.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，或多個(gè)附加核苷酸。26.才艮據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，序列。27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述結(jié)合至載體中的分子其中所述DNA分子的序列在其中所述分子進(jìn)一步包括一個(gè)其中所述附加核苦酸包括前導(dǎo)其中所述分子結(jié)合至載體中。其中所述載體是質(zhì)粒。其中所述質(zhì)并立是pVAX。其中所述質(zhì)粒是pUC。根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的至少約50%的核苷酸是鳥噤P令或胞嘧咬。根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的至少約60%的核苦酸是鳥噤f令或"包嘧，定。31.沖艮據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的序列編碼所述艱難4炎菌毒素A受體結(jié)合域的片^爻。32.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。33.—種用于降j氐人體內(nèi)感染艱難沖炎菌風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括向人體《會(huì)予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子包括編碼艱難梭菌毒素A受體-結(jié)合域的核苷酸序歹寸，其中才艮據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的？艮難4麥菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。34.—種用于在需要其的人體內(nèi)治療艱難梭菌感染的方法，所述方法包括向人體給予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子含有編碼艱難梭菌毒素A受體-結(jié)合域的核苦酸序列，其中才艮據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的才匡內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。35.—種包括編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域核普酸序列的DNA分子，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。36.—種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艱難一炎菌毒素B的抗體的方法，所述方法包4舌向所述哺乳動(dòng)物給予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子含有編碼所述艮難沖炎菌毒素B受體-結(jié)合域的核普酸序列，其中才艮據(jù)表i,每一種氛基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。37.—種用于降低人體內(nèi)感染^艮難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括向人體給予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子含有編碼艮難4炎菌毒素B受體-結(jié)合域的核苷酸序歹寸，其中根據(jù)表l,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的？艮難才炎菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。38.—種用于在需要其的人體內(nèi)治療？艮難沖炎菌感染的方法，所述方法包括向人體給予有效量的結(jié)合至載體中的DNA分子，其中所述DNA分子含有編碼艱難梭菌毒素B受體-結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表l，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。39.—種DNA分子，包括a.編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列，其中沖艮據(jù)表1,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率，以及b.編碼艱難梭菌毒素B受體結(jié)合域的核普酸序列，其中根據(jù)表1,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。40.—種用于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生艮難梭菌毒素A和毒素B抗體的方法，所述方法包i舌向所述哺乳動(dòng)物給予有效量的DNA分子，所述DNA分子包括a.編碼所述艮難一炎菌毒素A受體結(jié)合i或的核苦酸序列，其中根據(jù)表1,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率，以及b.編碼所述艮難4炎菌毒素B受體-結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。41.一種用于降低人體內(nèi)感染艱難梭菌風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括向人體給予有效量DNA分子，所述DNA分子包括a.編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表1,每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難沖炎菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率，以及b.編碼^艮難才炎菌毒素B受體-結(jié)合域的核苦酸序列，其中才艮據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:17的艱難梭菌毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的4吏用率。42.—種用于在需要其的人體內(nèi)治療？艮難才炎菌感染的方法，所述方法包括向人體纟合予有效量的DNA分子，所述DNA分子包括a.編碼艱難梭菌毒素A受體結(jié)合域的核苷酸序列，其中根據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ.ID.NO.:13的艱難梭菌毒素A對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率，以及b.編碼艱難沖炎菌毒素B受體-結(jié)合域的核苦酸序列，其中才艮據(jù)表1，每一種氨基酸殘基至少約10%的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有SEQ的艱難梭菌毒素B的對(duì)應(yīng)框內(nèi)密碼子具有更高的^f吏用率。全文摘要在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種DNA分子。該DNA分子包括編碼艱難梭菌毒素A或毒素B的受體-結(jié)合域的核苷酸序列，其中每一種氨基酸殘基至少約10％的框內(nèi)密碼子在人類基因組中比具有已知序列的艱難梭菌毒素A或毒素B對(duì)應(yīng)的框內(nèi)密碼子具有更高的使用率。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生艱難梭菌毒素A或毒素B的抗體的方法，以及用于降低感染艱難梭菌毒素A或毒素B風(fēng)險(xiǎn)的方法、以及用于治療艱難梭菌的方法。文檔編號(hào)A61K31/70GK101500581SQ200780029271公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2007年6月7日優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日發(fā)明者戴維·F·加德納申請(qǐng)人:科內(nèi)爾研究基金會(huì)