專利名稱：用免疫磁性mri造影劑對活化的血管內皮進行成像的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及用納米顆粒(nanoparticles)進行體內診斷成像。更 具體地說，本發(fā)明涉及一種診斷成像技術，該技術可用靼向造影劑 (targeted contrast agent)對疾病狀態(tài)成l象，所述造影劑是通過在摻入把向 部分的涂覆方法中功能化納米顆粒而形成的。這些造影劑適用于評估、 診斷和治療疾病狀態(tài)的磁共振成像，所述疾病狀態(tài)例如但不限于癌癥、 心血管病、腦血管病、外周血管病、自體免疫疾病和所有的炎癥。
背景技術：
本發(fā)明涉及作為造影劑的免疫磁性納米顆粒以及它們在醫(yī)學診斷 成像技術中的用途，所述醫(yī)學診斷成像技術例如但不限于磁共振成像 ("MRI")。本發(fā)明基于這些顆粒的保持懸浮并且不聚集的新能力，它們 的防止顆粒聚集由此提高顆粒穩(wěn)定性的涂覆組合物，它們的功能化顆 粒表面的能力，以及有效制備它們的方法。
造影劑在診斷醫(yī)學中的用途在快速增長。例如，在X射線診斷中， 通過施用比周圍組織、器官或間隔(space)更加使射線難以透過的造影 劑，可提高內部器官的對比度，所述內部器官例如腎、尿道、消化道、 心臟的血管系統(tǒng)(血管造影)等。在超聲診斷中，通過施用與血液和 其他組織聲阻抗不同的組合物可獲得改進的對比度。
在質子MRI診斷中，通過施用含順磁金屬物類的組合物，可獲得 內部器官和組織的提高的對比度。例如，羥磷灰石顆粒被用于改進身
體器官和組織的醫(yī)學成像。這些顆粒包含式Ca5(P04)3(OH)的礦物鈣磷 灰石。它是骨骼和牙齒的無機礦物組分。由于它的順磁金屬離子，它 可用于肝和脾的磁共振成^f象、X射線或超聲成^f象(US 5,6卯,908)。一般來說，為了使造影劑有效，它們必須與成像技術中所用的電磁 輻射的波長干涉，改變組織的物理特性，產(chǎn)生改變的信號，或提供輻 射源本身。通常使用的材料包括有機分子、金屬離子、鹽或螯合物、 顆粒(特別是鐵顆粒)、或標記的肽、蛋白、聚合物或脂質體。在施
用后，試劑可在被代謝和/或排泄之前非特異性地擴散到身體區(qū)域(body compartments);這些試劑一般^皮認為是非特異性試劑。或者，試劑可 對特定的身體區(qū)域、細胞、器官或組織具有特異性的親和力；這些試 劑可^皮稱為單巴向試劑。
對于注射到身體中或被身體吸收并隨血液分布的試劑而言，期望具 有適當?shù)难喊雺燮?US 7,229,606)。雖然在臨床成像情況下特別長的 半壽期(即幾天或幾周)是不必要的，并且可能是危險的(由于提高 了毒性或代謝降解為更多毒性分子的幾率)，但也不期望短的半壽期。 如果成像增強持續(xù)太短的時間，很難獲得患者的高質量的成像。此外， 粑向試劑的快速清除會減少能夠與耙位點結合的試劑的量，因此降低 了影像上靶位點的"亮度"。
磁共振成像(MRI)是用強磁場和無線電信號來產(chǎn)生體內結構和器官 的復雜的垂直、橫截面和三維影像的技術。MRI在提供含水的組織和 器官(例如腦、內部器官、腺體、血管和關節(jié))的影像方面最為有效。 當聚焦的無線電脈沖向目標組織中的磁場校直(aligned)氫原子傳播時， 氫原子會由于質子馳豫而反饋信號。來自不同身體組織的信號中的細 微差別使得MRI能夠區(qū)分器官，并可能區(qū)分良性和惡性組織，使得 MRI可用于檢測腫瘤、出血、動脈瘤、損傷、阻塞、感染、關節(jié)傷害 等。
當用于MRI時，造影劑改變了它們占據(jù)的組織的馳豫時間。MRI 的造影劑典型地是一些磁性材料，這些磁性材料由于造影劑和水質子 的磁力距之間的時間依賴性磁雙極相互作用，而在近距離增加了水質 子的馳豫時間。MRI造影劑或者是使它們占據(jù)的組織變亮的陽性試劑， 或者它們是使組織變暗的陰性試劑。對于體內診斷來說，MRI提供了 良好的分辨特性(大約2毫米)，然而，與其他成像技術相比，它的 靈敏度較差。施用造影劑會顯著提高成像靈敏度。順磁釓(Gd)物類，例 如Gd-DTPA (如OMNISCAN ),使組織變亮，并已被臨床用作MRI 造影劑。造影劑的特異性是在目標位置增加信噪比并通過成像提供功能信 息所需的特性。造影劑的天然分布依賴于大小、電荷、表面化學和施 用途徑。造影劑可在健康或損傷部位濃縮，提高正常組織和損傷之間 的對比度。為了提高對比度，必須在目標部位濃縮造影劑，并提高馳 豫性。此外，也需要相對于健康細胞提高疾病細胞對造影劑的攝取。
大多數(shù)造影劑都有 一 定程度的器官特異性，因為它們是由肝或腎排
泄的。用4L螯合物作為受體導向劑(receptor-directed agents)進行的初始 研究由于顯著減小的馳豫而需要高水平的造影劑(Eur. Radiol. 2001. 11:2319-2331, Y,X. J. Wang, S. M. Hussain, G. P. Krestin)。與釓螯合物 相比，磁石(magnetite)顆粒的磁化率(magnetic susceptibility)高大約兩至 三個數(shù)量級(Eur. Radiol. 2001. 11:2319-2331, Y,X. J. Wang, S. M. Hussain, G. P. Krestin)。因此，與釓螯合劑相比，氧化鐵造影劑可能在 較低的劑量下提供更強的信號。氧化鐵試劑的較高靈敏度還提供了額 外的益處，因為與特定組織結合的靶標的數(shù)量是有限的。
有多種磁性納米顆粒，例如磁性枝狀分子(magnetodedrimers)、磁 性脂質體和聚合物涂覆的納米顆粒(例如葡聚糖、聚乙烯醇等)，它 們被制成包埋在有機涂層中的結晶超順磁氧化鐵納米顆粒。
大多數(shù)市售造影劑基于葡聚糖或葡聚糖衍生物，其中使用了相對小 的顆粒。然而，葡聚糖涂層據(jù)稱在顆粒合成的堿性條件下是不穩(wěn)定的， 因此它們的化學組成是令人懷疑的。此外，葡聚糖誘導的過敏反應存 在潛在的問題(U.S. 5,492,814)。
通常，氧化鐵納米顆粒是在水溶性有機分子(例如葡聚糖)的存在 下在堿性水溶液中合成并沉淀的，這樣的納米顆粒一般具有有機涂層。 這樣的方法獲得的納米顆粒傾向于具有寬的順磁氧化鐵大小分布，結 果，涂覆的顆粒也具有寬的大小分布。此外，此方法對涂覆程度提供 了很小的控制，產(chǎn)生在單一試劑中包含多個氧化鐵納米顆粒的顆粒。 為了獲得所需的顆粒大小，必須使用包括多個純化和大小分離步驟的 復雜制造技術。顆粒大小和有機涂層組合物是非常重要的，因為它直 接影響了納米顆粒的藥物動力學。氧化鐵的大小與試劑的順磁性和馳 豫性直接有關。因此，寬的大小分布通常被解釋為平均靈敏度。
用常規(guī)方法獲得的納米顆粒還具有低水平的結晶度，其顯著地影響 了造影劑的靈敏度。此外，由于納米顆粒的高表面能，它們傾向于聚
5集，這是合成和純化步驟中遇到的很大的問題。這樣的聚集增加了顆 粒的大小，導致快速的血液清除并降低了粑向效率，而且可能會降低 馳子象性。大小、血液循環(huán)時間和有才幾涂層以不同的方式影響耙向效率。 當使用大顆粒時，僅有少量靶向配體在顆粒大到足以從血液中清除之 前連接，使得試劑不能到達指定的靶標。較小的顆粒大小可能會在生 物標記和配體識別的位點變得更"粘"。當涂層為球狀時，配體連接 的活性部位通常受到阻礙，由此降低了結合效率。此外， 一旦結合， 配體可能會存在于球狀涂層的內部，使得生物標記難以接近。
目前的成像劑和它們的用途主要提供解剖學信息。然而，潛在的疾 病狀態(tài)是這樣一些生物化學過程，它們在外在的身體癥狀出現(xiàn)之前就 開始傳播疾病。具有在疾病的早期對生物化學途徑或該途徑中的特異 性標記進行成像的能力，會提供功能信息。
人們需要這樣一些造影劑，它們靶向特定的分子標記，所述分子標 記能夠檢測關鍵的化學生物標記的提高的存在水平，由此在特定的疾 病狀態(tài)的早期提供生物化學信息。需要能夠靶向損傷部位的分子造影 劑來解決疾病的早期診斷和治療的醫(yī)學需要。分子成像和造影劑的靶 向遞送的主要開發(fā)需求之一是筌定生物標記。然而，造影劑具有一些 限制耙向效率的內在的問題，例如低靈敏度、低信噪比、大顆粒尺寸、 快速血液清除、低配體連接效率和配體與生物標記靶標的易接近性。
造影劑的靶向遞送的先前的實例涉及使用交聯(lián)葡聚糖涂覆的氧化
纟失納米顆粒，隨后加入抗體或肽(Kelly, K. A., Allport, J. R., Tsourkas, A. Shinde國Patil, V. R., Josephson, L., and Weissleder, R. (2005) h 96, 327-336; Wunderbaldinger, P., Josephson， L., and Weissleder, R. (2002) 5zoco"ywg C/zem 13, 264-268)。雖然完成了分子綴合和將試劑遞送至目 標部位，但由于生物綴合，試劑變得非常大065nm),而且表現(xiàn)出非常 低的血液半壽期(<50分鐘)，可能會顯著地影響在人體中的效力。
已對一些順磁氧化鐵納米顆粒作為MRI造影劑進行了醫(yī)學評估。 這些產(chǎn)品中的一些可在市場上獲得，例如Feridex IV , Abdoscan 和 Lumirem 用作肝和脾成l象的臨床應用的造影劑。
基于大小,納米顆粒分為:大顆粒(1.4至約50微米)、小顆粒(0.7-1.5 微米)或膠體顆粒(<200nm)。后者也^皮稱為4失i茲流體或4失磁流體樣 材料，在本文中有時被稱為膠體順磁顆粒。說 上面描述類型的小磁性顆粒對于涉及生物特異性親和反應的分析 非常有用，因為它們可用生物功能性聚合物(例如蛋白)方便地涂覆， 提供非常高的表面積，并提供合理的反應動力學。在專利文獻中已描
述了范圍為0.7-1.5微米的磁性顆粒，所述專利文獻包括，例如美國專 利Nos. 3，970,518; 4，018,886; 4,230,685; 4,267,234; 4,452,773; 4，554,088; 以及4,659,678。
小的磁性顆粒，例如上文描述的那些，通常屬于兩個大的類別。第 一類別包括可永磁化的，或鐵磁性的顆粒；第二類別包括只有在磁場 中才顯示出明顯(bulk^茲性行為的顆粒。后者^皮稱為i茲性響應顆粒。表 現(xiàn)出磁性響應行為的材料有時被描述為順磁性的。然而，當以直徑大 約30nm或更小的晶體形式提供時， 一般被認為是鐵磁性的材料(例如 磁性氧化鐵)可被表征為順磁性的。相反，相對較大的鐵磁材料晶體， 在暴露于磁場之后，保留永磁特性，并且隨后由于強的顆粒-顆粒相互 作用，傾向于聚集。
與上面提到的小的磁性顆粒類似，大的磁性顆粒(>1.5微米至大約 50微米)也可表現(xiàn)出順磁行為。典型的這樣的材料是Ugelstad在美國 專利No.4，654267描述的和Dynal(Oslo, Norway)制造的那些。
Owen等的美國專利No. 4,795,698涉及聚合物涂覆的膠體順磁顆 粒，它們是通過在聚合物的存在下由Fe+2/Fe+3鹽形成磁石(magnetite) 而制備的。Molday的美國專利No. 4,452,773描述了一種材料，其特性 類似于Owen等描述的那些，該材料是通過在非常高濃度的葡聚糖的存 在下，通過加入堿，由Fe+2/Fe+3形成磁石和其他氧化鐵而制備的。在 長達幾個月的觀察期內，由這兩種方法得到的顆粒顯示了可觀察到的 不從水性懸浮液中沉淀出來的傾向。如此制備的材料具有膠體性質， 已被證明在細胞分離中非常有用。Molday的技術已被Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany和Terry Thomas, Vancouver, Canada商業(yè) 化。美國專利No. 5,597,531描述了另一種制備順磁膠體顆粒的方法。 與Owen等或Molday的專利描述的顆粒相反，這些稍后的顆粒是通過 將生物功能性聚合物直接涂覆在預先形成的超順磁晶體上而形成的， 所述晶體已通過個高功率的聲能分散成范圍為25至120nm的準穩(wěn)態(tài)的 晶體簇。所得到的顆粒(本文中稱為直接涂覆的顆粒)比相同總體大 小的膠體顆粒(例如Molday或Owen等描述的那些)顯示出明顯更大的磁力矩。
人們對改進檢測極限、提高分辨率、在分子水平上獲得信息、在疾
病的早期檢測疾病和通過MRI研究獲得生理學信息的需求是巨大的。 這些挑戰(zhàn)需要改進造影劑的靈敏度、選擇性、血液循環(huán)時間，以及生 物標記和粑向配體的特性。因而，這樣的方法和/或組合物是特別有用 的，納米顆粒由這些方法或者含有所述組合物的納米顆粒會提供改進 的馳豫性、信噪比和粑向能力，對聚集的抗性，以及控制顆粒大小、 血液清除速率和分布的能力。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了改進醫(yī)學診斷成像的方法和組合物。本發(fā)明公開了用 于MRI的新的造影劑。所述造影劑包含綴合的單克隆抗體(mAb),所 述單克隆抗體抗內皮細胞活化標記的鼠同種型(isoform),例如但不限于 抗ICAM (CD54內皮細胞活化標記)的鼠同種型。典型地，耙向MRI 造影劑提供增強的馳豫性、改進的信噪比、靶向能力和對聚集的抗性。 制備這樣的MRI造影劑的方法提供了對顆粒大小的更好的控制，使用 這樣的MRI造影劑的方法典型地提供改進的血液清除速率和分布。 CD54-FF被用作耙向血管內皮細胞的MRI造影劑，包含與單硫醇化 (mono-thiolated)抗CD54綴合的，BSA涂覆的氧化鐵顆粒。淬滅的 (quenched)復合物保存于D1H20中。
本發(fā)明涉及在成像技術(例如MRI)中使用靶向造影劑的方法。
'受試者。


圖1:為MRI制備的FF的概述。對BSA涂覆的氧化鐵顆粒進行 一系列的分離和濃縮步驟，以獲得用于綴合步驟的在適當基質中的適 當濃度的較小的顆粒。隨后，F(xiàn)F與SMCC反應，與單硫醇化抗體綴合。 淬滅得到的FF-Mab綴合物，在DI H20中清洗和保存。
圖2:使抗ICAM/FF顆粒粑向小鼠內皮細胞(熒光顯微術)。
圖3:使抗ICAM/FF顆粒靶向小鼠內皮細胞(NMRminispec)。
圖4:以5 mg/kg FF注射后的T2馳豫。
圖5:以15 mg/kg FF注射后的T2馳豫。圖6: 5mg/kgFF， 60分鐘后不同器官中的T2馳豫。 圖7: 15mg/kgFF, 60分鐘后不同器官中的T2馳豫。
發(fā)明詳述
本發(fā)明使用了一種涂覆的磁性顆粒，其包含磁性材料的納米顆粒核 心，和磁性核心上的基底(base)涂覆材料(US 6,365,362)。這些磁性顆粒 的特征為特別低的非特異性結合。所描述的顆粒的磁性核'"材料可包 含至少一種過渡金屬氧化物，以及包含蛋白的適當?shù)幕淄扛膊牧稀?適用于涂覆磁性顆粒的蛋白包括但不限于牛血清白蛋白和酪蛋白。附 加的涂覆材料可以是原涂覆蛋白，或是與磁性核心上的基底材料偶聯(lián) 的特異性結合對的成員之一。示例性的特異性結合對包括生物素-鏈親 合素、抗原-抗體、受體-激素、受體-配體、激動劑-拮抗劑、外源凝集 素-碳水化合物、蛋白A-抗體Fc和抗生物素蛋白-生物素。特異性結合 對的成員可通過雙官能連接化合物與基底涂覆材料偶聯(lián)。示例性的生 物官能連接化合物包括琥珀酰亞氨基-丙酰-二硫代吡啶(SPDP),和 4-[馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己基-l-羧酸硫代琥珀酰亞胺酯(SMCC)，然 而，可以從Pierce, Rockford, 111獲得其他這樣的異雙官能化合物接頭化 合物的變體。
本發(fā)明的涂覆的》茲性顆粒優(yōu)選具有70-90。/。的/磁性質量(magnetic mass)。磁性顆粒的主體部分具有范圍為90-150,優(yōu)選15至70 nm的顆 粒大小。顆?？梢允呛铣傻模沟盟鼈兏哂袉畏稚⑿?，例如范圍為 15至30nm。本發(fā)明的顆粒典型地懸浮于生物相容介質中。
經(jīng)常需要對發(fā)生在不同的疾病狀態(tài)-癌癥、心血管病、腦血管病和 自體免疫病等中的血管腔內皮的活化官能障礙和/或死亡進行成像。結 果，內皮的完整性可能被損害(compromised),導致它在血管床(vascular bed)的一個或幾個區(qū)域內部分或完全破壞。對這樣的傷害的位置和程度 進行體內可視化的能力可提供可能有用的診斷和預后信息。這樣的信 息可進一步輔助內皮靶標特異性治療的遞送和監(jiān)測。本發(fā)明使用通過 與磁性納米顆粒綴合而官能化的單克隆抗體(mAb)作為MRI造影劑。
血管腔內皮的活化官能障礙和/或死亡發(fā)生在不同的疾病狀態(tài)-癌 癥、心血管病、腦血管病和自體免疫病等。結果，內皮的完整性可能 被損害，導致它在血管床的一個或幾個區(qū)域內部分或完全破壞。對這
9樣的傷害的位置和程度進行體內可視化的能力可提供可能有用的診斷 和預后信息。這樣的信息可進一步輔助內皮靼標特異性治療的遞送和
監(jiān)測。本發(fā)明涉及與磁性納米顆粒綴合的單克隆抗體(mAb)的用途，所 述單克隆抗體作為MRI造影劑，靶向內皮細胞表面活化標記。
造影劑是用以下方法制得的使針對鼠抗ICAM (CD54，內皮細 胞活化標記)異種型的大鼠mAb (克隆YN1 )與磁性鐵磁流體(FF)納 米顆粒綴合，產(chǎn)生大約75nm直徑的顆粒(圖1)。通過使正常大鼠IgG 與FF綴合來制備同類型(isotype)對照，產(chǎn)生IgG-FF (64nm直徑，F(xiàn)e = 11.48mg/mL)。通過使試劑與鼠內皮細胞(EC)溫育來測定抗CD54-FF的 體外反應性，所述鼠內皮細胞用TNFa處理過夜以加強ICAM-l表達(圖 2)。在用FITC標記的第二抗體復染后，用焚光顯微鏡(FM)檢查細胞。 然后裂解細胞，通過測量NMR minispec T2馳豫時間來進行目標追蹤 (圖3 )。然后向麻醉的先天非反應性小鼠(N-3)靜脈內注射5mg/kg或 15 mg/kg的抗CD54-FF或IgG-FF,在注射后1分鐘、30分鐘和60分 鐘采集血液(圖4和5)。 1小時后殺死動物，收集器官，用FM和NMR minispec分析。最后，向4只小鼠靜脈內注射5mg/kg，其中2只預先 用TNFa處理，2只沒有。另夕卜4只小鼠(2 TNFa+, 2 TNFa-)接受5mg/kg IgG-FF, —只對照不接受靜脈內輸注。l小時后殺死動物，在4。C下保 存。然后用帶有108/38mm (0.D./I.D.)正交鳥籠型成像RF線圈的用于 小動物的7T 21cm Varian MRI儀器對全部9具尸體成4象。進行胸部和 腹部的T2和丁2*成像。成像的持續(xù)時間為1小時/動物，以30分鐘/動 物進行數(shù)據(jù)分析。計算T2和T2+的變化以測定特異性靶向。
抗CD54-FF焚光追蹤(2nd mAb染色)和T2馳豫時間顯示與對照 IgG/FF相比在4°C或37°C下都特異性靶向培養(yǎng)的小鼠內皮細胞，信號 在37。C下較強(圖2)。與IgG/FF相比，用抗ICAM/FF以15mg/kg 或5mg/kg靜脈注射的小鼠(n=3)顯示肝和脾的實質性 (substantial)CD54-FF耙向，而腎和肺較差。心和腦也顯示了可測量的 造影劑濃縮。在下一批成像的九只小鼠中，IgG-FF對照增強在TNFa+/-^f又;故定位于脾和肝，而與TNFa陰性組相比，CD54-FF注射的動物顯 示在TNFa+動物的器官中T2馳豫時間下降(圖6和7)。
如在預先用TNFa細胞因子處理的動物中下降的馳豫時間所表明 的，CD54-FF作為MRI造影劑，在多個器官(包括腦)中靶向活化的血管內皮細胞。雖然數(shù)據(jù)表明最特異性粑向的是肺，脾和肝顯示IgG 和CD54-FF濃度都提高，很可能是由于通過網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)進行的Fc 介導的攝取。此外，來自培養(yǎng)細胞系研究的5。C對37。C數(shù)據(jù)也顯示這 些納米顆?？蒦皮內皮細胞內吞。
雖然上文已描述并特別地例示了本發(fā)明的實施方案，但本發(fā)明并不 限于這樣的實施方案。在不背離本發(fā)明的精神的條件下，可對這些實 施方案進行不同的修飾，改進的全部范圍在以下權利要求中描述。
權利要求
1.一種成像方法，其包括a.獲得進行體內成像的受試者；b.將造影劑引入所述受試者，其中所述造影劑主要包含內皮細胞活化標記，所述內皮細胞活化標記與具有生物官能聚合物基底涂層的超順磁納米顆粒偶聯(lián)。c.使所述造影劑與血管腔相互作用；d.使所述相互作用成像，其中所述成像是MRI；并且e.分析所述成像的特異性靶區(qū)域。
2. 權利要求l的方法，其中所述內皮細胞標記是抗ICAM。
3. 權利要求l的方法，其中所述造影劑是抗CD54-FF。
4. 權利要求1的方法，其中所述順磁納米顆粒在其核心具有至少 一種過渡金屬氧化物。
5. 權利要求1的方法，其中所述基底涂層選自蛋白、牛血清白蛋 白、酪蛋白和它們的組合。
6. —種用于體內成像的靶向MRI造影劑，其包含a. 具有至少一種過渡金屬氧化物的膠體納米顆粒核心；b. 所述納米顆粒具有生物官能聚合物基底涂層，其中所述聚合 物選自蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白和它們的組合；以及c. 通過所述納米顆粒官能化的單克隆抗體。
7. 權利要求2的造影劑，其中所述單克隆抗體是抗CD54。
8. 權利要求2的造影劑，其中所述納米顆粒的直徑小于75nm。
全文摘要
免疫磁性納米顆粒被用作增強醫(yī)學診斷成像(例如磁共振成像(MRI))的造影劑。本發(fā)明涉及由免疫磁性顆粒制備靶向MRI造影劑的方法，以及使用這樣的MRI造影劑的方法。典型地，這樣的靶向MRI造影劑提高增強的馳豫性，改進的信噪比，改進的靶向能力，并且難以聚集。制備這樣的MRI造影劑的方法典型地更好控制顆粒大小，使用這樣的MRI造影劑的方法提供改進的血液清除速率和分布。在MRI中使用造影劑的能力為診斷和治療幾種疾病狀態(tài)提供了工具。
文檔編號A61B5/055GK101636108SQ200780040966
公開日2010年1月27日 申請日期2007年11月1日 優(yōu)先權日2006年11月2日
發(fā)明者G·V·多伊爾 申請人:維里德克斯有限責任公司