專利名稱：治療膽管癌的藥物組合物、抑制膽管癌生長(zhǎng)或侵入的方法和治療膽管癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0001本發(fā)明涉及抑制膽管癌的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其包括抑制L1CAM 活性或表達(dá)的物質(zhì)——這種物質(zhì)是存在于膽管癌細(xì)胞表面的蛋白，以及使用該組合物 的治療方法。
0002
背景技術(shù)：
0003膽管癌是膽管的癌癥，膽管將膽汁從肝臟排至小腸。最近的證據(jù)己表明 肝癌可起因自多能肝臟干細(xì)胞(Sell和Dunsford Am J. Pathol. 134:1347-1363， 1989)。 膽管癌全世界發(fā)生的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝癌，其在東南亞的發(fā)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐洲或北美。 膽管癌不能通過(guò)手術(shù)切除來(lái)有效治療，原因在于它的高返回率(return rate)。普通 的化學(xué)療法和放射療法也不可用于膽管癌的治療(Pederson等，Cancer Res. 4325-4332， 1997)。另外，膽管癌難于診斷，并且已觀察到由于細(xì)菌或寄生蟲(chóng)的感染進(jìn)入膽管引 起的慢性炎癥有發(fā)展成膽管癌的傾向(Roberts等，Gastroenterology 112:269-279, 1997)。
0004盡管有大量的研究結(jié)果，但是膽管癌的發(fā)病機(jī)理仍然未知。用于治療膽 管癌的靶向分子也了解甚少。作為某些細(xì)胞遺傳研究的結(jié)果，僅建立了幾個(gè)細(xì)胞系 (Y咖aguchi等，J. Nat'l Cancer Inst 75: 29-35,1985; Ding等，Br J Caner 67: 1007-1010，
1993) 。但是，沒(méi)有使用這些細(xì)胞系制備膽管癌特異性抗體的方法的報(bào)道。0005最近，從患有膽管癌的韓國(guó)患者建立了膽管癌細(xì)胞系Choi-CK和SCK
(Kim等，Genes， chromosome & Cancer, 30:48-56, 2001)。如果從用膽管癌細(xì)胞系注 射小鼠來(lái)制備對(duì)細(xì)胞表面特異的單克隆抗體，那么它們可應(yīng)用于膽管癌治療。
0006表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)——已知為預(yù)后因子(prognostic factor) ——的基因是原癌基因。EGFR涉及腫瘤發(fā)生和攻擊生長(zhǎng)行為。EGFR在各種癌癥中 過(guò)量表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、直腸癌、腎癌、膽囊癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、 癌性宮頸腫瘤和胃癌(Modjtahedi, H.和Dean, C., The receptor for EGF and its ligands: expression, prognostic value and target for therapy in Cancer. Int. J. Oncol. 4: 277-296，
1994) 。另外，EGFR的表達(dá)與癌癥預(yù)后的相關(guān)性在一種癌癥和另一種癌癥之間有所不同(Nicholson, R工等EGFR and Cancer prognosis. Eur. J. Cancer 37， S9-S15,2001)。 例如，EGFR可用作膀胱癌、癌性宮頸腫瘤、食道癌、頭頸癌癥和卵巢癌的強(qiáng)預(yù)后因 子，但被識(shí)別為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的弱預(yù)后指示物。但是，還不知道關(guān)于膽 管癌預(yù)后因子的信息。
0007當(dāng)針對(duì)EGFR的抗體應(yīng)用于癌癥治療時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 活性對(duì)每種癌癥類型的功效在15-50%范圍內(nèi)變化。而且，即使在相同癌癥類型中， 體外和體內(nèi)生長(zhǎng)抑制作用之間存在差別(Dassonville， O.等，EGFR targeting therapies: monoclonal antibodies versus tyrosine kinase inhibitors similarities and differences. Critical Reviews in Oncology/Hematology 62， 53-61， 2007)。目前，針對(duì)EGFR的抗體 用于直腸癌和頭頸癌的治療劑，但不應(yīng)用于上述所有EGFR過(guò)量表達(dá)的示例性癌性疾 病的治療。
0008如上所述，在癌細(xì)胞中表達(dá)不能簡(jiǎn)單地保證蛋白是該癌癥的預(yù)后因子。 而且，蛋白在癌細(xì)胞中表達(dá)是否與癌癥預(yù)后相關(guān)取決于癌癥類型。癌癥的強(qiáng)和弱預(yù)后 因子不但可用于容易地預(yù)測(cè)治療劑對(duì)癌癥的治療和預(yù)后效果，而且可用于發(fā)展預(yù)后因 子-靶向治療劑，其可選擇性地和有效地應(yīng)用于感興趣的癌癥。因此，這種對(duì)癌癥特 異性的預(yù)后因子的發(fā)現(xiàn)在癌癥的診斷和治療中十分重要。
0009
0010LI細(xì)胞粘附分子(LICAM)——一種220kDa的整合膜糖蛋白——是 細(xì)胞粘附分子(CAMs)免疫球蛋白超家族的成員，其介導(dǎo)細(xì)胞表面上的細(xì)胞與細(xì)胞 粘附。LICAM——最初在神經(jīng)元中鑒定(Bateman等，EMBO J. 15:6050-6059; 1996) ——在神經(jīng)遷移、神經(jīng)突起和細(xì)胞遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用源自小鼠和大鼠的 LICAM同源物的簡(jiǎn)并寡核苷酸作為探針，從人胚胎腦cDNA文庫(kù)分離人LICAM基 因(Hlavin， M, L.和Lemmon， V. Genomics 11: 416-423,1991; 1999年2月16円公布 的美國(guó)專利號(hào)5,872,225) 。 LICAM主要在腦中表達(dá)，還可在某些JH常組織中檢測(cè)到 它的表達(dá)，并且最近在幾種癌癥中檢測(cè)到它的表達(dá)。
0011
0012LICAM和癌癥之間似乎存在聯(lián)系。已報(bào)道LICAM在許多腫瘤細(xì)胞類 型中表達(dá)，包括黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、卵巢癌和直腸癌(Takeda等,J.Neurochem. 66:2338-2349， 1996; Thies等，Eur. J, Cancer, 38:1708-1716, 2002: Arlt等，Cancer Res. 66:936-943,2006; Gavert等，J. Cell Biol. 168:633-642， 2005)。己發(fā)現(xiàn)LICAM不但以 膜結(jié)合形式，而且還作為切割產(chǎn)物被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)(Gutwein等，F(xiàn)ASEP J. 17 (2) :292-4,2003)。最近，已經(jīng)顯示LICAM是在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用的 分子(Primiano等，Cancer Cell. 4 (1) :41-53 2003)并且正開(kāi)始作為一種癌癥治療的 新靶標(biāo)(2004年6月17日提交的US2004/0115206 Al)。最近的研究還顯示LICAM 在人結(jié)腸癌癥組織的侵入前端表達(dá)(Gavert等，J Cell Biol. 14;168 (4) :633-42.2005)和抗L1CAM抗體發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的功能(Arit等，Cancer Res. 66:936-943.2006)。
0013以前的報(bào)道沒(méi)有提到L1CAM在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)。此外，還沒(méi)有 L1CAM是否涉及膽管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的任何信息。而且，根本沒(méi)有公開(kāi)關(guān)于當(dāng) L1CAM在癌細(xì)胞中以較髙水平表達(dá)時(shí)，膽管癌患者是否顯示較高死亡率的數(shù)據(jù)，即 L1CAM是否是膽管癌的不良預(yù)后因子。因此，在本發(fā)明之前，針對(duì)L1CAM的抗體 通過(guò)抑制膽管癌的增殖和轉(zhuǎn)移作為治療藥物的潛能也是未知。
0014
0015EP 1,172,654 Al和美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2004/0259084公開(kāi)了用于卵巢或子 宮內(nèi)膜腫瘤的診斷和預(yù)后的方法，該方法的特征在于測(cè)定患者樣品中L1CAM的水 平，基于L1CAM的存在表明卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的存在或是這種腫瘤的素因；以及 在需要這種治療的患者中治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的方法，其包括施用給患者足夠量 的L1CAM抗體或其偶聯(lián)至細(xì)胞毒性藥物的片段。如這些專利所公開(kāi)的，L1CAM蛋 白僅描述為卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的特異性標(biāo)志。
0016
0017美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2004/0115206公開(kāi)了在腫瘤細(xì)胞中使用特異性結(jié)合 L1CAM的抗體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法和試劑，以及包括L1CAM抗體的藥物組合物。 該方法的特征為以足夠在腫瘤細(xì)胞中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的時(shí)間和濃度，用 有效量的抗L1CAM抗體接觸腫瘤細(xì)胞。提及乳腺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌細(xì)胞作為表達(dá) L1CAM腫瘤細(xì)胞的例子，該專利公開(kāi)僅提供體外測(cè)試結(jié)果，但沒(méi)有體內(nèi)數(shù)據(jù)支持。 文中沒(méi)有說(shuō)明L1CAM和膽管癌之間的關(guān)系。此外，該專利公開(kāi)僅顯示腫瘤細(xì)胞接觸 抗L1CAM抗體用以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而沒(méi)有任何暗示抗L1CAM抗 體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵入和轉(zhuǎn)移。
0018國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2005/008148公開(kāi)了在卵巢和子宮內(nèi)膜癌中過(guò)量 表達(dá)的LICAM蛋白、干擾L1CAM表達(dá)的藥物組合物和使用該組合物預(yù)防和治療卵 巢和子宮內(nèi)膜癌的方法。所述藥物組合物，其包括抗L1CAM抗體或其衍生物，被 描述為能夠通過(guò)抑制癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)治療卵巢和子宮內(nèi)膜癌。該專利申請(qǐng)也僅提 及卵巢和子宮內(nèi)膜癌，在其中LICAM以細(xì)胞結(jié)合形式或可溶形式發(fā)揮功能來(lái)促進(jìn)癌 細(xì)胞的遷移。
0019簡(jiǎn)言之，先于本發(fā)明的文獻(xiàn)沒(méi)有公開(kāi)L1CAM在膽管癌中以高水平表達(dá)， 并且因此可用作膽管癌特異的不良預(yù)后因子，以及L1CAM抑制物——例如L1CAM 的抗體——因此可用于膽管癌的診斷和治療。0020
公開(kāi)內(nèi)容 技術(shù)問(wèn)題0021本發(fā)明人對(duì)用于癌癥診斷和治療的抗體的發(fā)展進(jìn)行了深入透徹的研究。 用最近建立的膽管癌細(xì)胞系免疫小鼠(Kim等，Genes， Chromosomes & Cancer 30:48-56,2001)，從而獲得特異性結(jié)合膽管癌細(xì)胞表面的L1CAM的單克隆抗體。所 獲得的單克隆抗體命名為"A10-A3",并且發(fā)現(xiàn)該抗體特異性識(shí)別L1CAM。
0022而且，用A10-A3抗體和已知的抗L1CAM抗體分析，發(fā)現(xiàn)L1CAM在 膽管癌細(xì)胞表面表達(dá)，而不在正常細(xì)胞——例如外周淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì) 胞等——的表面表達(dá)。已知L1CAM在乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、皮膚癌等中表達(dá)， 但在膽管癌的表達(dá)仍然未知。使用AI0-A3抗體，由本發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示L1CAM 在42個(gè)肝內(nèi)膽管癌患者的45.2%和103個(gè)肝外膽管癌患者的39.8%中過(guò)量表達(dá)，特 別是在侵入前端，其說(shuō)明膽管癌的轉(zhuǎn)移起始。而且，L1CAM表達(dá)率和存活率之間的 相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析顯示具有髙L1CAM表達(dá)率的膽管癌患者的死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于具有 低L1CAM表達(dá)率的膽管癌患的死亡率。證明L1CAM是膽管癌的不良預(yù)后因子，該 結(jié)果顯示L1CAM可以是膽管癌治療的重要靶標(biāo)。
0023
0024雖然EGFR在膽管癌中高水平表達(dá)，但是相反，EGFR其用作當(dāng)前 臨床用于結(jié)腸癌治療的治療劑的靶標(biāo)(例如cetuximab， EGFR的嵌合抗體)——證 叨不是膽管癌的不良預(yù)后因子，原因是在EGFR表達(dá)率和存活率之間的相關(guān)性分析中 未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。因此，EFGR不被識(shí)別為膽管癌的不良預(yù)后因子。因此，不是 所有在癌癥中過(guò)量表達(dá)的分子都可用作其治療的重要靶標(biāo)。
0025
0026當(dāng)通過(guò)將針對(duì)L1CAM的siRNA引入至表達(dá)L1CAM的膽管癌細(xì)胞系 (Choi-CK， SCK)來(lái)阻抑L1CAM表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它的生長(zhǎng)、遷移和侵入被阻抑。這 些結(jié)果顯示L1CAM在膽管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
0027如通過(guò)用A10-A3抗體或已知的抗L1CAM抗體(UJ127)治療膽管癌 細(xì)胞系(Choi-CK，SCK)所分析，發(fā)現(xiàn)L1CAM的抗體具有針對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷 移或侵入的抑制活性。另外，在移植膽管癌細(xì)胞系的裸鼠中，注射A10-A3抗體抑制 膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，由獲自用人胚胎干細(xì)胞免疫的小鼠的雜交瘤(KCTC 10966BP)產(chǎn)生的單克隆抗體4-63識(shí)別癌細(xì)胞表面的L1CAM,并且抑制膽管癌的生 長(zhǎng)。因此，引導(dǎo)本發(fā)明的，由本發(fā)明人進(jìn)行的深入而廣泛的研究己得出抗L1CAM抗 體可用于膽管癌診斷和治療的結(jié)論。
0028
技術(shù)方案
0029因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于抑制膽管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物組 合物，其包括抑制L1CAM活性或阻抑L1CAM表達(dá)的物質(zhì)。
0030本發(fā)明的另 一個(gè)目標(biāo)是提供基于藥物組合物的使用治療膽管癌的方法。
0031本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗體。0032本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供抑制L1CAM表達(dá)的寡核苷酸。0033本發(fā)明還有的另一個(gè)目的是提供基于藥物組合物的使用抑制膽管癌細(xì)胞 增殖或轉(zhuǎn)移的方法。0034
附圖描述
0035

圖1顯示了小鼠單克隆抗體A10-A3 (A)和4-63 (B)以及已知抗體 5G3 (C)和UJ127 (D)與包括膽管癌的各種癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合能 力的熒光細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。
0036圖2顯示了免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，表明A10-A3特異性地結(jié)合 L1CAM。 A: Choi-CK膽管癌的細(xì)胞表面被生物素化，并用A10-A3抗體或已知的抗 L1CAM單克隆抗體(UJ127)進(jìn)行免疫沉淀。被沉淀的蛋白用于10。/。SDS-PAGE和 用鏈酶抗生物素-HRP的蛋白質(zhì)印跡。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)L1CAM。B:用A10-A3抗 體免疫沉淀蛋白，在10。/。SDS-PAGE上分離并使用已知的抗L1CAM抗體(UJ127) 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)L1CAM。作為陰性對(duì)照"預(yù)清除"表示不存在 抗體的情況下進(jìn)行的免疫沉淀(IP)，"用A10-A3的IP"表示使用A10-A3抗體進(jìn)行 的IP，"用抗-LlCAM的IP"表示使用已知的抗L1CAM單克隆抗體進(jìn)行的IP以及"僅 A10-A3"表示只有抗體的SDS-PAGE。 C:表達(dá)可溶性Ll的HEK293T細(xì)胞用于使用 已知的抗體UJ127和5G3，以及A10-A3和4-63抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡。"-"表示不 攜帶L1表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以及"+"表示含有可溶性Ll表達(dá)載體的細(xì)胞培 養(yǎng)上清液。
0037圖3顯示了 Q-TOF分析的結(jié)果。來(lái)自Choi-CK細(xì)胞的蛋白使用A10-A3 抗體進(jìn)行免疫沉淀，在SDS-PAGE上分離，并且用胰蛋白酶消化。使用Q-TOF分析 所獲得的肽,其顯示免疫沉淀的蛋白是L1CAM。下面的氨基酸序列代表全長(zhǎng)L1CAM, 上面的氨基酸序列代表所分析的肽的序列，與全長(zhǎng)L1CAM序列的下劃線部分一致。
0038圖4顯示了使用A10-A3 (A和C)以及4-63 (B)抗體對(duì)來(lái)自癌癥患 者的癌組織免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)抗體結(jié)合人膽管癌組織，但不結(jié)合正常肝 組織。
0039圖5提供了表格，其中概括了肝內(nèi)膽管癌(A)和肝外膽管癌(B)中 L1CAM的表達(dá)與臨床病理性質(zhì)之間的相關(guān)性。
0040圖6提供顯示L1CAM表達(dá)率與肝外膽管癌患者(60例)存活率之間 相關(guān)性的圖，其表示為OS (總存活，overall survival)和DFS (無(wú)病存活，disease free survival)。
0041圖7顯示用針對(duì)L1CAM的siRNA和非特異的siRNA轉(zhuǎn)染的膽管癌細(xì) 胞中L1CAM的表達(dá)水平(A)以及被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖、侵入和遷移程度(B)。0042圖8顯示抗L1CAM抗體A10-A3 (A) 、 4-63 (B)以及UJ127和5G3 (C)對(duì)膽管癌細(xì)胞系Choi-CK和SCK生長(zhǎng)的抑制作用。卵巢癌細(xì)胞系SK-0V3 和A10-A3抗體不結(jié)合的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN分別用作陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照和陰性細(xì)胞對(duì)照。 對(duì)于陰性抗體對(duì)照，不用抗體(對(duì)照)處理、用熱滅活抗體(煮沸的A10-A3b或4-63b) 或正常小鼠IgG進(jìn)行處理。細(xì)胞生長(zhǎng)程度表示為在用10 jig/ml的抗體溫育細(xì)胞72小 時(shí)后，相對(duì)于不含有任何抗體的對(duì)照的百分比。
0043圖9顯示抗L1CAM抗體A10-A3、4-63和5G3對(duì)膽管癌細(xì)胞(Choi-CK， SCK)侵入和遷移的抑制作用。A10-A3抗體不結(jié)合的腎癌細(xì)胞系被用作陰性細(xì)胞對(duì) 照，而對(duì)于陰性抗體對(duì)照，不用抗體(對(duì)照)處理、用熱滅活抗體(煮沸的A10-A3b 或4-63b)或正常小鼠IgG進(jìn)行處理。細(xì)胞生長(zhǎng)程度表示為在用10pg/ml的抗體溫宵 細(xì)胞72小時(shí)后，相對(duì)于不含有任何抗體的對(duì)照的百分比。
0044圖IO顯示A10-A3抗體抑制涉及癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 用A10-A3抗體或小鼠IgG處理膽管癌細(xì)胞系Choi-CK或SCK,或不用任何抗體處 理，然后收集。細(xì)胞裂解物使用針對(duì)PCNA (A)、磷酸-MAPK (A)、磷酸-AKT (B)和磷酸-FAK (C)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。抗-P-肌動(dòng)蛋白抗體用于檢測(cè)作為加 樣對(duì)照的P-肌動(dòng)蛋白。
0045圖11顯示A10-A3抗體對(duì)人膽管癌異種移植小鼠模型中癌癥生長(zhǎng)的抑 制作用。圖A顯示在5只施用抗體(A10-A3組)的小鼠和5只未施用抗體(對(duì)照) 的小鼠中，腫瘤體積隨時(shí)間的變化。圖11B顯示癌細(xì)胞移植三周后的腫瘤重量。圖 C以圖片顯示癌癥組織。圖D是監(jiān)測(cè)小鼠體重一段時(shí)間的圖。
0046
最佳實(shí)施方式
0047
一方面，本發(fā)明涉及抑制膽管癌生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其包括抑制 L1CAM活性或阻抑L1CAM表達(dá)的物質(zhì)。
0048在其中的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包括抑制L1CAM 活性的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述抑制活性的物質(zhì)是特異性地識(shí)別膽管癌細(xì)胞表面抗原或分 泌的表面抗原(L1CAM)的抗體。所述抗體包括所有單克隆抗體和其嵌合抗體、人 源化抗體和人抗體。新的抗體，以及本領(lǐng)域已知的抗體，落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選 的是新的抗L1CAM單克隆抗體A10-A3或4-63,已知的抗L1CAM單克隆抗體UJ127 或其嵌合、人源化或人抗體。A10-A3和4-63抗體分別由具有KCTC登錄號(hào)KCTC 10卯9BP和KCTC 10966BP的雜交瘤分泌。
0049只要它們具有L1CAM的結(jié)合特異性，所述抗體包括具有兩條全長(zhǎng)輕鏈 和兩條全長(zhǎng)重鏈的完整形式，或可以是抗體分子的功能片段的形式。如本文所用，術(shù) 語(yǔ)"抗體分子的功能片段"的意圖是指至少保留抗原結(jié)合功能的片段，其示例性的為 Fab、 F(ab)、 F(ab')2和Fv。0050在這一方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可包括阻抑 L1CAM表達(dá)的物質(zhì)。當(dāng)它在表達(dá)L1CAM的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平被L1CAM表達(dá) 抑制物阻抑時(shí)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移降低，其因此可應(yīng)用于這些癌癥的治療。優(yōu)選 地，L1CAM表達(dá)抑制物選自siRNAs、 shRNAs和反義寡核苷酸，并且優(yōu)選地是含 有5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'或5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGG也dt-3'序列的 siRNA。
0051如本文所用，術(shù)語(yǔ)"siRNA"的意圖是指約20個(gè)核苷酸的小核酸分子， 其介導(dǎo)RNA干涉或基因沉默。術(shù)語(yǔ)"shRNA"是指短發(fā)夾RNA,其中siRNA耙向序 列的正義和反義序列被5至9個(gè)堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)分隔開(kāi)。最近，已研究RNA干涉
(RNAi)現(xiàn)象以應(yīng)用于在基因水平控制蛋白表達(dá)的方法。典型地，已顯示siRNA通 過(guò)特異性結(jié)合mRNA來(lái)抑制蛋白表達(dá)，所述mRNA具有與耙向基因互補(bǔ)的序列。
0052siRNA，其包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，可用直接化學(xué)合成(Sui G 等，(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)或體外轉(zhuǎn)錄(Brummelkamp TR等,
(2002) Science 296:550-553)制備，但本發(fā)明不限于這些方法。而且，shRNAs被設(shè) 計(jì)以克服siRNAs的缺點(diǎn)，其包括昂貴的siRNA生物合成和低轉(zhuǎn)染效率，導(dǎo)致RNA 干涉作用的短期持續(xù)，shRNAs可由包含在腺病毒、慢病毒或質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)中的 基于RNA聚合酶III的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)，所述系統(tǒng)已被引入細(xì)胞。使用細(xì)胞中的siRNA 加工酶(Dicer或RNase III) ， shRNA分子被加工成功能siRNA分子，并隨后誘導(dǎo) 耙向基因的沉默。
0053如本文所用，術(shù)語(yǔ)"反義"意圖指具有核苷酸堿基序列和亞基-至-亞基骨 架的寡聚體，其使反義寡聚體與RNA中的目標(biāo)序列通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)而雜 交，以在目標(biāo)序列內(nèi)形成RNA:寡聚體異源雙鏈體，通常是與mRNA。寡聚體可與 目標(biāo)序列具有精確的序列互補(bǔ)性或與其接近的互補(bǔ)性。這些反義寡聚體可阻斷或抑制
mRNA的翻譯，和/或修飾mRNA加工以產(chǎn)生該mRNA的剪接變體。因此，本發(fā)明 的反義寡聚體是與L1CAM基因的mRNA互補(bǔ)的反義寡聚體。
0054優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可包括已知的治療劑，其直接地或間接地 與抗體偶聯(lián)或以非偶聯(lián)形式存在。能夠結(jié)合抗體的治療劑包括但不限于放射性核素、 藥物、淋巴因子、毒素和雙特異性抗體。只要當(dāng)偶聯(lián)至抗體或與siRNA、 shRNA或 反義寡核苷酸組合施用時(shí)，它可對(duì)癌癥發(fā)揮治療效果，那么任何已知的治療劑都可用 于本發(fā)明。
0055放射性核素的實(shí)施例包括但不限于3H、 "C、 32P、 35S、 36C1、 51Cr、 57Co、 58Co、外Fe、卯Y、 1251、出I和"6Re。
0056可用于本發(fā)明的藥物和毒素包括表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩 糖苷、阿霉素、柔紅霉素、洋紅霉素、氨喋呤、更生霉素、絲裂霉素、順鉑以及順鉑 的類似物、博來(lái)霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、氮芥、但不限于此。
90057優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的組合物可包括適合于其給藥方式的可接受的載體。0058適合于給藥方式的配方是本領(lǐng)域己知的。而且，本發(fā)明的藥物組合物可
以以用于癌癥治療的藥學(xué)上有效的量施用。通常的劑量可使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)最優(yōu)化。
0059根據(jù)其另一方面，本發(fā)明涉及基于藥物組合物的使用來(lái)治療膽管癌的方法。
0060更詳細(xì)地，該方法包括將藥學(xué)上有效量的藥物組合物施用給機(jī)體。藥物 組合物可腸胃外、皮下、肺內(nèi)或鼻內(nèi)施用。對(duì)于局部免疫阻抑治療，如果期望，組合 物可使用合適的方法施用，包括病灶內(nèi)施用。腸胃外注射包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑。優(yōu)選的給藥方式包括靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)和滴注。
0061可通過(guò)將本發(fā)明藥物組合物施用給機(jī)體來(lái)治療膽管癌，其中組合物中含 有的L1CAM特異性抗體結(jié)合癌細(xì)胞表面抗原L1CAM，從而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖 或轉(zhuǎn)移。
0062而且，可通過(guò)將本發(fā)明藥物組合物施用給機(jī)體以使抗體能夠結(jié)合分泌的 L1CAM來(lái)治療膽管癌，其誘導(dǎo)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的阻斷。可選地，當(dāng)被注射時(shí)，抗 體結(jié)合癌細(xì)胞表面抗原L1CAM，以使免疫細(xì)胞識(shí)別這種結(jié)合，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的吞 噬、凋亡或殺死。
0063也可通過(guò)使用本發(fā)明藥物組合物中含有的L1CAM表達(dá)抑制物抑制 L1CAM的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)膽管癌的治療。在這種情況下，L1CAM對(duì)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 和轉(zhuǎn)移的刺激性作用降低。
0064根據(jù)其進(jìn)一歩方面，本發(fā)明涉及用于抑制L1CAM活性的針對(duì)L1CAM 的抗體，或用于抑制L1CAM表達(dá)的針對(duì)L1CAM的寡核苷酸。
0065在這方面的一個(gè)實(shí)施方式中，如根據(jù)本發(fā)明的組合物所述，只要抗體特 異性地結(jié)合L1CAM,抗體包括具有兩條全長(zhǎng)輕鏈和兩條全長(zhǎng)重鏈的完整形式，以及 抗體分子的功能片段?？贵w分子的功能片段是至少保留抗原結(jié)合功能的片段，并且包 括Fab、 F(ab)、 F(ab')2和Fv。
0066優(yōu)選地，抗體識(shí)別膽管癌細(xì)胞表面抗原或分泌的表面抗原(L1CAM)。 抗體的特征是它結(jié)合膽管癌細(xì)胞表面蛋白L1CAM以抑制或中和L1CAM的作用；以 及通過(guò)結(jié)合癌細(xì)胞，它抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、吞噬細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡或殺死 細(xì)胞。
0067如申請(qǐng)US20040115206中所述，抗L1CAM抗體不總是抑制L1CAM 的作用。本抗體的特征是它不刺激L1CAM的作用，而抑制L1CAM的活性。0068更優(yōu)選地，抗體是新的單克隆抗體A10-A3或4-63。0069在另一個(gè)實(shí)施方式中，針對(duì)L1CAM的本發(fā)明寡核苷酸——功能為阻抑 L1CAM的表達(dá)——選自針對(duì)LlCAM的siRNAs、 shRNAs和反義寡核苷酸，其針對(duì)本發(fā)明組合物被詳細(xì)說(shuō)明。
0070在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，大量培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞并將其注射至小鼠的爪墊。 從小鼠的淋巴結(jié)提取淋巴細(xì)胞并與骨髄瘤的腫瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生小鼠雜交瘤，該小鼠 雜交瘤產(chǎn)生結(jié)合膽管癌細(xì)胞的抗體。
0071詳細(xì)地，將膽管癌細(xì)胞系SCK和Choi-CK注射至小鼠的爪墊，并且從 小鼠的淋巴結(jié)提取淋巴細(xì)胞。所分離的淋巴細(xì)胞與FO骨髄瘤細(xì)胞融合，并且選擇表 達(dá)抗體的克隆。在所選擇的克隆中，測(cè)試相對(duì)穩(wěn)定地分泌單克隆抗體的雜交瘤上清液 結(jié)合膽管癌細(xì)胞的能力。由此建立的單克隆抗體-分泌雜交瘤命名為"雜交瘤 A10-A3"。該雜交瘤于2006年2月20日保藏于國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)KCTC (韓國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures);韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所 (Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB),韓國(guó))并給予登 錄號(hào)KCTC10909BP。
0072
0073分別地，使用人胚胎干細(xì)胞獲得識(shí)別LlCAM的另一個(gè)抗體4-63，并發(fā) 現(xiàn)該抗體結(jié)合膽管癌和肺癌細(xì)胞。分泌4-63抗體的雜交瘤保藏于KCTC并給予登錄 號(hào)KCTC10966BP。詳細(xì)地，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體結(jié)合癌細(xì)胞系——例如膽管癌(參見(jiàn)圖 1),但不結(jié)合正常細(xì)胞——包括肝細(xì)胞、HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)或外周血淋 巴細(xì)胞(參見(jiàn)圖l)。該抗體抑制膽管癌的生長(zhǎng)、遷移或侵入。而且，觀察到已知的 抗L1CAM抗體5G3結(jié)合膽管癌細(xì)胞，但只能以低效率抑制癌癥生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖8); 而發(fā)現(xiàn)另一個(gè)已知的抗L1CAM抗體UJ127結(jié)合膽管癌細(xì)胞并因此抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。 這些結(jié)果顯示抗L1CAM抗體不總是抑制L1CAM的作用。
0074
0075在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)在分別用 5-TGGTACAGTCTGGGdtdt國(guó)3和5-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3的siRNA序 列轉(zhuǎn)染的Choi-CK和SCK細(xì)胞系中，L1CAM的表達(dá)水平低于在用非特異性寡核苷 酸轉(zhuǎn)染的同樣的細(xì)胞系中的水平。而且觀察到，與正常表達(dá)L1CAM的癌細(xì)胞組相比， LlCAM的siRNA敲除的癌細(xì)胞組的增殖、侵入和遷移被降低。
0076如本發(fā)明的實(shí)施例證實(shí)(參考實(shí)施例5、 6和7),本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn) 在約40%的膽管癌患者中，L1CAM在膽管癌細(xì)胞中以過(guò)量表達(dá)的程度被表達(dá)。本發(fā) 明人還首次揭示，L1CAM是不良預(yù)后因子，其在膽管癌細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要 作用，從而增加死亡的危險(xiǎn)；并且以前已知是癌癥不良預(yù)后因子的EGFR，不是膽管 癌的不良指示物。因此，根據(jù)本發(fā)明的針對(duì)LiCAM活性或表達(dá)的抑制物可特異性地 應(yīng)用于表達(dá)L1CAM的癌癥——特別是膽管癌——的診斷和治療。
0077此外，免疫組織化學(xué)染色分析顯示，LiCAM在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 細(xì)胞上以低于10%的水平被表達(dá)。當(dāng)用A10-A3抗體處理表達(dá)UCAM的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H522時(shí)，它們的生長(zhǎng)被分別抑制14%和24%的量，其遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 40%_A10-A3對(duì)膽管癌生長(zhǎng)的近似抑制率，這說(shuō)明本發(fā)明的組合物對(duì)于膽管癌在 治療上是特別有效的。這種比較進(jìn)一步地描述于與本申請(qǐng)同日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng) (名稱為治療膽管癌的藥物組合物、抑制膽管癌生長(zhǎng)或侵入的方法和治療膽管癌的 方法)中，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
0078可通過(guò)如下實(shí)施例獲得對(duì)本發(fā)明的更好的理解，實(shí)施例用于說(shuō)明，而不 被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
0079
發(fā)明實(shí)施方式
0080實(shí)施例1:癌細(xì)胞的培養(yǎng)0081
0082使用如下培養(yǎng)基——含有10°/。胎牛血清(FBS;Gibco)——在37'C、 5%(:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)癌細(xì)胞系。使用MEM培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)SH-J1 (肝細(xì)胞 癌)、SCK (膽管癌)、Choi-CK (膽管癌)和ACHN (腎細(xì)胞腺癌)細(xì)胞；和使用 McCoy 5A培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)SK-OV3 (卵巢腺癌)細(xì)胞。在Ham's F12K培養(yǎng)基 中培養(yǎng)A549 (非小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞，以及在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)CI-H522 (非 小細(xì)胞肺癌)、DMS114 (小細(xì)胞肺癌)、DMS53 (小細(xì)胞肺癌)和NCI-H69 (小細(xì) 胞肺癌)細(xì)胞。SH-J1、 SCK和Choi-CK細(xì)胞系獲贈(zèng)自Daegon Kim博士 (全北國(guó)立 大學(xué)醫(yī)學(xué)院(Medical School, Chonbuk National University))以及其它癌細(xì)胞系購(gòu)自 ATCC。正常肝細(xì)胞和HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)均購(gòu)自Cambrax，使用含有10% FBS (Gibco)的EGM-2培養(yǎng)基(Hyclo加)在37'C、 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過(guò) Ficoll-梯度離心從人血分離外周淋巴細(xì)胞(PBL)。
0083
0084實(shí)施例2:結(jié)合癌細(xì)胞Choi-CK和SCK的A10-A3單克隆抗體的制備0085
0086使用細(xì)胞解離緩沖液(Invitrogen)分離培養(yǎng)的Choi-CK和SCK癌細(xì)胞， 并且5xl05個(gè)細(xì)胞懸浮于30 pi的PBS。用Choi-CK細(xì)胞注射Balb/c小鼠的右爪墊， 并且3天后用SCK細(xì)胞注射左爪墊。然后以3-4天的間隔，小鼠被加強(qiáng)6次，并且 最后在細(xì)胞融合的前一天進(jìn)行免疫。在細(xì)胞融合前兩周，待與淋巴結(jié)細(xì)胞融合的F0 骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， USA)的培養(yǎng)在含有10°/。FBS的DMEM (Gibco)中開(kāi)始。從 用Choi-CK和SCK細(xì)胞免疫的小鼠去除胭淋巴結(jié)，用DMEM培養(yǎng)基(Gibco)充 分洗滌并精細(xì)切片。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至15-ml管。通過(guò)離心收集F0骨髓瘤細(xì)胞， 懸浮于10ml的DMEM培養(yǎng)基中，并連同淋巴結(jié)細(xì)胞一起計(jì)數(shù)。然后，將1(^個(gè)F0 骨髓瘤細(xì)胞和107個(gè)淋巴結(jié)細(xì)胞在50-ml管中混合，并且以200xg離心5 min。棄除 上清液后，將管在含有水的燒杯在37'C中溫育2min。輕打管以松動(dòng)細(xì)胞沉淀后，將
121 ml的PEG (Gibco)在超過(guò)一分鐘的時(shí)間里緩慢地加入管中，同時(shí)在37C水浴中輕 搖管。在100xg離心細(xì)胞2min后，將5 ml的DMEM培養(yǎng)基以超過(guò)3 min緩慢地加 入管中，并且將5 ml的DMEM培養(yǎng)基以超過(guò)2 min進(jìn)一步地緩慢加入。然后通過(guò)200 xg離心收集細(xì)胞。為了增加細(xì)胞融合效率和細(xì)胞存活率，基本培養(yǎng)基(DMEM + 20% FBS)預(yù)先補(bǔ)充10%雜交瘤克隆因子(BioVeris，USA)?；厥盏募?xì)胞被小心地懸浮在 30ml補(bǔ)充雜交瘤克隆因子的正常培養(yǎng)基(DMEM+ 20% FBS)中。將細(xì)胞懸浮液在 37'C在CO2培養(yǎng)箱中溫育30min后，105個(gè)細(xì)胞(70 nl)被等分至96孔板并在37"C 在C02培養(yǎng)箱中溫育。第二天，將70 pl的HAT培養(yǎng)基加入每個(gè)孔，并且以3天為 間隔在超過(guò)2周的時(shí)間內(nèi)，觀察板內(nèi)是否在HAT培養(yǎng)基中形成集落。通過(guò)淋巴細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得的雜交瘤集落的培養(yǎng)上清液用于下面的測(cè)試，其中淋巴細(xì)胞從 用Choi-CK細(xì)胞免疫的小鼠淋巴結(jié)中和從用SCK細(xì)胞免疫的小鼠的淋巴結(jié)中分離。
0087使用夾層ELISA (酶聯(lián)免疫吸附分析)選擇表達(dá)抗體的克隆。將100 ^ 的雜交瘤培養(yǎng)物加入用2ng/ml的抗-小鼠IgG或IgM抗體包被的板，并使其在37'C 反應(yīng)1小時(shí)。然后在1:5,000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP; Sigma)-偶聯(lián)的抗-小鼠 IgG或IgM抗體中溫育板1小時(shí)。用含有0.08% Tween 20的磷酸鹽緩沖液洗滌板后， 將含有OPD( Sigma)和H202的底物溶液加至每個(gè)孔，并且使用分光光度計(jì)在492 nm 測(cè)定吸光率用以選擇產(chǎn)生抗體的克隆。
0088在所選擇的克隆中，測(cè)試相對(duì)穩(wěn)定地分泌單克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)匕 清液與SCK和Choi-CK細(xì)胞的結(jié)合能力。詳細(xì)地，用細(xì)胞解離緩沖液(Gibco)在 37'C處理培養(yǎng)的Choi-CK細(xì)胞20 min以將其解離至單個(gè)細(xì)胞，并將其通過(guò)40卞m的 滲濾器。5X1()S個(gè)細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)。將解離至單個(gè)細(xì)胞的SCK和Choi-CK細(xì)胞 懸浮于PBA (PBS中1% BSA),并使抗體上清液在4'C反應(yīng)30 min。以1200 rpm 離心細(xì)胞5min后，棄除100pl的上清液,并且使細(xì)胞與1:200稀釋的抗-小鼠Ig-FITC (BD)在4'C反應(yīng)30 min。用PBA洗滌細(xì)胞兩次后，選擇碘化丙錠(propidium iodide， PI)陰性細(xì)胞并使用流式細(xì)胞儀(FACS caliber)評(píng)價(jià)與SCK和Choi-CK細(xì)胞的結(jié)合 能力。
0089選擇分泌與SCK和Choi-CK細(xì)胞結(jié)合的抗體的各種雜交瘤，其通過(guò)連 續(xù)亞培養(yǎng)(傳代培養(yǎng))來(lái)穩(wěn)定，然后亞克隆。選擇分泌抗體A10-A3的雜交瘤，其通過(guò) 亞克隆穩(wěn)定地保持對(duì)SCK和Choi-CK細(xì)胞的特異性。
OO卯分泌A10-A3抗體的雜交瘤命名為"雜交瘤A10-A3"。該雜交瘤于2006 年2月20 R保藏于KCTC (韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研 究所(KRIBB)， 52, Oun-dong, Yusong-ku，韓國(guó)大田市)并指定登錄號(hào)KCTC10909BP。
0091
0092實(shí)施例3:在肺癌細(xì)胞系中評(píng)價(jià)L1CAM的細(xì)胞表面表達(dá)00930094.在無(wú)血清培養(yǎng)基(PFHM， Invi加gen)中培養(yǎng)雜交瘤A10-A3細(xì)胞系， 并且使用G蛋白-瓊脂糖柱(Pharmacia, Sweden)純化分泌的A10-A3抗體(Fike等， Focus 12: 79， 19卯)。使用熒光染色，根據(jù)與實(shí)施例3相同的方法(圖1)評(píng)價(jià)純化 的A10-A3抗體對(duì)膽管癌細(xì)胞的結(jié)合能力。圖1中，用實(shí)線描繪輪廓的空峰代表用單 克隆抗體A10-A3和4-63以及已知的抗L1CAM抗體5G3 (Phaimingen, SanDiego， USA)和UJ127 (Chemicon)處理的樣品，而實(shí)峰是單獨(dú)存在第二抗體的背景熒光。 使用流式細(xì)胞儀分析A10-A3、 4-63、 5G3和UJ127抗體對(duì)各種癌細(xì)胞的結(jié)合能力。 FACS分析揭示，單克隆抗體結(jié)合NCI-H522、 A549、 DMS114、 DMS53和NCI-H69 肺癌細(xì)胞(圖1的圖A、 B、 C和D)，而它們不結(jié)合ACHN癌細(xì)胞、正常細(xì)胞、肝 細(xì)胞、HUVEC或外周淋巴細(xì)胞(PBL)。
0095
0096實(shí)施例4:單克隆抗體A10-A3識(shí)別的抗原的分離和鑒定0097
0098實(shí)施例4-l:抗原分離0099
0100按如下分離單克隆抗體A10-A3識(shí)別的細(xì)胞表面蛋白。首先，用PBS 洗滌Choi-CK細(xì)胞并用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce, Rockford， IL)生物素 化該細(xì)胞。在裂解緩沖液(25mMTris-HCl， pH7.5, 250mMNaCl， 5mMEDTA' 1% Nonidet P-40, 2pg/ml牛胰蛋白酶抑制劑，100jig/ml苯甲基磺酰氟，5ng/ml抑蛋 白酶醛肽)中以4'C溫宵細(xì)胞20min。離心細(xì)胞去除細(xì)胞碎片后，回收上清液，并使 用二辛可寧酸(bicinchoninicacid, BCA)蛋白分析試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度。
0101在4'C將細(xì)胞裂解物與20nlG蛋白plus-瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz)反應(yīng)2小時(shí)，并離心去除非特異性結(jié)合G蛋白plus-瓊脂糖的蛋白?；?收上清液并將其與約1叫抗體在4'C反應(yīng)12小時(shí)。將20jU的G蛋白plus-瓊脂糖加 入反應(yīng)混合物，然后在4'C溫育2小時(shí)。離心反應(yīng)混合物并回收沉淀物。用細(xì)胞裂解 緩沖液洗滌回收的沉淀物十次以上，并使用10%SDS-PAGE分離保留的蛋白。
0102將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。用含有5%脫脂奶的 PBST (PBS + 0.1%Tween20)封閉硝酸纖維素膜1小時(shí)，并用PBST洗滌兩次以上。 然后，將印跡(blot)與鏈酶抗生物素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物(1:1,500; Amersham Biosciences)溫育1小時(shí)。用PBST洗滌印跡五次后，用ECL試齊U(Amersham Biosciences)顯影生物素化的蛋白。
0103發(fā)現(xiàn)A10-A3抗體結(jié)合約200kDa的蛋白(圖2中的圖A)。為了收集 被A10-A3抗體免疫沉淀的蛋白，將1X 108Choi-CK細(xì)胞的細(xì)胞裂解物根據(jù)如上所述 的相同方法進(jìn)行免疫沉淀，并在SDS-PAGE凝膠上電泳。用考馬斯G250 (Biorad) 染色凝膠。0104
0105實(shí)施例4-2:使用質(zhì)譜鑒定抗原0106
0107用考馬斯G250(Coomassie G250) (BIO-RAD)染色含有被A10-A3抗體 免疫沉淀的蛋白的SDS凝膠。從凝膠上切割蛋白條帶，用30o/o甲醇洗滌5min,并精 細(xì)切割。凝膠片用100。/。乙腈脫水10min，并在真空離心機(jī)中完全干燥30min。將干 燥的凝膠片與50mM碳酸氫銨中的300ng胰蛋白酶(Promega)在37C溫育16小時(shí)。 用100pl的50mM碳酸氫銨提取消化的肽三次，并在真空離心機(jī)中干燥。使用電噴 霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(electrospray quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry, ESI Q-TOF MS/MS) (Q-TOF micro, MicroMass)分析肽混合物。Al0-A3 抗體識(shí)別的蛋白被鑒定為L(zhǎng)1細(xì)胞粘附分子(L1CAM)(圖3)。圖3中，下劃線區(qū) 域表示由Q-TOF實(shí)際鑒定的氨基酸序列。因此，如實(shí)施例3-1所述，用購(gòu)自Chemicon (USA)的抗L1CAM單克隆抗體JU127.11免疫沉淀生物素標(biāo)記的Choi-CK細(xì)胞裂 解物，并用ECL顯影印跡。如圖2(A)所示，發(fā)現(xiàn)A10-A3抗體和抗L1CAM抗體免 疫沉淀了約200 kDa的相同分子量的蛋白。
0108
0109實(shí)施例4-3:使用蛋白質(zhì)印跡鑒定L1CAM抗原0110
0111為了確定A10-A3抗體識(shí)別L1CAM，使用A10-A3抗體在Choi-CK細(xì) 胞裂解物中進(jìn)行免疫沉淀。
0112在4'C將細(xì)胞裂解物與20 nl G蛋白plus-瓊脂糖(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz)反應(yīng)2小時(shí)，并離心去除非特異性結(jié)合G蛋白plus-瓊 脂糖的蛋白。回收上清液并將其與約l pg抗體在4X:反應(yīng)12小時(shí)。將20^的G蛋 白plus-瓊脂糖加入反應(yīng)混合物，然后在4'C溫宵2小時(shí)。離心反應(yīng)混合物并回收沉 淀物(圖2的預(yù)洗)。用細(xì)胞裂解緩沖液洗滌回收的沉淀物多于十次，并使用不含巰 基乙醇的10% SDS-PAGE分離保留的蛋白。
0113將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。用含有5%脫脂奶的 PBST (PBS + 0.1%Tween20)封閉硝酸纖維素膜1小時(shí)，并用PBST洗滌兩次以上。 然后，用作為初次抗體的已知抗L1CAM抗體UJ127 (Chemicon)溫育印跡1小時(shí)。 用PBST洗滌五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶聯(lián)物(1:1，500; Sigma)溫育印跡1小時(shí)。 用PBST洗滌印跡五次后，用ECL試劑(AmershamBiosciences)顯影生物素化的蛋 白。發(fā)現(xiàn)抗L1CAM抗體結(jié)合約200kDa的蛋白，該蛋白用A10-A3抗體免疫沉淀(圖 2的圖B)。該結(jié)果證實(shí)A10-A3抗體識(shí)別L1CAM。
0114
0115實(shí)施例4-4:可溶性L1CAM的表達(dá)
10116
0117為了構(gòu)建表達(dá)可溶性L1CAM的表達(dá)載體,使用RNA提取試劑盒(Roche co.)從Choi-CK癌細(xì)胞分離總RNA。使用RT-PCR試劑盒(Roche Co.)進(jìn)行PCR, 該P(yáng)CR使用該分離的總RNA作為模板，兩個(gè)末端引物為Ig-dom-F(5'-GAGGAGGAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG國(guó)3', 38 mer)和Ll-Fn-Stop-R (5'-CTC TAG AGT TCT CGA GTC AGA GCC TCA CGC GGC C-3'， 34 mer)以及pfii 聚合酶(SolgentCo.) 。 PCR條件包括在95'C預(yù)溫育5min，以95。C 30sec、 58" 30 sec和72X: 2 min進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，以及最終在72'C延伸10 min。
0118用EcoR I和Xho I消化被擴(kuò)增的可溶性LI DNA片段，并在1%瓊脂糖 凝膠上電泳。將L1 DNA片段從凝膠上切離，并用凝膠純化試劑盒(Intronco.)純化。 使用T4 DNA連接酶(Roche co.)，在16'C將消化的LI DNA片段與用EcoR I和Xho I消化的pJK-dhfr2表達(dá)載體(Aprogen)連接30 min，并通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a。從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離質(zhì)粒DNA,并測(cè)定其DNA序列。DNA測(cè)序顯示成功克隆 可溶性LICAM的cDNA。如此獲得的表達(dá)載體被命名為"pJK-dhfr2-Ll-單體"。
0119為了以單體形式表達(dá)可溶性L1CAM，將pJK-dhfr2-Ll-單體DNA轉(zhuǎn)染 至HEK293T細(xì)胞(ATCC CRL11268，下文中稱為293T)。
0120將10嗎的表達(dá)載體DNA和Lipofect咖ine 2000(脂轉(zhuǎn)染試劑)(Invitrogen co.)單獨(dú)地加至500 nl Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco BRL)，并使其在室溫靜置5 min。 然后，將該載體DNA與lipofectamine混合，并且使混合物在室溫反應(yīng)15 min。在 DNA-lipofectamine復(fù)合物形成過(guò)程中，小心地用PBS (pH7.4)洗滌293T細(xì)胞，并 將Opti-MEM培養(yǎng)基小心地加至細(xì)胞，然后去除。將DNA-lipofectamine復(fù)合物與4 ml Opti-MEM培養(yǎng)基混合，并小心地滴在細(xì)胞上。將細(xì)胞于37'C在培養(yǎng)箱內(nèi)溫宵。6小 時(shí)后，細(xì)胞再次給予5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，并進(jìn)一步培養(yǎng)3天。
0121
0122實(shí)施例4-5:抗體與可溶性L1CAM的結(jié)合特異性的評(píng)價(jià)0123
0124將表達(dá)可溶性L1CAM的293T細(xì)胞的培養(yǎng)液和另一種不表達(dá)可溶性 L1CAM的293T細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10% SDS-PAGE，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。用含有5% 脫脂奶的TBST(TBS + 0.05% Tween20)在4'C封閉硝酸纖維素膜1小時(shí)，并用TBST 洗滌兩次以上。然后，用初次抗體——已知的抗L1CAM抗體UJ127 (Chemicon)和 5G3 (Pharmingen)以及A10-A3和4-63抗體溫育印跡1小時(shí)，每種抗體在含有5% 脫脂奶的TBST中稀釋1:10,000。用TBST洗滌五次后，用抗小鼠IgG-HRP偶聯(lián)物 U:l，500; Sigma)溫育印跡1小時(shí)。用PBST洗滌印跡五次，并用ECL試劑(Amersham Biosciences)顯影。發(fā)現(xiàn)每種抗體結(jié)合約200 kDa的可溶性L1CAM (圖2(C))。而 且，使用上述抗體對(duì)表達(dá)L1的細(xì)胞培養(yǎng)物的ELISA顯示，每種抗體對(duì)表達(dá)的可溶性L1CAM具有結(jié)合特異性。0125
0126實(shí)施例5:膽管癌組織的免疫組織化學(xué)染色0127
0128制備腫瘤的3jun厚的切片用于膽管癌組織的免疫組織化學(xué)染色。將切 片放置于用聚-L-賴氨酸包被的載玻片上，并在60"C干燥3小時(shí)。然后在室溫將切片 在二甲苯中脫蠟5min，三次，并在100%、卯°/ 、 80%以及隨后在70%的醇中水合， 每種lmin。將載玻片浸泡在靶標(biāo)恢復(fù)液(target retrieval solution) (DAKO,Caipinteria， CA)中以恢復(fù)抗原性，并用TBST (Tris緩沖鹽-Tween20)洗滌，使用壓力鍋將TBST 預(yù)先煮沸4min。將無(wú)生物素的酪胺信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，CSA II (DAKO， Carpinteria， CA)用于免疫組織化學(xué)染色的高靈敏檢測(cè)。將載玻片在3%過(guò)氧化氫中溫育5 min 以阻斷抗體的非特異性結(jié)合。用TBST洗滌兩次，每次5min后，用充分地?zé)o血清的 蛋白封閉液溫育切片5 min以阻斷蛋白的非特異性結(jié)合。用初次抗體(A10-A3和 4-63， l:50稀釋)溫育組織切片15min，然后用抗小鼠免疫球蛋白-HRP溫育15 min。 然后用擴(kuò)增試劑和抗-熒光素-HRP溫育切片，每種溫育15min。最后，用DAB染色 切片5min，并且用Meyer's蘇木精復(fù)染，隨后用TBST洗滌5 min，兩次。根據(jù)如上
所述的相同方法來(lái)染色陰性對(duì)照，除了用不含有初次抗體的正常綿羊血清或正常小鼠 IgGl血清代替初次抗體。發(fā)現(xiàn)A10-A3或4-63抗體都不結(jié)合正常組織，但觀察到它 們結(jié)合膽管癌組織(圖4)。
0129該結(jié)果說(shuō)明L1CAM在膽管癌組織中的表達(dá)。
0130
0131使用A10-A3抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析，在42位肝內(nèi)膽管癌患 者的45.2%和103位肝外膽管癌患者的39.8%中觀察到L1CAM的表達(dá)(圖5)。特 別地，在侵入前端L1CAM以高水平表達(dá)，這解釋了膽管癌的轉(zhuǎn)移起始(圖4)。
0132
0133實(shí)施例6:膽管癌中L1CAM表達(dá)率和膽管癌患者存活率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析0134
0135在患有肝外膽管癌的患者(60例)中分析L1CAM表達(dá)率和存活率之 間的相關(guān)性。在顯示高L1CAM表達(dá)率的患者組中發(fā)現(xiàn)其總存活(OS)與無(wú)病存活 (DFS)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性降低，即與那些具有低L1CAM表達(dá)率的患者組相比，死 亡風(fēng)險(xiǎn)增加(圖6)。如存活曲線所示，在顯示高和低L1CAM表達(dá)率的膽管癌患者 之間2年OS中存在很大差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。而且，具有低L1CAM表達(dá)率的膽管 癌患者的2年DFS與具有髙L1CAM表達(dá)率的膽管癌患者的2年DFS之間存在具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的差異。
0136相反，患者的存活與EGFR (表皮生長(zhǎng)因子受體)表達(dá)率之間的相關(guān)性不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖6)，已知EGFR在膽管癌或其他腫瘤中過(guò)量表達(dá)。這些結(jié) 果暗示L1CAM的抗體對(duì)膽管癌的診斷和治療有用，并可應(yīng)用于膽管癌轉(zhuǎn)移的早期診 斷，從而增加其對(duì)疾病的治療作用。從L1CAM表達(dá)率與存活之間相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)明顯得出，具有L1CAM髙表達(dá)率的膽管癌患者發(fā)生比L1CAM低表達(dá)率患者更 髙的死亡率。0137
0138通過(guò)說(shuō)明L1CAM是不良預(yù)后因子，其結(jié)果顯示L1CAM可以是治療膽 管癌的靶標(biāo)。雖然EGFR在膽管癌中高水平表達(dá)，但是相反，由EGFR表達(dá)率和存活 率的相關(guān)性推斷，EGFR_其已作為治療劑的靶標(biāo)目前臨床上用于結(jié)腸癌的治療(例 如cetuximab, EGFR的嵌合抗體)——被證實(shí)不是膽管癌的不良預(yù)后因子。這證實(shí) 不是所有在癌癥中過(guò)量表達(dá)的分子都是癌癥的不良預(yù)后因子并因此作為其治療的重 要靶標(biāo)。
0139
0140實(shí)施例7: L1CAM表達(dá)的阻抑對(duì)膽管癌細(xì)胞的影響0141
0142實(shí)施例7-1:使用siRNAs在膽管癌細(xì)胞中抑制L1CAM表達(dá)0143
0144在Choi-CK和SCK細(xì)胞中敲除L1CAM的表達(dá)。為此，用L1CAM的 兩條siRNA寡核苷酸(5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3鄰5'-CAGCAACTTTGCTCAGA GGdtdt-3')或非特異性寡核苷酸(5'-CAGTCGCGTTTGCGACTGGdtdt-3')轉(zhuǎn)染癌細(xì) 胞并將其培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和使用A10-A3抗體的蛋白質(zhì)印跡， 評(píng)價(jià)L1CAM的敲除。結(jié)果，與用非特異性siRNA處理的對(duì)照相比，經(jīng)測(cè)定用siRNAs 處理的Choi-CK和SCK細(xì)胞在L1CAM的總表達(dá)和細(xì)胞表面L1CAM水平上降低(圖 7中的圖A)。
0145
0146實(shí)施例7-2:用針對(duì)L1CAM的siRNA處理后膽管癌細(xì)胞活性的評(píng)價(jià)0147
0148比較用針對(duì)L1CAM的siRNA和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染的膽管癌細(xì)胞之 間的細(xì)胞增殖、侵入和遷移。通過(guò)培養(yǎng)相同數(shù)目的細(xì)胞72小時(shí)后借助臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算細(xì) 胞數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)增殖程度。分別使用QCM24孔細(xì)胞侵入分析試劑盒(Chemicon)和 QCM 24孔比色細(xì)胞遷移分析試劑盒(Chemicon)分析侵入和遷移程度。用siRNA 敲除L1CAM的癌細(xì)胞，與正常水平表達(dá)L1CAM的癌細(xì)胞相比，前者顯示出增殖、 侵入和遷移程度的降低。這些結(jié)果顯示，L1CAM在膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵入 中發(fā)揮作用(圖7中的圖B)。
0149
18說(shuō)明書(shū)第17/20頁(yè)
0150實(shí)施例8: L1CAM特異性的抗體對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制0151
0152評(píng)價(jià)抗L1CAM抗體對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果。A10-A3抗體可結(jié) 合的Choi-CK和SCK細(xì)胞用于該測(cè)試，而卵巢癌細(xì)胞系(SK-0V-3)和ACNH分別 作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。將這些細(xì)胞以2xl()5細(xì)胞/孔的密度接種于每孔含有3 ml 培養(yǎng)基的24孔板并培養(yǎng)。將單克隆抗體以10ng/ml的濃度加至每孔，隨后將細(xì)胞在 37'C培養(yǎng)箱中溫育10天。收集后，使用0.2%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)存活的和死亡的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并 且細(xì)胞的存活率表達(dá)為總細(xì)胞數(shù)的百分比。當(dāng)用A10-A3抗體處理時(shí)，Choi-CK和SCK 細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯地降低，類似SK-OV3細(xì)胞，而ACHN細(xì)胞正常增殖(圖8中 圖A)。另一方面，發(fā)現(xiàn)4-63抗體抑制膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖8中圖B)。
0153當(dāng)以此治療膽管癌細(xì)胞時(shí)，已知特異性地結(jié)合L1CAM的UJ127 (Chemicon)抗體顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是，在5G3 (Pharmingen)的情況下一 一其也特異性地結(jié)合L1CAM~~僅微微抑制膽管癌細(xì)胞(Choi-CK)的生長(zhǎng)(圖8 中的圖C)。發(fā)現(xiàn)5G3抗體結(jié)合Choi-SK細(xì)胞(圖1中圖C)。這些結(jié)果顯示，抗 L1CAM抗體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合不一定抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
0154
0155實(shí)施例9: L1CAM特異性抗體對(duì)膽管癌細(xì)胞侵入和遷移的抑制作用0156
0157使用QCM 24孔細(xì)胞侵入分析試劑盒(CHEMICON)進(jìn)行細(xì)胞侵入分 析。使用300fxl的預(yù)熱無(wú)血清培養(yǎng)基(RPMI, 10 mM HEPES， pH 7.4)在室溫再水 合每個(gè)插入物(insert)的ECM層30 min。用PBS洗錄Choi-CK、SCK、SK-OV3和ACHN 細(xì)胞兩次，并用3ml胰蛋白酶-EDTA在培養(yǎng)箱中于37"C處理。收集分開(kāi)的細(xì)胞并在 20(Hil侵入培養(yǎng)基(RPMI， lOmMHEPES, pH7.4， 0.5%BSA)中調(diào)整至密度1 x105 細(xì)胞。然后將細(xì)胞插入至每個(gè)插入物，并用A10-A3抗體、4-63抗體、5G3抗體(10 Hg/ml)和正常小鼠IgG( 10 pg/ml)溫育。用補(bǔ)充10% FBS的侵入培養(yǎng)基填充下室(lower chamber),并在培養(yǎng)箱中于37'C溫育72小時(shí)。然后，去除保留在每個(gè)插入物中的細(xì) 胞和培養(yǎng)基，并將每個(gè)插入物轉(zhuǎn)移至新孔。將每個(gè)插入物置于225^1預(yù)熱的細(xì)胞脫離 溶液(detachment solution),并在培養(yǎng)箱中于37C溫育30 min。振蕩插入物以使保留的 細(xì)胞完全脫離，并將75^的裂解緩沖液/染液加入到每個(gè)含有細(xì)胞和細(xì)胞脫離溶液的 孔，然后在室溫溫育15 min。將200^1的混合物轉(zhuǎn)移至96孔板，在480/520 nm讀取 熒光。發(fā)現(xiàn)A10-A3抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-OV3的細(xì)胞侵入，但不誘導(dǎo)細(xì)胞 侵入的抑制(圖9中的圖A)。而且，4-63抗體降低Choi-SK細(xì)胞的侵入(圖9中的 圖A) 。 5G3抗體對(duì)Choi-SK細(xì)胞侵入抑制的效果低于A10-A3和4-63抗體(圖7 中的圖A)。
0158用如上所述的相同方法進(jìn)行細(xì)胞遷移分析，除了將膠原I型以10g/ml的濃度鋪層于插入物的底部。觀察到A10-A3抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-0V-3 的細(xì)胞遷移，但不抑制ACHN的細(xì)胞遷移(圖9)。而且，所述抗體抑制Choi-SK、 SCK和SK-OV-3的遷移(圖9)。0159
0160實(shí)施例10: A10-A3抗體對(duì)癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用0161
0162實(shí)施例10-1: A10"A3抗體對(duì)癌細(xì)胞的PCNA表達(dá)的抑制0163
0164進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測(cè)是否增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)——說(shuō) 明細(xì)胞增殖——被A10-A3抗體抑制。在這一點(diǎn)上，用A10-A3或IgG 10溫育Choi-SK 細(xì)胞72小時(shí)，收集并溶解于細(xì)胞裂解緩沖液。使用BCA (二辛可寧酸)蛋白分析試 劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度。將40嗎的蛋白在8% SDS-PAGE上電泳，并以25 V 90 min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將印跡在5%脫脂奶中4'C過(guò)夜封閉，并用小鼠單克隆 抗-PCNA (Novocastra Laboratories 1:500)抗體和抗p肌動(dòng)蛋白(Oncogene, 1:4000) 抗體溫育1小時(shí)。然后，用抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)抗體(Cell Signaling, 1:1000) 處理膜并用PBST洗滌，之后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)使得PCNA和P-肌動(dòng)蛋白可見(jiàn)。觀察到只有用A10-A3抗體處理的Choi-SK 細(xì)胞存在顯著降低的PCNA表達(dá)。
0165
0166實(shí)施例10-2: PCNA的表達(dá)對(duì)ERK磷酸化的抑制0167
0168進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測(cè)A10-A3抗體是否降低參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移 和存活的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。用10ng/ml的A10-A3抗體或小鼠IgG 溫存Choi-SK細(xì)胞72小時(shí)，收集并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解。使用二辛可寧酸(BCA) 蛋白分析試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度，并將40嗎的蛋白在12% SDS-PAGE上電 泳。以25V90min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將印跡用5%脫脂奶于4'C過(guò)夜封 閉，并用在1%脫脂奶中的兔多克隆抗磷酸MAPK抗體(Abeam,以1:1000稀釋) 過(guò)夜溫育。根據(jù)如上所述的相同方法處理相同量的蛋白，以研究非磷酸化MAPK的 表達(dá)，并且用抗-MAPK抗體(Abcam，以1:1000稀釋)溫育被封閉的硝酸纖維素膜 1小時(shí)。用抗兔HRP偶聯(lián)抗體(Cell Signaling,以1:10000稀釋)溫育印跡。用PBST 洗滌印跡后，使用ECL (Amersham Pharmacia Biotech)檢測(cè)磷酸MAPK和MAPK。 在表達(dá)相同MAPK的Choi-CK細(xì)胞中，只有那些用A10-A3抗體處理的細(xì)胞在磷酸 -MAPK水平上顯著降低(圖10A)。
0169
0170實(shí)施例10-3:用A10-A3抗體抑制AKT的磷酸化0171
0172進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測(cè)A10-A3抗體是否降低參與腫瘤細(xì)胞存活的AKT 磷酸化。用10ng/ml的A10-A3或小鼠IgG溫育Choi-CK細(xì)胞l、 1.5和2小時(shí)，收 集并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞。使用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度， 并將40嗎的蛋白在12% SDS-PAGE上電泳。以25 V、卯min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖 維素膜上。將因此形成的印跡用5。/。脫脂奶于4X:過(guò)夜封閉，并用在1%脫脂奶中的兔 多克隆抗磷酸Akt抗體(Ab cam， 1:1000稀釋〉和兔多克隆抗Akt (Abcam， 1:1000 稀釋)過(guò)夜溫育，隨后用抗兔IgGHRP(SantaCruzl: 1000稀釋)反應(yīng)1小時(shí)。用PBST 洗滌印跡后，使用ECL (Amersham Pharmacia Biotech)檢測(cè)磷酸Akt和總Akt。只有 在A10-A3抗體處理的Choi-CK細(xì)胞中，磷酸-Akt水平顯著降低(圖10B)。
0173
0174實(shí)施例10-4:用A10-A3抗體抑制FAK激活0175
0176進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測(cè)A10-A3抗體是否降低在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移 中發(fā)揮重要作用的黏著斑激酶(FAK)的磷酸化。用10ng/ml的A10-A3抗體溫宵 Choi-SK和SCK細(xì)胞0.5、 1、 1.5和2小時(shí)，收集并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞。使 用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白濃度，并將40嗎的蛋白在7.5 % SDS-PAGE 上屯泳。以25V卯min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶將如此形成的 印跡4'C過(guò)夜封閉，并用在1%脫脂奶中的兔多克隆抗磷酸FAK抗體(Abcam， 1:1000 稀釋)和抗-p-肌動(dòng)蛋白(Oncoge加，1:4000稀釋)溫育1小時(shí)。然后用抗兔HRP-偶聯(lián)抗體(Cell Spring, 1:10000稀釋)溫育1小時(shí)。用PBST洗滌印跡后，使用增強(qiáng) 的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL) (Amersham Pharmacia Biotech)檢測(cè)磷酸FAK和P-肌動(dòng)蛋 白水平。在用A10-A3抗體處理的Choi-CK和SCK細(xì)胞中都觀察到磷酸-FAK水平的 降低(圖IOC)。
0177
0178實(shí)施例ll:在小鼠模型中A10-A3抗體對(duì)癌細(xì)胞的抑制活性的分析0179
0180通過(guò)Central Lab. Animal Inc.從Japan SLC購(gòu)買6~8周齡且體重18~22 g 的裸鼠Balb/cnu/mi，并在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所的實(shí)驗(yàn)室習(xí)服(馴化)一周。 將Choi-CK細(xì)胞(3X106)皮下移植入小鼠并在第20天生長(zhǎng)成具有390mmS大小的 腫瘤塊(圖10A)。根據(jù)公式V-長(zhǎng)軸(mm)x短軸(mm)x高度(mm)x1/2來(lái)估定腫瘤體 積。在最后一天，用C02氣體處死小鼠，并且分離和稱重腫瘤。還測(cè)量小鼠體重以 測(cè)定毒性。使用ANOVA (Prism，GraphPad Software, USA)和t檢驗(yàn)(students t-test) 來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SDs)和p值。
01810182當(dāng)從第1天起， 一周三次將A10-A3抗體以10 mg/kg的劑量注射入尾靜 脈時(shí)，直到第20天觀察到有效的抗癌癥效果(圖1A)。將小鼠IgG抗體以相同劑量 注射作為對(duì)照。經(jīng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)腫瘤體積為232 mm3,其說(shuō)明抗癌癥活性比對(duì)照高約40% (圖11A)。在最后一天(第20天)，分離并稱重腫瘤(圖11 B)。對(duì)照組和A10-A3-施用組的標(biāo)準(zhǔn)腫瘤重量分別為872 mg和516 mg，其說(shuō)明的事實(shí)是A10-A3抗體的抗 癌癥活性比對(duì)照的抗癌癥活性髙40% 。
0183監(jiān)測(cè)裸鼠體重20天以預(yù)測(cè)A10-A3的毒性。而且，用裸眼觀察小鼠的 行為(圖11D)。在第20天觀察到與對(duì)照相比，用感興趣抗體處理的小鼠既沒(méi)有體 重變化，又沒(méi)有異常行為。
0184
工業(yè)實(shí)用性
0185到目前所述為止，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)L1CAM表達(dá)在膽管癌的細(xì)胞表面上， 在癌癥的生長(zhǎng)和侵入中發(fā)揮重要作用并且是膽管癌的不良預(yù)后因子。因此，抗體—— 結(jié)合膽管癌細(xì)胞表面的L1CAM蛋白，或siRNAs、反義寡核苷酸或shRNAs~~在膽 管癌細(xì)胞中阻抑L1CAM表達(dá)，和包括根據(jù)本發(fā)明的抗體、siRNAs、反義寡核苷酸或 shRNAs的藥物組合物可應(yīng)用于膽管癌的治療，原因在于它們被證實(shí)抑制膽管癌的生 長(zhǎng)、侵入和遷移。
0186
權(quán)利要求
1.抑制膽管癌的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其包括L1CAM活性或表達(dá)抑制物，所述L1CAM活性抑制物選自抑制L1CAM活性的抗L1CAM抗體、所述抗L1CAM抗體的抗原結(jié)合片段、所述抗L1CAM抗體的變體和所述抗L1CAM抗體的所述抗原結(jié)合片段的變體，所述L1CAM表達(dá)抑制物是阻抑L1CAM表達(dá)的寡核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述L1CAM活性抑制物識(shí)別膜結(jié)合形 式或可溶形式的L1CAM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述阻抑L1CAM表達(dá)的寡核苷酸 選自針對(duì)編碼L1CAM的基因的反義寡核苷酸、siRNA和shRNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述抗體是4-63，其由具有登錄號(hào) KCTC 10966BP或UJ127的雜交瘤分泌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述siRNA具有 5'-TGGTACAGTCTGGGdtdt-3'或5'-CAGCAACTTTGCTCAGAGGdtdt-3'的序列。
6. —種治療膽管癌的方法，其包括施用權(quán)利要求l所述的組合物。
7. —種抑制膽管癌的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的方法，通過(guò)抑制L1CAM的活性或阻抑 L1CAM的表達(dá)來(lái)進(jìn)行。
8. —種診斷膽管癌的方法，其使用對(duì)L1CAM特異的抗L1CAM抗體。
全文摘要
本文公開(kāi)的是抑制膽管癌的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其包括L1CAM活性抑制物或表達(dá)阻抑物，以及使用該組合物的治療方法。這是基于如下的發(fā)現(xiàn)L1CAM在膽管癌中過(guò)量表達(dá)和在膽管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，以及膽管癌患者的死亡率隨L1CAM表達(dá)率的增加而增加。而且，發(fā)現(xiàn)抑制L1CAM活性的抗體或阻抑L1CAM表達(dá)的siRNA降低膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵入。識(shí)別膽管癌細(xì)胞表面上的L1CAM蛋白和特異性結(jié)合膽管癌組織的小鼠單克隆抗體、或siRNAs、反義寡核苷酸或shRNAs可通過(guò)抑制膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵入和遷移來(lái)用于膽管癌的治療。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101605560SQ200780039170
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2007年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日
發(fā)明者孫演晟, 李應(yīng)碩, 李重屷, 洪孝貞, 金鎮(zhèn)萬(wàn) 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院