專利名稱：：N末端聚唾液酸化的制作方法N末端聚唾液酸化本發(fā)明涉;sj夷島素的新型多糖衍生物以及用于產(chǎn)生這種衍生物的方法。所述衍生物可用于改良胰島素的穩(wěn)定性、藥代動力學及藥效學。糖尿病是一種碳7K化合物代謝紊亂，由胰島素產(chǎn)生不足或?qū)σ葝u素敏感性降低導(dǎo)致。胰烏素在胰臟朗格罕氏島(isletsofLangerhans)的p細胞中合成，是體內(nèi)大多數(shù)細胞正常利用葡萄糖所必需的。在患有糖尿病的人中，利用葡萄糖的正常能力受到抑制，從而增加了*水平(高jklt癥)。有兩種不同類型的糖尿病。I型AM島素依賴型糖尿病即IDDM。IDDM在以前指的是青少年型糖尿病。在IDDM中，蒯險不分泌胰島素，必須通過外源來提供。II型成年型糖尿病通常可通過飲食進行控制，M某些重癥病例中需要胰島素。在20世紀20年代胰島素被分離之前，大多數(shù)患者在疾病發(fā)作后短時間內(nèi)死去。未治療的糖尿病會導(dǎo)致酮癥__酮鵬肪分解的產(chǎn)物)#液中積聚；是具有惡心和嘔吐癥狀的酸中毒(^ik液中積影。1^紊亂的糖代*月旨肪^R謝的毒性產(chǎn)物的持續(xù)積累，患者^^^^t尿病昏迷。糖尿病的治療-^:需要定期地注射胰島素。這產(chǎn)生^的、^!^l臨床改良。然而，由于胰島素注射的不便，大量努力聚焦于提高胰島素的給藥Ai物同化。胰島素分子由兩^Ht過^^鍵連接的募J^M^L^(mw5804)。胰島[P]細胞分泌單鏈的胰島素前體一一被稱為胰島素原。胰島素原的蛋白酶解導(dǎo)致4個堿性氨基酸(胰島素原鏈的31、32、64和65位分別為Arg、Arg、Lys、Arg)以》J^接("C，，)多肽被除去。在形成的雙M^島素分子中，在A鏈^末端具有甘氨酸，在B鏈M末端具有苯丙氨酸。胰島素可以以牟沐、二聚體或由三個二聚體形成的六聚體的形式存在。該六聚體與兩個Zn2+原子齡。生物活性位于科中。雖然直至最i^L乎只有牛胰島素和豬胰島素被用于治療人糖尿病，但是SW技術(shù)已知胰島素在物種之間的許多不同。豬胰島素與AI^島素最相似，它與A^島素僅有的不同是B鏈C末端為丙氨^14而非蘇氨^。盡管有這些差異，但是大多數(shù)哺乳動物胰島素具有相當?shù)奶禺愋曰钚?。直至最近，動物提取物提供了所有用于治療該疾病的島素，可從印第安納州印第安納波利斯的EliLillyandCompany購得)。已經(jīng)進行衍生胰島素的嘗試來改良其藥代動力學性質(zhì)。在市場上有一種產(chǎn)品，即PEG-胰島素(PEG-insulin)(NektarTherapeutics)。PEG是一種中性、溶于水的無毒聚合物，它包^f壬意數(shù)目的環(huán)氧乙烷的重復(fù)單元。設(shè)計聚乙二醇化(PEGylation)來增加活性襯大小，并最終通過如下途徑來改良藥物性能優(yōu)化藥代動力學；增加生物利用度；以及^fa疫原性和給藥頻率。PEG-胰島素的設(shè)計和開發(fā)在W02004091494中被進一步描述。iW技術(shù)已知大量用于產(chǎn)生聚乙二醇4破島素衍生物的方法。Davis等人(美國專利4，179，337)描述PEG-胰島素構(gòu)建體的合成，似門使用三氯-s-三溱(三聚M(cyanuricchloride))作為PEG和蛋白之間的銜接物。似門遵循這樣的合成方案，即大過量的(50x)三聚^活化的PEG(2000Da)在硼g緩沖液(pH9.2)中與胰島素M2小時。該發(fā)明的技術(shù)能夠產(chǎn)生具有部分活性(約50%)的PEG-胰島素4fe^物，這種4fe^是非免疫原性的和非抗原性的。Obermeier等人(加拿大專利1,156，217)發(fā)現(xiàn)，^^照Jiil引用的Davis的專利制備PEG-胰島素旨物產(chǎn)生了一種包含大約50。/4的三-PEG-胰島素的旨物的不均勻混合物，并且^fe可能的PEG-胰島素衍生物結(jié)^(單-PEG-胰島素或雙-PEG-胰島素)在殘基PheBl位JjI^M皮取代的。Obermeier等人(加拿大專利1，156，217)描述了專門在^PheBl位置作出組的PEG-胰島素4fe^物的合成。他們發(fā)明的絲涉及，用有^L^劑(例如DMF、DMSO、吡咬等)中的叔丁氧羥基(t-boc)或曱磺酰乙氧羰基(methylsulfonylethyloxycarbonyl)(Msc)在堿性條件下保護殘基GlyAl和LysB29位置的活',。從(單-、雙-K-)保護的胰島素的復(fù)雜;^^中，通過常規(guī)的色諳技術(shù)分離了NaAl，nsb29-雙-^護的胰島，類(N.sup..alpha.Al，N.sup..epsilon.B29-bis-protected-insulinspecies)。在分離^^,將所艦NaAl，NSB29-雙{護的胰島素與活化的(例如酸性氯化物或異氰g)PEG衍生物^，It^^^肽化學的通用技術(shù)去l^^基團。該發(fā)明AJ5i^到，GlyAl和LysB29的募J^/Iil^條降下比PheBl的^J^"性大。他們已經(jīng)確定，其位點專一性mPEG(1500)-B1-胰島素4/!^對1^^兔的*水平有100%的胰島素雌漆于摩爾數(shù)計算)。Geiger等人(1980)和Ehrat等人(1983)描述了專門在gPheBl位置作出^Lii的PEG-胰島素加合物，似l、:H^l的保護/旨/脫保護法與Obermeier等人、Geiger等人和Ehrat等人描述的多步法相似，并，iL^到，PEG(1500)-Bl-胰島素41^有比天然胰島素小得多的抗原性以及大得多的穩(wěn)定性(對于肝酶)。MPEG-胰島素制備法(Calicetietal.,1999;Uchioetal,，1999;Hindsetal.，2002)具有以下特征之一1)以上i^斤述的g的保護/旨/脫保護三步法為核心，2)形成所艦島素襯的非特異性改良，或者3)不能產(chǎn)生最有效的4fe^，即PEG-Bl-胰島素。Liu等人(美國專利6，323，311Bl)描述了一種可用于合成PEG-Bl-胰島素輒*的方法。該方法是Obermeier的保護/旨/脫保護三步法的夕卜延，^需要在步驟之間分離A^中間體(即一鍋式合^)。因此，將胰島素在絲GlyAl和LysB29位置保護，立即與PEG反應(yīng)，It^在分離任何種類之前進行脫保護。該發(fā)明人聲稱，他們的一鍋iCX應(yīng)可以得到最多達50%正確位置的異構(gòu)體(即PEG-B1-胰島素)及30%^^應(yīng)胰島素，iM^應(yīng)胰島素可再循環(huán)用于后續(xù)的衍生化中。^^iii4ii行了這些構(gòu)建體的制備，那也需耗時至少5天才能完成。另外，該發(fā)明需要大過量的PEG試劑來得到合意的結(jié)果。雖然該發(fā)明的產(chǎn)品可能是有效的，但是它們的制儲需妙白質(zhì)長時間在不利于蛋白質(zhì)的環(huán)嫂中(高pH和低pH)經(jīng)歷三個^步驟。申請US2007083006中的發(fā)明通過提供一種簡單制備高純度胰島素衍生物一一胰島素B鏈的N端(PheBl)在單個步驟中被特異性聚乙二醇化一一的方法，iJl了lW技術(shù)中聚乙二SH匕胰島素的方法的缺陷。與表明在PheBl位置聚乙二醇化為至少可能的反應(yīng)產(chǎn)物的在先經(jīng)驗(例如Calicetietal.,1999，JJi^)不同，該專利方法通過控制特異性pH條降，應(yīng)用金屬離子4^fiJ并添加有^i^劑，來增強PheBl募J^^端的相對反應(yīng)性，該PheBl^J^端變皿乙二S^f匕的主錄點?？紤]到在錄PheBl位置的位點特異性聚乙二a^f匕所賦予胰島素的大量有利'M(例如減少免^f、性/^f、性；增加蛋白7jc解、化學和物理的穩(wěn)定性；增加循環(huán)半衰期；增加水性的/有機的溶解度；完全生物活性)，用于得到這種結(jié)果的簡單、低成本且易于，化的方法將是對SW技術(shù)的一項絲進步。由g技術(shù)看來，需要提供這樣的改M島素衍生物，即其可用于A^物治療，具有優(yōu)化的穩(wěn)定性、半衰期和^峰性。我們已發(fā),PSA連接M島素上械予這些'歸。聚唾M(PSA)是由某些細菌菌^哺乳動物某些細胞產(chǎn)生的天然存在的無支鏈的唾液酸聚合物。通過限制性酸解或用神經(jīng)氨酸酶消化，或者通iW7天然的、細菌源形式的聚合物進行分級，可產(chǎn)生各種聚合度的聚唾液酸從n-約80或更多個唾液^基，至下限n-2。近些年，PSA的生物學性質(zhì)，特別是oc-2，8-連接的均聚聚唾液酸的生物學性質(zhì)，翻于改良蛋白質(zhì)和低襯量藥物襯的藥代動力爭It質(zhì)。聚唾M衍生化使許多治療型蛋白包括過氧化氫酶和天冬酰胺酶的循環(huán)半衰期得到了顯著的提高，并且使得在應(yīng)用這些蛋白質(zhì)時不用考慮已經(jīng)存在的抗體，這些抗體;Uh前暴露于該治療型蛋白而產(chǎn)生的一種不需要的(而且有時是不可避免的)結(jié)果[FernandesandGregoriadis，1996and1997]。所述a-2，8-連接的聚唾成為了佳人關(guān)注的PEG替代物，它作為人體的天然部分是免疫系統(tǒng)不可見的生物可降解聚合物，而且可由組織神經(jīng)氨酸酶降解為唾液酸，而唾液i^A—種無毒的糖類。我們在以前已經(jīng)描述了將多糖(特別是PSA)連接到治療藥劑如蛋白質(zhì)上的方法[US-A-5846,951;WO-A-0187922]。這些方法中有一些是依賴于聚*'非還原端，的化學衍生化來產(chǎn)生在伯胺基位置反應(yīng)的蛋白質(zhì)反應(yīng)活性醛基部分。由于含有鄰二醇，非還原的唾液酸末端單元可以容易地UJ^擇性地)被高碘酸鹽氧化而生成單醛形式，這種形式與蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性更高，并且含有適宜的活'ltiL件，用于通過還原性>^^化和，(匕學作用#^白質(zhì)連接。這一^JI在圖1和圖2中進行了闡述，其中圖l顯示了用高碘酸鈉氧化多聚唾液酸(colominicacid)(源自;^桿菌的oc-2，8-連接的PSA),從而在非還原端形成一個有蛋白質(zhì)活性的醛，和圖2顯示了用ltJ^硼氳化鈉選擇'IiiJ4iE原希夫堿，從而與蛋白質(zhì)M生成一個穩(wěn)、定、不可逆的^h鍵。本發(fā)明A^以前的出版物(例如BiochimicaetBiophysicaActa(2003))已描述了聚唾液酸化胰島素的合成。在該參考文獻中，22kDa和39kDa多聚唾液酸被氧化，并與重組A^島素的募JJl應(yīng)。所使用CA的多^H為1.33和1.40,這樣的多分^JL對于治療用途來iCA太大的。在我們以前的專利申請(以WO2005/016974^^f)中，我們還描述了胰島素-多聚唾液酸輒合物的合成。然而，在該申請中，所述輒合物并非都具有特異性N末端，從而形成了多種旨物。例如，在上述常M^^gJI過程中，通過多聚唾液酸與M酸側(cè)鏈的^JI可能產(chǎn)生預(yù)期"卜的副產(chǎn)物。ii^于制備化學結(jié)構(gòu)已知的輒合物來"^X以成為問題，而化學結(jié)構(gòu)已知的4^^_管才;1^對人和動物治療用途所要求的。從多種預(yù)期"卜的產(chǎn)物中純化預(yù)期的反應(yīng)產(chǎn)物(例如單多聚唾液酸化的產(chǎn)物)是不容易做到的，這是因為大多數(shù)的反應(yīng)產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)是類似的。這意味著，諸如離子交換色鐠和皿滲透色譜(它們分別基于電荷和大小進行分離)的技術(shù)將產(chǎn)生較弱的純4匕諳。才艮據(jù)本發(fā)明的第一方面，我們提供了包含蛋白質(zhì)的多糖衍生物群的組合物，其中所述蛋白質(zhì)為胰島素或胰島素樣蛋白質(zhì)，所述多糖是陰離子型并包含2-125個糖單元，并且其中所ii^J^上僅由所述蛋白質(zhì)的N末端衍生物組成。在下文中^fM術(shù)語胰島素時。我們還意在涵JU1島素才錄白質(zhì)。我們所指的胰島素才橫白質(zhì)是指具有與胰島素等效活性的蛋白質(zhì)。胰島素通常斷^Mt濃度。它還增加單糖、絲酸和脂肪酸的細艦透性，并加速糖酵解、；X^磷酸循環(huán)和肝中的糖原合成。>^^，胰島素#^白質(zhì)具有至少35%(更^^少50%)的Swissprot^il號為P01308的A^島素的活性。還可以使用上文詳細描述的具有必需活性的胰島素突變體。"胰島素樣"蛋白質(zhì)還可以指"胰島素同源物"。兩個序列是否是同源的可^^相似'Itil同一性百分tt常MiiLi^fti十算，術(shù)語相似性和同一'1^本領(lǐng)域中是熟知的。應(yīng)將序列與SEQI.D.No.U腺，后者A^加工的AJ4島素前體。25-54對應(yīng)于胰島素B鏈，90-110殘Jjit應(yīng)于胰島素A鏈。同源序列還可以與活性類型的人胰島素比較。同源^i^具有等于或大于50。/。的核酸水平或^J^^水平的相似'I^同一性，更^4等于或大于60%、70%、80%，更^ffei^等于或大于90%，例如95%或99%的核酸水平或絲酸水平的相似&或同一性。賄的多種禾聘可計算相似性或同一性；他逸的M為BLASTn、BLASTp和BLASTx禾誘，以默認^lt運行，可從爾.ncbi.nlnLnih.gov獲^il些禾踏。例如，可以^^)默1^人^:(30016(^1)=100、wordlength(字長)=11、expectationvalue(期望銜=11、lowcomplexityfiltering(>^J^Hitit^)=on(開))的BLASTn餅t嫩兩個^tJ^^列。<Mit些IW人^lti十算上述的同源'性tK平。所i^島素可以K然的，即源自Ai^動物，或者是合成的，例M過重組方法制備的。如;^w4頁域中所熟知的，胰島素包含兩條肽鏈。M地，本發(fā)明中的所M島素是在其B鏈的N末端被多糖衍生的。我們所指的'噼"是在所i^且楊中有多于一種的多糖衍生物。所述衍生物可包含相同或不同數(shù)目的糖單元。優(yōu)i^，在所i^且^^中的多糖的多^JL低于1.3，更to低于l丄在所*中，J^Ui所有蛋白^l^N末端被衍生化。因為在胰島素中有兩條肽鏈，所以有兩個N末端單元。在所*中，>^至少85°y4、更M至少90%、最^^i^少95%的B錄N末端被陰離子多糖衍生化。所述A鏈的N末端無需被衍生化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的標準技術(shù)例如肽圖譜(p印tide咖卯ing)或埃德曼降解(EdmanDegradation)確定所述N末端的矛汴生^M^^。^ffci^地，所述多糖具有至少2個，更M至少5個，最>^至少10個例如至少50個的糖單元。所述陰離子多糖M選自聚唾液酸、肝素、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素。優(yōu)選地，所述多糖是聚唾液酸并JLi^上僅由唾液酸單元組成。然而，在所述多糖分子中可以有唾液酸之外的單元。例如，唾液酸單元可以與其^t單元交替出現(xiàn)。然而，所述多糖優(yōu)i^^上僅由唾液酸單元組成。優(yōu)選地，所述多糖具有一個末端唾液酸基團，并且如上文詳細描述的，更優(yōu)選為一個聚唾液酸，它是包含至少2個通過oc-2-8或oc-2-9鍵相互連接的唾液酸單元的多糖。適宜的聚唾液酸具有的重量平均^f"量介于2-100kDa之間，^i^襯1-35kDa之間。最艦的聚唾液酸具有的襯量介于10-20kDa之間，通常約14kDa。最優(yōu)選的，所述聚唾液酸來源于細菌，例如來自;U^桿菌Kl、腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis),液化性摩拉克氏菌(Maraxellaliquefaciens)或銅綠巴斯^f菌(Pasteurellaaeruginosa)的多糖B，或者來自;U^桿菌株K92的K92多糖。最優(yōu)選來自雄桿菌Kl的多聚唾。所述陰離子多糖可以為鹽的形式或者為游離酸的形式。它可以為7jc解的形式，從而使得從細菌源回^分子量已降低。所述多糖(^i^聚唾,可以是具有很寬^^量范圍的材料，例如具有超過1.3例如高達2或更高的多^ft變。，也，所述W量的多^ltl小于1.3或1.2,M小于1.1，例如駄l.01。本發(fā)明的化^通常為胰島素的聚唾_衍生物,并包含2-125個唾^M單元。所述^^更常見包含10-80個唾:^^單元，M20-60個唾^^單元，最艦40-50個唾艦單元。^^發(fā)明的第一方面中的所述多糖衍生物可以是在胰島素N^和陰離子多糖之間^#^接的4&^。所述多齡所ii^島素之間的^^合方式包括靜電吸引。但優(yōu)選^#合。所述^h鍵可以;U^i^胺基之間的it^。所iil夷島素可M結(jié)合于所述多糖的另一種M^通過希夫堿。用于4fe^胺的合適基團在W02006/016168中有進一步的描述。^iC明中，所述多糖可以A^^^在的多糖，或者天^^在多糖的衍生物，例如通it^ltt上一個或多個活性基團的^所衍生的多糖，或者在多^t^:端已^H^接有衍生基團的多糖。所述多糖可以經(jīng)其還原的或非還原的末端單iU^接至所i2y夷島素上。用于將多糖連接至蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中熟知的，并且在W092/22331和WO-A-0187922中有更洋細的描述。在本發(fā)明中優(yōu)選的方法在下文有更詳細的描述。在本申請的圖1和圖2中也描述了這些方法。所述多糖可以經(jīng)其^^末端單it^非ii^末端單it^接至所i^島素上。這意味著一個多##可連接有兩個胰島素蛋白質(zhì)，即在其ii^末端和非還原末端銅皮衍生。所述多糖可直接連接至所艦島素肽(即如圖1和圖2中所示)，或者經(jīng)一個銜接物連接至所逸魄島素肽。合適的銜接物來自N-馬iM^胺、乙烯基砜、N-碘乙酰胺、正p比，定(orthopyridyl)或含N-羥l^自艦胺的試劑。所述銜接物還可以K物穩(wěn)定的或生物可降解的，并包含例如多M合成的寡聚物。所述銜接物可來自雙官能部分，如W02005/016973中進一步描述的。合適的雙官能試劑為例如Bis-NHS。該試劑可以具有通式Z-R1-Z,其中每個Z為可以相同或不同的官能基團，W為雙官負沐機基。M地，W選自娛二基(alkanediyl)、亞芳基(arylene)、烷亞芳基(alkarylene)、雜亞芳基(heteroarylene)和)^^雜亞芳基(alkylheteroarylene)，它們中的4—個都可,皮羰基、酯、硫化物、醚、^t^/或^^取^A/或間斷。特別MC3"C6^1基。J^最^^t應(yīng)于所述合適的雙官能試劑的適當部分。M的多糖衍生物具有通式(I)其中m至少為1;HNB來自B-冊2，后者;U夷島素或胰島素樣肽的N末端；L為一^、一個銜接基團，或者包^個多M—個^^成寡聚體；GlyO為陰離子糖單元；其中如^^在^f接基團，其具有通式-Y"C(0)-Ri"C(0)-;其中Y為肌2或NR2-NR2,W為上i^斤述的雙官負沐;^且R2為H或C^垸基。在本發(fā)明的該方面，所ii^島素連接至所述多糖的非還原端。所W端多糖單元是一個唾^M單元。所述多糖中務(wù)他的糖單元由GlyO表示，并且可以相同或不同。合適的糖單元包括肝素、透明質(zhì)酸il^^軟骨素。如^^斤艦島素直接連接至所述多糖上，所錄團L是一報。然而，或者所錄團L可來自N-馬來酰亞胺、乙烯輛、N-珙乙鵬、正p比咬或含N-羥基琥珀^胺的試劑。所述試劑可以具有jLi^L義的通式Z-Ri-Z。在該實施方案中，L通常為一個SS基團。本發(fā)明的另一個方面是一種J^1義的組^，它;^一種藥物癥且^^并皿包^—種或多種藥用賦形劑。所述藥物組合物可以為水性懸液的形式。水性懸液包含所述新型4^物，混合有適宜于制備^<4生懸液的賦形劑。所述藥物組合物可以為一種無菌可注射的水性或均質(zhì)懸液的形式。可依瞎JW技術(shù)^J^合適的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑配制該懸液。對于Ai^獸醫(yī)的用途，可以經(jīng)口服、靜脈內(nèi)、雌內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、局部或氣管內(nèi)給予藥物組，。所i^且，還可以包含制劑添加物。我們所指的制劑添加物是指育Mt體內(nèi)或體夕NI定所iil夷島素的賦形劑，如Wang等人(1999)所述。所iiJ^形劑可以是穩(wěn)定劑、助溶劑或^r屬離子。制劑添加物的^^適實例包m沖劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、鹽、聚絲、金屬離子、糖、多元醇或絲酸的一種或多種。這些制劑添加物可單獨朋，或者結(jié)"饑穩(wěn)定劑通常的作用是，通iW蛋白質(zhì)的變性狀態(tài)進行^l定化，導(dǎo)!Wt斤疊蛋白質(zhì)的吉布斯自由能變化增大。所述穩(wěn)定劑^A糖或多元醇，例如蔗糖、山梨糖醇、脊藻糖、甘油、甘露醇、享UI^乙二醇。一種穩(wěn)定緩沖劑是磷酸鈉。所艦溶劑艦為表面活性劑，艦非離子型表面活性劑。合適的實例包括p土^顯(Tween)80、p土5顯20、p土'溫40、PluoronicF68、Brij35和曲拉通X—100(TritonXIOO)。所it"^屬離子^ffe^l二價的。^^適的4^屬離子包括Zn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+~Fe2+。所述制劑添加物還可以是選自PSA、PEG或羥基-&-環(huán)糊晴的聚^。iE可以^f吏用例如間曱酚(m-Cresol)的防腐劑。用作制劑添加物的合適^^1^衍生物包^^且氨酸、甘氨酸、^ft^^J^和天冬氨酸鈉。本發(fā)明的又一方面另_在治療中使用的上i^斤述的4^^。才娥本發(fā)明的又一方面，我們提供了一種產(chǎn)生胰島素的或胰島素4W白質(zhì)的多糖衍生物的方法，其中包含2-125^Nt單元的陰離子多糖J^上僅與所艦島素的或胰島素#^白質(zhì)的N末端胺進行化學^。短語"J^Ui僅與N末端胺進行化學^JT是指在衍生物的群中，至少85%，更^i^少90。/。，最^^^少95。/。的蛋白錄其N末端胺位置衍生。^ffei^，這是在胰島素B鏈的N末端g置。通過該方法以及下文詳述的任何^實施方案獲得的多糖衍生物#成本發(fā)明的1分。我們已經(jīng)開發(fā)了一種新方法用于將多糖4fe^至蛋白質(zhì)上，由此可利用蛋白質(zhì)N末端的高反應(yīng)性，并且該方法避免了使用以高硤^lt氧化的天然多聚唾^^t蛋白質(zhì)進^^^#^(匕的賄方法(圖l和圖2)所產(chǎn)生的產(chǎn)物復(fù)雜性。所述多^ii可以與修飾形式的胰島素反應(yīng)。例如，胰島素上的一個或多個基團可以經(jīng)化學轉(zhuǎn)化(chemicaltransforation),例:fcrfij^^或氧化。例如，^JI氧化M可在胰島素的末端JL^位置產(chǎn)生具有活性的U。適合用于本發(fā)明的方法的多^前i^所述新型組^/所述的?？梢酝╥tt^技術(shù)中所述的^—適合的方法制備本發(fā)明的化合物。例如，在我們以前的專利申請W092/22331中描述了一種通常的方法。所述陰離子多皿常在衍生胰島素之前已g化。例如它可具有一個活性醛基，并且可^f、條件下進行所述衍生化反應(yīng)。通過對所述多糖的羥Ui行受控氧化，可產(chǎn)生所述活性醛基。最^tfci^—個預(yù)備步驟中產(chǎn)生所述活性醛，其中所述多糖在受控的氧化條降下例如使用高碘酸鈉，在水lt^液中進行反應(yīng)。所述氧4戰(zhàn)^A化學氧化，但是也可以使用能進行此步驟的酶。所述活性醛基可以位于所述多糖的非還原端或還原端。胰島素(通常其N末端)然后可以與所g'fiS^^以產(chǎn)生一種加^^，該加^^^皮ii^時可產(chǎn)生胰島素的N末^f生物。所述多糖的活^1W^這樣的條降下進行，即使得J4Ui沒有多糖主鏈的鏈中間斷裂，也就是說基本上沒有減小分子量。合適的氧化劑為高釕酸鹽(perrhuthenate),或者M為高員鹽?？梢允褂靡韵录m將氧4ti^f亍1min至48小時lmM-lM的高;^JlL濃變范圍、3-10的pH范圍、0-60匸的溫度范圍。用于衍生^^的合iiii^M可利用氳與催化劑，或^N^氬4匕物例:^硼氫化物。它們可以是被固定的，例如以安柏萊特(Amber1ite)(商標)固載的硼氫化物。4^Ji金屬氬化物例，氬^^^i^以下M下^I作i^f、劑1"M-0.1M的濃變范圍、4-10的pH范圍、0-60。C的溫度范圍以及1min-72小時的時間范圍。選擇條Hs使^^始材料上的側(cè)翼n不被還原。^f&^適的還原劑為酸性糾下的IL^硼氬化物，例如以聚絲固載的^^硼氬化物或堿金屬IL^硼氬化物、L-抗ifjk酸、焦亞自鈉、L-selectride、三乙酰HJ-硼氫化物等。多糖的，活性衍生物可被應(yīng)用于本發(fā)明中，包括具有諸如NHS的側(cè)翼官能基團的那些活性衍生物，如我們以前的專利申請WO06/00540中所述的。在一個實施方案中，所i^舌'Ii^基位于所述多糖的還原端，并且其非還原端已經(jīng)被4^M吏得其不與所i^島素的側(cè)翼基團反應(yīng)。雖然多聚唾^i^f、端對目標蛋白質(zhì)的活性是弱的，但是對于制^f匕學結(jié)構(gòu)確定的4fe^/卻;^L夠;^煩的。適合于制備在多糖的還原末端具有活性搭的多糖的化學法在我們以前的申請WO05/016974中有記載。該方法涉及一個預(yù)^^擇氧化步驟，^是還原，然后ii一步氧化，以產(chǎn)生一種^原端具有S^fJDT鈍化的非還原端的化^。W02005/016973描述了用于旨蛋白質(zhì)的聚唾^^矛汙生物，特別是那些具有游離錄的藥物的聚唾^^衍生物。所述聚唾液酸4^^與異雙官能試劑反應(yīng)以引入"HH^翼官食逸團用于位點特異性4"E^Si^。本發(fā)明中^^1的陰離子多糖也可以用異雙官能試劑以這種方式^f生。在所述多糖與胰島素^JL之前可以將^"生。例如，所述多糖可以與雙官能試劑>^。所述多糖可以經(jīng)過一個預(yù)備^步驟，其中在末端糖(M為唾自上形成選自伯胺基團、仲胺基團^J醉的基團，4U^是其與雙官能試劑反應(yīng)的AJI步驟，以形成一個反應(yīng)中間體，如WO2006/016168中進一步所述的。該中間體然后可以與胰島素或胰島素樣JliA應(yīng)。所ii^官能試劑可具有通式Z-RLZ,如上述。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些^^HH^J睫島素N末端位置的選棒性衍生化。為了14^(Jli^斤述N末端的選棒l!i^，應(yīng)在一種酸性pH的第一水l!i^液中進行衍生化反應(yīng)，然后應(yīng)在比第一水I4^液pH更高的第二水fciig:液中純/fW斤得到的多糖衍生物。對于酸性pH，我們是指小于7的pH。所述第一水l!iigi液的pH"^14.0-6.5的范圍，艦4.0-6.0,所錄二水Iii^液的pH是6.5-9.0的范圍，艦6.5-8.5或6.5-8.0。低pH的衍生^m^^(i^所述蛋白質(zhì)N末端一一而不是在鏈的任何中間位點一一的選棒性衍生化。再者，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用某些制劑添加物^ii形A^棒性的、穩(wěn)定的、多糖胰島素衍生物。所述制劑添加物可選自緩沖劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、鹽、聚^、金屬離子、糖多元醇或^J^的一種或多種。它們可4皮添加至所i^應(yīng)介質(zhì)中，或者可作為穩(wěn)定劑被添加至終產(chǎn)物組#中。^iM^發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑添加物為山梨糖醇、海藻糖賴糖。在另一個實施方案中，所述制劑添加物可以是非離子型表面活性劑。所述制劑添加物或者可以是選自PSA、PEG或羥基-p-環(huán)^^晴的聚^稱。在另一個實施方案中，所述制劑添加物是二價金屬離子。二價金屬離子包括Zn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+或Fe2+。所述制劑添加物可以是緩沖劑。如^^斤述制劑添加物是緩沖劑，那么它M是磷酸鈉或乙酸鈉。在本發(fā)明的方法中，純化多糖衍生物可以偵月本領(lǐng)域中已知的多種方法進行。合適純化方法的實例包括HIC(疏7M目互作用色譜法)、SECOCt排除色譜法)、HPLC(高效斜目色鐠)以及IEC(離子交換色鐠法)?？蓪⒕哂休^寬襯量分布的聚唾^^^狄具有較低多^:性的部分，即分級成具有不同平均^量的部分。分級m通過陰離子交換色譜進行，陰離子交換色"^用于洗1^^適的>^'|^沖劑，如我們以前的專利申請W02005/016794和W02005/03149中所述的。所述分級方法不Oit用于所述衍生物，iiit用于多^^材料。該技術(shù)因此可妙用于本發(fā)明的14^處理步驟之前或^。優(yōu)，所產(chǎn)生的胰島素多糖衍生物具有小于1.1的多^1。才Nt本發(fā)明對胰島素進行衍生^^導(dǎo)lU夷島素半衰期增加、穩(wěn)定性提高、免^f、性I^f氐，以;sv或者控制溶觶性并因雌制生物利用度和藥代動力學性質(zhì)。該新方法對于產(chǎn)生單聚唾液酸化的胰島素4fe^是特別有用的。通過實施例1-6^fit過參考以下附圖對本發(fā)明進行闡述圖1顯示用高>*^鈉氧化多聚唾M(來自大腸桿菌的a-2，8連接的聚唾液斷圖2顯示用募基硼氫化鈉選擇性J^原希夫堿，以形成一個連M白質(zhì)氨基的穩(wěn)定、不可逆的共價鍵；圖3是22kDaCAO-重纟JLAJ^島素^^在不同溫度下的SDS-PAGE;圖4顯示溫度對衍生^MS^度的^;圖5是27kDaCA0-重lEAl4島素4^^在不同摩爾比時的SDS-PAGE;圖6顯示摩爾H^j"衍生^^度的雌；圖7是8和11kDaCA0-重纟1AJ爽島素旨物的SDS-PAGE;圖8是8kDaCAO-重^LAJ爽島素制劑;SJ爽島素的SE-HPLC;圖9顯示10、15和21.5kDaCAO-重^EAJ^島素制劑的體內(nèi)效力；圖10顯示用于純/f^^物的用IEC或HIC的制備型HPLC實驗裝置；圖11顯示通逸在HiTrapButylFF柱上的疏擬目互作用色譜法純化CAO-圖12顯示通過在HitrapQFF柱上的陰離子交換色^f法以13kDaCAO作為例子從HIC的峰2純化CA0-胰島素4fe^/;圖13顯示13KDa和27KDaCAO-胰島素^物的等電聚焦(IEF)皿；圖14顯示CA0-胰島素4^^在小鼠中的體內(nèi)結(jié)果；以及圖15顯示^:德曼^J^^^解的結(jié)果。實施例1.蛋白和多聚唾液酸的確定通過間苯二酚法[Svennerholm1957]用間^SH^劑進行聚唾液酸(如唾液劇的定量測定，關(guān)于間苯二酚法也可參考[Gregoriadiset.al.，1993;FernandesandGregoriadis,1996，1997]。用BCA比色法或280nm的UV吸^!測量蛋白質(zhì)。2.聚唾液酸的活化在20X:下，鮮制備的0.02M的高碘酸鈉(Nal04)溶液(8倍摩爾數(shù)過量)與CA混合，并且在黑暗中將^;a^磁力攪拌15分鐘。然后將2倍體積的乙二醇添加至所￡^^;^^物中以*過量的NaI04,將所述〉V給物置于20匸下再攪拌30分鐘。在4匸下，將所述氧化的多聚唾液酸(CAO)對o.oiy減酸銨緩沖液(pH7.4)充分(24h)透析(3.5KDa截留襯量的透析fO。超濾(大于3.5kDa的截留W量)被用于，透析袋中的CAO溶液。在濃縮至所需體積之后，將所述濾液低壓凍干并置于-40C直至進一步佳月?；蛘?，通過乙醇^J定(2次)從所ii^;^^物中回收CAO。163.CA和衍生物的氧化態(tài)的測定用2，4-_=^'苯基肼(2，4-0^11)定量測定多聚唾液酸的氧化度，2,4-二硝苯JJ醉與羰基^^相互作用會生成旨的2，4-^^'J^:，。在2，4-DNPH試劑(l.0ml)中加入未氧化的(CA)/氧化的(CA0)，振蕩溶液然后置于37匸下直到觀察到晶體沉淀[Shrineret.al.，1980]。利用一種這樣的方法[ParkandJohnson,1949]測量了CA的氧化度(定量)，即方法該基于^性溶液中將氰化鐵離子還原為亞鐵氰化鐵(波斯藍)，然后在630nm下測量該亞鐵氰化鐵。在本實施例中，用葡萄糖作為標準。4.艦滲透色絲多聚唾液酸樣品(CA和CAO)溶于含NaN03(0.2M)的CH3CN(10%;5mg/ml)中，并在2xGMPWXL柱上用色譜法分離，通過折光率(GPC系統(tǒng)VE1121GPC溶劑泵，VE3590Rl檢測器)檢測，并用Trisec3軟件(ViscotekEuropeLtd)校正。樣品(5mg/ml)用0.45/am尼;^過濾，以0.7cm/min的iiJtit^，以0.2MNaN03和CH3CN(10%)作為流動相。5.多聚唾液酸穩(wěn)定性用于化學法聚乙二降f匕的規(guī)則不適用于聚唾^M化，這是因為這些分子生理化爭H貧的差異。PSA是一種對酸敏感的聚合物，在中性pH附近可穩(wěn)定存在數(shù)周(圖3)。圖3中的結(jié)a明，CAO在pH6.0和7.4可穩(wěn)定存在8天，在pH5.0時緩慢降解(48小時后，92%的初始,，在pH4.0時緩慢降解(48小時后，70%的初始MW)。在本'Ui,聚唾';^A高度親水的，而PEG是雙親性分子。如果使用用于聚乙二醇化的M進行聚唾液酸化，在多數(shù)情況下會，*到蛋白質(zhì)的聚6.N^蛋白質(zhì)"CA4fe^與制劑添加物的制備6.1胰島素-CA輒合物的制備(N末端方法)胰島素(5804Da)以白色固^4i供。將胰島素溶解于最少的lOOmMHCl中，然后將其調(diào)節(jié)至所需的pH并置于水上。需要添加用于旨的CA0量##下式計算蛋白質(zhì)的量(g)CA0重量=(蛋白質(zhì)的MW)x(CA0的MW)x(CA0過量的摩爾奶稱取所需的CA0量。將CA0溶解于10mMNa0Ac,pH6.0中，輕輕渦旋混合物直至所有CAO已溶解，然后或過濾至一個新的容器中以除去,聚集/沉淀的物質(zhì)。將所需量的胰島素蛋白質(zhì)溶液添加至所述CA0溶液中以獲得7.5倍(小別勢和5倍(;UM影摩爾數(shù)過量的CAO,并且在4士HC下通過將所述a^^物置于低速振蕩器上輕輕混合。添加100mg/mlNaCNBH3溶液以在終^Jl^^物中含有8mg/m1,輕輕^^并檢查所述終>^〉'^物的pH,如果需要則在4±1。C下用0.5MNaOH/HCl將pH調(diào)節(jié)至6.0。^用10mMNaOAc,pH6.0調(diào)整所itA應(yīng)物的體積，以得到所ii^^^物中1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。將管子密封并在所需溫度(4±rC)下渦旋24小時。通過合適的方法(例如pH7.4的三羥曱基氨基曱烷緩沖紀終止所述反應(yīng)，并將樣品取出用于SDS-PAGEM^J^18%的Tris甘氨酸^)、SE-HPLC(superose12柱)，并^"測反應(yīng)混/^的pH。為了消BHi^的沉i定物，在SE-HPLC^^斤和純4匕前將所iiA^^^在13000rpm下離心5min，絲的SE-HPLC的緩沖液為0.1M磷酸鈉(pH6.9)。6.2優(yōu)化用一定M量范圍的CA0(10-30kda)在胰島素上進^ii^性^J^化，用于N末端衍生化和隨^a汙生化。研究了輒合反應(yīng)的處理變量范圍10-20倍(小^M彰和5-10倍(;U)Mi)CAO摩爾數(shù)過量，試劑=50-10隨NaCNBH3，反應(yīng)緩沖劑=1隨NaOAcpH5.5-6.5,溫>^=4±110，時間=16-24小時等。X!J剖的伏/f^JlM如下CA(M.5倍(小測勢和5倍(;Jd^勢摩爾數(shù)過量，試劑=50nMNaCNBH3。AJI緩沖劑-10nMNaOAcpH5.5，溫度=4±1匸，時間=24小時。6.3胰島素-CA4fe^物(N末端方法)的純/tt^i表征為了從;a^中除去游離的CAO，了HIC(HiTrapButylFF)。^JI濃縮(NH4)2S04(例如3M)、20mMNa2HP04(pH7.4)，通過用最小體積來稀釋胰島素JM^^物制備加樣溶液，以得到所脅樣溶液中0.8M(NH4)2S04。檢查pH，應(yīng)該為7.4或者用0.5MHCl/NaOH進行調(diào)節(jié)，需要用0.2jam的膜濾器過濾所脅樣溶液。然后將該溶脅樣至(速率=0.5ml/min)以HIC緩沖液B(20mM磷酸鈉+0.8M(NH4)2S04，pH7.4)預(yù)先平衡的HIC柱上。收集所#樣部分(每^分為1.5倍柱體積)并才射己(Ll-Lx),然后用HIC緩沖液B(至少5倍柱體積；速率=0.5ml/min;1.5倍柱體積的部分)洗滌柱，收集并標記(Wl-Wx)。將產(chǎn)物與HIC緩沖液A(IOnM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)洗脫(速率=5ml/min)，并收集所述部分(1倍柱體積部分；6倍柱體積)并標記(E1-Ex)。如果兩個連續(xù)部分中沒有蛋白質(zhì)成分(UV280nm)，進行下一步驟。在純化過程中將所述樣品置18于冰上。通過UV(280nm)(1mg/ml胰島素在280nm下的消光系數(shù)為約1.043)^^斤蛋白質(zhì)濃度。取所述樣品用于SDS-PAGE和SE-HPLC。^^蛋白質(zhì)部分的HIC部分經(jīng)IEC緩沖液A(20mM磷B緩沖液，pH7.4)洗滌，以除去Vivaspin20(MW:5Kd)中^^T能的硫酸銨。檢查pH，并且如果需M其調(diào)節(jié)至pH7.4。加樣至以IEC緩沖液A預(yù)先平衡的IEC柱上。以如下的方式應(yīng)用一個梯度系統(tǒng)加樣以0.25ml/min注入樣品的IEC緩沖液A溶液，3CV的洗滌液洗滌梯度系統(tǒng)IEC緩沖液A:90%,AEX緩沖液B(20mM磷B緩沖液+1MNaCl，pH7.4):10%,5CV的梯度敲3CV的洗滌液，itii:0.25ml/minIEC緩沖液A:68%,IEC緩沖液B:32%,5CV的梯度液&3CV的洗滌液，0,25ml/minIEC緩沖液A:35%，IEC緩沖液B:65%，5CV的梯度液&3CV的洗滌液，流速0.25ml/minIEC緩沖液A:0%,IEC緩沖液B:100%,5CV的梯度敲3CV的洗滌液，流速0.25ml/min#^有純化的4^^的IEC部分*，將緩沖^為PBS緩沖^i^t洗滌以除去鹽。在除去I!L^調(diào)節(jié)pH至7.4。然后在4士1"C下，該溶液，通過UV光謙法(280nm)分析蛋白質(zhì)濃度。4fe^經(jīng)無菌過濾，取)斤述樣品用于活性測定，并用于通過SDS-PAGE和SE-HPLC的絲。如果需要，則取出等^#用于蛋白質(zhì)測定及CA測定。剩絲在4士1"C下絲至進一步4^1,并JLit過SE-HPLC研究物理穩(wěn)定性。多種方法影響胰島素^g:液中的穩(wěn)定性以及衍生^f^JL的^已被研究。6.4胰島素-14kDaCA4fe^(單^t性)的制備胰島素(5808Da)以白色固^fM^供。通過添加最少量100mMHC1的溶解胰島素，然后調(diào)節(jié)至所需pH并置于水上。需要添加用于旨的14kDaCA量才IL^下式計算蛋白質(zhì)的量(g)14kDaCAO重量=(歪白質(zhì)的MW)x(CAO的MW)x(CAO過量的摩爾奶稱取所需的14kDaCAO量。將14kDaCAO溶解于10mM磷B緩沖液，pH6.0中，輕輕渦旋;^^物直至所有14kDaCAO已溶解，然后或過濾至一個新的容器中以除去任何聚集的/沉淀的材料。將所需量的胰島素蛋白質(zhì)溶液添加至所述14kDaCAO溶液中以獲得7.5倍(小別影和5倍(;USM彰摩爾數(shù)過量的14kDaCAO,并JL^4土llC下通過將所ii^^^置于^f^4振蕩器上輕輕混合。添加100mg/mlNaCNBH3溶液以在終^》'S^物中含有63.5mM或4mg/ml，輕輕;^^f檢查所i^^^^^的pH,如果需要則在4±HC下用0.5MNaOH/HCl將pH調(diào)節(jié)至6.0。ft^用10mMNaOAc,pH6.0調(diào)整所i^應(yīng)物的體積，以得到所ii^^^物中l(wèi)mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。將管子密封并在所需溫度(4士1X:)下渦旋24小時。通過合適的方法終止所ii^，并將樣品取出用于SDS-PAGE18%的Tris甘氨酸^JK)、SE-HPLC(s叩erose12柱)，并;l^測^^^物的pH。為了消B^阿的沉淀物，在SE-HPLC分析和純化前將所ii^^^^在13000rpm下離心5min，艦的SE-HPLC的緩沖液為0.1M磷酸鈉(pH6,9)。6.5優(yōu)化用一定襯量范圍的CA0(10-30kda)在胰島素上進^ii原性^J^化，用于N末端衍生化和隨城生化。研究了輒合^i過程變化的范圍10-20倍(小規(guī)影和5-10倍(;U!^)CAO摩爾數(shù)過量；試劑=50-100nMNaCN朋3;反應(yīng)緩沖劑=10齒磷紋緩沖液，pH=5-7.4;溫度=4_37±1匸，時間=16-24小時等。M^到的伏/ft^M如下CAO=7.5倍(小，和5倍(;J^M彰摩爾數(shù)過量，試劑=63.5nMNaCNBH3(4mg/ml)。^緩沖液=10慮NaOAcpH6.0,溫度=4±11C，時間=24小時。6.6胰島素-CAife^(N末端方法)的純^tti^表征為了從^^中除去游離的CAO，使用了HIC。通過稀釋最小^^P、的胰島素^JL;^^物制備加樣溶液，侵月濃縮的(NH4)2S04(例如3M)，2謹Na2HP04(pH7.4)以得到所脅樣溶液中0.8M(NH4)2S04。檢查pH，應(yīng)該為7.4或者用0.5MHCl/NaOH調(diào)節(jié)，需要用0.2jam的膜濾器過濾所#樣溶液。然后將該溶^樣至(速率=0.5ml/min)以HIC緩沖液B(20幽磷酸鈉+0.8M(NH4)2S04，pH7.4)預(yù)先平衡的HIC柱上。收集所⑩樣部分(每^NP分1.5的柱體積)并標記(L1-Lx)。用緩沖液B(至少5倍柱體積；速率=0.5ml/min;收集1.5倍柱>^、的部分)洗滌柱，收集部分并標記(W1-Wx)。將產(chǎn)物與HIC緩沖液A(IOnM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)洗脫(速率=5ml/min);收集部分(l倍柱體積部分；6倍柱體積)并標記(E1-Ex)。如果兩個連續(xù)部分中沒有蛋白質(zhì)成分(UV280nm)，進行下一步驟。在純化過程中將所述樣品置于冰上。通過UV(280nm)(1mg/ml胰島素在280nm下的消光系數(shù)為約1.043)分析蛋白質(zhì)濃度。所述樣品祐月于SDS-PAGE和SE-HPLC。20含蛋白質(zhì)部分的HIC部分經(jīng)IEC緩沖液A(20慮>#^緩沖液，pH7.4)洗滌，以除去Vivaspin20(MW:5Kd)中任啊可能的硫酸銨。檢查pH，并且如果需M其調(diào)節(jié)至pH7.4。加樣至以IEC緩沖液A預(yù)先平衡的IEC柱上。以如下的方式應(yīng)用一個梯度系統(tǒng)加樣以0.25ml/min注入樣品的IEC緩沖液A溶液，3CV的洗滌液洗滌梯度系統(tǒng)IEC緩沖液A:90%,AEX緩沖液B(20mM磷g緩沖液+1MNaCl，pH7.4):10%,5CV的梯度齟3CV的洗'滌液，；j^:0.25ml/minIEC緩沖液A:68%,IEC緩沖液B:32%,5CV的梯度齡3CV的洗滌液，;ji^4:0.25ml/minIEC緩沖液A:35%，IEC緩沖液B:65%,5CV的梯度融3CV的洗滌液，流速0.25ml/minIEC緩沖液A:0%，IEC緩沖液B:100%，5CV的梯度魁3CV的洗滌液，流速0.25ml/min#^有純化的^^的IEC部分^Sf,將緩沖^t變?yōu)镻BS緩沖^ii什洗滌以除去鹽。在除去IL^調(diào)節(jié)pH至7.4。然后在4士lt:下自該溶液，通過UV光譜法(280nm)分析蛋白質(zhì)濃度。^^經(jīng)無菌過濾，取》斤述才羊品用于測定活性，并用于通過SDS-PAGE和SE-HPLC的表征。如果需要，則取出等^#用于蛋白質(zhì)測定及CA測定。剩^b在4±11:下絲至進一步^^1，并Jit過SE-HPLC研究物理穩(wěn)定性。多種方法影響胰島素在溶液中的穩(wěn)定性以及衍生^^1的^已被研究。6.7胰島素制劑的SE-HPLC在fj己有Jasco，AS-2057plus冷卻至4X:的自動釆^樣器，以及JascoUV-975UV/VIS糊'J器的斜目色^f義(JASCO)Jiit行HPLC。通過EZchromElite^t件在IBM/PC上記錄數(shù)據(jù)。在S叩erose12柱上，用0.1M磷酸鈉，pH6.9的^^'冼脫流動相(isocraticmobilephase)分析SEC樣品(圖8)。圖8僅顯示了RT=75.408位置的一*,該峰由胰島素產(chǎn)生。6.8SDS聚丙烯StJ^皿電^&蛋白質(zhì)印跡<^18%^""^^酰^"^^^^皿(triglyinegel)進行SDS-PAGE。^^Jii^'嫂沖'絲非ii^嫂沖液稀釋樣品，并將5.0ug蛋白質(zhì)加樣至每孔中。在甘油三酯(triglycerine)緩沖液體系中對該凝膠進行電泳，并用考馬斯藍(CoomasieBlue)進行染色(圖5&7)。<躺抗PSA^ii行蛋白質(zhì)印跡。圖4顯示了胰島素制劑的SDS-PAGE(位點特異性；N末端)。6.927和13kDaCAO-胰島素的等電聚焦(IEF)皿NovexIEF凝膠被用于確定胰島素和CAO-胰島素M物等電點的差異。以0.5mg/ml的濃度溶耕品。用5ulNovexIEF樣品緩沖液pH3-10(NovexIEFSampleBufferpH3-10)稀釋5ul樣品，然后將該蛋白質(zhì)樣品加樣至艦。6.10穩(wěn)定',究無菌胰島素4^^在PBS緩沖液中于41C下保存6周。每周進行所述樣品的非變性PAGE(Native-PAGE)。6.11胰鳥素制劑的體內(nèi)效力7-8周齡的雌性CD"1小l/9f究了胰島素制劑的體內(nèi)效力，0.3IU的蛋白質(zhì)劑量湘同活性)皮下注射小鼠。將動物分成7組，^M4只，按照以下方^j"每組的每只動物給予胰島素制劑胰島素(O.3IU/小I0、Lantus(Aventis)胰島素-PSA旨物(14KDa)、PBS。從每只動物:^一滴血液，員過ACCU-CHEKActive(RocheDiagnostics)效慢jHt。結(jié)果CA的活^R^I^^f呈度的測定所使用的多聚唾液酸(CA)是一種oc-2.8-連接的N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)絲的線性均聚物。在室溫Tf^)20iiM高;^IW多聚唾^^進行氧^^露15min。通過^M^透色^^析高;^^L處理后內(nèi)部ct-2.8連接的Neu5Ac的完塾性，將^^斤ii^化(CA0)材料獲得的色譜與天然CA的色譜進行了》艮。本發(fā)明A^現(xiàn)，氧化CA和天然CA呈現(xiàn)了幾乎同樣的^yt語，沒有跡綠明所iii^氧化步驟會引^^斤述聚^^鏈的J^斷裂。通過在堿性溶液中將氰化鐵離子還原為亞鐵氰化鐵(波斯藍)[ParkandJohnson,1949]，用葡萄糖作為標準定量測量了CA的氧化態(tài)。ii^明，所述氧化多聚唾液酸狄現(xiàn)有比化學計算量更多的i^^劑Ol0(W)，即112摩爾％的表M^Jr包^ii原端半縮酮和引X^(在另一端)的結(jié)M原力。聚唾液酸化^JI的優(yōu)化使用1mg重組AJl島素與CA0在不同溫度以;5L^應(yīng)物摩爾比和鏈長下優(yōu)化聚唾液酸化射卜。結(jié)l在圖5-12中顯示。在該^JI過程中，41C明顯是CA0和胰島素穩(wěn)定性的最適溫度。然而，在更高溫度下可獲得更多旨，7.5:1的CA0與胰島素的摩爾比更為有效。表1顯示摩爾比對聚唾液酸化的效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表2星號表示各^^目對于Tris緩沖液差異的概率水平'P<0.05，"P<0.01，■P<0.001。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表3星號表示各纟^目對于PBS緩沖^t異的概率水平'P<0.05，"P<0.01,"'P<0.001。pH對15kDaCAO-胰島素的體內(nèi)效力狄明，pH6.0優(yōu)于7.4。因》化pH6.0下進行了后面的實驗。來自肽鐠法和埃德曼降解的數(shù)據(jù)進一步證實，pH6.0的聚唾、^^^^降的4fe^M島素BMA被N末端特異性阻斷的。胰島素4/E^物的制備、純/ft^表征可成功軛合單分散CAO-胰島素，^itii^化HIC和IEC純/f娥到了高度純化的齡物。通過圖10中表明的IEC和HIC聯(lián)合裝置與預(yù)備型HPLC設(shè)備，改良了所i^M^率。上文已經(jīng)詳述了這樣的步驟，即通錄1^[氐的pH(pH6.0)及4±11C下進行反應(yīng)，以一種N末端選棒性的方式制M純化多聚唾^M(CA)4i^物。這涉及^4在^J-硼氬^^的情況下進行絲，然后^^1^M^目互作用色譜法(HIC)進行純化以除去游離CA(圖11)，然后通過離子交換色鐠法(IEC)除去胰島素(圖12)。佳月了較低pH，以有利于在胰島素Bi的N末端(PheBl)選棒性衍生化，并JLii為了在^^過程中^^島素的聚#*少化。最終的M緩沖液的組成為pH6.0的10慮NaOAc中1mg/ml胰島素、8mg/mlNaCNBH3和5倍摩爾數(shù)過量的CA0。圖13中的13Kda和27KdaCA0-胰島素^物的等電聚焦(IEF):^顯示，聚唾液酸化胰島素的4/E^沒有固定的等電點(pl)。胰島素-CA輒合物的形成和穩(wěn)定性被以下技術(shù)所證實SE-HPLC(胰島素-PSA與胰島素相比保留時間的變化；以及兩部分的共洗脫)；離子交換色譜(輒合物在IEC柱上的結(jié)合)，以及聚丙烯酰胺皿電泳(SDS-PAGE;具有較高^4^t類的帶的偏移)。用于體內(nèi)效力(在CD"1小鼠上，平均25g)的胰島素4^!^物顯示了比胰島素更優(yōu)的體內(nèi)效力(延長)和鈍性(#%少)。所述輒^^降4^t能力的延長與所述制劑中使用的聚合物的鏈長成比例，如圖14中所示。27KDaCAO-胰島素絲物的穩(wěn)定'l!^f究表明，在40天期間4C的絲過程中沒有^^T降解，這^^于來自非變性-PAGE的結(jié)果。對M^f匕制備^Jfc化的14kDa-胰島素4fe^的^在700mg胰島素作為起始反應(yīng)物的實例中，^f^JM^^f戰(zhàn)純化得到了230mg14kDaCAO-胰島素(蛋白質(zhì)重量)。通過比較色譜，圖15中g(shù)酸量的變化顯示了來自N末端的氨基酸。在pH7.4PBS中l(wèi)mg/mL的水性樣品經(jīng)水100倍稀釋。取2pL的這種稀#"溶^|于分析。結(jié)論是,序列G-I-V-E可標識胰島素的A鏈。無^J^Phe/Val/Asn/Gln表明胰島素的B鏈是帔N末端阻斷的。在體外活性測定中發(fā)現(xiàn)PSA扼^是有活性的。體內(nèi)效力研究表明，PSA-胰島素M物大大優(yōu)于胰島素。參考文獻Geigeretal.(inD.Branderburg,andA.Wollmer(eds.)，1980，Insulin:Chemistry,Structure,andFunctionofInsulinandRelatedHormones,WalterdeGruyter&Co.,NewYork,P409-415,EhratM.，LuisiP丄.，1983，Synthesisandspectroscopiccharacterizationofinsulinderivativescontainingoneortwopoly(ethyleneoxide)chainsatspecificpositions,Biopolymers，22:P569-573,CalicetiP，(1999)mprovementofthephysicochemicalandbiopharmaceuticalpropertiesofinsulinbypoly(ethyleneglycol)conjugation,STPPharmaSciences9:P107-113Uchio,T.,Baudys，M.,Liu,F.，Song,S.C.,Kim,S.W.,(1999)Site-specificinsulinconjugateswithenhancedstabilityandextendedactionprofile.,AdvancedDrugDeliveryReviews,35,P289-306HindsK,.Koh丄J,JossL，LiuF.,BaudysM.Kim，S.W.,(2000)."SynthesisandCharacterizationofPoly(ethyleneglycol)-'nsulinConjugates,"BioconjugateChem.，"，195-201HindsK.D.;KimS.W.(2002)，AdvancedDrugDeliveryReviews,54:505-530，F(xiàn)emandes，A丄'Gregoriadis,G.，Synthesis,characterizationandpropertiesofpolysialylatedcatalase,BiochimicaetBiophysicaActa,1293(1996)92-96Fernandes，A丄，Gregoriadis,G.，Polysialylatedasparaginase:preparation,activityandpharmacokinetics,BiochimicaetBiophysicaActa,1341(1997)26-34.Jain,S.etalPolysialylatedinsulin:synthesis,characteristaionandbiologicalactivityinvivo,BiochimicaetBiophysicaActa,1662(2003)42-49;Gregoriadis,G.，McCormack,B.，Wang,Z.,Lifely,R.,Polysialicacids:potentialindrugdelivery,FEBSLetters,315(1993)271-276.Park,丄T.,Johnson,M.丄，Asubmicrodeterminationofglucose,JournalofBiologicalChemistry,181(1949)149-151.Shriner,R.L.，F(xiàn)uson，R.D.C.，Curtin，D.Y.，Morill，T.C.,TheSystematicIdentificationofOrganicCompounds,6thed.,Wiley,NewYork,1980.Svennerholm，L，QuantitativeestimationofsialicacidII:Acolorimetricresorcinol-hydrochloricacidmethod,BiochimcaetBiophysicaActa,24(1957)604-611.Wang,W.，Instability,stabilization,andformulationofliquidproteinpharmaceuticals,InternationalJournalofPharmaceutics,185(1999)129-188.權(quán)利要求1.一種包含蛋白質(zhì)的多糖衍生物群的組合物，其中所述蛋白質(zhì)為胰島素或胰島素樣蛋白質(zhì)，所述多糖是陰離子并包含2-125個糖單元，并且其中所述群基本上僅由所述蛋白質(zhì)的N末端衍生物組成。2.才^^權(quán)利要求1的組合物，其中所述多撒t自聚唾液酸、肝素、透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素。3.才娥權(quán)利要求2的組#，其中所述多糖A^:唾液酸，優(yōu)i^i4Ui僅由唾液酸單元組成。4.#4)l前i^l矛J^求^-項的組^^其中所i^島素或胰島素才"W白質(zhì)^^斤述多糖在所述多糖的ii^末端單iL^生化。5.##權(quán)利要求1-3^-"項的組^，其中所述多糖衍生物具有通式(I)其中m至少為1;HNB來自B-NH2,B-NH2為胰島素或胰島素樣肽的N末端；L為一樣、一個銜接基團，或者包^-個多賦"Hv^成寡聚體；GlyO—個為陰離子^t單元；其中如^^在銜接基團，其具有通式-Y"C(0)-W"C(0)-；其中Y為N^或NRLNR2，W為選自以下的雙官肯沐;^:M^基、亞芳基、烷亞芳基、雜亞芳^^g雜亞芳基，它們中的^P個^T皿基、酯、減化物、醚、酰胺和/或^^取4^7或間斷；且R2為H或Cw烷基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.條權(quán)利要求5的組^^,其中L是一^^者一個一""n"基團。7.條前i^5l利要求^—項的組合物，其中所述多糖包含10-80個唾艦單元，艦20-60個唾艦單元，最艦40-50個唾艦單元。8.才娥前ii^利要求^-項的組^^，其中所述陰離子多糖的多^t^低于l.3，絲低于1.2，最艦低于l.l。9.才H^前i^U'J^求^""項的組^^,所i^且^^是一種藥物組M并且包^-種或多種藥用賦形劑。10.4N^5L利^"求1-8>^-~項的《且*用于治療。11.一種用于產(chǎn)生胰島素的或胰島素#^白質(zhì)的多糖衍生物的方法，其中將陰離子多糖^^上僅與所*島素的或胰島素#^白質(zhì)B鏈的N末端胺^Li化學反應(yīng)，所述陰離子多糖為包含20-125個唾_單元的聚唾,。12.^^^L利J^求11的方法，其中所述陰離子多糖具有一個活'li^基，所ii^基與所i^島素或胰島素W"白質(zhì)^，并JL^f、M下進行所述衍生化a。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所必舌性醛基位于所述多糖的非還原端。14.才^t權(quán)利要求12的方法，其中所ii5舌性醛基位于所述多糖的ii^端，并且其非還原端已經(jīng)被鈍化，以使它不能與所^J夷島素或胰島素4W白質(zhì)反應(yīng)。15.根據(jù)權(quán)利要求11-14^"項的方法，其中所述多糖與所ii^島素或胰島素4W白質(zhì)的胺基^。16.^^權(quán)利要求15的方法，其中所ii^A^端胺基團。17.才娥權(quán)利要求15的方法，其中所ii^來自于所i^島素或胰島素,白質(zhì)的一個^J^1氨酸。18.根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述陰離子多糖具有一個活性醛基，所^^1^一個預(yù)4^^步^^^L轉(zhuǎn)化M，然后所逸疾與雙官能試劑反應(yīng)以形成一個反應(yīng)中間體，所^官能試劑至少包^—^N^自N-馬i^il2胺、乙烯基颯、N-捵乙艦、正p比"^iJlN-羥l^l,胺的官負逸團，其中所^Jl中間體與所皿島素或胰島素樣蛋白質(zhì)反應(yīng)。19.才娥權(quán)利要求1卜18^-項的方法，其中所述陰離子多糖^Ji中間體在一種酸性pH的第一水^^液中與所艦島素或胰島素錄白質(zhì)的絲胺基反應(yīng)；并錄比所錄一水Iiiil液pH更高的第二水lt^液中純/M^斤得到的多糖衍生物。20.才緣權(quán)利要求19的方法，其中所絲一水l!iiii液的pH為4.0-6.0的范圍，JU斤述第二水li^液的pH為6.5-8.5的范圍。21.才il^權(quán)利要求11-20^-項的方法，所i^r法^^在制劑添加物的情況下進行。22.才^^權(quán)利要求21的方法，其中所述制劑添加物選自緩沖劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、鹽、聚絲、金屬離子、糖、多元醇或#^的一種或多種。23.mH權(quán)利^求22的方法，其中所述制劑添加物為山梨糖醇、海藻糖或24.##權(quán)矛]^求22的方法，其中所述制劑添加物為非離刊表面活性劑。25.#^權(quán)利要求22的方法，其中所述制劑添加物為選自PSA、PEG或羥基-P-柳精的聚緣26.##權(quán)利要求22的方法，其中所述制劑添加物為二價金屬離子，MZn2+、Ni2+、Co2+、Sr2+、Fe2+、Ca2，g2+。27.^^權(quán)利^"求22的方法，其中所述制劑添加物為一種緩沖劑且所i^爰沖劑為彿酸鈉。28.通過^t權(quán)矛j^求11-27^""項的方法得到的胰島素的或胰島素#^白質(zhì)的多糖^f生物。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含蛋白質(zhì)的多糖衍生物群的組合物，其中所述蛋白質(zhì)為胰島素或胰島素樣蛋白質(zhì)，所述多糖是陰離子型并包含2-125個糖單元，并且其中所述群基本上僅由所述蛋白質(zhì)的N末端衍生物組成。所述多糖通常為PSA。本發(fā)明還涉及包含所述新型化合物的組合物，以及用于制備該新型化合物的方法。文檔編號A61K47/48GK101511391SQ200780033741公開日2009年8月19日申請日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日發(fā)明者S·杰因,張榮升申請人:利普生技術(shù)有限公司