專利名稱：：具有可釋放的鍵合的ix因子部分-聚合物軛合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般涉及具有可釋放的鍵合(releasablelinkage)以由此在體內(nèi)釋放活性劑的聚合物-活性劑軛合物。此外，除了其他事項之外，本發(fā)明涉及用于合成所述軛合物的方法、用于純化所述軛合物的方法等。
背景技術：
：科學家和臨床醫(yī)師在嘗試將活性劑開發(fā)成適于遞送至患者的形式中面臨著許多挑戰(zhàn)。例如，為多肽的活性劑通常是經(jīng)由注射、而不是口服遞送的。這樣，多肽在不暴露于胃的蛋白水解環(huán)境(proteolyticenvironment)的情況下被引入到體循環(huán)中。然而，多肽的注射具有若干缺點。例如，很多多肽具有相對短的半衰期，因此需要重復注射，這通常是不便的且痛苦的。而且，某些多肽可誘導一種或多種免疫應答，其結果為患者的免疫系統(tǒng)試圖破壞或以其他方式中和免疫原性多肽。當然，一旦多肽被破壞或以其他方式被中和，則該多肽不能發(fā)揮其預期的藥效活性。因此，諸如多肽的活性劑的遞送通常是有問題的，即使是在這些劑通過注射施用時。在解決經(jīng)由注射遞送活性劑的問題中已經(jīng)獲得一些成功。例如，將活性劑與水溶性聚合物軛合已得到具有減少的免疫原性和抗原性的聚合物-活性劑軛合物。此外，由于通過腎的清除減少和/或體循環(huán)中的酶促降解減少，這些聚合物-活性劑軛合物與它們未軛合的對應物相比，通常具有顯著增加的半衰期。由于具有更長的半衰期，所以聚合物-活性劑軛合物需要更少頻率的給藥，這進而減少了疼痛注射和不便探訪健康護理專業(yè)人員的總次數(shù)。而且，僅僅勉強可溶的活性劑證明了當與水溶性聚合物軛合時，水溶性顯著增加。服應用，聚乙二醇已經(jīng)與活性劑軛合。、當活性劑與聚乙二i^"PEG"的聚合物軛合時，軛合的活性劑照慣例稱為"PEG化的"。PEG化的活性劑如PEGASYS⑧PEG化干擾素a-2a(Hoffmann-LaRoche,Nutley,NJ)、PEG-INTRONPEG化千擾素oc-2b(ScheringCorp.，Kennilworth，NJ)和NEULASTAPEG-非格司亭(AmgenInc.,ThousandOaks,CA)具有顯著的優(yōu)勢。小分子如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)S/oco/u'^.C力e邁.4(4):296-299)和氟尿嘧咬(Ouchi等人(1992)Zryg"es.""cor.2(l):93-105)也已被PEG化。Harris等人已提供了PEG化對藥物的作用的綜述。Harris等人(2003)"rz^""cor.2(3):214-221。盡管有了這些成功，但是聚合物與活性劑軛合以得到商業(yè)上相關的藥物通常具有挑戰(zhàn)性。例如，軛合可使得聚合物在對于藥理活性所必需的活性劑上的位點或此位點附近(例如在結合位點或在結合位點附近)被連接。由于，例如，聚合物所引入的立體效應，因此這些軛合物可能具有不能接受的低活性。當活性劑幾乎沒有或沒有其他適于與聚合物連接的位點時，嘗試補救具有不能接受的低活性的軛合物可能會失敗。因此，已期望其他PEG化替代物。一種用于解決這種問題或其他問題的所提議的方法為"可逆的PEG化"，其中天然活性劑(或與PEG化的活性劑相比具有增加的活性的部分)被釋放。例如，可逆的PEG化已在癌癥化學療法的領域中公開了。參見Greenwald(1997)i>/7.^/".7力er.a2(6):601-609。美國專利申請公布第2005/0079155號描述了使用可逆的鍵合的軛合物。如在此公布中所描述的，可逆的鍵合可通過使用酶底物部分來實現(xiàn)。然而，已經(jīng)指出，依賴于酶促活性的方法取決于酶的有效性。參見Peleg-Schulman(2004)/.#ecT.C力e頂.47:4897-4904。以這些酶的量和活性為基礎的患者差異性可在不同的群體中引入不一致的軛合物的性能。因此，已經(jīng)將不依賴用于降解的酶法的其他方法描述成是期望的。另一種用于可逆的PEG化的方法在美國專利第7,060,259號中描述，其描述了(除了其他事項之外)水溶性前藥，在水溶性前藥中生物活性劑通過可水解的氨基甲酸酯鍵連接到水溶性非免疫原性聚合物。如在其中所述，可通過不需添加酶或催化材料的氨基曱酸酯鍵的體內(nèi)水解，容易地釋放生物活性劑。另一種用于可逆的PEG化的方法在Peleg-Schulman(2004)/.￥ed.47:4897-4904、WO2004/089280和美國專利申請公布第2006/0171920號中描述。盡管這種方法已應用于有限數(shù)量的活性劑，但是這些參考文獻忽視了可逆的PEG化將特別適用的其他活性劑。還有另一種可釋放的方法在美國專利申請公布第2006/0293499號中描述。在出血性病癥的領域中，蛋白質(zhì)(諸如，例如IX因子)有時可被施用至患者以解決(address)或者以其他方式改善出血性病癥。由于IX因子和相關蛋白質(zhì)的半衰期相對短，所以通過例如可逆的PEG化來增加這些蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期將是有利的。因此，本發(fā)明試圖解決本領域中的此需要及其他需要。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個或多個實施方案中，提供了下式的軛合物法CIP口法,R1Y2I,IIC——Y1—C~NH-(F9)R2其中P0IT為第一水溶性聚合物；POI^為第二水溶性聚合物；X'為第一間隔基部分；X2為第二間隔基部分；H。為可電離的氫原子；W為H或有機基；112為H或有機基；(a)為0或1;(b)為0或1;R"當存在時，為第一電子改變基團(electronalteringgroup);R"當存在時，為第二電子改變基團；且yi為o或s;y2為o或s;且F9為含胺的IX因子部分的殘基。在本發(fā)明的一個或多個實施方案中，提供了用于制備軛合物的方在本發(fā)明的一個或多個實施方案中，提供了包括軛合物的藥物制在本發(fā)明的一個或多個實施方案中，提供了用于施用軛合物的方附圖簡述ii圖1為本發(fā)明軛合物的時間-濃度曲線。關于此圖的其他信息在實施例3中提供。圖2提供了本發(fā)明軛合物的凝血活性。關于此圖的其他信息在實施例4中提供。發(fā)明詳述在詳細描述本發(fā)明之前，應理解的是，本發(fā)明不限于具體的聚合物、合成纟支術、活性劑及類似事項，因為這些可以變化。必須注意的是，如在本說明書和權利要求書中所使用的，單數(shù)形式"一(a)"、"一(an)"和"該(the)"包括復數(shù)對象，除非上下文中另有明確規(guī)定。因此，例如，對"聚合物"的提及包括單個聚合物以及兩種或多種相同或不同的聚合物，對"軛合物"的提及是指單個輒合物以及兩種或多種相同或不同的輒合物，對"賦形劑"的提及包括單個賦形劑以及兩種或更多種相同或不同的賦形劑，以及類似情況。在描述本發(fā)明和要求本發(fā)明的權利時，將根據(jù)下述的定義使用下列術語。如本文所用的"PEG"、"聚乙二醇"和"聚(乙二醇)"意指涵蓋任何水溶性聚氧化乙烯。通常地，根據(jù)本發(fā)明使用的PEG包括下列結構"-0(CH2CH20)ra-，，，其中(m)為2至4000。如本文所用的，PEG還包括"-CH2CH2-0(CH2CH20)m-CH2CH2-，，和"-(CH2CH20)m-，，,取決于末端氧是否已被取代。當PEG進一步包括間隔基部分(將在下文更詳細地描述)時，包括間隔基部分的原子在共價連接到水溶性聚合物片段時，不會導致氧-氧鍵的生成(即"-0-0-"或過氧化物鍵合)。在整個說明書和權利要求書中，應記住的是，術語"PEG"包括含有各種端基或"封端"基團等的結構。術語"PEG"還表示包含大多數(shù)、也就是說超過50%的-CH2CH20-單體亞單元的聚合物。對于特定形式，PEG可采用許多分子量中的任何數(shù)量，以及采用各結構或幾何形狀如"支鏈的"、"直鏈的，，、"叉狀的"、"多官能的"及類似結構或幾何形狀，這將在下文更詳細地描述。術語"封端的"或"封末端的(terminallycapped)"在本文可互換地用于意指具有封端部分的聚合物的末端或端點。盡管不是必需地，通常封端部分包括羥基或Cw。烷氧基。因此，封端部分的實例包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和千氧基)以及芳基、雜芳基、環(huán)(cyclo)、雜環(huán)及類似基團。此外，設想前述每一個的飽和的、不飽和的、取代的和未取代的形式。而且，封端基團還可以是硅垸。封端基團還可有利地包括可檢測的標記。當聚合物具有包括可檢測標記的封端基團時，聚合物和/或與所述聚合物偶聯(lián)的感興趣部分(例如活性劑)的量或位置可通過使用適當?shù)臋z測器來確定。這些標記包括但不限于熒光劑、化學發(fā)光劑(chemiluminescer)、用于酶標記的部分、比色劑(coloriiiietric)(例如染料)、金屬離子、方丈射性部分及類似標記。適合的檢測器包括光度計、膜、分光計及類似檢測器。關于聚合物或水溶性聚合物的"非天然存在的"表示其整體未在自然界中發(fā)現(xiàn)的聚合物。然而，非天然存在的聚合物或水溶性聚合物可包含天然存在的一個或多個亞單元或亞單元的部分，只要總體聚合物結構未在自然界中發(fā)現(xiàn)。術語"水溶性聚合物，，為在室溫可溶于水的任何聚合物。通常地，水溶性聚合物將透射過濾后由相同溶液透射的光的至少約75%，更優(yōu)選至少約95%。在重量基礎上，水溶性聚合物將優(yōu)選為至少約35%(按重量計)溶于水，更優(yōu)選至少約50%(按重量計)溶于水，還更優(yōu)選約70%(按重量計)溶于水，以及還更優(yōu)選約85%(按重量計)溶于水。然而，還更優(yōu)選水溶性聚合物為約95%(按重量計)溶于水，且最優(yōu)選水溶性聚合物完全溶于水。在本發(fā)明水溶性聚合物如PEG的情況下，分子量可表示為數(shù)均分子量或重均分子量。除非另有說明，本文中對分子量的所有提及是指重均分子量。兩種分子量(數(shù)均和重均分子量)測定可使用凝膠滲透色譜法或其他液相色譜技術來測量。還可使用其他用于測量分子量值的方法，諸如使用端基分析或測量依數(shù)性(例如，水點降低、沸點上升或滲透壓)以測定數(shù)均分子量或使用光散射技術、超速離心或粘度測量法以測定重均分子量。本發(fā)明聚合物通常為多分散的(即聚合物的數(shù)均分子量和重均分子量不相等)，具有優(yōu)選小于約1.2、更優(yōu)選小于約1.15、還更優(yōu)選小于約1.10、甚至還更優(yōu)選小于約1.05、且最優(yōu)選小于約1.03的低的多分散性值。如本文所用，術語"羧酸"為具有-Jl-oH官能團[也表示為"-COOH"或-C(O)OH]的部分以及為羧酸衍生物的部分，這些衍生物包括例如被保護的羧酸。因此，除非上下文中另有明確規(guī)定，術語羧酸不僅包括酸式，而且還包括相應的酯和被保護的形式。關于適于羧酸和本文所述的任何其他官能團的保護基，請參考Greene等人，"PROTECTIVEGROUPSINORGANICSYNTHESIS(有機合成中的保護基)"第3版，JohnWileyandSons,Inc.，NewYork,1999。術語"反應性的"和"活化的"當與具體官能團結合使用時，是指容易與另一個分子上的親電體或親核體反應的反應性官能團。這與為了反應需要強催化劑或高度不切實際的反應條件的那些基團(即"非反應性的，，或"惰性的"基團)形成對比。術語"受保護的"、"保護基(protectinggroup)"和"保護基(protectivegroup)"是指存在預防或阻斷在某些反應條件下的分子中特定的化學反應性官能團的反應的部分(即保護基)。保護基將根據(jù)受保護的化學反應性官能團的類型以及將使用的反應條件和分子中另外的反應基或保護基(如果有的話)的存在而變化。本領域已知的保護基可在Greene等人(同上)中發(fā)現(xiàn)。如本文所用，術語"官能團"或其任何同義詞意指涵蓋其受保護的形式。術語"間隔基"或"間隔基部分"在本文用于意指在一個部分與另一個部分之間任選出現(xiàn)的原子或原子的集合。間隔基部分可以是水解穩(wěn)定的或可包括一個或多個生理上可水解的或酶促可釋放的鍵合(enz拜ticallyreleasablelinkage)。如本文所用的"有機基"包括，例如，烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。"烷基"是指烴鏈，通常長度范圍為約1至20個原子。這些經(jīng)鏈優(yōu)選但并不必需為飽和的且可為支鏈或直鏈，盡管通常優(yōu)選直鏈。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、l-甲基丁基、l-乙基丙基、3-甲基戊基及類似烷基。如本文所用，"烷基"包括"環(huán)烷基"(當涉及三個或更多個碳原子時)和低級烷基。"低級烷基"是指含有1至6個碳原子的烷基，并且可為直鏈或支鏈，如曱基、乙基、正丁基、異丁基和叔丁基所例示的。"環(huán)烷基"是指飽和的或不飽和的環(huán)狀烴鏈，包括橋環(huán)、稠環(huán)或螺環(huán)化合物，優(yōu)選由3至約12個碳原子、更優(yōu)選3至約8個碳原子組成。"無干擾取代基(non-interferingsubsUtuent)"為當其存在于分子中時，通常與包含于分子中的其他官能團是非反應性的那些基團。在例如"取代的烷基"中的術語"取代的"是指用一個或多個無千擾取代基取代一個或多個氫原子的部分(例如烷基)，所述無干擾取代基諸如但不限于C「G環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基及類似環(huán)烷基；卣素，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基，低級苯基；取代的苯基；及類似基團。"取代的芳基"為具有作為取代基的一個或多個無干擾基團的芳基。對于苯環(huán)上的取代，取代基可處于任何方向(即鄰位、間位或?qū)ξ?。"取代的銨，，為具有作為取代基的一個或多個無干擾基團(例如有機基)的銨。"烷氧基"是指-O-R基團，其中R為烷基或取代的烷基，優(yōu)選C「C2。烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、芐基等)，更優(yōu)選d-C7烷基。如本文所用，"烯基"是指長度為2至15個原子、含有至少一個雙鍵的支鏈或無支鏈的烴基。示例性的烯基包括(不限于)乙烯基、正丙烯基、異丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基及類似烯基。如本文所用的術語"炔基"是指長度為2至15個原子、含有至少一個三鍵的支鏈或無支鏈的烴基。示例性的炔基包括(不限于)乙炔基、15正丁炔基、異戊炔基、辛炔基、癸炔基等等。"芳基"表示一個或多個芳族環(huán)，每個芳族環(huán)為5個或6個核碳原子。芳基包括多個芳環(huán)，其可為稠合的例如在萘基中，或可為非稠合的例如在聯(lián)苯基中。芳環(huán)還可與一個或多個環(huán)狀烴、雜芳基或雜環(huán)稠合或非稠合。如本文所用，"芳基"包括雜芳基。含芳族的部分(例如Ar1、Af2等等)表示含芳基的結構。"雜芳基"為含有1至4個雜原子(優(yōu)選N、0或S或其組合)的芳基。雜芳環(huán)還可與一個或多個環(huán)狀烴、雜環(huán)、芳基或雜芳環(huán)稠合。"雜環(huán)"或"雜環(huán)的"表示5-12個原子、優(yōu)選5-7個原子的一個或多個環(huán)，其具有或不具有不飽和性質(zhì)或芳香性并且具有至少一個不是碳的環(huán)原子。優(yōu)選的雜原子包括硫、氧和氮。"取代的雜芳基"為具有作為取代基的一個或多個無干擾基團的雜芳基。"取代的雜環(huán)"為具有由無千擾取代基形成的一個或多個側鏈的雜環(huán)。"親電體"是指離子或原子或原子的集合，其可以為離子型的(ionic)，具有親電子中心，即尋找電子的、能與親核體反應的中心。"親核體"是指離子或原子或原子的集合，其可以為離子型的，具有親核中心，即尋找親電子中心或與親電體反應的中心。"生理上可裂解的，，以及"可水解的"鍵為相對弱的鍵，其在生理條件下與水反應(即水解)。鍵在水中水解的趨勢將不僅取決于連接兩個中心原子的鍵合的一般類型，而且取決于與這些中心原子連接的取代基。示例性的可水解的鍵包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、縮醛、縮酮、酰氧基烷基醚、亞胺和原酸酯。"可釋放的鍵合"包括但不限于生理上可裂解的鍵、可水解的鍵和酶促可降解的鍵合。因此，"可釋放的鍵合"為可在生理條件下經(jīng)受水解或經(jīng)由某些其他機理(例如酶催化機理、酸催化機理、堿催化機理等等)裂解的鍵合。例如，"可釋放的鍵合"可涉及具有堿性移去(baseabstraction)質(zhì)子(例如可電離的氬原子Ha)作為驅(qū)動力的消除反應。為了本文的目的，"可釋放的鍵合"與"可降解的鍵合，，同義。"酶促可釋放的鍵合"表示經(jīng)受一種或多種酶的降解的鍵合。"水解穩(wěn)定的"鍵合或鍵是指化學鍵，通常為共價鍵，其在水中基本上是穩(wěn)定的，也就是說，在延長的時段內(nèi)在生理條件下沒有經(jīng)受水解至任何可察覺的程度。水解穩(wěn)定的鍵合的實例包括但不限于下述碳-碳鍵(例如于脂肪鏈中)、醚、酰胺及類似鍵合。一般地，水解穩(wěn)定的鍵合是在生理條件下顯示少于約1-2%/天的水解速率的鍵合。代表性的化學鍵的水解速率可在大多數(shù)標準化學教科書中找到。必須指出的是，某些鍵合可以是水解穩(wěn)定的或可水解的，這取決于(例如)接近的和鄰近的原子和環(huán)境條件。本領域普通技術人員可通過例如將感興趣的含鍵合分子置于感興趣的條件下并測試水解的證據(jù)(例如由單個分子的裂解導致的兩個分子的存在和量)，來確定在給定情況下給定的鍵合或鍵是否為水解穩(wěn)定的或可水解的。還可使用本領域普通技術人員已知的用于確定給定的鍵合或鍵是否為水解穩(wěn)定的或可水解的其他方法。術語"活性劑，，、"生物活性劑"和"藥理活性劑"在本文可互換使用并且定義為包括提供某些通常有益的藥理作用(可在體內(nèi)或體外得以證實)的任何劑、藥物、化合物、物質(zhì)的組合或混合物。這包括食品增補劑、營養(yǎng)素、營養(yǎng)藥、藥物、蛋白質(zhì)、疫苗、抗體、維生素和其他有益的劑。如本文所用，這些術語進一步包括在患者中產(chǎn)生局部或全身效應的任何生理上或藥理上活性的物質(zhì)。"藥學上可接受的賦形劑"或"藥學上可接受的載體"是指可包含于本發(fā)明組合物中并且不會對患者產(chǎn)生明顯不利的毒理作用的賦形劑。"藥理有效量，，、"生理有效量"和"治療有效量"在本文可互換地用于表示在血流中或靶組織中提供期望水平的活性劑和/或軛合物所需的、通常存在于藥物制品中的聚合物-活性劑軛合物的量。精確量將取決于很多因素，例如具體活性劑、藥物制品的組分和物理特性、預期的患者種群、患者顧慮及類似因素，并且可根據(jù)本文提供的且在有關文獻中可獲得的信息由本領域普通技術人員容易地確定。在聚合物的情況下，"多官能的"表示具有包含在其中的3個或更多個官能團的聚合物，其中所述官能團可以是相同的或不同的。多官能的聚合物將通常包含約3-100個官能團、或3-50個官能團、或3-25個官能團、或3-15個官能團、或3至10個官能團、或者在聚合物中將包含3、4、5、6、7、8、9或10個官能團。"雙官能的"聚合物表示具有包含在其中的兩個官能團的聚合物，所述官能團為相同的(即同基雙功能的)或不同的(即異基雙功能的)。關于聚合物的幾何形狀或總體結構的"支鏈"是指含有2個或更多個聚合物"臂"的聚合物。支鏈聚合物可具有2個聚合物臂、3個聚合物臂、4個聚合物臂、6個聚合物臂、8個聚合物臂或更多。多支鏈聚合物的一種具體類型為樹枝狀聚合物或樹枝狀大分子，為了本發(fā)明的目的，其被認為具有不同于支鏈聚合物結構的結構。"樹枝狀大分子"或樹枝狀聚合物為球狀、尺寸單分散的聚合物，其中所有鍵以規(guī)則的支鏈模式且以重復單元(每個重復單元貢獻分支點)放射狀地從中心焦點或核引出。樹枝狀大分子顯示了某些樹枝狀狀態(tài)性質(zhì)如核包封，使它們較之于其他類型的聚合物是獨特的。本文所述的堿性或酸性反應物包括其中性的、荷電的及任何相應的鹽形式。術語"患者，，是指遭受或易受可通過施用本文所提供的軛合物而預防或治療的病狀的活生物體，且包括人和動物兩者。如本文所用，"藥物釋放速率"表示其中系統(tǒng)中聚合物-活性劑軛合物的總量的一半將裂解成活性劑和聚合物殘基的速率(表述為半衰期)。"任選的，，和"任選地，，表示隨后所描述的情況可以發(fā)生或可以不發(fā)生，以使描述包括了情況發(fā)生的實例和情況不發(fā)生的實例。如本文所用，當卣素與分子連接時，一般使用"halo(鹵素)"指示符(例如氟、氯、碘、溴等等)，而當鹵素以其獨立的離子形式存在時(例如，諸如當離去基團離開分子時)，使用后綴"ide(化物)"18(例如氟化物、氯化物、碘化物、浹化物等等)。如本文所用，術語"IX因子部分"是指具有IX因子活性的部分。IX因子部分還將至少具有適于與聚合物試劑反應的胺基。盡管不是必需的，通常所述IX因子部分為蛋白質(zhì)。此外，術語"IX因子部分"涵蓋軛合前的IX因子部分以及軛合后的IX因子部分殘基。如將在下文進一步詳細解釋的，本領域普通枝術人員可確定任何給定的部分是否具有IX因子活性。如本文所用，術語"IX因子部分"包括有意修飾的(例如通過定向誘變)或通過突變意外修飾的蛋白質(zhì)。術語"IX因子部分"還包括具有1至6個額外的糖基化位點的衍生物、在蛋白質(zhì)的羧基末端具有至少一個額外的氨基酸的衍生物(其中額外的氨基酸包括至少一個糖基化位點)和具有包括至少一個糖基化位點的氨基酸序列的衍生物。在本討論的情況下，應認識到，對于一種結構或結構式所提供的變量的定義可適用于在不同結構中重復的相同變量，除非上下文中另有規(guī)定。如前文所述，本發(fā)明包括(除了其他事項之外)具有可釋放的鍵合的輒合物。在描述本發(fā)明的示例性軛合物之前，將討論水溶性聚合物和能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基曱酸酯鍵合的官能團的實施方案。關于給定的水溶性聚合物，每種水溶性聚合物(例如POLY、P0LY1和P0LY2)可包括任何聚合物，只要聚合物為水溶性的且為非肽的。盡管優(yōu)選聚(乙二醇)，本文所用的水溶性聚合物可以是例如其他水溶性聚合物，諸如其他聚亞烷基二醇[也稱為"聚氧化烯烴，，]、諸如聚丙二醇("PPG")、乙二醇和丙二醇的共聚物及類似物、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羥烷基甲基丙烯酰胺、聚羥烷基甲基丙烯酸酯、多糖、聚(a-羥基酸)、聚乙烯醇、聚磷嗪、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)，諸如在美國專利第5，629，384號中描述的。水溶性聚合物可以是前述中任一種的均聚物、共聚物、三元共聚物、非無規(guī)嵌段聚合物和無規(guī)嵌段聚合物。此外，水溶性聚合物可為直鏈的，但還可為如將在下文進一步詳細描述的其他形式(例如支鏈的、叉狀的及類似形式)。在存在于總體結構內(nèi)的情況下，水溶性聚合物具有l(wèi)至約300個末端。在聚合物試劑包括兩個或更多個水溶性聚合物的實例中，總體結構中的每個水溶性聚合物可以是相同的或不同的。然而，優(yōu)選的是，總體結構中的所有水溶性聚合物具有相同的類型。例如，優(yōu)選的是，在給定結構內(nèi)的所有水溶性聚合物為聚(乙二醇)聚合物。盡管任何單個水溶性聚合物的重均分子量可變化，但是任何給定的水溶性聚合物的重均分子量通常在下述范圍內(nèi)100道爾頓至約150，000道爾頓。然而，示例性的范圍包括下述范圍內(nèi)的重均分子量約880道爾頓至約5,000道爾頓的范圍內(nèi)；大于5,000道爾頓至約IOO，OOO道爾頓的范圍內(nèi)；約6，000道爾頓至約90,000道爾頓的范圍內(nèi)；約IO，OOO道爾頓至約85，000道爾頓的范圍內(nèi)；大于IO，OOO道爾頓至約85，000道爾頓的范圍內(nèi)；約20，OOO道爾頓至約85，000道爾頓的范圍內(nèi)；約53，000道爾頓至約85，000道爾頓的范圍內(nèi)；約25，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍內(nèi)；約29，000道爾頓至約120,000道爾頓的范圍內(nèi)；約35，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍內(nèi)；約880道爾頓至約60，000道爾頓的范圍內(nèi)；約440道爾頓至約40，000道爾頓的范圍內(nèi)；約440道爾頓至約30，000道爾頓的范圍內(nèi)；和約40，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍內(nèi)。對于任何給定的水溶性聚合物，優(yōu)選具有在這些范圍的一個或多個中的分子量的PEG。水溶性聚合物的示例性重均分子量包括約IOO道爾頓、約200道爾頓、約300道爾頓、約400道爾頓、約440道爾頓、約500道爾頓、約600道爾頓、約700道爾頓、約750道爾頓、約800道爾頓、約900道爾頓、約1，000道爾頓、約1，500道爾頓、約2，000道爾頓、約2，200道爾頓、約2,500道爾頓、約3，000道爾頓、約4，000道爾頓、約4,400道爾頓、約4，500道爾頓、約5，000道爾頓、約5，500道爾頓、約6,000道爾頓、約7，000道爾頓、約7，500道爾頓、約8，000道爾頓、約9,000道爾頓、約10，000道爾頓、約11，000道爾頓、約12，000道爾頓、約13，000道爾頓、約14，000道爾頓、約15，000道爾頓、約16，000道爾頓、約17，000道爾頓、約18，000道爾頓、約19，000道爾頓、約20，000道爾頓、約22，500道爾頓、約25，000道爾頓、約30，000道爾頓、約35，000道爾頓、約40，000道爾頓、約45，000道爾頓、約50，000道爾頓、約55，000道爾頓、約60，000道爾頓、約65，000道爾頓、約70，000道爾頓和約75，000道爾頓。還可使用具有前述中任一個的總重均分子量的水溶性聚合物的支鏈形式(例如由兩個20，000道爾頓的聚合物組成的支鏈的40，000道爾頓的水溶性聚合物)。用于制備軛合物的聚合物試劑將包括至少一種水溶性聚合物，所述水溶性聚合物具有在適于由其所形成的軛合物的期望釋放速率的范圍內(nèi)的總尺寸。例如，具有相對長釋放速率(longreleaserate)的輒合物可由具有下述尺寸的聚合物試劑制備適于(a)在從軛合物中釋放活性劑之前，延長循環(huán)，和(b)—旦從軛合物中釋放，就適度快速地體內(nèi)清除從軛合物釋出的物類(species)的尺寸。同樣地，當軛合物具有相對快的釋放速率時，那么聚合物試劑通常將具有較低的分子當PEG用作聚合物試劑中的水溶性聚合物時，PEG通常包括許多(0(^(^2)單體[或(0120120)單體，取決于如何定義PEG]。如在整個說明書中使用，重復單元的數(shù)量通過"(OCH2CH2)n，，中的下標"n"來識別。因此，(n)值通常落入下述范圍中的一個或多個之內(nèi)2至約3400、約4至約1500、約100至約2300、約100至約2270、約136至約2050、約225至約1930、約450至約1930、約1200至約1930、約568至約2727、約660至約2730、約795至約2730、約795至約2730、約909至約2730和約1，200至約1，900。對于其中分子量已知的任何給定的聚合物，通過用聚合物的總重均分子量除以重復單體的分子量確定重復單元的數(shù)量(即"n，，)是可能的。每個水溶性聚合物通常是生物相容的且非免疫原性的。關于生物相容性，如果單獨使用物質(zhì)或與另一種物質(zhì)(例如活性劑)一起使用此物質(zhì)在活組織方面(例如施用至患者)相關的有益效果優(yōu)于臨床醫(yī)師例如醫(yī)生所評價的任何有害作用，則此物質(zhì)被認為是生物相容的。關于非免疫原性，如果單獨使用物質(zhì)或與另一種物質(zhì)一起使用此物質(zhì)在活組織方面不會產(chǎn)生免疫應答(例如生成抗體)或者如果產(chǎn)生免疫應答，認為這種應答不具有臨床醫(yī)師所評價的臨床顯著性或重要性，則此物質(zhì)被認為是非免疫原性的。特別優(yōu)選的是，本文所述的水溶性聚合物以及活性劑與聚合物的軛合物是生物相容的且非免疫原性的。在有用的一種形式中，游離的或非結合的PEG為每個端部用羥基封端的直鏈聚合物HO-CH2CH20-(CH2CH20)m'-CH2CH2-OH其中(m，)的范圍通常為0至約4,000，優(yōu)選為約20至約l，OOO。上述聚合物，a-、co-二羥基聚(乙二醇)可用簡略形式如H0-PEG-0H來表示，其中應理解的是，-PEG-符號可表示下述結構單元-CH2CH20-(CH2CH20)m'-CH2CH2-其中(m，)如上所定義。用于本發(fā)明的游離的或非結合的PEG的另一種類型為曱氧基-PEG-0H，或簡稱mPEG，其中一個末端為相對惰性的甲氧基，而另一個末端為羥基。下面給出mPEG的結構。CH30-CH2CH20-(CH2CH20)m'-CH2CH2-其中(m，)如上所述。多臂或支鏈PEG分子，如在美國專利第5，932，462號中描述的那些分子，也可用作PEG聚合物。例如，PEG可具有以下結構polya—R"—C一polyh~Q其中polya和polyb為PEG主鏈(相同的或不同的)，如甲氧基聚(乙二醇)；R，，為非反應性部分，如H、曱基或PEG主鏈；且P和Q為非反應性鍵合。在一個優(yōu)選的實施方案中，支鏈PEG聚合物為曱氧基聚(乙二醇)二取代的賴氨酸。此外，PEG可包括叉狀PEG。游離的或非結合的叉狀PEG的實例由下式表示z/PEG-X-C-H\Z其中X為間隔基部分，并且每個Z為經(jīng)由已定義長度的原子鏈與CH連接的活化端基。連接Z官能團與分支碳原子的原子鏈用作系鏈基團(tetheringgroup)并且可包括，例如，烷基鏈、醚鏈、酯鏈、酰胺鏈及其組合。美國專利第6，362，254號公開了能在本發(fā)明中使用的各種叉狀PEG結構。PEG聚合物可包括具有沿著PEG的長度而不是在PEG鏈的端部共價連接的反應基(如羧基)的側鏈(pendant)PEG分子。側鏈反應基可直接或通過間隔基部分如亞烷基與PEG連接。除了上述形式的PEG之外，聚合物試劑中的每個水溶性聚合物還可用聚合物(包括上述聚合物中的任一個)中的一個或多個弱鍵合或3！釋放的鍵合制備。例如，PEG可用易遭受水解的聚合物中的酯鍵合制備。如下所示，這種水解使得聚合物裂解成較低分子量的片段-PEG-C02-PEG-+H20--PEG-C02H+HO-PEG-碳酸酯鍵合；例如由胺與醛的反應得到的亞胺鍵合(參見，例如0uchi等人(1997)/^///z/er戶re;W/7〃M(l):582-3);例如由醇與磷酸基團(phosphategroup)反應形成的磷酸酯鍵合；通常由酰肼與醛的反應形成的腙鍵合；通常由醛與醇之間的反應形成的縮醛鍵合；例如由曱酸酯(formate)與醇之間反應形成的原酸酯鍵合；由例如在聚合物如PEG的端部的胺基與另一個PEG鏈的羧基形成的酰胺鍵合；由例如含有末端異氰酸酯基(isocyanategroup)的PEG與PEG醇的反應形成的聚氨酯(urethane)鍵合；由例如在聚合物如PEG的端部的胺基23與肽的羧基形成的肽鍵合；以及由例如在聚合物端部的亞磷酰胺基與寡核苷酸的5，羥基形成的寡核普酸鍵合。本領域普通技術人員應理解，術語聚(乙二醇)或PEG表示或包括所有上述形式的PEG。本領域普通技術人員將認識到，涉及基本上水溶性的聚合物的前述討論決不是窮舉的而僅僅是例證性的，并且涵蓋具有上述性質(zhì)的所有聚合物材料。如本文所用，術語"水溶性聚合物"既指分子也指已經(jīng)與另一部分連接的水溶性聚合物的殘基。水溶性聚合物的下列描述不僅可應用于聚合物試劑，而且可應用于使用所述聚合物試劑形成的相應的輒合物。用于形成本文所述軛合物的聚合物試劑的官能團為能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基甲酸酯鍵合的官能團。本發(fā)明并不限于特定官能團，只要官能團能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基甲酸酯鍵合。能與活性劑的氨基反應的示例性官能團包括選自由以下組成的組的那些官能團活性碳酸酯如N-琥珀酰亞胺基、1-苯并三唑基、咪唑、碳酸酯卣化物(如碳酸酯氯化物和碳酸酯溴化物)、苯酚鹽(如對硝基苯酚鹽)等。并且，作為特別的例子，如果具有轉(zhuǎn)化成異氰酸酯或異硫氰酸酯基團的活性胺基的活性劑是可用的，那么聚合物試劑的官能團可以是羥基，因為這些組分的反應提供了可釋放的氨基甲酸酯鍵合。現(xiàn)將進一步詳細地討論示例性的聚合物試劑。必須記住的是，盡管在任何結構式或結構(不論對于聚合物試劑、軛合物或任何其他結構式或結構)中沒有明確顯示立體化學，但是所提供的結構式和結構涵蓋兩種對映體以及含有等量(即外消旋混合物)和不等量的每個對映體的混合物的組合物。示例性的聚合物試劑具有以下結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中P0I^為第一水溶性聚合物；P0LY2為第二水溶性聚合物；X'i為第一間隔基部分；乂2為第二間隔基部分；H。為可電離的氫原子；R'為H或有機基；W為H或有機基；(a)為0或1;(b)為0或1;r'當存在時，為第一電子改變基團；R"當存在時，為第二電子改變基團；且(FG)為能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基甲酸酯鍵合的官能團。示例性的聚合物試劑包括在下式之內(nèi)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage26</image>其中，在每個實例中(FG)為能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基甲酸酯鍵合的官能團；R'為H或有機基；且R2為H或有機基。還有其他的示例性聚合物試劑具有以下結構<image>imageseeoriginaldocumentpage26</image>其中P0LY1、P0LY2、X1、X2、R1、R2、H。和(FG)中的每一個如前述定義，且R"為第一電子改變基團；且R"為第二電子改變基團。還有其他示例性的聚合物試劑包括在下述結構之內(nèi)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>CH3O-(CH2CH20)n-CH2CH2-00-CH2CH2-(OCH2CH2)n-OCH3CH2CH2<OCH2CH2)n-OCH3其中，對于每個結構和在每個實例中，(n)獨立地為4至1500的整數(shù)。聚合物試劑可以以許多方法來制備。因此，聚合物試劑的合成并不限于用于制備它們的特定技術或方法。中，所述方法包括(a)提供了帶有第一連接位點(attachmentsite)、第二連接位點和任選的第三連接位點的含芳族部分；(b)使官能團試劑與第一連接位點反應以得到帶有官能團的第一連接位點，所迷官能團能與活性劑的氨基反應并得到可釋放的鍵合，如氨基甲酸酯；和(c)使帶有反應基的水溶性聚合物與第二連接位點和任選的第三連接位點(當存在時)反應以得到(i)通過間隔基部分帶有水溶性聚合物的第二連接位點，和(ii)通過間隔基部分帶有第二水溶性聚合物的任選的第三連接位點(當存在時)。在某些實例中，在步驟(c)之前進行(b)，而在其他的實例中，在步驟(b)之前進行(c)。因此，在用于制備聚合物試劑的此方法中，所需步驟為(a)提供帶有第一連接位點、第二連接位點和任選的第三連接位點的含芳族部分。在合成制備的情況下，應理解的是，"提供"材料表示獲得材料(通過例如合成它或商業(yè)上獲得它)。為了說明的目的，示例性的含芳族部分為9-羥甲基-2，7-二氨基芴，如下所示。此含芳族部分9-羥曱基-2，7-二氨基藥為具有三個連接位點的含芳族部分的實例，所述三個連接位點為在9位的羥基及在2位和7位中每一個的氨基。含芳族部分可以以堿或鹽形式提供。對于9-羥甲基-2，7-二氨基芴，使用二鹽酸化物形式是可能的。其他含芳族部分可通過合成制備和/或從商品供應商購買而提供。已經(jīng)提供了含芳族部分，此方法中的另一個步驟廣泛地包括使帶有反應基的水溶性聚合物與含芳族部分上的連接位點反應的步驟。在這里，可使用用于將水溶性聚合物連接至含芳族部分上的一個或多個連接位點的任何本領域已知的方案，并且此方法并不限于特定方案。例如，胺反應性的PEG(諸如，例如在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIC)作為縮合劑和任選地在堿的存在下，由N-羥基琥珀酰亞胺和CH30-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH反應而形成的N-琥珀酰亞胺酯封端的mPEG)可與帶有含芳族部分如9-羥甲基-2，7-二氨基芴的胺反應。在某些實例中，帶有反應基的水溶性聚合物與含芳族部分的反應將使得所有可能的連接位點具有與其連接的水溶性聚合物。在如此情況下，除去至少一個水溶性聚合物是必要的，以使連接位點可用于與官能團試劑反應。因此，例如，在前段中所論述的N-琥珀酰亞胺酯封端的mPEG與9-羥甲基-2，7-二氨基芴的反應得到混合物，所述混合物包括(a)帶有兩個水溶性聚合物的物類，其中在兩個胺位點的每一個處有一個水溶性聚合物，和(b)帶有三個水溶性聚合物的物類，其中在兩個胺位點的每一個處有一個水溶性聚合物并且在羥基位點處有一個水溶性聚合物。在這里，通過使用尺寸排阻色語法除去并收集較高分子量的物類是可能的。此外，將混合物處理至高pH[例如用氫氧化鋰(LiOH)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)處理混合物]、然后進行離子交換色譜法(IEC)是可能的。在任一種情況下，結果為主要包括帶有兩個水溶性聚合物(在兩個胺位點的每一個處有一個水溶性聚合物)的9-羥甲基-2，7-二氨基芴的組合物。因而第三個羥基位點可用于與官能團試劑反應。終步驟是使含芳族部分的反應活性部位與官能團試劑反應。優(yōu)選的方法是將帶有兩個水溶性聚合物(在兩個胺位點的每一個處有一個水溶性聚合物)的含羥基的9-羥曱基-2，7-二氨基藥與三光氣反應，然后用N-羥基琥珀酰亞胺處理。以這種方式，在含羥基的反應活性部位上形成能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合如氨基甲酸酯鍵合(在此實例中，"活性碳酸酯")的官能團。不論使用何種方法，合成方法的步驟在適合的溶劑中發(fā)生。本領域普通技術人員可確定任何特定溶劑是否適于任何給定的反應。然而，通常地，所述溶劑優(yōu)選為非極性溶劑或極性非質(zhì)子溶劑。非極性溶劑的非限制性實例包括苯、二甲苯、二噁烷、四氫呋喃(THF)、叔丁醇和甲苯。特別優(yōu)選的非極性溶劑包括甲苯、二甲苯、二噁烷、四氫呋喃和叔丁醇。示例性的極性非質(zhì)子溶劑包括但不限于DMS0(二甲基亞砜)、HMPA(六曱基磷酰胺)、DMF(二甲基曱酰胺)、DMA(二曱基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidi醒e))。一旦制備好，就可分離聚合物試劑。可使用已知的方法來分離聚合物試劑，但是特別優(yōu)選使用色譜法，例如尺寸排阻色譜法。可選擇地或另外地，所述方法包括一旦形成聚合物試劑就將其純化的步驟。此外，可使用標準的本領域已知的純化方法來純化聚合物試劑。聚合物試劑對水分和氧是敏感的并且最好在惰性氣氛下諸如在氬氣下或在氮氣下和在低溫下貯存。以這種方式，減少或完全避免與例如大氣氧相關的潛在降解過程。在某些情況下，為了避免氧化降解，在貯存前可將抗氧化劑如丁羥曱苯(BHT)加入到聚合物試劑。此外，優(yōu)選將與l&存條件相關的水分量降至最低以減少與水相關的潛在的損害反應，例如活性酯的水解。而且，優(yōu)選將貯存條件保持黑暗以便避免涉及光的某些降解過程。因此，優(yōu)選的貯存條件包括以下的一種或多種在干燥氬氣或另一種干燥惰性氣體下貯存；在低于約-15。C的溫度下貯存；在沒有光下貯存；以及與適合量(例如約5Q至約5Q0ppm)的抗氧化劑如BHT—起ji&存。上述聚合物試劑用于與生物活性劑軛合。例如，活性劑上的氨基(例如伯胺)將與官能團反應，所述官能團能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的如氨基曱酸酯鍵合。示例性的軛合物具有以下結構其中POLY〗為第一水溶性聚合物；POLY2為第二水溶性聚合物；Xt為第一間隔基部分；乂2為第二間隔基部分；H。為可電離的氫原子；R'為H或有機基；W為H或有機基；(a)為0或1;(b)為0或1;R"當存在時，為第一電子改變基團;R"當存在時，為第二電子改變基團;Y〗為0或S;y2為0或S;且F9為含胺的IX因子部分的殘基。示例性的軛合物包括下式的那些R1Y2G—Y1—C-NH-F9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>卄N-CH2CH2{OCH2CH2)n-OCH30H其中，對于每個結構并且在每個實例中，(n)獨立地為4至1500的整數(shù)，且F9為含胺的IX因子部分的殘基?？膳c本文所述聚合物試劑扼合的生物活性劑為含胺的生物活性劑。通常地，所述生物活性劑將為分子量大于約3，500道爾頓的大分子，如多肽。藥理上活性的多肽表示優(yōu)選的生物活性劑類型。應理解的是，為了本討論的目的，術語"多肽"對于寡肽和蛋白質(zhì)為通用的。對于多肽，與聚合物試劑偶聯(lián)的胺可在多肽中氨基酸(如賴氨酸)的N-末端或含胺側鏈上。本發(fā)明還提供了制備軛合物的方法，其包括在適于形成聚合物與生物活性劑之間的共價連接的條件下，使聚合物試劑與生物活性劑接觸的步驟。通常地，以等摩爾量(就期望的適于與反應基反應的基團數(shù)而言)或以摩爾過量將聚合物加入到活性劑或表面。例如，可以約l:l(聚合物試劑:活性劑)、1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1或10:1的摩爾比將聚合物試劑加入到靶活性劑(targetactiveagent)。允許輒合反應進行直到基本上沒有進一步的軛合發(fā)生，這通常可通過監(jiān)測隨時間變化的反應進程來確定?？赏ㄟ^在不同的時間點從反應混合物中取出等分試樣并用SDS-PAGE或MALDI-TOF質(zhì)譜法或任何其他適合的分析方法分析反應混合物來監(jiān)測反應進程。一旦關于所形成的輒合物的量或剩余的未軛合聚合物的量達到穩(wěn)定水平，則假定反應完全。通常地，軛合反應花費大約數(shù)分鐘至數(shù)小時(例如5分鐘至24小時或更長)。優(yōu)選但不是必需的，將所得的產(chǎn)物混合物純化以分離出過量試劑、未軛合反應物(例如活性劑)、不希望的多軛合物類、和游離的或未反應的聚合物。然后可使用分析方法如MALDI、毛細管電泳、凝膠電泳和/或色i普法進一步表征所得的軛合物。關于聚合物-活性劑軛合物，可將軛合物純化以獲得/分離不同的軛合物類。可選擇地，且更優(yōu)選地，對于較低分子量(例如小于約20千道爾頓，更優(yōu)選小于約10千道爾頓)的聚合物來說，可將產(chǎn)物混合物純化以獲得每活性劑水溶性聚合物片段的分布。例如，可將產(chǎn)物混合物純化以獲得每活性劑(例如多肽)大約一個至五個PEG的平均值。最終軛合反應混合物的純化策略將取決于許多因素，包括例如所用聚合物的分子量、具體活性劑、期望的給藥方案和個別軛合物的剩余活度以及體內(nèi)性質(zhì)。如果需要，可使用凝膠過濾色譜法分離具有不同分子量的軛合物。也就是說，使用凝膠過濾色鐠法來以它們不同的分子量(其中該差異基本上對應于水溶性聚合物片段的平均分子量)為基礎將不同數(shù)目的聚合物活性劑的比率(例如，1-譜、2-mer、3-mer等等，其中"l-mer"表示l個聚合物活性劑，"2-mer"表示2個聚合物活性劑等等)進行分級。例如，在一個示例性反應中，該反應中100kDa蛋白質(zhì)與具有約20kDa分子量的聚合物試劑隨機軛合，所得的反應混合物將可能包含未改性的蛋白質(zhì)(分子量100kDa)、單-PEG化的蛋白質(zhì)(分子量120kDa)、雙-PEG化的蛋白質(zhì)(分子量140kDa)等等。盡管這種方法可用來分離PEG和具有不同分子量的其他聚合物軛合物，但是這種方法通常對于分離在蛋白質(zhì)中具有不同聚合物連接位點的位置異構體是無效的。例如，可使用凝膠過濾色譜法來從PEGl-mer、2-mer、3-mer等的彼此混合物中進行分離，盡管每個已回收的PEG-mer組合物可包含與活性劑中的不同反應性氨基(例如賴氨酸殘基)連接的PEG。適于進行此類分離的凝膠過濾柱包括可從AinershamBiosciences(Piscataway，NJ)獲得的Syperdex和Sephadex柱。具體柱的選擇將取決于所期望的分級范圍。通常使用適合的緩沖液如磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或類似緩沖液進行洗脫。所收集的部分可通過許多不同的方法來分析，所述方法例如(i)用于蛋白質(zhì)含量的在280nm下的光密度(0D)、(ii)牛血清白蛋白(BSA)蛋白質(zhì)分析、(iii)用于PEG含量的碘試驗[Sims等人(1980)^a人"/oc力e邁，107:60-63]和(iv)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，然后用碘化鋇染色。位置異構體的分離通過使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反相色鐠法或通過使用離子交換柱例如可從AmershamBiosciences獲得的Sepharose離子交換柱的離子交換色譜法來進行。任一種方法可用于分離具有相同分子量的聚合物-活性劑異構體(位置異構體)。關于IX因子部分，用于本發(fā)明的IX因子部分包括具有與天然的人IX因子相同的活性(盡管并不必需具有相同的活度)的任何蛋白質(zhì)。如前文所述，術語"IX因子部分"應包括在軛合前的IX因子部分和與水溶性聚合物連接后的IX因子部分。然而，應理解的是，當IX因子部分與非肽的水溶性聚合物連接時，由于與聚合物的鍵合(或與聚合物連接的間隔基部分)相關聯(lián)的一個或多個共價鍵的存在，IX因子部分被略微改變。經(jīng)常地，與另一個分子連接的IX因子部分的此略微改變的形式稱為IX因子部分的"殘基"。IX因子部分可由非重組方法或由重組方法得到并且本發(fā)明在這點上不受限制。此外，IX因子部分可從人源或從動物源中得到。IX因子部分可非重組地得到。例如，IX因子部分可從血源性來源(blood-derivedsources)獲得。特別地，IX因子可使用本領域普通技術人員已知的沉淀和離心技術從人血漿中分離。參見，例如Wickerhauser(1976)7Ya;^尸^/o/li(4):345-35G和Slichter等人(1976)7>a/^/Uy/o/7i^(6):616-626。IX因子還可從人粒細胞中分離。參見Szmitkoski等人(1977)#ae/nato/og/a(5ucTa/j.)il(l-2):177-187。IX因子部分可由重組方法得到。例如，已經(jīng)將編碼天然IX因子的cDNA(其為IX因子部分)分離、表征并克隆到表達載體中。參見，例如Choo等人(1982)"MolecularCloningoftheGeneforHumanAnti-hemophilicFactorIX(人抗血友病IX因子的基因的分子克隆)"，Nature,Vol.299:178-180和Kurachi等人(1982)"IsolationandCharacterizationofacDNACodingforHumanFactorIX(編碼人IX因子的cDNA的分離和表征)"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，Vol.79:6461-65。一旦被表達，天然IX因子就為約55，000道爾頓的單鏈糖蛋白。它在結構上可被認為具有四個結構域富含Gla或y羧基谷氨酸的結構域；EGF樣區(qū)；激活肽；和活性部位。關于IX因子部分的部分，還可使用保持至少一些所期望的IX因子活度的前述中任一種的生物活性片段、缺失變體、置換變體或添加變體?？捎欣匦揎椈钚詣﹣戆ㄒ环N或多種氨基酸殘基諸如，例如賴氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便提供聚合物與氨基酸側鏈內(nèi)原子的容易的連接。用于添加氨基酸殘基的技術為本領域普通技術人員所公知。請參考J.March,AdvancedOrganicChemistry:ReactionsMechanismsandStructure(高等有機化學反應機理和結構)，第4版(NewYork:Wiley-Interscience，1992)?；钚詣┛蓮难葱詠碓传@得。例如，VIII因子可使用本領域普通技術人員已知的沉淀和離心技術從人血漿中分離。參見，例如Wickerhauser(1976)7><2i^/*i;"'w3(4):345-350和Slichter等人(1976)7ya/^/Vw'o/711(6):616-626。VIII因子還可從人粒細胞中分離。參見Szmitkoski等人(1977)^函Wo《/a(歸早)U(l-2):177-187。此外，活性劑還可由重組方法獲得。簡要地，重組方法涉及構建編碼所期望的多肽或片段的核酸，將所迷核酸克隆至表達栽體，轉(zhuǎn)化宿主細胞(例如細菌、酵母或哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞或BHK細胞)和表達所述核酸以生成所期望的多肽或片段。用于在體外和在原核宿主細胞和真核宿主細胞中生成和表達重組多肽的方法為本領域普通技術人員已知的。參見，例如美國專利第4，868，122號。只要適用，上文示例性的生物活性劑意指涵蓋其類似物、激動劑、拮抗劑、抑制劑、異構體和藥學上可接受的鹽形式。關于肽和蛋白質(zhì)，本發(fā)明旨在涵蓋其合成的、重組的、天然的、糖基化的和非糖基化的形式以及生物活性片段。此外，術語"活性劑，，旨在涵蓋軛合前的活性劑和軛合后的活性劑"殘基"。對于任何給定的部分，確定所述部分是否具有IX因子活性是可能的。例如，已經(jīng)有意地用血友病的基因突變繁殖某些動物系(animalline),以使由該系產(chǎn)生的動物具有非常低且不足的IX因子水平。這些系可從多種來源獲得，所述來源諸如但不限于theDivisionofLaboratoriesandResearch,NewYorkDepartmentofPublicHealth(紐約公共衛(wèi)生局實驗室和研究部門)，Albany,NY和theDepartmentofPathology,UniversityofNorthCarolina(北卡羅來納大學病理學系)，ChapelHill,NC。例如，這兩個來源都提供了遭受犬血友病B的犬。為了測試正在討論的任何給定部分的IX因子活性，將所述部分注射到患病動物中，制造小切口并與作為對照的受治療的患病動物比較出血時間。用于確定IX因子活性的另一個方法是測定輔因子和促凝劑活性。參見，例如Mertens等人(1993)5r〃./.i^e邁"o/.133-42。還可使用本領域普通技術人員已知的其他方法來確定給定部分是否具有IX因子活性。這些方法用于確定所提議的IX因子部分以及相應的聚合物-IX因子部分軛合物兩者的IX因子活性。本發(fā)明還包括藥物制品，其包括與藥用賦形劑結合的本文所提供的軛合物。一般地，軛合物本身將為可與適合的藥用賦形劑結合的固體形式(例如沉淀物)，所述藥用賦形劑可以是固體或液體形式。示例性的賦形劑包括但不限于選自由以下組成的組的那些碳水化合物、無機鹽、抗微生物劑、抗氧化劑、表面活性劑、緩沖劑、酸、堿及其組合。碳水化合物如糖、衍生糖(derivatizedsugar)如糖醇、糖醛酸、酯化糖(esterifiedsugar)和/或糖聚合物可以作為賦形劑存在。特定的碳水化合物賦形劑包括，例如單糖，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖及類似單糖；二糖，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖及類似二糖；多糖，諸如棉子糖、^^三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉及類似多糖；和糖醇，諸如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇及類似糖醇。所述賦形劑還可包括無機鹽或緩沖劑，諸如檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。所述制品還可包括用于預防或阻止微生物生長的抗微生物劑。適于本發(fā)明的抗微生物劑的非限制性實例包括苯扎氯銨、節(jié)索氯銨、苯曱醇、西吡氯銨、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol及其組合?？寡趸瘎┮部纱嬖谟谥破分??？寡趸瘎┯糜陬A防氧化，因而預防本制品的扼合物或其他組分的變質(zhì)。用于本發(fā)明的適合的抗氧化劑包括，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁羥甲苯、次磷酸、硫代甘油、沒食子酸丙酯、亞硫酸氬鈉、曱醛次硫酸氫鈉、焦亞疏酸鈉及其組合。表面活性劑可作為賦形劑存在。示例性的表面活性劑包括聚山梨醇酯如"吐溫20"和"吐溫80"，和普朗尼克(plu醒ic)如F68和F88(這兩種均可得自BASF,MountOlive,NewJersey);脫水山梨糖醇酯；脂質(zhì)，諸如磷脂如卵磷脂和其他磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺(盡管優(yōu)選不以脂質(zhì)體形式存在)、脂肪酸和脂肪酸酯；類固醇，諸如膽固醇；和螯合劑，諸如EDTA、鋅和其他像這樣的適合的陽離子。酸或堿可作為賦形劑存在于制品中。可用的酸的非限制性實例包括選自由以下組成的組的那些酸鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、曱酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富馬酸及其組合。適合的堿的實例包括但不限于選自由以下組成的組的堿氫氧化鈉、醋酸鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀、醋酸銨、醋酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、甲酸鈉、硫酸鈉、硫酸鉀、富馬酸鉀(potassiumf腦rate)及其組合。所述藥物制品包括所有制劑類型，特別是適于注射的那些制劑，例如，可重建的粉劑以及懸浮液和溶液。組合物中軛合物(即本文所述的活性劑和聚合物之間形成的軛合物)的量將根據(jù)許多因素而變化，但是最佳地將為在組合物貯存于單位劑量容器(例如小瓶)中時的治療有效劑量。此外，所述藥物制品可保存于注射器中?？赏ㄟ^重復施用遞增量的軛合物以便確定哪一種量產(chǎn)生臨床上期望的終點，從而實驗性地確定治療有效劑量。任何單個賦形劑在組合物中的量將根據(jù)賦形劑的活性和組合物的具體需要來變化。通常地，任何單個賦形劑的最佳量通過常規(guī)實驗來確定，即通過制備含有變化量的賦形劑(范圍從低到高)的組合物，檢測穩(wěn)定性和其他參數(shù)，然后確定獲得最佳性能而沒有顯著副作用的范圍來確定。然而，一般地，賦形劑將以按賦形劑重量計約1%至約99%、優(yōu)選按賦形劑重量計約5%-98%、更優(yōu)選按賦形劑重量計約15-95%的量、最優(yōu)選以按重量計少于30%的濃度存在于組合物中。這些前述的藥用賦形劑連同其他賦形劑在"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy(雷明頓藥學的理論與實踐)"，第19版，Williams&Williams(1995)、"Physician'sDeskReference(醫(yī)生案頭參考)"，第52版，MedicalEconomics,Montvale，NJ(1998)和Kibbe，A.H.，HandbookofPharmaceuticalExcipients(藥用賦形齊寸手冊)，第3版，AmericanPharmaceuticalAssociation,Washington,D.C,2000中描述。盡管不是必需的，本發(fā)明的藥物制品通常經(jīng)由注射施用，且因此在即將施用前一般為液體溶液或懸浮液。所述藥物制品還可采用其他形式，諸如糖漿、乳骨、軟骨、片劑、粉劑及類似形式。還包括其他施用方式，諸如肺、直腸、透皮、透粘膜、口服、鞘內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)施用方式等。如前所述，軛合物可通過靜脈內(nèi)注射、或次優(yōu)選通過肌內(nèi)注射或通過皮下注射而胃腸外施用。用于胃腸外施用的適合的制劑類型包括即用型注射溶液、用于在使用前與溶劑結合的干粉、即用型注射懸浮液、用于在使用前與媒介物結合的干不溶性組合物以及乳劑和用于在施用前稀釋的液體濃縮物、及其他類型。本發(fā)明還提供了向遭受病狀的患者施用本文所提供的軛合物的方法，所述病狀對用軛合物治療是有響應的。所述方法包括施用(一般經(jīng)由注射)治療有效量的軛合物(優(yōu)選作為藥物制品的一部分提供)。施用的方法可用于治療任何病狀，所述病狀可通過施用具體輒合物來治療或預防。本領域普通技術人員理解特定的軛合物可有效治療哪種病狀。待施用的實際劑量將根據(jù)受治療者的年齡、體重和一般狀況、以及所治療病狀的嚴重程度、健康護理專業(yè)人員的判斷和所施用的軛合物而變化。治療有效量為本領域技術人員所已知的，和/或在有關的參考文本或文獻中描述。一般地，治療有效量將為約0.001mg至100mg的范圍，優(yōu)選為0.01mg/天至75mg/天的劑量，且更優(yōu)選為0.10mg/天至50mg/天的劑量。任何給定的軛合物(再一次，優(yōu)選作為藥物制品的一部分提供)的單位劑量可以以多種給藥方案來施用，所述給藥方案取決于臨床醫(yī)師的判斷、患者的需要等等。特定的給藥方案將為本領域普通技術人員已知的或可使用常規(guī)方法實驗性地確定。示例性的給藥方案包括但不限于施用一天五次、一天四次、一天三次、每天兩次、每天一次、每周三次、每周兩次、每周一次、每月兩次、每月一次及其任何組合。一旦已經(jīng)達到臨床終點，就停止組合物給藥。應理解的是，盡管已經(jīng)結合本發(fā)明優(yōu)選的特定實施方案描述了本發(fā)明，但是前文描述以及下文的實驗旨在說明而不限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)勢和變更對本發(fā)明所屬領域的技術人員來說是明顯的。因此，本文所參考的所有文章、書籍、專利、專利公布和其他出版物的全部內(nèi)容通過引用并入。實驗除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用本領域普通技術人員所理解的且在文獻中被闡明的有機合成及類似方法的常規(guī)技術。在下述實施例中，已經(jīng)努力確保關于所用的數(shù)(例如數(shù)量、溫度等等)的準確性，但是應考慮到某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，溫度以攝氏度計，壓力為海平面大氣壓或接近海平面大氣壓。除非另有說明，所有試劑從商業(yè)上獲得。所有產(chǎn)生的NMR得自Bruker(Billerica，MA)所制造的300或400MHzNMR波語儀。所有處理在玻璃或搪玻璃容器中進行并且避免與含金屬容器或裝置接觸。將使用下述縮寫。HPLC高壓液相色譜法SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳用于下述實施例的IX因子從以重組IX因子的8￡犯？1乂@商標市售的商業(yè)上可得到的制品(Wyeth，MadisonNJ)中分離。在降低的溫度下貯存所分離的蛋白質(zhì)溶液。聚合物試劑根據(jù)在美國專利申請公布第2006/0293499號中描述的基本方法來制備，并具有以下結構"聚合物試劑B"實施例1IX因子扼合物的制備(20,000道爾頓的總聚合物重均分子量)("短釋放")聚合物試劑A(其中F9為IX因子的殘基)從4。C貯存室取出一小瓶的Benefix衝IX因子(5.5mgIX因子，Wyeth)并允許加熱至室溫。如包裝插入物中所述，將凍干的粉劑再懸浮(每小瓶10mL無菌水)。當在搖板上將IX因子溶液再溶解時，從-20。C貯存室取出聚合物試劑A并加熱至室溫。使用GE的16/10HiPrepDeSalt柱將Benefix^再懸浮液體經(jīng)緩沖液更換為1xPBS+P/。蔗糖+0.005%吐溫20pH7.3以除去制劑中的甘氨酸。收集蛋白質(zhì)部分并匯合到用于聚合物試劑軛合反應的50mL錐形管(conicaltube)中。將新鮮溶解于2mMHC1中的9.34過量摩爾比(相對于IX因子)的聚合物試劑A緩慢地用移液管移到IX因子溶液中，聚合物試劑A具有約40,000道爾頓的總聚合物重均分子量(即每個聚合物"臂"的重均分子量的總和)。將攪拌棒加入到反應體系，且對于軛合過程低速攪拌溶液3小時。然后通過1:100地添加溶于水中的1M甘氨酸來淬滅反應，其允許于室溫在振蕩器上輕輕振蕩另外30分鐘。應認為，添加甘氨酸應發(fā)生在24小時之內(nèi)。通過3:1(體積)地添加2015mMBis-TrispH7.5+r/。蔗糖+10mM組氨酸+0.005%吐溫20來稀釋溶液。通過輕輕渦旋將溶液充分混合，然后通過離子交換色譜法除去溶液中未結合的聚合物試劑A。通過NaCl梯度洗脫軛合的IX因子。因而制得"短釋放"IX因子軛合物。除了使用具有約40,000道爾頓的總聚合物重均分子量的聚合物試劑A和640.64mg聚合物試劑，重復基本操作。實施例2IX因子扼合物的制備(20,Q00道爾頓的總聚合物重均分子量)("長釋放")42(其中F9為IX因子的殘基)從4'C貯存室取出一小瓶的BenefixIX因子(5.5mgIX因子，Wyeth)并允許加熱至室溫。如包裝插入物中所述，將凍干的粉劑再懸浮(每小瓶10mL無菌水)。當在搖板上將IX因子溶液再溶解時，從-20。C貯存室取出聚合物試劑B并加熱至室溫。使用GE的16/10HiPrepDeSalt柱將861^〃乂@再懸浮液體經(jīng)緩沖液更換為1xPBS+l。/。蔗糖+0.005°/。吐溫20pH7.3以除去制劑中的甘氨酸。收集蛋白質(zhì)部分并匯合到用于聚合物試劑輒合反應的50mL錐形管中。將新鮮溶解于2mMHC1中的9.34過量摩爾比(相對于IX因子)的聚合物試劑B緩慢地用移液管移到IX因子溶液中，聚合物試劑B具有約40，000道爾頓的總聚合物重均分子量(即每個聚合物"臂"的重均分子量的總和)。將攪拌棒加入到反應體系，且對于軛合過程低速攪拌溶液3小時。然后通過1:IOO地添加溶于水中的1M甘氨酸來淬滅反應，其允許于室溫在振蕩器上輕輕振蕩另外30分鐘。應認為，添加甘氨酸應發(fā)生在24小時之內(nèi)。通過3:1(體積)地添加2015mMBis-TrispH7.5+1%蔗糖+10mM組氨酸+Q.QQ5。/。吐溫20來稀釋溶液。通過輕輕渦旋將溶液充分混合，然后通過離子交換色譜法除去溶液中未結合的聚合物試劑B。通過NaCl梯度洗脫輒合的IX因子。因而制得"長釋放"IX因子軛合物。除了使用具有約40,000道爾頓的總聚合物重均分子量的聚合物試劑B和400.4mg聚合物試劑，重復基本操作。實施例3藥動學根據(jù)實施例1和2制備的扼合物(每個具有20，000道爾頓的總聚合物重均分子量)的藥動學(與作為對照的IX因子一起)使用常規(guī)技術來確定。簡要地，使用雄性SD大鼠(180-220克；6-7周齡)并給予一次IOOjiLiv注射。使用每組四只動物，并在注射后不同時間點(例如0、1、2、3、6、12、24、36、48、72小時)收集血漿。結果在下表l中提供，其中V為分布容積，CL為總血漿清除率，AUC為血漿濃度-時間曲線下面積，且L/J為末期消除相的半衰期。還做出了濃度-時間曲線，如圖1所提供。表1軛合物藥動學數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例4凝血活性根據(jù)實施例1和2制備的輒合物(每個具有20，OOO道爾頓的總聚合物重均分子量)的體外凝血活性(與作為對照的IX因子一起)使用常規(guī)技術來確定。結果在圖2中提供。權利要求1.一種化合物，其具有以下結構其中POLY1為第一水溶性聚合物；POLY2為第二水溶性聚合物；X1為第一間隔基部分；X2為第二間隔基部分；Hα為可電離的氫原子；R1為H或有機基；R2為H或有機基；(a)為0或1；(b)為0或1；Re1當存在時，為第一電子改變基團；Re2當存在時，為第二電子改變基團；Y1為O或S；Y2為O或S；且(F9)為含胺的IX因子部分的殘基。2.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其中所述含胺的IX因子部分為重組IX因子。3.根據(jù)權利要求2所述的化合物，其中所述重組IX因子為人重組IX因子。4.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其中所述第一水溶性聚合物為聚氧化烯烴且所述第二水溶性聚合物為聚氧化烯烴。5.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其中所述第一水溶性聚合物具有10，000道爾頓至85，OOO道爾頓之間的重均分子量且所迷第二水溶性聚合物具有10，000道爾頓至85，000道爾頓之間的重均分子量。6.根椐權利要求1所述的化合物，其具有選自由以下組成的組的結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>其中，對于每個結構和在每個實例中，(n)獨立地為4至1500的整數(shù)，且(F9)為含胺的IX因子部分的殘基。7.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其具有以下結構其中，(F9)為含胺的IX因子部分的殘基并且在每個實例中，(n)獨立地為4至1500。8.根據(jù)權利要求1所述的化合物，其具有以下結構其中，(F9)為含胺的IX因子部分的殘基并且在每個實例中，(n)獨立地為4至1500。9.根據(jù)權利要求7和權利要求8之一所述的化合物，其中所述IX因子部分為人重組IX因子。10.—種方法，其包括在適于形成聚合物試劑與生物活性劑之間的共價連接的條件下使所述聚合物試劑與含胺的IX因子部分接觸，其中所述聚合物試劑具有以下結構^^^p-CH2CHr(OCH2CH2""OCH3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中P0I^為第一水溶性聚合物；P0I^為第二水溶性聚合物；X〗為第一間隔基部分；X、為第二間隔基部分；H。為可電離的氫原子；t為H或有機基；R2為H或有機基；(a)為0或1;(b)為0或1;R"當存在時，為第一電子改變基團；R"當存在時，為第二電子改變基團；且(FG)為能與活性劑的氨基反應以形成可釋放的鍵合的官能團。11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述可釋放的鍵合為氨基甲酸酯鍵合。12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述聚合物試劑具有選自由以下組成的組的結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中，對于每個結構和在每個實例中，(n)獨立地為4至1500的整數(shù)。13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中IX因子部分為人重組IX因子。14.一種組合物，其包括權利要求1至9中任一項所述的化合物和藥學上可接受的賦形劑。15.—種方法，其包括施用權利要求14所述的組合物至患者。全文摘要本發(fā)明提供了具有可釋放的鍵合的IX因子部分-聚合物軛合物。還提供了制備軛合物的方法、用于施用軛合物的方法。文檔編號A61P7/00GK101588819SQ200780048279公開日2009年11月25日申請日期2007年12月27日優(yōu)先權日2006年12月27日發(fā)明者G·史蒂芬森,M·J·博薩德申請人:尼克塔治療亞拉巴馬公司