專利名稱：抑制或治療與細(xì)胞內(nèi)形成蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體相關(guān)的疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體，和溶解預(yù) 先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體，和涉及用于抑制或治療與細(xì) 胞內(nèi)形成蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體相關(guān)的疾病的方法和藥物組合物。
相關(guān)技術(shù)描述斑形成疾病特征在于在腦中存在淀粉狀蛋白斑沉積物以及神 經(jīng)變性。淀粉狀蛋白沉積物由聚集成不溶團(tuán)塊的肽形成。在不同疾病中肽 的性質(zhì)是不同的，但是在大部分情形中，所述聚集體具有P-褶皺的折疊結(jié) 構(gòu)，并且用剛果紅染料染色。除了阿爾茨海默病(AD)，其包括早期發(fā)作性 阿爾茨海默病、晚期發(fā)作阿爾茨海默病和癥狀發(fā)生前阿爾茨海默病，其它 以淀粉狀蛋白沉積物為特征的疾病是，例如，SAA淀粉樣變，遺傳學(xué)冰島 綜合征，多發(fā)性骨髓瘤，和朊病毒疾病。在動(dòng)物中的最常見(jiàn)的朊病毒疾病 是綿羊和山羊的癢病和牛的牛海綿狀腦病(BSE) (Wilesmith禾B Wells， 1991)。在人類中己經(jīng)鑒定了4種朊病毒疾病(i)庫(kù)魯病,(ii)克羅伊茨費(fèi) 爾特-雅各布病(CJD)， (iii)格-施-沙病(GSS),和(iv)致命的家族性失眠癥 (FFI) (Gajdusek, 1977;和Tritschler等.1992)。朊病毒疾病涉及正常細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPC)向?qū)?yīng)的癢病同 種型(PrPSc)的轉(zhuǎn)化。分光鏡測(cè)量表明，PrPC向癢病同種型(PrPSc)的轉(zhuǎn)化 涉及主要的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，暗示朊病毒疾病，同其它淀粉狀蛋白生成疾病一樣， 是蛋白構(gòu)象紊亂癥。從PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)變伴隨著ot-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的減少(從42%到30%)和卩-折疊含量的顯著增加(從3%到43%) (Caughey等, 1991;和Pan等，1993)。這種重排與異常的生理化學(xué)性質(zhì)相關(guān)，包括在非 變性去污劑中的不溶性和對(duì)蛋白質(zhì)水解的部分抗性。先前的研究已經(jīng)表明 與人PrP的殘基106-126 (PrP106-126)同源的合成肽表現(xiàn)出PrPSc的一些 致病和生理化學(xué)特征(Selvaggini等，1993; Tagliavini等，1993;和Forloni等, 1993)。該肽表現(xiàn)出顯著的構(gòu)象多態(tài)性，在不同環(huán)境中獲得不同的二級(jí)結(jié)構(gòu) (DeGioia等，1994)。在緩沖溶液中它傾向于采取(3-折疊構(gòu)象，并且聚集成 淀粉狀蛋白纖維，該淀粉狀蛋白纖維部分抵抗蛋白酶消化。最近，抗體3F4 及其肽表位(Prpl04-113)的復(fù)合物的X-射線結(jié)晶研究提供了這一柔性區(qū)域 的結(jié)構(gòu)圖，該柔性區(qū)域被認(rèn)為是對(duì)于發(fā)展朊病毒疾病所必需的構(gòu)象重排的 成分(Kanyo等，1999)。參與折疊-解折疊和/或增溶-聚集過(guò)程的序列的種類 鑒定可以為斑形成疾病的治療打開(kāi)新的方向，其是基于防止聚集和/或誘導(dǎo) 解聚集(Silen和Agard， 1989; Frenkel等，1998; Horiuchi禾卩Caughey， 1999)。
阿爾茨海默病(AD)是導(dǎo)致老年癡呆的進(jìn)展性疾病。廣義來(lái)說(shuō)， 該病分成兩類晚期發(fā)作性，其在老年(典型地超過(guò)65歲)時(shí)發(fā)生，和 早發(fā)作性，其在老年期之前例如在35-60歲就充分發(fā)展。在這兩種類型的 疾病中，病理是相似的，但是在從更早的年齡就開(kāi)始的病例中，異常傾向 于更嚴(yán)重和廣泛。該疾病特征在于在腦中的兩種類型的損傷，老年斑和神 經(jīng)原纖維纏結(jié)。老年斑是跨越多達(dá)150 mm的無(wú)組織嗜中性粒細(xì)胞的區(qū)域， 在中央有細(xì)胞外淀粉狀蛋白沉積物，通過(guò)腦組織切片的顯微鏡分析可以看 到。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是tau蛋白的細(xì)胞內(nèi)沉積，其由成對(duì)的彼此纏繞的兩 個(gè)細(xì)絲組成。老年斑的主要組成要素是叫作淀粉狀蛋白P(Af3)或P-淀粉狀肽 ((3AP或(3A)的肽。淀粉狀蛋白(3肽是叫作淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)的前 體蛋白的39-43個(gè)氨基酸的內(nèi)部片段。在APP蛋白內(nèi)部的一些突變與阿爾 茨海默病的存在相關(guān)(Goate等，(1991)，纈氨酸717到異亮氨酸；Chartier Harlan等，(1991),纈氨酸717到甘氨酸；Murrell等，(1991),纈氨酸717到 到苯丙氨酸；Mullan等，(1992),雙突變，賴氨酸595-甲硫氨酸596變成天 冬酰胺595-亮氨酸596)。認(rèn)為這樣的突變通過(guò)增加或改變APP向(3-淀粉狀蛋白的加工、特別是APP向增加量的長(zhǎng)形式的P-淀粉狀蛋白(即，A(31-42和A卩l(xiāng)-43) 的加工而引起阿爾茨海默病。認(rèn)為在其它基因諸如早老蛋白基因，即PS1 和PS2中的突變間接影響APP的加工，產(chǎn)生增加量的長(zhǎng)形式的(3-淀粉狀 蛋白(參見(jiàn)Hardy, TINS 20, 154, 1997)。這些觀察表明P-淀粉狀蛋白，并且 特別是其長(zhǎng)形式，是阿爾茨海默病中的病因要素。其它具有自我聚集跡象的肽或蛋白也是己知的，諸如，但不限 于，支鏈淀粉(Yoimg等，1994);鈴蟾肽，蛙皮縮膽囊肽，縮膽囊素八肽，章 魚(yú)唾腺精(eledoisin),胃泌素相關(guān)的五肽，胃泌素四肽，促生長(zhǎng)素抑制素 (還原的)，物質(zhì)P;和肽，促性腺素釋放素，促生長(zhǎng)素抑制素N-Tyr (Banks 和Kastin, 1992)。下表1提供與神經(jīng)變性相關(guān)的一些構(gòu)象疾病的列表。
表l
與神經(jīng)變性相關(guān)的構(gòu)象疾病 蛋白質(zhì)
病癥 阿爾茨海默病 帕金森病 朊病毒疾病
肌萎縮性側(cè)索硬化病
脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA1)
脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA3)
脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA6)
脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA7)
亨廷頓病
Entatombral-pallidoluysian萎縮
脊髓和延髓肌肉萎縮
遺傳性大腦淀粉狀蛋白血管病
家族性淀粉樣變
額顳葉癡呆
英國(guó)/丹麥癡呆
家族性腦病
淀粉狀蛋白-P
(x-突觸核蛋白
PrP
SODI
共濟(jì)失調(diào)蛋白-1 共濟(jì)失調(diào)蛋白-3 轉(zhuǎn)通道
共濟(jì)失調(diào)蛋白-7 亨廷頓蛋白(Huntington) 萎縮蛋白-1 雄激素受體
半胱氨酸蛋白酶抑制劑-C的片段
運(yùn)甲狀腺素蛋白/溶菌酶
突變的tau蛋白
突變的briPP蛋白片段
突變的神經(jīng)絲抑蛋白
9
關(guān)于淀粉狀蛋白纖維的出版物表明圓柱形的(3-折疊是與一些
x-射線和電子顯微鏡數(shù)據(jù)相一致的唯一的結(jié)構(gòu)，并且阿爾茨海默A|3片段 和變體的纖維可能是由兩個(gè)或三個(gè)同中心圓柱形P-折疊組成(Peretz等， 2002)。完整的A|3肽包含42個(gè)殘基，恰好是為圓柱形外殼提供核心的準(zhǔn) 確數(shù)目；這一發(fā)現(xiàn)和在不存在脯氨酸時(shí)在由A(3肽組成的P-折疊中的許多 可能的強(qiáng)靜電相互作用解釋了該Af3肽形成在阿爾茨海默患者中發(fā)現(xiàn)的細(xì) 胞外淀粉狀蛋白斑的傾向性。如果這種解釋是正確的，則淀粉狀蛋白由具 有中央充滿水的腔的狹窄的管(納米管)組成。淀粉狀蛋白斑體外生長(zhǎng)的 可逆性提示在斑中和在溶液中的卩A之間的穩(wěn)定狀態(tài)平衡(Maggio和 Mantyh, 1996)。 (3A聚合作用對(duì)肽-肽相互作用形成|3-皺褶的折疊原纖維的 依賴性，以及其它蛋白對(duì)該反應(yīng)的刺激影響，表明淀粉狀蛋白形成可以進(jìn) 行調(diào)節(jié)。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試來(lái)發(fā)現(xiàn)能夠干擾淀粉狀蛋白形成的物質(zhì)。其 中研究最多的化合物是抗體、由(3-斷裂者(breaker)氨基酸如脯氨酸組成的 肽、向識(shí)別基序上添加帶電荷的基團(tuán)和將N-甲基化的氨基酸用作構(gòu)建組件 (由Gazit, 2002綜述)。由交替的D和L殘基組成的環(huán)肽形成這樣的納米管，該納米 管通過(guò)將它們自身插入到膜中并且將它們?nèi)O化而殺死細(xì)菌(Peretz等, 2002)。存在一些暗示，表明一些淀粉狀蛋白纖維可能是導(dǎo)體并且通過(guò)相同 的機(jī)制殺死細(xì)胞?？梢詫⑺鼈冏陨聿迦氲铰菪D(zhuǎn)角之間的縫隙中的芳香化合物 諸如剛果紅可能使所述圓柱形外殼不穩(wěn)定，并且起始該過(guò)程，但是預(yù)防將 是更有效的，并且可能更易于實(shí)現(xiàn)(Peretz等,2002)。
細(xì)胞內(nèi)聚集體-構(gòu)象疾病的特點(diǎn)蛋白錯(cuò)誤折疊和構(gòu)象變化是一些類型的疾病中的表現(xiàn)和進(jìn)展 的主要起因(Raso等，2000)，并且在下表2中顯示了構(gòu)象疾病以及它們相 關(guān)的蛋白成分和細(xì)胞內(nèi)含體的列表(Goedert等，1998)。在一些情形中，不 止一種蛋白參與病癥，共存在斑中或使得斑的形成更容易。
表2在神經(jīng)變性和其它類型的疾病中的蛋白纖維狀內(nèi)含體
疾病蛋白成分細(xì)胞內(nèi)含體
神經(jīng)變性
阿爾茨海默病rau, A(3 42肽神經(jīng)原纖維纏結(jié)
皮克病i:au皮克體/細(xì)胞質(zhì)
進(jìn)展性核上癱瘓(PSP)Tau，熱激蛋白神經(jīng)原纖維纏結(jié)
具有雷維小體的癡呆癥oc-突觸核蛋白雷維小體/細(xì)胞質(zhì)
帕金森病a-突觸核蛋白，晶體神經(jīng)絲/細(xì)胞質(zhì)
亨廷頓病亨廷頓蛋白的延伸的核內(nèi)內(nèi)含體
Glu重復(fù)
脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)共濟(jì)失調(diào)蛋白1、 3、 7核內(nèi)內(nèi)含體
(SCA)的延伸的Glu重復(fù)
可傳播性海綿狀腦病朊病毒蛋白，組織蛋白內(nèi)體樣細(xì)胞器
(TSE)酶B
系統(tǒng)淀粉樣變
2型糖尿病支鏈淀粉
血液透析相關(guān)的AP-2微球蛋白
反應(yīng)性淀粉樣變淀粉狀蛋白A
囊性纖維化CFTR蛋白在阿爾茨海默病(AD)中，其代表西方國(guó)家老年人口中的主要問(wèn) 題，主要蛋白成分是APP，其是一種約700個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白。在 其異常加工過(guò)程中，在細(xì)胞外產(chǎn)生Ap(l-40)肽，并且沉積為斑。AD的另 一個(gè)標(biāo)記是另一種蛋白Tau (tau)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，其在細(xì)胞內(nèi)觀察到。 Tau是參與穩(wěn)定神經(jīng)元中位于細(xì)胞內(nèi)的軸突微管的微管-相關(guān)蛋白。在帕金森病中，其是第二最常見(jiàn)的神經(jīng)變性病，涉及一些蛋白， a-突觸核蛋白，synphilin (—種a-突觸核蛋白相互作用蛋白)和帕金蛋白 (Ciechanover，2001)。帕金森病的特征是存在細(xì)胞內(nèi)雷維小體，其在零星的 帕金森病病例中、在具有雷維小體的癡呆癥和阿爾茨海默病的雷維小體變體中發(fā)現(xiàn)(Chung等.，2001)。 a-突觸核蛋白是雷維小體的主要成分 (Spillantini等.，1997)。 a-突觸核蛋白和synphilin 二者都是形成雷維小體所 必需的，其中可能發(fā)生synphilin的遍在蛋白化(Ciechanover, 2001;和 Chung等"2001)。朊病毒疾病，構(gòu)象疾病的另外實(shí)例， 一定范圍的可傳播性海綿 狀腦病(人類的庫(kù)魯、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和致死性家族失眠癥，牛 的牛海綿狀腦病，綿羊的癢病，和鹿的慢性萎縮病)具有許多與細(xì)胞內(nèi)淀 粉樣變(amyloidose)共有的特征，并且最可能是"構(gòu)象的"(Soto, 2001)。 迄今為止，已經(jīng)在多種構(gòu)象病中的蛋白質(zhì)沉積(proteinaceous deposites)中發(fā) 現(xiàn)約20種人蛋白。這些沒(méi)有表現(xiàn)出任何序列或結(jié)構(gòu)同源性。認(rèn)為共同的 事件是構(gòu)象改變，導(dǎo)致缺乏生物學(xué)功能或獲得毒性活性，并且可能地，形 成淀粉狀蛋白原纖維。關(guān)于纖維聚集物和淀粉狀蛋白噬斑是否是一些其它病理學(xué)的 副產(chǎn)物或它們是否是所述疾病的主要原因是爭(zhēng)論的主題。蛋白聚集物與退 化組織的共同定位以及它們的存在與疾病癥狀的相關(guān)性是構(gòu)象疾病的發(fā) 病機(jī)理中sheji淀粉狀蛋白沉積的強(qiáng)指征(Soto, 2001)。在一些神經(jīng)變性疾 病的家族性原因(表1和2)中，已經(jīng)獲得關(guān)于在突變的蛋白質(zhì)形成原纖 維的能力和病理跡象出現(xiàn)之間的直接聯(lián)系的證據(jù)(Goedert等，1998;和 Conway等，1998)。利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究也已經(jīng)證實(shí)突變?cè)诖俚矸蹱钭?蛋白(amyloidgenic protein )和疾病發(fā)病機(jī)理中的貢獻(xiàn)(Soto, 2001; Scherzinger等，1997;禾口 Tu腿ine等，2000)。
在不同蛋白質(zhì)中的淀粉狀蛋白形成的相似性 Dobson與合作者提議淀粉狀蛋白-原纖維形成是蛋白質(zhì)的共有 特征(Guijarro等，1998; Fandrich等，2001;禾Q Dobson, 1999)。常見(jiàn)的觀察是 纖維化從中間體狀態(tài)起始，所述中間體狀態(tài)即部分解折疊的或部分折疊 的、熔珠或天然樣中間體(Rochet等，2000)。具有cx-螺旋結(jié)構(gòu)的部分必須 進(jìn)行a-向P-轉(zhuǎn)化，并且然后P-鏈締合成規(guī)則的纖維結(jié)構(gòu)。在體外，通過(guò)改變pH或加入有機(jī)溶劑而改變?nèi)軇l件(Buck, 1998)可以導(dǎo)致部分解折疊以及隨后的蛋白質(zhì)原纖維形成(Chiti等，1999a
12和1999b)。在體內(nèi)，部分解折疊可以作為由于突變、在膜處的pH的局部 變化、氧化和熱壓力引起的降低的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的結(jié)果而發(fā)生，而部分折
疊可以在暴露于環(huán)境疏水物質(zhì)如殺蟲(chóng)劑時(shí)發(fā)生(Uversky等，2001)。原纖維的共有特征是與原纖維的長(zhǎng)軸垂直排列的卩-鏈(間隔 4.7A)和與該軸平行延伸的J3-折疊(Serpe11, 2000)。所述(3-鏈形成具有在每 115或250A處的常見(jiàn)重復(fù)的卩-螺旋彎曲(Serpell，2000;禾BDing等，1999)。
理解淀粉狀蛋白-原纖維形成可以有助于解決一些目前最有破 壞性的疾病，并且至少增加對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、折疊和穩(wěn)定性的常識(shí)。已經(jīng)顯 現(xiàn)了淀粉狀蛋白原纖維的多種特性纖絲和原纖維的共有結(jié)構(gòu)(Serpell,
2000) ，成核依賴性動(dòng)力學(xué)(Lomakin等，1996)，低聚體中間體的作用(Harper 等，1999;和Walsh等，1999)以及由高能屏障隔開(kāi)的至少兩種蛋白質(zhì)構(gòu)象的 存在，其表現(xiàn)出兩種肉眼可見(jiàn)的狀態(tài)(Ferreira等，2001;和Schlunegger等,
2001) 。
家族性肌萎縮致死性硬化病(fALS)家族性肌萎縮致死性硬化病(fALS)， 一種先天性神經(jīng)變性病， 其中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被損害并且丟失，占ALS病例的10% (Cudkowicz等. 2004,-和Gonzalez de Aguilar等.2007)。在20%的這些病例中，病理學(xué)特征 在于蛋白質(zhì)超氧化物歧化酶1 (S0D1)的突變形式的細(xì)胞內(nèi)累積，其導(dǎo)致淀 粉狀蛋白-樣纖絲和聚集體的形成(Bruijn等，1998; Watanabe等，2001; Taylor等，2002;Elam等，2003; Wood等，2003;和Mats腿oto等，2005)。 盡管fALS是歸因于在SOD1基因中的導(dǎo)致S0D1蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊形式 的許多已知的突變，但是尚未證明缺乏在該S0D1基因中的任何已知突變 的其余80%的ALS患者是否經(jīng)受S0D1聚集體，所述SOD1聚集體可能 是翻譯后修飾或迫使SOD1蛋白錯(cuò)誤折疊的其它環(huán)境條件的結(jié)果。在研發(fā)了突變的人S0D1蛋白的一些轉(zhuǎn)基因小鼠模型后，獲得 了 ALS研究的進(jìn)展。這些模型中的一種攜帶G93A突變的SOD1蛋白，其 導(dǎo)致SODl累積和運(yùn)動(dòng)損傷(Watanabe等.2001; Wong等.2002; Julien禾口 Kriz2006;和Umshitani等.2007)。這些小鼠是最好也是最常用的ALS研 究模式動(dòng)物。解決和預(yù)防細(xì)胞內(nèi)聚集體的治療途徑新的治療途徑是針對(duì)實(shí)現(xiàn)下述目的之一抑制和/或逆轉(zhuǎn)構(gòu)象 改變，或者溶解較小的聚集體并且分解淀粉狀蛋白原纖維。在參考文獻(xiàn)中 已經(jīng)引用了一些成功的嘗試，其包括利用與蛋白的活性構(gòu)象結(jié)合并且因此 抑制構(gòu)象改變的單克隆抗體。在阿爾茨海默病中，開(kāi)始進(jìn)行接種，在這種
情形中，靶向較小的低聚體和前纖維(prefibrillar)聚集體(Ingram等，2001)。 Soto與同事已經(jīng)設(shè)計(jì)了所謂的"小-蛋白伴侶"，也稱為'P折疊破壞劑' (Soto等，2001)，其是與負(fù)責(zé)自我締合的蛋白質(zhì)區(qū)域的序列結(jié)合的肽。在朊 病毒疾病中，與阿爾茨海默病相似，開(kāi)始使用防止構(gòu)象改變的單克隆抗體 進(jìn)行試驗(yàn)(Jones, 2001)。已經(jīng)篩選了一些己經(jīng)用于其它目的的藥物，并且 發(fā)現(xiàn)一些藥物如果用于早期千預(yù)延遲或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性，并且還在非常危險(xiǎn) 的病例中改善疾病狀態(tài)，如由Prusiner組報(bào)告的(Korth等，2001)。這些藥 物中的一種，米帕林，是一種抗瘧藥，以及另一種，氯丙嗪，用來(lái)治療精 神分裂癥。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了淀粉狀蛋白原纖維形成的其它阻斷劑，在從剛果紅 衍生物、抗癌和抗生素藥到煙堿和褪黑激素的范圍內(nèi)(Findeis, 2000)。
用于噬菌體向細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽 22年前在fibronectin中發(fā)現(xiàn)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)細(xì) 胞黏附序列(Pierschbacher等，1984a)。在非常大的蛋白質(zhì)中僅3個(gè)氨基酸 將形成細(xì)胞的主要識(shí)別位點(diǎn)的這一令人驚訝的發(fā)現(xiàn)最初受到一些懷疑。然 而，關(guān)于纖維結(jié)合素的觀察很快得到證實(shí)并且擴(kuò)展到其它蛋白質(zhì)。如在關(guān) 于RGD的最初的論文中所預(yù)測(cè)地，結(jié)果是所述RGD序列是許多其它黏附 蛋白的細(xì)胞黏附位點(diǎn)(Pierschbacher等，1984b; Yamada等，1984; Gartner等， 1985; Plow等，1985; Suzuki等，1985;和Gardner等，1985)。在另一種內(nèi)在 化肽中，人免疫缺陷病毒(HIV)的Tat蛋白，是一種具有細(xì)胞黏附活性的含 有RGD的蛋白質(zhì)。Tat與細(xì)胞的相互作用是重要的，原因在于Tat可以被 細(xì)胞內(nèi)在化，因此允許由一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的Tat進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞，并且開(kāi)始 潛在HIV的生產(chǎn)(Ensoli等，1990)。包含Arg-Gly-Asp(RGD)黏附位點(diǎn)的蛋白，以及作為它們的受
14體的整聯(lián)蛋白，組成關(guān)于細(xì)胞黏附的主要識(shí)別系統(tǒng)。所述RGD序列是大 量黏附細(xì)胞外基質(zhì)、血液、和細(xì)胞表面蛋白的細(xì)胞黏附位點(diǎn)，并且多于20 種的已知整聯(lián)蛋白的幾乎一半識(shí)別在它們的黏附蛋白配體中的該序列。另 一些整聯(lián)蛋白結(jié)合在它們的配體中的相關(guān)序列。黏著蛋白的結(jié)合整聯(lián)蛋白
的活性可以由含有RGD序列的短合成肽重現(xiàn)。當(dāng)在表面上不溶時(shí)，這樣 的肽促進(jìn)細(xì)胞黏附，并且在溶液中呈遞到細(xì)胞時(shí)抑制它。通過(guò)環(huán)化具有在 RGD周圍的選擇序列的肽和通過(guò)合成RGD模擬物，可以設(shè)計(jì)與唯一的或 一些RGD-導(dǎo)向的整聯(lián)蛋白選擇性結(jié)合的反應(yīng)齊lJ。因?yàn)檎?lián)蛋白-介導(dǎo)的細(xì) 胞黏附影響并且調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)、分化和程序性細(xì)胞死亡，所以RGD 肽和模擬物可以用來(lái)探測(cè)在不同生物系統(tǒng)中的整聯(lián)蛋白功能。
由通過(guò)經(jīng)由RGD環(huán)肽的整聯(lián)蛋白受體的受體介導(dǎo)的胞吞作用引起的噬菌 體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)合和內(nèi)在化含有RGD序列的環(huán)形肽可以以高親和力結(jié)合整聯(lián)蛋白分子， 并且因此允許通過(guò)與假結(jié)核耶爾森氏菌(j /^"^^Z^cm/o^)的侵染素-介 導(dǎo)的內(nèi)在化相似的機(jī)制內(nèi)在化。在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中，結(jié)合整聯(lián)蛋白 的、含有RGD的環(huán)形肽融合到具有fd噬菌體的主要衣殼蛋白基因，即基 因VIII的外源DNA序列上(Greenwood等，1991;禾Q Hart等，1994)。該方 法的目的是展示多個(gè)拷貝的整聯(lián)蛋白-結(jié)合肽，以最大化噬菌體和細(xì)胞之間
相互作用的機(jī)會(huì)。衣殼包含野生型pvm和融合pvni亞基的雜交混合物
(Greenwood等，1991;和Hart等，1994)。 Hart設(shè)計(jì)了編碼該環(huán)形肽序列 GGCRGDMFGC (SEQ IDNO:l)的DNA寡核苷酸，以在噬菌體上以多個(gè)拷 貝展示。該肽最初在噬菌體展示文庫(kù)中在基因HI-編碼的絲狀噬菌體小外 殼蛋白中分離并且得到描述，并且證明具有高整聯(lián)蛋白-結(jié)合親和性(O'Neil 等，1992)。在它們的主要外殼蛋白亞基上展現(xiàn)該肽的噬菌體fd粒子還具有 針對(duì)整聯(lián)蛋白的高結(jié)合親和力。在噬菌體M13的pVm主要外殼蛋白上呈遞的環(huán)形肽序列 EFGACRGDCLGA (SEQ ID NO: 2)顯示出以高效率結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (Ivanenkov等，1999;和Masliash等，2000)。本文對(duì)任何文件的引用不意欲作為承認(rèn)所述文件是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或者認(rèn)為是關(guān)于本申請(qǐng)任何權(quán)利要求的專利性的材料。關(guān)于任何 文件的內(nèi)容或日期的任何陳述是基于本申請(qǐng)人在提交時(shí)可獲得的信息，并 且不是構(gòu)成對(duì)關(guān)于這樣的陳述的正確性的承認(rèn)。
發(fā)明概述本方法提供一種抑制或治療與蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的 細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的疾病的方法。所述方法包括向需要其的哺乳動(dòng)物受試者 施用有效量的治療劑，所述治療劑攜帶被展示的含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序 列的肽序列，以便能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)，從而抑制或治療所 述疾病。.本發(fā)明還提供用于抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi) 形成或用于解聚(溶解)預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的 方法。本發(fā)明還提供一種包含有效量的治療劑的藥物組合物，所述治 療劑在本方法中用作活性成分。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1C是顯示使用夾心ELISA進(jìn)行的內(nèi)在化噬菌體動(dòng)力學(xué) 的定量分析的圖。在圖1A中，將CHO細(xì)胞用噬菌體RGD(菱形)、WT(正 方形)、或PBS (三角形)以6.6X10"個(gè)噬菌體/平板的終濃度培養(yǎng)一些時(shí)延 (time lapse): 15分鐘和30分鐘，1、 2、 5和22小時(shí)。然后，裂解細(xì)胞， 并且將總細(xì)胞裂解物應(yīng)用到用小鼠抗-M13抗體包被的96孔微量滴定平板 上。在細(xì)胞內(nèi)的噬菌體水平用多克隆兔抗噬菌體抗體然后用山羊抗兔HRP 綴合的抗體檢測(cè)。在細(xì)胞內(nèi)的噬菌體濃度與通過(guò)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)的具有 405nm處參照的492nm處的光學(xué)密度成比例。圖1B是圖1A的放大，其 允許顯現(xiàn)達(dá)到2小時(shí)的短時(shí)延。圖1C是噬菌體RGD校準(zhǔn)曲線。圖2A-2C是顯示如通過(guò)夾心ELISA測(cè)量的噬菌體從CHO細(xì) 胞清除的動(dòng)力學(xué)的圖。在圖2A中，將CHO細(xì)胞用噬菌體RGD (菱形)、 WT (正方形)、或PBS (三角形)以6.6X10^個(gè)噬菌體/平板的終濃度培養(yǎng)2 小時(shí)初始內(nèi)在化。然后，清洗細(xì)胞，并且更換培養(yǎng)基。在一些時(shí)間點(diǎn)后即2, 5, 48和72小時(shí)后裂解細(xì)胞。將細(xì)胞裂解物應(yīng)用到用小鼠抗M13抗體包 被的96孔微量滴定平板上。細(xì)胞內(nèi)的噬菌體水平用多克隆兔抗-噬菌體抗 體然后是山羊抗兔HRP綴合的抗體進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞內(nèi)的噬菌體濃度與 通過(guò)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)的具有405nm處參照的在492nm處測(cè)量的光學(xué)密度 成比例。圖2B是圖2A的放大，其允許顯現(xiàn)達(dá)到10小時(shí)的短時(shí)延。圖2C 顯示用噬菌體RGD、 WT、 PBS或硫柳汞溫育1周的其它CHO細(xì)胞平板 的MTT存活性測(cè)定。圖3A和3B是顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬(圖3A)和皮層(圖 3B)中的雷維小體染色的圖。組A/對(duì)照用水劑bidest每周處理一次，持續(xù) 8周(11=5)。組B/噬菌體慢性用絲狀噬菌體每周處理一次，持續(xù)8周(11=5)。 評(píng)估在~15月齡的海馬和皮層(11=3/組)中的a-突觸核蛋白免疫反應(yīng)性。 在每天處理2次持續(xù)3天的急性處理組(8月齡)中沒(méi)有作用。圖4是顯示用噬菌體處理的SOD1小鼠的轉(zhuǎn)棒取樣器 (Rotorod)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的圖。此處描述的轉(zhuǎn)棒取樣器結(jié)果在估測(cè)的小鼠疾病 發(fā)作年齡評(píng)估運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。結(jié)果計(jì)算為3次操作/小鼠/周的平均時(shí)間?？梢?看出，經(jīng)處理的小鼠比未處理的小鼠具有更好的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，并且保持該能 力更長(zhǎng)的時(shí)間，其轉(zhuǎn)化為疾病發(fā)作的延遲。在所有組中，完全運(yùn)動(dòng)功能障 礙在大約相同的年齡達(dá)到終點(diǎn)。圖5是顯示用展示RGD的噬菌體處理的SODl ALS模式小鼠 的存活率的圖。深色粗線顯示未處理的小鼠的存活率。淺色細(xì)線顯示UV-滅活的噬菌體-處理的小鼠的存活率，其顯示出相對(duì)于對(duì)照組的26天的死 亡發(fā)作延遲，和在最老的小鼠中死亡的14天延遲。50%的存活平均數(shù)估計(jì) 比對(duì)照組長(zhǎng)10天。深色細(xì)線顯示活噬菌體-處理的小鼠的存活率，這顯示 出相對(duì)于對(duì)照組的15天死亡發(fā)作延遲，和在最老的小鼠中死亡的19天延 遲。50%存活平均數(shù)估計(jì)比對(duì)照組長(zhǎng)8天。圖6A-6E是來(lái)自SOD1和噬菌體免疫組織化學(xué)和共聚焦顯微 鏡結(jié)果的圖像，其中圖6A顯示利用單克隆抗體抗-人SOD1的cy2標(biāo)記 (Santa Cruz l:5 0)在皮層中的神經(jīng)元SODl染色。在皮層中可以看到大量 的SOD1陽(yáng)性神經(jīng)元。圖6B顯示使用cy3標(biāo)記的兔多克隆抗-M13噬菌體 (l:500)的噬菌體標(biāo)記。箭頭指向一些噬菌體陽(yáng)性皮層神經(jīng)元和所述噬菌體
17在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的存在。圖6C顯示使用兔多克隆抗-MB噬菌體的cy3 標(biāo)記(1:500)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(僅通過(guò)形態(tài)學(xué))的噬菌體標(biāo)記。圖6D和E 顯示S0D1神經(jīng)元和M13噬菌體的雙重標(biāo)記證明噬菌體向SOD1陽(yáng)性神 經(jīng)元的內(nèi)在化以及它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)內(nèi)的存在。圖7是顯示噬菌體感染在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的TG1細(xì)菌的 能力的培養(yǎng)皿圖像，其中在對(duì)照培養(yǎng)皿中，給予PBS的TG1不生長(zhǎng)，但 是當(dāng)TG1被給予M13噬菌體時(shí)，然后作為賦予該細(xì)菌四環(huán)素抗性的感染 噬菌體的結(jié)果，它們可以在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。圖8是顯示噬菌體的UV照射防止噬菌體感染TG1細(xì)菌的能 力的培養(yǎng)皿圖像，其中培養(yǎng)皿A是陽(yáng)性對(duì)照…-用M13噬菌體感染的TG1 細(xì)菌，因此能夠在四環(huán)素上生長(zhǎng)；培養(yǎng)皿B-用經(jīng)過(guò)一個(gè)200,000 pjUV滅 活周期因此失去它們感染細(xì)菌的能力的M13噬菌體感染的TG1細(xì)菌，；培 養(yǎng)皿C -用經(jīng)過(guò)兩個(gè)200,000 |ij UV滅活周期的M13噬菌體感染的TG1細(xì) 菌；培養(yǎng)皿D -用經(jīng)過(guò)三個(gè)200,000 ^ UV滅活周期的M13噬菌體感染的 TG1細(xì)菌；培養(yǎng)皿E -用經(jīng)過(guò)四個(gè)200,000 UV滅活周期的M13噬菌體 感染的TG1細(xì)菌；和培養(yǎng)皿F -用經(jīng)過(guò)五個(gè)200,000 nj UV滅活周期的M13 噬菌體感染的TG1細(xì)菌。圖9A和9B是UV照射的噬菌體的電子顯微照片(條100 nm)。 圖9A顯示處于它們天然的絲狀結(jié)構(gòu)的野生型噬菌體，并且圖9B顯示UV-照射的噬菌體。在所述UV-照射的噬菌體中的噬菌體絲狀結(jié)構(gòu)未被破壞。圖10是顯示用A(31-40聚集體評(píng)估噬菌體干涉的ThT測(cè)定的 結(jié)果的圖。淀粉狀蛋白含量在435nm處激發(fā)后在485nm波長(zhǎng)處用分光熒
發(fā)明詳述 P-淀粉狀蛋白肽((3A)是兩種阿爾茨海默病標(biāo)志中的一種。該肽 在腦組織中形成僅可以被強(qiáng)變性劑溶解的纖維狀毒性聚集體。由于這些神 經(jīng)毒性特性與肽聚集形成相關(guān)，己經(jīng)投入了許多努力以開(kāi)發(fā)減少或消除腦 中的淀粉狀蛋白纖維沉積的程度的治療途徑。在生理?xiàng)l件下，合成的(3A采取聚集的形式，并且還表現(xiàn)出從
18神經(jīng)突的改變，這促進(jìn)對(duì)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用。已經(jīng)表明(3A的聚 集依賴于pH、肽濃度、溫度和溫育時(shí)間。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，使用在結(jié)構(gòu)和遺傳水平上充分了解的 絲狀噬菌體M13、 fl和fd (Greenwood等，1991)。本實(shí)驗(yàn)室最先表明絲狀 噬菌體表現(xiàn)出向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的滲透特性，同時(shí)保持載體的惰性特性和攜 帶外源分子的能力(Frenkel和Solomon, 2002)。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室還已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在體外絲狀噬菌體 本身具有防止(3A聚集的能力，以及溶解已經(jīng)形成的聚集體。絲狀噬菌體是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的病毒，其包含環(huán)形單鏈DNA基 因組。它們?cè)谏a(chǎn)性感染過(guò)程中不殺死它們的宿主。感染包含F(xiàn)質(zhì)粒的大 腸桿菌(&c/zen'c/z^co//)的噬菌體統(tǒng)稱為Ff噬菌體。它們不感染哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。絲狀噬菌體是約l-2微米長(zhǎng)且直徑為6 nm的柔軟的棒狀，在 DNA核心周圍有蛋白亞基的螺旋外殼。兩種主要外殼蛋白，即蛋白pIII 和主要外殼蛋白pVin，在所展示的蛋白拷貝數(shù)目上不同。盡管pIII以4-5 個(gè)拷貝存在，發(fā)現(xiàn)pVIII以 3000個(gè)拷貝存在。約50個(gè)殘基的主要外殼蛋 白pVIII亞基主要是ot-螺旋，并且該cx-螺旋的軸與病毒體的軸形成小角度。 蛋白外殼可以以三個(gè)面考慮外表面，由該亞基的N端區(qū)域占據(jù)，富含酸 性殘基，所述酸性殘基與周圍溶劑相互作用并且賦予該病毒體低等電點(diǎn)； 外殼的內(nèi)部，其包括19個(gè)殘基的無(wú)極性側(cè)鏈片段，其中蛋白亞基主要彼 此之間相互作用；和內(nèi)表面，由該亞基的C端區(qū)域占據(jù)，富含堿性殘基， 所述堿性殘基與DNA核心相互作用。實(shí)際上所有蛋白側(cè)鏈相互作用處于 外殼蛋白陣列的不同亞基之間而不是在亞基內(nèi)的事實(shí)使其成為研究大分 子裝配中的ci-螺旋亞基之間的相互作用的有用的模式系統(tǒng)。絲狀噬菌體的 獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其能夠滲透到腦中，盡管它具有約16.3MD的質(zhì)量，并且由于 噬菌體結(jié)構(gòu)本身與淀粉狀蛋白原纖維相似，可能有助于其妨礙卩A纖維化 的能力。考慮上述，本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)檢驗(yàn)了絲狀噬菌體妨礙(3-淀粉狀蛋白肽聚集過(guò)程的能力，并且發(fā)現(xiàn)在體外用不同比例的P-淀粉狀蛋 白肽以不同時(shí)間間隔培育野生型絲狀噬菌體導(dǎo)致防止和/或解聚P-淀粉狀蛋白。此外，所述絲狀噬菌體表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞存活性的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明絲狀噬菌體M13對(duì)淀粉狀 蛋白-P肽(A(3P)聚集的體外調(diào)節(jié)作用，以及該噬菌體針對(duì)聚集的A|3介導(dǎo)的 毒性的神經(jīng)保護(hù)活性。表明絲狀噬菌體的線性結(jié)構(gòu)在體外和體內(nèi)均賦予針 對(duì)A(3的抗-聚集特性，抑制淀粉狀蛋白形成，并且溶解已經(jīng)形成的聚集體。 修飾噬菌體的線性結(jié)構(gòu)并且使其成為球形消除了其解聚以及穿透能力。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室最近表明，由于它們的線性形狀，絲狀噬菌 體具有向不同種類的膜的高透過(guò)性。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得它們穿透到 CNS，而不管它們的高M(jìn).W.。加工這些噬菌體以展示抗-A(3抗體，并且通 過(guò)鼻內(nèi)施用遞送至轉(zhuǎn)基因小鼠腦部，且與A(3斑共同定位。近來(lái)，提議了 針對(duì)可卡因?yàn)E用的相似治療策略，其利用鼻內(nèi)施用在其表面上展示可卡因 -螯合抗體的加工的絲狀噬菌體Q這些噬菌體粒子是CNS滲透的有效載體， 并且能夠結(jié)合可卡因，由此在嚙齒動(dòng)物模型中阻斷其行為作用(Carrem等， 2004)。在溫育絲狀噬菌體-(3-淀粉狀蛋白原纖維與在載玻片上生長(zhǎng)的 小膠質(zhì)細(xì)胞后獲得數(shù)據(jù)。如果P-淀粉狀蛋白的確活化小膠質(zhì)細(xì)胞，在不活 化小膠質(zhì)細(xì)胞的條件下，該噬菌體溶解其。噬菌體技術(shù)提供了一種新的且 實(shí)踐上不受限制的(3-淀粉狀蛋白抗聚集劑來(lái)源，防止可能通過(guò)Fc受體過(guò) 度活化小膠質(zhì)細(xì)胞的抗體的有害作用。與動(dòng)物病毒相比，噬菌體作為基因和/或遞送載體(vehicles) 具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。它們是簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，其大規(guī)模生產(chǎn)和純化是非常有效的， 并且比動(dòng)物病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)和純化更廉價(jià)。另外，在噬菌粒載體中 可以有效包裝DNA大片段。己經(jīng)設(shè)計(jì)了原核感染、裝配和復(fù)制，噬菌體 不可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，也不顯示出對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的天然向性。 這最小化了非特異性基因遞送的機(jī)會(huì)。噬菌體載體比病毒潛在安全得多， 原因在于它們更不可能在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生能夠復(fù)制的實(shí)體(Monaci等， 2001)。本發(fā)明提供一種抑制或治療與蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的 細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的疾病的方法，該方法通過(guò)給需要其的哺乳動(dòng)物受試者施 用有效量的治療劑進(jìn)行，所述治療劑攜帶被展示的包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在所述哺乳動(dòng)物受試者的細(xì)胞 內(nèi)，從而抑制或治療所述疾病。通過(guò)本發(fā)明方法抑制或治療的疾病是指與蛋白纖維狀內(nèi)含體 或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的那些疾病，所述蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體 諸如細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮克體、雷維小體、神經(jīng)絲、細(xì)胞內(nèi)內(nèi)含體
和由蛋白成分組成的內(nèi)體樣細(xì)胞器，所述蛋白成分如tau、 A(31-42肽、熱 激蛋白、(x-突觸核蛋白、cystallins、亨廷頓蛋白或共濟(jì)失調(diào)蛋白的延長(zhǎng)的 Glu重復(fù)、朊病毒蛋白、組織蛋白酶B、支鏈淀粉、淀粉狀蛋白A和卩-2 微球蛋白等，如在表l中所公開(kāi)。優(yōu)選地，所述疾病是阿爾茨海默病、帕 金森病、具有雷維小體的癡呆癥，或肌萎縮性側(cè)索硬化病(ALS)。盡管該 疾病的優(yōu)選實(shí)施方案與腦有關(guān)，本方法還可以治療在機(jī)體內(nèi)其它部位與蛋 白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的疾病。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，所述治療劑可以是抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或 聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成的或解聚(溶解)預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含 體或聚集體的任何試劑，只要所述治療劑攜帶由所述治療劑展示的包括哺 乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，從而能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)， 以解聚或抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的形成。攜帶所述肽序列的治療 劑的優(yōu)選實(shí)施方案是在其表面上展示該肽序列的絲狀噬菌體，優(yōu)選地具有 這樣的限制條件，即所述絲狀噬菌體除了該肽序列之外還不展示抗體或非 絲狀噬菌體抗原。所述治療劑的其它非限制性實(shí)例包括其它類型的噬菌體 和病毒，以及與所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列融合的肽、蛋白和其它治療化 合物。所述肽的非限制性實(shí)例包括在美國(guó)專利6,462,171和Soto等.(2001) 中公開(kāi)的抑制性肽。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列可以是作為細(xì)胞黏附的結(jié)果促進(jìn) 內(nèi)在化的任何序列。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。最優(yōu)選地，所述RGD細(xì)胞黏附序列包括SEQ ID NO : 1或SEQ ID NO : 2，并且是環(huán)形的。細(xì)胞黏附序列的另一個(gè)非限制性實(shí)例 是來(lái)自HIV的Tat肽。所述絲狀噬菌體可以是任何絲狀噬菌體，諸如M13, fl,fd,或 其混合物。盡管在下述實(shí)施例中使用M13，但是認(rèn)為任何其它的絲狀噬菌體以相似的形式表現(xiàn)和行使功能，原因在于它們具有相似的結(jié)構(gòu)，并且因 為它們的基因組具有大于95%的基因組相同性。所述絲狀噬菌體優(yōu)選地進(jìn) 行UV-照射且滅活，其中UV-照射和滅活使該噬菌體的絲狀結(jié)構(gòu)未受損害， 以致其保留其抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體形成的能力或其解 聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的能力。當(dāng)所述方法用來(lái)抑制或治療在腦中發(fā)生的疾病時(shí)，所述絲狀噬
菌體優(yōu)選地以鼻內(nèi)施用，以將活性成分通過(guò)受體的嗅覺(jué)系統(tǒng)引入到受體的體內(nèi)。作為所述治療劑的優(yōu)選實(shí)施方案，絲狀噬菌體M13具有許多 優(yōu)點(diǎn)。它是無(wú)毒的、用于表達(dá)肽或蛋白的充分確定的系統(tǒng)。它穩(wěn)定在其外 殼蛋白上表達(dá)的肽或蛋白，易于遞加至大規(guī)模生產(chǎn)，沒(méi)有針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì) 胞向性，并且促進(jìn)向腦的滲透。本發(fā)明還提供一種用于抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì) 胞內(nèi)形成的方法。該方法包括使得治療劑與能夠形成蛋白纖維狀內(nèi)含體或 聚集體的細(xì)胞內(nèi)肽或多肽接觸，以抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞 內(nèi)形成，所述治療劑攜帶被展示的包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列， 從而能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明還提供一種用于解聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi) 含體或聚集體的方法。本發(fā)明的這一實(shí)施方案包括使得治療劑與預(yù)先形成 的細(xì)胞內(nèi)纖維內(nèi)含體或聚集體接觸，以解聚所述預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖 維狀內(nèi)含體或聚集體，所述治療劑攜帶被展示的包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序 列的肽序列，從而能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化至細(xì)胞內(nèi)。所述絲狀噬菌體關(guān)于(3A原纖維形成或解聚的抗聚集或解聚特 性可以通過(guò)公知的硫黃素T (ThioflavinT, ThT)結(jié)合測(cè)定測(cè)量。中斷(3A 原纖維結(jié)構(gòu)形成以及預(yù)先形成的13A原纖維的解聚由ThT熒光的顯著減少 指不。為了本說(shuō)明書(shū)和附上的權(quán)利要求的目的，術(shù)語(yǔ)"受試者"、"患 者"和"受體"可互換使用。它們最優(yōu)選地是人，但是可以是任何哺乳動(dòng)物， 包括小鼠、大鼠、猴子、牛、綿羊、山羊、豬、馬、狗、貓等，其是預(yù)防、 實(shí)驗(yàn)或治療性處理的對(duì)象。
22
術(shù)語(yǔ)"(3淀粉狀蛋白肽"與"(3-淀粉狀蛋白肽"、"(3AP"、 "f3A"和 "A卩"同義。所有這些術(shù)語(yǔ)是指來(lái)源于淀粉狀蛋白前體蛋白的形成斑的肽。
當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，"PrP蛋白"、"PrP"、"朊病毒"是指在適當(dāng)?shù)?br> 條件下能夠誘導(dǎo)負(fù)責(zé)斑形成疾病的聚集體形成的多肽。例如，在這樣的條 件下，正常的細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPC)轉(zhuǎn)化成相對(duì)應(yīng)的癢病同種型(PrPSc)， 其負(fù)責(zé)斑形成疾病，諸如但不限于，牛海綿狀腦病(BSE)、或瘋牛病、貓 的貓科(feline)海綿狀腦病、庫(kù)魯病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、和致死性家族性失眠癥(FFI)。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)"解聚"是指典型通過(guò)非共價(jià)鍵保持在一 起的聚集的蛋白的增溶(溶解)。術(shù)語(yǔ)"治療"意欲意指基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，基 本上改善疾病的臨床癥狀或基本上防止疾病臨床癥狀的出現(xiàn)。因?yàn)榕c上述疾病相關(guān)的大部分淀粉狀蛋白斑(也稱為淀粉狀蛋 白沉積)定位在腦部，所以任何提議的關(guān)于細(xì)胞外斑的治療方式必須表現(xiàn)出 穿過(guò)血腦屏障(BBB)的能力以及溶解淀粉狀蛋白斑的能力。通常，能夠穿 過(guò)BBB的分子的平均大小約為2 kDa。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在AD的臨床階段早期影響中樞嗅覺(jué)途 徑中的嗅覺(jué)缺失和退化改變。此外，AD中涉及的解剖模式提示嗅覺(jué)途徑 可能是AD發(fā)展的初始階段。嗅覺(jué)受體神經(jīng)元是雙極細(xì)胞，其定位在鼻腔的上皮層中。它們 的軸突橫穿篩板，并且突出到在腦嗅球中的嗅覺(jué)途徑的第一突觸。這種構(gòu)型使得它們成為病毒或其它轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)可以獲得穿過(guò)BBB到達(dá)CNS的
"大路"。如先前所示，鼻內(nèi)施用(Mathison等，1998; Chou等，1997; Draghia等，1995)能夠使病毒和大分子直接進(jìn)入腦脊液(CSF)或CNS。在參考文獻(xiàn)中報(bào)道了利用嗅覺(jué)受體神經(jīng)元作為腺病毒載體到 腦的遞送點(diǎn)。據(jù)說(shuō)該方法使得報(bào)告基因在腦中表達(dá)持續(xù)12天而沒(méi)有明顯 的毒性(Draghia等，1995)。本發(fā)明所述的藥物制劑包括有效量的治療劑作為活性成分，所 述治療劑攜帶被展示的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明所述的制劑可以本身被施用到生物體，或者處于與適當(dāng) 的載體或賦形劑混合的藥物組合物中。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，"藥物組合物"是指本文所述的一種或多種 活性成分與其它化學(xué)成分如生理上適合的載體和賦形劑的制劑。藥物組合 物的目的是促進(jìn)化合物向生物體的施用。在本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)"活性成分"是指負(fù)責(zé)生物學(xué)作用的制劑。在下文，可以互換使用的短語(yǔ)"生理上可接受的載體"和"藥 用載體"是指不引起對(duì)生物體的顯著刺激且不消除所施用的化合物的生物 學(xué)活性和特性的載體或稀釋劑。在這些短語(yǔ)中涵蓋佐劑。在本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)"賦形劑"是指添加到藥物組合物中進(jìn)一步促 進(jìn)活性成分的施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸 鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。用于配制和施用藥物的技術(shù)可以在"雷明頓藥物科學(xué) (Remington's Pharmaceutical Sciences)," Mack出版公司,Easton， PA,最新 版本，中找到，其通過(guò)引用結(jié)合于此。適當(dāng)?shù)氖┯猛緩娇梢园ǎ?，口服、直腸、透粘膜特別是 透鼻的、小腸或腸胃外遞送，包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接 的心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。備選地，人們可以以局部而非系統(tǒng)模式施用制劑，例如，通過(guò) 將制劑直接注射到患者的腦部。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備，例如，通過(guò)常規(guī)混合、溶解、?；?、做糖衣丸、研磨、乳化、包封、包載(entrapping) 或凍干程序制備。因此，用于本發(fā)明的藥物組合物可以以常規(guī)方式使用一種或多 種生理上可用的載體配制，所述生理上可用的載體包括賦形劑和佐劑，其 促進(jìn)將活性成分加工到可以藥用的制劑中。適當(dāng)?shù)闹苿┮蕾囉谒x用的施 用途徑。對(duì)于注射，本發(fā)明的活性成分可以配制在水溶液中，優(yōu)選地在 生理相容的緩沖劑如Hank's溶液、林格溶液、或生理鹽水緩沖液中。對(duì)于 透黏膜施用，在所述制劑中使用適合透過(guò)屏障的滲透劑。所述滲透劑在本 領(lǐng)域內(nèi)是公知的。對(duì)于口服施用，治療劑可以容易地通過(guò)將活性成分與本領(lǐng)域公 知的藥用載體組合而配制。所述載體能夠?qū)⑺鲋委焺┡渲茷槠瑒?、丸劑?糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、結(jié)晶漿液、混懸液等，用于由患者口 服攝取。用于口服應(yīng)用的藥物制劑可以使用固體賦形劑制備，如果需要的 話，加入適當(dāng)?shù)淖魟┖?，任選地碾磨所得到的混合物，并且加工顆粒的混 合物，以獲得片劑或糖衣丸核。適當(dāng)?shù)馁x形劑特別是填充劑如糖，包括乳 糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纖維素制劑，諸如例如，玉米淀粉、小麥 淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪樹(shù)膠(gumtragacanth)、甲基纖 維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可用的聚合物， 諸如聚乙烯吡咯垸酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，諸如交聯(lián)的聚 乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或藻酸或其鹽如藻酸鈉。為糖衣丸核提供適當(dāng)?shù)陌?。為了該目的，可以使用濃縮的糖 溶液，其可以任選地包含阿拉伯樹(shù)膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝 膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液(lacquersolution)和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶 劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱且峦璋轮刑砑尤玖匣蛏兀糜谧R(shí)別或表征 活性成分劑量的不同組合?？梢钥诜褂玫乃幬锝M合物包括由明膠制成的推入-擬合式膠 囊，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制成的軟的、密封的膠囊。所述 推進(jìn)-擬合式膠囊可以包含與填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉、滑潤(rùn)劑如滑石 或硬脂酸鎂、以及任選地，穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，活性成
25分可以溶解或混懸在適當(dāng)?shù)囊后w中，如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二 醇中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。所有用于口服施用的制劑應(yīng)該以適合所選 施用途徑的劑量存在。對(duì)于口腔施用，所述組合物可以采用以常規(guī)方法配制的片劑或 錠劑形式。對(duì)于通過(guò)鼻吸入施用，按照本發(fā)明使用的活性成分便利地以噴
霧劑形式從利用適當(dāng)?shù)耐苿?dòng)劑如二氯二氟甲垸、三氯氟甲垸、二氯四氟乙
烷或二氧化碳的加壓包裝(pressurized pack)或噴霧器遞送。在壓縮的氣 溶膠的情形中，劑量單位可以通過(guò)提供閥門(mén)遞送計(jì)量的量而確定。用于分 配器的例如明膠的膠囊和藥筒可以配制成含有所述化合物和適當(dāng)?shù)姆勰?基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
.
本發(fā)明所述的制劑可以配制用于腸胃外施用，例如，通過(guò)大丸 劑(bolus)注射或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如， 存在于安瓿或在多劑量容器內(nèi)，任選地具有添加的防腐劑。所述組合物可 以是在油性或水性賦形劑中的混懸液、溶液或乳液，并且可以包含配方試 劑如混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于腸胃外施用的藥物組合物包括水溶形式的活性制劑的水 溶液。備選地，可以將活性成分的混懸液制備成適當(dāng)?shù)挠托曰蚧谒淖?射混懸液。適當(dāng)?shù)挠H脂溶劑或賦形劑包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪 酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射混懸液可以包含增加該混 懸液的粘性的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，所 述混懸液還可以包含適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑或增加活性成分的溶解性的試劑，以允 許制備高度濃縮的溶液。備選地，所述活性成分可以以粉末形式存在，以用于在使用前 用適當(dāng)?shù)馁x形劑如無(wú)菌、無(wú)熱原質(zhì)的基于水的溶液構(gòu)建。本發(fā)明的制劑還可以使用例如常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其它 甘油酯配制在直腸制劑中，諸如栓劑或保留灌腸劑。適用于本發(fā)明的情形的藥物組合物包括這樣的組合物，其中以 獲得有意目的的有效量包含活性成分。更具體地，治療有效量意指有效預(yù) 防、減輕或改善疾病癥狀或延長(zhǎng)被治療的受試者的存活的活性成分的量。它還可以意指抑制或減少蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成或解 聚/溶解預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的有效量。治療有效量的確定是充分處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi) 的，特別是依據(jù)本發(fā)明提供的詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何制劑，最初可以從體外和細(xì)胞培養(yǎng)
測(cè)定估計(jì)治療有效量或劑量。例如，可以在動(dòng)物模型中配制實(shí)現(xiàn)需要的效 果的劑量。這樣的信息可以用來(lái)更準(zhǔn)確地確定在人中的有效劑量。本文所述的活性成分的毒性和治療功效可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方 法在體外、細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定 和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制一定范圍的用于人的劑量。所述劑 量可以依賴于所用的劑型和所用的施用途徑而不同。可以由個(gè)體醫(yī)師考慮 患者的條件選擇準(zhǔn)確的制劑、施用途徑和劑量(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ingl等，在" 治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics)"，第1章第 1頁(yè)(1975)中)。劑量的量和時(shí)間間隔可以進(jìn)行個(gè)體調(diào)節(jié)，以提供足以防止聚集 或解聚已存在的聚集物的絲狀噬菌體血槳或腦水平(最小有效濃度， MEC)。 MEC將隨每種制劑不同，但是可以從體外數(shù)據(jù)確定。獲得MEC 所需要的劑量將取決于個(gè)體特征和施用途徑。結(jié)合測(cè)定可以用來(lái)確定血漿 濃度。劑量時(shí)間間隔也可以使用MEC值確定。制劑應(yīng)該使用在 10-90%的時(shí)間、優(yōu)選在30-90%并且最優(yōu)選在50-90%的時(shí)間保持血漿水平 高于MEC的方案施用。取決于待治療的病癥的嚴(yán)重性和響應(yīng)，給藥可以是單次或多 次施用，治療療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或獲得疾病狀態(tài)的減 輕。要施用的組合物的量當(dāng)然應(yīng)該取決于被治療的受試者、痛苦 的嚴(yán)重性、施用方式、開(kāi)處方醫(yī)師的判斷等。本發(fā)明的組合物，如果需要的話，可以存在于包裝或分配器 裝置中，諸如FDA核準(zhǔn)的試劑盒中，其可以包含一個(gè)或多個(gè)含有活性成 分的單位劑型。例如，所述包裝可以包括金屬或塑料箔，諸如泡狀包裝。所述包裝或分配器裝置可以附有施用說(shuō)明。所述包裝或分配器還可以包納 與容器相關(guān)的公告，所述公告采用政府機(jī)構(gòu)指定的形式，調(diào)節(jié)藥物的制備、 使用或銷售，所述公告反映所述機(jī)構(gòu)對(duì)所述組合物的形式或人或獸醫(yī)施用 的批準(zhǔn)。例如，這樣的公告可以是由美國(guó)食品藥品管理局對(duì)處方藥物批準(zhǔn) 的標(biāo)記，或是批準(zhǔn)的產(chǎn)品插頁(yè)。包括配制在相容藥物載體中的本發(fā)明的制 劑的組合物也可以制備、放置在適當(dāng)?shù)娜萜髦校⑶覙?biāo)記用于適應(yīng)征的治 療，如同上文更詳細(xì)所述那樣?，F(xiàn)在已經(jīng)概述了本發(fā)明，通過(guò)參考顯示下述實(shí)施例將更容易 理解本發(fā)明，所述實(shí)施例通過(guò)舉例說(shuō)明的方式提供，并不意欲限制本發(fā)明。
阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)
材料和方法
電鏡(EM)
絲微朦特淀微餅游被/鎖將噬菌體和AP樣品黏附到在200#柵板上蒸發(fā)的formvar包 被的碳上，持續(xù)10分鐘，并且進(jìn)行印跡。為了區(qū)分絲狀噬菌體粒子和A卩 原纖維，進(jìn)行用針對(duì)APP的EFRH氨基酸殘基(SEQ ID NO: 3)生產(chǎn)的單克 隆抗體(mAb)196 (在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn))免疫標(biāo)記，以檢測(cè)A(3， 使用兔多克隆抗M13 (在本實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn))來(lái)標(biāo)記所述噬菌體。所述免疫 標(biāo)記分別通過(guò)12 nm金綴合的山羊抗小鼠抗體和6 nm金抗兔抗體顯現(xiàn)(電 鏡科學(xué)(Electron Microsc叩y Sciences),華盛頓)。將樣品用一抗溫育10 分鐘，用0.1% BSA/TBS洗滌5次，然后用二抗溫育30分鐘，洗滌，用 水性乙酸雙氧鈾(2。/。wt/vol)(西格瑪(Sigma))負(fù)染色，并且在JEOL 1200 EX 電鏡下觀察(Ingram, 2001)。野生型M13噬菌體防止A(3P聚集的能力通過(guò)將A(3Pl-40 (97 ^M)用不同量的噬菌體(2xlO"噬菌體^10 nM, 2xl01Q噬菌體=1.1 nM,禾口 2xl08噬菌體=0.01 nM)在37°C溫育9天進(jìn)行證實(shí)。加入PBS作為對(duì)照。 將lOjil來(lái)自具有或不具有噬菌體的APP溶液的樣品按上述處理。對(duì)于解聚實(shí)驗(yàn)，將溶解在PBS中的A卩Pl-40在37°C溫育9天形成聚集體。向樣品(A(31-40 97 一)中加入噬菌體(^1012噬菌體=55 nM, 1乂101()噬菌體=0.55 nM)，在37。C共同溫育16小時(shí)，并且處理用于EM 分析。
構(gòu)建噬菌體RGD
縱艦吝乂厲微將不同的大腸桿菌菌株(K91Kan， DH5a禾卩XL-1 blue)在37°C 搖動(dòng)(250 RPM)下在2ml 2YT培養(yǎng)基(分別含有100 |ig/ml卡那霉素，20 pg/ml四環(huán)素或無(wú)抗生素)中生長(zhǎng)過(guò)夜。然后，將600 pl過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到 60mlSOB培養(yǎng)基中，并且生長(zhǎng)至早期對(duì)數(shù)階段(O.D.(600nm) 0.3)。將生 長(zhǎng)的細(xì)菌在冰上溫育10分鐘，然后在4°C以5000 rpm離心10分鐘。將 細(xì)菌團(tuán)塊重懸在20ml CCMB中，并且在冰上溫育20分鐘，然后在4°C以 5000 rpm離心10分鐘。將沉淀的細(xì)菌重懸在5ml CCMB中，整分并且保 存在-70。C，直到使用時(shí)。
克隆噬菌體RGD
F飼泰辦靴,分耍使用DNAmidi純化試劑盒，從"88型"fd文庫(kù)克隆(由George Smkh提供)分離f88-4載體。將F88-4載體用HindIII和Pstl限制性酶消化。 將包含15嗎dsDNA, l(_d Pstl和l^il HindIII, 4^1 3號(hào)限制酶緩沖液X10的 40[al總反應(yīng)體積在37。C溫育2小時(shí)，然后在70°C滅活5分鐘。然后，向 所消化的載體中加入1^1南極磷酸酶(Antarctic Phosphatase),在37°C持續(xù) 30分鐘，以去除DNA的5'-磷酸基團(tuán)。將該產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠上電 泳。使用DNA提取試劑盒從凝膠上純化線性處理的載體。
薪乂A虔縱.'翁乂微彌腳麟鵬乂將兩種互補(bǔ)的引物，每種50 pMol，與2.5^1 T4激酶緩沖液 X10, 1^1 T4激酶和16.5^1 DDW混合，并且在37°C溫育2小時(shí)，然后在 70°C滅活激酶10分鐘。然后，將20 pmol的每種引物混合至lOOpl的總 體積，并且在95°C溫育5分鐘。然后，實(shí)施逐漸降低的溫度，以允許引物退火。在這一階段退火的引物(插入片段)是由HindIII和PstI粘端組 成的dsDNA。
遂辭〃靴將處理的載體和退火的引物(插入片段)分別以分子比例l:
3連接，如下將100ng載體，1.423ng插入片段，1.5(^1 T4 DNA連接酶緩沖 液X10和1 pl T4 DNA連接酶加入到15^1總體積中，并且在室溫溫育2小 時(shí)，然后在4。C溫育過(guò)夜。為了評(píng)價(jià)載體自連率，制備僅由載體組成的另 一份混合物。利用熱激步驟，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)K91Kan細(xì)菌中， 按下述進(jìn)行
將10^1連接混合物加入到lOOpl解凍的細(xì)菌中，并且在冰水溫育30 分鐘，然后在42°C溫育2分鐘，并且立即在冰水再溫育3分鐘。然后， 向所述細(xì)菌中加入lml 2YT，并且在以150rpm的搖動(dòng)下將培養(yǎng)物在37 °C 生長(zhǎng)1小時(shí)，以表達(dá)抗生素抗性基因。將細(xì)菌以兩倍稀釋接種到含有 100jag/ml卡那霉素和20嗎/ml四環(huán)素的2YT平板上，并且在37°C生長(zhǎng)過(guò) 夜。
鑒定A維遊將已經(jīng)在Kan/Tet平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行菌落PCR。將每個(gè) 菌落與7nl準(zhǔn)備好的混合物、lpl(10pmol)的每種引物(插入片段引物作為 正向引物，并且與f88-4載體的pVIII互補(bǔ)的引物作為反向引物)和5^1無(wú) 菌ddH20混合，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)如下95。C6分鐘，然后29個(gè)下述 循環(huán)在94°C 30秒，在55°C 30秒，和在72°C 1分鐘。通過(guò)在72°C繼 續(xù)5分鐘而進(jìn)行最后的鏈延伸。然后，將PCR產(chǎn)物上樣到2。/。瓊脂糖凝膠 上，以檢測(cè)35bp條帶，該條帶指示RGD插入片段的確連接到所述載體中。 然后，使用在PCR中所用的反向引物對(duì)陽(yáng)性菌落測(cè)序。
麟粒產(chǎn)將用包含PEP插入片段的fB8-4載體以及野生型克隆(其為 "裸"f88-4載體)轉(zhuǎn)染的K91Kan大腸桿菌，在37。C， 250rpm在包含100嗎/ml卡那霉素和20(ig/ml四環(huán)素的2ml 2YT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)夜。將 lml過(guò)夜生長(zhǎng)起始物加入到包含100)ig/ml卡那霉素、20pg/ml四環(huán)素和 lmM IPTG的1升2YT培養(yǎng)基中，并且在37°C， 250rpm溫育過(guò)夜。第二 天，將接種體在4°C以6500rpm離心20分鐘，以除去細(xì)菌。收集上清， 并且用PEG/NaCl以5:1 (v/v)的比例在4°C溫育過(guò)夜，以能夠沉淀噬菌體。 然后，將噬菌體在4°C以9000 rpm離心1小時(shí)進(jìn)行沉淀。在倒掉上清后， 將沉淀物重懸在20ml無(wú)菌PBS中，并且通過(guò)在4。C用PEG/NaCl 1:5比例 過(guò)夜溫育再沉淀一次。通過(guò)在4°C以9000 rpm離心1小時(shí)沉淀噬菌體粒 子，重懸在l ml無(wú)菌PBS中，并且然后用0.45(i濾器尖端過(guò)濾，以去除 任何痕量的細(xì)菌。按照通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量的在269nm和作為參照的320 nm的吸收，按照下式確定回收的噬菌體粒子濃度
n幼M, ' [O.D.(269nm)-O.D.(32。nm)].6.1016
噬菌體/ml =-井乂士+ i & 、-
載體大小(bp)
,微微翻層都環(huán))澄微蘑粒產(chǎn)將ELISA 96孔微量平板每孔用稀釋在總體積5(^1的包被緩 沖液中的數(shù)種濃度的噬菌體RGD或噬菌體WT包被。在37°C溫育2小 時(shí)后，將所述平板用PBST洗滌兩次，并用PBS洗滌兩次。然后，將所述 平板用在PBS中的3%牛奶(200^1每孔)在37°C封閉3小時(shí)，然后洗滌， 如上述。將l: 1000稀釋在1%牛奶中的5(^1兔抗M13多克隆抗體洗滌， 并且在37。C溫育1.5小時(shí)，然后洗滌，如所述。加入山羊抗兔HRP綴合 的抗體(5(Hi1)，并且在37。C溫育1小時(shí)，然后洗滌，如所述。對(duì)每個(gè)孔用 50|il底物O-苯二胺(OPD) (15mg OPD在7.5ml檸檬酸緩沖液中，并且加 入3pl的30%H2O2)對(duì)所述平板顯色。用25^1的4NHCL終止反應(yīng)。使 用ELISA讀數(shù)儀，通過(guò)用405nm參照在492 nm處的吸收而監(jiān)測(cè)顏色密度。
, 乙、五迪定著藩膽歸疆,動(dòng)力,為了確定噬菌體內(nèi)在化的準(zhǔn)確時(shí)間并且為了定量在一些短時(shí) 間點(diǎn)的內(nèi)在化噬菌體的量，與所述相似，將所述噬菌體與CHO細(xì)胞溫育， 不同的是，在該測(cè)定中，所述時(shí)間點(diǎn)是15和30分鐘、1、 2、 5和22小時(shí)。裂解細(xì)胞，并且測(cè)定蛋白濃度。將96孔微量滴定平板用小鼠抗M13單克
隆抗體包被，所述抗體以1:250稀釋在包被緩沖液中，每孔50iLtl，并且在 4。C溫育過(guò)夜。次日，將所述平板用PBST洗滌兩次，然后用PBS洗滌兩 次，并且在總體積50卩的在PBS中的1%牛奶中標(biāo)準(zhǔn)化相等的蛋白濃度后， 一式三份加入。使用在該方法中以在總體積5(^1的在PBS中的1%牛奶中 幾次連續(xù)稀釋施用到細(xì)胞中的相同的噬菌體RGD生產(chǎn)制作噬菌體校準(zhǔn)曲 線。樣品在37。C溫育2小時(shí)，然后用PBST洗滌兩次，然后用PBS洗滌 兩次。將所述平板用100^1/孔在PBS中的3%牛奶在4°C溫育過(guò)夜。次日， 在用PBS洗滌一次后，加入1:1500稀釋在1。/。牛奶中的兔抗-M13多克隆 抗體，50fal/孔，在37。C溫育1.5小時(shí)。在所述平板用PBST洗滌兩次并用 PBS洗滌兩次后，加入1:2500稀釋在1%牛奶中的山羊抗兔HRP綴合的二 抗，并且在37°C溫育1小時(shí)。通過(guò)用PBST洗滌孔兩次并用PBS 洗滌兩次而去除未結(jié)合的二抗。將所述平板用每孔50|_d底物O-苯二胺 (OPD)(在7.5 ml檸檬酸緩沖液中的15mg OPD，并且加入3)id 30% H202) 顯色。反應(yīng)用25^1 4NHC1終止。使用ELISA讀數(shù)儀，通過(guò)用405nm參照 在492 nm處的吸收而監(jiān)測(cè)顏色密度。
定蘆玄C//(9潘應(yīng)^游耱朦銀臂餘動(dòng)力學(xué)
為了在初始內(nèi)在化到CHO細(xì)胞中后確定噬菌體清除動(dòng)力學(xué)， 進(jìn)行了清除測(cè)定。該測(cè)定是基于大部分噬菌體PEP粒子至多在約2小時(shí)后 內(nèi)在化到細(xì)胞中的事實(shí)。在37。C、 90%相對(duì)濕度和5% C02，將5xl()S個(gè) 細(xì)胞接種在處于CHO生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含有10%血清)中的10 cm平板上。 在90%匯合時(shí)，將細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌，并且向所述細(xì)胞中加入無(wú)血清 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在2小時(shí)溫育后，向細(xì)胞施用6xlO"噬菌體RGD或WT或 施用PBS作為對(duì)照(未處理的)。噬菌體粒子與所述細(xì)胞溫育2小時(shí)，此 后，細(xì)胞用PBS徹底洗滌3次。向細(xì)胞中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，并且在一些 時(shí)間間隔后裂解細(xì)胞2小時(shí)，5小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)。測(cè)定細(xì)胞提取物 的蛋白濃度。同樣進(jìn)行關(guān)于噬菌體從細(xì)胞的清除的定量ELISA。為了證實(shí) 噬菌體清除不是細(xì)胞死亡的結(jié)果，在另一個(gè)用噬菌體RGD或WT或用PBS 溫育1周的CHO細(xì)胞的10cm平板上進(jìn)行MTT測(cè)定。儲(chǔ)雌麟沐船D在潘謝定泣戯資微為了內(nèi)在化的噬菌體在細(xì)胞內(nèi)的特定定位，使用特異性抗體
和由細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記組成的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞的細(xì)胞器與噬菌體粒子的共同定位。
CHO細(xì)胞從平板底部分離，用錐蟲(chóng)藍(lán)方法計(jì)數(shù)，并且在具有13mm0玻 璃蓋玻片的無(wú)菌24孔平板上以5xl(^個(gè)細(xì)胞/孔在CHO生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包含 10%血清)(700pl/孔)在37°C， 90%相對(duì)濕度和5% C02中培養(yǎng)。在約60% 的匯合，將細(xì)胞用1嗎處于CMV啟動(dòng)子下的EEA1-GFP (早期內(nèi)體標(biāo)記)， Lgp-120 - YPP (溶酶體標(biāo)記)，GalT - GFP (高爾基標(biāo)記)或Sec61-GFP (E. R. 標(biāo)記)的DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑或用TransIT-LTl轉(zhuǎn)染試 劑按照供應(yīng)商的用法說(shuō)明進(jìn)行，并且將所述平板保持在銀紙上。24小時(shí)后， 徹底洗滌細(xì)胞，并且每孔用1011個(gè)噬菌體RGD, WT或PBS在無(wú)血清培養(yǎng) 基中溫育24小時(shí)。次日，將細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌3次，并且每孔用500W 4M低聚甲醛在40。C固定30分鐘，然后用700jil "/。NH4Cl洗滌3次，每 次5分鐘。將細(xì)胞在RT用20(^1 1%皂苷滲透15分鐘(未滲透的細(xì)胞用 PBS洗滌)，然后用PBS徹底洗滌3次。用封閉緩沖液在RT進(jìn)行封閉15 分鐘(未滲透的孔用無(wú)皂苷的封閉緩沖液洗滌)。向每個(gè)孔中加入20(Hil 以1:500稀釋在封閉緩沖液中的小鼠抗M13—抗，并且在RT溫育1小時(shí)。 然后，將細(xì)胞用1%皂苷洗滌3次(未滲透的孔用PBS洗滌)，并且加入 以1:500稀釋在封閉緩沖液中的山羊抗小鼠cy3綴合的二抗，在RT持續(xù)1 小時(shí)。然后，將細(xì)胞用PBS洗滌4次。向載玻片加入ProLong抗褪色溶液 (封固劑)，并且用蓋玻片(含細(xì)胞)蓋在其上。在40。C2天后，細(xì)胞用 共聚焦顯微鏡觀察。
/^玄眾游^^蘑銀/ GD游潘應(yīng)^/遂徑游免瘦黃f為了揭示與特定的內(nèi)吞細(xì)胞器相關(guān)和在一些時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi) 噬菌體途徑，將細(xì)胞用包含在CMV啟動(dòng)子下的EEA1-GFP (早期內(nèi)體標(biāo)記) 或Lgp-120 - YFP (溶酶體標(biāo)記)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將噬菌體粒子應(yīng)用到所轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞，如所述；然而，在該方法中，溫育的時(shí)間為15分鐘，30分鐘，1小時(shí), 2小時(shí)和5小時(shí)。在溫育后，將細(xì)胞用無(wú)菌PBS徹底洗滌，并且將細(xì)胞固定、染色并顯現(xiàn)，如所述。 結(jié)果
絲狀噬菌體的抗聚集特性
辦魏 ThT實(shí)驗(yàn)表明噬菌體的解聚活性比其防止細(xì)胞外原纖維形成 的能力更有效。當(dāng)在絲狀噬菌體的存在下溫育肽A(3時(shí)，觀察到AI3P聚集 中的26%的減少，而向預(yù)先聚集的A(3中加入噬菌體導(dǎo)致淀粉狀蛋白原纖 維中的45%減少。
銀被邀噬菌體的解聚特性通過(guò)將噬菌體腦內(nèi)注射到過(guò)量表達(dá)人淀粉 狀蛋白前體蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠中而在體內(nèi)顯現(xiàn)。絲狀噬菌體結(jié)合轉(zhuǎn)基因小 鼠的A|3斑的能力由AD模型腦切片的免疫組織化學(xué)染色證明。由M13, fl, 和fd組成的絲狀噬菌體家族(Ff)在結(jié)構(gòu)和遺傳上都是充分研究的。己經(jīng)設(shè) 計(jì)原核感染、裝配和復(fù)制，所述噬菌體缺少針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的向性。它 們的絲狀結(jié)構(gòu)(900 nm長(zhǎng)，7 nm直徑)使它們能夠滲透到CNS中。Ff病毒體 由包裝在由主要外殼蛋白pVIII組成并且在末端由4或5個(gè)拷貝的四種小 外殼蛋白中的每一種封閉的管中的單鏈DNA基因組組成。本發(fā)明人的實(shí) 驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)絲狀噬菌體的線性結(jié)構(gòu)賦予針對(duì)A卩P的抗聚集特性。修飾所 述噬菌體的線性結(jié)構(gòu)并且使其成為球形消除了它的解聚能力。絲狀噬菌體 妨礙A(3P聚集過(guò)程，并且溶解己存在的AP原纖維，這表明這些發(fā)現(xiàn)對(duì) AD治療以及其它淀粉樣變疾病的治療相關(guān)性。
噬菌體-RGD內(nèi)在化噬菌體-RGD早在施用后15分鐘就內(nèi)在化到CH0細(xì)胞內(nèi)(圖 1B，菱形)。在與細(xì)胞溫育2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到高水平的噬菌體RGD，并且直 到22小時(shí)的時(shí)延即所檢驗(yàn)的最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)一直持續(xù)內(nèi)在化(圖1A，菱 形)。相反，噬菌體WT僅在22小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)間溫育后表現(xiàn)出中等的內(nèi)在化 (圖1A，正方形)，并且直到該時(shí)間點(diǎn)才給出與未處理的細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)所測(cè)量的相同的測(cè)量。即使如此，其在該時(shí)間的內(nèi)在化等于僅在15分
鐘之內(nèi)的RGD內(nèi)在化。在校準(zhǔn)曲線(圖1C)評(píng)估后，O.D.492 = 0.5近似 于2)^109個(gè)噬菌體粒子。可以假設(shè)與細(xì)胞溫育15分鐘后內(nèi)在化的噬菌體 RGD的量是2xl09。誤差條表示從3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次計(jì)算的 標(biāo)準(zhǔn)偏差值。觀察到噬菌體RGD與用融合到GFP上的早期內(nèi)體標(biāo)記 EEA1-GFP或用溶酶體標(biāo)記Lgpl20-YFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的顯著共同定位。然 而，當(dāng)檢驗(yàn)其它細(xì)胞細(xì)胞器時(shí)，ER蛋白sec61-GFP和高爾基蛋白 GalT-GFP，沒(méi)有檢測(cè)到噬菌體的共同定位。這些結(jié)果表明噬菌體RGD確 實(shí)通過(guò)內(nèi)在化的胞吞途徑機(jī)制內(nèi)在化。
在AD轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型中實(shí)驗(yàn) Tg小鼠，在血小板衍生生長(zhǎng)因子-P (PDGF-(3)啟動(dòng)子的調(diào)控控
制下表達(dá)野生型人a-突觸核蛋白。選擇該啟動(dòng)子是因?yàn)樵谏窠?jīng)變性疾病的 轉(zhuǎn)基因模型中它己經(jīng)成功地用于將其它人蛋白的表達(dá)靶向神經(jīng)元(Masliah 等，2000)。人PDGF-(3鏈基因的5'-側(cè)連區(qū)域的1480-堿基對(duì)(bp)片段分離 自psisCAT質(zhì)粒(由哈佛醫(yī)學(xué)院T. Collins饋贈(zèng))，并且置于Not I-Sal I片段 上游，所述Not I-Sal I片段從5'到3'由SV40剪接體,423 bp的編碼全長(zhǎng)野 生型a-突觸核蛋白的人cDNA,和來(lái)自pCEP4載體(Invitrogen)提供多腺 苷酸化信號(hào)的SV40序列組成。得到的融合基因不含載體序列，純化，并 且按照標(biāo)準(zhǔn)方法顯微注射到單細(xì)胞胚胎(C57BL/6 x DBA/2 F2)中。通過(guò)尾 DNA的狹線-印跡分析鑒定13個(gè)轉(zhuǎn)基因建立者，并且與野生型C57BL/6x DBA/2 Fl小鼠雜交，以建立轉(zhuǎn)基因品系。通過(guò)尾DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)分析鑒定轉(zhuǎn)基因后代。提取基因組DNA，并且在30個(gè)循環(huán)(93。C 30 s, 57。C30s,72。C 1.5min)中擴(kuò)增，最后在72。C延伸5分鐘。引物如下 5'-CCAGCGGCCGCTCTAGAACTAGTG (有義；SEQ IDNO:4)
和 5'-CCAGTCGACCGGTCATGGCTGCGCC (反義；SEQ ID NO:5)雷維小體的染色針對(duì)人a-突觸核蛋白的抗體還識(shí)別在雷維小體疾病中發(fā)現(xiàn) 的特征性胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)含體。人(x-突觸核蛋白免疫反應(yīng)性內(nèi)含體在最高表達(dá)者 品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中是最豐富的，并且在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袡z測(cè)不到。在轉(zhuǎn) 基因小鼠中，所述內(nèi)含體最經(jīng)常在新皮質(zhì)的較深層、海馬的CA3區(qū)域、 和在嗅球中的神經(jīng)元中觀察到，并且在黑質(zhì)中偶然觀察到。在患有雷維小 體疾病的患者中，這些區(qū)域也典型地受到影響(Masliah等，2000)。
討論絲狀噬菌體M13具有許多應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)。它是無(wú)毒的，充分確定 的表達(dá)肽或蛋白的系統(tǒng)，穩(wěn)定在其外殼上表達(dá)的蛋白或肽，由簡(jiǎn)單的大規(guī) 模生產(chǎn)組成，并且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有向性。在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中還己經(jīng) 表明絲狀噬菌體能夠進(jìn)行腦滲透。在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中使用基于絲狀噬菌體M13內(nèi)在化到哺乳 動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的遞送系統(tǒng)。EFGACRGDCLGA序列(SEQIDNO:2)，由包含 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D核心)的共有核心組成，R-G-D是結(jié)合 av整聯(lián)蛋白家族所必需的最少的氨基酸序列(Ivanenkov等，1999a和 199%)。所述RGD核展示在通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸成環(huán)的噬菌體外殼蛋白上， 由此促進(jìn)RGD核心肽的環(huán)化呈遞。與非環(huán)化肽相比，環(huán)化肽的產(chǎn)生導(dǎo)致 更高的親和力，并且允許靶向特異性。此外，環(huán)化肽呈遞賦予更高的體內(nèi) 穩(wěn)定性(Stefanidakis和Koivunen， 2004)。因此，允許在噬菌體表面上 150個(gè)拷貝的多價(jià)肽呈遞，這樣 的呈遞產(chǎn)生活性細(xì)胞輸入受體介導(dǎo)的胞吞作用(RME)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由與a-
整聯(lián)蛋白受體的結(jié)合調(diào)控。使用免疫熒光標(biāo)記，與WT噬菌體相比較，觀察到噬菌體RGD 結(jié)合和向哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化。選擇CHO細(xì)胞作為用哺乳動(dòng)物 細(xì)胞表征噬菌體的細(xì)胞模型。這些細(xì)胞是常用的和充分確定的細(xì)胞模型， 并且具有成為黏附性的優(yōu)點(diǎn)。與非黏附模型相反，整聯(lián)蛋白在該細(xì)胞表面 上大量出現(xiàn)，允許它們與細(xì)胞內(nèi)a-肌動(dòng)蛋白相互作用，以進(jìn)行結(jié)合和內(nèi)在化。證明了施用至細(xì)胞的噬菌體RGD的劑量-依賴性內(nèi)在化，以致當(dāng)向細(xì) 胞施用更高量的噬菌體時(shí)，觀察到更高的內(nèi)在化。 —些細(xì)胞內(nèi)靶向系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞是有細(xì)胞毒性的，尤其是當(dāng)以高 劑量施用時(shí)(Mountain， 2000; Lee和Jameson, 2005)。因此，通過(guò)兩種不同 的比色實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了噬菌體施用對(duì)CHO細(xì)胞的影響。在向細(xì)胞施用噬菌體 RGD或WT后，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)計(jì)數(shù)檢查到細(xì)胞死亡，并且通過(guò)MTT測(cè)定評(píng) 估細(xì)胞存活性。進(jìn)行該測(cè)定以確保噬菌體在細(xì)胞內(nèi)的存在在溫育2天后沒(méi) 有任何不利的影響。在這兩種實(shí)驗(yàn)中，施用噬菌體RGD或噬菌體WT的 細(xì)胞表現(xiàn)出與未處理的細(xì)胞相似的存活性，并且可以看出這兩種相互的測(cè) 定給出相似的結(jié)果。為了揭示噬菌體RGD在細(xì)胞內(nèi)的命運(yùn)，發(fā)現(xiàn)其特異性定位并 且說(shuō)明其在細(xì)胞內(nèi)的途徑，將細(xì)胞內(nèi)噬菌體和細(xì)胞細(xì)胞器均進(jìn)行雙標(biāo)記。 在溫育的不同時(shí)刻，可以揭示按照胞吞途徑的噬菌體RGD細(xì)胞內(nèi)途徑 在最初15分鐘所述噬菌體定位在早期內(nèi)體。在溫育2小時(shí)后，更多的噬 菌體粒子定位在內(nèi)體，并且在2-5小時(shí)內(nèi)，大部分噬菌體粒子定位在溶酶 體，其表明內(nèi)在化的胞吞途徑。為了推論，本發(fā)明人在這里已經(jīng)建立了一種用于細(xì)胞內(nèi)靶向 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的系統(tǒng)。構(gòu)建了由RGD核心肽組成的內(nèi)在化的噬菌體，所 述RGD核心肽能夠以高活性和親和性進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)內(nèi)在化。該系統(tǒng)特征在 于在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)在化和清除動(dòng)力學(xué)二者，因此所述噬菌體在施用后15分 鐘內(nèi)進(jìn)行內(nèi)在化，并且在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的噬菌體的量隨時(shí)間增加。在約一天 后，噬菌體粒子從細(xì)胞清除。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用在培養(yǎng)基中或一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 時(shí)，所述內(nèi)在化系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。通過(guò)整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的胞吞作用的 內(nèi)體途徑，并且在15分鐘后，所述噬菌體定位在早期內(nèi)體，然后在接下 來(lái)的2小時(shí)內(nèi)重新定位在溶酶體，表明存在噬菌體細(xì)胞內(nèi)途徑。
實(shí)施例2 肌萎縮性側(cè)索硬化病(ALS)實(shí)驗(yàn)
材料和方法使用肌蔞縮性側(cè)索硬化病(ALS) B6SJL-Tg(SODl-G93A)lGur-J小鼠，其攜帶高拷貝數(shù)的突變形式的S0D1蛋白，所 述突變形式的SODl蛋白加速蛋白聚集、疾病發(fā)作和死亡。這些小鼠的平 均壽命估計(jì)為130-135天，疾病發(fā)作定義為在80-90天30%的運(yùn)動(dòng)性能丟 失(Umshitani等.2007)。將8只小鼠分成兩組。4只小鼠使用微量移液器鼻內(nèi)施用l(Vl 活的RGD-噬菌體，并且4只小鼠以相同方式用12 pl UV-滅活的RGD-噬 菌體處理。在每次施用中給與每只小鼠的噬菌體數(shù)目為2.5x1012。小鼠從 50日齡起處理2次/周，持續(xù)40天的期間(估計(jì)運(yùn)動(dòng)下降發(fā)作)，從第90天 起處理3次/周，直到將它們處死。34只未處理的小鼠用作對(duì)照評(píng)估存活 時(shí)間。 —周一次，使用轉(zhuǎn)棒取樣器鼓(Rotorod drum)(SDI,加利福尼 亞)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。監(jiān)測(cè)在轉(zhuǎn)棒取樣器上的表現(xiàn)時(shí)間。設(shè)定達(dá)到 25RPM的加速模式(4級(jí))。直到小鼠不同到達(dá)食物和水和/或當(dāng)以它們側(cè) 面放置后它們不能立即翻身以它們的腹部支撐時(shí)，評(píng)估存活率。將小鼠用 C02處死，并且取出它們的腦和脊骨，固定在PFA 4%中用于進(jìn)一步的分 析和組織學(xué)。 _按照Ddmastro等.(1997)進(jìn)行噬菌體的UV滅活。噬菌體溶 液以一些25 pl的液滴整分，每個(gè)液滴置于24孔平板的孔中。小滴用U. V. Stratalinker以200,000 (jj照射3個(gè)周期(周期之間暫停1分鐘)。進(jìn)行ThT結(jié)合測(cè)定，以與活噬菌體溶解這些聚集體的能力比 較評(píng)估UV-滅活的噬菌體溶解淀粉狀蛋白聚集體的能力(體外)。淀粉狀蛋 白-P原纖維形成通過(guò)硫黃素-T (ThT)結(jié)合測(cè)定定量，其對(duì)鑒定淀粉狀蛋白 原纖維是特異性的。ThT迅速與聚集的原纖維締合，產(chǎn)生在435-450 nm的 新激發(fā)(吸收)最大值，和在485 nm的增強(qiáng)的發(fā)射，這與游離的染料的 385 nm (激發(fā))和445 nm發(fā)射相反。這種改變?nèi)Q于聚集的狀態(tài)，因?yàn)閱?體或二體肽不反應(yīng)，并且聚集體的胍解離破壞該信號(hào)(LeVineH. 1993)。使 用Perkin-Elmer模式LS-50分光熒光計(jì)測(cè)量樣品發(fā)射，并且由任意單位表 示。
由于這種檢測(cè)是比較性的(淀粉狀蛋白-(3的聚集與所述肽和 噬菌體的聚集相比較)，絕對(duì)值不如相對(duì)聚集百分?jǐn)?shù)那樣重要。
聚集百分?jǐn)?shù)以下述方式計(jì)算
%聚集=發(fā)射482 nm (用噬菌體溫育的淀粉狀蛋白B) X 100 發(fā)射482 nm (單獨(dú)溫育的淀粉狀蛋白卩)
將淀粉狀蛋白卩-聚集視作100%?？偸菧y(cè)量噬菌體和緩沖溶液 的背景數(shù)值，并且那些值從所有結(jié)果得分中省略不計(jì)。在所有進(jìn)行的檢測(cè) 中，噬菌體溶液的數(shù)值幾乎與緩沖液的數(shù)值相同；因此，結(jié)論是噬菌體不 形成ThT-陽(yáng)性(3-折疊結(jié)構(gòu)。將APP1-40在37°C溫育20天以促進(jìn)聚集。加入噬菌體或 PBS，并且與預(yù)先聚集的AP再溫育72小時(shí)。按上述測(cè)量熒光。
結(jié)果與對(duì)照未處理組相比較，在UV-滅活的RGD-噬菌體和活 RGD-噬菌體的兩個(gè)組中均觀察到疾病發(fā)作延遲、以及存活率提高。在任 一組內(nèi)沒(méi)有可觀察到的副作用。
運(yùn)動(dòng)表觀盡管處理的和未處理的組均在相同年齡達(dá)到相同的運(yùn)動(dòng)損傷 終點(diǎn)，圖4所示的轉(zhuǎn)棒取樣器結(jié)果表明處理的小鼠比未處理的小鼠在更長(zhǎng) 的時(shí)間具有更好的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，由此證明疾病發(fā)作的延遲。
存話率與未處理的組相比，在兩個(gè)處理組中均觀察到更長(zhǎng)的壽命(圖5)。
鄉(xiāng)學(xué)微
組織學(xué)結(jié)果(圖6A-6E)表明噬菌體滲透到神經(jīng)元和星形膠質(zhì) 細(xì)胞。
"n微,銜城斷贈(zèng)溝為了確保噬菌體失去它們的感染能力而沒(méi)有進(jìn)行由UV-滅活 導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)修飾，進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)
-通過(guò)照射失去噬菌體細(xì)菌感染性
-能夠顯現(xiàn)噬菌體的絲狀結(jié)構(gòu)的電鏡照片
-淀粉狀蛋白-P肽的體外解聚測(cè)定
通過(guò)照射失去噬菌體細(xì)菌感染性將攜帶四環(huán)素抗性基因的M13絲狀噬菌體涂布在加入四環(huán)素 的2YT培養(yǎng)皿上。將平板接種TG1細(xì)菌。在所述噬菌體不感染它們并且 不賦予所述細(xì)菌四環(huán)素抗性基因的條件下，TG1培養(yǎng)物不能在這些平板上 生長(zhǎng)。在圖7中，當(dāng)將PBS置于接種的TG1細(xì)菌上時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)皿 沒(méi)有顯現(xiàn)出任何細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)將M13噬菌體接種TG1培養(yǎng)物上時(shí)，由于 感染的噬菌體賦予的四環(huán)素抗性，細(xì)菌能夠生長(zhǎng)。不同濃度的噬菌體(由 在培養(yǎng)皿上的數(shù)目表示)與能夠生長(zhǎng)的TG1培養(yǎng)物的數(shù)目和密度相關(guān)。當(dāng) 通過(guò)UV照射時(shí)，噬菌體失去它們感染TG1細(xì)菌的能力，由此防止細(xì)菌生 長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)對(duì)于噬菌體滅活， 一個(gè)周期的UV照射是足夠的。
t/K-順游麟鄉(xiāng)嵐頗拍攝UV-滅活的RGD-噬菌體的電鏡圖片(圖9A和9B)，以確 保照射處理沒(méi)有損壞噬菌體的絲狀結(jié)構(gòu)。
^藏貴,:r祭^^/定分橋"F-滅活游朦朦,與淀粉猶歪A覆桌銀游互,本實(shí)驗(yàn)用展示RGD肽的UV滅活的噬菌體進(jìn)行，以證明UV 滅活的噬菌體不但保持它們的結(jié)構(gòu)，而且保留它們的功能和解聚淀粉狀蛋白聚集體的能力。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的先前的體外實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證實(shí) 活的噬菌體具有解聚A|3聚集體的能力。解聚檢測(cè)-將58pM A(3p l-40溫育20天。加入絲狀噬菌體 并且共溫育72小時(shí)。使用ThT檢測(cè)淀粉狀蛋白含量。當(dāng)向預(yù)先聚集的A卩中加入RGD-噬菌體時(shí)，觀察到A(3P聚 集的45%減少。使用未進(jìn)行UV-照射的RGD-噬菌體觀察到相同的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)證明UV-照射不損壞RGD-噬菌體解聚淀粉狀蛋白聚 集體的能力。此外，本實(shí)驗(yàn)表明在所述噬菌體上展示以允許它們內(nèi)在化到 神經(jīng)元中的RGD肽不損壞所述噬菌體的解聚能力(與細(xì)胞內(nèi)聚集體相關(guān)， 如在帕金森、亨廷頓和ALS中發(fā)現(xiàn)的那些)。
結(jié)論上述證據(jù)表明絲狀噬菌體具有溶解和解聚已經(jīng)形成的細(xì)胞內(nèi) 淀粉狀蛋白斑的能力。在ALS病的突變體-SODl-Tg小鼠模型中的實(shí)驗(yàn)表 明，在這些小鼠細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成的S0D1聚集體可以溶解并且導(dǎo)致小 鼠死亡的改善。這些小鼠的噬菌體處理不但提高它們的壽命預(yù)期，而且相 對(duì)于對(duì)照小鼠，將它們的運(yùn)動(dòng)能力和身體強(qiáng)度延長(zhǎng)到更高水平。在噬菌體上的UV-滅活實(shí)驗(yàn)是開(kāi)發(fā)用于人類的安全產(chǎn)品的另 一個(gè)步驟。UV-滅活的噬菌體保持它們的絲狀結(jié)構(gòu)不被損壞，并且因此保 留它們?nèi)芙獾矸蹱畹鞍装叩慕饩勰芰Α，F(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解， 在不背離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明可以 在寬范圍的等價(jià)參數(shù)、濃度和條件下進(jìn)行。盡管己經(jīng)結(jié)合其具體的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是 應(yīng)該理解，它能夠進(jìn)一步改進(jìn)。本申請(qǐng)意欲覆蓋本發(fā)明的任何變化、用途 或應(yīng)用，其通常遵循本發(fā)明的原理，并且包括與本公開(kāi)內(nèi)容的這樣的背離， 所述背離在本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的已知或慣用實(shí)踐內(nèi)，并且可以應(yīng)用到在上 文以及后附權(quán)利要求范圍內(nèi)描述的基本特征。本發(fā)明引用的所有參考文獻(xiàn)，包括雜志論文或摘要，公布的 或相對(duì)應(yīng)的美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)，授權(quán)的美國(guó)或外國(guó)專利，或任何其它參考文獻(xiàn)，通過(guò)引用完全結(jié)合于此，包括所引用的參考文獻(xiàn)中描述的所有數(shù) 據(jù)、表格、附圖和正文。另外，在所述參考文獻(xiàn)中所引用的參考文獻(xiàn)的完 整內(nèi)容也通過(guò)引用完全結(jié)合。對(duì)已知的方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的 參考不以任何方式承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨冈谙嚓P(guān)技術(shù)領(lǐng) 域內(nèi)被公開(kāi)、教導(dǎo)或暗示。具體實(shí)施方案的前述描述將如此充分地揭示本發(fā)明的一般性
質(zhì)，以致在不背離本發(fā)明的總觀念的條件下，其他人通過(guò)利用本領(lǐng)域技術(shù) 內(nèi)的知識(shí)(包括其中引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)可以容易地改進(jìn)和/或修改所 述具體實(shí)施方案的各種應(yīng)用，無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)。因此，基于本發(fā)明描述 的教導(dǎo)和指導(dǎo)，這樣的修改和改進(jìn)意欲在所公開(kāi)的實(shí)施方案的等價(jià)物的含 義和范圍之內(nèi)。應(yīng)該理解，本發(fā)明的措詞或術(shù)語(yǔ)是為了描述的目的而不是 限制，以致熟練的技術(shù)人員基于本發(fā)明所述的教導(dǎo)和指導(dǎo)，聯(lián)系本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員的知識(shí)，應(yīng)該理解本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)或措詞。參考文獻(xiàn)
Banks禾口 Kastin，腦研究進(jìn)展(Prog Brain Res.) ,91:139-4(1992)
Barillari Q Gendelman R， Gallo RC, Ensoli B. 1993. HIV-1的TAT蛋白，即 AIDS-卡波西肉瘤和細(xì)胞因子活化的血管細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，通過(guò)利用識(shí)別 RGD氨基酸序列的整聯(lián)蛋白受體而誘導(dǎo)相同細(xì)胞類型的黏附(The TAT protein of HIV-1, a growth factor for AIDS-Kaposi's sarcoma and cytokine-activated vascular cells, induces adhesion of the same cell-types by using integrin receptors recognizing the RGD amino-acid sequence ).美國(guó)國(guó) 家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:7941-45.
Bruijn, L. I., M. K. Houseweart，等.(1998)."不依賴于野生型SOD1的ALS-連鎖的SOD1突變體的聚集和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元毒性"("Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SODl.")科學(xué)(Science) 281 (5384): 1851-4.
Buck, M. (1998)三氟乙醇和同系物共溶劑的時(shí)代到來(lái)了。肽和蛋白的最 近石開(kāi)究(Trifluoroethanol and colleagues: cosolvents come of age. Recent studies with peptides and proteins.) Q. Rev. Biophys. 31:297-355.
Carrera, M. R.A., Kaufmann, G. F.， Mee, J. M., Meijler, M. M., Koob, G. F., Janda， K. D.,"用病毒治療可卡因上癮"("Treating cocaine addiction with viruses").美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 101 (28): 10416 (2004).
Caughey等，"通過(guò)紅外光譜學(xué)在水中進(jìn)行癢病-相關(guān)的蛋白PrP 27-30的 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析"("Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by infrared spectroscopy"), 生物化學(xué) (Biochemistry) 30:7672-7680(1991)Chartier Harlan等，自然(Nature) 353:844(1991)
Chiti, R, Taddei, N.， Webster, P" Hamada, D.， Fiaschi, T.， Ramponi， G.禾口 Dobson， C.M. (199%)通過(guò)穩(wěn)定局部二級(jí)結(jié)構(gòu)而加速乙酰磷酸酶的折疊 (Acceleration of the folding of acylphosphatase by stabilisation of local secondary structure).自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nat Struct. Biol,) 6:380-387.
Chiti, F., Webster, P., Taddei， N., Clark, A., Stefani, M., Ramponi， G.和Dobson: C.M. (1999a)設(shè)計(jì)體外形成淀粉狀蛋白原絲和原纖維的條件(Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils ).美國(guó) 國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(p腦.Natl. Acad. Sci. USA) 96:3590-3594.
Chou等，生物藥物分配(BiopharmDmgDispos.) 18(4) :335-46 (1997)
Chung, K. K., Zhang, Y" Lim, K. L.， Tanaka, Y., Huang， H., Gao， J., Ross, CA., Dawson, V. L.和Dawson, T. M. (2001)帕金蛋白遍在a-突觸核蛋白-相互作 用蛋白，突觸核蛋白-l:暗示雷維小體在帕金森病中的形成(Parkin ubiquitinates the a-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease). 自然醫(yī)學(xué) (Nat. Med.) 7:1144-1150.
Ciechanover,A.(2001)聯(lián)系遍在蛋白、帕金蛋白和突觸核蛋白-l (Linking ubiquitin, parkin and synphilin-1) 自然醫(yī)學(xué)(Nat. Med.) 7:1108-1109.
Conway， K.A. , Harper, J. D. & Lansbury， P. T. (1998)通過(guò)突變體a-突觸核 蛋白加速體外原纖維形成與早期發(fā)作帕金森病的聯(lián)系(Accdemted in vitro fibril formation by a mutant a-synuclein linked to early-onset Parkinson disease).自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med,) 4:1318-1320.
Cudkowicz, M., M. Qureshi,等.(2004)."肌萎縮性側(cè)索硬化病中的測(cè)量和標(biāo)"i己"("Measures and markers in amyotrophic lateral sclerosis.") NeuroRx 1(2): 273-83.
De Gioia等，"與朊病毒蛋白殘基106-126同源的淀粉樣變和神經(jīng)毒性肽的 構(gòu)象多態(tài)性"("Conformational polymorphism of the amyloidogenic and neurotoxic peptide homologous to residues 106-126 of the prion protein"),生 物化學(xué)雜志(JBiolChem) 269:7859-7862 (1994)
Delmastro, P.， A. Meola,等.(1997).在口服施用后展示肽模擬表位的絲狀噬 菌體的免疫原性("Immunogenicity of filamentous phage displaying peptide mimotopes after oral administration."疫苗(Vaccine) 15(11): 1276-85.
Ding, T. T.和Harper, J. D. (1999)使用輕打式原子力顯微術(shù)在周圍環(huán)境條 件下分析淀粉狀蛋白-卩裝酉己(Analysis of amyloid-卩assemblies using tapping mode atomic force microscopy under ambient conditions ).酉每學(xué)方《去 (Methods Enzymol.) 309:510-525.
Dobson， CM. (1999)蛋白錯(cuò)誤折疊、進(jìn)化和疾病(Protein misfolding, evolution and disease).生物化學(xué)科學(xué)趨勢(shì)(Trends Biochem. Sci.) 24:329-332.
Draghia等，基因治療(Gene Therapy) 2:418-423 (1995)
Elam， J. S" A. B. Taylor,等.(2003)."由與家族性ALS連鎖的SOD1突變蛋 白形成的淀粉狀蛋白樣細(xì)絲和充滿水的納米管"("Amyloid-like filaments and water-filled nanotubes formed by SOD1 mutant proteins linked to familial ALS.")自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nat Struct Biol) 10(6): 461-7.
Ensoli B, Barillari G, Salahuddin SZ, Gallo RC, Wong-Staal F. 1990. HIV-1的
Tat蛋白刺激來(lái)源于艾滋患者的卡波西肉瘤損傷的細(xì)胞的生長(zhǎng)(Tat proteinof HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi's sarcoma lesions of AIDspatients).自然(Nature) 345:84-86.
F紐drich, M., Fletcher, M.A.和Dobson, CM. (2001)來(lái)自肌肉肌紅蛋白的淀 粉狀蛋白原纖維(Amyloid fibrils from muscle myoglobin).自然(Nature) 410:165-166.
Ferreira， S. T.禾口 De Felice, F. G. (2001) PABMB講座。蛋白動(dòng)力學(xué)、折疊和 錯(cuò)誤折疊從基礎(chǔ)物理化學(xué)到人構(gòu)象疾病(PABMB Lecture. Protein dynamics, folding and misfolding: from basic physical chemistry to human conformational diseases) . FEBS Lett. 498:129-134.
Findeis, M.A. (2000)發(fā)現(xiàn)和表征淀粉狀蛋白卩-肽多態(tài)性的抑制劑的途徑 (Approaches to discovery and characterization of inhibitors of amyloid
(3，peptide polymerization) . Biochim. Biophys. Acta 1502:76-84. 綜述 (Review).
Forloni等,"朊病毒蛋白片段的神經(jīng)毒性"("Neurotoxicity of a prion protein fragment",自然(Nature) 362:543-546 (1993)
Frenkel和Solomon, PNAS， 99:5675-5679 (2002)
Frenkel等，"阿爾茨海默|3-淀粉狀蛋白肽的N端EFRH序列代表其抗聚集 抗體的表位"("N-terminal EFRH sequence of Alzheimer's (3-amyloid peptide represents the epitope of its anti-aggregating antibodies"),神經(jīng)免疫學(xué)雜志(J Neuroimmimology) 88 : 85-90 (1998)
Gajdusek,科學(xué)(Science) 197:943-960(1991)
Gardner JM， Hynes RO. 1985.纖連蛋白與其在血小板上的受體的相互作用(Interaction of fibronectin with its receptor on platelets).細(xì)胞(Cell) 42:439-48.
Gartner TK， Bennett JS. 1985.纖連蛋白的細(xì)胞附著位點(diǎn)的四肽類似物抑制 血小板聚集和凝血因子I與活化的血小板的結(jié)合(The tetrapeptide analog of the cell attachment site of fibronectin inhibits platelet aggregation and fibrinogen binding to activated platelets).生物^f七學(xué)雜;志(J Biol Chem) 260:11891-94.
Goate等,自然(Nature) 349:704(1991)
Goedert, M., Spillantini, M. G.和Davies， S. W. (1998)在神經(jīng)變性疾病中的 絲狀神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)含體(Filamentous nerve cell inclusions in neurodegenerative diseases).現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Neurobiol.) 8:619-632.
Gonzalez de Aguilar, J. L., A. Echaniz-Laguna,等.(2007)."肌萎縮性側(cè)索硬化 病條條大路通羅馬"("Amyotrophic lateral sclerosis: all roads lead to Rome.")神經(jīng)化學(xué)雜志(JNeurochem) 101 (5) : 1153-60.
Greenwood, J., A. E. Willis和R. N. Perham (1991)."在絲狀噬菌體上的外源 肽的多個(gè)展示來(lái)自瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白的肽作為抗原"("Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage: Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens.")分子生物學(xué)雜 志(Journal of Molecular Biology) 220(4) : 821-827.
Guijarro， J丄，Sunde， M., Jones, J.A., Campbell, I. D.和Dobson, CM. (1998) SH3結(jié)構(gòu)域的淀粉狀蛋白原纖維形成(Amyloid fibril formation by an SH3 domain).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl Acad. Sci. USA) 95:4224-4228.
Hardy， TINS, 20:154 (1997)Harper, J. D., Wong， S. S., Lieber, CM.和Lansbury, R T. Jr (1999) A |3淀粉狀
蛋白原絲的裝配關(guān)于阿爾茨海默病的可能的早期事件的體外模型
(Assembly of A (3 amyloid protofibrils: an in vitro model for a possible early event in Alzheimer's disease).生物化學(xué)(Biochemistry) 38:8972-8980.
Hart, S. L.， A. M. Knight，等.(1994)."通過(guò)展示環(huán)形包含Arg-Gly-Asp的肽 的絲狀噬菌體的細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)在化"("Cell binding and internalization by filamentous phage displaying a cyclic Arg-Gly-Asp-containing peptide.")生物 化學(xué)雜志G Biol Chem) 269(17): 12468-74.
Hart, S. L.， A. M. Knight, R. P. Harbottle，等.(1994)."通過(guò)展示環(huán)形包含 Arg-Gly-Asp的肽的絲狀噬菌體的細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)在化"("Cell binding and internalization by filamentous phage displaying a cyclic Arg-Gly-Asp-containing peptide.")生物化學(xué)雜志(J Biol Chem) 269 (17) :12468-74.
Horiuchi和Caughey,"正常朊病毒蛋白通過(guò)定位結(jié)構(gòu)域?qū)ΠW病形式的特異 性結(jié)合起始其向蛋白酶抗性狀態(tài)轉(zhuǎn)化"("Specific binding of normal prion protein to the scrapie form via a localized domain initiates its conversion to the protease-resistant state") , EMBO雜志(EMBO J)18:3193- 3203 (1999)
Ingram, D. K. (2001)對(duì)于阿爾茨海默病的疫苗開(kāi)發(fā)令人興奮的好消息 (Vaccine development for Alzheimer's disease: a shot of good news).神經(jīng) 科學(xué)趨勢(shì)(Trends Neurosci.) 24:305-307.
Ivanenkov, V. V., F. Felici和A. G. Menon (1999b)."向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)耙向 遞送多價(jià)噬菌體展示載體"("Targeted delivery of multivalent phage display vectors into mammalian cells.") Biochim Biophys Acta 1448 (3) : 463-72Ivanenkov， V., F. Felici和A. G. Menon (1999a)."噬菌體展示載體在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞內(nèi)的攝入和細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)"("Uptake and intracellular fate of phage display vectors in mammalian cells.") Biochim Biophys Acta 1448(3) : 450-62.
Jones, R. (2001)阻斷朊病毒轉(zhuǎn)化。集萃(Blocking prion conversion-Highlights.) 自然神經(jīng)科學(xué)綜述(Nat.Rev.Neurosci.) 2:605.
Mien, J. P.和J. Kriz (2006)."肌萎縮性側(cè)索硬化病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型" ("Transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.") Biochim Biophys Acta 1762 (11-12): 1013-24.
Kanyo等，"抗體結(jié)合限定參與PrPC- -〉PrPSc構(gòu)象改變的表位的結(jié)構(gòu)" ("Antibody binding defines a structure for an epitope that participates in the PrPC- ->PrPSc conformational change"),分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol.) 293:855-863 (1999)
Koivunen E, Wang B, Ruoslahti E. 1995.展示具有不同的環(huán)大小的環(huán)形肽 的噬菌體文庫(kù)RGD-引導(dǎo)的整聯(lián)蛋白的配體特異性(Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring size: ligand specificities of the RGD-directedintegrins).生物技術(shù)(Bio/Technology) 13:265-70.
Korth， C, May, B.C.， Cohen， R E.和Prusiner, S. B. (2001)吖啶和吩噻嗪衍 生物作為朊病毒疾病的藥物治療齊U (Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease).美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 98:9836-9841.
Lee和Jameson (2005)垂體疾病的基因治療(Gene Therapy of pituitary diseases),內(nèi)分泌學(xué)雜志(J.Endocrinol.) 185(3)353-362
LeVine H. (1993).合成的阿爾茨海默J3-淀粉狀蛋白肽的硫黃素T相互作用檢測(cè)溶液中的淀粉狀蛋白聚集("Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution."蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.) 2(3) :404-10.
Lomakin， A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirschner, D.A.禾卩Teplow, D. B. (1996)關(guān)于淀粉狀蛋白P-蛋白原纖維的成核和生長(zhǎng)，核的檢測(cè)和速率常量 的定量(On the nucleation and growth of amyloid p-protein fibrils, detection of nuclei and quantitation of rate constants).美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)乎艮(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 93:1125-1129.
Maggio JE, Mantyh PW，腦淀粉狀蛋白-a的物理化學(xué)觀察(Brain amyloid-a physicochemical perspective) 月畝病理學(xué)(Brain Pathol.) Apr; 6(2) : 147-62 (1996)
Masliah, E.等.(2000)在a-突觸核蛋白小鼠中的多巴胺能損失和內(nèi)含體形 成；神經(jīng)變性病癥的日音不(Dopaminergic loss and inclusion body formation in a-synuclein mice; implications for neurodegenerative disorders).禾斗學(xué) (Science) 287(5456), 1265-1269.
Mathison等，藥物耙點(diǎn)雜志(J. Drug Target) , 5(6):415-441 (1998)
Matsumoto, G.， A. Stojanovic，等.(2005)."肌萎縮性側(cè)索硬化病-相關(guān)的 Cu/Zn超氧化物歧化酶1聚集體的結(jié)構(gòu)特征和神經(jīng)毒性"("Structural properties and neuronal toxicity of amyotrophic lateral sclerosis-associated Cu/Zn superoxide dismutase 1 aggregates.")細(xì)胞生物學(xué)雜志(J Cell Biol) 171 (1) : 75-85.
Monaci R,等.,現(xiàn)代分子治療觀點(diǎn)(Curr Opin Mol Ther.) , 3(2): 159-69 (2001)Mountain (2000)基因治療第一個(gè)十年(Gene Therapy: the first decade), 生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotechnol.) 18 (3) : 119-128
Mullan等,自然遺傳學(xué)(Nature Genet.) 1:345 (1992)
Murrell等，科學(xué)(Science) 254:97(1991)
O'Neil, K. T., R. H. Hoess， S. A. Jackson,等.(1992)."從構(gòu)象限制性噬菌體肽 文庫(kù)鑒定關(guān)于GPIIb/IIIa的新型肽拮抗劑"("Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library."蛋白質(zhì)(Proteins) 14:509-515.
Pan等，"在癢病朊病毒蛋白形成中的ct-螺旋向P-折疊特征的轉(zhuǎn)化" ("Conversion of alpha-helices into beta-foldings features in the formation of the scrapie prion proteins"),美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:10962-10966(1993)
Peretz等,"在癢病同種型形成中起重要作用的朊病毒蛋白N端的構(gòu)象轉(zhuǎn)化" ("A conformational transition at the N terminus of the prion protein features in formation of the scrapie isoform"),分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol) 273:614-622(1997)
Pierschbacher MD, Ruoslahti E. 1984a.纖連蛋白的細(xì)胞附著活性可以由該 分子的小片段復(fù)制 (The cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small fragments of the molecule). 自然(Nature) 309:30-33
Pierschbacher MD, Ruoslahti E. 1984b.保留促進(jìn)附著活性的纖連蛋白細(xì)胞 識(shí)另ll位點(diǎn)的變體(Variants of the cell recognition site of fibronectin that retain attachment-promoting activity).美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)t艮(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 81:5985-88Plow EF, Pierschbacher MD, Ruoslahti E, Marg證ie GA, Ginsberg MH. 1985. 含有Arg-Gly-Asp的肽對(duì)凝血因子I和與血小板結(jié)合的馮維勒布蘭德因子 的作用(The effect of Arg-Gly-Asp containing peptides on fibrinogen and von Willebrand factor binding to platelets).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci.USA) 2:8057-61.
Raso, S. W. & King, J. K. (2000)蛋白折疊和人類疾病(Protein folding and human disease).在蛋白折疊機(jī)審1」(In Mechanisms of Protein Folding)中 (Pain R. H.，編.)分子生物學(xué)系列的邊緣(Frontiers in Molecular Biology Series),第406-428頁(yè).牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press),牛津.
Rochet, J. C.和Lansbury, P. T. Jr (2000)淀粉狀蛋白原纖維形成主題和變 化(Amyloid fibrillogenesis: themes and variations).現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)觀點(diǎn) (Curr. Opin. Struct. Biol.) 10:60-68.
Ruoslahti, E. (1996). RGD和其它關(guān)于整聯(lián)蛋白的識(shí)別序列(RGD and other recognition sequences for integrins).細(xì)胞禾口發(fā)育生物學(xué)綜述年干U(Ann. Rev. Cell and Devel. Biol.) 2:697-715.
Scherzinger， E., Lurz, R., Turmaine, M., Mangiarini, L., Hollenbach, B., Hasenbank, R.， Bates, G. P.， Davies, S. W" Lehrach, H.和Wanker, E. E. (1997) 亨廷頓蛋白編碼的多谷氨酰胺擴(kuò)展蛋白在體外和體內(nèi)形成淀粉狀蛋白樣 蛋白聚集體(Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo).細(xì)胞(Cell) 90:549-558.
Schlunegger, M. P., Bennett, M丄禾Q Eisenberg， D. (1997)通過(guò)3D結(jié)構(gòu)域交 換形成低聚體蛋白裝配和錯(cuò)誤裝配的模型(Oligomer formation by 3D domain swapping: a model for protein assembly and misassembly ).高級(jí)蛋白 質(zhì)化學(xué)(Adv. Protein Chem.) 50:61-122.Selvaggini等，"與朊病毒蛋白殘基106-126同源的蛋白酶抗性、淀粉樣變 禾口神經(jīng)毒性肽的分子特征"("Molecular characteristics of a protease-resistant, amyloidogenic and neurotoxic peptide homologous to residues 106-126 of the prion protein")，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊 (Biochem Biophys Res Commun ) 194:13 80-13 86 (1993)
Serpell， L. C. (2000)阿爾茨海默淀粉狀蛋白原纖維結(jié)構(gòu)和裝配 (Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly) . Biochim. Biophys. Acta 1502:16-30.
Silen和Agard，"a-溶解蛋白酶前區(qū)域在體內(nèi)激活蛋白酶結(jié)構(gòu)域不需要物理 連接"("The alpha-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo"), 自然(Nature) 341:462-464 (1989)
Soto, C.和Saborio, G. P. (2001)朊病毒通過(guò)構(gòu)象改變進(jìn)行疾病傳播和疾病 治療(Prions: disease propagation and disease therapy by conformational transmission).分子醫(yī)學(xué)趨勢(shì)(Trends Mol. Med.) 7:109-114.
Soto, C. (2001)蛋白錯(cuò)誤折疊和疾?。坏鞍字匦抡郫B和治療(Protein misfolding and disease; protein refolding and therapy ) . FEBS Lett. 498:204-207.
Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R.禾口 Goedert, M. (1997)在雷維小體中的a-突觸核蛋白(a-synuclein in Lewy bodies).自然(Nature) 388:839-840.
Stefanidakis禾P Koivunen,肽介導(dǎo)的治療劑和成像劑向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的 遞送 (Peptide-mediated delivery of therapeutic and imaging agents intomammalian cells)，現(xiàn)代藥物設(shè)計(jì)(Curr. Pharm. Des.) (2004) 10 (24): 3033-3044
Suzuki S, Oldberg A, Hayman Pierschbacher MD， Ruoslahti E. 1985.從 cDNA推導(dǎo)的人玻連蛋白的完整氨基酸序列。在玻連蛋白和纖連蛋白細(xì)胞 中附著"(立點(diǎn)的相〈以'性(Complete amino acid sequence of human vitronectin deduced from cDNA. Similarity of cell attachment sites in vitronectin and fibronectin) . EMBO雜志 (EMBOJ) .4:2519-24.
Tagliavini等，"與朊病毒蛋白殘基106-147同源的合成肽在體外形成淀粉 狀蛋白樣原纖維"("Synthetic peptides homologous to prion protein residues 106-147 form amyloid-like fibrils in vitro"),美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90:9678-9682 (1993)
Taylor, J. P.， J. Hardy,等.(2002)."在神經(jīng)變性疾病中的毒性蛋白"("Toxic proteins in neurodegenerative disease.")禾斗學(xué)(Science) 296(5575): 1991-5.
Turmaine, M,, Raza, A., Mahal, A., Mangiarini， L., Bates, G. R禾卩Davies， S. W. (2000)在亨廷頓疾病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的Nonapoptotic神經(jīng)變性 (Nonapoptotic neurodegeneration in a transgenic mouse model of Huntington's disease).美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 97:8093-8097.
Umshitani， M., S. A. Ezzi,等.(2007)."在肌萎縮性側(cè)索硬化病小鼠模型中用 突變體超氧化物歧化酶免疫的治療作用"("Therapeutic effects of immunization with mutant superoxide dismutase in mice models of amyotrophic lateral sclerosis.")美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)手艮(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 104(7) :2495-500.
Uversky, V.N., Li, J.和Fink， A. L. (2001)關(guān)于在a-突觸核蛋白原纖維形成中的部分折疊中間體的證據(jù)(Evidence for a partially folded intermediate in a-synuclein fibril formation ). 生物化學(xué)雜志 (J. Biol. Chem.) 276:10737-10744.
Vogel BE, Lee S-J, Hildebrand A， Craig W, Pierschbacher M，等.1993.由 av|35整聯(lián)蛋白與HIVTat蛋白和玻連蛋白的堿性結(jié)構(gòu)域結(jié)合例證的新整聯(lián) 蛋白特異性(A novel integrin specificity exemplified by binding of the av(35 integrin to the basic domain of the HIV Tat protein and vitronectin).細(xì)胞生物 學(xué)雜志(J. Cell Biol.) 121:461-68.
Walsh, D. M. , Hartley, D. M., Kusumoto, Y" Fezoui, Y" Condron, M. M, Lomakin, A.， Benedek, G. B.， Selkoe, D丄禾B Teplow， D. B. (1999)淀粉狀蛋 白卩-蛋白原纖維形成。原絲中間體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性(Amyloid p-protein fibrillogenesis. Structure and biological activity of protofibrillar intermediates). 生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 274:25945-25952.
Watanabe, M.， M. Dykes-Hoberg,等.(2001)."在突變體SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠和 肌萎縮性側(cè)索硬化病神經(jīng)組織中的蛋白聚集的組織學(xué)證據(jù)"("Histological evidence of protein aggregation in mutant SOD1 transgenic mice and in amyotrophic lateral sclerosis neural tissues.")神經(jīng)生物學(xué)疾病(Neurobiol Dis) 8(6): 933-41.
Weeks BS, Desal K， Lowenstein PM, Klo加an ME, Klo加an PE，等.1993.鑒 定HIV-1 Tat蛋白中的新細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)域及其90-kDa細(xì)胞表面結(jié)合蛋白 (Identification of a novel cell attachment domain in the HIV-1 Tat protein and its 90-kDa cell surface binding protein).生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 268:5279-84.
Wilesmith禾卩Wells,微生物學(xué)和免疫學(xué)的現(xiàn)代主題(Curr Top Microbiol Immunol) 172:21-38 (1991)Wong, P. C, H. Cai ,等.(2002)."神經(jīng)變性疾病的遺傳工程小鼠模型" ("Genetically engineered mouse models of neurodegenerative diseases.") 自 然神經(jīng)科學(xué)(NatNeurosci) 5(7): 633-9.
Wood, J. D.， T. P. Beaujeux，等.(2003)."在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥中的蛋白聚集" ("Protein aggregation in motor neurone disorders.")神經(jīng)病理學(xué)禾口應(yīng)用神經(jīng) 生物學(xué)(NeuropatholApplNeurobiol) 29 (6) :529-45.
Yamada KM, Kennedy DW. 1984.黏附蛋白功能的二元性質(zhì)纖連蛋白及其 生物學(xué)活性肽片段可以自動(dòng)抑制纖連蛋白功能(Dualistic nature of adhesive protein function: Fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function).細(xì)胞生物學(xué)雜志(J. Cell Biol.) 99:29-36
Young AA.等，F(xiàn)EBS Lett, 343(3) :237-41 (1994)
權(quán)利要求
1.抑制或治療與蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向需要其的哺乳動(dòng)物受試者施用有效量的治療劑，所述治療劑攜帶被展示的包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)，從而抑制或治療所述疾病。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述治療劑是在其表面上展示包括所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的所述肽序列的絲狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體不 展示除了所述肽序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗原。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、 fl、禾口 fd 噬菌體、以及它們的混合物組成的組。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述絲狀噬菌體是M13。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中約150個(gè)拷貝的所述肽序列被展示在所述 絲狀噬菌體的表面上。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述絲狀噬菌體是保留其絲狀結(jié)構(gòu)的UV-滅活的絲狀噬菌體。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中有效量的所述絲狀噬菌體是鼻內(nèi)施用的。
8. 權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中包括所述RGD細(xì)胞黏附序列的所述肽序 列是環(huán)形的。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID N0:1 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO: 2 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是阿爾茨海默病。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是具有雷維小體的癡呆癥。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中所述疾病是帕金森病。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是肌萎縮性側(cè)索硬化病。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物受試者是人。
18. 抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成的方法，所述方法 包括使治療劑與能夠形成蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)肽或多肽 接觸，以抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成，所述治療劑攜帶 被展示的包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在 化在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述治療劑是在其表面上展示包括所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的所述肽序列的絲狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體 不展示除了所述肽序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗原。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、 fl、和fd 噬菌體、以及它們的混合物組成的組。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述絲狀噬菌體是M13。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中約150個(gè)拷貝的所述非絲狀噬菌體肽序 列被展示在所述絲狀噬菌體的表面上。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中所述絲狀噬菌體是保留其絲狀結(jié)構(gòu)的 UV-滅活的絲狀噬菌體。
24. 權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
25. 權(quán)利要求18的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中包括所述RGD細(xì)胞黏附序列的所述肽 序列是環(huán)形的。
27. 權(quán)利要求63的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:l 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO: 2 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
29. 解聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的方法，所述 方法包括使治療劑與預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)纖維狀內(nèi)含體或聚集體接觸，以解 聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體，所述治療劑攜帶被展示的包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì) 胞內(nèi)。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述治療劑是在其表面上展示包括所述 哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的所述肽序列的絲狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體 不展示除了所述肽序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗原。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、 fl、和fd 噬菌體、以及它們的混合物組成的組。
32. 權(quán)利要求30的方法，其中所述絲狀噬菌體是M13。
33. 權(quán)利要求30的方法，其中約150個(gè)拷貝的所述非絲狀噬菌體肽序 列被展示在所述絲狀噬菌體的表面上。
34. 權(quán)利要求30的方法，其中所述絲狀噬菌體是保留其絲狀結(jié)構(gòu)及其 解聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的能力的UV-滅活的絲 狀噬菌體。
35. 權(quán)利要求30的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
36. 權(quán)利要求29的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中包括所述RGD細(xì)胞黏附序列的所述肽 序列是環(huán)形的。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:l 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
39. 權(quán)利要求37的方法，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:2 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
40. —種藥物組合物，其包括藥用載體或賦形劑和作為活性成分的有 效量的治療劑，所述治療劑攜帶被展示的包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽 序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)。
41. 權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述治療劑是在其表面上展示包 括所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的所述肽序列的絲狀噬菌體，其中所述絲狀 噬菌體不展示除了所述肽序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗原。
42. 權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述絲狀噬菌體選自由M13、fl、fd、以及它們的混合物組成的組。
43. 權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述絲狀噬菌體是M13。
44. 權(quán)利要求41的藥物組合物，其中約150個(gè)拷貝的所述非絲狀噬菌 體肽序列被展示在所述絲狀噬菌體的表面上。
45. 權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述絲狀噬菌體是保留其絲狀結(jié) 構(gòu)的UV-滅活的絲狀噬菌體。
46. 權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
47. 權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列是 Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
48. 權(quán)利要求47的藥物組合物，其中包括所述RGD細(xì)胞黏附序列的 所述肽序列是環(huán)形的。
49. 權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:l的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
50. 權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO: 2的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
51. 治療劑用于制備藥物的應(yīng)用，所述治療劑攜帶被展示的包括哺乳 動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列，以能夠?qū)⑺鲋委焺﹥?nèi)在化在細(xì)胞內(nèi)。
52. 權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述治療劑抑制或治療與蛋白纖維狀內(nèi) 含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成相關(guān)的疾病。
53. 權(quán)利要求52的應(yīng)用，其中所述疾病是阿爾茨海默病、具有雷維小 體的癡呆癥、帕金森病或肌萎縮性側(cè)索硬化病。
54. 權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述治療劑抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚 集體的形成。
55. 權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述治療劑解聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白 纖維狀內(nèi)含體或聚集體。
56. 權(quán)利要求51-55中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述治療劑是在其表面上 展示包括所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的所述肽序列的絲狀噬菌體，并且其 中所述絲狀噬菌體不展示除了所述肽序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗 原。
57. 權(quán)利要求51-56中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序 列是Arg-Gly-Asp (RGD)細(xì)胞黏附序列。
58. 權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中包括所述RGD細(xì)胞黏附序列的所述肽 序列是環(huán)形的。
59. 權(quán)利要求58的應(yīng)用，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:l 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
60. 權(quán)利要求58的應(yīng)用，其中所述肽序列包括序列為SEQ ID NO:2 的所述RGD細(xì)胞黏附序列。
全文摘要
攜帶包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞黏附序列的肽序列的治療劑可以用來(lái)抑制或治療與細(xì)胞內(nèi)形成蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體相關(guān)的疾病，用來(lái)抑制蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體的細(xì)胞內(nèi)形成，并且用來(lái)解聚預(yù)先形成的細(xì)胞內(nèi)蛋白纖維狀內(nèi)含體或聚集體。在其表面上展示非絲狀噬菌體RGD細(xì)胞黏附序列而不是除所述RGD細(xì)胞黏附序列之外的抗體或非絲狀噬菌體抗原的絲狀噬菌體是這樣的治療劑的優(yōu)選實(shí)施方案。
文檔編號(hào)A61K35/76GK101553567SQ200780034953
公開(kāi)日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2007年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者奧代德·格林斯泰因, 諾亞·沙侖, 貝卡·所羅門(mén) 申請(qǐng)人:臺(tái)拉維夫大學(xué)拉莫特