專利名稱：：具有針對i類和iib類組蛋白脫乙酰酶的組合活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑和蛋白酶體抑...的制作方法具有針對I類和IIB類組蛋白脫乙酰酶的組合活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑的組合本發(fā)明涉及具有針對I類和II類組蛋白脫乙酰酶的組合活性的組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑。其涉及包含它們的組合和組合物，以及它們作為藥物的用途，例如用作抑制諸如淋巴瘤和白血病的血液系統(tǒng)腫瘤的藥物。HDAC酶家族以它們首先被鑒定的底物，即核組蛋白進(jìn)行了命名。組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)形成八聚體復(fù)合體，DNA螺旋圍繞其纏繞以建立凝聚染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。組蛋白的乙?；癄顟B(tài)處于動態(tài)平衡，該平衡由乙?；慕M蛋白乙酰化酶(HAT)和負(fù)責(zé)組蛋白尾部脫乙?；饔玫腍DAC支配。HDAC酶的抑制作用促進(jìn)核小體組蛋白尾部的乙?；龠M(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更強的轉(zhuǎn)錄活性，其隨后導(dǎo)致參與例如細(xì)胞增殖、凋亡和分化的細(xì)胞過程的基因表達(dá)改變。近年來，鑒定了越來越多其它的非組蛋白HDAC底物。在白血病和淋巴瘤的特異形式例如急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)、非何杰金淋巴瘤和急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)中觀察到向下調(diào)控的和不斷的HDAC募集和致癌轉(zhuǎn)錄因子。隨著疾病從惡性損傷和分化良好的雄激素敏感的前列腺癌向表型去分化的雄激素不敏感的前列腺癌進(jìn)展，在前列腺癌細(xì)胞中觀察到在蛋白水平下HDAC1向上調(diào)控。另外，在大多數(shù)的人結(jié)腸癌外植體中發(fā)現(xiàn)增加的HDAC2表達(dá)，這是由抑癌基因結(jié)腸腺瘤息肉病(APC)的損失引起的。與癌癥中HDAC/HAT活性平4纖一致，已經(jīng)證實HDAC抑制劑在體外廣鐠人肺瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、終末分化和/或凋亡，抑制血管發(fā)生以及在棵小鼠的人異種移植模型中顯示體內(nèi)抗腫瘤活性。HDAC家族的酶通常分為3類即I類、II類和III類。目前在臨床發(fā)展中只有I類和II類主要被暗示介導(dǎo)HDAC抑制劑的作用。已經(jīng)證實包括HDAC家族成員1-3和8的I類HDACs對腫瘤細(xì)胞增殖是重要的。在多種利用I類HDACs沉默特異性啟動子的轉(zhuǎn)錄因子中，最熟知的實例是核激素受體類，在沒有它們的配體時其只連接HDAC3,并因此保持轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。復(fù)合體以配體依賴性方式解離，例如，通過類視黃醇、雌激素、雄激素等等，導(dǎo)致基因表達(dá)和分化。另一個重要的實例是周期蛋白依賴性激酶抑制因子p2iwan'一的HDACl-依賴性沉默。與親代HCT-116細(xì)胞相比，在p2iwa^^缺失細(xì)胞中顯示對HDAC抑制劑曲古抑菌素A(TSA)耐藥性6-倍的增長的研究證實了p2iw咸叫4秀導(dǎo)在HDAC抑制劑的抗增殖作用中的重要作用。另外，與真正的抑癌基因不同，p2ran'—在腫瘤細(xì)胞中無所不在，并被HDAC抑制劑誘導(dǎo)。組蛋白不是I類HDAC的唯一底物。例如，HDACl-3脫乙酰酶抑癌基因p53,p53因此被泛素化并降解。因為p53是有效的抑癌基因，包括細(xì)胞周期阻滯和凋亡，保持該蛋白的低水平對使腫瘤細(xì)胞存活和增殖失控是重要的。II類HDAC可以分為2個亞類包含HDAC4、5、7、9和HDAC9剪接變體MITR的IIa類。包含HDAC6和HDAC10的IIB類，它們都具有重復(fù)的HDAC域。IIa類HDACs不具有內(nèi)在的組蛋白脫乙酰酶活性，但由于他們與1類HDAC復(fù)合體和轉(zhuǎn)錄因子/DNA復(fù)合體連接，其能作為橋接因子調(diào)控基因表達(dá)。作為IIB類的一員，HDAC6由于凈皮鑒定為Hsp90脫乙酰酶而受到關(guān)注。現(xiàn)已證實HDAC抑制劑LAQ824和LBH589誘導(dǎo)Hsp90脫乙?；?，而trapoxin和丁酸鈉不會。Hsp90脫乙酰酶導(dǎo)致Hsp90相關(guān)的前存活和前增殖客戶蛋白降解。重要的實例包括Her-2、Bcr-Abl、糖皮質(zhì)激素受體、FLT-3突變體、c-Raf和Akt。除Hsp90外，HDAC60也介導(dǎo)微管蛋白脫乙?；?，其導(dǎo)致在應(yīng)激條件下微管去穩(wěn)定化。HDAC6的特異性小分子抑制劑tubacin引起a-微管蛋白超乙?；约皽p少細(xì)胞細(xì)胞運動性而不影響細(xì)胞周期進(jìn)展的事實進(jìn)一步證實了HDAC6的生物學(xué)作用。僅抑制HDAC6的a-微管蛋白脫乙酰酶域的Tubacin僅引起HSP90乙?；奈、增加。一致地，發(fā)現(xiàn)HDAC6對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的雌二醇-刺激細(xì)胞遷移是重要的。最后，HDAC6在錯折疊蛋白的細(xì)胞管理和從細(xì)胞質(zhì)清除這些蛋白中起到重要作用。由于HDAC在它們表達(dá)或活性水平下調(diào)控大量的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，HDAC抑制劑的抗增殖作用不能與單一的作用機制相關(guān)。HDAC抑制在抗癌治療中具有特別的前景，而對生長抑制、分化和凋亡中涉及的多種途徑的協(xié)調(diào)作用在治療不同病癥例如肺瘤形成和生長中可能是有利的。這些年來，已經(jīng)證實HDAC不但在癌癥發(fā)生中起到重要作用，在許多非惡性分化過程中也起到重要作用。這對于IIa類4、5、7和9是最明顯的。例如，已經(jīng)證實HDAC7在T細(xì)胞的胸腺成熟中發(fā)揮重要作用，而HDAC4涉及軟骨細(xì)胞肥大和軟骨內(nèi)骨化的調(diào)控。但是，更多的關(guān)注聚焦于IIa類HDAC在肌肉分化中的作用。由于作為肌細(xì)胞增強因子2(MEF2)的轉(zhuǎn)錄共抑制因子，HDAC4、5、7和9全都抑制肌細(xì)胞(肌肉細(xì)胞)的分化。HDAC抑制劑最常見的毒性是輕度至中度的骨髓抑制。另外，在許多臨床試驗中出現(xiàn)以惡心/嘔吐、疲勞和腹渴為特征的副作用。在2003年9月18日出版的EP1485365公開了HDAC抑制劑R306465。在2006年2月2日出版的WO2006/010750描述了具有下列馬庫式結(jié)構(gòu)的化合物，其N-氧化物形式、藥學(xué)上可接受的加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)體形式的制劑、制劑和藥學(xué)性質(zhì)，其中n、m、R1、R2、R3、X和Y具有如所述說明書中定義的含義。然而HDAC抑制劑治療的潛力超出了單一藥物應(yīng)用。HDAC抑制劑影響的分子途徑使其成為組合研究有前景的候選者。存在對具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的抑制劑的需要，考慮到療效和/或毒性其能夠提供臨床優(yōu)勢。其單獨或與其他治療藥物組合。蛋白酶體抑制也代表了近來癌癥治療中重要的發(fā)展策略。蛋白酶體是存在于所有細(xì)胞中的多酶復(fù)合體，其在涉及細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白降解中發(fā)揮作用。許多重要的調(diào)控蛋白，包括p53、細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶p21wafl'"p在泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控的細(xì)胞周期中暫時降解。這些蛋白有序的降解對細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞周期和有絲分裂是必需的。進(jìn)一步地，泛素-蛋白酶體途徑對轉(zhuǎn)錄調(diào)控是必需的。EP788360、EP1312609、EP1627880、US6066730和US6083903公開了用作蛋白酶體抑制劑的肽硼酸酯(peptideboronicester)和酸化合物?；衔颪-吡。秦羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(PS-341，現(xiàn)稱為硼替佐米(bortezomib)或Velcade(Millenium))在人腫瘤異種移植才莫型中具有抗腫瘤活性并已在患有復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤的病人的治療中獲得認(rèn)可，目前其正處于包括血液癌癥和固體瘤的其它適應(yīng)癥的臨床試驗中。硼替佐米通過引起錯折疊和其他損傷蛋白的聚集誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而激活凋亡的線粒體途徑，例如通過Bax-或活性氧簇依賴性機制。硼替佐米會引起泛素結(jié)合蛋白多價螯合形成稱為聚集體的結(jié)構(gòu)。聚集體似乎參與響應(yīng)蛋白酶體抑制激活的細(xì)胞保護(hù)應(yīng)答，可能是通過將泛素化蛋白穿梭至溶酶體降解。使用HDAC抑制劑SAHA(辛二酰苯胺異羥將酸)能夠中斷硼替佐米誘導(dǎo)的聚集體形成。SAHA在體外和體內(nèi)原位胰腺癌異種移植模型中也顯示對細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用(CancerResearch2006;66:(7)3773-3781)。另一HDAC抑制劑LAQ824與硼替佐米也顯示細(xì)^^死亡的協(xié)同水平(JournalofBiologicalChemistry2005;280:(29)26729-26734)。SAHA和LAQ824與硼替佐米的協(xié)同作用與它們的HDAC6抑制活性相關(guān)。存在增加蛋白酶體抑制劑對腫瘤生長抑制效果和降低這類藥物劑量以減少對病人毒副作用可能性的進(jìn)一步的需要?，F(xiàn)在還沒有乙?；潭群湍[瘤應(yīng)答相關(guān)性的強大數(shù)據(jù)?？焖?、簡便和容易再現(xiàn)的定量下文描述的HDAC抑制劑或包含所述HDAC抑制劑的組合引起的組蛋白和非組蛋白底物乙酰化程度的方法對它們的未來是重要的。本發(fā)明的一個目的是提供HDAC抑制劑和蛋白酶體與下文描迷的類型的HDAC抑制劑的治療組合，其具有強大和特征的乙?；饔谩類和IIB類HDACs的抑制作用、對腫瘤細(xì)胞生長有利的抑制作用和更少的不希望的副作用。因此根據(jù)本發(fā)明，我們提供蛋白酶體抑制劑和式(I)HDAC抑制劑、其藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式的組合，其中W選自氫或卣素。感興趣的化合物是那些W是氟的式(I)化合物。更感興趣的化合物是那些RM立于巧I哚4或7位的式(I)化合物。優(yōu)選的式(I)化合物是對應(yīng)于WO2006/010750中所示編號的化合物la、化合物30和化合物39。H0'NY^N0H一AC2HF302;化合物laC2HF302(1:1);化合物30FC2HF302(1:1);化合物39其他優(yōu)選的式(I)化合物是w是氫的化合物。最優(yōu)選的化合物是化合物la(JNJ26481585)或其藥學(xué)上可接受的加成鹽。由取代基畫向二環(huán)系統(tǒng)的線表示該鍵可以連接于任何合適的二環(huán)系統(tǒng)的環(huán)原子上。如上文定義和下文中使用的，卣素是氟、氯、溴和換的統(tǒng)稱。本文所用的術(shù)語"組蛋白脫乙酰酶，，和"HDAC，，指任意一個從組蛋白N端的賴氨酸殘基的e-氨基消除乙?；拿讣易宓某蓡T。除非在上下文另有指明，術(shù)語"組蛋白"是指來源于任意物種的任意組蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白或基因產(chǎn)物包括但不限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。組蛋白脫乙酰酶也可以得自原生動物或真菌來源。術(shù)語"組蛋白脫乙酰酶抑制劑"或者"組蛋白脫乙酰酶的抑制劑"用于表示能夠與組蛋白脫乙酰酶作用并抑制其活性，更具體地是其酶活性的化合物。抑制組蛋白脫乙酰酶的酶活性是指降低組蛋白脫乙酰酶從組蛋白或其他蛋白底物中消除乙?；哪芰?。優(yōu)選地，這種抑制是特異性的，即組蛋白脫乙酰酶抑制劑在一定濃度下降低組蛋白脫乙酰酶從組蛋白或其他蛋白底物中消除乙?；哪芰?，該濃度低于產(chǎn)生某些其它不相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)所需的抑制劑濃度。術(shù)語"具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑"或"I類和IIB類HDAC的抑制作用"是在低于其他種類的HDAC酶例如IIa類產(chǎn)生抑制作用所需的抑制劑濃度或低于某些其他不相關(guān)生HDAC家族成員(HDAC1-3或8)和IIB類HDAC家族成員(HDAC6或10)的酶活性的化合物。本文所用的術(shù)語"蛋白酶體"和"泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)"是指UPS中所有組分的任意一個結(jié)構(gòu)和功能，其包括但不限于a)泛素(Ub)和泛素樣蛋白(Ulp);f.e.SUMO、NEDD8、ISG15等，b)泛素單體，K48-連接的多泛素鏈，K63-連接的多泛素鏈等，c)El泛素-活化酶;f.e.ElUb、ElSUMO、E1NEDD8、El腦"等，d)El泛素-活化酶的亞基；f.e.APPBPl、UBA3、SAE1、SAE2等，e)E2泛素-結(jié)合酶，f.e.UBC9、UBC12、UBC8等，10f)E3泛素連接酶，f.e.謹(jǐn)G-fingerE3s、simple畫G-fingerE3s、cullin-basedRING-fingerE3s、RBXl'/RBX2-依賴性E3s、HECT-域E3s、U國boxE3s等，g)SCF(SKPl-Cullinl-F-box)E3泛素連接復(fù)合體，f.e.SCFSKP2、h)cullins,f.e.CULl、CUL2、CUL3、CUL4、CUL5等，i)F-box蛋白，f.e.SKP2、B-TRCP蛋白、FBW蛋白等，j)-艽他底物特異性接合休，f.e.BTB蛋白、SOCS^box蛋白、DDB1/2、VHL等，k)蛋白酶體，其組分等，1)金屬外肽酶(metalloisopeptidase)RPNll、在UPS目標(biāo)破壞前去泛素化它們的蛋白酶體lid亞基等，m)金屬外肽酶CSN5、負(fù)責(zé)從cullins移除NEDD8的COP9信號復(fù)合體亞基等，n)通過E1泛素-活化酶的活化步驟，其中Ub/Ulp首先在其C端甘氨酸殘基上腺苦酰化，然后變?yōu)閹щ姷牧蝓?，在其C端重復(fù)進(jìn)行，o)Ub/Ulp從El泛素-活化酶向E2泛素-結(jié)合酶的轉(zhuǎn)移，p)泛素-結(jié)合物識別，q)底物-泛素復(fù)合體轉(zhuǎn)移并連接于蛋白酶體，r)泛素消除，s)底物降解。術(shù)語"蛋白酶體抑制劑"和"泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的抑制劑"用于表示能夠與UPS中正常的、改變的、活性尤進(jìn)的或過表達(dá)的組分相互作用并抑制其活性，特別是其酶活性的化合物。抑制UPS酶活性是指降低UPS組分發(fā)揮其活性的能力。優(yōu)選地，這種抑制是特異性的，即，蛋白酶體抑制劑在一定濃度下降低UPS組分的活性，該濃度低于產(chǎn)生某些其他不相關(guān)的生物學(xué)作用所需的濃度。UPS組分活性的抑制劑包括但不限于a)通過阻斷Ub/Ulp進(jìn)入腺苦酸位點或者通過阻斷ATP進(jìn)入的Ub或Ulp腺苷酰化抑制劑；f.e.伊馬替尼(Gleevec;Novartis)等，b)E3或E3-復(fù)合體與E2相互作用的干擾劑，c)底物和E3或E3-復(fù)合體上的底物相互作用域之間相互作用的阻斷劑，例如阻斷p53(底物)和MDM2(RING-fingerE3)之間的相互作用，f.e.nutlins(通過連接于MDM2)、RITA(通過連接于p53的N端)等，d)E3連接酶復(fù)合體阻斷劑，e)泛素連接酶底物的人工募集物，f.e.protacs等，f)蛋白酶體及其組分的抑制劑，f.e.硼替佐米、carfilzomib、NPI-0052、Bsc2118等，g)泛素/Ulp::'條抑制劑」例如金屬外肽酶RPN11和CSN5的抑弟i劑，或者h(yuǎn))修飾多泛素鏈，f.e.ubistatins等。如上文所述的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽是指包含式(I)化合物能夠形成的有治療活性的無毒的酸加成鹽的形式。具有堿性的式(I)化合物可以通過使用合適的酸處理所述堿形式而轉(zhuǎn)化成它們藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。合適的酸包括，例如，無^/L酸例如氫卣酸，如氫氯酸或氫溴酸；硫酸；硝酸；璘酸等酸；或有機酸，例如，乙酸、三氟乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)，馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磧酸、苯磺酸、對甲基苯磺酸、環(huán)己烷氨基磺酸、水楊酸、對氨基水楊酸、樸酸等酸。迷的酸形式而轉(zhuǎn)化為它們藥學(xué)上可接受的堿加成鹽。合適的堿鹽的形式包括，例如，銨鹽，堿和堿土金屬鹽，例如，鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽等，與有機堿的鹽，例如節(jié)星(benzathine)、N誦曱基-D-葡糖胺、hydrabamine鹽，以及與氨基酸例如精氨酸、賴氨酸等的鹽。術(shù)語酸或堿加成鹽也包括式(I)化合物能夠形成的水合物和溶劑加成形式。這種形式的實例是例如水合物、醇化物等。本文所用的術(shù)語式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)體形式，定義了通過相同鍵順序鍵合的相同原子構(gòu)成但具有不能互換的不同三維結(jié)構(gòu)的式(I)化合物可能具有的所有可能的化合物。除非另有提及或指明，化合物的化學(xué)名稱包括所述化合物可能具有的所有可能的立體化學(xué)異構(gòu)體形式的混合物。所述混合物可以含有所述化合物的基本分子結(jié)構(gòu)的所有非對映體和/或?qū)τ丑w。所有以純形式或者相互混合物形式的式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)體形式包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。12某些式(I)化合物也可以以其互變異構(gòu)體形式存在。雖然這種形式在上式中沒有明確地指明，但也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)在下文中使用時，術(shù)語式(I)化合物也包括藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽和所有的立體異構(gòu)體形式。本發(fā)明使用的特別優(yōu)選的蛋白酶體抑制劑是硼替佐米。硼替佐米可以商標(biāo)名Velcade從Millennium購得，并且可以如EP788360、EP1312609、EP1627880、US6066730和US6083903描述的或其他類似過程制備。本發(fā)明也涉及用于例如抑制腫瘤細(xì)胞生長的醫(yī)學(xué)治療的本發(fā)明組合。物的用途。本發(fā)明也涉及抑制人類個體中腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包含給予個體有效量的本發(fā)明組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過給予有效量的本發(fā)明組合，抑制包括變異細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞的異常生長的方法。細(xì)胞的異常生長是指不依賴于正常調(diào)控機制的細(xì)胞生長(例如失去接觸抑制)。該方法包括通過引起癌細(xì)胞生長停滯、終末分化和/或凋亡直接抑制腫瘤生長，以及通過抑制腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤和存活或肺瘤的新生血管形成而間接抑制腫瘤生長。本發(fā)明還提供通過給予需要這種治療的個體，例如哺乳動物(尤其是人)有效量的本發(fā)明組合抑制腫瘤生長的方法。特別地，本發(fā)明提供通過給予有效量的本發(fā)明組合抑制腫瘤生長的方法。本發(fā)明特別適用于治療胰腺癌、淋巴系統(tǒng)的血液腫瘤，例如，急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、急性單核細(xì)胞白血病、淋巴瘤、慢性B細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、Burkitt's淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、非何杰金淋巴瘤、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸異常綜合征(MDS)、原發(fā)間質(zhì)瘤(例如纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)、畸胎瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、良性皮膚瘤(例如角化,束皮瘤)、腎癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。本發(fā)明還提供通過給予需要這種治療的個體，例如哺乳動物(尤其是人)有效量的式(I)組蛋白脫乙酰酶抑制劑，治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、急性單核細(xì)胞白血病、淋巴瘤、慢性B細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、Burkitt's淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的方法。本發(fā)明也提供通過給予需要這種治療的個體，例如哺乳動物(尤其是人)單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的有效量的式(I)組蛋白脫乙酰酶抑制劑，治療耐藥性腫瘤的方法，耐藥性肺瘤例如但不限于淋巴系統(tǒng)血液肺瘤，例如，耐藥性急性淋巴細(xì)胞白血病、耐藥性急性骨髓性白血病、耐藥性急性早幼粒細(xì)胞白血病、耐藥性急性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性急性單核細(xì)胞白血病、耐藥性淋巴瘤、耐藥性慢性B細(xì)胞白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、耐藥性Burkitt's淋巴瘤和耐藥性多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明特別適用于治療耐藥性多發(fā)性骨髓瘤，更特別適用于治療對蛋白酶體抑制劑耐藥的多發(fā)性骨髓瘤，甚至更特別適用于治療硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤。術(shù)語"耐藥性多發(fā)性骨髓瘤"包括但不限于對選自下列一種或多種藥物耐藥的多發(fā)性骨髓瘤沙利度胺、地塞米松、來那度胺(revlimid)、多柔比星、長春新^喊、環(huán)-疇酰胺、帕米膦酸(pamidronate)、美法侖、去纖苦、潑尼松、darinaparsin、belinostat、vorinostat、PD0332991、LBH589、LAQ824、MGCDO103、HuLuc63、AZD6244、Pazopanib、P276-00、plitidepsin、苯達(dá)莫司汀、坦螺旋霉素(tanespimycin)、恩扎妥林(enzastaurin)、哌立福辛、ABT-737或RADOOl。術(shù)語"耐藥性多發(fā)性骨髓瘤"也包括復(fù)發(fā)性或難治性多發(fā)性骨髓瘤。術(shù)語"耐藥性，，是指顯示內(nèi)在性耐藥性或者獲得性耐藥性的情況。"內(nèi)在性耐藥性"是指癌細(xì)胞相關(guān)路徑中關(guān)鍵基因的特異性表達(dá)性質(zhì)，包括但不限于凋亡、細(xì)胞進(jìn)展和DNA修復(fù)，與它們正常的相似物相比，其導(dǎo)致癌變細(xì)胞更快速生長的能力。"獲得性耐藥性"是指發(fā)生于腫瘤形成和進(jìn)展中的多因子現(xiàn)象，其能夠影響癌細(xì)胞對藥物的敏感性。獲得性耐藥性可能是由于一些機制，例如但不限于改變的藥物靶點、減少的藥物蓄積、改變的細(xì)胞內(nèi)藥物分布、降低的藥物-靶點相互作用、增加的脫毒應(yīng)答、細(xì)胞周期失調(diào)、增加的損傷DNA修復(fù)和降低的凋亡應(yīng)答。一些所述的^幾制可以同時發(fā)生和/或可以相互作用。它們的活化和/或失活可能是由于遺傳或非遺傳事件或者oncoviral蛋白的存在。獲得性耐藥性可以發(fā)生于個別藥物，但也可以更廣泛地發(fā)生于許多具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和不同作用機制的不同藥物。這種形式的耐藥性被稱為多藥耐藥性。本發(fā)明組合可以用于其它治療目的，例如a)通過在對腫瘤進(jìn)行放射治療癌癥之前、期間或之后給予本發(fā)明的化合物以促進(jìn)肺瘤對放療的敏感性；b)治療關(guān)節(jié)病和骨病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年型關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、多關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅c)抑制平滑肌細(xì)胞增殖，包括血管性增殖疾病、動脈粥樣硬化和再狹窄；d)治療炎性疾病和皮膚疾病，例如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、過敏性鼻炎、移植物抗宿主疾病、結(jié)膜炎、嗜喘、ARDS、白塞病、移植排斥、蕁麻滲(uticaria)、變應(yīng)性皮炎、斑禿、硬皮病、滲病、濕疹、皮肌炎、痤瘡、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼皰、川崎病、多發(fā)性硬化病、肺氣腫、嚢性纖維化和慢性支氣管炎；e)治療子宮內(nèi)膜異位、子宮平滑肌瘤、功能障礙性子宮出血和子宮內(nèi)膜增生；f)治療眼睛血管化，包括影響視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管的血管病變；g)治療心臟功能障礙；h)抑制免疫抑制疾病，例如治療HIV感染；i)治療腎功能障礙；j)抑制內(nèi)分泌疾??；k)抑制糖異生功能障礙；l)治療神經(jīng)病，例如帕金森病或?qū)е抡J(rèn)知障礙的神經(jīng)病，例如，阿爾海默茨病或多聚谷胺酰胺相關(guān)的神經(jīng)性疾??；m)治療精神病，例如精神分裂癥、雙極性障礙、抑郁癥、焦慮癥和精神??；n)抑制神經(jīng)肌肉性疾病，例如，肌萎縮性側(cè)索硬化；o)治療脊髓性肌萎縮；p)治療易于通過基因表達(dá)治療的其它疾?。籷)增強基因治療；r)抑制脂肪形成；S)治療寄生蟲病，例如癡疾。因此，本發(fā)明公開了用作藥物的上文描述的組合以及具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的式(I)的HDAC抑制劑，單獨或與蛋白酶體抑制劑組合，用于制備治療一種或多種上述病癥的藥物的用途。因此，本發(fā)明公開了具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的式(I)的HDAC抑制劑，單獨或組合，用于制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、急性f核細(xì)胞白血^.淋巴瘤.慢忖JR細(xì)紈白血病、'tl性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、Burkitt's淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的藥物的用途。本發(fā)明還公開了具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的式(I)的HDAC抑制劑，單獨或組合，用于制備治療耐藥性腫瘤的藥物的用途，例如但不限于淋巴系統(tǒng)的血液肺瘤，例如，耐藥性急性淋巴細(xì)胞白血病、耐藥性急性骨髓性白血病、耐藥性急性早幼粒細(xì)胞白血病、耐藥性急性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性急性單核細(xì)胞白血病、耐藥性淋巴瘤、耐藥性慢性B細(xì)胞白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、耐藥性Burkitt's淋巴瘤和耐藥性多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明進(jìn)一步公開了具有針對I類和IIB類HDAC的組合活性的式(I)的HDAC抑制劑，單獨或組合，用于制備治療耐藥性多發(fā)性骨髓瘤，更特別地對蛋白酶體抑制劑耐藥性多發(fā)性骨髓瘤，甚至更特別地硼替佐米耐藥性多發(fā)性骨髓瘤的藥物的用途。蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑可以同時(例如，以分開的或單一的組合物)或以任一順序連續(xù)給藥。在后一情況中，兩種化合物在一段時間內(nèi)以足以保證獲得有利或協(xié)同作用的量和方式給藥。應(yīng)當(dāng)理解優(yōu)選的給藥方法和順序和組合每種成份的各自的劑量和方案取決于給藥的具體的蛋白酶體抑制劑和HDAC抑制劑、組合給藥的途徑、治療的具體腫瘤和治療的具體主體。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的方法并根據(jù)本文所述的信息可以容易地確定最適宜的給藥方法和順序和劑量和方案。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含作為笫一活性成分的式(I)的HDAC抑制劑和作為第二活性成分的蛋白酶體抑制劑的產(chǎn)品，作為組合制劑同時、分開或連續(xù)用于治療患有癌癥的病人。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地通過下文提供的試驗結(jié)果確定有效量。通常預(yù)期式(I)的化合物和蛋白酶體抑制劑的治療有效量是0.005mg/kg-100mg/kg體重，特別是0.005mg/kg-10mg/kg體重。在一天中將所需的劑量分為2、3、4或更多亞劑量以適當(dāng)?shù)拈g隔給藥可能是合適的。所述的亞劑量可以配制成單位劑型，例如，每單位劑量劑型包含0.5-500mg、特別是10mg-500mg的活性成分。鑒于它們有用的藥理學(xué)性質(zhì)，本發(fā)明組合的組分，即蛋白酶體抑制劑和HDAC抑制劑可以配制成用于給藥目的的各種藥物劑型。組分可以分開配制于單獨的藥物組合物或配制于包含兩種成分的單一藥物組合物中?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法并特別地根據(jù)本文提及并通過參考《1入的已出版的專利說明書描述的方法制備HDAC抑制劑并配制成藥物組合物。因此本發(fā)明也涉及包含蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體的藥物組合物。為了制備本發(fā)明使用的藥物組合物，有效量的堿或酸加成鹽形式的特定化合物作為活性成分與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合形成緊密的混合物，該載體可以采取多種不同的形式，取決于給藥所需的制劑形式。這些藥物組合物理想地是優(yōu)選適合于口服、直腸給藥、經(jīng)皮給藥或胃腸外注射的單位劑型。例如，在制備口服劑型的組合物時，可以使用任意常用的藥物介質(zhì)，例如，在例如混懸液、糖漿劑、酏劑和溶液劑的口服液體制劑情況中的水、乙二醇、油、醇等；或在粉劑、丸劑、膠嚢劑和片劑的情況中例如淀粉、糖、高嶺土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等固體載體。由于易于給藥，片劑和膠嚢劑代表了最有利的口服劑量單位劑型，在這種情況下顯然會使用固體藥學(xué)載體。對于非腸道組合物，載體通常至少包括大部分的無菌水，雖然也可以包括例如輔助溶解的其它組分。例如，可以制備注射溶液，其中載體包括鹽水溶液、葡萄糖溶液或鹽水和葡萄糖溶液的混合物。也可以制備可注射混懸液，在這種情況下，可以使用合適的液體載體、混懸劑等。在適于經(jīng)皮給藥的組合物中，載體任選包含滲透促進(jìn)劑和/或合適的潤濕劑，任選與以較小比例的任何性質(zhì)的合適添加劑組合，所述添加劑不會對皮膚引起顯著的有害作用。所述添加劑可以促進(jìn)向皮膚給藥和/或有助于制備所需的組合物。這些組合物可以以多種方式給藥，例如作為透皮貼劑、點劑(spot-on)或軟膏。將上述藥物組合物配制成劑量單位劑型對方便給藥和劑量一致性是特別有利的。本說明書和權(quán)利要求書中使用的劑量單位劑型是指適合作為單位劑量的物理分散的單位，每個單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性成分以及所需的藥物載體。這種劑量單位劑型的實例是片劑(包括刻痕片或包衣片)、膠嚢劑、丸劑、粉末袋、糯米紙嚢劑(wafers)、可注射溶液或混懸液、茶匙量制劑(teaspoonfuls)、湯匙量制劑(tablespoonfuls)等，及其分開的復(fù)合體(segregatedmultiples)。在整個療程中將組合中的每種成分所需的劑量分為2、3、4或更多亞劑量以適當(dāng)?shù)拈g隔給藥可能是合適的。亞劑量可以配制成單位劑型，例如，在每種情況中每單位劑量劑型獨立地包含0.01-500mg，例如0.1-200mg以及特別地1-1OOmg的每種活性成分。術(shù)語"組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用"是指HDAC底物乙?；癄顟B(tài)的誘導(dǎo)作用，HDAC底物例如但不限于組蛋白，例如組蛋白3、組蛋白4等；微管蛋白，例如a微管蛋白等；熱休克蛋白，例如Hsp90等。術(shù)語"所述乙酰化功能性調(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用，，是指次級效應(yīng)，例如但不限于Hsp70的誘導(dǎo)作用，p21的誘導(dǎo)作用等。本發(fā)明也涉及表征單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的式(I)的HDAC抑制劑的方法，包括測定樣品中組蛋白或其他蛋白乙酰化的誘導(dǎo)作用的量，或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量。更特別地，本發(fā)明涉及表征單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的式(I)的HDAC抑制劑的方法，包括測定樣品中下述作用的量a)組蛋白3乙酰化的誘導(dǎo)作用、組蛋白4乙?；恼T導(dǎo)作用或p21的誘導(dǎo)作用和b)a-微管蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用、Hsp90乙?；恼T導(dǎo)作用或Hsp70的誘導(dǎo)作用。最特別地本發(fā)明涉及上述方法，其中在a)情況下獲得誘導(dǎo)作用需要的濃度與在b)情況下獲得誘導(dǎo)作用的濃度是相同的范圍。樣品中組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量的測定可能包括鑒別對治療應(yīng)答的病人，并且因此可能對治療人癌癥具有有利的作用。樣品中組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙酰化功能性調(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量的測定可能包括監(jiān)測治療在病人中的有效性，并且因此可能對治療人癌癥具有有利的作用。樣品中組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量的測定可能包括預(yù)測對治療的治療性應(yīng)答，并且因此可能對治療人癌癥具有有利的作用。因此本發(fā)明還涉及單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的具有針對I類和II類HDAC組合活性的式(I)的HDAC抑制劑的用途，其中組蛋白或其他蛋白的超乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙酰化功能性調(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用對治療人癌癥具有有利的作用。樣品也可以來源于疾病侵襲的組織和/或式(I)的HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑的組合治療的個體。細(xì)胞可以是已經(jīng)接觸過所述HDAC抑制劑或所述組合的培養(yǎng)細(xì)胞。所述抑制劑或所述組合可以添加至細(xì)胞的培養(yǎng)基中。細(xì)胞也可以來源于組織和/或所述抑制劑或所述組合治療的個體。優(yōu)選地，表征方法只包括體外實施的步驟。因此，根據(jù)該實施方案本發(fā)明不包括從人或動物體獲取組織材料的步驟。通常處理細(xì)胞以使其處于適合所用方法的條件下，以測定組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用。處理可以包括勻漿化、提取、固定、洗滌和/或透化。處理的方式很大程度取決于用于測定組蛋白或其他蛋白乙酰化的誘導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的方法。樣品可以來源于病人的活檢組織?？梢赃M(jìn)一步處理活檢組織以得到樣品，該樣品處于適合用于測定組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的條件。蛋白乙?；牧炕蛘T導(dǎo)蛋白的量可以使用抗體測定。本文所用的術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白或其具有相同結(jié)合特異性的衍生物。本發(fā)明使用的抗體可以是單克隆抗體或來源于或包含于多克隆抗血清中的抗體。術(shù)語"抗體"進(jìn)一步是指衍生物，例如Fab、F(ab，)2、Fv或scFv片段?？贵w或其衍生物可以是天然來源或(半)合成生產(chǎn)的?？梢?使用本領(lǐng)域普遍已知的Western印跡法?？梢詫⒓?xì)月包材料或組織勻漿化以及使用變性劑和/或還原劑進(jìn)行處理從而獲得樣品。樣品可以19加樣于聚丙烯酰胺凝膠上以分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至膜或直接點樣于固定相上。然后抗體與樣品接觸。在一個或多個洗滌步驟后使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測結(jié)合抗體。在組織材料例如實體瘤切片固定和透化后可以使用免疫組織化學(xué)技術(shù)，然后將抗體與樣品進(jìn)行培養(yǎng)，在一個或多個洗滌步驟后檢測結(jié)合抗體?？梢酝ㄟ^ELISA測定組蛋白或其他蛋白乙酰化的誘導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量?？梢栽O(shè)想多種形式的ELISA。在一種形式中，將抗體固定化于例如微孔滴定板的固定相上，然后封閉非特異性結(jié)合位點并與樣品進(jìn)行培養(yǎng)。在另一種形式中，首先將樣品與固定相接觸以固定包含于樣品中的乙?；暮?或誘導(dǎo)的蛋白。在封閉和任選的洗滌之后，將抗體與固定的樣品接觸?？梢酝ㄟ^流式細(xì)胞術(shù)測定組蛋白或其他蛋白乙酰化的誘導(dǎo)作用或所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量。固定并透化細(xì)胞，例如細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞或血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞，以使抗體接觸乙酰化的和/或誘導(dǎo)的蛋白。在任選的洗滌和封閉步驟后將抗體接觸細(xì)胞。然后根據(jù)本領(lǐng)域已知的操作進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以測定具有抗體結(jié)合于乙?；?或誘導(dǎo)蛋白的細(xì)月包。為了測定HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑的組合是否具有活性，人們可以測定參照樣品中蛋白乙?；虻鞍渍T導(dǎo)作用的量，其中參照樣品來源于沒有使用所述HDAC抑制劑或所述組合處理的細(xì)胞?？梢云叫羞M(jìn)行樣品和參照樣品中蛋白乙?；牧亢?或誘導(dǎo)蛋白的量的測定。就細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞而言，提供兩種細(xì)胞組合物，其中一種使用所述HDAC抑制劑或所述組合處理，而另一種不進(jìn)行處理。隨后進(jìn)一步處理兩種組合物并測定各自蛋白乙酰化的量和/或誘導(dǎo)蛋白的量。可選擇地，為了測定HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑的組合是否具有活性，人們可以測定細(xì)胞增殖的抑制作用。就病人而言，樣品來源于使用式(I)的HDAC抑制劑或蛋白酶體抑制劑和式(I)的HDAC抑制劑的組合治療的病人。參照樣品來源于另一個患有相同疾病但沒有使用所述HDAC抑制劑或所述組合治療的病人或者來源于健康個體。參照樣品來源的組織對應(yīng)于樣品來源的組織。例如，如果樣品來源于乳腺癌病人的肺瘤組織，參照樣品也來源于乳腺癌病人的腫瘤組織或者健康個體的乳腺組織。也可以設(shè)想樣品和參照樣品來源于相同的個體。在這種情況下，參照樣品來源的組織是在使用所述HDAC抑制劑或所述組合治療個體之前或之后從個體獲取的。優(yōu)選地，在治療之前獲取組織以排除在治療中斷后抑制劑治療可能的后效應(yīng)。實驗部分A.藥理學(xué)實施例對于在A2780腫瘤細(xì)胞中使用測定細(xì)胞毒性或存活的比色測定法測定式(I)4匕合物的細(xì)月包活性(MosmannTim,JournaloflmmunologicalMethods65:55-63,1983),參考WO2006/010750的實驗部分。HDAC抑制劑的抗增殖作用與I類HDACs的抑制作用相關(guān)，I類HDACs包括HDAC家族成員1-3和8。與R306465、SAHA、LBH-589和LAQ-824相比，JNJ26481585對由A2780細(xì)月包免疫沉淀的HDAC1的活性和其效力可見實施例A.1.。與R306465、SAHA、LBH-589和LAQ-824相比，JNJ26481585對HDAC8人重組酶的活性和其效力可見實施例A.2.。進(jìn)一步研究R306465是否調(diào)控HDAC1底物組蛋白3(H3)和組蛋白4(H4)的乙?；癄顟B(tài)。還研究了A2780卵巢癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21wafl'—的誘導(dǎo)作用。由于組蛋白乙酰化，p21wafl'—被抑制，并且在響應(yīng)HDAC抑制劑的細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)作用中起到重要作用(參見實施例A.3.)。為了評價HDAC6的抑制作用，以及化合物對HDAC1對HDAC6的相對效力，監(jiān)測HDAC6的底物微管蛋白的乙?；虷sp70的誘導(dǎo)作用，Hsp70的誘導(dǎo)作用是Hsp90乙?；慕Y(jié)果(參見實施例A.4.)。實施例A:式(I)化合物的I類特異性和乙酰化作用實施例A.l:由A2780細(xì)胞免疫沉淀的HDAC1酶的抑制作用對于HDAC1活性測定，HDAC1由A2780細(xì)胞溶解產(chǎn)物免疫沉淀，并使用指明的HDAC抑制劑的濃度曲線，以及H4肽的卩H]乙?；?標(biāo)記的片斷(50.000cpm)[生物素-(6-氨基己酸)Gly-Ala-(乙?；鵞3H]Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)培養(yǎng)。通過測定游離乙?；尼尫旁u價HDAC活性。三組獨立試驗的結(jié)果以平均ICso值士SD表示。HDAC1抑制作用IC5()nMJNJ264815850.16±0.02R3064653.31±0.78SAHA73±26LAQ-8240.29土0.05LBH-5890.23±0.06實施例A.2:HDAC8人重組酶的抑制作用對于人重組HDAC8的抑制作用，使用HDAC8色度法/熒光活性測定/藥物發(fā)現(xiàn)試劑盒(Biomol;Cat.nr.AK-508)。三組獨立試-瞼的結(jié)果以平均1(350值(nM)±SD表示。測定進(jìn)行兩份，使用GmphpadPdsm(Graphpad軟件)計算IC50的標(biāo)準(zhǔn)誤。HDAC8抑制作用IC50nMJNJ2648158534±41R30646523±17SAHA370±314LAQ-82437士23LBH-589283土29實施例A.3:細(xì)胞HDAC1底物的乙酰化和p2lwafLcipl的誘導(dǎo)作用采用0、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM的化合物培養(yǎng)人A2780卵巢癌細(xì)胞24小時。制備總的細(xì)胞溶解產(chǎn)物并通過SDS-PAGE分析。使用兔多克隆抗體和小鼠單克隆抗體檢測乙?；腍3和H4組蛋白水平、總的H3蛋白水平和p2r^'—蛋白的水平，隨后進(jìn)行增強化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測。采用來自UpstateBiotechnology(Cat.nr.06-299和06-866)的抗體檢測乙酰化的H3和H4的水平，使用來自Abeam(Cat.Nr.ab1791)的抗體檢測總的H3蛋白水平，使用來自Transduction實驗室(Cat.nr.C24420)22的抗體檢測p21wafl'—蛋白的水平。合適的抗體稀釋劑在室溫下培養(yǎng)1-2小時或在4。C下過夜培養(yǎng)。為了控制相等的裝量，剝離印跡，用小鼠單克隆抗-actinlgM(Ab-I,腫瘤基因研究產(chǎn)品)再探測。為了控制核蛋白提取的效率，剝離印跡，用抗-laminBl(Zymed;Cat.nr.33.2000)再探測。然后根據(jù)制造商的說明通過化學(xué)發(fā)光(PierceChemicalCo)或熒光(Odyssey)使蛋白-抗體復(fù)合體可視化。試驗進(jìn)行三次。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例A.4.微管蛋白的乙?；虷sp70的誘導(dǎo)作用采用0、1、3、10、30、100、300、1000和3000nM的化合物培養(yǎng)人A2780卵巢癌細(xì)胞24小時。制備總的細(xì)胞溶解產(chǎn)物并采用SDS-PAGE分析。使用Sigma的抗體克隆DM1A(Catnr.T9026)和6-111B(Cat.nr.T6793)檢測總的和乙酰化的微管蛋白的水平。采用Stressgen的抗體(Cat.nr.SPA-810)檢測Hsp70蛋白，然后進(jìn)行ECL檢測。合適的抗體稀釋劑在室溫下培養(yǎng)1-2小時或在4。C過夜培養(yǎng)。為了控制相等的裝量，剝離印跡，用小鼠單克隆抗-actinIgM(Ab-I,腫瘤基因研究產(chǎn)品)再探測。為了控制核蛋白提取的效率，剝離印跡，用抗-laminBl(Zymed;Cat.nr.33.2000)再探測。然后根據(jù)制造商的說明通過化學(xué)發(fā)光(PierceChemicalCo)或焚光(Odyssey)使蛋白-抗體復(fù)合體可視化。試驗進(jìn)行三次。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例B:人血液肺瘤細(xì)胞增殖的抑制作用人血液腫瘤細(xì)胞系中JNJ26481585的抗增殖活性的評價外包于Oncodesign(第戎，法國)。腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞混懸液形式在相應(yīng)的適宜的培養(yǎng)基中在37。C下于增濕的5。/。C02培養(yǎng)箱中生長。無支原體的腫瘤細(xì)胞接種于96孔平底微量滴定板并在含有10%FCS的培養(yǎng)基中37。C下培養(yǎng)24小時。然后肺瘤細(xì)胞暴露于載體(對照)或增加濃度的JNJ26481585(5種不同濃度*)、硼替佐米(5種不同濃度*)或兩種藥物不同比例的組合。然后再培養(yǎng)細(xì)胞72小時。使用標(biāo)準(zhǔn)的MTS測定通過測定490nm的吸光度顯示化合物的細(xì)胞毒性。通過多重藥物作用分析計算化合物的相互作用(協(xié)同、相加或拮抗)，并根據(jù)Chou&Talalay描述的方法論通過中位數(shù)方程原則進(jìn)行[CHOU等。(1984)Adv.EnzymeRegul。22:27-55;CHOU等。(1991)EncyclopaediaofhumanBiology。AcademicPress。2:371-379;CHOU等。(1991)Synergismandantagonisminchemotherapy。AcademicPress:61-102;CHOU等。(1994)J.Natl.CancerInst。86:1517-1524]*基于每種藥物用作單一藥物的抗增殖活性的預(yù)測定，選擇在每種選定的細(xì)胞系中抑制作用不超過50%的濃度。液腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用表F.l:從3個獨立的可信試驗測得結(jié)果以平均IC化值(即達(dá)到細(xì)胞增殖40%抑制作用所需的濃度，以nM表示)土SD表示。細(xì)胞系類型平均值SDCCRF-CEM急性淋巴細(xì)胞白血病11.937.18JurkatcloneE6-l急性淋巴細(xì)胞白血病9.221.78KG-1急性淋巴細(xì)胞白血病13.3910.48MOLT-4急性淋巴細(xì)胞白血病42.9656.25SUP-B15急性淋巴細(xì)胞白血病1.13HL-60急性淋巴細(xì)胞白血病24.2810.72OCI陽AML2急性髓細(xì)胞樣白血病19.5613.93THP-1急性單核細(xì)胞白血病50.6522.84EHEB慢性B細(xì)胞白血病165.81128.15BV-173十曼性B細(xì)胞白血病4.544.28K-562慢性髓細(xì)胞樣白血病15.918.29KCL-22十曼性髓細(xì)胞樣白血病7.715.14LAMA-84慢性髓細(xì)胞樣白血病急變30.4019.93U-937淋巴瘤23.6710.14DaudiBurkitt，s'淋巴瘤9.081.27NamalwaBurkitt，s'淋巴瘤4.654.32RajiBurkitt，s淋巴瘤26.3416.11R^mosBurkitt，s淋巴瘤4.662.82ARH-77骨髓瘤40.4224.32RPMI8226骨髓瘤6.415.4425實施例B.2.:硼替佐米引起的人血液肺瘤細(xì)胞增殖的抑制作用表F.2:從3個獨立的可信試驗測得結(jié)果以平均IC4o值(即達(dá)到細(xì)胞增殖40°/。抑制作用所需的濃度，以nM表示)±SD表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實施例B.3:JNJ26481585和硼替佐米的組合引起的人血液腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用表3:結(jié)果以每個獨立試驗(3個獨立可信試驗)中位數(shù)CI值的平均組合指數(shù)(CI±SD)表示，并由每個獨立組合比例計算。CI低于0.9表示'協(xié)同'(灰色)，CI在0.91-1.09間表示'相加，(白色)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>權(quán)利要求1.蛋白酶體抑制劑和式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑及其藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式的組合，其中R4選自氫或鹵素。1.蛋白酶體抑制劑和式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑及其藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式的組合，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R"選自氫或鹵素。2.權(quán)利要求1所述的組合，其中式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑選自化合物la、化合物30和化合物39<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>3.權(quán)利要求1或2所述的組合，其中式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑是化合物la(JNJ26481585)4.權(quán)利要求l-3任一項所述的組合，其中所述蛋白酶體抑制劑是硼替佐米。5.權(quán)利要求l-4任一項所述的組合，其為包含蛋白酶體抑制劑和式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑以及一種或多種藥物載體的藥物組合物的形式。6.權(quán)利要求5所述的組合，其是用于同時、分別或相繼使用。7.權(quán)利要求l-5任一項所述的組合，其是用于醫(yī)學(xué)治療。8.權(quán)利要求1-5任一項所述的組合在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。9.組蛋白脫乙酰酶抑制劑單獨或與蛋白酶體抑制劑的組合在制備用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞樣白血病、急性單核細(xì)胞白血病、淋巴瘤、慢性B細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、Burkitt's淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的用途，其中所述的組蛋白脫乙酰酶抑制劑是式(I)化合物及其藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中W選自氫或鹵素。10.權(quán)利要求9所述的用途，其中所述的藥物是用于治療耐藥性急性淋巴細(xì)胞白血病、耐藥性急性骨髓性白血病、耐藥性急性早幼粒細(xì)胞白血病、耐藥性急性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性急性單核細(xì)胞白血病、耐藥性淋巴瘤、耐藥性慢性B細(xì)胞白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病、耐藥性慢性髓細(xì)胞樣白血病急變、耐藥性Burkitt's淋巴瘤和耐藥性多發(fā)性骨髓瘤。11.權(quán)利要求9和10所述的用途，其中所述的藥物是用于治療硼替佐米耐藥性多發(fā)性骨髓瘤。12.權(quán)利要求8-11任一項所述的用途，其中組蛋白或其他蛋白超乙?；恼T導(dǎo)作用或通過所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用對人類癌癥的治療具有有利的作用。13.—種表征單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的權(quán)利要求1-3任一項所定義的式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑的方法，所述方法包括測定樣品中組蛋白或其他蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用的量，或通過所述乙?；δ苄哉{(diào)控的蛋白的誘導(dǎo)作用的量。14.一種表征單獨或與蛋白酶體抑制劑組合的權(quán)利要求1-3任一項所定義的式(I)的組蛋白脫乙酰酶抑制劑的方法，所述方法包括測定樣品中下述作用的量a)組蛋白3乙酰化的誘導(dǎo)作用、組蛋白4乙酰化的誘導(dǎo)作用或p21的誘導(dǎo)作用，和b)a-微管蛋白乙?；恼T導(dǎo)作用、Hsp90乙?；恼T導(dǎo)作用或Hsp70的誘導(dǎo)作用。全文摘要本發(fā)明涉及抑制腫瘤細(xì)胞生長用于治療癌癥的蛋白酶體抑制劑與具有針對I類和IIB類組蛋白脫乙酰酶的組合活性的組蛋白脫乙酰酶抑制劑的組合。文檔編號A61K31/506GK101516374SQ200780034143公開日2009年8月26日申請日期2007年9月11日優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日發(fā)明者J·阿茨,M·J·帕格,M·M·F·賈尼科特,P·W·J·赫爾曼斯申請人:詹森藥業(yè)有限公司