專利名稱：泰伐洛星作為抗病毒劑的用途的制作方法
專利說明泰伐洛星作為抗病毒劑的用途 本發(fā)明涉及一種抗生素在制備抗病毒藥劑中的用途。本發(fā)明還涉及一種治療病毒感染的方法，包括將一種抗生素給予病毒感染的受試者。
泰伐洛星(tylvalosin)是乙?；愇祯Ｌ肪?acetylisovaleryltylosin)的臨時(shí)INN名稱，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。含泰伐洛星的產(chǎn)品被稱為愛樂新

(

)。它被用于多種治療當(dāng)中，特別是用于治療農(nóng)場動物的多種細(xì)菌感染。泰伐洛星是一種泰樂菌素(tylosin)衍生物，具有下式
其中R是異戊酰。
當(dāng)以大規(guī)模方式尤其是集約方式進(jìn)行家畜類動物飼養(yǎng)時(shí)，它們趨向于患某些疾病。這些疾病還往往會通過家畜快速傳播。一種這樣的疾病是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)。PRRS是由病毒PRRSV引起的，并感染所有年齡段的豬。它具有呼吸和生殖兩種體征，并且被認(rèn)為每年造成全世界豬產(chǎn)業(yè)數(shù)億英鎊的損失。
PRRS經(jīng)常與細(xì)菌感染并發(fā)，特別是與豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)(M-hyo)感染并發(fā)。這種感染普遍存在于豬群中并能引起肺炎。當(dāng)豬同時(shí)感染了M-hyo和PRRSV時(shí)，肺炎會變得非常嚴(yán)重。如今，愛樂

(泰伐洛星)在患有和未患有PRRS的豬中均被用于治療M-hyo。
本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，愛樂

(泰伐洛星)本身可用于治療PRRSV。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，愛樂

(泰伐洛星)對所述病毒有直接效應(yīng)。
迄今為止，愛樂

僅被用于治療細(xì)菌感染，例如M-hyo。愛樂

(泰伐洛星)還沒有被用于治療病毒感染。雖然愛樂新

(泰伐洛星)已被用于治療患有PRRS的豬體內(nèi)的M-hyo，但是除了它對所述細(xì)菌感染有效果之外，并不知道它還對所述病毒有效果。
抗生素對病毒感染有效應(yīng)不是通?，F(xiàn)象。泰伐洛星是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。其他大環(huán)內(nèi)酯類對病毒有極其不同的效應(yīng)。替米考星(tilmicosin)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可有效地對抗一些包括PRRSV的病毒。然而，替米考星在抗病毒能力的細(xì)胞培養(yǎng)物測定中的毒性比泰伐洛星大的多。而且，與泰伐洛星最密切相關(guān)的抗生素——泰樂菌素，對PRRSV沒有效應(yīng)，并且不知道它對其他病毒有任何的效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽在制備用于預(yù)防或治療病毒感染的藥劑中的用途。
如上文指出的，泰伐洛星是一種被稱為3-O乙酰基-4＂-O-異戊酰泰樂菌素的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。泰伐洛星是本領(lǐng)域中熟知的。泰伐洛星的衍生物和代謝物包括與泰伐洛星密切相關(guān)的的任何化合物，或者在泰伐洛星溶于溶液中或被給予受試者時(shí)所形成的任何化合物。泰伐洛星的衍生物和代謝物包括大量被發(fā)現(xiàn)作為與泰伐洛星(特別是溶于溶液中)有關(guān)的物質(zhì)的化合物，例如3-O-乙酰脫碳糖泰樂菌素(Acetyldesmycosin)、3-O-乙酰泰樂菌素、3，4＂-二-O-乙酰泰樂菌素、a-O-乙?；?4＂-O-丙酰泰樂菌素、3-O-乙?；?4＂-O-異戊酰大菌素(Isovalerylmacrocin)、3-O-乙酰基-4＂O-丁基泰樂菌素、3-O-乙酰基-4＂-O-異戊酰瑞洛霉素(isovalerylrelomycin)、4＂-O-異戊酰泰樂菌素、3，20-二-O-乙?；?4＂-異戊酰瑞洛霉素和3，4″′-二-O-乙?；?4＂-O-異戊酰泰樂菌素。泰伐洛星可以為愛樂新

的形式。
當(dāng)泰伐洛星以可藥用酯的形式存在時(shí)，優(yōu)選它的烷基酯。當(dāng)泰伐洛星以可藥用鹽的形式存在時(shí)，可以使用任何合適的鹽。優(yōu)選與有機(jī)酸形成的鹽，特別是與諸如抗壞血酸、羥乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸的酸形成的鹽。
功能性衍生物、代謝物、酯和鹽以與泰伐洛星相同的方式發(fā)揮功能，也就是說，它們對于具體的病毒感染有類似的效應(yīng)。
特別優(yōu)選的是，本發(fā)明涉及泰伐洛星或者其酯或鹽在制備用于預(yù)防或治療病毒感染的藥劑中的用途。
術(shù)語病毒感染的意思是宿主中存在病毒顆粒。具體來說，它的意思是在受試者中存在正常情況下不出現(xiàn)于該宿主中的病毒顆粒，或者在所述宿主中是致病的或會引起疾病的病毒顆粒。
預(yù)防病毒感染的意思是，當(dāng)與暴露于病毒后未經(jīng)治療宿主的預(yù)期狀態(tài)相比較時(shí)，減少宿主中病毒顆粒的數(shù)目，減少或防止宿主中病毒顆粒的復(fù)制，減少或防止病毒復(fù)制的細(xì)胞病變效應(yīng)，減少或防止所述病毒侵入細(xì)胞質(zhì)，或者減少或防止病毒感染的病理效應(yīng)或體征/癥狀。
未經(jīng)治療的宿主是沒有接受根據(jù)本發(fā)明制備的藥劑的宿主。
所述預(yù)期狀態(tài)是暴露于病毒后未經(jīng)治療的宿主中可能的病毒顆粒數(shù)目、細(xì)胞病變效應(yīng)的水平、病理效應(yīng)或者體征/癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠預(yù)測這一點(diǎn)。
對病毒感染治療的意思是，當(dāng)與治療前的狀態(tài)相比較時(shí)，減少宿主中病毒顆粒的數(shù)目，減少或防止宿主中病毒顆粒的復(fù)制，減少或防止病毒復(fù)制的細(xì)胞病變效應(yīng)，減少或防止所述病毒侵入細(xì)胞質(zhì)，或者減少或防止病毒感染的病理效應(yīng)、臨床體征或癥狀。
當(dāng)宿主中病毒顆粒的數(shù)目得到減少，宿主中病毒顆粒的復(fù)制得到減少或防止，病毒復(fù)制的細(xì)胞病變效應(yīng)得到減少或防止，所述病毒侵入細(xì)胞質(zhì)得到減少或防止，或者病毒感染的病理效應(yīng)、臨床體征或癥狀得到減少或防止時(shí)，那么所述減少優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。例如，優(yōu)選的減少為至少25％，更優(yōu)選至少30％，還更優(yōu)選至少35％，最優(yōu)選至少40％。
宿主為高等生物，病毒使用其細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制。所述宿主可以為人或動物。所述宿主優(yōu)選地為動物，特別是家畜動物，例如牛、馬、家禽或豬。所述宿主特別優(yōu)選地為豬。或者，所述宿主優(yōu)選地為人。
所述病毒優(yōu)選地為使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
術(shù)語內(nèi)體途徑和溶酶體途徑是本領(lǐng)域中熟知的。它們是指被某些病毒使用來侵入細(xì)胞的機(jī)制。為了啟動復(fù)制，所有病毒都必須有侵入靶細(xì)胞的途徑。病毒通常以兩種途徑做到這一點(diǎn)，通過在細(xì)胞質(zhì)膜處的直接機(jī)制，或者通過細(xì)胞內(nèi)攝作用侵入諸如內(nèi)體(endosome)或溶酶體的細(xì)胞區(qū)室中。使用內(nèi)體和溶酶體侵入細(xì)胞的病毒還必須與所述內(nèi)體膜或溶酶體膜融合或者透過所述膜，以釋放至細(xì)胞質(zhì)中。
內(nèi)體是攜帶通過胞吞作用新攝入的物質(zhì)的細(xì)胞器。該術(shù)語在本領(lǐng)域中是熟知的。
溶酶體是含降解酶的細(xì)胞器。該術(shù)語在本領(lǐng)域中是熟知的。
許多使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑的病毒需要特定的pH，目的是經(jīng)歷構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化會觸發(fā)與內(nèi)體膜融合及細(xì)胞入侵。
不希望拘囿于具體的理論，本發(fā)明人相信泰伐洛星會進(jìn)入細(xì)胞、在內(nèi)體和溶酶體中富集，并影響這些內(nèi)體和溶酶體中的pH。本發(fā)明人相信，內(nèi)體或溶酶體pH的這種變化可阻止所述內(nèi)體或溶酶體中的病毒顆粒與所述內(nèi)體膜或溶酶體膜的融合，從而阻止所述病毒侵入細(xì)胞質(zhì)和復(fù)制。
所述病毒優(yōu)選是使用晚期內(nèi)體途徑或溶酶體途徑的病毒。
晚期內(nèi)體是一種前溶酶體細(xì)胞器(pre-lysosomal organelle)。術(shù)語晚期是指胞吞的分子被送遞至所述晚期內(nèi)體中所耗的時(shí)長。晚期內(nèi)體比早期內(nèi)體更圓，并且位于靠近核的地方。晚期內(nèi)體具有比早期內(nèi)體更酸的pH。術(shù)語晚期內(nèi)體在本領(lǐng)域中是熟知的。
所述病毒優(yōu)選是使用受Rab7調(diào)控的內(nèi)體途徑或溶酶體途徑的病毒。
Rab蛋白是存在于某些細(xì)胞區(qū)室的細(xì)胞質(zhì)面上的小鳥苷三磷酸酶(small GTPase)。它們具有調(diào)節(jié)通過這些區(qū)室膜的運(yùn)輸?shù)墓δ?。Rab7具有調(diào)節(jié)晚期內(nèi)體和溶酶體中運(yùn)輸?shù)墓δ堋?br> 所述病毒優(yōu)選地是需要內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的pH低于6.5、優(yōu)選低于6、更優(yōu)選低于5.5、還更優(yōu)選低于5、最優(yōu)選低于4.5的病毒。
可以使用pH敏感染料(例如在中性pH下發(fā)藍(lán)色熒光且在低pH下發(fā)黃色/綠色熒光的染料)測量內(nèi)體或溶酶體的pH。藍(lán)色黃色的比值可提供內(nèi)體/溶酶體pH的一個(gè)量度(Diwu，Chen，Zhang，Klaubert andHaughland(1999)Chemistry and Biology，第6卷，第7期，411-418)。
一種病毒是否使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞侵入是普遍已知的。在這一點(diǎn)未知的不常見情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過在存在已知會改變內(nèi)體pH或溶酶體pH的化合物時(shí)測試病毒侵入細(xì)胞，或者通過使用缺失特定Rab蛋白的突變體，可以確認(rèn)病毒是否使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑，檢驗(yàn)該途徑的哪一部分被使用，或者確認(rèn)pH依賴性或Rab蛋白依賴性。例如，可以使用以下的化學(xué)抑制劑 ·氯喹或氯化銨，它們通過作為質(zhì)子池(proton sink)來升高內(nèi)體pH；以及 ·諾考達(dá)唑(nocodazole)，它將微管解聚，并阻斷從早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體的轉(zhuǎn)換。
如果病毒在存在氯喹或氯化銨時(shí)不能侵入細(xì)胞，那么可以認(rèn)為它是pH依賴的，需要酸性pH來感染細(xì)胞。如果是諾考達(dá)唑阻止病毒感染細(xì)胞，那么可以認(rèn)為它使用晚期內(nèi)體途徑或溶酶體途徑侵入細(xì)胞，其侵入的這些途徑被諾考達(dá)唑阻斷。
或者，可以使用以下的顯性負(fù)突變體 ·rab5 S34N突變體，它阻斷從質(zhì)膜中網(wǎng)格蛋白包被的小窩到早期內(nèi)體的轉(zhuǎn)換，以及 ·rab7 T22N突變體，它阻斷從早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體的轉(zhuǎn)換。
被rab5 S34N突變體抑制的病毒需要在約pH6.5時(shí)通過早期內(nèi)體。被rab7 T22N突變體抑制的病毒需要在約pH5時(shí)通過晚期內(nèi)體。
所述病毒可以是，例如來自任何以下科的病毒腺病毒科(Adenoviridae)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、環(huán)狀病毒科(Circoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、纖絲病毒科(Filoviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、微小核糖核酸病毒科(Pieornaviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。
再者，所述病毒可以是，例如來自任何以下屬的病毒哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)、非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)、漢坦病毒屬(Hantavirus)、環(huán)狀病毒屬(Circovirus)、冠狀病毒屬(Coronavirus)、黃病毒屬(Flavivirus)、瘟病毒屬(Pestivirus)、肝炎病毒屬(Hepacivirus)、甲型流感病毒(Influenza virusA)、貧病毒屬(Isavirus)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)、腸道病毒屬(Enterovirus)、鼻病毒屬(Rhinovirus)、正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、輪狀病毒屬(Rotavirus)和甲病毒屬(Alphavirus)。
具體來說，術(shù)語病毒可以指任何一種或多種的以下病毒或者它們的任何組合腺病毒7、PRRSV、流感(包括人、禽、豬、馬、牛和狗流感)、鮭魚貧血病毒(salmon anaemia virus)、豬瘟(classical swine fever)、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲豬瘟病毒、普馬拉病毒(Puumalavirus)、傳染性支氣管炎病毒、傳染性腸胃炎、SARS CoV、馬堡病毒(Mraburg virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、西尼羅河病毒(West Nilevirus)、黃熱病病毒(yellow fever virus)、蜱傳腦炎病毒(tick borneencephalitis virus)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine diarrhoea virus)、犬細(xì)小病毒、柯薩奇B3病毒(Coxsackie B3)、柯薩奇B5病毒(Coxsackie B5)、禽呼腸孤病毒(avian reovirus)、輪狀病毒、塞姆利基森林病毒(Semlikiforest virus)和2型豬環(huán)狀病毒(porcine circo type 2)。
所述病毒優(yōu)選為PRRSV。
或者，所述病毒優(yōu)選不是PRRSV。
在另一個(gè)備選方案中，所述病毒優(yōu)選地為流感，特別是人流感，具體地是甲型(A)或乙型(B)人流感毒株，特別是甲型人流感毒株。
優(yōu)選的病毒的詳細(xì)情況在表6給出。
此外，本發(fā)明提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽在制備用于治療任何一種或多種的以下病毒(包括它們的任一組合)的藥劑中的用途腺病毒7、PRRSV、流感(包括人、禽、豬、馬、牛和狗流感)、鮭魚貧血病毒、豬瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲豬瘟病毒、普馬拉病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性腸胃炎、SARSCoV、西尼羅河病毒、馬堡病毒、埃博拉病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、犬細(xì)小病毒、柯薩奇B3病毒、柯薩奇B5病毒、禽呼腸孤病毒、輪狀病毒、塞姆利基森林病毒和豬環(huán)狀病毒2型。
另外，本發(fā)明提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽在制備用于預(yù)防或治療本文中定義的病毒感染和預(yù)防或治療細(xì)菌感染的藥劑中的用途。
所述病毒感染的預(yù)防或治療可以與所述細(xì)菌感染的預(yù)防或治療同時(shí)進(jìn)行，或者在其之后或之前進(jìn)行。
術(shù)語細(xì)菌感染的意思是在宿主中存在細(xì)菌。具體來說，它的意思是在受試者中存在正常情況下不出現(xiàn)于該宿主中的細(xì)菌或在所述宿主中是致病的或會引起疾病的細(xì)菌；或者在所述宿主的部位中存在正常情況下不出現(xiàn)的細(xì)菌。
預(yù)防細(xì)菌感染的意思是，當(dāng)與暴露于細(xì)菌后未經(jīng)治療宿主的預(yù)期狀態(tài)相比較時(shí)，減少宿主中細(xì)菌的數(shù)目；減少或防止宿主中細(xì)菌的復(fù)制；或者減少或防止細(xì)菌感染的病理效應(yīng)或者臨床體征或癥狀。
未經(jīng)治療的宿主是沒有接受根據(jù)本發(fā)明制備的藥劑的宿主。
所述預(yù)期狀態(tài)是暴露于細(xì)菌后在未經(jīng)治療的宿主中可能的細(xì)菌數(shù)目、病理效應(yīng)或者臨床體征或癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠預(yù)測這一點(diǎn)。
對細(xì)菌感染治療的意思是，當(dāng)與治療前的狀態(tài)相比較時(shí)，減少宿主中細(xì)菌的數(shù)目；減少或防止宿主中細(xì)菌的復(fù)制；或者減少或防止細(xì)菌感染的病理效應(yīng)或者臨床體征或癥狀。
所述細(xì)菌感染可以是對泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽治療敏感的任何感染。具體來說，所述細(xì)菌感染可以是任何一種或多種以下細(xì)菌的感染 支原體屬(Mycoplasma)的種(豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)、豬滑液囊支原體(M.hyosynoviae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、雞毒支原體(M.gallisepticum)、滑液囊支原體(M.synoviae)、火雞支原體(M.meleagridis)、牛支原體(M.bovis)、牛鼻支原體(M.bovirhinis)) 鼻氣管鳥桿菌(Orninthobacterium rhinotracheale) 支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) 胸膜肺炎放線桿菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae) 多殺性巴斯德氏桿菌(Pasteurella multocida) 溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica) 馬紅球菌(馬棒狀桿菌)(Rhodococcus(Corynebacterium)equi)鏈球菌(Streptococci)(豬鏈球菌(Strep.suis)、化膿性鏈球菌(Strep.pyogenes)) 葡萄球菌(Staphylococci)(金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)、表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)) 豬痢疾短螺旋體(Brachyspira hyodysenteria) 多毛短螺旋體(Brachyspira pilosicoli) 細(xì)胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsonia intracellularis) 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) (梭菌屬(Clostridium)的多個(gè)種) 白喉?xiàng)U菌(corynebacterium diphtheriae) 觸酶氣球菌(Aerococcus catalasicus) 粘乳產(chǎn)堿菌(Alcaligenes viscolactis) 藤黃微球菌(Micrococcus luteus) 黃色微桿菌(Microbacterium tlavum) 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 立克次氏體屬種(Rickettsia spp) 衣原體屬種(Chlamydia spp) 李斯特菌屬種(Listeria spp) 紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) 漢賽巴通體(Bartonella henselae) 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori) 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、乳房鏈球菌(Strep.uberis) 壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum) 鉤端螺旋體屬種(Leptospira spp) 所述細(xì)菌感染優(yōu)選地為支原體種的感染，特別是豬肺炎支原體感染。
許多病毒感染經(jīng)常與其他病毒感染和/或細(xì)菌感染聯(lián)合出現(xiàn)，使用一種藥劑即能治療不止一種感染將是特別有用的。例如，豬商業(yè)化生產(chǎn)的最重要經(jīng)濟(jì)疾病之一是被稱為豬呼吸道綜合癥(PRDC)的疾病。它是多因素的，涉及許多的病毒和細(xì)菌，包括PRRSV、2型豬環(huán)狀病毒、豬流感、豬冠狀病毒和偽狂犬病病毒(奧葉茲基氏病(Aujeszky’s))，以及細(xì)菌病原體豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴斯德氏桿菌、豬鏈球菌和支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。從而，當(dāng)所述病毒感染是PPRSV和/或豬流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選地是豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴斯德氏桿菌、豬鏈球菌或支氣管敗血性博德特氏菌中的一種或多種的感染。
在牛中有類似的呼吸道疾病綜合癥，這種綜合癥與牛病毒性腹瀉病毒(BVD)、副流行性感冒(parainfluenza)(PIV)、牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytical virus)(BRSV)、傳染性牛鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis)(IBR)及巴斯德氏菌(Pasteurella)相關(guān)。牛支原體(Mycoplasma bovis)也可能會加重這種疾病。
因此，當(dāng)所述病毒感染是牛病毒性腹瀉病毒的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選地是溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)桿菌或牛支原體的感染。
在家禽中有許多低致病的禽流感病毒，這些病毒與在雞毒支原體也存在時(shí)很大增加的疾病相關(guān)。高死亡率和發(fā)病率出現(xiàn)于雙重感染的群體中。
因此，當(dāng)所述病毒感染是禽流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選地是雞毒支原體感染。
人的流感病毒感染可使該個(gè)體易于受第二細(xì)菌的感染，所述細(xì)菌例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性鏈球菌(Streptococcihaemolyticus)、肺炎球菌(Pneumococci)、銅綠假單胞菌(Pseudomanoasaeruginosa)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。
因此，當(dāng)所述病毒感染是人流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選地是金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌中的一種或多種的感染。
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是呼吸道疾病的常見的誘因(common cause)，它與流感病毒和呼吸道合胞病毒的共同感染已被報(bào)道，這是因?yàn)橛羞@樣的事實(shí)，即肺炎支原體在流感爆發(fā)中可重疊感染。
因此，或者說，當(dāng)病毒感染是流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選地為肺炎支原體的感染。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或治療病毒感染的方法，包含將泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽，或者含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽的藥物組合物給予已感染病毒的受試者。
所述方法同時(shí)還用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染。
在本發(fā)明的方法中給予的藥物組合物包含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽，以及任一藥用載體、佐劑或運(yùn)載體(vehicle)?？捎糜谒鏊幬锝M合物中的可藥用載體、佐劑和運(yùn)載體包括，但不限于，離子交換劑、鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)例如磷酸鹽、甘油、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)例如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅溶膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇以及羊毛脂。
可用通過以下方式給予所述藥物組合物口服、經(jīng)腸胃外、通過吸入噴霧、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、含服、經(jīng)陰道、經(jīng)局部、經(jīng)皮膚或經(jīng)植入型藥盒。本發(fā)明的藥物組合物可以包含無毒可藥用的任何常規(guī)載體、佐劑或運(yùn)載體。本文使用的術(shù)語腸胃外的包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
所述藥物組合物可以為無菌注射制劑的形式，例如為無菌注射用的水性懸液或油性懸液?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域的已知技術(shù)使用合適的分散劑或濕潤劑(例如吐溫80)及助懸劑配制該懸液。該無菌注射用制劑還可以為溶于可腸胃外用的無毒稀釋劑或溶劑的無菌注射用溶液或懸液，例如為溶于1，3-丁二醇的溶液。甘露醇、水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液在可以應(yīng)用的可用運(yùn)載體及溶劑的范圍內(nèi)。另外，無菌不揮發(fā)性油通常被用作溶劑或助懸介質(zhì)?；诒疚牡哪康模梢允褂萌魏螠睾偷牟粨]發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。在注射劑的制備中可使用脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，也可使用天然的可藥用油，例如橄欖油或蓖麻油(特別是以它們的聚氧乙烯化的形式)。這些油溶液或懸液還可以包含長鏈的醇稀釋劑或分散劑，例如Ph.Helv或類似的醇。
可以以任何可口服的劑型經(jīng)口服給予所述藥物組合物，所述劑型包括，但不限于，膠囊、片劑以及水性懸液和溶液。在用于口服的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還添加潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于以膠囊形式的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)通過口服給予水性懸液時(shí)，所述活性成分可與乳化劑及助懸劑結(jié)合。如果需要，可添加某些甜味劑和/或增香劑和/或著色劑。
還可以以用于直腸給藥的栓劑的形式給予所述藥物組合物。這些組合物可以通過將本發(fā)明的化合物與合適的非刺激性賦形劑(excipient)混合來制備，所述賦形劑在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體，因此將在直腸中熔化以釋放所述活性組分。這種材料包括，但不限于，可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
可以以鼻氣霧劑或吸入劑給予所述藥物組合物。這種組合物可根據(jù)藥物配制領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備并且可被制成溶于鹽水的溶液，并應(yīng)用苯甲醇或其他適宜的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物，以及/或者本領(lǐng)域中已知的其他增溶劑或分散劑。
所述受試者可以是任何病毒感染的受試者。具體而言，所述受試者可以為人或動物。所述宿主優(yōu)選地為動物，特別是家畜動物例如牛、馬、家禽或豬。所述宿主特別優(yōu)選地為豬?；蛘撸鏊拗鲀?yōu)選地為人。
下面將參照以下附圖僅通過示例的方式詳細(xì)描述本發(fā)明，其中

圖1所示為存在愛樂新

(泰伐洛星)的情況下，暴露于PRRSV后感染的細(xì)胞數(shù)目的測定結(jié)果； 圖2所示為存在愛樂新

(泰伐洛星)的情況下，暴露于流感后感染的MDCK細(xì)胞數(shù)目的測定結(jié)果； 圖3所示為存在愛樂新

(泰伐洛星)的情況下，暴露于流感后感染的Caco-2細(xì)胞數(shù)目的測定結(jié)果； 圖4所示為存在愛樂新

(泰伐洛星)的情況下，暴露于流感后感染的HeLa細(xì)胞數(shù)目的測定結(jié)果； 圖5所示為時(shí)間和濃度對泰伐洛星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚的效應(yīng)。a)將HRT-18細(xì)胞用0.5、5或50μg/mL泰伐洛星孵育4或24小時(shí)。采集雙份的培養(yǎng)基樣品(白色柱和淺灰色柱)和細(xì)胞樣品(黑色柱和深灰色柱)。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg泰伐洛星/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg泰伐洛星/mg細(xì)胞。b)計(jì)算每個(gè)樣品中泰伐洛星的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(樣品1為黑色柱，樣品2為白色柱)； 圖6所示為泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚。a)將HRT-18細(xì)胞用10μg/mL每種抗生素孵育4或24小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集雙份細(xì)胞樣品(白色柱和黑色柱)，并采集一份培養(yǎng)基樣品(灰色柱)。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg大環(huán)內(nèi)酯/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg大環(huán)內(nèi)酯/mg細(xì)胞。b)計(jì)算每種大環(huán)內(nèi)酯的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(樣品1為黑色柱，樣品2為白色柱)； 圖7所示為泰伐洛星在極化的Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸。將Caco-2細(xì)胞用頂室(apical chamber)(a)或底外側(cè)室(basolateral chamber)(b)中的100μg/mL泰伐洛星孵育30分鐘(淺灰色柱)、60分鐘(黑色柱)、120分鐘(白色柱)和240分鐘(深灰色柱)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集雙份細(xì)胞樣品并從兩個(gè)室中采集雙份培養(yǎng)基樣品。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg泰伐洛星/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg泰伐洛星/mg細(xì)胞。在將泰伐洛星加入至頂室(c)和底外側(cè)室(d)的情況下，計(jì)算樣品的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(樣品1為黑色柱，樣品2為白色柱)。對在頂室給藥后的底外側(cè)室培養(yǎng)基(e)和在底外側(cè)室給藥后的頂室培養(yǎng)基(f)取樣，并將泰伐洛星濃度以投入量百分比的形式繪圖； 圖8所示為泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在極化的Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸。a)將Caco-2細(xì)胞用頂室中的10μg/mL泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星孵育30分鐘(淺灰色柱)、60分鐘(黑色柱)、120分鐘(白色柱)和240分鐘(深灰色柱)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集雙份細(xì)胞樣品并從兩室中收集雙份培養(yǎng)基樣品。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg大環(huán)內(nèi)酯/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg大環(huán)內(nèi)酯/mg細(xì)胞。b)計(jì)算樣品的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(樣品1為黑色柱，樣品2為白色柱)。c)對在頂室給藥后的底外側(cè)室培養(yǎng)基取樣，并將抗生素濃度以投入量百分比的形式繪圖； 圖9所示為泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在豬腎上皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚。a)將LLC-PK1細(xì)胞用10μg/mL每種抗生素孵育圖例中所示的時(shí)間。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集雙份細(xì)胞樣品和培養(yǎng)基樣品(灰色柱為32分鐘樣品，白色柱為75分鐘樣品，黑色柱為120分鐘樣品)。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg大環(huán)內(nèi)酯/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg大環(huán)內(nèi)酯/mg細(xì)胞。b)計(jì)算每種大環(huán)內(nèi)酯的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(灰色柱為32分鐘樣品，白色柱為75分鐘樣品，黑色柱為120分鐘樣品)；以及 圖10所示為大環(huán)內(nèi)酯抗生素在豬白細(xì)胞和雞白細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚。a)將豬白細(xì)胞用10μg/mL泰伐洛星或泰樂菌素孵育10或20分鐘。在孵育20分鐘后，將加載大環(huán)內(nèi)酯的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中，并繼續(xù)孵育30分鐘。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集雙份細(xì)胞樣品和培養(yǎng)基樣品(灰色柱為10分鐘沖洗，白色柱為20分鐘沖洗，黑色柱為30分鐘沖洗)。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg大環(huán)內(nèi)酯/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg大環(huán)內(nèi)酯/mg細(xì)胞。b)計(jì)算每種大環(huán)內(nèi)酯的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(灰色柱為10分鐘，白色柱為20分鐘)。c)估計(jì)沖洗之后所述細(xì)胞中剩余的大環(huán)內(nèi)酯量，計(jì)算所述細(xì)胞中的保留量％并繪圖(黑色柱為30分鐘沖洗樣品)。d)將雞白細(xì)胞用10μg/mL泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星孵育15、30或60分鐘。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集雙份細(xì)胞樣品和培養(yǎng)基樣品(灰色柱為15分鐘，白色柱為30分鐘，黑色柱為60分鐘)。培養(yǎng)基中的濃度顯示為μg大環(huán)內(nèi)酯/mL培養(yǎng)基，而細(xì)胞中的濃度為μg大環(huán)內(nèi)酯/mg細(xì)胞。e)計(jì)算每種大環(huán)內(nèi)酯的細(xì)胞內(nèi)濃度細(xì)胞外濃度的比值并繪圖(灰色柱為15分鐘，白色柱為30分鐘，黑色柱為60分鐘)。
圖11所示為愛樂新

(泰伐洛星)、替米考星和泰樂菌素對MDCK細(xì)胞的流感病毒感染的效應(yīng)。
圖12所示為愛樂新

(泰伐洛星)對感染后PRRSV擴(kuò)散的效應(yīng)。圖13所示為各種化學(xué)藥品(氯丙嗪(chlorpromazine)、氯喹(chloroquine)、細(xì)胞松弛素D、諾考達(dá)唑(Nocodazole))和愛樂新

(泰伐洛星)對PRRSV的效應(yīng)。
圖14所示為各種劑量的氯喹對PRRSV、EAV(馬動脈炎病毒(equinearteritis virus))和FCV(貓杯狀病毒(feline calicivirus))復(fù)制的效應(yīng)。
圖15所示為愛樂新

(泰伐洛星)對流感病毒(Udorn毒株)的效應(yīng) a)細(xì)胞單層中病毒感染細(xì)胞的百分率 b)用于在用愛樂新

(泰伐洛星)預(yù)處理或未處理的細(xì)胞中定量病毒滴度的噬菌斑測定。PRRSV病毒的復(fù)制在處理的細(xì)胞單層中被抑制，僅檢測到殘留的病毒接種物。
圖16所示為各種大環(huán)內(nèi)酯對VR2332(美洲I型PRRSV毒株)復(fù)制的效應(yīng)。
圖17所示為VR2332侵入的測定結(jié)果。
圖18所示為泰伐洛星對HeLa細(xì)胞和HT29細(xì)胞的病毒感染的效應(yīng)。
圖19所示為測試泰伐洛星對內(nèi)體pH的效應(yīng)的吖啶橙測定的結(jié)果。
實(shí)施例 實(shí)施例1 PRRSV測定 MA 104細(xì)胞經(jīng)愛樂新

(泰伐洛星)或替米考星預(yù)處理4小時(shí)。然后在存在泰伐洛星或替米考星的情況下將細(xì)胞暴露于PRRSV。然后所述細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗3次以除去未結(jié)合的病毒，并加入含泰伐洛星或替米考星的新鮮培養(yǎng)基。將所述細(xì)胞繼續(xù)孵育24小時(shí)，隨后用4％甲醛進(jìn)行固定。使用豬多克隆抗PRRSV一抗以及FITC-標(biāo)記的抗豬二抗，通過間接免疫熒光檢測病毒感染。使用Leica共聚焦顯微鏡檢測免疫熒光。通過DAPI染色的細(xì)胞核，將顯示(由FITC染色產(chǎn)生的)綠色熒光的細(xì)胞記作陽性。
實(shí)施例2 流感測定 將各種濃度的泰伐洛星加入至MDCK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或CaCo-2細(xì)胞達(dá)2或4小時(shí)。然后將細(xì)胞暴露于甲型流感病毒PR8毒株(感染復(fù)數(shù)為10)。然后在4小時(shí)后將所述細(xì)胞用4％甲醛固定，并用兔抗NP一抗及Alexa Fluor 488抗兔二抗對流感核蛋白進(jìn)行染色。使用Leica共聚焦顯微鏡檢測免疫熒光。通過DAPI染色的細(xì)胞核，將顯示(由AlexaFluor 488染色產(chǎn)生的)綠色熒光的細(xì)胞記作陽性。
實(shí)施例3 比較愛樂新、泰樂菌素和替米考星的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸 在3種細(xì)胞類型——即上皮細(xì)胞(腸、腎)和白細(xì)胞中，測試了大環(huán)內(nèi)酯抗生素泰伐洛星、替米考星和泰樂菌素進(jìn)入細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)積聚的能力。泰伐洛星(3-乙?；?-異戊酰泰樂菌素)快速地進(jìn)入所有3種細(xì)胞類型，并且在白細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中達(dá)到最大濃度。它還通過頂室表面或底外側(cè)室表面進(jìn)入極化的Caco-2上皮細(xì)胞，在所述細(xì)胞內(nèi)富集并被運(yùn)輸至對側(cè)面。有相對少的泰樂菌素進(jìn)入所有細(xì)胞類型中，而替米考星進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)積聚的能力處于前兩者之間。對泰伐洛星的較多攝取可能與存在異戊?；鶊F(tuán)有關(guān)。雖然這3種抗生素都是大環(huán)內(nèi)酯類，但是至少在分布這方面它們顯示出了差異，這與其治療臨床疾病的效力有關(guān)。
已知大環(huán)內(nèi)酯抗生素可穿透細(xì)胞并在其中富集。這種弱堿性抗生素被捕捉到細(xì)胞的酸性環(huán)境中，特別是溶酶體中(Tulkens，1991)，并且也可能會在其他胞內(nèi)細(xì)胞器中富集。然而，在不同大環(huán)內(nèi)酯之間和不同細(xì)胞類型之間，進(jìn)入細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)富集的程度是不同的(Bosnar et al.，2005，Labro，1993)。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)報(bào)道了替米考星可在細(xì)胞內(nèi)富集(Scorneaux and Shrycock，1998a，b)。
聲稱有相似效力的3種大環(huán)內(nèi)酯抗生素為乙?；愇祯Ｌ肪?Tylvalosin，ECO Animal Health)、泰樂菌素(Tylan，Elanco AnimalHealth)和替米考星(Pulmotil，Elanco Animal Health)。泰伐洛星在最近已經(jīng)通過集中程序在歐盟(EU)范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療及預(yù)防豬中的地方流行性肺炎(豬肺炎支原體)，用于治療回腸炎(胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis))，以及用于治療及預(yù)于豬痢疾(赤痢螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae))。它在某些非EU國家中被用于治療及預(yù)防雞中的支原體病(雞毒支原體、滑液囊支原體(Mycoplasma synovae))。替米考星被用于治療豬的由肺炎支原體引起的肺炎，以及被用于治療雞群中與雞毒支原體相關(guān)的呼吸道感染。泰樂菌素被用于預(yù)防及控制地方流行性肺炎，用于預(yù)防及控制或者治療豬痢疾，以及被用于治療及控制胞內(nèi)勞森菌。它還被用于控制雞中的雞毒支原體的S6毒株。
因此，腸上皮細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞顯示為這些病原體的靶標(biāo)。有幾項(xiàng)關(guān)于大環(huán)內(nèi)酯對先天免疫系統(tǒng)或非特異性免疫系統(tǒng)的效應(yīng)的報(bào)道(Ianaro et al.，2000；Labro，1993；Labro，2000；Sunazuka et al.，(2003))。在體內(nèi)參與對抗微生物疾病的兩種主要的吞噬細(xì)胞類型是巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞(雞中為嗜異性粒細(xì)胞)。來源于血單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞是壽命相對較長的細(xì)胞，而嗜中性粒細(xì)胞壽命較短。現(xiàn)有技術(shù)已知兩種細(xì)胞類型在先天免疫系統(tǒng)中都是重要的。
研究了這三種抗生素在腸上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及白細(xì)胞(WBC)為代表的多種細(xì)胞類型中的攝取和富集。該研究使用了已建立的人腸上皮細(xì)胞系(HRT-18和Caco-2)，這是因?yàn)檫@兩個(gè)細(xì)胞類型保持了體內(nèi)腸上皮細(xì)胞的某些性質(zhì)。將將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于半透膜上時(shí)，它可形成極化的單層(使它們具有頂室表面和底外側(cè)室表面)?？蓪⑴囵B(yǎng)基同時(shí)置于所述半透膜之上及之下，并可以使用這些細(xì)胞研究分子的跨上皮運(yùn)輸。腸上皮細(xì)胞參與腸(腸內(nèi)腔)攝取抗生素。使用豬腎細(xì)胞作為上皮細(xì)胞類型的實(shí)例，并且還使用了雞WBC和豬WBC。
材料和方法 抗生素儲液 獲取的泰伐洛星為酒石酸鹽形式的水溶性產(chǎn)物(ECO AnimalHealth)。根據(jù)分析認(rèn)證(certificate of analysis)，用于口服溶液的泰伐洛星顆粒劑中活性成分泰伐洛星(3-乙?；?-異戊酰泰樂菌素)占70.71％。在此報(bào)告全文中，泰伐洛星是指活性成分乙酰基異戊酰泰樂菌素。Tylan Soluble(ELANCO Animal Health)形式的泰樂菌素被用作酒石酸鹽。使用Pulmotil AC(ELANCO Animal Health)形式的替米考星。替米考星源自于泰樂菌素B部分的發(fā)酵產(chǎn)物。
細(xì)胞系 HRT-18、Caco-2和LLC-PK1細(xì)胞來自于ECACC。HRT-18細(xì)胞被培養(yǎng)于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。Caco-2細(xì)胞被培養(yǎng)于補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM中。LLC-PK1細(xì)胞被培養(yǎng)于含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的Medium199培養(yǎng)基中。
豬白細(xì)胞和雞白細(xì)胞的制備 將豬血收集于肝素包被的BD vacutainer(6)中。將20mL血與30mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在50mL錐形離心管中混合。重復(fù)該過程以得到3支這樣的管。在2050×g下離心所述混合物10分鐘。將白細(xì)胞與下面的一些紅細(xì)胞收集到50mL錐形離心管中。加入PBS至大約50mL。制備63％的Percoll溶液，如下6.3mL Percoll(Sigma)、1.0mL1.5M NaCl、2.7mL H2O。向兩支50mL錐形離心管的每管中添加10mL63％的Percoll。使25mL經(jīng)重懸的白細(xì)胞小心地鋪在每份Percoll溶液的上方。形成了清晰的界面。將該材料在3000×g下離心10分鐘。在PBS/Percoll界面處出現(xiàn)清晰的白細(xì)胞帶。將白細(xì)胞收集于PBS(50mL)中，并在500×g下離心10分鐘。將細(xì)胞的片狀沉淀物再懸浮于培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素的格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基(Glasgow minimumessential medium))中。使用錐蟲藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
將用于分離豬WBC的相同方法用于雞WBC，不同之處是制備肝素(100I.U./mL)并將其與等體積的雞全血混合。
泰伐洛星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚的時(shí)間和濃度效應(yīng) 在存在0.5、5或50μg/mL泰伐洛星的情況下，于6cm組織培養(yǎng)皿中孵育HRT-18細(xì)胞。在4小時(shí)后，從培養(yǎng)箱中取出每種泰伐洛星濃度的兩個(gè)平皿，并取出無抗生素的兩個(gè)平皿。取出培養(yǎng)基樣品(約1mL)，置于貼上標(biāo)簽的Eppendorf管中，并放置在-20℃下保存。然后將剩下的培養(yǎng)基移除。每個(gè)細(xì)胞單層用PBS沖洗兩次，每次沖洗使用大約5mL。使用2mL塑料注射器的注射器內(nèi)芯輕輕地刮下所述細(xì)胞。在平皿中添加PBS(500μL)，并使用微量加液器將細(xì)胞輕輕地轉(zhuǎn)移至該培養(yǎng)基中。然后將該樣品置于Eppendorf管中，并在臺式離心機(jī)(Biofugepico，Heraeus instruments)中于8000×g下離心13秒。形成了明顯的細(xì)胞片狀沉淀物。使用微量加液器移除上清液，將細(xì)胞材料置于貼上標(biāo)簽的Eppendorf管中在-20℃下保存。在大約24小時(shí)后，從培養(yǎng)箱中取出剩余的組織培養(yǎng)皿，并如上述用于4小時(shí)樣品的方式進(jìn)行處理。然后將包括4小時(shí)樣品在內(nèi)的所有樣品在-70℃下保存。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 如上述制備HRT-18細(xì)胞，并使用第42代。將抗生素(泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星)儲液稀釋于生長培養(yǎng)基中，并將10μg/mL的每種抗生素添加至匯合的細(xì)胞單層中。將所述細(xì)胞在37℃下于5％ CO2的氛圍中培養(yǎng)4小時(shí)或24小時(shí)。按照上文所述，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞并就抗生素對其進(jìn)行測定。
在Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚及跨上皮運(yùn)輸 將Caco-2細(xì)胞以每孔0.8×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于0.4μm孔尺寸的Transwell Clear filter 6孔板上。在頂室和底外側(cè)室中用2mL培養(yǎng)基孵育細(xì)胞。每2天換一次培養(yǎng)基，持續(xù)10-14天。在第7、10和/或14天使用Millicell ERS裝置(Millipore)測量跨上皮的電阻，以識別所述細(xì)胞何時(shí)已被極化。>1000Ω的讀數(shù)說明細(xì)胞已被極化。
在不同時(shí)間點(diǎn)——上限至240分鐘，將不同的藥物(100μg/mL)置于頂室或底外側(cè)室中，收集頂室和底外側(cè)室中的培養(yǎng)基以及細(xì)胞，并分析其大環(huán)內(nèi)酯含量。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在豬腎細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 將LLC-PK1細(xì)胞在6cm2的塑料組織培養(yǎng)皿中用10μg/mL的不同大環(huán)內(nèi)酯孵育。在30、75和120分鐘時(shí)，如上文所述收集細(xì)胞及培養(yǎng)基。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在豬白細(xì)胞和雞白細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 將細(xì)胞用10mg/mL的每種抗生素孵育。將所有管置于37℃的旋轉(zhuǎn)混合儀上。在附注中所述的時(shí)間采集上清液樣品和細(xì)胞樣品。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)針對每種抗生素使用雙份樣品。
對含泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星的樣品的分析 將所有上清液樣品和細(xì)胞樣品冰凍(大約-20℃)運(yùn)輸至YorkBioanalytical Solutions(York，England)用于分析。簡而言之，稱量0.25g的緩沖液(含10％ FCS的RPMI培養(yǎng)基)至聚丙烯管中。將50μL體積的合適的工作溶液添加至質(zhì)量控制(QC)樣品中。將甲醇(50μL)添加至每個(gè)空白樣品中，用于制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物、回收樣品和試劑空白物。將體積為2.5mL的0.1M磷酸鹽緩沖液添加至每個(gè)樣品中，旋轉(zhuǎn)混合大約1分鐘，然后在4℃下于3220×g離心10分鐘。
對于液液純化階段，將上清液的等分試樣(100μL)轉(zhuǎn)移至聚丙烯管中。通過添加0.1M NaOH將pH調(diào)整至pH8-8.5，并旋轉(zhuǎn)混合。添加乙酸乙酯(5mL)，在罩蓋后將整個(gè)混合物搖晃10分鐘，然后在4℃下于3220×g下離心10分鐘。
將乙酸銨(20mM；未調(diào)整pH(pH native))-甲酸(1000:3，v/v)(100μL)添加至2mL聚丙烯收集板的每個(gè)孔中。將所述乙酸乙酯的等分試樣(100μL)轉(zhuǎn)移至所述聚丙烯收集板上，在氮?dú)庵姓舭l(fā)(40℃)，直至乙酸乙酯完全蒸發(fā)而乙酸銨被剩下。在除校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物之外的每個(gè)孔中添加甲醇(100μL)。
在含校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物的每個(gè)孔中，添加100μL的合適的校準(zhǔn)工作溶液。然后將樣品旋轉(zhuǎn)混合至少10分鐘，上樣至具有串聯(lián)質(zhì)譜分析的液相色譜。所述的方法適用于所述培養(yǎng)基樣品(以及所述校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物和質(zhì)量控制樣品)。
對于所述細(xì)胞，將樣品管稱重，并添加100μL乙腈。將所述樣品旋轉(zhuǎn)混合10秒，然后在4℃下于10285×g下離心5分鐘。將所述樣品轉(zhuǎn)移至聚丙烯管中，原始樣品管經(jīng)0.1M磷酸鹽緩沖液(1mL)沖洗。將其轉(zhuǎn)移至所述聚丙烯管中。進(jìn)行1mL的第二次沖洗，然后進(jìn)行0.5mL的最后一次沖洗。這時(shí)所述聚丙烯管與所述液體萃取結(jié)束時(shí)處于同一個(gè)階段，但存在細(xì)胞而不存在培養(yǎng)基。然后將其用于上述的樣品制備過程。使所述原始樣品管干燥(即蒸發(fā)掉任何剩余的溶劑)，然后再次稱重以確定所述樣品中細(xì)胞的重量，以使得每克細(xì)胞中的濃度得以確定。
結(jié)果 泰伐洛星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚的時(shí)間和濃度效應(yīng) 進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)隨時(shí)間不斷增加的濃度對泰伐洛星在腸上皮細(xì)胞系HRT-18中的細(xì)胞內(nèi)積聚的效應(yīng)。如圖5a中顯示的，泰伐洛星被快速地(在4小時(shí)內(nèi))攝取至HRT-18細(xì)胞中，與培養(yǎng)基中的濃度成正比。所述細(xì)胞積聚了高濃度的泰伐洛星——至少585μg/g細(xì)胞。對于泰伐洛星在培養(yǎng)基中的全部3種初始濃度，細(xì)胞濃度培養(yǎng)基濃度的比值(在圖5b中顯示)都是大約1:12。在24小時(shí)的孵育后得到類似的結(jié)果，但該比值更小。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 本發(fā)明人接著比較了泰伐洛星與相關(guān)的大環(huán)內(nèi)酯——泰樂菌素和替米考星在HRT-18細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚。如圖6a中顯示的，泰伐洛星更為快速地進(jìn)入HRT-18腸上皮細(xì)胞。在4小時(shí)的時(shí)候檢測到61.8μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均值，而在相同的時(shí)間點(diǎn)僅檢測到7.24μg替米考星/mg細(xì)胞的平均值。在24小時(shí)時(shí)出現(xiàn)57.6μg泰伐洛星/mg細(xì)胞和32.45μg替米考星/mg細(xì)胞的平均值。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，泰樂菌素都不容易進(jìn)入HRT-18細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值在圖6b中顯示。在4小時(shí)后，泰伐洛星積聚得到了在細(xì)胞內(nèi)富集5.13倍的平均值。僅在一個(gè)替米考星樣品中出現(xiàn)富集，且為1.32倍。在24小時(shí)后，泰伐洛星(5.34倍)和替米考星(4.64倍)的平均濃度比值類似。泰樂菌素沒有能力進(jìn)入HRT-18上皮細(xì)胞意味著該濃度比值小于1。
泰伐洛星在極化的Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸 本發(fā)明人接著檢驗(yàn)了泰伐洛星在另一種腸上皮細(xì)胞系——Caco-2中的細(xì)胞內(nèi)積聚。這些細(xì)胞當(dāng)在透化的支持物上培養(yǎng)時(shí)，可分化并被極化由于它們在細(xì)胞之間形成緊密連接，這導(dǎo)致形成了頂(上)室膜以及底外側(cè)(側(cè)和下)室膜。
圖7a顯示了當(dāng)在頂室培養(yǎng)基中添加泰伐洛星的時(shí)候，泰伐洛星在細(xì)胞中以及頂室和底外側(cè)室的培養(yǎng)基中的濃度。圖7b顯示了當(dāng)在底外側(cè)室中添加泰伐洛星的時(shí)候的相似的結(jié)果。泰伐洛星顯示出快速地進(jìn)入極化的Caco-2細(xì)胞。在頂室給藥后30分鐘檢測到428μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均細(xì)胞內(nèi)濃度(圖7a中的淺灰柱)，在底外側(cè)室給藥后檢測到493μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均細(xì)胞內(nèi)濃度(圖7b中的淺灰柱)。在頂室給藥后，細(xì)胞中的泰伐洛星濃度在60分鐘和120分鐘之間達(dá)到最大值(559.5-620μg泰伐洛星/mg細(xì)胞)，然后在240分鐘時(shí)減少到375μg泰伐洛星/mg細(xì)胞。已接受經(jīng)底外側(cè)室給予泰伐洛星的細(xì)胞沒有達(dá)到與在經(jīng)頂室給藥情況下的相同的細(xì)胞內(nèi)濃度水平。在孵育30分鐘后達(dá)到平均最大濃度值，所述細(xì)胞內(nèi)濃度在該時(shí)刻后降低，在240分鐘時(shí)降至155.5μg泰伐洛星/mg細(xì)胞。
所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值顯示于圖7c和7d中。在頂室給藥后(圖7c)，泰伐洛星快速地在Caco-2細(xì)胞中富集，在30分鐘后得到4.64的比值。該比值在60分鐘和120分鐘之間出現(xiàn)峰值(10.23-15.58的平均值)，然后在240分鐘時(shí)降低到5.85的平均值。在底外側(cè)室給藥后，泰伐洛星也顯示出快速富集——僅在30分鐘后就出現(xiàn)7的平均細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值。但在該時(shí)刻后，所述比率在240分鐘后降低至3.57。
本發(fā)明人還檢驗(yàn)了與給藥位點(diǎn)相對的室(即在將泰伐洛星添加至頂室時(shí)為底外側(cè)室)中的培養(yǎng)基，來研究泰伐洛星是否能被運(yùn)輸通過所述極化的上皮細(xì)胞。如圖7e(頂室給藥)和7f(底外側(cè)室給藥)中所示的，在相對的室中檢測到相似的泰伐洛星水平——240分鐘后泰伐洛星水平達(dá)給藥室的19％(圖7e)或22.05％(圖7f)。泰伐洛星在相對的室的培養(yǎng)基中的濃度增加與在所述細(xì)胞內(nèi)檢測到的泰伐洛星水平降低一致，這說明細(xì)胞內(nèi)濃度的降低可能是由于泰伐洛星進(jìn)入到細(xì)胞對側(cè)的培養(yǎng)基中所致。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在CaCo-2細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸 進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)來比較泰伐洛星與泰樂菌素和替米考星的細(xì)胞內(nèi)積聚和跨上皮運(yùn)輸，但是本發(fā)明人僅檢驗(yàn)了頂室給藥后的效應(yīng)。如圖8a中顯示的，泰伐洛星再次顯示了快速的進(jìn)入及積聚，在120分鐘后達(dá)到42.2μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的最大平均濃度值。如前文，泰伐洛星的細(xì)胞內(nèi)濃度在240分鐘的時(shí)間點(diǎn)降低(至34.3μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均值)。泰樂菌素不能容易地進(jìn)入極化的Caco-2細(xì)胞——在240分鐘后僅檢測到1.86μg泰樂菌素/mg細(xì)胞。替米考星顯示出比泰伐洛星慢的進(jìn)入及積聚。在120分鐘時(shí)的平均細(xì)胞內(nèi)濃度為8.6μg替米考星/mg細(xì)胞(與在相同時(shí)間點(diǎn)的42.2μg泰伐洛星/mg細(xì)胞相比)。在240分鐘時(shí)，替米考星達(dá)到16.05μg替米考星/mg的平均濃度。
圖8b中所示的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值顯示，泰伐洛星快速地在所述極化的Caco-2細(xì)胞中富集。泰樂菌素不在這些細(xì)胞中富集，替米考星顯示了居于它們之間的效應(yīng)，具有較低的富集動力學(xué)，但在240分鐘后達(dá)到相似倍數(shù)的富集(泰伐洛星富集3.49倍，替米考星富集2.5倍)。
圖8c中所示的數(shù)據(jù)表明，泰伐洛星可比泰樂菌素或替米考星被更有效地轉(zhuǎn)移至底外側(cè)室流體中。在與泰伐洛星孵育240分鐘后，底外側(cè)室所含有的泰伐洛星其平均值為頂室值的10.47％。與之相對的是，泰樂菌素的平均值為頂室值的0.52％，替米考星的平均值為頂室值的1.08％。
泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在豬腎細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 通常用泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星處理的宿主動物為豬和家禽。本發(fā)明人檢驗(yàn)了這些大環(huán)內(nèi)酯在豬腎上皮細(xì)胞系LLC-PK1的細(xì)胞內(nèi)積聚。如圖9a顯示的，泰伐洛星快速地進(jìn)入LLC-PK1細(xì)胞并在其中積聚，在75分鐘后檢測到53.95μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均濃度，與之相對的是2.41μg泰樂菌素/mg細(xì)胞和4.98μg替米考星/mg細(xì)胞。如圖9b中所示的，在120分鐘時(shí)，泰伐洛星達(dá)到8.9的最大細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值。泰樂菌素根本不在LLC-PK1細(xì)胞中富集，替米考星在120分鐘時(shí)顯示出1.7倍富集。
泰伐洛星和替米考星在豬白細(xì)胞和雞白細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚 本發(fā)明人還檢驗(yàn)了所述大環(huán)內(nèi)酯在從雞和豬分離的白細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)積聚。泰伐洛星快速地進(jìn)入豬白細(xì)胞中(圖10a)。在10分鐘后檢測到57.4μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均濃度，與之相對的是31.25μg替米考星/mg細(xì)胞。在20分鐘時(shí)檢測到這些值幾乎沒有增加——此時(shí)檢測到61.45μg泰伐洛星/mg細(xì)胞和36μg替米考星/mg細(xì)胞。如在圖10b中所示的，泰伐洛星的平均細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值為8.68，與之相對的是替米考星的為4.33。在20分鐘分鐘后，兩種抗生素均出現(xiàn)相似的比值。當(dāng)將加載了抗生素的細(xì)胞置于無抗生素的培養(yǎng)基中時(shí)，會出現(xiàn)抗生素被運(yùn)輸至細(xì)胞外。兩種抗生素保留在所述細(xì)胞中的量相似，大約為14-15％(圖10c)。因此，在這些條件下從細(xì)胞中流失了大多數(shù)的抗生素。
哺乳動物嗜中性粒細(xì)胞在雞中的等價(jià)細(xì)胞類型是嗜異性粒細(xì)胞。從雞血分離白細(xì)胞并用于測試抗生素的積聚。如圖10d中所示的結(jié)果表明，泰伐洛星快速地在細(xì)胞內(nèi)積聚。在15分鐘時(shí)細(xì)胞中的泰伐洛星濃度具有89.8μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的平均值，對于該測試而言，在60分鐘后這達(dá)到122.9μg泰伐洛星/mg細(xì)胞的最大值。泰樂菌素能進(jìn)入這些細(xì)胞，泰樂菌素的細(xì)胞內(nèi)濃度顯示從15分鐘時(shí)的10.1μg泰樂菌素/mg細(xì)胞增加至60分鐘時(shí)的32.1μg泰樂菌素/mg細(xì)胞。替米考星再次顯示出居于它們之間的效應(yīng)，并且從15分鐘時(shí)的37.1μg替米考星/細(xì)胞增加至60分鐘時(shí)的71.3μg替米考星/mg細(xì)胞。
所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外的比值(圖10e)顯示，在15分鐘時(shí)，泰伐洛星的細(xì)胞內(nèi)濃度是培養(yǎng)基中濃度的約18倍。在60分鐘后檢測到19倍富集。替米考星和泰樂菌素都在細(xì)胞中富集，但這在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間階段中有變化，替米考星從約4.2變化至8倍，泰樂菌素從2.65變化至約4.7。
討論 抗生素在細(xì)胞中的攝取及積聚可能是影響病毒復(fù)制的一個(gè)重要因素。病毒復(fù)制只在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行，這是因?yàn)椴《拘枰?xì)胞的機(jī)制進(jìn)行復(fù)制。通常不認(rèn)為抗生素會影響病毒復(fù)制。然而，在本例中意外地發(fā)現(xiàn)愛樂新

(泰伐洛星)可影響PRRSV和甲型流感的復(fù)制。大環(huán)內(nèi)酯之間進(jìn)入細(xì)胞的比較數(shù)據(jù)可幫助解釋對病毒復(fù)制影響可能的差異。
在這些研究中，本發(fā)明人研究了三種大環(huán)內(nèi)酯——泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星——在人和豬上皮細(xì)胞以及雞和豬白細(xì)胞(WBC)中的攝取及細(xì)胞內(nèi)積聚。它們表明泰伐洛星能夠以比泰樂菌素或替米考星更大的程度進(jìn)入到所有細(xì)胞類型中并在其中富集。然而，由于在細(xì)胞之間存在培養(yǎng)基(細(xì)胞間流體)，因而這些數(shù)據(jù)明顯低估了細(xì)胞內(nèi)富集的程度(Scorneaux and Shryock，1999)。另外已經(jīng)證明大環(huán)內(nèi)酯定位在酸性細(xì)胞區(qū)室內(nèi)，特別是溶酶體內(nèi)(Tulkens，1991，Carbon，1995)。這些區(qū)室在上皮細(xì)胞系的細(xì)胞溶質(zhì)體積中占相對小的比例，因此抗生素的局部濃度將較高。
研究泰伐洛星在腸上皮(HRT 18)細(xì)胞中積聚的初步實(shí)驗(yàn)表明，抗生素被有效地富集達(dá)到直接依賴于培養(yǎng)基中濃度的水平。比較泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星在HRT-18細(xì)胞和LLC-PK1細(xì)胞中的攝取及富集的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，它們的表現(xiàn)之間有顯著差異。最顯著的差異是泰樂菌素不能有效地進(jìn)入這兩種細(xì)胞系，并且不被富集。因此，根據(jù)HRT-18數(shù)據(jù)可預(yù)期，泰樂菌素通過腸上皮細(xì)胞被攝取進(jìn)入宿主慢于泰伐洛星。體內(nèi)數(shù)據(jù)(Okamoto et al.，1981)已顯示口服給予泰伐洛星產(chǎn)生比泰樂菌素更高的血液水平。雖然泰伐洛星和泰樂菌素有緊密相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)，但它們的表現(xiàn)之間明顯地有著顯著差異。3-乙?；肪?未發(fā)表的數(shù)據(jù))和泰樂菌素以相同方式表現(xiàn)的結(jié)果支持這樣的觀點(diǎn)，即存在于泰伐洛星(3-乙酰基-4”-異戊?；肪?中的疏水性異戊酰基基團(tuán)對于其被有效攝取及隨后在酸性區(qū)室中積聚是重要的。替米考星在進(jìn)入細(xì)胞速率/積聚方面居于它們之間，但達(dá)到的最終水平與泰伐洛星達(dá)到的水平很相似。這可能反應(yīng)了替米考星的居于中間的疏水性。報(bào)道的所述藥物的pKa值與在酸性區(qū)室例如溶酶體中的質(zhì)子化和積聚全都相符。泰樂菌素甚至經(jīng)過24小時(shí)仍不能被積聚可能反映出它通過質(zhì)膜及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜這兩種膜的能力有限。
使用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行的大環(huán)內(nèi)酯抗生素的攝取及分泌的研究可推廣至在HRT-18細(xì)胞上的工作。Caco-2細(xì)胞是人結(jié)腸癌細(xì)胞。這種上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出成熟腸上皮細(xì)胞的特性，包括微絨毛、緊密連接、酶例如小腸水解酶、營養(yǎng)素運(yùn)載體以及膜蛋白，所述膜蛋白例如CTFR、ICAM-1、白細(xì)胞介素-1受體、白細(xì)胞介素-6受體和α抗胰蛋白酶受體(Varilek etal.，1994，Kaiserlian et al.，1991，Zweibaum et al.，1983，Sood et al.，1992，Molmenti et al.，1993)。這些特征使得它們很適宜用于評估藥物以定向的方式通過上皮的能力。
已經(jīng)在多項(xiàng)研究中使用了極化細(xì)胞，以檢驗(yàn)多種不同類型的分子的進(jìn)入路徑和運(yùn)輸，所述分子包括免疫球蛋白和白蛋白(Ellinger et al.，2001，Maples et al.，1997，Antohe et al.，1997)。這些細(xì)胞還已經(jīng)被用于研究病毒的極化侵入和釋放(Cordo et al.，2005，Chu and Ng 2002，Rossenet al.，2001，Jarvis et al.，1999)。
在本研究中，Caco-2細(xì)胞的結(jié)果證明，對于頂室給藥和底外側(cè)室給藥來說，泰伐洛星在30分鐘時(shí)(所使用的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn))都被快速富集。使用兩種給藥途徑得到類似的值，表明在兩個(gè)室表面有類似的攝取機(jī)制。泰伐洛星穿過細(xì)胞至相對表面，并釋放于培養(yǎng)基中。因此，在頂室表面給予的抗生素可以在底側(cè)室培養(yǎng)基中被檢測到。這種效應(yīng)隨時(shí)間而增加，使得在4小時(shí)后總泰伐洛星量的約20％已被運(yùn)輸?？紤]到少量的細(xì)胞參與該運(yùn)輸，這看起來是一個(gè)有效的過程。泰伐洛星順濃度梯度移動。出現(xiàn)該現(xiàn)象的機(jī)制是未知的。泰樂菌素不在Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)富集，替米考星顯示出介于兩者之間的表現(xiàn)——沒有發(fā)生快速進(jìn)入，但該抗生素隨時(shí)間在細(xì)胞內(nèi)富集，并且適度的量被運(yùn)輸通過上皮。
這項(xiàng)使用腸上皮細(xì)胞的體外工作表明，抗生素能在體內(nèi)被從腸道運(yùn)輸至軀體并也能被從軀體運(yùn)輸至腸道。已經(jīng)證明大環(huán)內(nèi)酯克拉霉素(clarithromycin)和阿奇霉素(azithromycin)也是這樣。Nightingale(1997)報(bào)道，阿奇霉素通過肝途徑與一些膽汁分泌物一塊被排出，并且也通過分泌至腸道中而被直接排出。該經(jīng)腸路徑被認(rèn)為排出了總給藥劑量的30-35％。該作者認(rèn)為克拉霉素經(jīng)肝臟和腎臟清除，另外還經(jīng)腸道清除，經(jīng)腸道清除導(dǎo)致排出該大環(huán)內(nèi)酯總劑量的約10％。
以前的研究已強(qiáng)調(diào)，大環(huán)內(nèi)酯在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞中攝取增加并被更多地積聚。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)證明，僅在孵育10分鐘后，泰伐洛星就快速地進(jìn)入雞白細(xì)胞和豬白細(xì)胞中并在其中積聚。該攝取大于所觀察到的泰樂菌素或替米考星的攝取。嗜中性粒細(xì)胞的一個(gè)主要功能是吞噬致病性生物體。裝載抗生素的細(xì)胞通過增加細(xì)胞內(nèi)的殺傷能力，能夠更好地從宿主中清除敏感性生物體。而且，通過將抗生素釋放至臨近的周圍培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞使得在局部產(chǎn)生高濃度的抗生素，這使得細(xì)胞外殺傷得以發(fā)生。
在本研究中，本發(fā)明人的技術(shù)使得可以比較泰伐洛星和替米考星在豬WBC中的攝取。泰伐洛星被豬白細(xì)胞(大多數(shù)為嗜中性粒細(xì)胞)快速地?cái)z入，僅在10分鐘孵育后就得到9的IC:EC比。替米考星也快速地進(jìn)入豬WBC，但是達(dá)到的富集程度較低(×4)。在使用禽WBC時(shí)，泰伐洛星在15分鐘內(nèi)達(dá)到高IC:EC比，約×18，并且該比值得到了維持。泰樂菌素和替米考星也都被富集，但是所達(dá)程度較低。
已經(jīng)證明大環(huán)內(nèi)酯對先天免疫系統(tǒng)有效應(yīng)，包括通過導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞凋亡增加(Chin et al.，1998)以及降低嗜中性粒細(xì)胞至感染部位的募集(Ianaro et al.，2000)而減輕炎癥。這些效應(yīng)還可協(xié)助宿主預(yù)防與發(fā)炎相關(guān)的病狀。
存在多種不同的分子可籍由其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。它們包括沿濃度梯度的被動擴(kuò)散(對于脂溶性分子)、主動運(yùn)輸以及各種形式的胞吞作用(如Pelkmans and Helenius 2003、Stuart and Ezekowitz 2005描述的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的、細(xì)胞膜穴樣凹陷介導(dǎo)的胞飲作用、巨胞飲作用和吞噬作用)。已經(jīng)研究了大環(huán)內(nèi)酯抗生素向細(xì)胞內(nèi)移動，但是這方面的信息很有限。許多研究不能區(qū)分通過質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)溶膠的過程以及在酸化囊泡中積聚的過程。進(jìn)入胞質(zhì)溶膠可能是一種被動的、濃度梯度依賴的過程。已經(jīng)證明大環(huán)內(nèi)酯的攝取在堿性pH中會更大。這證實(shí)了這樣的觀點(diǎn)，即不帶電荷分子傾向于被動擴(kuò)散。在4℃下不發(fā)生大環(huán)內(nèi)酯類的積聚；這可能因?yàn)樵谠摐囟认滤峄瘍?nèi)體和溶酶體的質(zhì)子泵沒有活性，而不是因?yàn)橘|(zhì)膜的活化過程被抑制，但是阿奇霉素仍在代謝抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞內(nèi)富集的現(xiàn)象(Gladue and Snider，1990)說明，已經(jīng)存在的pH梯度應(yīng)該足以使得大環(huán)內(nèi)酯在內(nèi)體和溶酶體中積聚。因此，低溫效應(yīng)可能會歸因于低pH在這些細(xì)胞器中的損耗，或者更有可能被歸因?yàn)橘|(zhì)膜結(jié)構(gòu)的重組，該重組減緩擴(kuò)散的效果比根據(jù)溫度對擴(kuò)散速率的正常效應(yīng)所預(yù)計(jì)的更顯著。分子在不存在特異性通道或運(yùn)載體的情況下通過膜的能力較強(qiáng)地依賴于它們在膜脂質(zhì)相中的“溶解”能力。因此，疏水性可能是大環(huán)內(nèi)酯進(jìn)入及積聚效率的關(guān)鍵決定因素，在某些情況下pKa值也起作用。該公開中報(bào)道的泰伐洛星的性質(zhì)與其具有異戊酰基團(tuán)和7.6的pKa的情況相符。
有關(guān)抗菌活性和有效的細(xì)胞積聚之間關(guān)系的問題是復(fù)雜的。Carbon(1995)認(rèn)為，對于一種給定類型的細(xì)胞和給定類型的細(xì)胞內(nèi)感染，很難預(yù)測抗微生物藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用所必需的真實(shí)的細(xì)胞內(nèi)濃度。然而，一個(gè)關(guān)鍵的考慮因素是所述細(xì)菌和所述積聚所述抗生素的細(xì)胞之間的空間關(guān)系。就大環(huán)內(nèi)酯如泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星而言，有三種類型的相互作用是值得特別關(guān)注。第一種類型涉及那些細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，它們能夠在內(nèi)體/吞噬溶酶體的低pH環(huán)境中存活。在這種情況下，藥物在酸性區(qū)室中的積聚使之高度有效。第二種類型的相互作用涉及從囊泡逃離進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。在這種情況下，抗生素在囊泡中的積聚將僅在細(xì)菌逃離前有相關(guān)性，但囊泡積聚的物質(zhì)可提供用于向胞質(zhì)溶膠釋放的抗生素池。第三種形式的相互作用涉及細(xì)菌通常結(jié)合于“宿主”細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜上的細(xì)胞外緊密相互作用。在這種情況下，積聚也將僅當(dāng)細(xì)胞作為緩慢釋放至周圍環(huán)境中的藥物池時(shí)有相關(guān)性。在該文件中描述的泰伐洛星的性質(zhì)與對和細(xì)胞有任何這些類型關(guān)系的細(xì)菌的抵抗效力是相符的。
通過用其他有效積聚的、相對疏水的大環(huán)內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)來說明從體外特性進(jìn)行外推的困難性。因此，阿奇霉素的細(xì)胞攝取相對較高(該攝取比其他大環(huán)內(nèi)酯的攝取慢)，但是這并未伴有效力的增加(Labro，1996)。類似地，已經(jīng)報(bào)道了替米考星的高的胞內(nèi)胞外的比值(Scorneaux andShryock，1998a，b，1999)，但其效力并不突出(特別是在使用商業(yè)劑量的情況下)，如Reeve-Johnson等人(1997a，b)用雞的支原體病上所證實(shí)那樣。這種抗生素——被發(fā)現(xiàn)具有較高細(xì)胞內(nèi)富集并能相對容易地通過細(xì)胞膜——可能已經(jīng)被預(yù)期可高效地對抗例如支原體。還需要確定的是，3′乙酰基4′異戊酰泰樂菌素分子的什么性質(zhì)可解釋其對一系列重要的細(xì)胞相關(guān)病原體的特異性效力。
本發(fā)明人使用來自豬(PK)的上皮細(xì)胞的結(jié)果給出了與使用人細(xì)胞(HRT-18、Caco-2)的結(jié)果類似的結(jié)果。事實(shí)上，該結(jié)果很明確，泰伐洛星又一次快速地在細(xì)胞內(nèi)富集，而泰樂菌素沒有富集且替米考星具有介于它們之間的性質(zhì)。
因此，雖然替米考星衍生自泰樂菌素的B部分，并且泰伐洛星衍生自A部分，但是本研究中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明了所述大環(huán)內(nèi)酯分子的細(xì)胞攝取中有顯著的差異。3′乙酰基4′異戊酰泰樂菌素由于具有異戊?；鶊F(tuán)而與3′乙?；肪?3AT)不同。泰伐洛星快速穿透細(xì)胞的能力可能是由于該異戊?；鶊F(tuán)，這被來自本研究的數(shù)據(jù)所證明并且也被來自以前研究(Tsuchiya et al.，1981)的數(shù)據(jù)所證明，所述以前的研究說明泰伐洛星與泰樂菌素或3AT相比更加親脂。3AT是泰伐洛星的主要代謝物，并且在細(xì)胞內(nèi)形成。可以推測，該代謝物與泰伐洛星相比具有降低的出細(xì)胞的能力。3AT仍是有代謝活性的并且可能比所述母體分子在細(xì)胞中保持更長時(shí)間，這樣的事實(shí)可能在臨床上是有利的。
實(shí)施例4 接著實(shí)施例1，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)泰伐洛星對馬流感毒株Miami(與人PR8毒株和Udorn毒株比較)的MDCK細(xì)胞感染的效應(yīng)。MDCK細(xì)胞用1μg/ml泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星預(yù)處理4小時(shí)。然后在存在所述藥物的情況下用PR8、Udorn或Miami(感染復(fù)數(shù)為10)感染細(xì)胞。感染后將細(xì)胞固定4小時(shí)，并且通過對流感核蛋白的間接免疫熒光評定感染。結(jié)果在圖11中顯示。
泰伐洛星(1μg/ml)抑制了92％馬流感毒株Miami對MDCK細(xì)胞的感染、76％馬流感毒株Udorn對MDCK細(xì)胞的感染，并完全抑制了PR8感染。
實(shí)施例5 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星對PRRSV感染和以低復(fù)數(shù)感染后細(xì)胞擴(kuò)散的效應(yīng)，并且還檢驗(yàn)了在感染后添加所述藥物的效應(yīng)。
用PRRSV以0.01的感染復(fù)數(shù)(moi)感染MA104細(xì)胞(在第一輪應(yīng)感染大約10％的細(xì)胞)。在感染8小時(shí)后，添加1μg/ml的泰伐洛星、泰樂菌素和替米考星。在感染后28小時(shí)收獲細(xì)胞，并通過間接免疫熒光評定感染。顯示每次處理的病毒陽性細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果在圖12中示出。
如上述，0.01的感染復(fù)數(shù)應(yīng)感染大約10％的細(xì)胞。然而，所述病毒在28小時(shí)后將已完成第一輪感染，并且將已經(jīng)感染了鄰近細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在感染后10小時(shí)可檢測到低水平的病毒抗原。該檢測值在感染后16-20小時(shí)會增加，并且至24小時(shí)時(shí)在鄰近細(xì)胞中可檢測到低水平的表達(dá)。
在感染后8小時(shí)添加藥物將對原發(fā)感染沒有效應(yīng)(即對投入病毒的侵入沒有效應(yīng))。但它可能通過其他機(jī)制直接或間接地作用于病毒復(fù)制，并還可能在第二輪感染中作用于病毒侵入，第二輪感染即原發(fā)感染的細(xì)胞產(chǎn)生的病毒感染鄰近細(xì)胞。
感染8小時(shí)后添加愛樂新

(泰伐洛星)抑制了PRRSV感染，將感染降低至1％的病毒陽性細(xì)胞。愛樂新

(泰伐洛星)似乎抑制了病毒復(fù)制(檢測到更少的感染的細(xì)胞)，阻止病毒向鄰近細(xì)胞的擴(kuò)散，并且還減少了未處理細(xì)胞/感染細(xì)胞中出現(xiàn)的旁觀者效應(yīng)(bystander effect)，其中鄰近細(xì)胞未顯示出病毒抗原表達(dá)的放大。
實(shí)施例6 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定泰伐洛星是否對馬動脈炎病毒(EAV)有效應(yīng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，EAV感染未被泰伐洛星或諾考達(dá)唑阻斷，這說明EAV不會被運(yùn)輸?shù)酵砥趦?nèi)體中。
實(shí)施例7 用于檢驗(yàn)當(dāng)在感染前和后多個(gè)時(shí)間添加的已知的PRRSV感染抑制劑時(shí)其效應(yīng)的研究 當(dāng)在感染前4小時(shí)加入時(shí)，氯丙嗪、氯喹、諾考達(dá)唑、細(xì)胞松弛素D和愛樂新

泰伐洛星)抑制了原發(fā)的PRRSV感染，因此沒有觀察到擴(kuò)散。
當(dāng)在感染時(shí)添加時(shí)，氯丙嗪、氯喹、細(xì)胞松弛素D和泰伐洛星抑制了原發(fā)的PRRSV感染，因此沒有觀察到擴(kuò)散。諾考達(dá)唑未抑制原發(fā)感染。諾考達(dá)唑處理的細(xì)胞仍舊產(chǎn)生長突起(long processes)，這表明雖然它們含有微管但它們的產(chǎn)生不依賴于微管。
當(dāng)在感染后2或4小時(shí)添加時(shí)，僅愛樂新

(泰伐洛星)抑制了感染初始位點(diǎn)的感染以及擴(kuò)散。氯丙嗪處理的細(xì)胞顯示了初始位點(diǎn)的感染，但該藥物似乎阻止了擴(kuò)散。諾考達(dá)唑?qū)Ω腥緵]有效應(yīng)(由于毒性它對擴(kuò)散的影響也是不清楚的)，并且再次觀察到了包含病毒的長突起。由于檢測到了感染的細(xì)胞，因此細(xì)胞松弛素D對原發(fā)感染沒有效應(yīng)，然而長突起不復(fù)存在并且不能檢測到擴(kuò)散。這說明，該突起是由肌動蛋白聚合驅(qū)動，并且對于病毒從初始感染位點(diǎn)向外擴(kuò)散是必需的。當(dāng)在感染后添加時(shí)，氯喹對于原發(fā)感染或病毒擴(kuò)散沒有效應(yīng)。
結(jié)果在圖13中示出。
實(shí)施例8 比較PRRSV、EAV和FCV對氯喹的敏感性 為了成功感染其宿主細(xì)胞，貓杯狀病毒、馬動脈炎病毒和PRRSV都需要內(nèi)體酸化。用例如氯喹的藥物升高內(nèi)體pH已經(jīng)證明這一點(diǎn)。氯喹是弱堿，并通過隔離質(zhì)子來升高內(nèi)體pH(即CQ濃度越大將隔離越多的質(zhì)子并將pH升至更高)。升高CQ濃度的效應(yīng)在圖14中示出。這些數(shù)據(jù)表明，需要相對低濃度的CQ(低于5μM)來抑制PRSV感染，這說明適度升高內(nèi)體pH對于抑制病毒侵入是足夠的。FCV的抑制需要高濃度的CQ(等于及高于200μM)，并且EAV被等于及高于50μM的CQ所抑制。更高濃度的CQ說明，需要增大pH升高幅度來抑制FCV和EAV。這些數(shù)據(jù)都表明，與EAV或FCV(即在早期內(nèi)體中)相比，PRRSV需要通過pH低得多的內(nèi)體(即在晚期內(nèi)體中)。
實(shí)施例9 PRRSV的US毒株 本發(fā)明人還用VR2332感染MA104細(xì)胞(PRRSV的US毒株)來檢驗(yàn)泰伐洛星對感染的效應(yīng)。結(jié)果在圖16中示出。將MA104細(xì)胞用所示濃度的愛樂新

泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星預(yù)孵育4小時(shí)。然后在存在藥物的情況下將細(xì)胞用VR2332以10的感染復(fù)數(shù)感染。然后將細(xì)胞孵育20小時(shí)。通過間接免疫熒光評定感染。
將結(jié)果與前文所檢驗(yàn)的歐洲毒株的結(jié)果相比較。
實(shí)施例10 VR2332(PRRSV的US毒株)侵入測定 將MA104細(xì)胞用氯丙嗪、氯喹、諾考達(dá)唑或細(xì)胞松弛素D預(yù)處理30分鐘；或者用泰伐洛星、泰樂菌素或替米考星預(yù)處理4小時(shí)。然后將細(xì)胞用VR2332以10的感染復(fù)數(shù)感染并孵育過夜。
圖17中所示的結(jié)果表明，PRRSV的US毒株也對泰伐洛星敏感，而對泰樂菌素不敏感。替米考星在所使用濃度下顯示了部分的抑制。
實(shí)施例11 泰伐洛星對HeLa細(xì)胞或HT29細(xì)胞的病毒感染的效應(yīng)高復(fù)數(shù)及低復(fù)數(shù)的病毒 本文工作已經(jīng)顯示，泰伐洛星處理的HeLa細(xì)胞對病毒感染具有高度抗性。本發(fā)明人已經(jīng)用多種病毒重復(fù)了該測定，并將此與HT29細(xì)胞(一種通常用于腸胃道病毒感染的細(xì)胞系)的病毒感染相對比。以高復(fù)數(shù)(以考察侵入)及低復(fù)數(shù)(以考察病毒在細(xì)胞單層中的擴(kuò)散)添加病毒。
將細(xì)胞用泰伐洛星、泰樂菌素、替米考星和氯喹處理4小時(shí)。然后將細(xì)胞用病毒以10的感染復(fù)數(shù)感染4小時(shí)，或者以0.1的感染復(fù)數(shù)感染16小時(shí)。
泰伐洛星抑制了流感病毒的侵入及柯薩奇B5病毒的侵入。氯喹也抑制了所有三種病毒的侵入。泰樂菌素和替米考星無效應(yīng)。EV11未受任何處理的影響。
泰伐洛星和氯喹抑制了低復(fù)數(shù)的流感病毒感染和柯薩奇B5病毒感染。泰樂菌素和替米考星無效應(yīng)。在低復(fù)數(shù)測定中，EV11令人意外地被泰伐洛星所抑制。泰伐洛星似乎會抑制病毒擴(kuò)散，這是因?yàn)橥ㄟ^免疫熒光可以觀察到感染的初始位點(diǎn)，而觀察不到繼發(fā)位點(diǎn)。結(jié)果在圖18中示出。
實(shí)施例12 流感病毒的時(shí)程 將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于有蓋玻片或無蓋玻片的24孔板中(在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞用于免疫熒光測定)。將細(xì)胞用1μg/ml的泰伐洛星處理4小時(shí)。然后用Udorn(感染復(fù)數(shù)為0.1)感染細(xì)胞。
在4、8、16和24小時(shí)的時(shí)候收集樣品。
圖15a顯示免疫熒光測定的結(jié)果，15b顯示噬菌斑測定的結(jié)果。在兩項(xiàng)測定中，愛樂新

(泰伐洛星)在24小時(shí)的測定周期中都抑制了流感毒株Udorn的感染。
實(shí)施例13 吖啶橙測定 吖啶橙是一種染料，導(dǎo)致細(xì)胞除酸性區(qū)室(例如內(nèi)體)以外均發(fā)綠色熒光，所述酸性區(qū)室由于染料的質(zhì)子化及綠色熒光的猝滅而呈現(xiàn)紅色。升高內(nèi)體pH的物質(zhì)將阻止紅色熒光的出現(xiàn)。在多種細(xì)胞系中確定了愛樂新

和其他大環(huán)內(nèi)酯抗生素對吖啶橙的內(nèi)體染色的效應(yīng)(參見圖19)。首先使用DAPI染色對生長于玻璃蓋玻片上的一片細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行選擇。該染色將細(xì)胞的細(xì)胞核顯示為藍(lán)色。該選擇步驟有助于減少結(jié)果中的任何偏差。然后用落差熒光顯微鏡上的綠色和紅色濾光片檢查約20個(gè)細(xì)胞。確定紅斑(內(nèi)體囊泡)的數(shù)目。計(jì)數(shù)吖啶橙染色的內(nèi)體的平均數(shù)目。泰樂菌素對任一細(xì)胞系的內(nèi)體中pH的升高沒有很大影響。愛樂新

(泰伐洛星)和替米考星對RAW細(xì)胞有類似的效應(yīng)。然而，愛樂新

(泰伐洛星)在上皮細(xì)胞中比替米考星有更大的效應(yīng)。
這些結(jié)果顯示，愛樂新

(泰伐洛星)升高內(nèi)體中的pH。PRRSV需要酸性條件來進(jìn)行融合并侵入細(xì)胞質(zhì)膜。pH升高可阻止該融合過程以及隨后的病毒侵入及細(xì)胞內(nèi)增殖。
實(shí)施例14 泰伐洛星控制PRRSV的效力的確定 材料和方法 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 所有研究步驟和動物管理由愛荷華州立大學(xué)動物管理和使用委員會(Iowa State University Institutional Committee on Animal Care andUse)批準(zhǔn)并依照該委員會的指導(dǎo)方針。
68只10-12日齡雜交的去勢公豬(barrow)從血清反應(yīng)陰性的且未接種PRRSV或豬肺炎支原體的群中產(chǎn)生，這由主要研究人員選定。在到達(dá)時(shí)對所有豬進(jìn)行標(biāo)記并稱重。將豬分成4組，每組16只(表1)。由統(tǒng)計(jì)學(xué)家將豬分組——使用區(qū)組(通過重量)隨機(jī)化將豬分組，使得組之間在豬重量方面平衡。將每組單獨(dú)圈養(yǎng)，但是在隔離設(shè)施中相同的房間內(nèi)。在每個(gè)板面上有喂食器和乳頭飲水器，因此豬在整個(gè)試驗(yàn)過程中都可以自由進(jìn)食和飲水。另外四只豬在試驗(yàn)前被處死，沒有被納入本試驗(yàn)中。
每個(gè)處理組有兩個(gè)圈，每圈8只豬。在這些豬到達(dá)時(shí)，給其喂食市售的濃縮藥物飲食，該飲食沒有任何已知污染物或殺蟲劑，且每噸含50克卡巴氧(Mecadox)(Philbro Animal Health)。所有豬在到達(dá)后依照標(biāo)簽的指導(dǎo)用頭孢噻夫鹽酸鹽(

，Pfizer Inc.)處理3天。
生產(chǎn)參數(shù) 在達(dá)到時(shí)及試驗(yàn)的第0、7、14、17和28天時(shí)對各個(gè)豬稱重，來評估體重增加(平均日增重)。
臨床評估 每天就臨床呼吸體征對豬進(jìn)行評定，持續(xù)10天，所述體征包括如先前描述的咳嗽和呼吸頻率增加1。評分為0＝正常；1＝應(yīng)激時(shí)輕度呼吸困難和/或呼吸急促；2＝休息時(shí)輕度呼吸困難和/或呼吸急促；3＝應(yīng)激時(shí)中度呼吸困難和/或呼吸急促；4＝休息時(shí)中度呼吸困難和/或呼吸急促；5＝應(yīng)激時(shí)重度呼吸困難和/或呼吸急促；以及6＝休息時(shí)重度呼吸困難和/或呼吸急促。另外，任何觀察到的咳嗽均記作0＝不咳嗽以及1＝咳嗽。由獸醫(yī)或有資質(zhì)人員進(jìn)行這些觀察。
治療 三組豬均接受含3種不同濃度泰伐洛星的藥物飼料，泰伐洛星由ECO Animal Health提供。在從試驗(yàn)的第0天至試驗(yàn)的第28天的整個(gè)試驗(yàn)過程中，這三組中的豬均接受藥物飲食。給第4組喂食同樣的無藥物飼料。
飼料測定 在試驗(yàn)的第17天和28天收集1磅代表性飼料樣品。在試驗(yàn)開始時(shí)沒有收集飼料樣品。所有樣品用代號、采樣位點(diǎn)、記錄號(protocolnumber)、采樣日期及簽名標(biāo)記，并置于塑料冰袋中。飼料的重量為大約0.5kg。收集雙份樣品。一組樣品置于干冰上運(yùn)送至ECO AnimalHealth，以在分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行化驗(yàn)，第二份樣品保存于取樣地點(diǎn)。
攻擊步驟 用2ml高毒力PRRSV毒株VR2385的培養(yǎng)基以1×105組織培養(yǎng)感染劑量(TCID)50的接種劑量經(jīng)鼻內(nèi)給予所有的豬。
尸檢 在試驗(yàn)的第17天時(shí)(感染后的10天)對來自每個(gè)處理組的6只豬進(jìn)行尸檢，并且在試驗(yàn)的第28天時(shí)(感染后的21天)對剩余的豬進(jìn)行尸檢。在試驗(yàn)的第17天時(shí)從每圈隨機(jī)選擇兩只豬進(jìn)行尸檢，并且在試驗(yàn)的第28天時(shí)對剩余的豬(n＝10)進(jìn)行尸檢。在給予一種AVMA核準(zhǔn)的安樂死溶液(Fatal-Plus，Vortech Pharmaceuticals，Dearborn，MI)后將豬放血。用鑷子夾住氣管和肺，將它們從豬身上取出。就與先前所述的PRRSV相符的宏觀損傷對肺進(jìn)行評估。無菌條件下收集氣管拭子(tracheal swab)，用于使用標(biāo)準(zhǔn)的微生物學(xué)方法的細(xì)菌分離。將肺用50ml含抗生素(9μg慶大霉素、100U青霉素/ml和100μg鏈霉素/ml)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)灌洗。
收集并處理每個(gè)肺葉的一部分，用于進(jìn)行組織病理檢驗(yàn)。如先前所述對組織病理損傷進(jìn)行評分。簡言之，0＝無微觀損傷；2＝中度多病灶間質(zhì)性肺炎；3＝中度彌散性間質(zhì)性肺炎；以及4＝重度間質(zhì)性肺炎。如先前所述對免疫組織化學(xué)進(jìn)行評分。簡言之，0＝無PRRSV抗原陽性細(xì)胞；1＝1-10個(gè)陽性細(xì)胞/視野；2＝11-30個(gè)陽性細(xì)胞/視野；3＝31-100個(gè)陽性細(xì)胞/視野；以及4＝>100陽性細(xì)胞個(gè)/視野。
實(shí)時(shí)PCR 在試驗(yàn)的第0、10、17、21和28天收集用于PCR的血液。
使用QIAamp Viral RNA Mini試劑盒(QIAGEN)依照廠商說明書提取總RNA，并將其溶解于60μl洗脫液中。將該RNA提取物在-80℃下保存直至進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增。
用于定量PRRSV的正向引物和探針是ORF7區(qū)。將該探針用熒光報(bào)告染料——6-羧基熒光素(FAM)在5′端標(biāo)記，并將猝滅染料——BlackHole Quencher 1(BHQ_1)在3′端標(biāo)記。在Rotor-Gene RG-300(CorbettResearch，Sydney，AU)上使用實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行PRRSV定量。20μl反應(yīng)混合物的組成為10μl 2×TaqMan Universal PCR主混合緩沖液(master mix buffer)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)；0.1μlSuperscript III逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)；0.2μlRNaseout(40U/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)；2μl最佳濃度的正向引物和反向引物；0.8μl最佳濃度的TaqMan探針；2.9μl無DNase/Rnase水以及2μl RNA標(biāo)準(zhǔn)物的10倍稀釋物或2μl提取自每個(gè)樣品的總RNA。在以下條件下進(jìn)行擴(kuò)增55℃下45分鐘，95℃下10分鐘；然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃下15秒及60℃下60秒。在每一輪擴(kuò)增結(jié)束讀取熒光。所有標(biāo)準(zhǔn)稀釋物和未知樣品均有兩個(gè)重復(fù)。當(dāng)相關(guān)系數(shù)(r2)>0.99時(shí)，則接受該標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比較投入樣品RNA的循環(huán)閾(CT)值和不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)RNA的CT值實(shí)現(xiàn)對PRRSV定量。
血清學(xué) 在到達(dá)時(shí)以及在試驗(yàn)的第0、17和28天采血。使用市售的ELISA測定法(HerdChekPRRS；IDEXX Laboratories，Westbrook，ME)確定PRRSV抗體水平。
統(tǒng)計(jì)分析 首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納(使用平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和直方圖)，來評定數(shù)據(jù)質(zhì)量和分布假設(shè)。將數(shù)據(jù)處理為連續(xù)值(包括評分的平均值)或者離散值(例如評分)。某些數(shù)據(jù)是每天重復(fù)測量的(溫度和呼吸評分)，并先通過用最大評分值或平均評分值簡化各個(gè)豬的值來分析，然后作為單變量數(shù)據(jù)來分析。所有其他重復(fù)測量結(jié)果都被橫向(cross-sectionally)分析。依據(jù)數(shù)據(jù)類型及分布使用ANOVA、Kruskal-Wallace非參數(shù)ANOVA或卡方檢驗(yàn)分析所述數(shù)據(jù)。在統(tǒng)計(jì)顯著性全局檢驗(yàn)(omnibus test)后，使用Tukey HSD調(diào)整(連續(xù)數(shù)據(jù))或Bonferroni調(diào)整(離散數(shù)據(jù))進(jìn)行后續(xù)的成對檢驗(yàn)。第17天的ADG變量是一個(gè)例外，對于該變量而言，各個(gè)組次之間全局檢驗(yàn)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，但調(diào)整的成對檢驗(yàn)顯示無顯著性。對于這種情況，報(bào)告了無調(diào)整的成對檢驗(yàn)。已對肺葉數(shù)據(jù)取平均。
結(jié)果 生產(chǎn)參數(shù) 通過體重和平均日增重(ADG)(表2)評定豬的整體生長表現(xiàn)。沒有觀察到在任何一組的任何一只豬的平均體重中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第17天，組4中豬的平均日增重與組1中豬相比有顯著差異。在該試驗(yàn)的任何時(shí)間點(diǎn)均沒有觀察到其他差異。
臨床疾病 對臨床疾病的評分總結(jié)于表4中。記錄下每只豬的臨床呼吸評分和直腸溫度記錄在一段時(shí)間內(nèi)的最大值，然后分析這些最大值的平均值。另外分析了平均直腸溫度的均值。對于呼吸評分，組1和2中的豬具有比在組3和4中所觀察到的分值顯著低的分值。對于最大直腸溫度，組3中的豬具有比所有其他組都顯著高的平均直腸溫度的均值。然而，沒有觀察到在每組的平均直腸溫度中存在差異。
宏觀、微觀和免疫組織化學(xué)(IHC)評分 微觀肺損傷評分總結(jié)于表5中。沒有觀察到任何組中的宏觀肺損傷評分的平均值存在差異。在該試驗(yàn)的40只豬中均觀察到與細(xì)菌感染相符的肺炎。這還可能影響該試驗(yàn)中PRRSV肺炎的嚴(yán)重度。
組1中的豬與所有其他組相比，在初次尸檢時(shí)具有顯著低的微觀損傷評分值。在第二次尸檢時(shí)沒有觀察到微觀損傷評分值中存在差異。
支氣管淋巴結(jié)、扁桃體以及肺(2個(gè)切片的平均)的免疫組織化學(xué)評分在組之間均沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)差異。
細(xì)菌學(xué) 從大多數(shù)豬的呼吸道中分離到了支氣管敗血性博德特氏菌。另外，培養(yǎng)大量動物來評估是否存在豬支原體。其中，從23只豬中的7只中分離到了豬鼻支原體。
實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)測定 RT-PCR的結(jié)果總結(jié)于表5中。在試驗(yàn)第10天觀察到差異，組3和4中PRRSV RNA的拷貝數(shù)水平顯著高于組2中的水平。另外，在相同的時(shí)間點(diǎn)，組4中PRRSV RNA的水平比顯著高于組1。在試驗(yàn)的任一點(diǎn)均沒有觀察到PRRSV血清RNA水平中存在其他差異。在攻擊前的試驗(yàn)第0天沒有檢測到PRRSV RNA。
血清學(xué) 所有豬在試驗(yàn)的第0天時(shí)都是血清抗體陰性。在試驗(yàn)第17天，組1和2中的兩只豬以及組3和4中各有一只豬保持對PRRSV抗體的血清反應(yīng)陰性。所有其他豬都是血清反應(yīng)陽性的。所有剩余的豬在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)都是血清反應(yīng)陽性的。
討論 PRRSV仍是豬產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重大的問題。ECO Animal Health關(guān)注于評定愛樂新

(泰伐洛星)減少與PRRSV感染相關(guān)的臨床疾病和病毒血癥的能力。在以下兩個(gè)方面中觀察到有差異，即試驗(yàn)第17天的平均日增重，以及通過呼吸評分和最大直腸溫度測量的臨床疾病的嚴(yán)重度。另外，在試驗(yàn)第10天——即接種PRRSV后的3天，組之間的PRRSV RNA水平有差異。沒有觀察到其他的水平差異，但是各個(gè)組中所測量到的RNA水平變化范圍較寬，這使得難以對數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。值得注意的是，在增大平均日增重以及減少臨床疾病和病毒血癥水平方面，較低劑量的愛樂新

(泰伐洛星)似乎是最有效的。
對于PRRSV誘導(dǎo)的肺炎，觀察到泰伐洛星有較弱的效應(yīng)。沒有觀察到豬的宏觀肺炎的嚴(yán)重度有差異，但PRRSV肺炎在這個(gè)攻擊模型中是相當(dāng)嚴(yán)重的。再者，與病毒血癥、臨床疾病及平均日增重的情況一樣，給予低劑量的泰伐洛星似乎能更有效地控制疾病，這表現(xiàn)為在初次尸檢時(shí)減少的微觀損傷。
該研究表明，低劑量的泰伐洛星看起來似乎可減少與PRRSV感染相關(guān)的臨床疾病和病毒血癥。
表1.用PRRSV感染且喂食愛樂新

(泰伐洛星)的豬以及未治療對照的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
表2.用PRRSV感染且喂食愛樂新

(泰伐洛星)的豬以及未治療對照的平均日增重(磅)(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

A，B＝列中具有不同字母的平均值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
＊p-值表示列中治療組之間的統(tǒng)計(jì)差異。
表3.用PRRSV感染且喂食愛樂新

(泰伐洛星)的豬以及未治療的對照的臨床疾病的總結(jié)。
A，B＝列中具有不同字母的平均值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
＊p-值表示列中治療組之間的統(tǒng)計(jì)差異。
表4.用PRRSV感染且喂食愛樂新

(泰伐洛星)的豬以及未治療對照的微觀PRRSV肺損傷評分的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

A，B＝列中具有不同字母的平均值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
＊p-值表示列中治療組之間的統(tǒng)計(jì)差異。
表5.用PRRSV感染且喂食泰伐洛星的豬以及未治療對照的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶多聚酶鏈反應(yīng)測定(RT-PCR)的平均值(±括號中的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

＊ND＝未檢測到 A，B＝列中具有不同字母的平均值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
＊p-值表示列中治療組之間的統(tǒng)計(jì)差異。
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權(quán)利要求
1.泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽在制備用于預(yù)防或治療病毒感染的藥劑中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述病毒是一種使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述病毒是一種使用晚期內(nèi)體途徑或溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述病毒是一種使用溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述病毒是一種使用晚期內(nèi)體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的用途，其中所述病毒需要內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的pH低于6.5。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述病毒為哺乳動物腺病毒屬、動脈炎病毒屬、非洲豬瘟病毒屬、漢坦病毒屬、環(huán)狀病毒屬、冠狀病毒屬、纖絲病毒屬(Filiovirus)、黃病毒屬、瘟病毒屬、肝炎病毒屬、甲型流感病毒、貧病毒屬、細(xì)小病毒屬、腸道病毒屬、鼻病毒屬、正呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬或甲病毒屬。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述病毒選自腺病毒7、PRRSV、流感、鮭魚貧血病毒、豬瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲豬瘟病毒、辛諾柏病毒(Sin Nombre)、四角病毒(Four Corners)、普馬拉病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性腸胃炎、SARS CoV、西尼羅河病毒、馬堡病毒、埃博拉病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、犬細(xì)小病毒、柯薩奇B3病毒、柯薩奇B5病毒、禽呼腸孤病毒、輪狀病毒、塞姆利基森林病毒和2型豬環(huán)狀病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述病毒為PRRSV。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述病毒為流感。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的用途，其中所述藥劑還用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的用途，其中所述藥劑還用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中當(dāng)所述病毒感染是PPRSV或豬流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染是豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多殺性巴斯德氏桿菌(Pasteurella multocida)、豬鏈球菌(Streptococcussuis)和支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)中的一種或多種的感染。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中當(dāng)所述病毒感染是牛病毒性腹瀉病毒的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染是溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)桿菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)或牛支原體(Bordetellabrochiseptica)的感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中當(dāng)所述病毒感染是人流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性鏈球菌(Streptococci haemolyticus)、肺炎球菌(Pneumococci)、銅綠假單胞菌(Pseudomanoas aeroginosa)和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)中的一種或多種的感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中當(dāng)所述病毒感染是禽流感的感染時(shí)，所述細(xì)菌感染優(yōu)選是雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)感染。
17.一種治療病毒感染的方法，包括將泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽，或者含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代謝物、酯或鹽的藥物組合物給予已感染病毒的受試者。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述病毒是一種使用內(nèi)體途徑或溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述病毒是一種使用晚期內(nèi)體途徑或溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述病毒是一種使用溶酶體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述病毒是一種使用晚期內(nèi)體途徑來感染宿主細(xì)胞的病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求17-21任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒需要內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的pH低于6.5。
23.根據(jù)權(quán)利要求17-22任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒為哺乳動物腺病毒屬、動脈炎病毒屬、非洲豬瘟病毒屬、漢坦病毒屬、環(huán)狀病毒屬、冠狀病毒屬、黃病毒屬、瘟病毒屬、肝炎病毒屬、甲型流感病毒、貧病毒屬、細(xì)小病毒屬、腸道病毒屬、鼻病毒屬、正呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬或甲病毒屬。
24.根據(jù)權(quán)利要求17-23任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒選自腺病毒7、PRRSV、流感、鮭魚貧血病毒、豬瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲豬瘟病毒、辛諾柏病毒、四角病毒、普馬拉病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性腸胃炎、SARS CoV、西尼羅河病毒、馬堡病毒、埃博拉病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、犬細(xì)小病毒、柯薩奇B3病毒、柯薩奇B5病毒、禽呼腸孤病毒、輪狀病毒、塞姆利基森林病毒和2型豬環(huán)狀病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述病毒為PRRSV。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述病毒為流感。
27.根據(jù)權(quán)利要求17-26任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素泰伐洛星作為抗病毒劑的用途。泰伐洛星對于PRRSV的治療特別有用。
文檔編號A61K31/7042GK101511374SQ200780033220
公開日2009年8月19日 申請日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日
發(fā)明者A·P·A·莫克特, T·D·K·布朗, A·D·斯圖亞特 申請人:?？苿游锝】涤邢薰? 劍橋大學(xué)技術(shù)服務(wù)公司