專利名稱：Hsv-1和hsv-2疫苗和其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供向個體接種疫苗以對抗單純皰疹病毒(HSV)感染和與其有關(guān)的病癥 和癥狀、和在個體中阻止下列病狀、抑制下列病狀、降低下列病狀的發(fā)生率和阻抑下 列病狀的方法HSV感染、神經(jīng)元病毒擴散、帶狀皰疹樣損傷形成、皰疹性眼睛疾 病、皰疹介導(dǎo)的腦炎和生殖器潰瘍疾病，所述方法包含使所述個體與HSV突變體菌 株接觸的步驟，所述HSV突變體菌株在編碼gE、 gl、 Us9或其它蛋白質(zhì)的基因中含 有失活突變、任選地在編碼gD的基因中含有失活突變。
背景技術(shù)：
人類I型或II型單純皰疹病毒(HSV)感染通常是通過密切接觸獲得并造成口腔和 生殖器損傷。HSV-1通常導(dǎo)致口腔潰瘍且HSV-2通常導(dǎo)致生殖器潰瘍，但相反的情 況也會發(fā)生。感染HSV-l或HSV-2的人將永遠是此病毒的攜帶者。在最初感染后， 損傷痊愈且HSV以休眠潛伏狀態(tài)存在于感覺神經(jīng)元中。HSV周期性地自潛伏受感染 的神經(jīng)元復(fù)活并導(dǎo)致在皮膚表面上形成新潰瘍。新生嬰兒和免疫抑制個體尤其易受 HSV感染攻擊，通常會導(dǎo)致彌散性感染并具有致命后果。眼睛HSV感染是此病毒的 另一種嚴(yán)重后果，其是失明的最主要原因。此外，生殖器HSV感染使得HIV傳播速 率增加兩倍。因此，迫切需要阻止HSV傳播的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供向個體接種疫苗以對抗單純皰疹病毒(HSV)感染和與其有關(guān)的病癥 和癥狀、和在個體中阻止下列病狀、抑制下列病狀、降低下列病狀的發(fā)生率和阻抑下 列病狀的方法HSV感染、神經(jīng)元病毒擴散、帶狀皰疹樣損傷形成、皰疹性眼睛疾 病、皰疹介導(dǎo)的腦炎和生殖器潰瘍疾病，所述方法包含使所述個體與HSV突變體菌 株接觸的步驟，所述HSV突變體菌株在編碼gE、 gl、 Us9或其它蛋白質(zhì)的基因中含 有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在個體中治療單純皰疹病毒(HSV)感染、減少其發(fā)病、改善其癥狀、改善其繼發(fā)性癥狀、降低其發(fā)生率、延長至其復(fù)發(fā)的潛伏期的方法， 所述方法包含使所述個體與包含突變體單純皰疹病毒疫苗菌株的組合物接觸的步驟， 其中所述突變體HSV疫苗菌株在Us8基因中包含失活突變。在一個實施例中，突變 體HSV疫苗菌株是HSV-Li汰，—而在另一實施例中，突變體HSV疫苗菌株是HSV-2 菌株。在一個實施例中，HSV感染是HSV-1感染，而在另一實施例中，HSV感染是 HSV-2感染。
在一個實施例中，突變體菌株在所述個體的皮膚組織中具有復(fù)制能力。在一個實 施例中，所述突變體菌株的神經(jīng)元病毒擴散被阻止。
在一個實施例中，所述突變體HSV疫苗菌株在Us7基因中、或在另一實施例中 于Us9基因中、或在另一實施例中于Us7和Us9基因二者中進一步包含額外失活突 變。在一個實施例中，所述突變體HSV疫苗菌株在編碼病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì) 的基因中進一步包含額外失活突變，所述基因在一個實施例中是Us5，在另一實施例 中是Us4，在另一實施例中是UL53，在另一實施例中是ULIO，或在另一實施例中是 Us5、 Us4、 UL53、和UL10的任何組合。在一個實施例中，所述突變體HSV疫苗菌 株在編碼病毒入侵所需要的膜蛋白質(zhì)的基因中進一步包含額外失活突變，所述基因在 一個實施例中是Us6。
在一個實施例中，HSV感染是生殖器HSV感染，而在另一實施例中，HSV感染 是HSV腦炎，而在另一實施例中，HSV感染是眼睛疾病，而在另一實施例中，HSV 感染是唇部HSV感染，而在另一實施例中，HSV感染是上述的任何組合。
在一個實施例中，個體已感染HSV，而在另一實施例中，個體具有感染HSV的 風(fēng)險，所述個體在一個實施例中是新生兒個體，在另一實施例中是免疫受損個體，在 另一實施例中是老年個體，且在另一實施例中是免疫受損新生兒或免疫受損老年個 體。
在一個實施例中，所述方法在個體中誘導(dǎo)抗HSV免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答在一 個實施例中是抗HSV中和抗體應(yīng)答。
在一個實施例中，接觸步驟包含表皮注射，在另一實施例中包含肌內(nèi)注射，在另
一實施例中包含皮下注射，且在另一實施例中包含呼吸系統(tǒng)內(nèi)粘膜注射。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在編碼gE蛋白質(zhì)的基因中包含第一失活突變且包 含第二失活突變的經(jīng)分離突變體HSV-1菌株。在另一實施例中，編碼gE蛋白質(zhì)的基 因是Us8基因。在另一實施例中，第二失活突變是在Us7基因中。在另一實施例中， 第二失活突變是在Us9基因中。在另一實施例中，第二失活突變是在業(yè)內(nèi)已知的任何 其它HSV-1基因中。在另一實施例中，經(jīng)分離突變體HSV-l菌株在編碼gE蛋白質(zhì)、 gl蛋白質(zhì)、和Us9蛋白質(zhì)的基因中含有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在編碼gE蛋白質(zhì)的基因中包含第一失活突變且包 含一或多種額外失活突變的經(jīng)分離突變體HSV-2菌株。在一個實施例中，編碼gE蛋 白質(zhì)的基因是Us8基因。在一個實施例中，額外失活突變是在病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì)中。在另一實施例中，額外失活突變是在Us7基因中。在另一實施例中，額外失 活突變是在Us9基因中。在另一實施例中，額外失活突變是在Us5、 Us4、 UL53、 UL10 或其組合中。在一個實施例中，額外失活突變是在病毒入侵所需要的膜蛋白質(zhì)中。在 另一實施例中， 卜-失活突變是在118—6中i在另一實施例中，額外失活突變是在業(yè)內(nèi) 已知的任何其它HSV-2基因中。在另一實施例中，經(jīng)分離突變體HSV-2菌株在編碼 gE蛋白質(zhì)、gl蛋白質(zhì)、和Us9蛋白質(zhì)的基因中含有失活突變。


圖l.HSV在神經(jīng)元中擴散。
圖2.小鼠側(cè)腹的典型HSV-1感染。
圖3.小鼠側(cè)腹/疫苗接種模型中的皮膚疾病譜。
圖4.感染HSV-1 (gE無效)疫苗或有毒HSV-1 (a救gE無效)后小鼠的存活。
圖5.感染HSV-1
(gE無效) 疫苗或有毒HSV-1 (拯救gE無效) 后的原發(fā)性皮膚疾病。 圖6.感染HSV-l(gE無效)疫苗或有毒HSV-1 (超救gE無效)后的繼發(fā)性(帶狀皰疹樣) 皮膚疾病。
圖7.在感染疫苗或有毒HSV-1后皮膚中的病毒滴度。 圖8.在感染疫苗或野生型HSV-1后皮膚中的HSV檢測。 圖9.在感染疫苗或有毒HSV-1后背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中的病毒滴度。 圖10.用10SpfuWTHSV-l(NS)攻擊后接種疫苗或模擬接種疫苗小鼠的存活。 圖11.用105pfuWTHSV-1 (NS)攻擊的接種疫苗小鼠中的原發(fā)性皮膚疾病評分。 圖12.用105 pfuWT HSV-1 (NS)攻擊的接種疫苗小鼠皮膚中的病毒滴度。 圖13.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻擊的模擬接種疫苗或接種疫苗小鼠皮膚中的 HSV檢測。
圖14.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻擊的接種疫苗小鼠中的繼發(fā)性皮膚疾病。
N=3。
圖15.用105 pfu WT HSV-1 (NS)攻擊的模擬接種疫苗或接種疫苗小鼠的神經(jīng)節(jié) 病毒滴度。N=3。
圖16.疫苗保護神經(jīng)節(jié)免于潛伏感染。
圖17.接種5xl05 pfu HSV-lAgE疫苗對小鼠對抗105 pfu HSV-2(2.12)側(cè)腹攻擊的 交叉保護。"Mock Vac"表示模擬接種疫苗；"DgEVac"表示接種5xlC)5pfuHSV4 AgE疫苗。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差("SEM")。
圖18.接種5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗對小鼠對抗5 x 105 pfu HSV-1 (KOS)側(cè)腹 攻擊后潛伏的保護。誤差棒代表SEM。
圖19.接種5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗對小鼠對抗105 pfu HSV-l(NS)陰道攻擊 后死亡、明顯疾病和大量病毒復(fù)制的保護。A.上圖-存活曲線；下圖-借助陰道擦拭物評價的病毒滴度。B.攻擊后第8天小鼠的照片。誤差棒SEM。
圖20.通過不同途徑("Ep.Scar.":表皮劃痕；"SubQ":皮下；IM:肌內(nèi)) 接種5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗對小鼠對抗105 pfu HSV-l(NS)側(cè)腹攻擊的保護。"DgE Vac"表示HSV-lAgE;誤差皿表SEM。——
圖21.通過不同途徑接種5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗在小鼠中誘導(dǎo)中和抗體應(yīng) 答。所述百分比是與來自模擬接種疫苗小鼠的血清進行比較。n-3(表皮劃痕與皮下)， n=2 (肌內(nèi))， 一式兩份實施分析。誤差棒代表SEM。
圖22.接種5 x 105 pfu HSV-lAgE疫苗對小鼠對抗105 pfu HSV-1 (NS、 F或17) 側(cè)腹攻擊的保護。誤差棒代表SEM。
圖23.接種5 x 105pfu HSV-1 AgE疫苗對小鼠對抗10" pfu HSV-1 (NS)側(cè)腹攻 擊的保護。誤差棒代表SEM。
圖24. A. HSV-1(NS) gE (SEQ ID NO: 2)與HSV-2(HG52) gE (SEQ ID NO: 6)的比 對。B.產(chǎn)生gE-2缺失的策略。
圖25. Us區(qū)域的額外缺失。繪示HSV-2基因組(155 kb總基因組大小)Us區(qū)段 內(nèi)4.5 kb區(qū)域的示意圖。圖中標(biāo)出與HSV-lAgE疫苗菌株中缺失的區(qū)域等效的區(qū)域 和提議的額外缺失區(qū)域。
圖26. A.在受感染細胞的提取物中實施蛋白質(zhì)印跡法以檢測gD (Us6)和gl (Us7)。 B. KOS-gDA3C病毒在活體外的穩(wěn)定性。KOS或KOS-gDA3C的經(jīng)PCR擴增 gD基因片段的Sspl消化。C. KOS-gDA3C突變體病毒在活體內(nèi)的穩(wěn)定性。將自 KOS-gDA3C感染小鼠的DRG獲得的經(jīng)PCR擴增gD片段用Sspl切割或不切割。
圖27. KOS、 rKOS-gDA3C和KOS-gDA3C病毒至(A)非洲綠猴腎細胞(Vero)、 (B)B78-H1、 (C)A10或(D)C10細胞的入侵。結(jié)果為分別以一式三份實施的三種單獨 感染的平均值+ SE。
圖28.在A10 (A、 C)或C10 (B、 D)細胞中實施的KOS、 rKOS-gDA3C和 KOS-gDA3C的單步驟(A、 B)和多步驟(C、 D)生長曲線。結(jié)果為三種單獨感染的平均 值+ SE。
圖29.鼠科動物側(cè)腹模型中的疾病。在接種5xl05 PFU KOS、 rKOS-gDA3C或 KOS-gDA3C的小鼠中接種位點(A)和帶狀皰疹樣位點(B)的疾病評分。誤差棒代表SE。 C.感染KOS、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C后10天拍的小鼠側(cè)腹的照片。
圖30. DRG中的病毒滴度和基因組拷貝數(shù)。將DRG自感染KOS、 rKOS-gDA3C 或KOS-gDA3C的小鼠中解剖下來并分析其病毒滴度(A)或病毒基因組拷貝數(shù)(B)。結(jié) 果代表平均值+ SE。 '
圖31.先前感染KOS-gDA3C可對抗WT HSV-1攻擊。結(jié)果代表感染后3-7天接 種位點(八)和帶狀皰疹樣位點(8)的平均疾病評分+ SE。 DRG病毒滴度(C)和基因組拷 貝數(shù)(D)是在用NS攻擊后5天測量。結(jié)果代表平均值+ SE。
圖32. KOS-gDA3C感染的小鼠模型。KOS感染上皮細胞(E)并在接種位點處引起疾病。病毒擴散到DRG中的神經(jīng)元(N)中、復(fù)制并擴散到鄰近神經(jīng)元中且隨后傳播回 皮膚中的上皮細胞中導(dǎo)致帶狀皰疹樣疾病。KOS-gDA3C的入侵受損且感染較少上皮 細胞，此導(dǎo)致DRG中較少神經(jīng)元受感染。入侵缺陷也使DRG中受感染的鄰近神經(jīng)元 減少并導(dǎo)致減少的帶狀皰疹樣疾嵐。
具體實施例方式
本發(fā)明提供向個體接種疫苗以對抗單純皰疹病毒(HSV)感染和與其有關(guān)的病癥 和癥狀、和在個體中阻止下列病狀、抑制下列病狀、降低下列病狀的發(fā)生率和阻抑下 列病狀的方法HSV感染、神經(jīng)元病毒擴散、帶狀皰疹樣損傷形成、皰疹性眼睛疾 病、皰疹介導(dǎo)的腦炎和生殖器潰瘍疾病，所述方法包含使所述個體與HSV突變體菌 株接觸的步驟，所述HSV突變體菌株在編碼gE、 gl、 Us9、其它蛋白質(zhì)或其組合的 基因中含有失活突變。在另一實施例中，HSV突變體菌株在編碼gE的基因中包含失 活突變，其在一個實施例中是gE無效突變。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含HSV 突變體菌株的醫(yī)藥組合物，所述HSV突變體菌株在編碼gE的基因中包含失活突變， 其在一個實施例中是gE無效突變。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含HSV突變體菌 株的醫(yī)藥組合物，所述HSV突變體菌株在編碼gE、 gl、 Us9、其它蛋白質(zhì)或其組合 的基因中包含失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供向個體接種疫苗以對抗HSV感染的方法，其包含 使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中HSV-1感染的方法，其包含使所述個 體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含 有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中HSV-2感染的方法，其包含使所述個 體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含 有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中原發(fā)性HSV感染的方法，其包含使所 述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因 中含有失活突變。在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中原發(fā)性HSV-1感染的方 法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋 白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中原發(fā)性 HSV-2感染的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體 菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，術(shù)語"阻止HSV感染"和"阻止原發(fā)性HSV感染"是指傳染 性病毒的滴度降低909fc。在另一實施例中，滴度降低50%。在另一實施例中，滴度降低55%。在另一實施例中，滴度降低60%。在另一實施例中，滴度降低65%。在另 一實施例中，滴度降低70%。在另一實施例中，滴度降低75%。在另一實施例中，滴 度降低80%。在另一實施例中，滴度降低85%。在另一實施例中，滴度降低92%。 在另一實施例中，滴度降低95%。在另一實施例中，滴度降低96%。在另一實施例中， 滴度降低97%。在另一實施例中，滴度降低98%。在另一實施例中，滴度降低999fc。 在另一實施例中，滴度降低99%以上。
在另一實施例中，所述術(shù)語是指病毒復(fù)制程度降低90%。在另一實施例中，復(fù) 制減少50%。在另一實施例中，復(fù)制減少55%。在另一實施例中，復(fù)制減少60%。 在另一實施例中，復(fù)制減少65免。在另一實施例中，復(fù)制減少70%。在另一實施例中， 復(fù)制減少75%。在另一實施例中，復(fù)制減少80%。在另一實施例中，復(fù)制減少85%。 在另一實施例中，復(fù)制減少92%。在另一實施例中，復(fù)制減少95%。在另一實施例中， 復(fù)制減少96%。在另一實施例中，復(fù)制減少97%。在另一實施例中，復(fù)制減少98%。 在另一實施例中，復(fù)制減少99%。在另一實施例中，復(fù)制減少99%以上。
衡量HSV感染的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且在一個實施例中包括 測定皮膚損傷和病毒介導(dǎo)的疾病的外觀和嚴(yán)重程度(實例1和4)。衡量病毒感染的 其它方法實施例闡述于(例如)博格斯(BurgosJS)等人(生殖腺中經(jīng)由血流具有載脂 蛋白E依賴性的I型單純皰疹病毒感染受性別影響(Herpes simplex virus type 1 infection via the bloodstream with apolipoprotein E dependence in the gonads is influenced by gender.),病毒學(xué)期刊(J Virol.) 2005年2月；79(3):1605-12)和帕爾(Parr MB)等人 (陰道內(nèi)投與II型單純皰疹病毒至小鼠中導(dǎo)致數(shù)個神經(jīng)和神經(jīng)外位點感染 (Intravaginal administration of herpes simplex virus type 2 to mice leads to infection of several neural and extraneural sites.),神經(jīng)病毒學(xué)期刊(J Neurovirol.) 2003年12月； 9(6):594-602)。測定HSV復(fù)制和HSV感染程度的其它方法充分闡述于(例如)蘭 比亞斯(Lambiase A)等人(在皰疹性角膜炎動物模型中用神經(jīng)生長因子實施局部治療 (Topical treatment with nerve growth factor in an animal model of herpetic keratitis.)，格拉 芙臨床與實驗眼科學(xué)文獻(Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.)' 2007年5月4日)、 雷馬瓦米(Ramaswamy M)等人(HSV禾fl HIV共感染中的相互影響和處理問題 (Interactions and management issues in HSV and HIV coinfection.)，抗感染治療專家纟宗述 (ExpertRev AntiInfectTher.) 2007年4月；5(2):231-43)、和蔣(JiangC)等人(可降低 單純皰疹病毒DNA聚合酶的持續(xù)合成因子的DNA結(jié)合、降低病毒產(chǎn)率、改變病毒 DNA復(fù)制的動力學(xué)、并降低DNA復(fù)制的保真度的突變(Mutations that decrease DNA binding of the processivity factor of the herpes simplex virus DNA polymerase reduce viral yield, alter the kinetics of viral DNA replication, and decrease the fidelity of DNA replication.),病毒學(xué)期刊，2007年4月；81(7):3495-502)。
依照本文，用本發(fā)明gE無效HSV菌株接種疫畝可防止隨后的有毒HSV感染。 在另一實施例中，接種疫苗可防止由有毒HSV引起的疾病。在另一實施例中，疫苗菌株本身不引起明顯疾病，所述疾病在一個實施例中是皰疹(實例1和4),或在另 一實施例中，疫苗菌株本身導(dǎo)致明顯癥狀。
在一個實施例中，gE中的"失活突變"是指終止HSV神經(jīng)元擴散的突變。在另 一實施例中，所述術(shù)語是指終止HSV的細胞至細胞擴散的突變。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指終止沿軸突擴散。在另一實施例中，擴散是逆行性的(下文中予以定義)。 在另一實施例中，擴散是順行性的(下文中予以定義)。在另一實施例中，順行和逆 行方向二者的擴散均被終止。
在一個實施例中，神經(jīng)元擴散降低90%。在另一實施例中，神經(jīng)元擴散降低60%。 在另一實施例中，降低65%。在另一實施例中，降低70%。在另一實施例中，降低 75%。在另一實施例中，降低80%。在另一實施例中，降低85%。在另一實施例中， 降低95%。在另一實施例中，降低96%。在另一實施例中，降低97%。在另一實施 例中，降低98%。在另一實施例中，降低99%。在另一實施例中，降低99%以上。
在一個實施例中，所述術(shù)語是指終止gE蛋白質(zhì)隔絕宿主抗HSV抗體的能力。 在另一實施例中，gE對抗HSV抗體的隔絕降低90%。在另一實施例中，隔絕降低50%。 在另一實施例中，降低65%。在另一實施例中，降低70%。在另一實施例中，降低 75%。在另一實施例中，降低80%。在另一實施例中，降低85%。在另一實施例中， 降低95%。在另一實施例中，降低96%。在另一實施例中，降低97%。在另一實施 例中，降低98%。在另一實施例中，降低99%。在另一實施例中，降低99%以上。
在一個實施例中，所述術(shù)語是指終止gE蛋白質(zhì)結(jié)合IgG單體的能力。在另一實 施例中，gE對IgG單體的結(jié)合降低90呢。在另一實施例中，結(jié)合降低50%。在另一 實施例中，降低65%。在另一實施例中，降低70%。在另一實施例中，降低75%。 在另一實施例中，降低80%。在另一實施例中，降低85%。在另一實施例中，降低 95%。在另一實施例中，降低96%。在另一實施例中，降低97%。在另一實施例中， 降低98%。在另一實施例中，降低99%。在另一實施例中，降低99呢以上。
在一個實施例中，所述術(shù)語是指終止gE蛋白質(zhì)結(jié)合IgG復(fù)合物的能力。在另一 實施例中，gE對IgG復(fù)合物的結(jié)合降低90免。在另一實施例中，結(jié)合降低50%。在 另一實施例中，降低65%。在另一實施例中，降低70%。在另一實施例中，降低75%。 在另一實施例中，降低80%。在另一實施例中，降低85%。在另一實施例中，降低 95%。在另一實施例中，降低96%。在另一實施例中，降低97%。在另一實施例中， 降低98%。在另一實施例中，降低99%。在另一實施例中，降低99呢以上。
在一個實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸124-508。在另一實施例中， gE中的失活突變包含缺失氨基酸110-500。在另一實施例中，gE中的失活突變包含 缺失氨基酸1-552。在另一實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸l-50。在另一 實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸1-100。在另一實施例中，gE中的失活 突變包含缺失氨基酸1-250。在另一實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸 100-300。在另一實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸1-400。在另一實施例
10中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸200-500。在另一實施例中，gE中的失活突變 包含缺失氨基酸24-71。在另一實施例中，gE中的失活突變包含缺失氨基酸30-508。 在另一實施例中，gE中的失活突變包含缺失約氨基酸40-70。在另一實施例中，gE 中的失活突變包含向編碼gE的基因的一部分中插入非天然序列，其中結(jié)果是所述gE 失活。在另一實施例中，gE中的失活突變包含置換氨基酸殘基，例如極性殘基置換 非極性殘基、非極性殘基置換極性殘基、帶電荷殘基置換不帶電荷殘基、帶正電荷殘 基置換帶負(fù)電荷殘基、或反之亦然或其組合，此已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知。在 另一實施例中，gE中的失活突變基本上由任何一種上文列示突變組成。在另一實施 例中，gE中的失活突變由任何一種上文列示突變組成。在另一實施例中，本發(fā)明對 于第一 HSV菌株所闡述的gE或其它蛋白質(zhì)中的失活突變也可在第二 HSV菌株中對 應(yīng)蛋白質(zhì)的等效位置上突變，其中如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，插入、缺失或置換 的等效位置可通過序列比對來推斷，其中與第一菌株中的突變序列匹配的區(qū)域在第二 菌株中將突變。
在一個實施例中，gD中的"失活突變"是指抑制蛋白質(zhì)/受體相互作用的突變， 所述相互作用在一個實施例中是與HVEM細胞受體、連接蛋白-l細胞受體、或二者 的相互作用，且在另一實施例中，gD中的"失活突變"是指抑制病毒入侵至細胞中、 抑制gB、 gH、和gL下游激活、抑制病毒包膜與細胞膜融合或其組合的突變。在一 個實施例中，gD中的失活突變是在gD肽的氨基端，其在一個實施例中是殘基1-15， 且在另一實施例中，突變可抑制當(dāng)gD結(jié)合HVEM時形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在另一實施例 中，突變是在氨基酸3、 38、或二者處，且在一個實施例中，這些位置上的丙氨酸和 酪氨酸殘基被半胱氨酸殘基代替(A3C/Y38C)以在氨基端產(chǎn)生3-38 二硫鍵和/或固定發(fā) 夾環(huán)。
在一個實施例中，本發(fā)明的失活突變是利用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知的手段來 達成。在一個實施例中，用于本發(fā)明和編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)和用于本發(fā)明方法中的核酸 可通過例如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的任何合成或重組方法來產(chǎn)生?？山柚鶎兕I(lǐng) 域的技術(shù)人員所習(xí)知的技術(shù)對核酸實施進一步修飾以改變生物物理學(xué)或生物學(xué)特性。 例如，核酸可經(jīng)修飾以增加其對核酸酶的穩(wěn)定性(例如，"封端")、或改良其親油性、 溶解性、或與互補序列的親和性。在另一實施例中，可使用轉(zhuǎn)座子來使基因失活突變， 其中在一個實施例中，轉(zhuǎn)座子可為Tn551、邁諾斯(Minos)、赫耳墨斯(Hermes)或騎肩 (piggyback)。在另一實施例中，轉(zhuǎn)座子可為AT-2(基于tyl的轉(zhuǎn)座子，珀金埃爾默(Peridn Elmer);戴維尼(Devine)等人，(1997)基因組研究(GenomeRes.)， 7:551-563) 、 GPS-1 (新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)) 、 GPS-2(新英格蘭生物實驗室)、EZ::tn (基于Tn5的轉(zhuǎn)座子，震中技術(shù)(Epicenter Technologies)) 、 SIF (基于Tn7的轉(zhuǎn)座子， 畢爾瑞(Biery)等人，(2000)核酸研究(Nucl Acid Res) 28:1067-1077)、或Mu (芬蘭酶 (Finnzymes),哈帕(Haapa)等人，(1999)核酸研究13:2777-2784)。在一個實施例中， 可利用來自各轉(zhuǎn)座子突變體的經(jīng)消化DNA的DNA印跡分析來證實轉(zhuǎn)座子插入。在另一實施例中，可利用序列分析、PCR和/或雜交來確定轉(zhuǎn)座子插入。突變也可使用 甲磺酸乙酯(EMS)或輻射來引發(fā)。在另一實施例中，可利用化學(xué)試劑誘變。在其它實 施例中，所述化學(xué)誘變劑可包含影響非復(fù)制DNA的諸如HN02和NH20H等化學(xué)品、 以及影響復(fù)制DNA的諸如吖啶類染料等試劑，已顯示其可導(dǎo)致移碼突變。使用輻射 或化學(xué)試劑產(chǎn)生突變體的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且任何方法均可用于 本發(fā)明方法中(參見，例如，托馬斯布魯克(ThomasD.Brock)，生物技術(shù)工業(yè)微生 物學(xué)教程(Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology),第二版(1989)塞諾爾 協(xié)會(Sinauer Associates)公司，桑德蘭(Sunderland)， MA.，或戴什潘德(Deshpande)、 穆昆德(Mukund V.)，應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)(Appl. Biochem. Biotechnol.) 36， 227 (1992))。
在一個實施例中，DNA可通過業(yè)內(nèi)習(xí)知方法全部或部分自四種核苷酸化學(xué)合成。 所述方法包括闡述于卡如瑟(Caruthers) (1985年；科學(xué)(Science) 230:281-285)中者。 DNA也可通過制備重疊雙鏈寡核苷酸、填充間隙、和將末端連接在一起來合成(通 常參見，薩姆布魯克(Sambrook)等人(1989年；分子克隆-實驗室手冊(MoZecwtor CZwi^g -A Latorato 7 Ma肌aZ)，第2版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Habour Laboratory Press),紐約(New York)))。在另一實施例中，失活突變可通過位點定向誘變自野 生型DNA制備(參見，例如，左勒(Zoller)等人(1982年；DNA. 1984年12月； 3(6):479-88);左勒(1983);和左勒(1984年;DNA. 1984年12月;3(6):479-88); 麥克弗森(McPherson) (1991年；定向誘變實用方法(Directed Mutagenesis: A Practical Approach.),牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press), NY))?？赏ㄟ^業(yè)內(nèi)習(xí)知的 方法對所獲得DNA實施擴增。 一種適宜方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，其闡述于佐 伯(Saiki)等人(1988年；科學(xué)1988年1月29日；239(4839):487-491)、穆利斯(Mullis) 等人，美國專利第4,683,195號、和薩姆布魯克等人(1989)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中阻止?jié)摲麳SV感染建立的方法，其包含 使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的潛伏HSV感染在原發(fā)性HSV感染 之后。在另一實施例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體 具有HSV感染風(fēng)險。在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過 本發(fā)明方法接種疫苗均可有效保護個體以防原發(fā)性HSV感染之后潛伏HSV感染。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中抑制HSV突發(fā)的方法，其包含使所述個 體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含 有失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的突發(fā)在個體暴露至HSV之后。在另一實施 例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。 在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗 均可有效保護個體以防個體暴露至HSV之后形成突發(fā)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供保護個體以防HSV突發(fā)的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟,其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含 有失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的突發(fā)在個體暴露至HSV之后。在另一實施 例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。 在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗 均可有效保護個體以防個體暴露至HSV之后形成突發(fā)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低HSV突發(fā)發(fā)生率的方法，其包含使所述個體 與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有 失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的突發(fā)在個體暴露至HSV之后。在另一實施例 中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。 在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗 均可有效降低個體暴露至HSV之后的突發(fā)發(fā)生率。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中抑制HSV復(fù)發(fā)的方法，其包含使所述個 體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含 有失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的復(fù)發(fā)在個體暴露至HSV之后。在另一實施 例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。 在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗 均可有效保護個體以防個體暴露至HSV之后復(fù)發(fā)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低HSV復(fù)發(fā)發(fā)生率的方法，其包含使所述個體 與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有 失活突變。在另一實施例中，所預(yù)防的復(fù)發(fā)在個體暴露至HSV之后。在另一實施例 中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。 在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗 均可有效降低個體暴露至HSV之后的復(fù)發(fā)發(fā)生率。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在個體中阻抑HSV-1感染的方法，其包含使所述 個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-1菌株。在 另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在個體中阻抑HSV-2感染的方法，其包含使所述 個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-1菌株。在 另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
根據(jù)本發(fā)明的任何方法且在一個實施例中，所述個體是人類。在另一實施例中， 所述個體是鼠科動物，其在一個實施例中是小鼠，且在另一實施例中是大鼠。在另一 實施例中，所述個體是犬科動物、貓科動物、牛科動物、或豬。在另一實施例中，所 述個體是哺乳動物。在另一實施例中，所述個體是易受HSV感染的任何生物體。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在人類個體中保護個體以防形成帶狀皰疹樣損傷或
13類似暴發(fā)的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌 株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在人類個體中阻止形成HSV帶狀皰疹樣損傷或類 似暴發(fā)的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株 在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在另一實施例中，所阻止的帶狀皰疹樣損傷或類似暴發(fā)在個體暴露至HSV之后。 在另一實施例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV 感染風(fēng)險。在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方 法接種疫苗均可有效阻止個體暴露至HSV之后形成帶狀皰疹樣損傷或類似暴發(fā)。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在人類個體中阻止HSV帶狀皰疹樣擴散或類似病 狀的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編 碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，所阻止的帶狀皰疹樣擴 散或類似病狀在個體暴露至HSV之后。在另一實施例中，個體在接種疫苗之前已感 染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。在另一實施例中，無論個體在 接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗均可有效阻止個體暴露至HSV 之后形成帶狀皰疹樣擴散或類似病狀。
在一個實施例中，"帶狀皰疹樣"是指HSV感染(尤其在復(fù)活感染期間)的皮膚 損傷特征，在一個實施例中，其以疹形式開始且隨后在生皮節(jié)附近分布，通常以條狀 或帶狀形式出現(xiàn)。在一個實施例中，疹發(fā)展成裝滿漿液的囊泡或小水皰。在一個實施 例中，帶狀皰疹樣損傷是由于接觸HSV而在小鼠中形成。在另一實施例中，帶狀皰 疹樣損傷是由于接觸HSV而在人類中形成。
在一個實施例中，"帶狀皰疹樣擴散"是指HSV感染自神經(jīng)節(jié)擴散到生皮節(jié)內(nèi) 的繼發(fā)性皮膚位點。在另一實施例中，所述術(shù)語是指在與起始感染位點相同的生皮節(jié) 內(nèi)擴散。在另一實施例中，所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)已知的"帶狀皰疹樣擴散"的任何其它 定義。在另一實施例中，"暴發(fā)"是指疾病癥狀或疾病擴散或流行突然增加，且在一 個實施例中，是指帶狀皰疹樣損傷突然增加，而在另一實施例中，"暴發(fā)"是指帶狀 皰疹樣損傷突然出現(xiàn)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在人類個體中阻止形成生皮節(jié)損傷或類似病狀的方 法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋 白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，所阻止的生皮節(jié)損傷或類似病狀 在個體暴露至HSV之后。在一個實施例中，生皮節(jié)損傷是由于接觸HSV而在人類中 形成。在另一實施例中，人類中的生皮節(jié)損傷最常見地在病毒于神經(jīng)節(jié)中自潛伏狀態(tài) 復(fù)活時出現(xiàn)，且在一個實施例中，沿神經(jīng)擴散，在一個實施例中，導(dǎo)致復(fù)發(fā)感染。在 另一實施例中，生皮節(jié)損傷是由于接觸HSV而在小鼠中形成。在另一實施例中，個 體在接種疫苗之前己感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。在另一 實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方法接種疫苗均可有效阻止個體暴露至HSV之后形成生皮節(jié)損傷或類似病狀。
依照本文，用本發(fā)明gE無效HSV菌株接種疫苗可防止在隨后感染有毒HSV后 潛伏HSV感染(實例5)和形成帶狀皰疹樣和生皮節(jié)損傷(實例4)。在另一實施例 中，接種疫苗可防止由潛伏HSV感染引起或與其有關(guān)的疾病。在另一實施例中，接 種疫苗本身不會引起明顯疾病(實例2)。
在一個實施例中，"有毒HSV"是指天然存在的HSV菌株。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指能夠引起感染的HSV菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指能夠建立 潛伏感染的HSV菌株。
在另一實施例中，本發(fā)明提供阻止個體中HSV神經(jīng)元擴散的方法，其包含使所 述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因 中含有失活突變。在另一實施例中，所阻止的神經(jīng)元擴散在個體暴露至HSV之后。 在另一實施例中，個體在接種疫苗之前已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV 感染風(fēng)險。在另一實施例中，無論個體在接種疫苗時是否感染HSV，通過本發(fā)明方 法接種疫苗均可在個體暴露至HSV之后有效阻止神經(jīng)元擴散。
衡量神經(jīng)元HSV擴散的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且在一個實施例 中包括測定繼發(fā)性生皮節(jié)損傷的存在和程度(實例2)。衡量病毒擴散的其它方法實 施例闡述于(例如)拉貝圖勒(LabetoulleM)等人(HSV1自口腔粘膜至眼睛的神經(jīng)元 增殖(Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye.)，目艮禾斗學(xué)石開究與視 力學(xué)(Invest Ophthalmol Vis Sci.), 2000年8月；41(9):2600-6)和湯普森(Thompson KA) 等人(在病灶皰疹性腦炎大鼠模型中皮質(zhì)類固醇治療并未使單純皰疹復(fù)制和彌散增加 (Herpes simplex replication and dissemination is not increased by corticosteroid treatment in a rat model of focal Heipes encephalitis.),神經(jīng)病毒學(xué)(J Neurovirol.), 2000年2月； 6(l):25-32)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中皰疹性眼睛疾病發(fā)生率的方法，其包含 使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個體 具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中皰疹性眼睛疾病嚴(yán)重程度的方法，其包 含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個 體具有HSV感染風(fēng)險。在另一實施例中，疫苗菌株來自與攻擊菌株不同的物種。在 另一實施例中，疫苗菌株是與攻擊菌株相同的物種。
在另一實施例中，本發(fā)明提供降低個體中HSV-1角膜感染、皰疹性角膜炎或任 何其它皰疹性眼睛疾病發(fā)生率的方法，所述方法包含向所述個體投與本發(fā)明HSV突 變體菌株由此降低個體中HSV-1角膜感染或皰疹性角膜炎發(fā)生率的步驟。在另一實 施例中，向所述個體中投與本發(fā)明HSV突變體菌株引發(fā)對抗HSV-1的免疫應(yīng)答。測定皰疹性眼睛疾病、角膜感染和皰疹性角膜炎的存在和程度的方法已為所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員所熟知，且闡述于(例如)拉貝圖勒等人(HSV1自口腔粘膜至眼睛的 神經(jīng)元增殖，眼科學(xué)研究與視力學(xué)，2000年8月；41(9):2600-6)和馬任達(Majumdar
Si)(用于治療HSV-1誘導(dǎo)的角膜上皮和基質(zhì)角膜炎的二肽單酯更昔洛韋前藥活體
夕卜禾卩活體內(nèi)評價(Dipeptide monoester ganciclovir prodrugs for treating HSV-l-induced corneal epithelial and stromal keratitis: in vitro and in vivo evaluations.),目艮目青藥i里學(xué)與治 療學(xué)期刊(J Ocul Pharmacol Ther.)， 2005年12月;21(6):463-74)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中生殖器潰瘍疾病發(fā)生率的方法，其包含 使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8 基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個體 具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中生殖器潰瘍疾病嚴(yán)重程度的方法，其包 含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個 體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，生殖器潰瘍疾病的特征在于在生殖器上具有潰瘍性損傷。測定 生殖器潰瘍疾病的存在和程度的方法己為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中HSV-1介導(dǎo)的腦炎的發(fā)生率的方法， 其包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì) 的Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，"HSV-1腦炎"是指由HSV-1引起 的腦炎。在另一實施例中，所述術(shù)語是指與HSV-1有關(guān)的腦炎。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型HSV-1介導(dǎo)的腦炎。在另一實施例中，個體 已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。在另一實施例中，疫苗菌 株來自與攻擊菌株不同的物種。在另 一實施例中，疫苗菌株是與攻擊菌株相同的物種。
在一個實施例中，"HSV-1"是指單純皰疹病毒l。在另一實施例中，所述術(shù)語 是指KOS菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指F菌株。在另一實施例中，所述術(shù) 語是指NS菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指CL101菌株。在另一實施例中，所 述術(shù)語是指"17"菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指"17+syn"菌株。在另一實 施例中，所述術(shù)語是指麥金泰爾(MacIntyre)菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指 MP菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指HF菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是 指業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-1菌株。
在一個實施例中，"HSV-2"是指單純皰疹病毒2。在另一實施例中，所述術(shù)語 是指HSV-2333菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指2.12菌株。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指HG52菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指MS菌株。在另一實施例 中，所述術(shù)語是指186菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指G菌株。在另一實施例 中，所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)己知的任何其它HSV-2菌株。
16在另一實施例中，本發(fā)明提供降低個體中HSV-2介導(dǎo)的腦炎的發(fā)生率的方法， 其包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì) 的Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，"HSV-2腦炎"是指由HSV-2引起 的腦炎。在另一實施例中，所述術(shù)語是指與HSV-2有關(guān)的腦炎。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)己知的任何其它類型的HSV-2介導(dǎo)的腦炎。在另一實施例中，個 體已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中皰疹介導(dǎo)的腦炎的嚴(yán)重程度的方法，其 包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個 體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，通過本發(fā)明方法治療或預(yù)防的皰疹介導(dǎo)的腦炎是病灶皰疹性腦 炎。在另一實施例中，皰疹介導(dǎo)的腦炎是新生兒皰疹性腦炎。在另一實施例中，皰疹 介導(dǎo)的腦炎是業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型的皰疹介導(dǎo)的腦炎。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中彌散性HSV感染的發(fā)生率的方法，其 包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個 體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中彌散性HSV感染的嚴(yán)重程度的方法， 其包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì) 的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中， 個體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體后代中新生兒HSV-1感染的發(fā)生率的方 法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼 gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，后代接觸帶有突變體HSV 菌株的個體。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施例中，個體具有HSV 感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體后代中新生兒HSV-2感染的發(fā)生率的方 法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼 gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，個體已感染HSV。在另一 實施例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供減少HSV-1感染自個體至其后代傳播的方法，所 述方法包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼 gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供減少HSV-2感染自個體至其后代傳播的方法，所 述方法包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼 gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在一個實施例中，本發(fā)明提供減少HSV-1傳播至后代的方法，所述方法包含使 所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。業(yè)內(nèi)已知，HSV-2感染會使生殖器分泌物中的HIV-1病毒 排出增加(納戈特(Nagot N)等人，利用阻抑單純皰疹病毒的療法來降低HIV-1 RNA 含量(Reduction of HIV-l RNA levels with therapy to suppress herpes simplex virus.), 新 英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed.)2007年2月22日；356(8):790-9)。因此，我們認(rèn)為 抑制HSV-2感染的本發(fā)明方法也可有效減少HIV-1至后代的傳播。在另一實施例中， 突變體HSV菌株是HSV-1菌株。在另一實施例中，突變體HSV菌株是HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供減少HSV-1傳播至性伴侶的方法，所述方法包含 使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼gE蛋白質(zhì) 的Us8基因中含有失活突變。業(yè)內(nèi)已知，HSV-2感染會使生殖器分泌物中的HIV-1 病毒排出增加。因此，我們認(rèn)為抑制HSV-2感染的本發(fā)明方法也可有效減少HIV-1 至性伴侶的傳播。在另一實施例中，突變體HSV菌株是HSV-1菌株。在另一實施例 中，突變體HSV菌株是HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低對HIV-1的易感染性的方法，所述方法包含 使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體HSV菌株在編碼gE蛋白質(zhì) 的Us8基因中含有失活突變。業(yè)內(nèi)已知，HSV-2感染會使HIV-1復(fù)制增加(屋德瑞 古(Ouedraogo A)等人，在采取抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的女性中阻抑性皰疹療法對生殖器 HIV-1 RNA的影響隨機受控試驗(Impact of suppressive herpes therapy on genital HIV匿l RNA among women taking antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.), 艾滋病04/A5). 2006年11月28曰;20(18):2305-13)。因此，我們認(rèn)為抑制HSV-2 感染的本發(fā)明方法也可有效降低對HIV-1的易感染性。在另一實施例中，突變體HSV 菌株是HSV-1菌株。在另一實施例中，突變體HSV菌株是HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體后代中新生兒HSV感染的嚴(yán)重程度的方 法，其包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋 白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，個體已感染HSV。在另一實施 例中，個體具有HSV感染風(fēng)險。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中與皰疹介導(dǎo)的腦炎有關(guān)的或其繼發(fā)性疾 病、病癥、或癥狀的發(fā)生率的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步 驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供治療個體中與皰疹介導(dǎo)的腦炎有關(guān)的或其繼發(fā)性疾 病、病癥、或癥狀的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸由此治療個體 中與皰疹介導(dǎo)的腦炎有關(guān)的或其繼發(fā)性疾病、病癥、或癥狀的步驟，其中突變體菌株 在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是發(fā)熱。在另一實施例中，所述疾病、 病癥、或癥狀是頭痛。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是頸強直。在另一
18實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是癲癇發(fā)作。在另一實施例中，所述疾病、病癥、 或癥狀是部分麻痹。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是木僵。在另一實施 例中，所述疾病、病癥、或癥狀是昏迷。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀 是業(yè)內(nèi)已知的與皰疹介導(dǎo)的腦炎有關(guān)的或其繼發(fā)性的任何其它疾病、病癥、或癥狀。
測定皰疹介導(dǎo)的腦炎的存在和嚴(yán)重程度的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知， 且闡述于(例如)邦考斯卡(Bonkowsky JL)等人(在用促皮質(zhì)素治療嬰兒痙攣癥期間 單純皰疹病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病復(fù)發(fā)(Herpes simplex virus central nervous system relapse during treatment of infantile spasms with corticotropin.),兒禾斗學(xué)(Pediatrics)， 2006 年5月；117(5):el045-8)和可汗(Khan OA)等人(以輕微失語癥存在的皰疹性腦炎 病例報告(Herpes encephalitis presenting as mild aphasia: case report.), BMC家庭醫(yī)學(xué) (BMC Fam Pract.)， 2006年3月24日；7:22)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供治療個體中與HSV感染有關(guān)的疾病、病狀、或癥 狀的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編 碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中與HSV感染有關(guān)的疾病、病狀、或癥 狀的發(fā)生率的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體 菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供治療個體中HSV感染的繼發(fā)性疾病、病狀、或癥 狀的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編 碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供降低個體中HSV感染的繼發(fā)性疾病、病狀、或癥 狀的發(fā)生率的方法，其包含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體 菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。
在一個實施例中，HSV感染的繼發(fā)性疾病、病癥、或癥狀是口腔損傷。在另一 實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是生殖器損傷。在另一實施例中，所述疾病、病 癥、或癥狀是口腔潰瘍。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是生殖器潰瘍。 在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是發(fā)熱。在另一實施例中，所述疾病、病 癥、或癥狀是頭痛。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是肌肉痛。在另一實 施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是腹股溝區(qū)域中腺體腫脹。在另一實施例中，所述 疾病、病癥、或癥狀是排尿疼痛。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是陰道 排出物異常。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是發(fā)皰。在另一實施例中， 所述疾病、病癥、或癥狀是流感樣身體不適。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或 癥狀是角膜炎。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是皰疹性瘭疽。在另一實 施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是貝爾麻痹(Bell's palsy)。在另一實施例中，所述 疾病、病癥、或癥狀是皰疹性多形紅斑。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀 是下背部癥狀(例如麻木、臀部或肛門附近區(qū)域具有麻刺感、尿潴留、便秘、和陽萎)。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是局部皰疹性濕疹。在另一實施例中，所 述疾病、病癥、或癥狀是彌散性皰疹性濕疹。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或 癥狀是外傷性皰疹。在另一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是皰疹性須瘡。在另 一實施例中，所述疾病、病癥、或癥狀是食管癥狀(例如吞咽困難或燒灼感、吞咽時 咽喉刺痛、體重減輕、吞咽時上胸中或上胸后疼痛)。在另一實施例中，所述疾病、 病癥、或癥狀是業(yè)內(nèi)已知的任何其它疾病、病癥、或癥狀。
在一個實施例中，通過本發(fā)明方法和組合物治療或改善的HSV感染是生殖器 HSV感染。在另一實施例中，HSV感染是口腔HSV感染。在另一實施例中，HSV 感染是眼睛HSV感染。在另一實施例中，HSV感染是皮膚病HSV感染。
在一個實施例中，HSV感染是HSV-2感染。在另一實施例中，HSV感染是HSV-1 感染。在另一實施例中，HSV感染是業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型HSV感染。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中誘導(dǎo)快速清除HSV-1感染的方法，其包 含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-1菌株。 在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中誘導(dǎo)快速清除HSV-2感染的方法，其包 含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-1菌株。 在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中誘導(dǎo)抗HSV免疫應(yīng)答的方法，其包含使 所述個體與突變體HSV菌株接觸由此在個體中誘導(dǎo)抗HSV免疫應(yīng)答的步驟，其中突 變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV 菌株是突變體HSV-1菌株。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中誘導(dǎo)抗HSV中和抗體應(yīng)答的方法，其包 含使所述個體與突變體HSV菌株接觸的步驟，其中突變體菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的 Us8基因中含有失活突變。在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-1菌株。 在另一實施例中，突變體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在個體中抑制唇部HSV感染的方法，其包含按照 本發(fā)明方法向個體接種疫苗以對抗HSV的步驟。
在另一實施例中，本發(fā)明提供在個體中抑制唇部HSV感染的方法，其包含按照 本發(fā)明方法阻止個體中HSV感染的步驟。
在一個實施例中，通過本發(fā)明方法和組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是細胞免疫應(yīng)答。在 另一實施例中，免疫應(yīng)答包含CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答。在另一實施例中， 免疫應(yīng)答包含CD4+輔助性T細胞應(yīng)答。在另一實施例中，免疫應(yīng)答包含體液免疫應(yīng) 答。
在一個實施例中，本發(fā)明方法中突變體菌株的投與途徑是經(jīng)表皮。在另一實施例中，突變體菌株是通過表皮劃痕或刮痕來投與。在另一實施例中，突變體菌株是經(jīng)肌 內(nèi)投與。在另一實施例中，突變體菌株是經(jīng)皮下投與。在另一實施例中，突變體菌株 是經(jīng)鼻內(nèi)投與。在另一實施例中，突變體菌株是經(jīng)皮投與。在另一實施例中，突變體 菌株是經(jīng)陰道內(nèi)投與。在另一實施例中，突變體菌株是經(jīng)粘膜投與，在一個實施例中， 所述經(jīng)粘膜投與是經(jīng)呼吸系統(tǒng)內(nèi)粘膜投與。在另一實施例中，突變體菌株是經(jīng)鼻內(nèi)投 與。在另一實施例中，突變體菌株是以氣溶膠形式投與。在另一實施例中，突變體菌 株是經(jīng)由業(yè)內(nèi)己知的任何其它途徑來投與。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述HSV菌株的編碼gE的基因中的 失活突變是缺失突變。在另一實施例中，失活突變是插入突變。在另一實施例中，失 活突變是置換突變。在另一實施例中，失活突變是gE無效突變。在另一實施例中， 失活突變是業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型突變。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述HSV菌株的編碼糖蛋白的基因中 的失活突變是缺失突變。在另一實施例中，失活突變是插入突變。在另一實施例中， 失活突變是置換突變。在另一實施例中，失活突變是無效突變。在另一實施例中，失 活突變是業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型突變。在一個實施例中，插入、缺失或置換突變包
含插入、缺失或置換單一氨基酸，而在另一實施例中，其包含插入、缺失或置換1-5 個氨基酸、1-10個氨基酸、5-20個氨基酸、10-50個氨基酸、25-100個氨基酸、100-500 個氨基酸、300-400個氨基酸、200-1000個氨基酸、或1000個或1000個以上氨基酸。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在編碼gE蛋白質(zhì)的基因中包含第一失活突變且包 含第二失活突變的經(jīng)分離突變體HSV-1菌株。在另一實施例中，編碼gE蛋白質(zhì)的基 因是Us8基因。在另一實施例中，突變是gE無效突變。在一個實施例中，本發(fā)明方 法和組合物中所述的經(jīng)分離突變體HSV-1菌株進一步包含一或多種額外突變，所述 額外突變在一個實施例中是失活突變。在另一實施例中，第二或額外失活突變是在 Us7基因中。在另一實施例中，第二或額外失活突變是在Us9基因中。在另一實施例 中，第二失活突變是在賦予神經(jīng)毒力的任何基因中。在另一實施例中，第二失活突變 是在為病毒入侵至宿主細胞中所需要的任何基因中。在另一實施例中，第二失活突變 是在宿主關(guān)閉基因(shut-offgene)中。在另一實施例中，第二失活突變是在胸苷激酶基 因中。在另一實施例中，第二失活突變是在業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-1基因中。在 另一實施例中，經(jīng)分離突變體HSV-1菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的基因、Us7基因、和 Us9基因中含有失活突變。在另一實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的經(jīng)分離突 變體HSV-l菌株在編碼gD蛋白質(zhì)的基因中進一步包含額外突變。
在一個實施例中，本發(fā)明提供在編碼gE蛋白質(zhì)的基因中包含第一失活突變且包 含第二失活突變的經(jīng)分離突變體HSV-2菌株。在另一實施例中，編碼gE蛋白質(zhì)的基 因是Us8基因。在另一實施例中，突變是gE無效突變。在一個實施例中，本發(fā)明方 法和組合物中所述的經(jīng)分離突變體HSV-2菌株進一步包含一或多種額外突變，所述 額外突變在一個實施例中是失活突變。在另一實施例中，第二或額外失活突變是在Us7基因中。在另一實施例中，第二或額外失活突變是在Us9基因中。在另一實施例
中，第二失活突變是在賦予神經(jīng)毒力的任何基因中。在另一實施例中，第二失活突變 是在為病毒入侵至宿主細胞中所需要的任何基因中。在另一實施例中，第二失活突變 是在宿主關(guān)閉基因中。在另一實施例中，第二失活突變是在胸苷激酶基因中。在另一
實施例中，第二失活突變是在業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-2基因中。在另一實施例中， 經(jīng)分離突變體HSV-2菌株在編碼gE蛋白質(zhì)的基因、Us7基因、和Us9基因中含有失 活突變。在另一實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的經(jīng)分離突變體HSV-2菌株 在編碼gD蛋白質(zhì)的基因中進一步包含額外突變。
在一個實施例中，突變的Us7基因在a-皰疹病毒中高度保守。在另一實施例中， 突變的Us7基因為病毒順行性擴散所需要。在另一實施例中，突變的Us7基因為病毒 逆行性擴散所需要。
在一個實施例中，突變的Us9基因在a-皰疹病毒中高度保守。在另一實施例中， 突變的Us9基因為病毒順行性擴散所需要。在另一實施例中，突變的Us9基因為病毒 逆行性擴散所需要。
在一個實施例中，Us7和/或Us9中的突變是失活突變。在另一實施例中，突變 是缺失突變。在另一實施例中，突變是插入突變。在另一實施例中，突變是置換突變。 在另一實施例中，突變是業(yè)內(nèi)已知的任何其它類型突變。
在一個實施例中，突變的額外基因在a-皰疹病毒中高度保守。在另一實施例中， 突變的額外基因為病毒順行性擴散所需要。在另一實施例中，突變的額外基因為病毒 逆行性擴散所需要。
在一個實施例中，突變的額外基因是病毒粒子膜蛋白質(zhì)。在一個實施例中，額外 基因是病毒入侵不需要或必需的病毒粒子膜蛋白質(zhì)。在另一實施例中，膜蛋白質(zhì)是糖 蛋白。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白J。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白 G。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白K。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白M。 在另一實施例中，額外基因是選自糖蛋白J、 G、 K、和M。
在一個實施例中，"順行性"是指自神經(jīng)節(jié)到皮膚擴散。在另一實施例中，所述 術(shù)語是指自細胞體向軸突擴散。在另一實施例中，所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)接受的任何其它 定義。
在一個實施例中，"逆行性"是指自感染位點到神經(jīng)節(jié)擴散。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指自軸突向細胞體擴散。在另一實施例中，所述術(shù)語是指業(yè)內(nèi)接受的任何 其它定義。
在一個實施例中，引入額外突變以增強對突變體HSV-1菌株順行性擴散的抑制。 在另一實施例中，需要額外突變與gE突變來抑制突變體HSV-l菌株順行性擴散。在 另一實施例中，gE突變不足以抑制突變體HSV-l菌株的順行性擴散。在另一實施例 中，于不存在gE突變下額外突變已足以抑制突變體HSV-1菌株的順行性擴散。
在一個實施例中，引入額外突變以增強對突變體HSV-2菌株的順行性擴散的抑制。在另一實施例中，需要額外突變與gE突變來抑制突變體HSV-2菌株的順行性擴 散。在另一實施例中，gE突變不足以抑制突變體HSV-2菌株的順行性擴散。在另一 實施例中，于不存在gE突變的情況下額外突變已足以抑制突變體HSV-2菌株的順行 性擴散。
在一個實施例中，引入額外突變以增強對HSV-1或HSV-2菌株或二者的毒力的 衰減。在另一實施例中，需要額外突變與gE突變來衰減毒力。
在一個實施例中，突變的額外基因是病毒粒子膜蛋白質(zhì)。在另一實施例中，額外 基因是病毒入侵所需要的病毒粒子膜蛋白質(zhì)。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白B。 在另一實施例中，額外基因是糖蛋白D。在另一實施例中，額外基因是糖蛋白H。在 另一實施例中，額外基因是糖蛋白L。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體HSV菌株在個體的皮膚 組織中具有復(fù)制能力。在另一實施例中，突變體菌株在個體的皮膚細胞中具有復(fù)制能 力。在另一實施例中，突變體菌株在個體所屬物種的皮膚組織中具有復(fù)制能力。在另 一實施例中，突變體菌株在來源于個體物種皮膚組織的細胞系中具有復(fù)制能力。在另 一實施例中，突變體菌株在個體物種的皮膚細胞培養(yǎng)物中具有復(fù)制能力。在另一實施 例中，突變體菌株在來源于個體物種皮膚細胞的細胞系中具有復(fù)制能力。
在一個實施例中，"具有復(fù)制能力"是指能夠復(fù)制。在另一實施例中，所述術(shù)語 包括展示受損但仍可檢測到的復(fù)制水平的菌株。在另一實施例中，所述術(shù)語是指展示 可測量復(fù)制的菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體HSV菌株不能自接種位 點擴散到背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。在一個實施例中，背根神經(jīng)節(jié)含有神經(jīng)纖維的神經(jīng)元細 胞體。在另一實施例中，突變體HSV菌株不能逆行性擴散。在另一實施例中，突變 體HSV菌株的逆行性擴散受損。在另一實施例中，突變體HSV菌株的逆行性擴散顯 著受損。在另一實施例中，突變體HSV菌株的逆行性擴散受損，但在皮膚中仍具有 復(fù)制能力。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體HSV菌株不能自DRG 擴散到皮膚。在另一實施例中，突變體HSV菌株不能順行性擴散。在另一實施例中， 突變體HSV菌株的順行性擴散受損。在另一實施例中，突變體HSV菌株的順行性擴 散顯著受損。在另一實施例中，突變體HSV菌株的順行性擴散受損，但在皮膚中仍 具有復(fù)制能力。
在一個實施例中，"DRG"是指神經(jīng)元細胞體。在另一實施例中，所述術(shù)語是 指業(yè)內(nèi)使用的"DRG"的任何其它定義。
在一個實施例中，"突發(fā)"或"復(fù)發(fā)"是指在潛伏神經(jīng)元HSV感染后皮膚組織 再感染。在另一實施例中，所述術(shù)語是指在潛伏期后HSV復(fù)活。在另一實施例中， 所述術(shù)語是指在無癥狀潛伏期后出現(xiàn)癥狀性HSV損傷。
在一個實施例中，本發(fā)明的突變體HSV菌株在特定組織中或普遍(例如在神經(jīng)組織中)具有復(fù)制缺陷。衡量病毒復(fù)制的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且在 一個實施例中包括對接種位點附近的組織樣品實施滴定分析(本文實例)。在另一實 施例中，利用自接種位點附近的組織中回收傳染性病毒(本文實例)。衡量病毒復(fù)制 的方法中所述的其它實施例闡述于(例如)森(ThiTN)等人(通過實時PCR來快速測 定I型和n型單純皰疹病毒的抗病毒藥物敏感性(Rapid determination of antiviral drag susceptibility of herpes simplex virus types 1 and 2 by real-time PCR.)， 抗病毒石開究 (Antiviral Res.)， 2006年3月;69(3):152-7);熊茲(Schang LM)等人(細胞周期蛋白 依賴激酶的特異性抑制劑羅斯克韋亭(Roscovitine)于病毒早期蛋白質(zhì)存在下抑制單純 皰疹病毒DNA合成(Roscovitine， a specific inhibitor of cellular cyclin-dependent kinases, inhibits herpes simplex virus DNA synthesis in the presence of viral early proteins.), 病毒 學(xué)期刊，2000年3月;74(5):2107-20);和肯尼迪(Kennedy PG)等人(I型單純皰疹 病毒RL1突變體1716在原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中的復(fù)制一可能與用作病毒載體具有 相關(guān)性(Replication of the herpes simplex virus type 1 RLl mutant 1716 in primary neuronal cell cultures—possible relevance to use as a viral vector.), 神纟圣病學(xué)其月干l)(J Neurol Sci.)， 2000年10月1日；179(S 1-2):108-14)。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體菌株在個體神經(jīng)組織中的 擴散受損。在另一實施例中，突變體菌株在個體神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中的擴散受損。在另 一實施例中，突變體菌株在個體所屬物種的神經(jīng)組織中的擴散受損。在另一實施例中， 突變體菌株在來源于個體物種神經(jīng)組織的細胞系中的擴散受損。在另一實施例中，突 變體菌株在個體物種的神經(jīng)細胞培養(yǎng)物中的擴散受損。在另一實施例中，突變體菌株 在來源于個體物種神經(jīng)細胞的細胞系中的擴散受損。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述突變體菌株入侵個體神經(jīng)組織的能 力受損。在另一實施例中，突變體菌株入侵個體神經(jīng)細胞培養(yǎng)物的能力受損。在另一 實施例中，突變體菌株入侵個體所屬物種的神經(jīng)組織的能力受損。在另一實施例中， 突變體菌株入侵來源于個體物種神經(jīng)組織的細胞系的能力受損。在另一實施例中，突 變體菌株入侵個體物種的神經(jīng)細胞培養(yǎng)物的能力受損。在另一實施例中，突變體菌株 入侵來源于個體物種神經(jīng)細胞的細胞系的能力受損。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體HSV菌株可誘導(dǎo)抗HSV 免疫應(yīng)答。在另一實施例中，免疫應(yīng)答阻止HSV在個體中復(fù)制。在另一實施例中， 免疫應(yīng)答阻止HSV在個體中的神經(jīng)元擴散。在另一實施例中，免疫應(yīng)答可殺死個體 中受HSV感染的細胞。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的突變體HSV菌株是突變體 HSV-1菌株。在另一實施例中，所述突變體HSV-1菌株賦予對抗HSV-1感染、擴散、 或其后果(例如帶狀皰疹樣損傷或皰疹性眼睛疾病)的保護。在另一實施例中，突變 體HSV菌株是突變體HSV-2菌株。在另一實施例中，所述突變體HSV-2菌株賦予對 抗HSV-2感染、擴散、或其后果(例如帶狀皰疹樣損傷或皰疹性眼睛疾病)的保護。在另一實施例中，突變體HSV菌株是業(yè)內(nèi)已知的任何其它突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明的突變體HSV-1菌株可保護個體以防野生型HSV-1感 染和與其有關(guān)的病癥和癥狀。在另一實施例中，所述病癥和癥狀包括唇皰疹(感冒瘡 或發(fā)熱性水皰)。在另一實施例中，所述病癥和癥狀包括HSV介導(dǎo)的角膜疾病。在 另一實施例中，所述病癥和癥狀包括皰疹介導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎。在另一實施例中，所述病 癥和癥狀包括皰疹介導(dǎo)的腦炎。在另一實施例中，所述病癥和癥狀包括HSV-1介導(dǎo) 的生殖器潰瘍疾病。在另一實施例中，本發(fā)明的突變體HSV-1菌株提供對抗HSV-1 感染的充分保護和對抗與HSV-2感染有關(guān)的一或多種癥狀的部分保護。在另一實施 例中，這些HSV-2癥狀包括上文所述癥狀。
在另一實施例中，所述病癥和癥狀包括免疫受損個體(包括帶有人類免疫缺陷病 毒(HIV)的個體)中的HSV感染。在另一實施例中，本發(fā)明的突變體HSV-1菌株可 阻止或抑制生殖器HSV-1自接種疫苗的母親傳播至其新生嬰兒。在另一實施例中， 本發(fā)明的突變體HSV菌株可在老年個體中治療、阻抑、阻止或抑制HSV。
在一個實施例中，本發(fā)明的突變體HSV-2菌株可保護個體以防野生型HSV-2感 染和與其有關(guān)的病癥和癥狀。在另一實施例中，所述突變體HSV-2菌株可阻止或抑 制生殖器HSV-2自接種疫苗的母親傳播至其新生嬰兒。在另一實施例中，所述突變 體HSV-2菌株可預(yù)防或抑制生殖器潰瘍疾病。在另一實施例中，所述突變體HSV-2 菌株可提供對抗HSV-2感染和HSV-1感染二者的充分保護。
根據(jù)本發(fā)明的任何方法且在一個實施例中，感染是HSV-1感染。在另一實施例 中，感染是HSV-2感染。
根據(jù)本發(fā)明的任何方法且在一個實施例中，疫苗菌株來自與采取保護措施所對抗 的菌株("攻擊菌株")不同的物種。在另一實施例中，疫苗菌株是與攻擊菌株相同 的物種。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的疫苗可保護個體以防異源HSV 攻擊。在另一實施例中，異源攻擊是相同物種的不同菌株。在另一實施例中，在突變 體HSV-1疫苗菌株情形下，所述疫苗可賦予對抗異源HSV-1菌株的保護。在另一實 施例中，在突變體HSV-2疫苗菌株情形下，所述疫苗可賦予對抗異源HSV-2菌株的 保護。在另一實施例中，異源菌株具有相對于疫苗菌株明顯異源的抗原蛋白質(zhì)。在另 一實施例中，抗原蛋白質(zhì)是gD。在另一實施例中，抗原蛋白質(zhì)是gB。在另一實施例 中，抗原蛋白質(zhì)是業(yè)內(nèi)已知的任何其它抗原蛋白質(zhì)。
在一個實施例中，異源菌株具有相對于疫苗菌株明顯異源的gD蛋白質(zhì)。在另一 實施例中，異源菌株的gD蛋白質(zhì)與疫苗菌株具有50呢同源性。在另一實施例中，異 源菌株的gD蛋白質(zhì)與疫苗菌株具有55%同源性。在另一實施例中，具有60%同源性。 在另一實施例中，具有65%同源性。在另一實施例中，具有70%同源性。在另一實施 例中，具有75%同源性。在另一實施例中，具有80%同源性。在另一實施例中，具有 85%同源性。在另一實施例中，具有90%同源性。在另一實施例中，具有95%同源性。在另一實施例中，具有98%同源性。在另一實施例中，具有98%以上的同源性。
在一個實施例中，異源菌株具有相對于疫苗菌株明顯異源的gB蛋白質(zhì)。在另一 實施例中，異源菌株的gB蛋白質(zhì)與疫苗菌株具有50免同源性。在另一實施例中，異 源菌株的gB蛋白質(zhì)與疫苗菌株具有55%同源性。在另一實施例中，具有60%同源性。 在另一實施例中，具有65%同源性。在另一實施例中，具有70%同源性。在另一實施 例中，具有75%同源性。在另一實施例中，具有80%同源性。在另一實施例中，具有 85%同源性。在另一實施例中，具有90%同源性。在另一實施例中，具有95%同源性。 在另一實施例中，具有98%同源性。在另一實施例中，具有98%以上的同源性。
在一個實施例中，異源攻擊菌株是HSV-1NS。在另一實施例中，異源攻擊菌株 是HSV-1(F)。在另一實施例中，異源攻擊菌株是HSV-1 (17)。在另一實施例中，異 源攻擊菌株是業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-1菌株。
在一個實施例中，異源攻擊菌株是HSV-2(2.12)。在另一實施例中，異源攻擊菌 株是業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-2菌株。
在一個實施例中，異源攻擊菌株是不同的HSV物種。在另一實施例中，在突變 體HSV-1疫苗菌株情形下，所述疫苗可賦予對抗HSV-2攻擊的保護。在另一實施例 中，在突變體HSV-2疫苗菌株情形下，所述疫苗可賦予對抗HSV-1攻擊的保護。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的疫苗可保護個體對抗HSV大接 種物攻擊。在另一實施例中，大接種物為10"籃斑形成單位(pfu)。在另一實施例中， 接種物為1.5xl06pfu。在另一實施例中，接種物為2xl(fpfu。在另一實施例中，接 種物為3xlO、fu。在另一實施例中，接種物為4x 106pfu。在另一實施例中，接種 物為5 x 106pfu。在另一實施例中，接種物為7 x 106 pfu。在另一實施例中，接種物 為lxlO pfu。在另一實施例中，接種物為1.5xl07pfu。在另一實施例中，接種物為 2 x 107 pfu。在另一實施例中，接種物為3 x 107 pfu。在另一實施例中，接種物為4 x 107 pfu。在另一實施例中，接種物為5 x 107 pfu。在另一實施例中，接種物為7xl(^pfu。 在另一實施例中，接種物為108pfu。在另一實施例中，接種物為103-106pfu。在另一 實施例中，接種物為103-105 pfu。在另一實施例中，接種物為104-106pfu。在另一實 施例中，接種物為3xlO、3xlO fu。在另一實施例中，接種物為10、10、fu。在另 一實施例中，接種物為3xlO、3xl(^pfu。在另一實施例中，接種物為105-108 pfu。 在另一實施例中，接種物為3 x 105-3 x 108 pfu。在另一實施例中，接種物為108 pfu 以上。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的疫苗由于不能感染神經(jīng)節(jié)而展示 相對于含gEHSV疫苗菌株增強的安全性。在另一實施例中，本發(fā)明方法由于不能在 神經(jīng)元中擴散而展示相對于含gEHSV疫苗菌株增強的安全性。
在另一實施例中，突變體HSV顆粒的多種劑量范圍實施例可用于本發(fā)明方法中。 在另一實施例中，劑量為10Spfu。在另一實施例中，劑量為2xl()Spfu。在另一實施 例中，劑量為3xl()Spfu。在另一實施例中，劑量為5xl(^pfu。在另一實施例中，劑量為104pfu。在另一實施例中，劑量為1.5xl04pfu。在另一實施例中，劑量為104 pfu。在另一實施例中，劑量為2xl0"pfu。在另一實施例中，劑量為3xl(^pfu。在 另一實施例中，劑量為5xl0"pfu。在另一實施例中，劑量為7xl(fpfu。在另一實 施例中，劑量為105pfu。在另一實施例中，劑量為2xl()Spfu。在另一實施例中，劑 量為3 x 105 pfu。在另一實施例中，劑量為5 x 105 pfu。在另一實施例中，劑量為7 x 105pfu。在另一實施例中，劑量為l(^pfu。在另一實施例中，劑量為2xl()Spfu。在 另一實施例中，劑量為3xl(^pfu。在另一實施例中，劑量為5xl0Spfu。在另一實 施例中，劑量為7xl0Spfu。在另一實施例中，劑量為l(^pfu。在另一實施例中，劑 量為2xl(^pfu。在另一實施例中，劑量為3xl0、fu。在另一實施例中，劑量為5x 107pfu。在另一實施例中，劑量為7xl0 pfu。在另一實施例中，劑量為l()Spfu。在 另一實施例中，劑量為2xl()Spfu。在另一實施例中，劑量為3xl()Spfu。在另一實 施例中，劑量為5xl()8pfu。在另一實施例中，劑量為7xl()Spfu。
在另一實施例中，劑量為10Spfu/劑量。在另一實施例中，劑量為2 x 103 pfu/劑 量。在另一實施例中，劑量為3xl(^pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為5xl(^pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為10"pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為1.5xl04pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為104 pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為2xl(/pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為3x 1(/pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為5x 104pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為7 x 104 pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為l(^pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為2x 105 pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為3x 105pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為5xl()Spfu/劑量。在另一實施例中，劑量為7xl()Spfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為106 pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為2xl()Spfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為3x 1(^pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為5x 106pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為7 x 1(^pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為l(^pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為2x 10、fu/劑量。在另一實施例中，劑量為3x 107pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為5x 10 pfu/劑量。在另一實施例中，劑量為7x 107pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為H)Spfu/劑量。在另一實施例中，劑量為2xl()8pfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為3xl()Spfu/劑量。在另一實施例中，劑量為5xl()Spfu/ 劑量。在另一實施例中，劑量為7x 1()8pfu/劑量。在另一實施例中，劑量大于108pfu。 在另一實施例中，劑量為103-106 pfu。在另一實施例中，劑量為103-105 pfu。在另一 實施例中，劑量為104-106pfu。在另一實施例中，劑量為3xl04-3xl()6pfu。在另一 實施例中，劑量為104-107 pfu。在另一實施例中，劑量為3xl()4-3xl07pfu。在另一 實施例中，劑量為105-108 pfu。在另一實施例中，劑量為3xl()5-3xl08pfu。
在一個實施例中，"治療"是指治療性治療和預(yù)防性(pr叩hylactic或preventative) 措施二者，其中目的是預(yù)防或減輕上文所述目標(biāo)病理學(xué)病狀或病癥。因此，在一個實 施例中，治療可包括直接影響或治愈、阻抑、抑制、預(yù)防疾病、病癥或病狀、減輕其 嚴(yán)重程度、延遲其發(fā)作、減少其伴隨的癥狀或其組合。因此，在一個實施例中，"治
27療"尤其是指延遲進展、促進好轉(zhuǎn)、誘導(dǎo)好轉(zhuǎn)、增強好轉(zhuǎn)、加速恢復(fù)、增強替代療法 的功效或降低對替代療法的抗性或其組合。在一個實施例中，"預(yù)防"尤其是指延遲 癥狀發(fā)作、防止疾病復(fù)發(fā)、減少復(fù)發(fā)事件的次數(shù)或頻率、延長癥狀性事件之間的潛伏 期或其組合。在一個實施例中，"阻抑"或"抑制"尤其是指降低癥狀的嚴(yán)重程度、 降低急性事件的嚴(yán)重程度、減少癥狀次數(shù)、降低疾病相關(guān)癥狀的發(fā)生率、減少潛伏癥 狀、改善癥狀、減少繼發(fā)性癥狀、減少繼發(fā)性感染、延長患者存活期或其組合。
在一個實施例中，癥狀是原發(fā)性癥狀，而在另一實施例中，癥狀是繼發(fā)性癥狀。 在一個實施例中，"原發(fā)性"是指癥狀是個體病毒感染的直接結(jié)果，而在一個實施例 中，"繼發(fā)性"是指癥狀來源于原發(fā)性原因或為其結(jié)果。在一個實施例中，用于本發(fā) 明的組合物和菌株可治療與HSV感染有關(guān)的原發(fā)性或繼發(fā)性癥狀或繼發(fā)性并發(fā)癥。
在另一實施例中，"癥狀"可為HSV感染的任何表現(xiàn)形式，包含水皰、潰瘍形 成、或女性尿道、子宮頸、大腿上部、和/或肛門損傷和男性陰莖、尿道、陰囊、大 腿上部、和肛門損傷、炎癥、腫脹、發(fā)熱、流感樣癥狀、口瘡、咽喉痛、咽炎、疼痛、 舌頭、口腔或嘴唇上的水皰、潰瘍、感冒瘡、頸痛、淋巴結(jié)腫大、發(fā)紅、出血、瘙癢、 排尿困難、頭痛、肌肉痛等或其組合。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的gE蛋白質(zhì)具有以下序列
MDRGAVVGFLLGVCVVSCLAGTPKTSWRRVSVGEDVSLLPAPGPTGRGPTQ
V(3PAPVPTPPPTPADYDEDDNDEGEDESLAGTPASGTPRLPPPPAPPRSWPSAPEVS HVRGVTVRMETPEAILFSPGETFSTNVSIHAIAHDDQTYSMDWWLRFDVPTSCAE MRIYESCLYHPQLPECLSPADAPCAASTWTSRLAVRSYAGCSRTNPPPRCSAEAHM EPVPGLAWQAAS VNLEFRD ASPQHSGL YLC VV YVNDHIHAWGH1TISTA AQYRN AVVEQPLPGRGADLAEPTHPHVGAPPHAPPTHGALRLGAVMGAAUXSALGLSV WACMTCWRRRAWRAVKSRASGKGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERD(^VPWLA PPERPDSPSTNGSGFEILSPTAPSVYPRSDGHGSRRQLTTFGSGRPDRRYSQASDSSV FW(SEQIDNo: 2)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 2的同源物。在另一 實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:2的變體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQID No:2的異構(gòu)體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:2的片段。在另一實施例 中，gE蛋白質(zhì)包含SEQIDNo: 2。
在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是由具有以下序列的核苷酸序列編碼 atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctgga gacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgcttccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatggg ccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtgcccgagacggtcg tggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcgtacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacga acggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttattcacggggtccgagagacggacagcggcctgtataccctgtccgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccga
ccccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgaggacgaaagtctcgccggcactcccgccag
cgggaccccccggctcccgcctccccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacatgtgcgtggggtga
ccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggagacgttcagcacgaacgtctccatccatgccatcgcccac
gacgaccagacctactccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatacgaatcgtg
tctgtatcacccgcagctcccagaatgtctgtccccggccgacgcgccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcctggccgtc
cgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccaccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccgtcccggggctggc
gtggcaggcggcctccgtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccggcctgtatctgtgtgtggtgtacgtcaacg
accatattcacgcctggggccacattaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccctcccacagc
gcggcgcggatttggccgagcccaccc3cccgcacgtcggggcccctcccc3cgcgcccccaacccacggcgccctgcggtt
aggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcactggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgcaggcgtgcc
tggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgcggactgga
gctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccaccaatggatc
cggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgatgggcatcaatctcgccgccagctcacaacctttgga
tccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaa (SEQ ID No: 3)。在另一實施
例中，gE蛋白質(zhì)是由為SEQIDNo:3同源物的核苷酸分子編碼。在另一實施例中，
核苷酸分子是SEQIDNo: 3的變體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 3
的異構(gòu)體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQIDNo:3的片段。在另一實施例中，
核苷酸分子包含SEQ ID No: 3。
在另一實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的gE蛋白質(zhì)具有以下序列 MDRGAVVGFLLGVCVVSCLAGTPKTS職RVSVGEDVSIXPAPGPTGRGPTQ
V(^PAPVPTPPPTPADYDEDDNDEGEGEDESLAGTPASGTPRLPPSPAPPRSWPSAPE VSHVRGVTVRMETPEAILFSPGEAFSTNVSIHAIAHDD(2TYTMDVVWLRFDVPTSC
畫EPFPGLAWGAASVNLEFRDASPGHSGLYLCVVYVNDHIHAWGHITINTAAQY
VWACMTC職RRAWRAVKSRASGKGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERDQVPWL APPERPDSPSTNGSGFEILSPTAPSVYPRSDGHOSRRQLTTFGSGRPDRRYSOASDSS VFW(SEQIDNo:4)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 4的同源物。在另 一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:4的變體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQ IDNo:4的異構(gòu)體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:4的片段。在另一實 施例中，gE蛋白質(zhì)包含SEQ ID No: 4 。
在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是由具有以下序列的核苷酸序列編碼 atggatcgcggggcggtggtggggtttcttctcggtgtttgtgttgtatcgtgcttggcgggaacgcccaaaacgtcctggagacgggtgagtgtcggcgaggacgtttcgttgctaccagctccggggcctacggggcgcggcccgacccagaaactactatgg
gccgtggaacccctggatgggtgcggccccttacacccgtcgtgggtctcgctgatgccccccaagcaggtacccgagacggtc
gtggatgcggcgtgcatgcgcgctccggtcccgctggcgatggcatacgcccccccggccccatctgcgaccgggggtctacg
gacggacttcgtgtggcaggagcgcgcggccgtggttaaccggagtctggttatttacggggtccgagagacggacagcggcct
gtataccctgtctgtgggcgacataaaggacccggctcgccaagtggcctcggtggtcctggtggtgcaaccggccccagttccg
actccacccccgaccccagccgattacgacgaggatgacaatgacgagggcgagggcgaggacgaaagtctagccggcactc
ccgccagcgggaccccccggctcccgccttcccccgcccccccgaggtcttggcccagcgcccccgaagtctcacacgtgcgt
ggggtgaccgtgcgtatggagactccggaagctatcctgttttcccccggggaggcgtttagcacgaacgtctccatccatgccat
cgcccacgacgaccagacctacaccatggacgtcgtctggttgaggttcgacgtgccgacctcgtgtgccgagatgcgaatatac
gaatcgtgtctgtatcatccgcagctcccagagtgtctgtccccggccgacgctccgtgcgccgcgagtacgtggacgtctcgcct
ggccgtccgcagctacgcggggtgttccagaacaaaccccccgccgcgctgttcggccgaggctcacatggagcccttcccgg
ggctggcgtggcaggcggcctcagtcaatctggagttccgggacgcgtccccacaacactccgggctgtatctgtgcgtggtgta
cgtc33cg3CC3tettcacgcatggggccac3ttaccatc犯caccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcccct
cccacagcgcggcgcggatttggccgagcccacccacccgcacgtcggggcccctccccacgcgcccccaacccacggcgc
cctgcggttaggggcggtgatgggggccgccctgctgctgtctgcgctggggttgtcggtgtgggcgtgtatgacctgttggcgca
ggcgtgcctggcgggcggttaaaagcagggcctcgggtaaggggcccacgtacattcgcgtggccgacagcgagctgtacgc
ggactggagctcggacagcgagggagaacgcgaccaggtcccgtggctggcccccccggagagacccgactctccctccacc
aatggatccggctttgagatcttatcaccaacggctccgtctgtatacccccgtagcgatgggcatcaatctcgccgccagctcaca
acctttggatccggaaggcccgatcgccgttactcccaggcctccgattcgtccgtcttctggtaa (SEQ ID No: 5)。在另
一實施例中，gE蛋白質(zhì)是由為SEQIDNo:5同源物的核苷酸分子編碼。在另一實施
例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 5的變體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQ ID No:
5的異構(gòu)體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 5的片段。在另一實施例中，
核苷酸分子包含SEQ ID No: 5。
在另一實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的gE蛋白質(zhì)具有以下序列 MARGAGLVFFVGVWVVSCLAAAPRTSWKRVTSGEDVVLLPAPAERTRAHK LLWAAEPLDACGPLRPSWVALWPPRRVLETWDAACMRAPEPLAIAYSPPFPAGDE
APVPTPTPDDYDEEDDAGVTNARRSAFPPQPPPRRPPVAPPTHPRVIPEVSHVRGVT VHMETLEAILFAPGETFGTNVSIHAIAHDDGPYAMDVVWMRFDVPSSCADMRIYE
TCWRRRSWRAVKSRASATGPTYIRVADSELYADWSSDSEGERDGSLWQDPPERPD SPSTNGSGFEILSPTAPSVYPHSEGRKSRRPLTTFGSGSPGRRHSQASYPSVLW (SEQ
ID No: 6;此蛋白質(zhì)在本文實例1-5中突變)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQID No:6的同源物。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:6的變體。在另一實施例
30中，gE蛋白質(zhì)是SEQIDNo:6的異構(gòu)體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 6的片段。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)包含SEQIDNo:6。
在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是由具有以下序列的核苷酸序列編碼-
atggctcgcggggccgggttggtgttttttgttggagtttgggtcgtatcgtgcctggcggcagcacccagaacgtcctgga aacgggtaacctcgggcgaggacgtggtgttgcttccggcgcccgcggaacgcacccgggcccacaaactactgtgggccgcg gaacccctggatgcctgcggtcccctgcgcccgtcgtgggtggcgctgtggcccccccgacgggtgctcgagacggtcgtggat gcggcgtgcatgcgcgccccggaaccgctcgccatagcatacagtcccccgttccccgcgggcgacgagggactgtattcgga gttggcgtggcgcgatcgcgtagccgtggtcaacgagagtctggtcatctacggggccctggagacggacagcggtctgtacac cctgtccgtggtcggcctaagcgacgaggcgcgccaagtggcgtcggtggttctggtcgtggagcccgcccctgtgccgacccc gacccccgacgactacgacgaagaagacgacgcgggcgtgacgaacgcacgccggtcagcgttccccccccaacccccccc ccgtcgtccccccgtcgcccccccgacgcaccctcgtgttatccccgaggtgtcccacgtgcgcggggtaacggtccatatggag accctggaggccattctgtttgcccccggggagacgtttgggacgaacgtctccatccacgccattgcccacgacgacggtccgta cgccatggacgtcgtctggatgcggtttgacgtgccgtcctcgtgcgccgatatgcggatctacgaagcttgtctgtatcacccgca gcttccagagtgtctatctccggccgacgcgccgtgcgccgtaagttcctgggcgtaccgcctggcggtccgcagctacgccggc tgttccaggactacgcccccgccgcgatgttttgccgaggctcgcatggaaccggtcccggggttggcgtggctggcctccaccg tcaatctggaattccagcacgcctccccccagcacgccggcctctacctgtgcgtggtgtacgtggacgatcatatccacgcctgg ggccacatgaccatcagcaccgcggcgcagtaccggaacgcggtggtggaacagcacctcccccagcgccagcccgagccc gtcgagcccacccgcccgcacgtgagagccccccatcccgcgccctccgcgcgcggcccgctgcgcctcggggcggtgctgg gggcggccctgttgctggccgccctcgggctgtccgcgtgggcgtgcatgacctgctggcgcaggcgctcctggcgggcggtta aaagccgggcctcggcgacgggccccacttac倉gcgtggcggacagcgagctgtacgcggactggagttcggacagcga gggggagcgcgacgggtccctgtggcaggaccctccggagagacccgactctccctccacaaatggatccggctttgagatctt atcaccaacggctccgtctgtatacccccatagcgaggggcgtaaatctcgccgcccgctcaccacctttggttcgggaagcccg ggccgtcgtcactcccaggcctcctatccgtccgtcctctggtaa (SEQ ID No: 7;此基因在本文實例1-5 中突變)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是由為SEQIDNo:7同源物的核苷酸分子編 碼。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQIDNo:7的變體。在另一實施例中，核苷酸 分子是SEQIDNo:7的異構(gòu)體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 7的片 段。在另一實施例中，核苷酸分子包含SEQIDNo:7。
在一個實施例中，gE蛋白質(zhì)是由以下基因庫登錄號(GenBank Accession Number) 中的一個禾口 AJ626469-AJ626498中的任何一個編碼DQ889502、 NC_001806、 NC—001798、 Z86099、 X14112、 L00036、 X02138、和X04798。在另一實施例中，gE 蛋白質(zhì)與一個上文基因庫登錄號所揭示的序列同源。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是 一個上文基因庫登錄號所揭示序列的變體。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是一個上文 基因庫登錄號所揭示序列的片段。
在一個實施例中，gE蛋白質(zhì)HSV-l糖蛋白E(gE)是病毒粒子表面蛋白質(zhì)，其為 在神經(jīng)元中擴散所需要，且在一個實施例中，其為在任一方向上沿軸突至("逆行性") 和自("順行性")神經(jīng)元細胞體擴散所需要。在另一實施例中，gE也有助于通過隔絕對抗HSV-1的宿主抗體使其無活性來躲避宿主免疫系統(tǒng)。在一個實施例中，gE 缺失型HSV-1能在皮膚中復(fù)制，但不能沿神經(jīng)元擴散以建立潛伏或逃避宿主抗體應(yīng) 答。因此，在一個實施例中，活減毒gE缺失型HSV-l或HSV-2感染會在皮膚中引 發(fā)強烈免疫應(yīng)答并防止宿主將來遭到野生型病毒的侵襲。
在一個實施例中，gE蛋白質(zhì)是HS—V'-l gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì) 是HSV-1 (NS)gE蛋白質(zhì)。在另-實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-K17)gE蛋白質(zhì)。在 另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-l (F) gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是 HSV-l(KOS)gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-l(CL101)gE蛋白質(zhì)。在 另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-l (麥金泰爾(MacIntyre)) gE蛋白質(zhì)。在另一實施 例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-1 (MP) gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是 HSV-l(17+syn) gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-l(KOS) gE蛋白質(zhì)。 在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是業(yè)內(nèi)己知的任何其它HSV-1 gE蛋白質(zhì)。
在一個實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-2 gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì) 是HSV-2(HG52)gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-2(2.12) gE蛋白質(zhì)。 在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-2(MS) gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì) 是HSV-2(186) gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是HSV-2(G) gE蛋白質(zhì)。在 另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是業(yè)內(nèi)已知的任何其它HSV-2 gE蛋白質(zhì)。
在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)是任何其它HSV-l或HSV-2gE蛋白質(zhì)，其在一個 實施例中與上文所列示的一種gE蛋白質(zhì)或核酸序列具有80%以上的同源性，在另一 實施例中具有85%以上的同源性，在另一實施例中具有95%以上的同源性，且在另一 實施例中具有98%以上的同源性。在另一實施例中，gE蛋白質(zhì)與HSV(NS)或HSV(17) 或二者具有98.6%的同源性。
在一個實施例中，gE蛋白質(zhì)是業(yè)內(nèi)已知的任何其它gE蛋白質(zhì)。在另一實施例中， gE蛋白質(zhì)是由業(yè)內(nèi)已知的任何Us8核苷酸編碼。在一個實施例中，Us8基因所具有 的核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703448或GeneID: 1487360所示的核酸序 列，或編碼糖蛋白E的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號 NP—044670.1或NP—044538.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是Us6基因失活。在一個實施例中，Us6基因所具有的核酸 序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703444 、 GeneID: 1487358 、 NC_001806、 NC—001798、 EU029158、 EF177451、 EF177450、 EF157322、 EF157321、 EF157320、 EF157319、 Z86099、 AJ004801 、 X14112、 AF147806、 AY779754、 AY779753、 AY779752、 AY779751、 AY779750、 AY517492、 AY155225、 AB016432、 AF02B42、 U12183、 U12182、 U12181、 U12180、或InterPro:IPR002896所示的核酸序列，或編碼糖蛋白D 的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中，對應(yīng)于以下基因庫登錄號所示者NP—044668.1、 NP一044536.1 、 CAA38245 、 AAB59754 、 AAA 19629 、 AAA19631 、 AAA19630 、AAK93950 、 ABS84899 、 ABM66848 、 ABM66847 、 AAW23134 、 AAW23133 、 AAW23132、 AAW23131、 AAW23130、 AAS01730 、 ABM52981 、 ABM52980 、 ABM52979、 ABM52978、 AAN74642、 AA026211、 AAL90884、 AAL90883、 AAK19597、 AAA45785、 BAA00020、 AAB60555、 AAB60554、 AAB60553、 AAB60552、 AAA98962、 AAA98963、 AAA45842、 AAA45786、 VGBEDZ、 CAB06713、 CAA32283、 AAB72102、 或CAB06713.1。
在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是任何其它HSV-l或HSV-2gD蛋白質(zhì)，其在一個 實施例中與上文所列示的一種gD蛋白質(zhì)或核酸序列具有80%以上的同源性，在另一 實施例中具有85%以上的同源性，在另一實施例中具有95%以上的同源性，且在另一 實施例中具有98%以上的同源性。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是Us9基因失活。在一個實施例中，Us9基因所具有的核酸 序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703452或GeneID: 1487362所示的核酸序列，或編 碼Us9膜蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NPJ)44672.1 或NPJ)44540.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是Us5基因失活。在一個實施例中，Us5基因所具有的核酸 序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703406或GeneID: 1487357所示的核酸序列，或編 碼糖蛋白J的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NP—044667.1或 NP—044535.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是Us4基因失活。在一個實施例中，Us4基因所具有的核酸 序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703404或GeneID: 1487356所示的核酸序列，或編 碼糖蛋白G的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NP_044666.1或 NP—044534.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL53基因失活。在一個實施例中，UL53基因所具有的 核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703425或GeneID: 1487342所示的核酸序列， 或編碼糖蛋白K的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NP_044656.1 或NP—044524.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL10基因失活。在一個實施例中，UL10基因所具有的 核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703379或GeneID: 1487293所示的核酸序列， 或編碼糖蛋白M的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NPJ)44611.1 或NPJ)44479.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活
33突變，其在一個實施例中是UL1基因失活。在一個實施例中，UL1基因所具有的核 酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703393或GeneID: 1487292所示的核酸序列，或 編碼糖蛋白L的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NP—044602.1 或NP—044470.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL22基因失活。在一個實施例中，UL22基因所具有的 核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703373或GeneID: 1487306所示的核酸序列， 或編碼糖蛋白H的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NP—044623.1 或NP—044491.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL27基因失活。在一個實施例中，UL27基因所具有的 核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703455或GeneID: 1487312所示的核酸序列， 或編碼糖蛋白B的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NPJ)44629.1 或NPJ)44497.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL44基因失活。在一個實施例中，UL44基因所具有的 核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703410或GeneID: 1487331所示的核酸序列， 或編碼糖蛋白C的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號NPJ)44646.1 或NPJ)44514.1所示者。
在一個實施例中，本發(fā)明方法的和用于本發(fā)明方法中的HSV菌株包含額外失活 突變，其在一個實施例中是UL49a基因失活。在一個實施例中，UL49a基因所具有 的核酸序列對應(yīng)于基因庫登錄號GenelD:2703419或GeneID: 1487337所示的核酸序 列，或編碼糖蛋白N的蛋白質(zhì)序列，其在一個實施例中對應(yīng)于基因庫登錄號 NP_044652.1或NP—044520.1所示者。
在另一實施例中，額外突變是在HSV-1或HSV-2糖蛋白中，在一個實施例中其 與上文所列示的一或多種糖蛋白具有80%以上的同源性，在另一實施例中具有85% 以上的同源性，在另一實施例中具有95%以上的同源性，且在另一實施例中具有98% 以上的同源性。
在一個實施例中，本發(fā)明的和用于本發(fā)明中的HSV菌株在編碼gD的基因中包 含失活突變，在一個實施例中所述基因是Us6。在另一實施例中，本發(fā)明的和用于本 發(fā)明中的HSV菌株在編碼gE的基因中包含失活突變，在一個實施例中所述基因是 Us8。在另一實施例中，本發(fā)明的和用于本發(fā)明中的HSV菌株在編碼gE的基因和編 碼gD的基因中包含失活突變。在一個實施例中，引入Us6突變以衰減包含Us8突變 的高毒力HSV菌株的毒力。在一個實施例中，Us6突變可減少病毒入侵。Us6突變以 及本發(fā)明的任何突變可在HSV-1或HSV-2或二者中。在一個實施例中，HSV-1 gD 與HSV-2 gD具有較大程度的同源性。在一個實施例中，HSV-1 gD與HSV-2 gD的氨基酸序列具有81%的同源性，或在另一實施例中80%以上的同源性，或在另一實施例
中85%以上的同源性，或在另一實施例中90%以上的同源性，或在另一實施例中95% 以上的同源性。在一個實施例中，HSV-1 gD與HSV-2gD的核酸序列具有85呢的同 源性，或在另一實施例中80%以上的同源性，或在另一實施例中85%以上的同源性， 或在另一實施例中90%以上的同源性，或在另一實施例中95%以上的同源性。 在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中得到的gD蛋白質(zhì)具有以下序列 MGGTAARLGAVILFWIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLD GLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVIXNAPSEAPQIVRG ASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRT(2PR麗YY DSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLV腿DWTEIT(2FILEHRAKGSCKYALP LRIPPSACLSPQAYGGGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPKAPYTST LLPPELSETPNAT(3PELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSI(5DAATPYHPP ATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDq PSSHQPL (SEQ ID No: 14)。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 14的同源物。 在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQIDNo: 14的變體。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì) 是SEQIDNo: 14的異構(gòu)體。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 14的片段。 在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)包含SEQIDNo: 14。在一個實施例中，gD氨基酸序列 是HSV-1氨基酸序列。
在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是由具有以下序列的核苷酸序列編碼 gtggccccggcccccaacaaaaatcacggtagcccggccgtgtgacactatcgtccataccgaccacaccgacgaaccc ctaagggggaggggccattttacgaggaggaggggtataacaaagtctgtctttaaaaagcaggggttagggagttgttcggtcat aagcttcagcgcgaacgaccaactaccccgatcatcagttatccttaaggtctcttttgtgtggtgcgttccggtatgggggggactg ccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctct caagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgt gtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcc tgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcgg鄉(xiāng)ccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaacccta caacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaa gtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctgggg ttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtt tatcctggagc3ccgagcc3agggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgc3tccccccgtcagcctgcctctccccccaggcc taccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacag cttgaagatcgccgggtggcacgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacg ccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaat cccaccaaactggcacatcccgtcg3tccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggcc3ccccgaac3ac噸ggcctg3t cgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagc ccc犯agcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactagatacccccccttaatgggtgcgggggggtcaggtctgcggggttgggatgggaccttaactccatataaagcgagtctggaaggggggaaaggcgg
(SEQ ID No: 15)。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是由為SEQ ID No: 15同源物的核苷酸 分子編碼。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 15的變體。在另一實施例中， 核苷酸分子是SEQIDNo:15的異構(gòu)體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQ ID No: 15的片段。在另一實施例中，核苷酸分子包含SEQIDNo: 15。在一個實施例中，gD 核苷酸序列是HSV-1核苷酸序列。
在一個實施例中，本發(fā)明方法和組合物中所述的gD蛋白質(zhì)具有以下序列 MGRLTSGVGTAAIXVVAVGL證CAKYALADPSL腿ADPNRFRGKNLPVLD GLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRSVLLHAPSEAPQ1VRG ASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYY DSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVK歸WTEITQFILEHRARASCKYALP
LLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIGDVAPHHAPA APSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRACJMAPKRLRLPHIRDDDAPPSHGPL FY (SEQ ID No: 16)。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 16的同源物。在另 一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 16的變體。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQ ID No: 16的異構(gòu)體。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是SEQIDNo: 16的片段。在另一 實施例中，gD蛋白質(zhì)包含SEQIDNo: 16。在一個實施例中，gD氨基酸序列是HSV-2 氨基酸序列。
在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是由具有以下序列的核苷酸序列編碼 atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc cgcgtcgtct gcgccaaatacgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac agcatcggga tgctaccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac tcggccctct tagaggatcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggtgc tggtcatcgg cggtattgcg ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg gatgacgacg
36cgcccccctcgcaccagcca ttgttttact ag (SEQ ID No: 17)。在另一實施例中，gD蛋白質(zhì)是由 為SEQIDNo: 17同源物的核苷酸分子編碼。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQID No:17的變體。在另一實施例中，核苷酸分子是SEQIDNo: 17的異構(gòu)體。在另一實 施例中，核苷酸分子是SEQID No: 17的片段。在另一實施例中，核苷酸分子包含SEQ ID No: 17。在一個實施例中，gD核酸序列是HSV-2核酸序列。
在一個實施例中，編碼gD的基因中的失活突變包含HSV-1 gD或HSV-2 gD的 氨基酸3上的丙氨酸突變成半胱氨酸的突變(A3C)。在另一實施例中，編碼gD的基 因中的失活突變包含以下突變HSV-1 gD或HSV-2 gD的殘基3上的丙氨酸突變成 半胱氨酸(A3C)、殘基2上的酪氨酸突變成丙氨酸(Y2A)、殘基4上的亮氨酸突變成丙 氨酸(L4A)或其組合。在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變包含HSV-1 gD 或HSV-2gD的殘基3上的丙氨酸缺失、殘基2上的酪氨酸缺失、殘基4上的亮氨酸 缺失或其組合。在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變包含氨基酸位置38、 222、 223、 215或其組合上的突變。在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變 包含Y38C突變，而在另一實施例中，其包含R222N、 F223I、 D215G突變或其組合。
在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變包含氨基酸2和3、 3和4、 2-4、 1-5、 1-7、或1-10中的突變。在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變基本上 由HSV-1 gD或HSV-2 gD的氨基酸3上的丙氨酸突變成半胱氨酸的突變(A3C)組成。 在另一實施例中，編碼gD的基因中的失活突變由HSV-1 gD或HSV-2gD的氨基酸3 上的丙氨酸突變成半胱氨酸的突變(A3C)組成。在一個實施例中，用于描述突變位置 的編號方式是指在信號序列裂解后成熟肽的氨基酸編號方式，在一個實施例中，其為 HSV-1或HSV-2 gD的最初25個氨基酸，如業(yè)內(nèi)所習(xí)知。
依照本文且在一個實施例中，包含gD中的突變的本發(fā)明突變體HSV菌株具有 降低的毒力(實例21)且能夠到達DRG (實例22)。在另一實施例中，用本發(fā)明包 含gD中的突變的突變體HSV菌株接種疫苗可在后來感染有毒HSV后防止?jié)摲麳SV 感染(實例23)。在另一實施例中，接種疫苗可防止由潛伏HSV感染引起或與其有 關(guān)的疾病。在另一實施例中，接種疫苗本身不會引起明顯疾病。
在一些實施例中，在本文所述的任何形式或?qū)嵤├校景l(fā)明方法的和用于本發(fā) 明方法的任何突變體HSV菌株將包含本發(fā)明的失活突變。在一些實施例中，在本文 所述的任何形式或?qū)嵤├?，本發(fā)明的任何突變體HSV菌株將由本發(fā)明的失活突變 組成。在一些實施例中，在本文所述的任何形式或?qū)嵤├?，本發(fā)明的突變體HSV 菌株將基本上由本發(fā)明的失活突變組成。在一些實施例中，術(shù)語"包含"是指包括諸 如gE或gD中的突變等失活突變、以及包括業(yè)內(nèi)已知的其它突變。在一些實施例中， 術(shù)語"基本上由其組成"是指僅菌株的功能突變是指定的功能突變，然而，也可包括 與菌株效用不直接相關(guān)的其它突變。在一些實施例中，術(shù)語"由其組成"是指菌株含 有特定基因的突變或特定突變。
在一個實施例中，可使用質(zhì)?；パa來補充失活突變，在一個實施例中，此容許至少一輪本發(fā)明突變體HSV感染。
在一個實施例中，本發(fā)明提供用于阻止個體中形成帶狀皰疹樣損傷的組合物，所
述組合物包含本發(fā)明的突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供用于阻止個體中皰疹性眼睛疾病的組合物，所述組
合物包含本發(fā)明的突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供用于向個體接種疫苗以防HSV感染的組合物，所 述組合物包含本發(fā)明的突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供用于阻止個體中HSV感染的組合物，所述組合物 包含本發(fā)明的突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明提供用于阻止個體中皰疹介導(dǎo)的腦炎的組合物，所述組 合物包含本發(fā)明的突變體HSV菌株。
在一個實施例中，本發(fā)明gE蛋白質(zhì)與本文所揭示或列舉的肽同源。在一個實施 例中，當(dāng)提及任何蛋白質(zhì)或肽時，術(shù)語"同源性"、"同源的"等是指在比對序列并 引入間隙(若需要，以達成最大百分比同源性)后候選序列中與對應(yīng)天然多肽殘基相 同的氨基酸(AA)殘基的百分比，且不應(yīng)將任何保守置換視為序列一致性的一部分。用 于比對的方法和計算機程序在業(yè)內(nèi)已眾所周知。
在一個實施例中，同源性是通過業(yè)內(nèi)充分闡述的方法通過用于序列比對的計算機 算法來測定。例如，核酸序列同源性的計算機算法分析可包括使用任何數(shù)量的可用軟 件包，例如BLAST、 DOMAIN、 BEAUTY (BLAST增強比對效用(BLAST Enhanced Alignment Utility)) 、 GENPEPT和TREMBL包。
在一個實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有70%以上 的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有72% 以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有75%以 上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有 78%以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQ ID No: 2-7之一具有80% 以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有82呢以 上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有 83%以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQ ID No: 2-7之一具有85% 以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQ ID No: 2-7之一具有87%以 上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有 88%以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQ ID No: 2-7之一具有90% 以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有92免以 上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有 93%以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQ ID No: 2-7之一具有95% 以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與選自SEQ ID No: 2-7的序列具有 96%以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有979fc
38以上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有98呢以 上的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有99免以上 的一致性。在另一實施例中，"同源性"是指與SEQIDNo:2-7之一具有100呢的一致性。
在一個實施例中，同源性是經(jīng)由測定候選序列雜交來測定，此方法業(yè)內(nèi)已充分闡 述(參見，例如，"核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)",黑姆斯(Hames BD)和希 金斯(HigginsSJ)編輯，(1985);薩姆布魯克等人，2001，分子克隆-實驗室手冊，冷泉 港出版社，紐約；和奧蘇貝爾(Ausubel)等人，1989，分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols in Molecular Biology),格林出版協(xié)會和約翰威立公司(Green Publishing Associates and Wiley Interscience)，紐約)。在其它實施例中，在中等至嚴(yán)格條件下實 施與編碼天然半胱天冬酶肽的DNA補體的雜交方法。例如，雜交條件為在42'C下于 包含以下的溶液中過夜培育10-20%甲酰胺、5XSSC (150mMNaCl、 15 mM檸檬 酸三鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、 5 X丹哈德溶液(Denhardt's solution)、 10%硫酸葡 聚糖、和20 pg/ml變性已剪切的鮭魚精DNA。
在一個實施例中，通過業(yè)內(nèi)充分闡述的方法(包括免疫印跡分析)或經(jīng)由AA序 列的計算機算法分析使用眾多可用軟件包的任何一種經(jīng)由既定方法來測定本文所列 示任何AA序列的蛋白質(zhì)和/或肽同源性。這些軟件包的一些包括FASTA、 BLAST、 MPsrch或Sca叩s軟件包，且在另一實施例中，例如，利用使用史密斯(Smith)和沃特 曼(Waterman)算法、禾口/或全局/局部(global/local)或BLOCKS比對來分析。
在一個實施例中，"變體"是指與大多數(shù)群體不同但與普通模式仍然充分類似可 視為其中之一的氨基酸或核酸序列(或在其它實施例中是生物體或組織)，例如剪接 變體。
在一個實施例中，"異構(gòu)體"是指由相同元素以相同比例構(gòu)成但由于原子排列不 同而具有不同化學(xué)和/或生物學(xué)特性的兩種或更多種物質(zhì)中的任何一種，在一個實施
例中其為立體異構(gòu)體，在另一實施例中其為組成型異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。在一個實施 例中，異構(gòu)體是光學(xué)異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體、幾何異構(gòu)體、D-和L-異構(gòu)體、位置異構(gòu) 體、或順-反異構(gòu)體。
在本發(fā)明的一個實施例中，"核酸"或"核苷酸"是指至少兩個堿基-糖-磷酸組 合的串。在一個實施例中，所述術(shù)語包括DNA和RNA。在一個實施例中，"核苷酸" 是指核酸聚合物的單體單元。在一個實施例中，RNA呈以下形式tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)、 snRNA (小核RNA) 、 rRNA (核糖體RNA) 、 mRNA (信使RNA)、反義RNA、 小抑制RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)和核酶。siRNA和miRNA的用途已有闡述 (考迪(Caudy AA)等人，基因與發(fā)育(Genes & Devel) 16: 2491-96和其中所引用的參考 文獻)。在其它實施例中，DNA可呈質(zhì)粒DNA、病毒DNA、線狀DNA、或染色體 DNA或這些類別DNA的衍生物形式。另外，這些DNA和RNA形式可為單鏈、雙 鏈、三鏈、或四鏈。在另一實施例中，所述術(shù)語也包括含有其它類型主鏈但相同堿基的人工核酸。在一個實施例中，人工核酸是PNA (肽核酸)。PNA含有肽主鏈和核 苷酸堿基且在一個實施例中能夠結(jié)合DNA和RNA分子二者。在另一實施例中，核 苷酸經(jīng)環(huán)氧丙垸修飾。在另一實施例中，通過用硫代磷酸酯鍵代替一或多個磷酸二酯 鍵對核苷酸進行修飾。在另一實施例中，人工核酸含有業(yè)內(nèi)已知的天然核酸的磷酸主 鏈的任何其它變體。硫代磷酸酯核酸和PNA的使用已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知， 且闡述于(例如)尼爾森(Neilsen PE)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點(Curr Opin Struct Biol) 9:353-57;和拉茲(Raz NK)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem Biophys Res Commun.) 297:1075-84。核酸的產(chǎn)生和使用已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知，且 闡述于(例如)分子克隆(Molecular Cloning), (2001)，薩姆布魯克和拉塞爾(Russell) 編輯；和酶學(xué)方法真核細胞中的分子克隆方法(Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells), (2003)，普爾丘(Purchio)和法瑞德(G. C. Fareed)。
在一個實施例中，本發(fā)明提供包含在實施本發(fā)明方法中所使用的化合物或組合物 的試劑盒。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明組合物、工具、或裝置的試劑盒。
在一個實施例中，"接觸"是指使靶細胞與本發(fā)明的突變體HSV菌株直接接觸。 在另一實施例中，"接觸"是指使靶細胞與本發(fā)明突變體HSV菌株間接接觸。因此， 在一個實施例中，本發(fā)明方法包括如下方法使個體與突變體HSV菌株接觸以通過 擴散或業(yè)內(nèi)已知的任何其它主動運輸或被動運輸過程(化合物借此在體內(nèi)循環(huán))使突 變體HSV菌株與靶細胞接觸。
在本發(fā)明方法的一個實施例中，突變體HSV菌株在個體血流中被攜帶到靶細胞。 在另一實施例中，通過擴散將突變體HSV菌株攜帶到靶細胞。在另一實施例中，通 過主動運輸將突變體HSV菌株攜帶到靶細胞。在另一實施例中，突變體HSV菌株是 以可直接接觸靶細胞的方式投與到個體中。
醫(yī)藥組合物和投與方法
在一個實施例中，本發(fā)明方法包含投與包含突變體HSV菌株和醫(yī)藥上可接受的 載劑的醫(yī)藥組合物。
在一個實施例中，"醫(yī)藥組合物"是指治療有效量的活性成份(即突變體HSV 菌株)與醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑。在一個實施例中，"治療有效量"是指對于 給定病狀和投與方案可提供治療效果的量。
在一個實施例中，可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所習(xí)知的任何方法將含有突變體 HSV菌株的醫(yī)藥組合物投與到個體中，例如非經(jīng)腸、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、 皮內(nèi)、皮下、腹膜腔內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、陰道內(nèi)或瘤內(nèi)。
在如本發(fā)明方法和組合物中所述的另一實施例中，醫(yī)藥組合物是經(jīng)口投與，且因 此以適于經(jīng)口投與的形式經(jīng)調(diào)配，即以固體或液體制劑形式。適宜固體經(jīng)口調(diào)配物包 括片劑、膠囊、丸劑、顆粒劑、小藥丸和其類似物。適宜液體經(jīng)口調(diào)配物包括溶液、 懸浮液、分散液、乳液、油狀物和其類似物。在本發(fā)明的另一實施例中，將活性成份 調(diào)配于膠囊中。根據(jù)此實施例，除活性化合物和惰性載劑或稀釋劑外，本發(fā)明組合物
40也包含硬凝膠化膠囊。
在另一實施例中，所述醫(yī)藥組合物是通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、或肌內(nèi)注射液體制劑 來投與。適宜液體調(diào)配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油狀物和其類似物。在 另一實施例中，所述醫(yī)藥組合物是經(jīng)靜脈內(nèi)投與且因此將其調(diào)配成適于靜脈內(nèi)投與的 形式。在另一實施例中，所述醫(yī)藥組合物是經(jīng)動脈內(nèi)投與且因此將其調(diào)配成適于動脈 內(nèi)投與的形式。在另一實施例中，所述醫(yī)藥組合物是經(jīng)肌內(nèi)投與且因此將其調(diào)配成適 于肌內(nèi)投與的形式。
在另一實施例中，所述醫(yī)藥組合物是經(jīng)局部投與到身體表面且因此將其調(diào)配成適 于局部投與的形式。適宜局部調(diào)配物包括凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、滴劑和其類似物。 對于局部投與，制備突變體HSV菌株并以存于含有或不含有醫(yī)藥載劑的生理學(xué)上可 接受的稀釋劑中的溶液、懸浮液、或乳液形式施用。
在另一實施例中，本文提供的醫(yī)藥組合物是受控釋放組合物，即組合物中的突變 體HSV菌株在投與后經(jīng)一段時間釋放出來。受控或持續(xù)釋放組合物包括存于親脂貯
藏物質(zhì)(例如脂肪酸、蠟、油)中的調(diào)配物。在另一實施例中，所述組合物是立即釋
放組合物，即組合物中的所有突變體HSV菌株在投與后立即釋放出來。
上文添加劑、賦形劑、調(diào)配物和投與方法中的每一者均代表本發(fā)明的單獨實施例。
實驗細節(jié)部分
實例l: HSV(化蹄)不引起疾病 材料和實驗方法(實例l-4)
錄泰蘿拔
使用低傳代數(shù)臨床分離物野生型HSV-1菌株NS來產(chǎn)生突變體病毒。為構(gòu)建 HSV-1 (gE無效)，用Xbal將全部gE編碼序列自pCMV3gE-l切除并克隆到pSPT18中。 pSPT18具有以下序列
gaatacaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattccggtctccctatagtgagt cgtattaatttcgataagccagctgggcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggt cacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcag ccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccat atgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcg ctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagga aagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccc cctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctg gaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct caatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgac cgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacag gattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttg gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagt
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3tcaatctaaagtat3totg3gta肌cttggtctg3C3gttoccaatgcttaatC3gtg郷cacctotctcagcgatctgtctatttcgtt
catccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgc
gagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactt
tatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattg
ctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccc
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gaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtattt
sgaaaaBtaaacaaatoggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccscctgacgtctaagaaaccattattatcatgscattaac
ctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgga
gacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggg
gctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccccc
ggccacgggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgat
gtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatctggctag
cgatgaccctgctgattggttcgctgaccatttccgggtgcgggacggcgttaccagaaactcagaaggttcgtccaaccaaaccg
actctgacggcagtttacgagagagatgatagggtctgcttcagtaagccagatgctacacaattaggcttgtacatattgtcgttaga
acgcggctacaattaatac3t犯ccttatgtatc加cacatacgatttaggtgac3ctata (SEQ ID No: 1)。
自氨基酸(AA) 124-508切除1.1 kb HpaI-BglII片段，并將Hpal位點改變成BglII 位點。將在HSVICP6啟動子控制下來源于含有大腸桿菌(Kyc/^n'c&a co"') |3-半乳糖苷 酶基因(p-gal)的pD6P的4.3 kb片段克隆到BglII位點中。所得載體含有ICP6::lacZ盒 的374 bp NS DNA序列5'和225 bp 3'并使用其來構(gòu)建gE無效病毒。分離出含有側(cè)翼 序列載體的Xbal片段，并將750 ng Xbal片段與1.0昭NS DNA通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn) 染到非洲綠猴腎細胞(Verocell)中。移除DNA-磷酸鈣混合物，并用15%甘油使細胞休 克。當(dāng)在30-40%的細胞中觀察到細胞病變效應(yīng)時，收獲細胞并實施超聲處理以制備 病毒庫。通過感染非洲綠猴腎細胞并覆蓋0.5%瓊脂糖、5.0呢胎牛血清(FBS)、和300昭 5-溴-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)來選擇表達(3-gal的重組gE無效病毒。挑選藍色噬斑并 在X-Gal瓊脂糖覆蓋物中純化兩次并通過限制稀釋純化一次。在5-70%蔗糖梯度上自 受感染非洲綠猴腎細胞的上清液提純病毒。
通過用1.0昭NS-gE無效DNA和1.5昭野生型gE片段(純化自pCMV3gE-l) 共轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞來制備HSV-l(g救gE無效)，pCMV3gE-l是通過用Nrul消化HSV-1(NS) DNA來獲得。通過使用抗gE MAb 1BA10實施免疫過氧化物酶染色來檢查子代 病毒以證實gE在受感染細胞表面上表達。通過限制稀釋來純化噬斑，并制備病毒庫。 使病毒原液以2.0 MOI在匯合非洲綠猴腎細胞(Vero cell)(非洲綠猴腎上皮細胞 系)上生長。感染后24小時，在培養(yǎng)基中刮除細胞并在3,000 xg下離心。移除差不 多l(xiāng)mL上清液，并再懸浮細胞，超聲處理3秒并分配成50mcL (微升)分液。對于 模擬感染，使用未經(jīng)感染細胞來制備類似分液。 </、嚴(yán)纖,染方菜
所有實驗方案均經(jīng)賓夕法尼亞州大學(xué)(University of Pennsylvania)動物和實驗室 資源IACUC委員會批準(zhǔn)。使五周至六周齡BalbC小鼠(美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute))適應(yīng)恒定溫度和光周期(12小時光照，12小時黑暗)的生物安全2 級動物設(shè)施達1周。給小鼠剃毛并用脫毛乳膏(奈爾(Nair)TM)沿右側(cè)腹(用于接種 疫苗)或左側(cè)腹(用于攻擊)進行脫毛，隨后用溫水洗滌。第二天，經(jīng)由腹膜腔內(nèi)注 射75 mcL存于PBS中的14.3 mg/ml氯胺酮和1.8 mg/ml甲苯噻嗪使小鼠麻醉，隨后 通過在1 cn^側(cè)腹面積(距脊柱1 cm的背側(cè))中用26號(3/8)計量注射針表面刮痕60 次借助10 mcL含有5x 103 - 5 x 105 pfu HSV的微滴進行感染(圖1)。在側(cè)腹受HSV 感染的小鼠中，自一或多個脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元繼發(fā)性擴散回皮膚導(dǎo)致帶狀損傷(圖2)。 通過用C02窒息、繼之頸椎脫臼宰殺小鼠。自接種后第3天開始以24小時間隔觀察 小鼠以記錄皮膚損傷和疾病的外觀和嚴(yán)重程度。使用用以描述損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)化 評分系統(tǒng)來使觀察結(jié)果一致(圖3)。 麥辨資勞微擊
對于接種疫苗，通過在右側(cè)腹上造成刮痕借助含有HSV-1 (gE無效)或無病毒 細胞溶解產(chǎn)物(上文所述)的接種物使小鼠受感染。28天后借助含有1 x 105 pfuHSV-l (NS)的微滴通過刮痕在相對(左)側(cè)腹上對小鼠進行攻擊。 麟紫餅經(jīng)微激
取下沿脊柱右側(cè)(用于接種HSV-1
(gE無效)
疫苗或HSV-1 (拯救gE無效) 感染分析)或 左側(cè)(用于HSV-1(NS)攻擊分析)的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，集中并置于110mcLDMEM (2.5呢FBS)中并在-8(TC下冷凍，直至分析。
取下接種位點處1 crr^面積的皮膚。將一半樣品置于含有110mcLDMEM(2.5% FBS)的管中并在-8(TC下冷凍直至分析。將另一半置于含有類似樣品的索引卡上并在4 。C下于存于1XPBS中的4%多聚甲醛中浸沒24小時，隨后用1XPBS代替所述溶液。 將樣品保存在4'C下直至組織學(xué)分析處理。 薪、資織學(xué)微鄉(xiāng)織眾學(xué)
由費城兒童醫(yī)院(Children's Hospital of Philadelphia)的病理學(xué)核心設(shè)施(Pathology Core Facility)對皮膚樣品實施石蠟包埋、切片和染色。使用抗HSV-1兔多克隆抗體 (DAKO)針對HSV-1抗原對皮膚切片進行染色并用蘇木素對比染色。
43通過103.5、 104'5、或105'5噬斑形成單位(pfu)疫苗菌株HSV-l(gE無恥劃痕使具有 五只小鼠的群組側(cè)腹感染。為與HSV-1的有毒形式進行比較，將具有五只小鼠的另 一群組用10"pfuHSV-l (拯救gE無效) 側(cè)腹感染，所述HSV-1 (拯救gE無效) 疫苗菌株主鏈的編 碼gE的基因已恢復(fù)。HSV-l(述救gE無效)感染導(dǎo)致疾病和60呢的死亡率(圖4)。然而， 在HSV-1 (gE無效)接種疫苗后未出現(xiàn)疾病、病或死亡的臨床體征。
另外，HSV-1麵gE無效)感染導(dǎo)致看似潰瘍性和壞死性的嚴(yán)重原發(fā)性損傷(圖5)。 相比之下，HSV-1 (gE，,感染導(dǎo)致與模擬接種疫苗無差別的接種位點處的輕微皮膚病 變。因此，在投與HSV-l(gE無奶后的所有或基本上所有皮膚病變均由刮痕接種過程本 身造成。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，感染gE無效皰疹病毒不會引起疾病。
實例2: HSV (&就)不在感覺神經(jīng)元中擴散
HSV-1消救gE絲)感染造成嚴(yán)重繼發(fā)性(帶狀皰疹樣)潰瘍性和壞死性損傷，所述 損傷在4-5 (感染后天數(shù))dpi時首次出現(xiàn)(圖6)。相比之下，HSV-l(gE無效,感染后 未看見繼發(fā)性損傷。由于沿生皮節(jié)的繼發(fā)性損傷形成取決于病毒沿神經(jīng)元自皮膚到神 經(jīng)節(jié)和隨后再反向擴散的能力，因此這些結(jié)果顯示疫苗不能在感覺神經(jīng)元中擴散。因 此，HSV(gE無效)不能引起復(fù)發(fā)感染。
實例3: HSV^^，可在皮膚細胞中復(fù)制
為測定HSV-1 (gE無效)在皮膚細胞中的復(fù)制程度，使小鼠(n-3)感染HSV-1 (gE無效)或 有毒HSV-l(揚救gE無效)。在接種后l、 3、 6、 8和13天，宰殺小鼠，取下接種位點處的 皮膚，并集中來自每只小鼠右側(cè)的DRG。對均質(zhì)化組織進行滴定以測定其病毒含量， 揭示接種疫苗后HSV-1
(gE無效) 在皮膚中復(fù)制，但不及HSV-1
(拯救gE無效) 大量(圖7)。 此外，免疫細胞浸潤接種HSV-l(gE無效)疫苗的皮膚，且截止第6天病毒已被清除(圖 8)。
這些結(jié)果顯示HSV (gE無^在皮膚中復(fù)制，且因此預(yù)期會引發(fā)宿主炎癥應(yīng)答。 HSV-l(旌救gE無效)的含量超過HSV-l(gE無效)4個數(shù)量級(圖9)。另外，在感染HSV-1 ^e皿)小鼠的DRG中未檢測到傳染性病毒。在神經(jīng)節(jié)中不存在特征性帶狀模式損傷 和可檢測病毒證實在接種HSV-1 (gE絲)疫苗后未發(fā)生神經(jīng)元病毒擴散。
因此，gE不存在的HSV感染限于宿主皮膚，且免疫系統(tǒng)能夠快速檢測到病毒并 將其清除。
實例4:接種HSV-1 (w德疫苗可防止野生型HSV-1感染
在接種疫苗后28天用致死劑量的105 pfu WT HSV-1 (NS菌株)對模擬接種疫 苗或接種HSV-l(gE琉)疫苗的小鼠進行攻擊。盡管100%的模擬接種疫苗的小鼠在攻 擊后死亡，但100%的接種HSV-l(gE無影疫苗的小鼠歷經(jīng)致死攻擊而存活下來(圖10)。 HSV-l(gE無效)的所有測試劑量(103'5、 1045、禾口10"pfu)均可對抗攻擊。另夕卜，在對 接種HSV-1 (ge m)疫苗的小鼠進行攻擊后觀察到非常少的原發(fā)性(接種位點)疾病(圖 11)。接種疫苗小鼠的皮膚中具有不可檢測到的攻擊病毒含量，比模擬接種疫苗小鼠低至少5個數(shù)量級(圖12)。
與嚴(yán)重患病的模擬接種疫苗小鼠相比，在接種疫苗的小鼠中原發(fā)性疾病快速痊 愈。為證實此觀察結(jié)果，同等皮膚樣品的免疫組織化學(xué)展示第3天時在接種疫苗的小 鼠中存在非常少抗原且截止第6天已清除(圖13)。組織學(xué)分析也揭示，接種疫苗 的小鼠中免疫細胞明顯浸潤，顯示疫苗成功起動宿主免疫系統(tǒng)。
與模擬接種疫苗小鼠中病毒帶狀皰疹樣擴散導(dǎo)致嚴(yán)重生皮節(jié)損傷不同，在接種疫 苗小鼠中未看見帶狀皰疹樣疾病(圖14)。另外，在接種疫苗小鼠中在粉碎的DRG 中不能檢測到病毒滴度，且因此，此病毒滴度較模擬接種疫苗小鼠至少低4個數(shù)量級 (圖15)。
實例5:接種HSV (^m、疫苗可預(yù)防在隨后攻擊后 建立潛伏野生型HSV-1感染
材料和實驗方法
力邀織#嫩傳染絲諒泰
在宰殺后立即(在l、 3、 6、 8或13dpi)取下小鼠的DRG和皮膚樣品。對于每 一數(shù)據(jù)點感染三只小鼠，但對來自這些小鼠的類似組織單獨進行分析。將組織置于 110 mcL含有2.5% FBS的DMEM中并存儲于-80。C下直至分析。為測定病毒滴度， 解凍組織并使用用即棄研杵將其粉碎。通過在12孔盤中對匯合非洲綠猴腎細胞進行 噬斑分析來定量存于50 mcL連續(xù)稀釋(1:10、 1:100禾n l"OOO)上清液中的傳染性病 毒。
為自潛伏受感染小鼠取出傳染性病毒，自感染HSV-l(gE無效〕的相同(右)側(cè)取 DRG。將來自個體小鼠的所有DRG置于12孔盤的一個孔中，所述12孔盤含有浸泡 在DMEM (2.5% FBS)中的匯合非洲綠猴腎細胞。每兩天更換培養(yǎng)基并監(jiān)測細胞的細 胞病變效應(yīng)(CPE)跡象，其為DRG含有傳染性病毒的指示。
結(jié)果
在攻擊后28天，取出接種疫苗小鼠的DRG，并外植以使?jié)摲舨《緩?fù)活。在 取出后15只接種疫苗小鼠中僅1只的相關(guān)神經(jīng)元發(fā)生復(fù)活(圖16)。
此實例和先前實例的結(jié)果顯示，HSV(gE通)可保護小鼠免于攻擊后的神經(jīng)元感染 和免于通常伴隨WT HSV感染的潛伏感染發(fā)生。
實例6:給小鼠接種HSV-lAgE疫苗 可交叉保護對抗HSV-2攻擊
材料和實驗方法
使6-8周齡的雌性Balb/C小鼠適應(yīng)所述動物設(shè)施達10天。將小鼠麻醉并剃毛并 通過奈爾(Nair)處理右側(cè)腹移除毛發(fā)。第二天，給麻醉小鼠模擬接種疫苗或接種5x 105 pfuHSV-lAgE (在一個實施例中，其為gE無效形式)，此通過用26號(5/8)計量注
45射針刮痕60次借助10mcl (微升)接種物微滴來實施。27天后，如上將每只小鼠的 相對側(cè)腹(左側(cè))剃毛和脫毛。第二天(第28天)，通過刮痕接種105pfuHSV-2 (菌 株2.12)來攻擊小鼠。觀察小鼠并且每天對接種位點疾病、帶狀皰疹樣疾病和存活進 行評分。(評分0=無疾病=> 4=嚴(yán)重壞死性疾病)。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEM)。
結(jié)果
為測試接種HSV-lAgE疫苗防止HSV-2疾病的能力，用野生型HSV-2經(jīng)表皮攻 擊接種HSV4AgE疫苗的小鼠。接種HSV-lAgE疫苗的小鼠沒有一只死亡，而80% 的模擬接種疫苗小鼠死亡(圖17，上圖)。與未接種疫苗的小鼠相比，接種疫苗的 小鼠展示可快速痊愈的接種位點疾病(圖17，中圖)。另外，接種疫苗小鼠經(jīng)保護 完全免于模擬接種疫苗小鼠中所觀察到的帶狀皰疹樣疾病和死亡(圖17，下圖)。，
因此，接種AgE HSV疫苗能夠保護個體以防異源HSV疾病，甚至不同物種的 單純皰疹。
實例7:接種HSV-lAgE疫苗可對抗HSV-l(KOS) 并抑制HSV.l潛伏建立
材料和實驗方法
如先前實例中所述實施疫苗接種和疾病評價，只是使用5 x 105 pfu HSV-1菌株 KOS進行攻擊。為衡量潛伏感染，在攻擊后第41天宰殺小鼠，并取右側(cè)和左側(cè)DRG， 置于DMEM/10呢FBS中，用剪刀剪碎，并外植到亞匯合的非洲綠猴腎細胞單層上。 每天檢測培養(yǎng)物的噬斑形成(指示自潛伏狀態(tài)復(fù)活)，持續(xù)20天。
結(jié)果
此實驗測試接種HSV-lAgE疫苗保護小鼠免于與異源HSV-1野生型菌株有關(guān)的 疾病的能力。與未接種疫苗的小鼠相比，用野生型HSV-1菌株KOS攻擊的接種HSV-1 AgE疫苗的小鼠展示可快速痊愈的接種位點疾病(圖18,上圖)。另夕卜，接種HSV-1 AgE疫苗可保護受HSV-lKOS攻擊的小鼠完全免于帶狀皰疹樣疾病(圖18，中圖)。 由于HSV-1 KOS感染對于小鼠并非致死的，因此在攻擊后4周在模擬接種疫苗相對 于接種HSV-lAgE疫苗的小鼠中使用此菌株來比較病毒自潛伏狀態(tài)的復(fù)活。在模擬接 種疫苗的小鼠中，來自外植DRG的HSV-1 (KOS)病毒在100%小鼠(11=10)中復(fù)活，而 接種HSV-lAgE疫苗的小鼠中僅l/10(10呢)展示復(fù)活(圖18，下圖表)，其可能為疫 苗或攻擊病毒潛伏感染。因此，接種HSV-lAgE疫苗可有效保護小鼠免于疾病和通過 異源HSV病毒建立潛伏。
實例8:接種HSV-lAgE疫苗可對抗HSV-1陰道攻擊 材料和實驗方法
如實例6中所述實施疫苗接種。33天后，將于0.9% NaC1/10 mM HEPES緩沖液 中稀釋至IOO mcl總體積的乙酸甲羥孕酮(2 mg)(思科醫(yī)藥(Sicor Pharmaceuticals)公司，加利福尼亞州爾灣(IrvineCA))經(jīng)皮下注射到每只小鼠的頸部中。5天后(第38 天)，麻醉小鼠，用浸于PBS中的藻酸鈣拭子擦拭陰道內(nèi)，并通過陰道內(nèi)滴注5x105 pfuHSV-l (菌株NS)進行攻擊。使小鼠在其籠中恢復(fù)，以俯臥姿勢休息。每天觀察 受攻擊小鼠的陰道疾病和存活情況。每天取陰道內(nèi)擦拭物以用于通過在非洲綠猴腎細 胞上實施病毒滴定進行的分析。
繼
測試接種HSV-lAgE疫苗對抗野生型HSV-1陰道攻擊的能力。接種HSV-lAgE 疫苗的所有小鼠均歷經(jīng)攻擊而存活下來，而60%的模擬接種疫苗小鼠死亡(圖19A， 上圖)。所有模擬接種疫苗小鼠均在陰道部位顯示一些可見疾病體征；然而，接種 HSV-lAgE疫苗的小鼠則未顯示明顯可見疾病體征(圖19B)。截止陰道攻擊后第l 天，如在陰道擦拭物樣品中所檢測，接種HSV-lAgE疫苗的小鼠所具有的傳染性病毒 為模擬接種疫苗動物的1/100。截止攻擊后第3天，在來自接種HSV-lAgE疫苗小鼠 的擦拭物中未檢測到傳染性病毒，此值為相同天時模擬接種疫苗小鼠的1/至少 30,000。另外，接種HSV-lAgE疫苗的小鼠的感染清除比模擬接種疫苗小鼠快接近三 倍(圖19A，下圖)。因此，接種HSV-lAgE疫苗可防止死亡和與HSV-1陰道攻擊 有關(guān)的疾病并賦予快速清除HSV感染的能力。
實例9:經(jīng)表皮、皮下、和肌內(nèi)途徑接種HSV-l厶gE 疫苗均可對抗HSV.l攻擊
材料和實驗方法
用5 x 105 pfu HSV-lAgE通過借助10 mcl接種物微滴用26號(5/8)計量注射針刮 痕60次、經(jīng)皮下注射100 mcl接種物到頸背中、或通過肌內(nèi)注射100 mcl接種物到右 股后肌中來實施疫苗接種。
為衡量潛伏感染，在攻擊后32天宰殺小鼠，并取右側(cè)和左側(cè)DRG，置于 DMEM/10% FBS中，用剪刀剪碎，并外植到亞匯合的非洲綠猴腎細胞單層上。每天 (持續(xù)15天)檢測培養(yǎng)物的噬斑形成(指示自潛伏狀態(tài)復(fù)活)。
驢
將肌內(nèi)和皮下途徑投與HSV-lAgE疫苗的功效與先前實例中所用的表皮劃痕進 行比較。所有疫苗接種途徑均可有效保護小鼠以防HSV-1(NS)表皮攻擊后死亡(圖20， 上圖)。通過三種途徑的每一種接種疫苗的小鼠在HSV-1(NS)攻擊后均展示接種位點 疾病，僅略微大于模擬攻擊的小鼠(圖20，左下圖)。通過表皮劃痕或肌內(nèi)注射接 種HSV-lAgE疫苗可保護小鼠完全對抗帶狀皰疹樣疾病(圖20，右下圖)。攻擊后， 經(jīng)皮下途徑接種疫苗的小鼠有1/5具有數(shù)個不連續(xù)的帶狀皰疹樣損傷，其不嚴(yán)重且快 速消退(圖20，右下圖)。另外，也衡量疫苗防止?jié)摲腥镜哪芰?。?jīng)所有途徑接 種HSV-lAgE疫苗均可防止?jié)摲?表l)。模擬接種疫苗的小鼠顯示100%復(fù)活 (表1;也參見圖18)。
47表1.經(jīng)不同途徑接種HSV-1疫苗均可防止HSV潛伏。
疫苗接種途徑 自潛伏狀態(tài)復(fù)活
模擬 1/1
表皮劃痕 0/4 肌內(nèi) 0/5 皮下 1/5
因此，經(jīng)表皮、肌內(nèi)或皮下途徑投與HSV-lAgE各自均可對抗野生型HSV攻擊 的急性疾病、突發(fā)和潛伏疾病。
實例10:經(jīng)表皮劃痕、皮下注射和肌內(nèi)注射接種HSV-lAgE
疫苗可誘導(dǎo)中和抗體
如先前實例中所述給小鼠接種疫苗。在第21天，通過頸靜脈給小鼠放血。在第 28天，如上將每只小鼠的相對側(cè)腹(左側(cè))剃毛和脫毛。如下對血清樣品實施中和 分析在37。C下將50 mcl血清稀釋物(1:10到1:320)與5 mcl 102 pfu HSV-1 (NS) 培育1小時，并隨后接種非洲綠猴腎細胞單層。
結(jié)果
衡量經(jīng)表皮劃痕、肌內(nèi)、和皮下投與途徑接種HSV-lAgE疫苗對于誘導(dǎo)中和抗 體的功效。經(jīng)所有三種途徑給小鼠接種HSV-lAgE疫苗均可誘導(dǎo)中和抗體形成；表皮 劃痕和肌內(nèi)途徑比皮下接種疫苗產(chǎn)生顯著較高的量(圖21)。
實例11:接種HSV-lAgE疫苗可對抗多種異源HSV-1菌株的側(cè)腹攻擊
衡量接種HSV-lAgE疫苗對抗異源較高毒力野生型HSV-l菌株(F和n)的能 力；疫苗接種和攻擊如實例7中所述實施，只是使用不同菌株進行攻擊。接種HSV-1 AgE疫苗可完全保護小鼠免于HSV-1(NS)、HSV-1(F)和HSV-1(17)表皮攻擊后死亡(圖 22，上圖)。接種疫苗也會減少接種位點疾病，盡管HSV-1(F)攻擊會在接種位點造 成比HSV-1(NS)或HSV-1(17)攻擊略微較多的疾病(圖22，中圖)。而且，接禾中HSV-1 AgE疫苗可完全保護所有受HSV-1(NS)和HSV-1(17)攻擊的小鼠和2/3的受HSV-1(F) 攻擊的小鼠免于帶狀皰疹樣疾??；受HSV-1(F)攻擊的其它小鼠具有兩處小帶狀皰疹 樣損傷(圖22，下圖)。因此，接種HSV-lAgE疫苗可保護小鼠對抗多種異源HSV-l 菌株。
實例12:接種HSV-lAgE疫苗可對抗劑量髙達 1 X 107 PFU HSV-1(NS)的側(cè)腹攻擊
衡量接種HSV-lAgE疫苗對抗較高劑量野生型HSV-1的能力，如實例7中所述 實施疫苗接種和攻擊，只是使用105、 106或107 pfu HSV-1(NS)較高劑量進行攻擊。 接種疫苗的小鼠全部完全經(jīng)保護免于死亡和帶狀皰疹樣疾病(圖23，上圖和下圖)。 接種疫苗且用105 pfu HSV-1(NS)攻擊的小鼠展示的接種位點疾病比模擬攻擊小鼠略微嚴(yán)重，表明大多數(shù)疾病是由劃痕(針刮痕)造成。接種HSV-lAgE疫苗且用106或 107 pfu攻擊的小鼠的接種位點處疾病顯著減少，與模擬接種疫苗小鼠相比其快速痊愈
(中圖)。
實例13: HSV-2 (￡^^不引起疾病 材料和實驗方法
潘微虜奉
在含有熱滅活10%新生牛血清(生命技術(shù)公司(Life Technologies),蓋瑟斯堡 (Gaithersburg)，馬里蘭州(Md.))加上50微克(mcg)青霉素/ml、 50 mcg/ml鏈霉素/ml、 禾口0.15 mcg/ml兩性霉素B (Fungizone) (生命技術(shù)公司)的杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng) 基(Dulbecco's mod迅ed Eagle's medium)中于37。C和5% C02下培養(yǎng)非洲綠猴腎細胞 (ATCC CCL81)。自受感染非洲綠猴腎細胞單層制備HSV-2菌株的澄清原液并存儲于 -8(TC下直至使用。通過標(biāo)準(zhǔn)噬斑分析來測定病毒滴度。
如下引入編碼HSV-2 gE的1635 bp HSV-2 (2.12) Us8基因的堿基對(bp) 369-1479 缺失。將來自HSV-2(2.12)的兩種PCR片段，即對應(yīng)于具有擬定缺失的5'區(qū)域的658 bp 片段和具有擬定缺失的536 bp片段3'亞克隆到pBluescript SK+多克隆位點(MCS)中。 將5'側(cè)翼區(qū)域亞克隆到pBluescript SK+ MCS的Kpnl和HindIII位點中，并將3'側(cè)翼 區(qū)域亞克隆到MCS的Pstl和Sacl位點中。此留下介于5'與3'側(cè)翼區(qū)域之間的一段較 短MCS序歹U,包括EcoRI和EcoRV限制位點并造成移碼，由此僅表達gE的最初123 個氨基酸(圖24B)。將載體與HSV-2(2.12)基因組DNA共轉(zhuǎn)染到非洲綠猴腎細胞中 以實施同源重組。通過PCR來篩選自所得噬斑純化的病毒粒子DNA以檢測缺失納入。 證-2麟鮮離微,
在病毒接種前7天和1天用2.0 mg得普樂(Depo-Provera)(普強(Upjohn)，卡拉 馬祖市(Kalamazoo)，密執(zhí)安州(MI))經(jīng)皮下在頸背中對小鼠進行處理以使其動情周期 同步并增強其對于HSV-2陰道感染的易感染性。用藻酸鈣拭子(飛世爾科學(xué)(Fisher Scientific),匹茲堡(Pittsburgh)，賓夕法尼亞州(Pa.))進行濕潤和隨后干燥陰道擦拭， 然后將HSV-2病毒(104 pfu)滴注入陰道腔中。在接種后(p丄)14天期間每天評價動物的 癥狀性疾病(由陰道附近脫毛和紅斑來指示)。在接種后21天期間觀察存活。作為 感染的另一指標(biāo)，收集陰道擦拭物并在非洲綠猴腎細胞上檢驗病毒含量。
MM
使用與HSV-1 (實例l)所用類似的策略自菌株HG52構(gòu)建gE無效HSV-2病毒。 HSV-1 (NS) gE(實例1-5)與HSV-2 (HG52) gE序列72%—致且79%類似(陽性)(圖 24A)。另夕卜，也構(gòu)建HSV-2 (拯救gE無效) 菌株。
為測試HSV-2(gE無效)菌株是否會引起疾病，將10"pfu (在wt病毒情形下致死) wt HSV-2和HSV-2 (gE無效)菌株投與到單獨小鼠群組中。預(yù)期接受wt和HSV-2 (拯救^無 效)病毒的小鼠會死亡，同時預(yù)期接受HSV-2(gE無效)菌株的小鼠會存活，且預(yù)期不會展 示明顯疾病體征。
49實例14:接種HSV-2 (&壬紀(jì)疫苗可防止野生型HSV-2感染
材料和實驗方法
如先前實例中所述給小鼠接種HSV-2 (gE琉)疫苗或模擬接種疫苗，并在28天后 用致死劑量的WT HSV-2進行攻擊。預(yù)期接種HSV-2 (gE，)疫苗的小鼠在攻擊后不會 死亡，而預(yù)期模擬接種疫苗的小鼠會死于此感染。另外，預(yù)期接種HSV-2 (ge魏,疫苗 會大大減少或消除wt HSV-2攻擊后的原發(fā)性(接種位點)疾病。與模擬接種疫苗小 鼠中陰道附近預(yù)期出現(xiàn)脫毛和紅斑不同，在接種疫苗小鼠中預(yù)期不會觀察到帶狀皰疹 樣疾病。在攻擊后數(shù)天在接種疫苗小鼠中預(yù)期相同皮膚樣品的免疫組織化學(xué)展示大大 降低的抗原含量，此可證實上述觀察。預(yù)期組織學(xué)分析會揭示，接種疫苗的小鼠展示 免疫細胞明顯浸潤。
在另外實驗中，在小鼠側(cè)腹模型中對HSV-2 (gE魏)疫苗進行測試(實例4-5), 且預(yù)期可防止HSV-2感染。
實例15:接種HSV-2 (&fw疫苗對抗天竺鼠模型中 現(xiàn)存HSV-2生殖器感染的功效
材料和實驗方法
主遭器棘游天，微
在接種當(dāng)天，用預(yù)濕潤的藻酸鈣拭子使陰道封閉膜破裂。用干燥藻酸鈣拭子擦拭 陰道穹窿，并用注射器和20號計量塑料導(dǎo)管將10" pfu HSV-2滴注到陰道穹窿中。 此劑量是亞致死量的，同時使幾乎每只接種動物都感染。在急性生殖器感染期間，在 p.U4天期間每天評價動物的生殖器皮膚疾病和尿潴留。通過自0 (無疾病)到4 (嚴(yán) 重疾病，特征在于大潰瘍和衰弱)不等的皮膚損傷評分系統(tǒng)來定量疾病。在急性疾病 后，基于疾病嚴(yán)重程度來分配動物以產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)類似的群組。自p.i.21-56每天對每只 動物進行評分以確定外部復(fù)發(fā)皰疹性損傷的頻率。 豫泰微層
即使不存在疾病體征，天竺鼠仍本能地自陰道腔排出HSV-2?？稍?0-20%的來 自潛伏感染天竺鼠的陰道擦拭物中檢測到病毒DNA，此容許研究病毒排出頻率并比 較數(shù)量。在p.i.22-43天每天用頂端覆蓋有藻酸鈣的拭子擦拭陰道腔。使用QIAmp DNA提取系統(tǒng)(凱俊(Qiagen)公司，查茨沃思(Chatsworth)， CA)自每一擦拭物樣品 提取DNA，包括模擬擦拭物空白作為樣品污染的檢測物質(zhì)，并使用靶向DNA聚合酶 基因的引物經(jīng)PCR來定量HSV-2DNA。使用擴增單拷貝天竺鼠白蛋白基因的第二組 引物對于每一樣本實施單獨反應(yīng)以確定模板的質(zhì)量和量。使用所得498 bp擴增引物 來規(guī)范化DNA濃度并更定量性地估計每一樣本中的HSV-2負(fù)荷。比較陽性樣本與使 用MS HSV-2原液擴增的既定基因組等效物的一系列IO倍系列稀釋物。在基因擴增 (GeneAmp) PCR系統(tǒng)9600(珀金埃爾默(Perkin-Elmer)公司，諾沃克(Norwalk)， Conn.) 中進行反應(yīng)，先在95'C下進行2min"熱啟動"；隨后在95'C下進行35個變性周期，1 min，在65'C下復(fù)性1 min，和72。C下延伸1 min 30 s;和最后在72。C下延伸7 min。 通過DNA印跡來檢測每一樣品的擴增產(chǎn)物、陽性和陰性對照、和已知標(biāo)準(zhǔn)物系列。 HSV-2負(fù)荷是自線性關(guān)系推斷得出，所述線性關(guān)系是自與樣品平行擴增的已知基因組 等效物的系列稀釋物的帶密度確立。 #定服-2應(yīng)在效廣蘿餅經(jīng)穸柳潛微。
解剖骶骨背根神經(jīng)節(jié)(每只動物6-8節(jié))并稱重，通過使用QIAamp⑧DNA微型 試劑盒(凱俊(QIAGEN))來提取病毒DNA，并實施實時PCR。使用含有HSV-2gD 基因序列的純化質(zhì)粒來構(gòu)建每個實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將數(shù)據(jù)以對于天竺鼠乳清蛋白 DNA具有特異性的探針為基準(zhǔn)進行規(guī)范化。
MM
使用天竺鼠模型來評價iss對抗復(fù)發(fā)皰疹性疾病的功效。此模型提供與人類
HSV-2感染中所見類似的天然存在復(fù)發(fā)疾病，且受潛伏感染的天竺鼠以類似于人類中 所觀察到的頻率經(jīng)陰道排出病毒。
給天竺鼠接種HSV-2 (gE無效)疫苗或模擬接種疫苗并在28天后用105'7 pfu HSV-2 進行攻擊。預(yù)期與模擬接種疫苗的動物相比接種HSV-2 (gE無效)疫苗會顯著降低生殖器 損傷發(fā)生的頻率并減少經(jīng)歷任何復(fù)發(fā)的動物的數(shù)量。另外，預(yù)期接種HSV-2(gE誠)疫 苗會顯著降低病毒排出量。
為測試接種HSV-2 (gE無效)疫苗對潛伏HSV-2感染建立的影響，對wt HSV-2病毒 基因組在天竺鼠DRG中的聚集進行評價。預(yù)期接種HSV-2(gE無效液苗會顯著降低DRG 中病毒基因組的數(shù)量。
預(yù)期此實例和先前實例將提供HSV-2 (gE無效)疫苗可有效保護個體以防HSV-2感 染和隨后生殖器復(fù)活的額外證據(jù)。
實例16:向US區(qū)域中引入額外缺失以進一步削弱 △gE-2疫苗菌株的順行性擴散
為進一步衰減AgE-2疫苗菌株的毒力，使用與構(gòu)建HSV-2 Us8缺失所用類似的 方法向編碼gl和Us9蛋白質(zhì)的Us7和Us9中引入額外缺失(圖25)。構(gòu)建含有兩個 500-1000堿基對側(cè)翼區(qū)域的克隆用載體，每一側(cè)翼區(qū)域與具有擬定缺失的DNA序列 5'或3'同源。這兩個區(qū)域的DNA是通過對HSV-2(2.12)基因組DNA實施PCR來獲得。 將克隆用載體與HSV-2基因組DNA共轉(zhuǎn)染，由此通過同源重組將缺失納入到病毒 DNA中。通過PCR針對正確的Us缺失來篩選所得噬斑。
實例17:識別削弱AgE-2疫苗菌株的順行性擴散的額外突變
使用RNA干擾(RNAi)基因沉默方法來識別與病毒擴散有關(guān)的除gE、 Us7和Us9 之外的基因。RNAi技術(shù)使用約20-22個堿基對雙鏈RNA片段，其序列與靶向沉默的 病毒基因相同。為耙向HSV-l或HSV-2病毒基因上的序列，使用業(yè)內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)來合成序列與病毒RNA相同的小RNA雙鏈片段，并通過轉(zhuǎn)染技術(shù)引入到細胞中， 隨后用HSV-1或HSV-2野生型或突變體病毒感染。缺陷病毒的擴散是通過篩選人類
51表皮角質(zhì)形成細胞(HaCaT)中的小噬斑來檢測(柯林斯(Collins WJ)等人，在上皮細胞 中表達的單純皰疹病毒gE/gl干擾細胞到細胞的擴散(Herpes simplex virus gE/gl expressed in epithelial cells interferes with cell-to-cell spread.), 病毒學(xué)期干U(J Virol.)， 2003年2月；77(4):2686-95)。在基因缺失研究中使用誘導(dǎo)小噬斑的RNAi片段靶向 的基因。隨后將失活突變引入到通過上文RNAi篩選方法識別的一或多種基因中以產(chǎn) 生突變體病毒。突變體病毒的擴散特性是使用大鼠頸上神經(jīng)節(jié)細胞神經(jīng)元培養(yǎng)物(王 (WangF)、唐(TangW)、麥格羅(McGraw HM)、班尼特(Bennett J)、安奎斯特(Enquist LW)、和弗里德曼(Friedman HM)，病毒學(xué)期刊79:13362-72， 2005)和小鼠視網(wǎng)膜眼 感染模型(王(WangF)、唐(TangW)、麥格羅(McGraw HM)、班尼特(Bennett J)、安 奎斯特(Enquist LW)、弗里德曼(Friedman HM)，病毒學(xué)期刊79:13362-72， 2005)在 活體外進行評價。將識別的活體外或活體內(nèi)擴散改變的病毒突變體菌株引入到含有 gE、 Us7或Us9缺失的菌株中以產(chǎn)生含有多種基因缺失的菌株以確定最佳突變組合， 所述最佳突變組合接種到實驗室動物中時引起很少或不引起疾病、在DRG中產(chǎn)生低 含量病毒DNA或不產(chǎn)生病毒DNA、并在通過感染野生型HSV-1或HSV-2進行攻擊 時提供對抗疾病和病毒潛伏建立的最大保護。
在其它實驗中，人們的努力集中在病毒粒子膜蛋白質(zhì)上，例如糖蛋白J、 G、 K、 和M。病毒入侵所需要的諸如糖蛋白B、 D、 H和L等膜糖蛋白被排出在外。如先前 段落中所述對這些病毒粒子膜蛋白質(zhì)進行分析。
實例18: HSVgD突變體的特征和穩(wěn)定性 禱淑實避方茲f諸格23j
諒奉曹拔
使用野生型HSV-1菌株KOS來制備gD突變體。為構(gòu)建HSV-1 (gD無效)，通過向 質(zhì)粒pRM416中插入A3C (丙氨酸到半胱氨酸)和Y38C (酪氨酸到半胱氨酸)突變 來構(gòu)建質(zhì)粒pSC594，所述質(zhì)粒pRM416含有KOS gD開放讀碼框，其側(cè)翼為開放讀 碼框的474個堿基對5'和985個堿基對3'。將HSV-1 gD-無效DNA和pSC594 DNA 共轉(zhuǎn)染到VD60細胞中。通過在非洲綠猴腎細胞中復(fù)制來篩選重組病毒并隨后進行噬 斑純化。在每次噬斑純化后，通過在gD基因的5'端(包括突變位點)實施PCR來擴 增600個堿基對。通過限制酶圖譜法來篩選擴增的gD片段。引入新Sspl位點證實存 在A3C突變且無Rsal位點證實存在Y38C突變。在進一步噬斑純化后，實施DNA 測序以證實存在突變。無性系在非洲綠猴腎細胞上生長到高滴度，在10%到60%蔗糖 梯度上純化，并最后實施DNA序列分析和限制性內(nèi)切酶圖譜法，其揭示僅剩余A3C 突變。在蔗糖梯度上進一步純化KOS-gDA3C并對全部gD基因進行測序以證實存在 A3C突變和不存在額外非擬定突變。
拯救的KOS-gDA3C病毒(稱為rKOS-gDA3C)是通過用KOS-gDA3C和pRM416 DNA共轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞來產(chǎn)生。
病毒原液是在補充有10呢胎牛血清(FCS)的杜貝克氏最低必需培養(yǎng)基(Dulbecco'sminimum essential medium) (DMEM)中生長。B78-H1細胞是不允許HSV-1入侵的小 鼠黑色素瘤細胞，使其在含有5% FCS的DMEM中生長。B78-H1-A10細胞(AIO)和 B78-H1-C10細胞(C10)分別穩(wěn)定表達HVEM和連接蛋白-1，并使其在含有5% FCS和 500昭/ml G418的DMEM中生長。在用gD DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細胞(VD60 細胞)中繁殖gD無效病毒。使用HSV-1菌株NS (低傳代臨床分離物)來進行小鼠 攻擊研究。除非另外說明，病毒均在非洲綠猴腎細胞中生長，在蔗糖梯度上純化并存 儲于-8(TC下。 荷微滅染方案
所有實驗方案均經(jīng)賓夕法尼亞州大學(xué)動物和實驗室資源IACUC委員會批準(zhǔn)。使 五至六周齡的Balb/c小鼠(査爾斯河(Charies River))適應(yīng)恒定溫度和光周期(12小 時光照，12小時黑暗)的生物安全2級動物設(shè)施達1周。給小鼠剃毛并用脫毛乳膏 (奈爾(Nair)TM)沿右側(cè)腹(用于接種疫苗)或左側(cè)腹(用于攻擊)進行脫毛，隨后 用溫水洗滌。第二天，經(jīng)由腹膜腔內(nèi)注射75 mcL存于PBS中的14.3 mg/ml氯胺酮和 1.8 mg/ml甲苯噻嗪使小鼠麻醉，隨后通過在1 cr^側(cè)腹面積(距脊柱1 cm的背側(cè)) 中用30號計量注射針表面刮痕60次借助10 mcL含有5x 105 pfu HSV的微滴進行感 染。自接種后第3天開始以24小時間隔觀察小鼠以記錄皮膚損傷和疾病的外觀和嚴(yán) 重程度。接種位點處的評分自0到5不等且?guī)畎捳顦游稽c處的評分自0到10不等。 每個囊泡指定一個點或若損傷匯合，則基于匯合損傷的大小指定多個點。
乂虔督
將K0S-gDA3C、 rKOS-gDA3C或KOS (400 pfu)與B78-Hl、 A10、 C10或非洲 綠猴腎細胞在4。C下培育一小時。使細胞升溫到37。C,保持0、 10、 30、 60或120分 鐘，隨后洗滌移除未結(jié)合的病毒并經(jīng)受檸檬酸鹽緩沖液pH 3.0洗滌1分鐘以使已結(jié)合 但未入侵細胞的病毒失活。額外洗滌后，給細胞覆蓋上存于DMEM中的0.6免低熔點 瓊脂，并使噬斑顯影并于68小時后計數(shù)。 卓步麥教多,麥主長箱遂
實施MOI為3下與KOS、KOS-gDA3C或rKOS-gDA3C病毒一起培育的B78-H1 、 A10和C10細胞的單步驟生長曲線。在于37。C下一小時后，將細胞用檸檬酸鹽緩沖 液pH 3.0處理一分鐘，并立即(0時間)或在2、 4、 8、 10、 12、 20和24小時收集 細胞和上清液。將樣品冷凍-解凍一次，超聲處理三次(每次持續(xù)10秒)，并在非洲 綠猴腎細胞上進行滴定。以類似方式實施多步驟生長曲線，只是感染是在MOI為0.01 下實施且滴度是在24、 48和72小時測定。 蘿餅經(jīng)卿/ G)頓奉DiVA麟好定蘆尸C7f
收獲最接近接種位點的DRG并使用凱俊擴增微型(Qia Amp-mini) DNA試劑盒 (凱俊(Qiagen))來分離DNA。擴增Us9基因以定量DRG中的病毒基因組拷貝數(shù)。 在50 mcl體積中用最少200 ng來自DRG的DNA實施PCR反應(yīng)。添加50 pmol正向 引物5'cgacgccttaataccgactgtt (SEQ ID NO: 8)和反向引物5'acagcgcgatccgacatgtc (SEQID NO: 9)和15 pmol塔曼(Taqman)探針5'tcgttggccgcctcgtcttcgct (SEQ ID NO: 10)。每 50 mcl反應(yīng)物添加一單位擴增塔曼金(Ampli Taq Gold)(應(yīng)用生物科學(xué)(Applied Bioscience))。在ABI Prism7700序列檢測器(應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)) 上實施實時PCR擴增。自經(jīng)純化HSV-1 (NS) DNA產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。小鼠脂肪細胞蛋 白酶(細胞持家基因)也在相同條件下自DRG DNA擴增。用于擴增的引物是正向 5'gatgcagtcgaaggtgtggtta (SEQ ID NO: ll)和反向5' cggtaggatgacactcgggtat (SEQ ID NO: 12)，同時使用塔曼(T叫man)探針5'tctcgcgtctgtggcaatggc (SEQ ID NO: 13)進行檢測。 隨后基于鼠科動物脂肪細胞蛋白酶拷貝數(shù)將病毒DNA拷貝規(guī)范化。
結(jié)果
由于gD轉(zhuǎn)錄物與gl和gJ同3'末端，因此gD和gl的分子量是通過對感染W(wǎng)T、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C病毒的細胞實施蛋白質(zhì)印跡法來定值。對于所述三種 病毒，蛋白質(zhì)大小類似(圖26A)，同時DNA測序證實KOS-gDA3C中的gJ基因完 整(結(jié)果未顯示)。通過使用經(jīng)PCR擴增的DNA片段的SspI進行限制酶切消化證 實位置3上存在半胱氨酸殘基來證實gDA3C突變的穩(wěn)定性。所述Sspl位點經(jīng)30次 傳代仍存在，表明殘基3上丙氨酸到半胱氨酸的改變是穩(wěn)定的(圖26B)。此通過每 5次傳代后實施DNA序列分析得以證實。
在側(cè)腹上給小鼠刮痕接種KOS-gDA3C,并在感染后5天收獲DRG以證實gDA3C 突變在活體內(nèi)的穩(wěn)定性。自三個單獨噬斑分離病毒。所有三種分離物均保留Sspl位點 (圖26C)，表明氨基酸3上的半胱氨酸殘基存在，此通過DNA測序得以證實。 實例19: HSV gD突變體作為入侵受損的活病毒疫苗 對KOS、 rKOS-gDA3C、和KOS-gDA3C至表達HVEM (A10)、連接蛋白-1 (C10)、 二者(非洲綠猴腎細胞)、或兩受體均不表達(B78-H1)的細胞的入侵進行評價。三種 病毒至非洲綠猴腎細胞的入侵相當(dāng)(圖27A)，然而各病毒均不能入侵B78-H1細胞 (圖27B)。與KOS或rKOS-gDA3C相比，KOS-gDA3C至A10細胞的入侵被減少 約50% (圖27C)，且至C10細胞的入侵被減少約70% (圖27D)。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，gDA3C突變可減少由HVEM和連接蛋白-l受體二者調(diào)介的入侵。
實例20: HSVgD突變體病毒的生長曲線 通過實施MOI為3時的單步驟生長曲線來檢查病毒復(fù)制。KOS、 rKOS-gDA3C 和KOS-gDA3C不能感染B78-Hl細胞(結(jié)果未顯示)。三種病毒的復(fù)制在A10細胞 (圖28A)和C10細胞(圖28B)中相當(dāng)，只是KOS-gDA3C的滴度在0時間(在一 小時吸附期結(jié)束時)降低，此反映實例19中所見的入侵缺陷。
通過在MOI為0.01下感染細胞以容許多周期病毒復(fù)制來實施多步驟生長曲線。 與KOS和rKOS-gDA3C相比，KOS-gDA3C的峰值滴度在72小時于A10細胞中降低 約1.51og10 (圖28C)且在C10細胞中降低約21og10 (圖28D)。
實例21: HSVgD突變體毒力降低 KOS-gDA3C突變體的毒力是在小鼠側(cè)腹模型中予以評價。用5xl05 PFU KOS、
54rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C將小鼠感染并對接種位點和帶狀皰疹樣位點處的疾病 進行評分。感染KOS-gDA3C的小鼠接種位點處的疾病較為不嚴(yán)重(圖29A)且?guī)缀?無帶狀皰疹樣疾病，在第5天30只小鼠中僅一只小鼠發(fā)生3處損傷(圖29B)。顯 示第10天帶狀皰疹樣位點疾病的照片(圖29C)。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，用gD突變體皰疹病毒感染引起最少疾病。
實例22: HSV gD突變體到達DRG的能力降低
用5xl05 PFU KOS、 rKOS-gDA3C、或KOS-gDA3C接種小鼠且在感染后5天， 收獲DRG以測量病毒滴度(圖30A)和病毒基因組拷貝數(shù)(圖30B)，與KOS或 rKOS-gDA3C相比KOS-gDA3C降低。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，gD突變體皰疹病毒不能到達DRG。
實例23: HSV gD突變體作為減毒活病毒疫苗
將小鼠模擬感染或用rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C感染并使其恢復(fù)。盡管 rKOS-gDA3C弓l起大面積疾病，但所有動物都存活，此與所有小鼠感染KOS的情形 相同。30天后，在相對側(cè)腹上用HSV-1菌株NS以106PFU (約20LD50)攻擊先前 感染KOS-gDA3C或rKOS-gDA3C的小鼠。攻擊病毒在模擬群組中在接種位點(圖 31A)和帶狀皰疹樣位點(圖31B)引起大面積疾病。KOS-gDA3C和rKOS-gDA3C 對抗接種位點處的疾病且兩種病毒全部可防止帶狀皰疹樣疾病。感染rKOS-gDA3C 或KOS-gDA3C的小鼠在NS菌株攻擊后沒有一只死亡，而模擬感染的小鼠100%死 亡(結(jié)果未顯示)。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，KOS-gDA3C可提供與更具毒力rKOS-gDA3C所提供保護相當(dāng)?shù)?對抗攻擊的保護。
對先前感染KOS-gDA3C阻止WT病毒到達DRG的能力進行評價。將小鼠模擬 感染或在側(cè)腹中用5xl05 pfu rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C進行感染。30天后，在相 對側(cè)腹上用1(fpfuNS對小鼠進行攻擊。攻擊后5天，收獲分布神經(jīng)于攻擊位點中的 DRG。先前模擬感染的小鼠的DRG中NS病毒滴度為約6 loglO,而自先前感染 rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C的小鼠的DRG中未回收到病毒(圖31C)。
在攻擊后5天，對DRG實施定量PCR。在先前模擬感染小鼠的DRG中檢測到 約5.8 loglO HSV-1基因組拷貝，相比之下，在先前感染rKOS-gDA3C或KOS-gDA3C 的小鼠中分別為3.4或3.21oglODNA拷貝(圖31D)。
這些發(fā)現(xiàn)顯示，KOS-gDA3C在接種位點和帶狀皰疹樣位點處引起皮膚損傷和感 染DRG的毒力減弱，然而其仍然可與rKOS-gDA3C同樣有效地保護小鼠對抗WT HSV-1攻擊。
這些實例表明，gD中具有突變的HSV菌株可用作減毒活HSV疫苗。圖32顯示 在病毒生命周期的每一步驟由于病毒入侵具有缺陷導(dǎo)致產(chǎn)生較少KOS-gDA3C的模 型。這些步驟包括在表皮細胞(標(biāo)記為E) 、 DRG核(標(biāo)記為N)中產(chǎn)生、和返回到 皮膚帶狀皰疹樣位點的病毒的量。
55在一個實施例中，本發(fā)明實例為接種疫苗對抗HSV感染的方法提供實驗支持， 所述方法通過使個體與含有一或多種失活突變的HSV突變體菌株接觸來實施。
權(quán)利要求
1、一種突變體HSV-1菌株，其在Us8基因中包含第一失活突變且在Us7基因、Us9基因或其組合中包含第二失活突變。
2、 如權(quán)利要求1所述的HSV-1菌株，其中所述第一或第二失活突變是添加、缺 失或置換突變。
3、 一種突變體HSV-2菌株，其在Us8基因中包含第一失活突變且在一或多種額 外基因中包含第二失活突變。
4、 如權(quán)利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第二失活突變是在編碼病毒入侵 不需要的膜蛋白質(zhì)的基因中。
5、 如權(quán)利要求4所述的HSV-2菌株，其中所述編碼病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì) 的基因是Us7基因、Us9基因或其組合。
6、 如權(quán)利要求4所述的HSV-2菌株，其中所述編碼病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì) 的基因是Us5、 Us4、 UL53、 UL10或其組合。
7、 如權(quán)利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第二失活突變是在編碼病毒入侵所需要的膜蛋白質(zhì)的基因中。
8、 如權(quán)利要求7所述的HSV-2菌株，其中所述編碼病毒入侵所需要的膜蛋白質(zhì) 的基因是Us6。
9、 如權(quán)利要求3所述的HSV-2菌株，其中所述第一或第二失活突變是添加、缺 失或置換突變。
10、 一種在個體中治療單純皰疹病毒(HSV)感染、減少其發(fā)病、改善其癥狀、改 善其繼發(fā)性癥狀、降低其發(fā)生率、延長至其復(fù)發(fā)的潛伏期的方法，所述方法包含使所 述個體與包含突變體單純皰疹病毒疫苗菌株的組合物接觸的步驟，其中所述突變體 HSV疫苗菌株在Us8基因中包含失活突變。
11、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述突變體HSV疫苗菌株是HSV-1菌株 或HSV-2菌株。
12、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述HSV感染是HSV-1感染或HSV-2感染。
13、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述突變體菌株的神經(jīng)元病毒擴散被阻止。
14、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述突變體菌株在所述個體的皮膚組織中 具有復(fù)制能力。
15、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述突變體HSV疫苗菌株在編碼病毒入侵 不需要的膜蛋白質(zhì)的基因中進一步包含額外失活突變。
16、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述編碼病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì)的基 因是Us7基因、Us9基因或其組合。
17、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述編碼病毒入侵不需要的膜蛋白質(zhì)的基 因是Us5、 Us4、 UL53、 UL10或其組合。
18、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述突變體HSV疫苗菌株在編碼病毒入侵 所需要的膜蛋白質(zhì)的基因中進一步包含失活突變。
19、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述編碼病毒入侵所需要的膜蛋白質(zhì)的基 因是Us6。
20、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述HSV感染是生殖器HSV感染、HSV 腦炎、眼睛疾病、唇部HSV感染或其組合。
21、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述個體已感染HSV或具有感染HSV的 風(fēng)險。
22、 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述個體是新生兒、免疫受損個體、老年 個體或其組合。
23、 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述治療單純皰疹病毒(HSV)感染、減少 其發(fā)病、改善其癥狀、改善其繼發(fā)性癥狀、降低其發(fā)生率、延長至其復(fù)發(fā)的潛伏期是 通過在所述個體中誘導(dǎo)抗HSV免疫應(yīng)答來實施。
24、 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述抗HSV免疫應(yīng)答是抗HSV中和抗體應(yīng)答。
25、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述接觸步驟包含表皮、肌內(nèi)、皮下或呼 吸系統(tǒng)內(nèi)粘膜注射。
全文摘要
本發(fā)明提供向個體接種疫苗以對抗單純皰疹病毒(HSV)感染和與其有關(guān)的病癥和癥狀、和在個體中阻止下列病狀、抑制下列病狀、降低下列病狀的發(fā)生率和阻抑下列病狀的方法HSV感染、神經(jīng)元病毒擴散、帶狀皰疹樣損傷形成、皰疹性眼睛疾病、皰疹介導(dǎo)的腦炎和生殖器潰瘍疾病，所述方法包含使所述個體與HSV突變體菌株接觸的步驟，所述HSV突變體菌株在編碼gE、g1、Us9或其它蛋白質(zhì)的基因中含有失活突變。
文檔編號A61K48/00GK101583381SQ200780038798
公開日2009年11月18日 申請日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者伊麗莎白·E·布里特勒, 哈維·弗里德曼 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)董事會