專利名稱：：螺桿菌的體外培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于體外分離和/或培養(yǎng)螺桿菌、尤其是"暫定豬螺桿菌(Cawt/Wa^Helicobactersuis)"的方法和工具。本發(fā)明還涉及由分離的螺桿菌培養(yǎng)物制備抗原和疫苗。
背景技術(shù)：
：人群中的幽門螺桿菌(/^&0^"^py/oW)感染是胃和十二指腸潰瘍以及胃癌的一個主要原因。幽門螺桿菌(//.;^/oW)不是唯一一種能在人的胃黏膜上集落化的螺桿菌。已經(jīng)在約0.96%的人的胃活組織切片中發(fā)現(xiàn)了"海爾曼螺桿菌，，(//6/&0^"^/^7附a朋"，建議名)(Heilmann禾BBorchard(1991)Gut32，137-140)。這一生物體與胃炎密切相關(guān)，但也與消化器官潰瘍、胃腺癌以及黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤相關(guān)。近期的證據(jù)顯示，海爾曼螺桿菌(//./^7ma"m》不是單一的物種，而是代表了具有相似的螺旋形形態(tài)的不同細(xì)菌種類，其中大部分可能具有人畜共患性起源。在16SrRNA基因序列的基礎(chǔ)上分為1型海爾曼螺桿菌和2型海爾曼螺桿菌(Solnick等，(1993)J.Infect.Dis.168，379-385)。50%以上的人類海爾曼螺桿菌感染是由1型海爾曼螺桿菌引起的(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)。1型海爾曼螺桿菌已被證實等同于"暫定豬螺桿菌"(CandidatusH.suis)(O，Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)，后者是一種在60%以上屠宰的豬的胃中集落化的迄今無法培養(yǎng)的螺旋形細(xì)菌。暫定豬螺桿菌在豬的胃病中的實際作用仍不清楚，但已經(jīng)指出，這一細(xì)菌與食管部O胃潰瘍以及慢性幽門胃炎相關(guān)。使用小鼠接種將這一細(xì)菌從受感染的豬胃黏膜中分離出來(Dick等，(1989)J.Med.Microbiol.29，55-62)。Hellemans等人[(2005)Antimicrob.agentschemother.49，45304535]改進了現(xiàn)有的暫定豬螺桿菌感染的體內(nèi)小鼠模型，用于評價這一生物體的抗生素易感性。仍未實現(xiàn)暫定豬螺桿菌的體外培養(yǎng)。發(fā)明概述本發(fā)明是建立在開發(fā)能夠分離和培養(yǎng)螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌o的培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上的，暫定豬螺桿菌在這之前未被證明能以體外分離株的形式培養(yǎng)。本發(fā)明的第一個方面涉及一種用于分離螺桿菌的培養(yǎng)體系的應(yīng)用，更具體地說，涉及一種包含固體成分的培養(yǎng)體系(即固體培養(yǎng)基)的應(yīng)用，所述固體培養(yǎng)基包含至少7.5%血液或10%血清，其pH調(diào)節(jié)至5.0至6.0之間。在一具體實施方式中，所述固體成分包含用于苛求生物體生長的營養(yǎng)素。更具體地說，這些營養(yǎng)素選自布氏、馬-欣二氏或心腦浸液培養(yǎng)基。在進一步的具體實施方式中，存在于所述固體成分中的血清是濃度至少12.5%的血清。在另一具體實施方式中，存在于所述固體成分中的血液濃度至少為10%。更具體地說，本發(fā)明涉及在"暫定豬螺桿菌"的分離中使用上述培養(yǎng)體系。在第二個方面，本發(fā)明提供了用于從含有相同螺桿菌的樣品中分離螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的方法，所述方法包括在含有pH5.0到6.0之間、補充了至少10%血清或至少7.0%血液的培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)所述含螺桿菌的樣品的步驟。在這些方法的具體實施方式中，所使用的培養(yǎng)基包含用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。更具體地說，所述用于苛求菌生長的營養(yǎng)素選自布氏、馬-欣二氏或心腦浸液營養(yǎng)素。此外或或者，在具體實施方式中，所述培養(yǎng)基包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)。在進一步的具體實施方式中，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。在本發(fā)明所述方法的具體實施方式中，含至少10%血清的所述培養(yǎng)基含有12.5和25%之間的血清。另外，含至少7.0%血液的所述培養(yǎng)基含有7.5和15%、尤其是10和15%之間的血液。可選地，本發(fā)明所述方法中使用的培養(yǎng)基進一步包含從維生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、對氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(輔酶1)、輔羧酶、硝酸鐵、硫胺和鹽酸半胱氨酸中選擇的一種或多種生長因子。在本發(fā)明所述方法的具體實施方式中，使用了包含一種固體成分和一種液體成分的培養(yǎng)體系，其中至少所述固體成分含有如上所述的培養(yǎng)基。在進一步的實施方式中，固體和/或液體成分都含有用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。更具體地說，這些營養(yǎng)素選自布氏、馬-欣二氏或心腦浸液營養(yǎng)素。在本發(fā)明所述方法的一種進一步具體的實施方式中，培養(yǎng)體系的固體和/或液體成分包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)。更具體地說，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。本發(fā)明所述方法的進一步具體的實施方式使用含有一種固體和一種液體成分的培養(yǎng)體系，其中所述固體成分包含12.5和15%之間的血清或7.5和15%、尤其是10和15%之間的血液。本發(fā)明所述進一步具體的實施方式使用如上所述含有一種固體和一種液體成分的培養(yǎng)體系，其中所述固體和/或液體成分進一步包含從維生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、對氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(輔酶1)、輔羧酶、硝酸鐵、硫胺和鹽酸半胱氨酸中選擇的一種或多種生長因子。本發(fā)明的方法尤其適于"暫定豬螺桿菌"的分離。事實上，本發(fā)明首次提供了獲得"暫定豬螺桿菌"分離株的方法。因此，本發(fā)明的第二個方面提供了螺桿菌的分離株、尤其是"暫定豬螺桿菌"的分離株。在這里首次展示的這種分離株是通過本發(fā)明的方法獲得的。本發(fā)明的第三個方面提供了用于培養(yǎng)螺桿菌分離株的方法，所述方法包括在包含pH在4.0和7.0之間的補充了至少10%血清或至少7.5%血液的培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系中應(yīng)用所述螺桿菌分離株、以及在其中培育所述分離株的步驟。如本發(fā)明這一方面所述方法的具體實施方式中，所使用的培養(yǎng)體系包含一種固體和一種液體成分，并且至少該培養(yǎng)體系的所述固體成分含有以上所述培養(yǎng)基。在本發(fā)明所提供的這些培養(yǎng)方法的進一步具體實施方式中，所述固體和液體成分含有用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。在具體實施方式中，本發(fā)明培養(yǎng)方法中所使用的所述培養(yǎng)體系的至少所述固體成分pH緩沖在4.7和7.0之間。本發(fā)明的另一個方面提供了含有一種用于分離和/或培養(yǎng)螺桿菌的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器，所述固體培養(yǎng)基包含用于苛求生物生長的營養(yǎng)素、濃度在7.5至15%之間的血液或濃度在12.5至25%之間的血清、以及至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)，所述培養(yǎng)容器的特征在于，其中所包含的固體培養(yǎng)基的pH介于5.0至6.0之間。更具體地說，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐咬、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。在本發(fā)明所述培養(yǎng)容器的具體實施方式中，所述固體培養(yǎng)基含瓊脂。本發(fā)明的另一個方面提供了含有"暫定豬螺桿菌"分離株抗原制劑的疫苗。事實上，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)"暫定豬螺桿菌"的抗原制劑的方法，所述方法包括按照上述方法分離并可選地培養(yǎng)"暫定豬螺桿菌"以及由所獲得的"暫定豬螺桿菌"分離株生產(chǎn)抗原制劑。此外，本發(fā)明提供了含有活的減毒的"暫定豬螺桿菌"和/或完全滅活的"暫定豬螺桿菌"的疫苗以及用于制備這樣的疫苗的方法，所述方法包括上述的分離和可選地培養(yǎng)方法。本發(fā)明的另一個方面提供了針對"暫定豬螺桿菌"感染對動物進行疫苗接種的方法，所述方法包括將含有"暫定豬螺桿菌"分離株、活的減毒"暫定豬螺桿菌"和/或完整的"暫定豬螺桿菌"中的一種或多種抗原制劑的疫苗對動物給藥。類似地，本發(fā)明設(shè)想了針對用于預(yù)防和/或治療螺桿菌感染的疫苗生產(chǎn)，使用能通過這里所述的方法分離和/或培養(yǎng)的螺桿菌分離株、尤其是"暫定豬螺桿菌"分離株，或使用由"暫定豬螺桿菌"獲得的抗原制劑。更具體地說，設(shè)想了使用螺桿菌制劑、尤其是"暫定豬螺桿菌"用于生產(chǎn)預(yù)防和/或治療螺桿菌感染、尤其是用于針對"暫定豬螺桿菌"進行免疫的疫苗。發(fā)明詳述本發(fā)明將參照某些實施方式進行描述，但本發(fā)明不限于這些實施方式而僅受權(quán)利要求的限制。這里所使用的術(shù)語"暫定豬螺桿菌"(或豬螺桿菌(HW&))是指以前認(rèn)為是1型海爾曼螺桿菌()的細(xì)菌(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)?，F(xiàn)在認(rèn)為，1型海爾曼螺桿菌等同于暫定豬螺桿菌(0，Rourke等(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211;DeGroote等(1999)Int.J.Syst.Bacteriol.49，1769-1777)，它是一種在60%以上屠宰的豬的胃中集落化的螺旋狀細(xì)菌。暫定豬螺桿菌在分子水平上也被定義為具有Genbank登錄號AF127028(DeGroote等(1999)，前文引用)和AF506788-92(O，Rourke等(2004)，前文引用)的16SrRNA序列和Genbank登錄號AF508013-AF508014(O，Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)中所述尿素酶基因序列的螺桿菌。這里所使用的術(shù)語"分離株"是純的、勻質(zhì)的微生物體外培養(yǎng)物。它可以通過其體外培養(yǎng)從異質(zhì)的微生物野生群落得到。本發(fā)明上下文中所使用的術(shù)語"培養(yǎng)容器"涉及適于培養(yǎng)微生物的容器，諸如但不限于皮氏培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、滾瓶以及細(xì)胞工廠。本發(fā)明上下文中所使用的術(shù)語"抗原制劑"涉及包含至少一種對動物給藥時激發(fā)免疫應(yīng)答(因此稱為"抗原")的蛋白質(zhì)或其片段的組合物。這里所使用的術(shù)語"疫苗"是指如前文所述抗原制劑的組合物，用于對動物或人給藥以刺激所述動物或人體內(nèi)針對一種引發(fā)疾病的生物體的免疫應(yīng)答，從而為所述動物或人針對所述生物體引起的疾病或病癥提供保護。疫苗可以包含完整的引起疾病的生物體(滅活的或弱化的)或這些生物體的部分、或?qū)?yīng)于這些生物體的整體或部分的合成分子。術(shù)語疫苗包括針對預(yù)防應(yīng)用的組合物(即在感染前對動物或人給藥以防止最初的(和/或再次發(fā)生的)感染)以及針對治療應(yīng)用的組合物(即在感染后對動物或人給藥以降低或阻止由所述生物體引起的疾病進程)。通過疫苗接種過程用來自一個物種的抗原為由另一個物種所引起的疾病提供保護被稱為"交叉疫苗接種"或"異源疫苗接種"。這里所使用的術(shù)語"胃的材料"是指直接或間接從人或其他動物的胃腸道中獲得的任何材料。這樣的材料包括例如胃上皮細(xì)胞、胃黏膜以及消化液。這里所使用的術(shù)語"培養(yǎng)基"是指適合于微生物生長的液體、固體或半固體組合物。術(shù)語"苛求生物體"在這里按照其在細(xì)菌學(xué)中的常規(guī)含義使用，即是指具有復(fù)雜營養(yǎng)要求的細(xì)菌[Stedmans醫(yī)學(xué)詞典]。本發(fā)明的第一個方面提供了用于分離和/或培養(yǎng)螺桿菌、尤其是"暫定豬螺桿菌"的體外方法。暫定豬螺桿菌的體外分離迄今還未報道。本發(fā)明提供了能使螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌選擇性生長的方法。通過高濃度血液或血清以及提供最優(yōu)化pH條件的組合已經(jīng)實現(xiàn)了用于暫定豬螺桿菌的選擇性生長條件。有利于螺桿菌生長的pH條件同時對于大量非螺桿菌和真菌是有害的。通過使用低pH，降低了污染，使得暫定豬螺桿菌得以放大。在本發(fā)明的分離方法中，含有螺桿菌的樣品在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為約5.0至約6.0之間。這一pH調(diào)節(jié)可以通過向培養(yǎng)基營養(yǎng)素中添加濃酸進行，所述培養(yǎng)基營養(yǎng)素通過作為兩性離子的氨基酸的存在提供了足夠的緩沖能力。另外，在培養(yǎng)基中加入在pH5.0至5.5附近具有高緩沖能力的生物相容性緩沖液(例如醋酸鹽、磷酸鹽)。驚訝地發(fā)現(xiàn)，在pH值5.0至6.0之間，暫定豬螺桿菌的分離形成螺旋狀運動的細(xì)菌，而在此pH區(qū)間以外，暫定豬螺桿菌表現(xiàn)為球菌狀不運動形式。如稍后在實施例中詳細(xì)解釋的，pH對暫定豬螺桿菌的作用隨著連續(xù)的傳代在某種程度上有所改變。而在pH5.0至6.0之間成功分離了暫定豬螺桿菌。按照一種實施方式，本發(fā)明的方法包括將含有螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的樣品應(yīng)用于一種培養(yǎng)體系，所述培養(yǎng)體系是一種雙組分培養(yǎng)體系，包含一種固體組分和一種液體(或半液體)組分，所述樣品位于液體組分中。所述固體組分通常包含瓊脂，所述液體組分是至少含有營養(yǎng)素的肉湯。已經(jīng)觀察到，在這樣的培養(yǎng)體系中，螺桿菌分離株保留在液體組分中并可以通過轉(zhuǎn)移至另一種固體組分加以亞培養(yǎng)。在本發(fā)明的分離方法中使用雙組分體系的情況下，至少固體組分的pH介于5.0至6.0之間。本發(fā)明分離方法中的培養(yǎng)基包含高濃度血液(7.5至25%之間)或諸如血清的血液成分(12.5至30%之間)。除非另有說明，培養(yǎng)基中的血清和血液濃度是體積百分比(v/v)。在具體實施方式中，培養(yǎng)基中的血清濃度介于12.5至25%之間，這包括諸如12.5、15、17.5、20和25%的濃度。在其他具體實施方式中，培養(yǎng)基中的血液濃度介于7.5至25%之間、更具體介于8至20%之間、尤其介于9至15%之間，這包括諸如9.5、10和12.5%的濃度。在使用雙組分培養(yǎng)體系的情況下，所述培養(yǎng)體系的至少固體組分、但可選地以及液體組分應(yīng)當(dāng)含有具體的血清或血液濃度。本發(fā)明上下文中所使用的培養(yǎng)基中的血清可以是不同動物的胎兒、新生兒或成年個體的血清(所述動物例如但不限于牛、馬、綿羊、山羊或豬)、尤其是馬血清、或其組合。通常，除了其他成分以外，血清還包含諸如白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等為螺桿菌提供鐵的鐵結(jié)合蛋白。也可以使用含有這樣的基礎(chǔ)成分的適當(dāng)?shù)难寤蜓禾娲?。諸如但不限于牛、馬、綿羊、山羊或豬的血液等不同種類的血液適用于本發(fā)明的方法。在具體實施方式中，培養(yǎng)基中的血液濃度介于7.5至15%之間，這包括例如10%和12.5%的血液濃度。根據(jù)具體實施方式，本發(fā)明的最初分離方法中使用的培養(yǎng)基還含有抗菌劑以進一步確保螺桿菌的選擇性生長。這樣的抗菌劑包括抗細(xì)菌物質(zhì)和抗真菌物質(zhì)，它們限制或抑制所述樣品中潛在的非螺桿菌的細(xì)菌或酵母的生長。在使用雙組分體系的情況下，這些抗菌劑至少存在于固體組分中，并且可選地也存在于液體或半液體組分中。在具體實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含一種或多種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的抗生素。這樣的抗生素的例子有萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。例如，Skirrow補充物(奧氏公司(Oxoid))是適合于本發(fā)明所述方法的一種商品化抗生素組合物，其在培養(yǎng)基中的終濃度為10mg/mL萬古霉素、5mg/L乳酸甲氧芐啶和2500IU/L多粘菌素B。其他的抗生素混合物例如是抗真菌混合物，諸如兩性霉素B(兩性霉素B(flingizone))。一旦已經(jīng)獲得了諸如暫定豬螺桿菌的螺桿菌分離株，可以使用前文所述用于本發(fā)明的分離方法的培養(yǎng)條件對其進一步培養(yǎng)。然而，已經(jīng)觀察到，已分離的培養(yǎng)物可以在更寬的pH范圍內(nèi)(4.0到7.0之間)培養(yǎng)。pH在分離過程中更為關(guān)鍵，因為在pH6.0以上的條件下，新分離的胃部樣品中存在的污染物(其他細(xì)菌和真菌)比樣品中的螺桿菌長得快，這對分離是不利的。然而已經(jīng)觀察到，對于含有較少污染物的暫定豬螺桿菌分離株而言，可以在pH7.0以下生長。因此，本發(fā)明進一步提供了如上所述用于螺桿菌分離株、尤其是暫定豬螺桿菌的培養(yǎng)方法，其中培養(yǎng)基的pH介于約4.0至約7.0之間，尤其介于(并包括)約4.7至約6.0之間。在樣品中存在不同的細(xì)菌和真菌情況下的分離過程中，尤其適用上述抗生素和抗真菌劑。然而，在獲得了純分離株的情況下，可以在含有較少或不含抗生素或抗真菌劑的培養(yǎng)基中實現(xiàn)培養(yǎng)。在本發(fā)明的分離和/或培養(yǎng)方法的具體實施方式中，培養(yǎng)基還包含額外的生長因子。例如，商品名為Vitox(奧氏公司)的是一種商品化的生長因子混合物。這一商品化組合物的生長因子在生長培養(yǎng)基(瓊脂或肉湯)中的終濃度為維生素B12(0.5mg/L)、L-谷氨酰胺(50.0mg/L)、腺嘌呤(5.0mg/L)、鳥嘌呤(0.15mg/L)、對氨基苯甲酸(0.65mg/L)、L-胱氨酸(5.5mg/L)、NAD輔酶-1(1.25mg/L)、輔羧酶(0.5mg/L)、硝酸鐵(O.lmg/L)、硫胺(0.015mg/L)和鹽酸半胱氨酸(130.0mg/L)。在使用雙組分體系的情況下，所述生長因子可以存在于固體組分中或液體組分中或雙組分中。根據(jù)一具體實施方式，在固體組分中添加所述生長因子。通常,本發(fā)明的分離和/或培養(yǎng)方法中使用的培養(yǎng)基包含用于苛求生物體生長的營養(yǎng)素。這些營養(yǎng)素通常通過添加諸如但不限于布氏培養(yǎng)基、馬-欣二氏培養(yǎng)基、牛和豬腦心浸液等培養(yǎng)基以及諸如但不限于哥倫比亞瓊脂、胰蛋白大豆瓊脂酯類等效培養(yǎng)基提供。布氏培養(yǎng)基通常在1L培養(yǎng)基中包含10g酪蛋白胰酶消化物、10g動物組織胃蛋白酶消化物、lg葡糖、2g酵母提取物、5g氯化鈉和O.lg亞硫酸氫鈉。其中蛋白胨提供有機氮。酵母提取物是B族維生素的有力來源。葡糖用作能量來源。馬-欣二氏培養(yǎng)基通常在lL培養(yǎng)基中包含2g肉浸液、17.5g酪蛋白水解物和1.5g淀粉。這樣的培養(yǎng)基可以從例如戴氏公司(Difco)和奧氏公司等公司購得。本發(fā)明提供了用于螺桿菌分離和/或培養(yǎng)的方法，所述方法能夠?qū)φ嬲穆輻U菌分離株、尤其是"暫定豬螺桿菌"分離株進行分離和培養(yǎng)。然而應(yīng)當(dāng)理解，存在影響螺桿菌富集的其他因素。這樣的因素包括獲得含螺桿菌的樣品的方式，特別是在取得胃的材料時對胃和胃壁進行處理以使其他生物污染最小化的方式。因此，本發(fā)明所述分離方法的具體實施方式進一步包括在特定條件下提供含有螺桿菌的胃的材料的樣品的第一個步驟。在一種實施方式中，胃壁的一部分在殺滅大量酸不穩(wěn)定微生物的酸性條件下培育。在另一種具體實施方式中，通過只分離胃的表面粘液對胃壁進行處理?？蛇x地，在本發(fā)明的培養(yǎng)和/或分離方法中使用的培養(yǎng)基包含一種或多種額外成分。在本發(fā)明所述方法的具體實施方式中，培養(yǎng)基進一步包含活性炭。在使用雙組分體系的情況下，活性炭至少存在于固體組分中。在本發(fā)明所述方法的具體實施方式中，培養(yǎng)基進一步包含在pH5.5至6.0之間變色的生物相容性pH指示劑。例如，可以使用pH6.6以下顯黃色并在pH8以上顯紅色的苯酚紅。這樣的指示劑在含血清的平板中尤其有用。通常，在雙組分體系中，這樣的pH指示劑存在于固體組分中。在具體實施方式中，本發(fā)明所述的分離和/或培養(yǎng)方法包括將含有螺桿菌的樣品應(yīng)用于雙組分體系，其中固體組分含營養(yǎng)素、生長因子和抗生素，并調(diào)節(jié)pH至4.7和7.0之間(更具體為5.0和6.0之間)，而液體組分只包含營養(yǎng)素而不進行pH調(diào)節(jié)。可選地，液體組分的pH調(diào)節(jié)至4.7和7.0之間(或更具體地，5.0和6.0之間)，并且/或液體組分也含有生長因子和抗生素?？梢钥紤]用于實現(xiàn)本發(fā)明所述方法的具體實際結(jié)構(gòu)。通常，在培養(yǎng)瓶或皮氏培養(yǎng)皿(平板)中進行分離和培養(yǎng)。在具體實施方式中，所述方法包括一種雙組分體系，其中固體組分覆蓋了培養(yǎng)容器的整個底部(厚度通常為lmm至5mm之間)，液體或半液體組分在固體組分的全部或部分表面上展開。在一種非常具體的實施方式中，在直徑為10cm的含有5到15mL具有前文所述成分的固體瓊脂的皮氏培養(yǎng)皿類容器中進行分離。在瓊脂頂部加入約500至約lOOO)iL作為液體組分的液體肉湯。在另一具體實施方式中，所述雙組分體系包含沒有添加營養(yǎng)素、血清或其它添加劑的底層瓊脂，但包含pH5的緩沖劑。在這一底層瓊脂的頂部，涂布了含有暫定豬螺桿菌培養(yǎng)所需的所有成分的頂層瓊脂。通過使用這一緩沖劑使用了最少量的昂貴的成分，而通過下面底層瓊脂的存在，所述頂層瓊脂的pH保持穩(wěn)定。本發(fā)明所述的方法可以用于螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的分離和/或培養(yǎng)。通常，在本發(fā)明所述方法中，根據(jù)微生物污染和培養(yǎng)基的營養(yǎng)利用程度，胃的材料的樣品在培養(yǎng)體系中培育1至15天。在使用固體培養(yǎng)基的情況下，培養(yǎng)基耗盡的標(biāo)志通常是在固體培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明區(qū)域。此外或另外，可以評價液體培養(yǎng)基中螺桿菌的活動性，其中降低的活動性是培養(yǎng)基耗盡的指標(biāo)。此外或另外，當(dāng)培養(yǎng)基(或固體和/或液體組分)的pH提高到pH6.0或更高時，可以將細(xì)菌分離株轉(zhuǎn)移至新鮮平板。通常，本發(fā)明的方法涉及將含有螺桿菌或螺桿菌分離株的樣本在37°C培育。發(fā)現(xiàn)螺桿菌在25。C以下或40。C以上不生長。通常，含螺桿菌的平板在微氧條件下生長，即2到8%之間的氧氣、特別是約4-5%的氧氣。然而，螺桿菌在完全厭氧條件下不生長。用于從樣品中分離螺桿菌的方法的一種具體實施方式包括以下步驟a)將樣品應(yīng)用于含一種固體和一種液體組分的培養(yǎng)體系，-其中至少所述固體組分緩沖在pH5.0至6.0之間，以及-其中所述固體組分包含至少10%血清或至少7.5%血液，以及-其中所述固體和液體組分包含用于苛求菌生長的營養(yǎng)素，以及-其中所述固體和/或液體組分包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)，所述方法進一步包括以下步驟b)將所述樣品在微氧條件下在這一體系中培育。使用上述用于螺桿菌分離和培養(yǎng)的方法，可以從胃的材料的樣品中獲得真正的螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的分離株。此外，本發(fā)明的方法使大批量體外培養(yǎng)成為可能。具體地說，可以獲得能夠傳代的、更優(yōu)選傳代至少一次、更優(yōu)選傳代至少兩次、或至少5到10次，并且/或能在培養(yǎng)物中(即體外)保持至少24小時、更優(yōu)選至少2天、最優(yōu)選至少10到25天的培養(yǎng)物。已經(jīng)證實，通過使用本發(fā)明的方法，涂布在10cm細(xì)菌平板上的約lmL胃粘液在3天內(nèi)產(chǎn)生約106到1(^細(xì)菌/mL之間的培養(yǎng)物。傳代時可以將培養(yǎng)物1到5倍稀釋。因此，即便使用小規(guī)模體系，也可以達到高產(chǎn)率。然而在大規(guī)模生產(chǎn)中，產(chǎn)率可以進一步提高。本發(fā)明的方法首次使得大量真實的螺桿菌分離株、尤其是暫定豬螺桿菌的產(chǎn)生成為可能。因為使用所分離的暫定豬螺桿菌或由此獲得的抗原制劑可以進行疫苗生產(chǎn)，這是重要的。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及將通過這里所描述的方法獲得的暫定豬螺桿菌用于可作為疫苗使用的抗原性制劑的生產(chǎn)。事實上，本發(fā)明首次使得基于純粹的暫定豬螺桿菌分離株的疫苗生產(chǎn)成為可能。本發(fā)明的上下文中所設(shè)計的暫定豬螺桿菌分離株的抗原制劑包括全細(xì)胞細(xì)菌制劑和暫定豬螺桿菌的組分的制劑。這樣的抗原制劑可以包含完全殺死的(滅活)細(xì)菌、活的減毒(弱化的)細(xì)菌或經(jīng)加工和/或人造細(xì)菌制劑或其組合。經(jīng)加工的細(xì)菌制劑包括部分或完全純化和/或預(yù)處理的細(xì)菌蛋白質(zhì)制劑。這些制劑可以單獨或與人造抗原制劑(例如部分或完全通過合成或重組方法獲得的蛋白制劑)組合使用。根據(jù)一種具體實施方式，本發(fā)明所提供的抗原制劑包括從暫定豬螺桿菌分離株獲得的一種或多種抗原。使用從分離株獲得的抗原制劑的優(yōu)點是純度，這降低了被其他生物或細(xì)菌的抗原性混合物污染的機會，當(dāng)注射于人體或其他動物時，這樣的污染會增加抗原性制劑產(chǎn)生有害副作用的風(fēng)險。根據(jù)一種具體實施方式，所述抗原制劑是暫定豬螺桿菌的一種細(xì)胞溶解物，即細(xì)菌細(xì)胞溶解獲得的混合物。細(xì)菌細(xì)胞溶解物的一個具體例子是超聲破碎的細(xì)菌培養(yǎng)物的可溶組分(例如過濾后所獲得的)。另外或此外，可以使用高壓勻質(zhì)機(例如Avestin的EmulsiFlexC5型號)破碎細(xì)菌?？蛇x地，通過各種已知方法之一，超聲破碎前或之后進一步滅活細(xì)胞溶解物，這些方法例如但不限于用福爾馬林、二乙烯亞胺(BEI)、P-丙內(nèi)酯(BPL)、戊二醛、放射線或熱處理。通常溶菌物中不是所有的蛋白質(zhì)會激發(fā)免疫應(yīng)答。另外，本發(fā)明所述的抗原制劑是通過對溶菌物或細(xì)菌培養(yǎng)基中的一種或多種蛋白質(zhì)進行分級和/或純化以獲得富集的或純化的抗原的組合物而獲得的。適用于本發(fā)明上下文中的分離或純化的細(xì)菌蛋白質(zhì)的例子是熱休克蛋白質(zhì)和/或脲酶蛋白質(zhì)、cagA和vacA。因此，本發(fā)明的另一個方面提供了含有如上所述從暫定豬螺桿菌中獲得的抗原制劑的疫苗。本發(fā)明含有暫定豬螺桿菌分離株的抗原制劑的疫苗可以用于對螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌引起的感染獲得預(yù)防性或治療性免疫。本發(fā)明的疫苗可選地僅含有本發(fā)明所述的抗原制劑。另外，除了本發(fā)明的抗原制劑，所述疫苗還可以包含適當(dāng)?shù)淖魟?。例如，本發(fā)明所述疫苗中的抗原制劑可以在脂質(zhì)體、優(yōu)選中性或陰離子脂質(zhì)體、微球體、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)或類病毒顆粒(VLP)中進行配方或與之配伍，以促進對蛋白質(zhì)或多肽的屏蔽保護或增強免疫應(yīng)答。精通本領(lǐng)域的人員可以毫無困難地獲得這些復(fù)合物；例如參見《脂質(zhì)體實踐方法》(Liposomes:APracticalApproach).RRC新編，IRL出版社(1990))。也可以使用不同于脂質(zhì)體的佐劑。大量佐劑對于精通本領(lǐng)域的人員而言是已知的。根據(jù)抗原制劑的類型和所使用的給藥途徑，佐劑的種類會有所不同。根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式，抗原制劑是一種與作為佐劑的霍亂毒素(CT)一同鼻內(nèi)給藥的或與作為佐劑的皂角苷一同皮下給藥的超聲破碎的抗原溶液。疫苗組合物中可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何佐劑，這包括諸如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑的油基佐劑、基于霉菌酸酯的佐劑(例如海藻糖二霉菌酸酯)、細(xì)菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即胞壁質(zhì)、黏肽或諸如N-Opaca的糖蛋白、胞壁酰二肽(MDP)或MDP類似物)、蛋白聚糖(例如從克雷伯氏肺炎菌(《/eZwW/a戶ewmom'fle)中提取的)、鏈球菌制劑(例如OK432)、BiostimTM(例如01K2)、EP109942、EP180564和EP231039中的免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、氫氧化鋁、皂角苷、DEAE-葡聚糖、中性油(如米格萊科(miglyol))、植物油(如花生油)、脂質(zhì)體、Pluronic⑧聚醇。佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(tǒng)(瑞比公司(RibiInc.))、明礬、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳劑、油包水乳劑(如完全和不完全弗氏佐劑)、嵌段共聚物(佐治亞州亞特蘭大的賽特萊公司(CytRx，AtlantaGA))、SAF-M(加州艾默維爾的希龍公司(Chiron，EmeryvilleCA))、AMPHIGEN⑧佐劑、皂角苷、QuilA、QS-21(馬薩諸塞州劍橋的劍橋生物科技公司(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA))、GPI-0100(阿拉巴馬州伯明翰的格林制藥公司(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL))或其他皂角苷分餾物、單磷酰脂質(zhì)A、阿夫立定脂質(zhì)-胺(Avridinelipid-amine)佐劑、大腸桿菌熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素(重組的或其他形式的)、霍亂毒素、或胞壁酰二肽及其他。根據(jù)一種具體實施方式，在注射動物之前，在抗原制劑中添加大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素的重組突變體。對于非腸道給藥，可以添加諸如氫氧化鋁、磷酸鋁和氫氧化磷酸鋁等具體成分。所述抗原制劑的一種或多種抗原可以按照常規(guī)方法吸附或沉積在一種鋁化合物上。可以用于非腸道給藥的其他佐劑包括例如聚膦腈(WO95/2415)、DC-chol(3-(3-[N-(N',N'-二甲氨基甲垸)氨甲?；?膽固醇)(](美國專利No.5,283,185和WO96/14831)、QS-21(WO88/9336)以及RIBI。本發(fā)明所述疫苗的成分可以按照常規(guī)生產(chǎn)。例如，本發(fā)明所述組合物中所包含的一種多肽、一種混合物或一種DNA分子與例如水或諸如磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)的一種鹽溶液的制藥上允許的稀釋劑或載體組合使用。通常，所述稀釋劑或載體在給藥模式和途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的制藥實踐的基礎(chǔ)上加以選擇。雷明頓制藥科學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)中描述了制藥上允許的稀釋劑和載體及其在藥物配方中使用所必需的所有內(nèi)容。本發(fā)明的疫苗可以是固體或液體形式的，例如藥片、膠囊、粉末、溶液、懸液或乳劑。固體單位劑量形式可以是常規(guī)類型的。固體形式可以是膠囊，例如包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽以及載體(例如潤滑劑和諸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉的惰性填充物)的普通明膠類型。在另一種實施方式中，通過諸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉的常規(guī)藥片基材與諸如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠的粘合劑、諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或褐藻酸的崩解劑以及如硬脂酸或硬脂酸鎂的潤滑劑的組合使用，將這些化合物制成片劑。通過將這些材料的溶液或懸液置于含有藥物載體的生理學(xué)上允許的稀釋劑中，本發(fā)明的疫苗也可以以注射劑量形式給藥。這樣的載體包括諸如添加了或沒有添加表面活性劑和其他制藥上允許的佐劑的水或油的無菌液體。例如，所述的油可以是石油、動物、植物或合成來源的油，諸如花生油、大豆油或礦物油。通常，水、鹽溶液、葡萄糖水溶液和相關(guān)的糖溶液、以及諸如丙二醇或聚乙二醇的二元醇是優(yōu)選的液體載體，尤其對于注射用溶液而言。對于作為氣霧劑使用，含有位于溶液或懸液中的抗原制劑的本發(fā)明的疫苗可以與適當(dāng)?shù)膲嚎s氣體(例如碳?xì)浠衔飰嚎s氣體，如含常規(guī)佐劑的丙烷、丁垸或異丁烷。)共同包裝在增壓氣霧劑容器中。本發(fā)明的材料也可以以非增壓形式(如霧化器或噴霧器中)給藥。含有暫定豬螺桿菌抗原制劑的疫苗可以用于自體疫苗接種或異源疫苗接種。在使用本發(fā)明的疫苗進行自體疫苗接種時，目的是對暫定豬螺桿菌引起的感染提供保護。在異源疫苗接種時，目的是通過注射含暫定豬螺桿菌的抗原性制劑，對一種或多種其他的螺桿菌引起的感染提供保護。因此，本發(fā)明進一步的一個方面提供了使用本發(fā)明的疫苗對人或其他動物進行疫苗接種的方法。使用本發(fā)明所述獲得自暫定豬螺桿菌的疫苗的接種方案的目標(biāo)包括在動物中獲得了針對螺桿菌、尤其是針對暫定豬螺桿菌的完全保護(滅菌免疫性)，但也包括與接種前相比，以及/或與沒有接受本發(fā)明的疫苗并遭受/已遭受相同感染性物質(zhì)感染的動物相比，將螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的細(xì)菌負(fù)荷降低至少25、40、60、80%。最具體地，本發(fā)明涉及在延長的時間段內(nèi)(例如至少4、6、10、12周或12周以上)確保保護作用或降低的細(xì)菌負(fù)荷的疫苗和接種策略。本發(fā)明疫苗的給藥可以是單次劑量的或在某一時間段后重復(fù)一次或幾次的劑量。合適的劑量隨各種參數(shù)而有所變化，正如精通本領(lǐng)域的人員能夠確定的，這些參數(shù)包括例如所治療的個體(成人或兒童)；疫苗抗原本身性質(zhì)；給藥模式和頻率；是否存在佐劑；以及如果存在佐劑，佐劑的類型和所需的效果(例如保護或治療)。例如，在使用含有滅活的完整"暫定豬螺桿菌"的抗原制劑的情況下，適當(dāng)?shù)膭┝堪ǖ幌抻?0pg、50嗎、100嗎、250pg、500嗎和lmg抗原制劑。另外，劑量可以用CFU表示，100嗎對應(yīng)約107CFU。粗抗原制劑(即含有微量培養(yǎng)基等)可能比部分純化或純化的制劑需要更高的劑量以產(chǎn)生效果。疫苗接種方法可以包括在將含本發(fā)明所述的暫定豬螺桿菌的疫苗給藥前或給藥后(口服)給予人或動物一種或多種組合物。這樣的組合物包括降低胃中酸產(chǎn)生的化合物(例如西咪替丁(Tagamet⑧，比利時加弗的葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline;Genval，Belgium)))?？梢杂枚喾N方法進行動物中感染和/或細(xì)菌負(fù)荷的鑒定和量化。傳統(tǒng)上這通過確定體液、尿液或糞便樣本中感染性物質(zhì)、或其一種蛋白質(zhì)或DNA序列的存在來進行。另外，可以檢測免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，例如存在針對感染性物質(zhì)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式，通過例如采用本領(lǐng)域中所述的PCR(Fox和Lee(1997)Lab.Anim.Sci.47,222-255)鑒定暫定豬螺桿菌DNA實現(xiàn)對螺桿菌的精確診斷和定量。另外，一種定量的脲酶檢測被用于暫定豬螺桿菌定量。簡而言之，將黏膜組織樣品(約0.5cm勺浸入lOOOiilCUTest溶液(德國馬爾堡的戴姆勒制藥公司(TemmlerPharma;Marburg，Germany))并37°C培育約3小時(如Corth6sy國Theulaz等，(1995)，Gastroenterology109，115-121所述)。離心后將上清液在550nm的光密度(OD)處進行分光光度定量。針對每個胃部區(qū)域計算用于區(qū)分是否感染的臨界點并等于平均值加上由未攻擊的對照動物的胃組織切片樣本獲得的吸光值的兩倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。大于這一臨界點的值作為暫定豬螺桿菌集落化生長的證據(jù)。如上所詳細(xì)描述的，設(shè)計了本發(fā)明所述疫苗在自體接種和異源接種方案中的應(yīng)用。根據(jù)一種實施方式，提供了用于治療和/或預(yù)防人和/或其他動物的由一種或多種不同螺桿菌(可選地包括暫定豬螺桿菌)引起的感染的方法。本發(fā)明的具體實施方式涉及使用得自暫定豬螺桿菌分離株的疫苗以獲得對其他螺桿菌(例如但不限于幽門螺桿菌(H^/o&)、H.bizzozeronii、貓螺桿菌(/Z./e/^)和H.salomonii)的預(yù)防性或治療性免疫性。其他適當(dāng)?shù)穆輻U菌有膽汁螺桿菌(H.bilis)、芬納兒螺桿菌(/Z./e"e〃/a^、帕美特螺桿菌(//.戸m"e"^)、獼猴螺桿菌(TZ."emeWn'wae)、獼猴螺桿菌(//."eweW〃'"ae)、帕美特螺桿菌CK;ametow&)、獵豹螺桿菌(//.ac/wo_yc/z/5)、幼禽螺桿菌(//.;^//owm)、鼬鼠螺桿菌(Hww他/"e)、肝螺桿菌(//./jep油'cw力、同性戀螺桿菌(//.c/wae&')和犬螺桿菌(//.根據(jù)一種具體實施方式，本發(fā)明提供了針對暫定豬螺桿菌感染的預(yù)防性和/或治療性保護的方法，所述方法包括給予得自暫定豬螺桿菌分離株的本發(fā)明所述的疫苗。更具體地說，提供了在預(yù)防性接種中使用的抗原制劑，它確保提供針對螺桿菌、尤其是針對暫定豬螺桿菌的保護，這種保護不是暫時性的。當(dāng)所述微生物已經(jīng)將宿主免疫應(yīng)答調(diào)整至對它們有利的方向的情況下，本發(fā)明的具體實施方式也提供了用于治療性免疫的方法。本發(fā)明的免疫方法包括通過任何適當(dāng)途徑給予疫苗的方法，例如通過黏膜(鼻內(nèi))、非腸道或肌內(nèi)給藥、口服、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮或皮下給藥。適當(dāng)?shù)慕臃N途徑也包括組合給藥(例如口服/肌內(nèi)給藥)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，通過本發(fā)明所述疫苗或抗原制劑的非腸道給藥進行治療性免疫。非腸道給藥可以調(diào)動還未在螺桿菌感染所引起的一個特定方向上啟動的全身來源的細(xì)胞(Guy等，(1999)Vaccine17，1130-1135)。根據(jù)本發(fā)明的另一種具體實施方式，肌內(nèi)給藥用于有效接種。通過但不限于以下詳細(xì)描述的實施例對本發(fā)明的不同方面進行舉例說明。實施例實施例l:暫定豬螺桿菌的體外分離和培養(yǎng)在這一實施例中，使用一種雙組分體系分離"暫定豬螺桿菌"，其中固體組分是布氏瓊脂平板。布氏瓊脂平板(比利時BD公司(Becton-Dickinson，Erembodegem，Belgium))中補充了Vitox補充物(英國奧氏公司(Oxoid，Basingstoke,UK))、Skirrow補充物(奧氏公司)、20yo胎牛血清(FCS;英國QB公司(QBPerbioTattenhall，UK))、0."/?；钚蕴縂R(AC;德國默克公司(Merck，Darmstadt,Germany))、0.00001%結(jié)晶紫(英國CT公司(Clin-TechLtd，Essex,UK))和0.001y。乳鏈菌肽(Nisin)(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma-Aldrich，St-Louis，Mo，USA))。高壓滅菌后但在瓊脂凝膠化之前，在500mL布氏瓊脂中加入0、0.2、0.5和0.7mLHCl溶液(最少37。/。；德國RH公司(Riedel-deHagn，Seelze，Germany)),這分別形成7.0、6.3、5.5和5.0的pH值。除非另有說明，含血清的布氏平板含20%血清。在這一實施例中，雙組分體系中的液體組分是沒有添加其他補充物、血清和沒有調(diào)節(jié)pH的布氏肉湯。第0天從屠宰場(比利時則勒的PMNV工廠(PorcMeatN.V.，Zele，Belgium))收集了5個豬胃(A到E)并在進一步使用前+4。C保存。將其在胃大彎處剖開并用自來水沖洗。胃的一半進行酸處理(在P/。的HC1浴中浸泡1小時)。隨后，通過用玻片刮胃僅收集表面粘液。所述粘液收集在無菌試管中。豬胃粘液的顯微鏡檢査顯示，所有胃為暫定豬螺桿菌陽性。用含有20。/。血清的布氏肉湯(體積約5mL以下)輕微液化所述粘液并接種在補充了血清的pH為5.0、5.5、6.3和7的4塊布氏瓊脂平板上。所述樣品接種在平板中間，并隨后在粘液樣品的中間滴加3滴布氏肉湯(約150pL)。每只豬的總共4塊平板在微氧空氣中37°C培育過夜。通過抽出80%正常空氣并導(dǎo)入8%C02、8%H2和84%N2的混合氣體建立所述微氧環(huán)境。第l天對5個胃樣品中的4個成功進行了運動的螺旋形細(xì)菌(說明存在螺桿菌)的初步分離。對于胃D，在第l天生長不充分。干燥的平板用含血清的布氏肉湯輕微濕潤。第2天對于所有的胃觀察到，其中瓊脂的pH為7和6.3的平板被其他細(xì)菌污染。對來自這些平板的肉湯進行過濾(使用0.65nm孔徑的濾器)并在相同pH的新的瓊脂平板上傳代。只有一些pH5.5或5.0的平板受污染，在這種情況下也對肉湯進行過濾并在新的平板上傳代。在沒有發(fā)現(xiàn)污染的情況下，將平板進一步培育。這是pH5.0的胃樣品D和E的情況。在0.65)im孔徑濾器的孔徑太小導(dǎo)致培養(yǎng)基堵塞濾器的情況下，使用0.80pm濾器進行過濾。這是pH7、6.3和5.5的胃樣品E的受污染平板的情況。第3天那些用在第2天經(jīng)過濾的培養(yǎng)基接種的平板，污染菌的生長大部分是陰性的。對來自胃E的最初沒有受污染、未過濾的PH5.0的平板進行了顯微鏡分析，并顯示出大量具有顯著運動性的暫定豬螺桿菌，估計其數(shù)量約為108或109/mL。所述肉湯培養(yǎng)基(約500pL)轉(zhuǎn)移至新的pH5的瓊脂培養(yǎng)基上。第4天胃E的最初pH5.0平板及其傳代平板長滿了污染物。使用0.65|im孔徑濾器將來自這些平板的肉湯轉(zhuǎn)移至新的瓊脂平板上。其他胃的許多平板也受到了污染并廢棄。來自胃A的兩個過濾-傳代平板細(xì)菌污染為陰性并進一步培育。來自胃B、C和E的一個過濾-傳代平板為陰性并進一步培育。來自胃D的pH5.0平板的污染細(xì)菌生長仍為陰性并進一步培育。第5天所有在第4天暫定豬螺桿菌陰性的過濾-傳代平板仍為螺桿菌陰性，并進一步培育。一些平板顯示出污染細(xì)菌。第7天來自胃D的pH5.0平板頂部的肉湯顯示出有活力的、運動的暫定豬螺桿菌，估計其數(shù)量為106/mL。沒有看到粘液受其他細(xì)菌污染。這一平板進一步培育第8天來自胃D的pH5.0的最初平板顯示出暫定豬螺桿菌菌體的進一步生長。將所述肉湯轉(zhuǎn)移至新的pH7的平板。在原始平板上添加500pL含血清的布氏肉湯。第ll天樣品D在第8天在pH7的平板上的傳代為螺桿菌生長陰性。pH5.0的原始平板仍然顯示出暫定豬螺桿菌的活力培養(yǎng)物(估計為10S細(xì)菌/mL)。將此肉湯轉(zhuǎn)移至pH5.0平板，并添加等量的含血清布氏肉湯。在原始平板上添加500pL含血清布氏肉湯。第13天第11天在pH5.0平板上的傳代成功獲得源自樣品D的分離株。肉湯含運動的螺桿菌(估計為10S細(xì)菌/mL)。將肉湯再次轉(zhuǎn)移至pH5.0平板，而首次傳代的平板用lmL含血清的布氏肉湯濕潤。樣品D的原始平板上的肉湯也含有活力培養(yǎng)物，將其中約200|liL在等量LYM(%BHI肉湯+3/4馬血清+7.5%(重量體積比)葡萄糖)中-70。C凍存。進一步培育前再次加入50(HiL含血清布氏肉湯。在第4天在pH5平板上過濾傳代的胃B和C的樣品顯示為暫定豬螺桿菌弱陽性。第14天將第13天冷凍的培養(yǎng)物D解凍并涂布于pH5的補給性布氏瓊脂平板，并在微氧空氣中培育。第15天樣品D的第二次傳代培養(yǎng)物為暫定豬螺桿菌陽性(估計10S細(xì)菌/mL)。將這一平板的肉湯(約500jiL)以及原始樣品DpH5.0平板的肉湯加入等體積的布氏肉湯、3體積的FCS和7.5。/。(重量體積比)葡萄糖中并-70。C冷凍。第一次傳代培養(yǎng)物含有更多的肉湯(約1mL)并在兩塊pH5的新鮮的瓊脂平板上傳代。添加等量的含血清的布氏肉湯。樣品B的過濾傳代培養(yǎng)物仍為螺桿菌弱陽性，而C的過濾傳代培養(yǎng)物含有約1()s細(xì)菌/mL。這些平板用含血清的布氏肉湯稍加濕潤。第17天樣品D的原始pH5.0平板再次為螺桿菌陽性，但其活動性較低。由于瓊脂培養(yǎng)基或許耗盡了，再次將肉湯轉(zhuǎn)移至新鮮的含培養(yǎng)基的瓊脂平板(pH5)并廢棄原始平板。樣品D的第二次傳代培養(yǎng)物是陽性的并將肉湯再次轉(zhuǎn)移至新的瓊脂平板，并且用補給性布氏肉湯再次濕潤平板并進一步培育。將B和C的過濾傳代平板的肉湯轉(zhuǎn)移至新的pH5的瓊脂平板。在原始平板上添加含血清的布氏肉湯。第19天從源自胃D(分離株HS1)、C(分離株HS2)和B(分離株HS3)的培養(yǎng)物中取樣。使用DNeasyTissuekit(恰根公司(Qiagen))試劑盒從細(xì)菌中抽提DNA。使用暫定豬螺桿菌特異性引物(DeGroote等，1999Bacteriology49，1769-1777;2000J.Clin.Microbiol.38，1131-1135)進行PCR。瓊脂糖凝膠電泳顯示，所有三種分離株具有433bp長的PCR片段。小鼠體內(nèi)傳代的暫定豬螺桿菌培養(yǎng)物的DNA用作陽性對照。在第14天用解凍的HSl材料接種的平板為暫定豬螺桿菌陽性。將肉湯轉(zhuǎn)移至兩塊新的平板(第二次傳代)。HSl的第二次傳代培養(yǎng)物與等量的1體積布氏肉湯、3體積FCS、7.5%(重量體積比)葡萄糖混合并-70。C冷凍。來自HSl的第三次傳代培養(yǎng)物的肉湯是陽性的并將其轉(zhuǎn)移至新的平板。第20天對于HS2和HS3，來自第二次傳代培養(yǎng)物的肉湯與等量的1體積布氏肉湯、3體積FCS、7.5。/。(重量體積比)葡萄糖混合并-70。C冷凍。第22天在用HS1的解凍材料接種的平板上，暫定豬螺桿菌沒有更進一步生長。然而，這一分離株第19天的傳代培養(yǎng)物顯示出更多的螺桿菌。來自原始培養(yǎng)物的第19天的第四次傳代培養(yǎng)物沒有顯示出具有很多細(xì)菌。源自C和D的培養(yǎng)物在第17天的第二次傳代培養(yǎng)物顯示具有許多暫定豬螺桿菌。樣品C(HS2)的肉湯轉(zhuǎn)移至兩塊新的平板，并加入等體積的補給性布氏肉湯。樣品B(HS3)的肉湯轉(zhuǎn)移至一塊新的平板，并加入等體積的補給性布氏肉湯。第25天對于HS1，第15天的第二次傳代培養(yǎng)物顯示出極少的暫定豬螺桿菌。所有肉湯轉(zhuǎn)移至新鮮瓊脂平板(pH5.0)并廢棄老的平板。第17天的第三次傳代培養(yǎng)物和第19天的第四次傳代培養(yǎng)物是陰性的，將其廢棄。在第14天用HS1的解凍材料接種的平板顯示出暫定豬螺桿菌培養(yǎng)物的生長，將此肉湯接種在兩塊新的含布氏肉湯(含血清的)的平板上。這一分離株在第19天的第二次傳代培養(yǎng)物也各自接種在兩塊新的平板上。對于HS2和HS3，第17天的第二次傳代培養(yǎng)物顯示出較低運動性的螺桿菌。平板顯示出透明區(qū)域，可能是耗盡了培養(yǎng)基。所有肉湯轉(zhuǎn)移至新的平板，并廢棄老的平板。第三次傳代培養(yǎng)物顯示出生長良好的培養(yǎng)物，將每種分離株的這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至兩塊新的平板。第27天及以后來自HS1第三次和第四次傳代培養(yǎng)物的肉湯在等體積的1體積布氏肉湯、3體積FCS和7.5%(重量體積比)葡萄糖中冷凍。第22天的第二次傳代培養(yǎng)物的肉湯接種在新的瓊脂平板上。對于HS2和HS3，將第三次和第四次傳代培養(yǎng)物接種在新的瓊脂平板上。將培養(yǎng)物每2或3天連續(xù)傳代，并將肉湯培養(yǎng)物如上所述定期冷凍。使用與保守端互補的引物擴增HS1、HS2和HS3分離株的16SrRNA。如先前所述(Baele等(2001)J.Appl.Microbiol.91，488-491)，使用共有引物ap-NOT(5'-tcaaactaggaccgagtc-3')[SEQIDNO:1]禾卩coMB(5'-taccttgttacttcacccca-3')[SEQIDNO:2]。按照Coenye等所述(Coenye等，(1999)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.49，405-413)，使用引物pD(5'-cagcagccgcggtaatac-3')[SEQIDNO:3]、(5,-ctcctacgggaggcagcagt-3')[SEQIDNO:4]、3(5'陽gttgcgctcgttgcgggact-3')[SEQIDNO:5]禾口O*(5'-aactcaaaggaattgacgg-3')[SEQIDNO:6]對這一PCR反應(yīng)中所擴增的1500bp擴增子進行測序。使用ABIPrism3100遺傳分析儀(比利時應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems，Le皿ik，Belgium))進行序列分析，并使用BLAST工具將序列與Genbank比對。該序列與GenBank中的暫定豬螺桿菌序列(AF127028)具有99%的相似性。在如上所述的實驗設(shè)置中，在含有較低pH值(5.0或5.5)的培養(yǎng)基的平板上，初步分離最為成功。在這些條件下，減少了污染細(xì)菌的生長。從胃E中分離暫定豬螺桿菌是成功的。在接種后第3天，在顯微鏡下看到了約108或109/mL的純培養(yǎng)物。在將肉湯轉(zhuǎn)移至新的瓊脂平板時，在粘液上生長的污染物與含螺桿菌的肉湯相混合是不可避免的。獲得了來自胃B、C和D的暫定豬螺桿菌純培養(yǎng)物。種特異性PCR擴增的16SrDNA片段證實了對種的鑒定。完整16SrDNA基因的測序顯示了與GenBank中暫定豬螺桿菌序列99%的相似性。對于源自樣品D的分離株HS1，培育7天后獲得了對暫定豬螺桿菌的純?nèi)鉁囵B(yǎng)物的初步分離。將肉湯轉(zhuǎn)移至含相同培養(yǎng)基的pH7的平板上導(dǎo)致不生長。傳代至pH5.0的平板是成功的。具有活力和運動性螺桿菌的肉湯分成等體積的兩份并轉(zhuǎn)移至兩塊新鮮的瓊脂平板上。補充等量的布氏肉湯(含20%FCS)導(dǎo)致細(xì)菌的良好生長?？梢詫憾ㄘi螺桿菌細(xì)胞在等量的1體積布氏肉湯、3體積FCS和7.5%(重量體積比)葡萄糖中于-70。C冷凍。將冷凍的小瓶解凍后，暫定豬螺桿菌成功地在相同培養(yǎng)基上再次生長。對于分別源自胃B和C的分離株HS2和HS3，pH5.0的培養(yǎng)基上的初始培養(yǎng)物受到了其他細(xì)菌的輕度污染。隨后將肉湯經(jīng)0.65pm孔徑濾器過濾并接種在新的pH5的瓊脂平板上。培育11天后，這些平板顯示為螺桿菌生長陽性。再培育4天后，肉湯包含了足以進行菌株傳代的螺桿菌。培育后5和3天分別獲得了第二次和第三次傳代培養(yǎng)物。實施例2:溫度和環(huán)境對暫定豬螺桿菌生長的影響在這一實驗及所有以后的實驗中，考察了對暫定豬螺桿菌分離株HS1、HS2和HS3的培養(yǎng)基和生長條件的最優(yōu)化。這些菌株的分離的詳情見實施例1。將分離株HS1和HS3各自接種在六塊如先前實施例中所述的布氏瓊脂平板(即含20。/。FCS并調(diào)節(jié)至pH5.0)上。用添加了Vitox補充物、兩性霉素B、20°/。FSC和每500mL肉湯0.7mLHC1(導(dǎo)致pH為5)的布氏肉湯覆蓋平板。將三塊平板在使用Campygen2.5L(奧氏公司)系統(tǒng)在廣口瓶中所建立的微氧環(huán)境中分別在37。C、25。C和42。C培育。其他三塊平板分別在37°C的有氧、無氧和補充了5%C02的空氣中培育。培育6天后，通過顯微鏡檢測考査上層肉湯中的細(xì)菌生長。在補充了5%(:02的環(huán)境和有氧空氣中沒有實現(xiàn)生長。在無氧環(huán)境中，只看到了很少的細(xì)菌。在微氧條件下，在37。C時觀察到良好的生長，而25。C或42。C時沒有生長。實施例3:活性炭和生長因子對暫定豬螺桿菌生長的影響在補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B和20%胎牛血清、pH調(diào)節(jié)為5.0的馬-欣二氏瓊脂平板上接種分離株HS1和HS3。向這些平板添加以下成分。一種平板(MH1)額外含Vitox補充物但不含活性炭。另一種平板(MH2)額外含活性炭但不含Vitox補充物，而第三種平板(MH3)含Vitox補充物和活性炭。在閉合回路中微氧條件下37°C培育3天和7天后，通過顯微鏡檢測考査上層肉湯的細(xì)菌生長，其中微氧條件是通過抽出80%正?？諝獠?dǎo)入8%(:02、8%H2和84%N2的混合氣體建立的。培養(yǎng)基MH1和MH3顯示出分離株HS1和HS3的良好生長。在MH2上，沒有觀察到任何一種分離株的生長。在使用馬-欣二氏培養(yǎng)基的情況下，Vitox生長補充物的省略阻礙細(xì)菌生長，而活性肽的存在與否沒有作用或作用很小。實施例4:其他營養(yǎng)素組合物對暫定豬螺桿菌生長的影響在本實驗中，馬-欣二氏瓊脂或布氏瓊脂被另一種稱為牛腦心浸液(BHI)瓊脂平板的用于苛求菌的培養(yǎng)基所替代。這些平板補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B和20。/。胎牛血清，并用濃鹽酸調(diào)至pH5。平板用補充了20%胎牛血清的BHI肉湯覆蓋。這些分離株HS1和HS2的平板在37°C的微氧環(huán)境中培育4天后，通過對上層肉湯的顯微鏡檢測證實了細(xì)菌生長。實施例5:平板中血清對暫定豬螺桿菌生長的影響在a)補充了Skirrow補充物、兩性霉素B、用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0的馬-欣二氏瓊脂平板和b)與a)中相同但額外包含了20%FCS和vitox培養(yǎng)物的平板上接種分離株HS1。用補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B、20%FCS、并用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0的馬-欣二氏肉湯覆蓋平板。在平板a)或b)上37°C微氧環(huán)境培育3天后，通過肉湯的顯微鏡檢測考察細(xì)菌生長。僅在瓊脂中不含血清的平板上觀察到菌球形式(a)。在含常規(guī)量20%FCS的平板上實現(xiàn)了HS1的良好生長(b)。隨后將分離株HSl接種在c)補充了Skirrow補充物、兩性霉素B、用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0的馬-欣二氏瓊脂平板上，并用補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B、40。/。FCS并用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0的馬-欣二氏肉湯覆至皿o在平板c)上37°C微氧環(huán)境培育4天后，通過肉湯的顯微鏡檢測考察細(xì)菌生長。再次只觀察到菌球形式。實施例6:血液對暫定豬螺桿菌生長的影響通過用10%綿羊血或10%馬血替代平板中的20%血清評估了代替血清的血液的應(yīng)用。平板的pH用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0。用馬-欣二氏肉湯覆蓋平板。在微氧環(huán)境中37°C培育4天后，通過對上層肉湯的顯微鏡檢測考察細(xì)菌生長。無論所使用的血液來源，實現(xiàn)了兩種分離株的非常良好的生長，這說明血液可以代替血清在培養(yǎng)基中添加。實施例7:血液濃度對暫定豬螺桿菌的影響在補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B和不同量馬血(2.5%、5%、7%、10%和15。/。(體積比))的馬-欣二氏瓊脂平板上接種分離株HSl。用濃鹽酸將平板pH調(diào)節(jié)為pH5.0。用不含其它補充物的馬-欣二氏肉湯覆蓋平板。在微氧環(huán)境中37°C培育3天后，通過肉湯的顯微鏡檢測考察細(xì)菌生長。在含2.5%、5%或7%馬血的平板上，只看到了菌球形式。在含10%或15%馬血的平板上觀察到了暫定豬螺桿菌的生長。隨后，通過接種lmL培養(yǎng)物并添加lmL新鮮肉湯，將含10%和15%血液的平板的肉湯在含有2.5至15%之間血液濃度、含相同培養(yǎng)基的新的瓊脂平板上亞培養(yǎng)。平板在相同條件下再培育3天。再次只在含10%或15%馬血的平板上觀察到了有活力的培養(yǎng)物。實施例8:pH對暫定豬螺桿菌生長的影響在補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B和20%FCS、并調(diào)節(jié)至不同pH值的馬-欣二氏瓊脂平板上接種分離株HS1。用補充了Vitox補充物、Skirrow補充物、兩性霉素B和20%FCS、用濃鹽酸調(diào)節(jié)至不同pH值的馬-欣二氏肉湯覆蓋平板。瓊脂和肉湯的具體pH組合見表l。在微氧環(huán)境中37°C培育3天后，通過對肉湯的顯微鏡檢測考察細(xì)菌生長。隨后，通過接種lmL培養(yǎng)物并添加lmL相同pH值的新鮮肉湯將肉湯在新的瓊脂平板上亞培養(yǎng)。培育2天后評估初始培養(yǎng)物和亞培養(yǎng)物。將第一次的亞培養(yǎng)物再次如上所述轉(zhuǎn)移至新的瓊脂平板。分別在培育4天和7天后考察細(xì)菌生長。在pH5.3和4.8的培養(yǎng)基上的第二次亞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮瓊脂平板上。pH4.75、4.5、4.4和4的培養(yǎng)基上的第一次的亞培養(yǎng)物也轉(zhuǎn)移至新鮮平板。分別在培育3天和7天后考察細(xì)菌生長。表l.在不同pH值的馬-欣二氏培養(yǎng)基上亞培養(yǎng)后豬螺桿菌分離株HS1的生長原代培養(yǎng)第一次亞培養(yǎng)第二次亞培養(yǎng)第三次亞培養(yǎng)PH瓊脂PH肉湯3天天2天4天8天4天7天3天7天5.07.0++++NDNDNDNDNDNDNDND6.86.8+++++NDNDNDND6.76,7++++++++/-NDND6.66.6+++++++++NDND6.f6.f+++++++NDND6.26.3+++++++++NDND6.1++++++++++++++++NDND5.3++++.++++++++++ND4.84.8+++++++++ND4.74.6+++++++++NDND++-++++4,74.4++++++++NDND+4.44.4++++++NDND++4.14.2++++++NDND+3.3.9+NDNDNDND3.6+NDNDNDNDND:未進行;+/-很少細(xì)菌;++++:生長非常好;-:沒有生長生長良好；++:生長中等；+:生長微弱;所使用的分離株(HS1)不能在pH低于4(pH3.5或3.7)的培養(yǎng)基上生長。在pH值介于4到7之間的培養(yǎng)基上獲得了原代培養(yǎng)物。在這些平板上的亞培養(yǎng)獲得了成功，然而，反復(fù)的亞培養(yǎng)僅在pH值介于4.7到6之間的培養(yǎng)基上獲得成功。暫定豬螺桿菌可以在pH4.5到6.0之間的培養(yǎng)基上生長，其最優(yōu)pH值為4.7和5.5?？偠灾?，暫定豬螺桿菌在37°C微氧條件中在雙組分體系上具有最佳生長。固體組分包含補充了胎牛血清或血液、生長補充物并調(diào)節(jié)至pH5.0的用于苛求微生物的培養(yǎng)基(諸如布氏瓊脂、腦心浸液瓊脂或馬-欣二氏瓊脂)。用液體組分覆蓋平板，所述液體組分是包括或不包括生長補充物、血清或pH調(diào)節(jié)的用于苛求微生物的生長培養(yǎng)基肉湯(諸如布氏肉湯、腦心浸液肉湯或馬-欣二氏肉湯)。實施例9:使用從暫定豬螺桿菌分離株獲得的暫定豬螺桿菌抗原對豬進行使用超聲破碎濾出液確定暫定豬螺桿菌疫苗的安全性和有效性。暫定豬螺桿菌抗原通過超聲破碎滅活并裂解，隨后進行無菌過濾并與水包油乳液佐劑配制。在所存在的總蛋白量的基礎(chǔ)上確定抗原劑量。研究設(shè)計通過對屠宰場的豬群的胃進行PCR和脲酶篩選，從優(yōu)選沒有暫定豬螺桿菌感染的豬群中選取母豬。隨后將這些母豬的小豬分成三組鹽水對照組、暫定豬螺桿菌疫苗組和第三組(NTX;未治療的并用正常食物喂養(yǎng))。本研究是完全隨機設(shè)計，并且每只動物作為實驗單位。斷奶后對母豬實施安樂死，并通過PCR對胃中是否存在豬螺桿菌進行分析。任何發(fā)現(xiàn)其胃中豬螺桿菌PCR陽性的母豬的小豬從研究中剔除。表2.研究設(shè)計治療疫苗方案接種年齡#攻擊T01鹽水IM1,3,5周5，6,7，8周T02豬螺桿菌IMU，5周5,6,7,8周NTX+NANANANA#頸部肌內(nèi)(IM)注射，左側(cè)(第l周)、右側(cè)(第3周)并隨后左側(cè)(第5周)交替進行c所有的豬在第14周齡時實施安樂死。+NTX=未治療的；在試驗過程中用正常食物喂養(yǎng)的對照。表3.抗原和研究用獸醫(yī)產(chǎn)品(IVP)制劑IVP*抗原劑量每劑量佐劑A每劑量體積鹽水(PBS)NA1mL2mL豬螺桿菌250pg前兩次劑量；500|ig第三次劑量1mL2mL*IVP=研究用獸醫(yī)產(chǎn)品A佐劑-終濃度5%的Amphigen將與抗原1:1混合。疫苗接種和攻擊首次接種前一天和解剖尸體時對每只豬稱重。在1、3和5周齡時通過頸部肌內(nèi)注射對豬進行疫苗接種。對照豬在同一時間用等體積的鹽水接種。疫苗接種1天前和兩天后并在接種后1小時內(nèi)觀察豬的臨床體征。首次接種日、第3次接種后兩周、以及尸體解剖前從每只豬收集血樣(在血清分離試管中收集約將血清置于至少兩個低溫劑量瓶中。將血清樣本-20。C冷凍用于隨后的暫定豬螺桿菌特異性抗體ELISA分析。為了進行豬螺桿菌攻擊，使用已經(jīng)檢測為豬螺桿菌陽性(通過脲酶測試)的胃樣品腔的上部細(xì)胞層刮取物和粘液的勻衆(zhòng)。為了證實用作攻擊材料的豬胃勻漿的生命力和劑量，用試樣量的每種攻擊材料對未受豬螺桿菌感染的5周齡雄性SPFBALB/c小鼠給藥。兩周后殺死小鼠并通過脲酶和PCR對胃內(nèi)容物中是否存在豬螺桿菌進行篩選。攻擊后方法和評分為了確定感染，切開腸道并對食管部的黏膜表面進行顯微鏡檢測。使用Hessing等人(1992，TijdschriftvoorDiergeneeskunde117，445-450)的方法對損傷進行5分制評分。簡而言之，評分記錄如下0=完整黏膜；1=輕微的過度角化(<50%表面積)；2=嚴(yán)重的過度角化(^50%表面積)；3=過度角化及一些小的侵蝕(小于5處并短于2.5cm);4=過度角化和廣泛的侵蝕(大于5處侵蝕并/或長于2.5cm);5=過度角化和很大的侵蝕(大于10處侵蝕或長于5cm)以及/或潰瘍。也使用0-100mm的直觀類比標(biāo)度對每個胃進行評分，其中0=無損傷，100=穿孔性潰瘍。評分后，通過PCR、定量脲酶測試和組織學(xué)對每個胃的腺狀黏膜的幾個位點(約0.5cm、進行取樣分析。用于暫定豬螺桿菌特異性檢測的PCR如DeGroote等(2000，見上文)所述進行。通過這里所述的定量脲酶測試檢測細(xì)菌負(fù)荷。對于組織病理檢查，將胃黏膜組織在10%磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定、按常規(guī)方法處理、并在石蠟中包埋。如DeGroote等(2000)所述，將一個5pm的切片用多克隆羊抗豬螺桿菌抗體(丹麥DC公司(Dakocytomation，DenmarkA7S:Glostrup，Denmark))進行免疫組織化學(xué)染色。第二個切片用HE染色用于胃炎評分。針對以下四個方面進行評分1)淋巴細(xì)胞擴散一對于固有黏膜中淋巴細(xì)胞擴散滲透的評分；2)在固有黏膜中形成淋巴濾泡；3)在表層上皮細(xì)胞下形成淋巴濾包；4)在固有黏膜中漿細(xì)胞的擴散滲透的組織病理改變。表層上皮細(xì)胞下淋巴濾泡的存在和漿細(xì)胞的滲透是非常顯著和具有特征性的損傷。根據(jù)嚴(yán)重性用0-3的記分對它們進行評分。1=輕微的，2=中度的，3=嚴(yán)重的。也使用直觀類比標(biāo)度(O-1OOmm)對其評分。結(jié)果接種的豬的胃組織的每個腔、胃底或賁門的平均脲酶值顯著(PO.10)低于未接種的豬的對應(yīng)值。相對于經(jīng)接種-攻擊的豬，未經(jīng)接種-攻擊的豬的暫定豬螺桿菌PCR陽性的胃的百分比顯著(PO.10)較高。根據(jù)PCR和脲酶所測定的結(jié)果，NTX豬的胃是陰性的。次級變量是組織學(xué)(淋巴細(xì)胞深入和表層濾泡形成以及漿細(xì)胞數(shù)量)和總的胃潰瘍評定分。預(yù)計在未免疫接種的攻擊的豬中的暫定豬螺桿菌的平均損傷評分會顯著大于免疫接種的攻擊的豬(P《0.10)。實施例10:體外培養(yǎng)的豬螺桿菌的超聲破碎濾出液抗原的免疫原性在實驗開始前2-3周，將3周齡的雄性SPFBALB/c小鼠(無螺桿菌屬)在高壓滅菌的具有頂部過濾器的籠子里圈養(yǎng)(每籠5只動物)，隨意用商品化飼料喂養(yǎng)并提供水。分組時，將小鼠在單獨的籠子里圈養(yǎng)。使用這里實施例1中所述的方法分離和培養(yǎng)暫定豬螺桿菌培養(yǎng)物。通過超聲破碎細(xì)菌懸液并經(jīng)0.22pm孔徑濾器過濾制備抗原。通過Lowry法確定蛋白質(zhì)濃度。豬螺桿菌制劑濃度為1.838mg/mL。對于每種疫苗劑量，使用了IOO嗎蛋白質(zhì)。對于抗原的鼻內(nèi)(IN)給藥，每劑量添加5嗎霍亂毒素(西格瑪(Sigma))。從屠宰場收集豬胃并勻槳。這些胃勻漿用于感染BALB/c小鼠以體內(nèi)繁殖豬螺桿菌。使用在LYM(5mLLYM/胃)中勻漿的完整的脲酶陽性小鼠胃每兩周在小鼠內(nèi)進行傳代(這一實施例中所使用的LYM包含2體積馬血清、1體積腦心浸液肉湯和10%葡萄糖)。PCR證實了每種傳代培養(yǎng)物中存在豬螺桿菌。在10只BALB/c小鼠中進行第4次小鼠傳代。將這10只小鼠的脲酶陽性胃集中起來并勻漿。勻漿-70。C冷凍。冷凍存儲物解凍后測定冷凍存儲物的滴度。37。C解凍后15分鐘，在LYM中進行勻漿的連續(xù)稀釋并在小鼠中灌胃接種以測定100%小鼠感染劑量水平。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>T10NVNCNA5DO,D21，D42D70D88-D91D119-120IVP=研究用獸醫(yī)產(chǎn)品SF=超聲破碎濾出液制劑SC=皮下注射；IN=鼻內(nèi)給藥NVNC=未經(jīng)疫苗接種的、未攻擊的小鼠；NA=不適用小鼠胃中的脲酶活性是螺桿菌集落化生長的指標(biāo)并通過Corth6sy-Theulaz等(1995，前文中引用)的方法進行了評價。胃的一半浸入500pLCUTest(戴姆勒制藥公司)中并37°C培育3小時。離心(5分鐘，100xg)后將上清液用于OD550nm處的分光光度定量。每個實驗中計算了臨界點的值并等于平均值加上用未免疫的、未攻擊的小鼠的胃樣品所獲得的吸光值的5倍標(biāo)準(zhǔn)差。用DneasyTissuekit(德國希爾頓的恰根公司(Qiagen，Hilden，Germany))試劑盒抽提了黏膜組織樣品的DNA。如上所述進行用于豬螺桿菌特異性檢測的PCR(DeGroote等，2000，前文中引用)。將疫苗接種小鼠的每個胃組織的平均脲酶值與未經(jīng)疫苗接種的小鼠的值比較。比較了未經(jīng)疫苗接種/攻擊的小鼠與疫苗接種-攻擊的對照之間豬螺桿菌PCR陽性胃的百分比。未攻擊的小鼠的胃是PCR和脲酶陰性的。尸檢時取血樣用于血清學(xué)分析。T01組小鼠的排泄物樣品在D(天)88-D91都是陽性的。T10小鼠的排泄物在D88-D91都是陰性的。表5中總結(jié)了脲酶和PCR測試結(jié)果。表5.用體外培養(yǎng)的豬螺桿菌抗原疫苗接種并用豬螺桿菌攻擊的小鼠的脲酶測試和PCR測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>以上結(jié)果顯示，鼻內(nèi)和皮下免疫在所有疫苗接種的動物中引起了平均脲酶活性值的降低。鼻內(nèi)免疫接種的動物中的脲酶活性水平更低。胃樣品的PCR測試顯示了在鼻內(nèi)免疫接種的動物中豬螺桿菌DNA的部分清除。小鼠的皮下免疫沒有表現(xiàn)出豬螺桿菌PCR檢測量的降低。通過使用體外生長的豬螺桿菌實現(xiàn)了所制備的權(quán)利要求1.一種用于從樣品中分離螺桿菌的方法，所述方法包括在一種培養(yǎng)體系中培養(yǎng)所述樣品的步驟，所述體系包括一種補充了至少10％血清或至少7.5％血液的具有5.0和6.0之間pH的培養(yǎng)基。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述用于苛求菌生長的營養(yǎng)素選自布氏、馬-欣二氏或腦心浸液營養(yǎng)素。4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有12.5%和25%之間的血清。7.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有7.5%和15%之間的血液。8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基進一步包含從維生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、對氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(輔酶1)、輔羧酶、硝酸鐵、硫胺和鹽酸半胱氨酸中選擇的一種或多種生長因子。9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)體系包含一種固體和一種液體組分，并且其中至少所述固體組分包含所述培養(yǎng)基。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述固體和液體組分都包含用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述用于苛求菌生長的營養(yǎng)素選自布氏、馬-欣二氏或腦心浸液營養(yǎng)素。12.如權(quán)利要求9-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述固體和/或液體組分包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。14.如權(quán)利要求9-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述固體組分包含12.5%和25%之間的血清。15.如權(quán)利要求9-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述固體組分包含7.5%和15%之間的血液。16.如權(quán)利要求9-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述固體和/或液體組分進一步包含從維生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、對氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(輔酶1)、輔羧酶、硝酸鐵、硫胺和鹽酸半胱氨酸中選擇的一種或多種生長因子。17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，所述螺桿菌是"暫定豬螺桿菌，，(CawM加Helicobactersuis)。18.—種"暫定豬螺桿菌"分離株，其特征在于，所述分離株可通過權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法獲得。19.一種用于培養(yǎng)螺桿菌分離株的方法，所述方法包括將所述分離株應(yīng)用于一種培養(yǎng)體系并在其中培育分離株的步驟，所述體系包含一種補充了至少10%血清或至少7.5%血液的具有4.0和7.0之間的pH的培養(yǎng)基。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)體系包含一種固體和一種液體組分，并且其中至少所述固體組分包含所述培養(yǎng)基。21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述固體和液體組分都包含用于苛求菌生長的營養(yǎng)素。22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的方法，其特征在于，至少所述固體組分緩沖在pH4.7和7.0之間。23.—種包含用于分離和/或培養(yǎng)螺桿菌的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器，所述固體培養(yǎng)基含有濃度在7.5和15%之間的血液或濃度在12.5和25%之間的血清，其中所述固體培養(yǎng)基的pH在5.0和6.0之間。24.如權(quán)利要求23所述的培養(yǎng)容器，其特征在于，進一步包含用于苛求生物體生長的營養(yǎng)素。25.如權(quán)利要求23或24所述的培養(yǎng)容器，其特征在于，進一步包含至少一種抑制不同于所培養(yǎng)的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質(zhì)。26.如權(quán)利要求25所述的培養(yǎng)容器，其特征在于，所述至少一種選擇性物質(zhì)選自下組萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結(jié)晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。27.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)容器，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基包含瓊脂。28.—種包含"暫定豬螺桿菌"分離株的抗原制劑的疫苗。29.—種用于生產(chǎn)"暫定豬螺桿菌"抗原制劑的方法，所述方法包括按照權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法分離"暫定豬螺桿菌"以及從所獲得的"暫定豬螺桿菌"分離株生產(chǎn)抗原制劑。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，進一步包括按照權(quán)利要求19-22中任一項所述的方法對所述分離的"暫定豬螺桿菌"進行培養(yǎng)。31.—種針對"暫定豬螺桿菌"感染對動物進行疫苗接種的方法，所述方法包括將包含以下一種或多種成分的疫苗對所述動物給藥-來自"暫定豬螺桿菌"分離株的一種或多種抗原制劑，-"暫定豬螺桿菌"分離株的活的減毒的"暫定豬螺桿菌"，和/或-"暫定豬螺桿菌"分離株的完全滅活的"暫定豬螺桿菌"。全文摘要本發(fā)明涉及用于分離和培養(yǎng)“暫定豬螺桿菌”的培養(yǎng)基和方法以及通過這些方法獲得的“暫定豬螺桿菌”分離株。本發(fā)明進一步涉及將這些細(xì)菌用于抗原制劑和疫苗的生產(chǎn)。文檔編號A61K39/106GK101558150SQ200780041991公開日2009年10月14日申請日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日發(fā)明者F·黑斯布魯克,M·巴埃萊申請人:根特大學(xué)