專利名稱：：免疫親和素配體以及調(diào)節(jié)免疫親和素和鈣通道活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：無
背景技術(shù)：
：鈣經(jīng)由電壓門控鈣通道進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞中將介導(dǎo)多種細(xì)胞和生理反應(yīng)，包括興奮-收縮偶聯(lián)、激素分泌和基因表達(dá)(米勒(Miller)爭乂，(1987)與學(xué)(Sc/e"")235:46-52;奧古斯汀(Augustine)爭乂，(1987)淨(jìng)經(jīng)^"統(tǒng)學(xué)伊述64""w,7Vewmy"J10:633-93)。鈣通道直接影響到膜電位并有助于神經(jīng)元的不同電學(xué)特性。鈣進(jìn)入通過調(diào)控鈣依賴性離子通道并調(diào)節(jié)諸如蛋白激酶C和鈣調(diào)蛋白(calmodulin)依賴性蛋白激酶II等鈣依賴性酶的活性而進(jìn)一步影響神經(jīng)元功能。突觸前神經(jīng)末梢的鈣濃度的增加通常會引起神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并增加鈣通道活性。所述鈣增加已涉及多種人類病癥，包括(但不限于)神經(jīng)病癥和心臟病癥(例如，先天性偏頭痛、小腦性共濟(jì)失調(diào)、心絞痛、癲癇、高血壓、局部缺血和一些節(jié)律失常)。考慮到電壓門控鈣通道在生理學(xué)和病理學(xué)功能方面的廣泛作用，仍需要鑒別新穎鈣通道活性調(diào)節(jié)劑并了解其作用機(jī)制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明揭示調(diào)節(jié)免疫親和素和鈣通道活性的方法和組合物。在一個實施例中，已顯示，在雷帕霉素(rapamycin)mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾的免疫親和素配體能降低FKBP52和電壓門控L型鈣通道、尤其L型鈣通道的pi亞基的活性。經(jīng)證實，所述活性降低與神經(jīng)突起生長和神經(jīng)元存活的伴隨增加相關(guān)聯(lián)。在不受理論束縛的情況下，相信FKBP52和通道活性的降低至少部分是經(jīng)由形成包括免疫親和素配體；免疫親和素(例如FKBP52)和/或L型鈣通道(31亞基中的一者或兩者的復(fù)合物而發(fā)生。因此，本發(fā)明提供使用免疫親和素配體(例如，在mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾的免疫親和素配體)來調(diào)節(jié)(例如，抑制、減弱和/或降低)免疫親和素和/或L型鈣通道p亞基的活性的方法。在其它方面，還揭示治療或預(yù)防例如神經(jīng)變性病癥和心血管病癥等與鈣通道功能障礙有關(guān)的病況的方法。另外，本發(fā)明涵蓋鑒別調(diào)節(jié)免疫親和素和/或鈣通道亞基的活性的化合物的方法和試劑。一方面，本發(fā)明提供一種經(jīng)純化復(fù)合物，其包括免疫親和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素(meridamycin)類似物(例如，已知或未知類似物))，以及(i)免疫親和素或其功能性變異體，和/或(ii)鈣通道亞基或其功能性變異體中的一者或兩者。因此，本發(fā)明的例示性復(fù)合物可包括免疫親和素配體和免疫親和素或其功能片段；免疫親和素配體和鈣通道亞基或其功能性變異體；以及免疫親和素配體、免疫親和素或其功能性變異體和鈣通道亞基或其功能性變異體。應(yīng)了解，本發(fā)明的復(fù)合物還可包括其它多肽或其片段。在一個實施例中，雷帕霉素類似物是在雷帕霉素的mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾，例如，在雷帕霉素主鏈的l位和4位具有雜原子取代基(參看圖1A)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物在雷帕霉素主鏈的l位、2位、3位和/或4位具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物具有如本文中所述的化學(xué)式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物具有在本文中稱為"雷帕霉素I"和"雷帕霉素II"(圖1A)(在本文中也分別稱為"化合物r和"化合物ir)的化合物的結(jié)構(gòu)。在其它實施例中，相對于其它免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP12)，免疫親和素配體以一定選擇性結(jié)合例如FKBP-52等免疫親和素，所述選擇性比雷帕霉素的選擇性高至少100、200、300、400、500、600、700、800倍或更高。在各實施例中，免疫親和素為FK506結(jié)合蛋白，例如FKBP52(例如哺乳動物FKBP52)或其功能性變異體。在其它實施例中，鈣通道亞基為電壓門控L型鈣通道亞基，例如pi亞基(例如哺乳動物卩l(xiāng)亞基)或其功能性變異體。本文所述多肽的功能性變異體包括保留未經(jīng)修飾形式的一種或多種活性(例如，保留結(jié)合免疫親和素配體和/或形成如本文所述的復(fù)合物的能力)的片段、突變形式、融合蛋白、經(jīng)標(biāo)記形式(例如放射性標(biāo)記)。盡管出于閱讀的便利，短語"其功能性變異體"可能在全文中重復(fù)出現(xiàn)或可能并未重復(fù)出現(xiàn)，但術(shù)語"免疫親和素"和"鈣通道"等仍包括"其功能性變異體"。另一方面，本發(fā)明提供一種鑒別測試化合物(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)的方法或分析，所述測試化合物能與(i)免疫親和素(例如，如本文所述的免疫親和素(例如FKBP52))(或其功能性變異體)和/或(ii)鈣通道亞基(例如，如本文所述的鈣通道亞基(例如P1亞基))(或其功能性變異體)相互作用(或結(jié)合)，和/或調(diào)節(jié)(例如，降低或增加)其活性。所述方法或所述分析包括使免疫親和素和/或鈣通道亞基與測試化合物在允許發(fā)生相互作用和/或活性調(diào)節(jié)的條件下接觸；檢測在存在測試化合物的情況下免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用和/或活性相對于參考物(例如，參考樣本，例如未暴露于測試化合物的對照樣本或暴露于雷帕霉素的對照樣本)的變化。在存在測試化合物的情況下，免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用水平和/或活性相對于參考物的變化(例如，增加或降低)表明，所述測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基相互作用和/或影響(例如，增加或降低)其活性。在各實施例中，測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基中的一者或兩者的相互作用是通過形成復(fù)合物(例如，以下一者或多者的復(fù)合物測試化合物與免疫親和素；測試化合物與f丐通道亞基；或測試化合物、免疫親和素與鈣通道亞基)來檢測。在存在測試化合物的情況下，所述復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性相對于參考物的變化表明，所述測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基中的一者或兩者相互作用。另一方面，本發(fā)明提供一種鑒別神經(jīng)營養(yǎng)和/或神經(jīng)保護(hù)化合物的方法或分析。所述方法或所述分析包括使(i)免疫親和素(例如，如本文所述的免疫親和素(例如FKBP52))(或其功能性變異體)和/或(ii)鈣通道亞基(例如，如本文所述的鈣通道亞基(例如(31亞基))(或其功能性變異體)與測試化合物在允許發(fā)生相互作用和/或活性調(diào)節(jié)的條件下接觸；檢測在存在測試化合物的情況下免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用和/或活性相對于參考物(例如，參考樣本，例如未暴露于測試化合物的對照樣本或暴露于雷帕霉素的對照樣本)的變化。在存在測試化合物的情況下，免疫親和素和/或鈣通道亞基相對于參考物的相互作用水平的增加和/或活性降低將指示潛在神經(jīng)營養(yǎng)和/或神經(jīng)保護(hù)化合物。在各實施例中，測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用的增加是通過兩種或兩種以上上述組分的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性的增加來檢測。在其它實施例中，活性降低是通過檢測鈣通道活性的降低(例如，如本文中更詳細(xì)描述)來確定。可例如通過測量糖皮質(zhì)激素受體活化來檢測免疫親和素活性的降低。上述篩選方法和分析的其它實施例可包括以下一個或多個特征在各實施例中，免疫親和素和/或鈣通道亞基存在于樣本中。所述樣本可為細(xì)胞溶解產(chǎn)物或重構(gòu)系統(tǒng)(例如，細(xì)胞膜或可溶組分)?；蛘撸鰳颖究砂ㄅ囵B(yǎng)(例如，純化培養(yǎng))的細(xì)胞，或重組細(xì)胞，或動物個體的活體內(nèi)細(xì)胞。測試化合物或神經(jīng)營養(yǎng)化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用和/或活性的變化可通過檢測以下一種或多種變化來確定例如通過生物化學(xué)檢測、基于親和力的檢測(例如，蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot)、親和柱)、免疫沉淀、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的分析、分光光度方式(例如，圓二色譜、吸光度和溶液特性的其它測量法)檢測的復(fù)合物本身的結(jié)合或?qū)嶋H形成的變化；例如鈣依賴性磷酸化和/或轉(zhuǎn)錄活性(例如，如本文所述的轉(zhuǎn)錄譜)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化，例如增加或降低；鈣通道活性(例如，電生理學(xué)活性、鈣動力學(xué))的變化，例如增加或降低；和/或神經(jīng)元存活、分化和/或神經(jīng)突起生長的變化，例如增加或降低。在一個實施例中，鑒別測試化合物或神經(jīng)營養(yǎng)化合物并以相同或不同分析再測試。舉例來說，以活體外或無細(xì)胞系統(tǒng)鑒別測試化合物或神經(jīng)營養(yǎng)化合物，并且以動物模型或基于細(xì)胞的分析進(jìn)行再測試?？墒褂萌魏畏治龃涡蚧蚪M合。舉例來說，可將高通量分析與動物模型或組織培養(yǎng)組合使用。在其它實施例中，所述方法或分析包括提供基于接近程度依賴性信號產(chǎn)生的步驟，例如包括第一融合蛋白(例如，包含免疫親和素部分的融合蛋白)和第二融合蛋白(例如，包含(3亞基部分的融合蛋白)的雙雜交分析；使雙雜交分析與測試化合物在一定條件下接觸，其中所述雙雜交分析檢測復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性的變化，例如，復(fù)合物的形成將起始報告基因的轉(zhuǎn)錄活化。在其它實施例中，所述方法或分析進(jìn)一步包括以下步驟使免疫親和素和/或鈣通道亞基與巳知的免疫親和素配體(例如，如本文所述，在雷帕霉素的mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾的雷帕霉素類似物)接觸；檢測在不存在或存在測試化合物的情況下，己知的免疫親和素配體與免疫親和素和/或鈣通道亞基的相互作用和/或活性。在存在或不存在測試化合物的情況下，免疫親和素和/或鈣通道亞基的結(jié)合(例如，復(fù)合物形成)和/或活性的變化將指示，所述測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基相互作用和/或結(jié)合。在其它實施例中，所述方法或分析進(jìn)一步包括以下步驟將測試化合物與復(fù)合物的結(jié)合與已知的免疫親和素配體與復(fù)合物的結(jié)合相比較。另外，所述方法或分析可任選包括檢測相對于測試化合物與個別組分的相互作用，測試化合物與免疫親和素和/或鈣通道亞基的復(fù)合物的相互作用(例如，結(jié)合)。在一些實施例中，所述方法另外包括評估神經(jīng)元活性(例如，神經(jīng)元存活、分化和/或神經(jīng)突起生長中的一者或多者)的變化(例如，增加或降低)的步驟。神經(jīng)元存活、分化和/或神經(jīng)突起生長中的一者或多者的增加將指示神經(jīng)營養(yǎng)和/或神經(jīng)保護(hù)化合物。評估步驟可在培養(yǎng)的細(xì)胞或如本文所述的動物模型中進(jìn)行。候選測試化合物或神經(jīng)營養(yǎng)化合物能增加本文所述的復(fù)合物的形成，和/或抑制鈣通道或免疫親和素活性。在一個實施例中，測試化合物以比結(jié)合復(fù)合物的個別組分的親和力高的親和力結(jié)合復(fù)合物。測試化合物或神經(jīng)營養(yǎng)化合物可為天然產(chǎn)物或化學(xué)合成的化合物。舉例來說，測試化合物可為從天然存在或經(jīng)修飾(例如，重組修飾)的原核生物(例如，放射菌類(Actinomycete)，諸如絰霉葳(5^^om;K")，例如級水絰霉^"(S./^gra^o內(nèi)c^))或真核生物(例如，真菌或哺乳動物)細(xì)胞獲得的聚酮。在各實施例中，測試化合物為雷帕霉素或美立霉素，或其類似物(例如，本文所述的雷帕霉素或美立霉素化合物，或其類似物)。本文所揭示和/或通過本文所述的方法或分析鑒別的化合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還揭示包括本發(fā)明的化合物和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的組合物，例如醫(yī)藥組合物。在一個實施例中，所述組合物包括本發(fā)明的化合物與一種或多種藥劑(例如，治療劑)的組合。在一個實施例中，第二藥劑為鈣通道拮抗劑，例如L型鈣通道拮抗劑。L型鈣通道拮抗劑的實例包括二氫吡啶、苯基垸基胺和苯并硫氮雜卓二苯基丁基哌啶類抗精神分裂癥神經(jīng)安定藥。在某些實施例中，所投與的在組合物中存在的免疫親和素配體和/或鈣通道拮抗劑的量低于單獨(dú)投與的組合物中存在的藥物的量。另一方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，其包含一個或多個編碼本文所揭示的復(fù)合物的一種或多種多肽成分的核酸。在一個實施例中，宿主細(xì)胞含有第一核酸，其包括編碼免疫親和素(例如FKBP52，例如哺乳動物FKBP52)(或其功能性變異體)的核苷酸序列；和/或第二核酸，其包括編碼電壓門控L型鈣通道亞基(例如(31亞基，例如哺乳動物pl亞基)(或其功能性變異體)的核苷酸序列。在一些實施例中，重組免疫親和素和鈣通道亞基和/或其控制調(diào)控序列是通過外源方式添加。另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合本文所揭示的復(fù)合物的抗體，或其抗原結(jié)合片段。在某些實施例中，抗體或其片段能增加本文所揭示的復(fù)合物的形成。在其它實施例中，抗體或其片段能減少或抑制本文所揭示的復(fù)合物的形成。在一個實施例中，抗體或其片段選擇性結(jié)合復(fù)合物，但不會顯著結(jié)合復(fù)合物的個別組分。如本文所述，所述復(fù)合物可包括免疫親和素配體或測試化合物和免疫親和素和/或鈣通道。另一方面，本發(fā)明提供一種制造抗體或其抗原結(jié)合片段的方法。所述方法包括使用本文所述的復(fù)合物作為抗原(例如，動物模型或噬菌體呈現(xiàn)選擇中的免疫原)；和根據(jù)與復(fù)合物的結(jié)合，選擇抗體或其結(jié)合片段。所述方法可任選包括以下步驟確定抗體或其片段與復(fù)合物的結(jié)合；和比較抗體與所述復(fù)合物的個別組分或與含有所述復(fù)合物的三種組分的復(fù)合物的結(jié)合。優(yōu)選相對于個別組分或其復(fù)合物，選擇性結(jié)合所述復(fù)合物的抗體或其片段。另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)(例如降低)免疫親和素(或其功能性變異體)和/或鈣通道亞基(或其功能性變異體)的活性的方法。所述方法包括使(i)免疫親和素(例如，如本文所述的FKBP52)和/或(ii)鈣通道亞基(例如，如本文所述的pl亞基)中的一者或兩者與免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)在允許發(fā)生相互作用(例如結(jié)合)的條件下接觸。在各實施例中，活性的調(diào)節(jié)(例如增加)將指示包括免疫親和素配體以及免疫親和素和/或鈣通道亞基中的一者或兩者的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性。在一個實施例中，接觸步驟可在活體外，例如在細(xì)胞溶解產(chǎn)物或重構(gòu)系統(tǒng)中實現(xiàn)?；蛘?，可對培養(yǎng)(例如，活體外或離體)的細(xì)胞執(zhí)行本方法。舉例來說，可在活體外培養(yǎng)細(xì)胞(例如，純化或重組細(xì)胞)，并且可通過將免疫親和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素類似物)加入培養(yǎng)基中來實現(xiàn)接觸步驟。通常，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。在一些實施例中，所述細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞或心血管細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)(例如，抑制)細(xì)胞中的鈣通道活性(例如，電壓門控鈣通道活性)和/或免疫親和素活性的方法。所述方法包括使表達(dá)(i)免疫親和素(例如FKBP52，例如哺乳動物FKBP52)(或其功能性變異體)和/或(ii)電壓門控L型鈣通道亞基(例如pi亞基，例如哺乳動物(31亞基)(或其功能性變異體)的細(xì)胞與免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)在允許發(fā)生配體與免疫親和素和/或亞基中的一者或兩者的相互作用(例如，包括所述物質(zhì)的復(fù)合物的形成)的條件下接觸，由此抑制鈣通道和/或免疫親和素活性。通常，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。在一些實施例中，所述細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞或心血管細(xì)胞。所述方法可利用如本文所述的培養(yǎng)基中的細(xì)胞來進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明提供一種增加例如神經(jīng)突起生長和/或存活等祌經(jīng)元功能的方法。所述方法包括使神經(jīng)元細(xì)胞與足以促進(jìn)神經(jīng)元功能的量的免疫親和素配體接觸。在各實施例中，免疫親和素配體是以引起以下一種或多種作用的濃度存在(i)下調(diào)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中至少一種組分(例如，鈣流入通道、谷氨酸的N-甲基D-天冬氨酸亞型(NMDA)受體、纖溶酶原活化劑(PLAU)、SHT3R通道)的表達(dá)和/或活性；(ii)降低免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)的活性和/或表達(dá)；(iii)降低或抑制鈣通道(例如，L型鈣通道)的活性和/或表達(dá)；(iv)活化類固醇受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，糖皮質(zhì)激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo))；(v)誘導(dǎo)形成包括免疫親和素配體、免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)和/或電壓門控L型鈣通道亞基(例如卩l(xiāng)亞基)的復(fù)合物；和/或(vi)保護(hù)神經(jīng)元免于經(jīng)歷鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。另一方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防個體的與鈣通道功能障礙相關(guān)的病癥(例如，與L型鈣通道功能相關(guān)的病癥)的方法。在各實施例中，所述病癥與雷諾定受體離子通道病(ryanodinereceptorchannelopathy)無關(guān)。所述方法包括對個體投與足以治療或預(yù)防病癥的量的免疫親和素配體。在各實施例中，免疫親和素配體是以引起以下一種或多種作用的濃度存在(i)下調(diào)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中至少一種組分(例如，鈣流入通道、NMDA受體、纖溶酶原活化劑(PLAU)、SHT3R通道)的表達(dá)或活性；(ii)降低免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)的活性和/或表達(dá)；(iii)降低或抑制鈣通道(例如，L型鈣通道)的活性和/或表達(dá)；(iv)活化類固醇受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，糖皮質(zhì)激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo))；(V)誘導(dǎo)形成包括免疫親和素配體、免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)和/或電壓門控L型鈣通道亞基(例如卩l(xiāng)亞基)的復(fù)合物；和/或(vi)保護(hù)神經(jīng)元免于經(jīng)歷鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述調(diào)節(jié)活性和治療或預(yù)防病癥的方法的其它實施例可包括以下一個或多個特征。在一個實施例中，免疫親和素配體為在mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾，例如在雷帕霉素主鏈的1位和4位具有雜原子取代基(參看圖1A)的雷帕霉素類似物。在其它實施例中，雷帕霉素類似物在雷帕霉素主鏈的1位、2位、3位和/或4位具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物具有如本文中所述的化學(xué)式(例如，式I、Ia和/或Ib)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物具有在本文中稱為"雷帕霉素I"和"雷帕霉素II"的化合物的結(jié)構(gòu)(圖1A)。在其它實施例中，相對于其它免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP-12),免疫親和素配體以一定選擇性結(jié)合例如FKBP-52等免疫親和素，所述選擇性比雷帕霉素的選擇性高至少100、200、300、400、500、600、700、800或更高。在其它實施例中，可對個體(例如，作為活體內(nèi)(例如治療或預(yù)防)方案的一部分，或動物個體(例如，活體內(nèi)動物模型))中存在的細(xì)胞(例如，神經(jīng)元細(xì)胞)執(zhí)行所述方法。對于活體內(nèi)方法，可將單獨(dú)或與另一藥劑組合的免疫親和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素類似物)以足以形成復(fù)合物和/或使復(fù)合物穩(wěn)定的量投與罹患例如神經(jīng)變性病癥或心血管病癥等病癥的個體，例如哺乳動物。在一些實施例中，例如在對個體投藥之前，可通過在活體外測試引起以下一種或多種作用所需的免疫親和素配體的量來確定治療量或劑量(i)誘導(dǎo)復(fù)合物形成；(ii)下調(diào)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中至少一種組分的表達(dá)或活性；(iii)降低或抑制鈣通道(例如，L型鈣通道)的活性；和/或(iv)活化類固醇受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，糖皮質(zhì)激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo))?；铙w內(nèi)方法可任選包括以下步驟鑒別(例如，評估、診斷、篩選和/或選擇)有患一種或多種與鈣通道功能障礙的相關(guān)病癥(例如，與L型鈣通道功能有關(guān)的病癥)有關(guān)的癥狀的風(fēng)險或具有所述癥狀的個體。在各實施例中，所述病癥與雷諾定受體離子通道病無關(guān)。所述個體可為例如罹患神經(jīng)變性病癥或心血管病癥的哺乳動物，例如人類。在各實施例中，個體為具有一種或多種與鈣通道功能障礙的相關(guān)病癥(例如，與L型鈣通道功能有關(guān)的病癥)有關(guān)的癥狀的哺乳動物。在各實施例中，所述病癥與雷諾定受體離子通道病無關(guān)。舉例來說，個體為罹患選自以下一者或多者的病癥的哺乳動物(例如，人類患者)中風(fēng)、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、癲癇、心絞痛、心律失常和局部缺血。在其它實施例中，所述個體為罹患以下一種或多種病癥的哺乳動物偏頭痛、神經(jīng)性疼痛、急性疼痛、情緒障礙、精神分裂癥、抑郁癥、焦慮癥、小腦性共濟(jì)失調(diào)、遲發(fā)性運(yùn)動障礙、高血壓和/或尿失禁?？蓪⒚庖哂H和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素類似物)單獨(dú)或與一種或多種藥劑(例如治療劑)組合投與個體。在一個實施例中，第二藥劑為鈣通道拮抗劑，例如L型鈣通道拮抗劑。L型鈣通道拮抗劑的實例包括二氫吡啶、苯基垸基胺和苯并硫氮雜卓二苯基丁基哌啶類抗精神分裂癥神經(jīng)安定藥。在某些實施例中，組合投與的免疫親和素配體和/或鈣通道拮抗劑的量低于單獨(dú)投與的藥物的量。所述藥劑可同時或依次投與。另一方面，本發(fā)明提供一種刺激神經(jīng)元細(xì)胞(例如，多巴胺能、膽堿能、皮層和脊髓神經(jīng)元細(xì)胞)的神經(jīng)突起生長、存活和/或分化中的一者或多者的方法。所述方法包括使細(xì)胞與免疫親和素(例如FKBP52)和/或鈣通道卩亞基(例如，電壓門控L型鈣通道Pl亞基)的拮抗劑接觸。所述拮抗劑也可為免疫親和素(例如FKBP52)或鈣通道(3亞基的活性和/或表達(dá)的抑制劑。在一個實施例中，抑制劑為鈣通道的細(xì)胞內(nèi)拮抗劑，例如鈣通道(3亞基的拮抗劑。在另一實施例中，所述拮抗劑為免疫親和素配體，例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物。通常，免疫親和素配體是以足以形成包括配體、免疫親和素(或其功能性變異體)和/或鈣通道亞基(或其功能性變異體)的復(fù)合物和/或使所述復(fù)合物穩(wěn)定的量投與。在其它實施例中，所述拮抗劑為免疫親和素(例如FKBP52)和/或鈣通道p亞基的轉(zhuǎn)錄抑制劑，例如RNAi。如本文所述，可在活體外(例如，在培養(yǎng)過程中)或在活體內(nèi)(例如，通過投與個體)來實現(xiàn)接觸步驟。如本文所使用，冠詞"一"("a"和"an")是指所述冠詞的一個或一個以上(例如，至少一個)語法主體。除非上下文中另作清楚指示，否則術(shù)語"或"在本文中用于指術(shù)語"和/或"，并且可與術(shù)語"和/或"互換使用。術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文中可互換使用。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢將根據(jù)實施方式和圖式以及權(quán)利要求而變得顯而易見。圖1A提供雷帕霉素類似物I和II(在圖式(和全文)中可分別互換稱為"1"和"2"，或"化合物l"和"化合物2")的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)圖。還提供使用本文所參考的編號系統(tǒng)的雷帕霉素結(jié)構(gòu)。圖1B提供描述皮層神經(jīng)元中神經(jīng)元存活響應(yīng)雷帕霉素類似物I(在圖式中稱為"化合物1")而得到促進(jìn)的柱狀圖。圖1C提供描述皮層神經(jīng)元中神經(jīng)突起響應(yīng)雷帕霉素類似物I(在圖式中稱為"化合物1")而生長的圖。圖1D提供描述F-ll細(xì)胞中神經(jīng)突起響應(yīng)雷帕霉素類似物I(在圖式中稱為"化合物1")而生長的圖。圖2提供展示若干雷帕霉素類似物I、II、FK506以及雷帕霉素的親和基質(zhì)的制備的圖。圖3提供通過由Fll細(xì)胞(小鼠胚胎神經(jīng)母細(xì)胞瘤與大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元的融合物)的溶解產(chǎn)物親和沉淀而分離的蛋白質(zhì)的移動性的SDS-PAGE凝膠照片。圖4提供經(jīng)胰蛋白酶消化的SDS-PAGE凝膠譜帶的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometric，F(xiàn)T-ICR-MS)分豐斤。"Rap.An.I"表示雷帕霉素類似物I。圖5A-5D描述雷帕霉素類似物I和II的免疫親和素結(jié)合特征。圖5A提供與各種親和基質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠分析。標(biāo)記泳道中所見的譜帶為(1)220kDa、(2)78kDa、(3)45.7kDa;在雷帕霉素類似物I下拉部分(pull-downfraction)中為(4)肌球蛋白(Myosin),(5)FKBP52、(6)CACNBl、FKBP25和FKBP12;在空白珠粒對照中為(7)肌動蛋白；且在雷帕霉素類似物II下拉部分中為(5)FKBP52禾n(6)CACNBl。"化合物1"表示雷帕霉素類似物I，并且"化合物n"表示雷帕霉素類似物n。圖5B提供使用抗FKBP52和抗Ca"通道^亞基抗體進(jìn)行的用于檢測涂有雷帕霉素類似物I和FK506的親和珠粒上相應(yīng)抗原的存在的蛋白質(zhì)免疫印跡分析。圖5C為描述測量結(jié)合純重組免疫親和素和親環(huán)素(cycl叩hilin)的["C]-1部分的尺寸排阻色譜的結(jié)果的柱狀圖。圖5D為描述測試FKBP25和PPID蛋白與化合物2的結(jié)合的親和色譜的結(jié)果的圖。泳道標(biāo)記如下"C"表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；"+"表示與含化合物2的珠粒一起培育的蛋白質(zhì)；"_"表示與空白珠粒一起培育的蛋白質(zhì)。圖6A-6D描述化合物I和II與L型鈣通道卩亞基的結(jié)合特征。圖6A描述使用相應(yīng)抗體進(jìn)行的關(guān)于存在CACNBl的部分的蛋白質(zhì)免疫印跡分析。圖6B為描述測量結(jié)合純重組CACBN1和CACBN4的["C]-1部分的尺寸排阻色譜的結(jié)果的柱狀圖。圖6C描述測量在化合物2(1^M)與CACNB1(0-8^M)結(jié)合后誘導(dǎo)的熒光淬滅的熒光分析的結(jié)果。圖6D描述測試CACNB1與化合物2的結(jié)合的親和色譜的結(jié)果。泳道標(biāo)記如下"C"表示蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；"+"表示與含化合物2的珠粒一起培育的蛋白質(zhì)；"-"表示與空白珠粒一起培育的蛋白質(zhì)。圖7提供使用抗FKBP52抗體沉淀的暴露于各種濃度的雷帕霉素類似物I(0^M、5pM或50^M)的Fll細(xì)胞溶解產(chǎn)物的免疫共沉淀物的免疫印跡。用抗Ca^通道Pi亞基抗體進(jìn)行免疫沉淀的部分的免疫印跡。下圖提供概述蛋白質(zhì)相互作用的圖。"RAI"表示雷帕霉素類似物I。圖8提供描述使用神經(jīng)絲蛋白ELISA測定的各種濃度的雷帕霉素類似物I(50pM、5pM或0nM,)對Fll細(xì)胞的神經(jīng)突起生長的影響的柱狀圖。圖9A-9F描述化合物1和2對鈣電流的生物作用。圖9A為由在浸浴液中用5[iM化合物1、FK-506或媒劑處理2小時的F-ll細(xì)胞的全細(xì)胞記錄得到的平均Ca^電流密度的柱狀圖。記錄是用各情形中7個細(xì)胞來進(jìn)行。圖9B描述在0秒(底部跡線)、800秒(中間跡線)時內(nèi)部施用化合物l(移液管中10^M)的情況下且在外部存在L型Ca^通道阻斷劑BAY-K5552(頂部跡線)的情況下的代表性Ca^電流。圖9C描述圖9B中所述實驗的時程圖。全細(xì)胞及隨后化合物1擴(kuò)散到細(xì)胞中是在零時開始。在400秒后電流穩(wěn)定后，即在浸浴液中施用10pMBayK-5552。(n=3)圖9D描述與圖9C類似的情形，但在300秒后經(jīng)由浸浴液施用100nMcoCTXMVIIA。(n=2)圖9E描述在侵入全細(xì)胞(對照)后立即取得的以及在內(nèi)部施用10^M化合物2和外部施用wCTXGVIA的情況下記錄10分鐘后取得的海馬神經(jīng)元的C^+電流跡線。圖9F描述歸一化為海馬神經(jīng)元的初始電流的平均反應(yīng)(+/-SEM)。從零時開始，經(jīng)由記錄移液管內(nèi)部施用化合物2UOpM)，其中指示為"和T)。外部溶液含有l(wèi)pMTTX+100nMcoCTXGVIA+10)xMBAY-K5552(▼，n=4)，或1|aMTTX+100nMcoCTXGVIA(，n=5)。無化合物的對照(■)含有外部施用的100nMcoCTXGVIA(n=3)。圖10A提供描述siRNA驅(qū)動的FKBP52和CACNB1減少對神經(jīng)突起生長的影響的圖。圖10B提供描述siRNA驅(qū)動的FKBP52禾nCACNBl減少對神經(jīng)元存活的影響的圖。圖IOC展示蛋白質(zhì)免疫印跡，其證實siRNA處理在24小時后減少皮層神經(jīng)元中核纖層蛋白(lamin)A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表達(dá)。圖11A-11B提供人(^2+通道^亞基同功異形體1的氨基酸序列和核苷酸序列(分別為SEQIDNO:1-2)。圖11C-llD提供人C^+通道^亞基同功異形體2的氨基酸和核苷酸序列(SEQIDNO:3-4)。圖11E-llF提供人C^+通道(3i亞基同功異形體3的氨基酸和核苷酸序列(SEQIDNO:5-6)。圖11G-11H提供小鼠(小家鼠/m^cw/M))Ca^通道p!亞基同功異形體A的氨基酸和核苷酸序列(SEQIDNO:7-8)。圖111-11J提供小鼠(小家鼠)Ca"通道&亞基同功異形體B的氨基酸序列(SEQIDNO:9-10)。圖12A-12B提供人FKBP52的氨基酸和核苷酸序列(SEQIDNO:11-12)。圖12C-12D提供小鼠(小家鼠)FKBP52的氨基酸序列(SEQEDNO:13-14)。具體實施例方式本發(fā)明至少部分是基于以下發(fā)現(xiàn)免疫親和素配體(例如，在mTOR結(jié)合區(qū)經(jīng)修飾的雷帕霉素類似物)與免疫親和素FKBP52和/或電壓門控L型鈣通道卩l(xiāng)亞基相互作用，例如結(jié)合。通過這些化合物抑制FKBP52和/或CACNBl將刺激神經(jīng)突起生長和/或神經(jīng)元存活。因此，相信這些組分之間的相互作用(和復(fù)合物形成)能抑制PI亞基的活性，并刺激神經(jīng)突起生長，從而暗示諸如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物等免疫親和素配體所展現(xiàn)的對于電壓門控L型鈣通道的某種神經(jīng)營養(yǎng)和/或神經(jīng)保護(hù)活性。另外，申請者已在隨附實例中展示，至少一種本文所揭示的免疫親和素配體(雷帕霉素類似物II)展示相對于FKBP12結(jié)合對FKBP52的結(jié)合選擇性明顯增加，比雷帕霉素高至少600倍。在不受理論束縛的情況下，相信抑制FKBP52活性將可能通過活化類固醇(例如糖皮質(zhì)激素受體)來介導(dǎo)神經(jīng)突起生長。此外，用本文所揭示的免疫親和素配體處理皮層神經(jīng)元會引起鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的全面下調(diào)以及L型鈣通道的部分抑制。也通過選擇性降低培養(yǎng)過程中Pl亞基和FKBP52的表達(dá)來檢測對于神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突起生長的明顯作用。本文所揭示的資料表明，在mTOR結(jié)合區(qū)對雷帕霉素進(jìn)行修飾可明顯提供對于FKBP52具有獨(dú)特選擇性且具有有效神經(jīng)營養(yǎng)活性的非免疫抑制性化合物。如通過在FKBP52siRNA處理的皮層神經(jīng)元中所觀察到的神經(jīng)突起生長所證實，F(xiàn)KBP52似乎可能通過活化類固醇受體(包括糖皮質(zhì)激素受體)來介導(dǎo)免疫親和素配體介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長。另外，這些雷帕霉素類似物部分抑制L型C^+通道并降低各種C^+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)錄的能力表明，這些類似物能保護(hù)神經(jīng)元免于經(jīng)歷C^+誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，這與其對神經(jīng)元存活的影響相符。鈣通道存在于包括神經(jīng)元和心血管組織在內(nèi)的各種組織中，并且在動物的多個重要過程中具有重要作用，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮、起搏活動以及激素和其它物質(zhì)的分泌。鈣經(jīng)由電壓門控鈣通道進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞中將介導(dǎo)多種細(xì)胞和生理反應(yīng)，包括(但不限于)調(diào)節(jié)諸如蛋白激酶C和鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II等鈣依賴性酶的活性；控制膜電位并引起諸如興奮性和反復(fù)觸發(fā)模式(repetitivefiringpattern)等電學(xué)特性；和增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。這些過程都涉及到人類病癥，諸如神經(jīng)病癥和心血管病癥。因此，如本文中較詳細(xì)描述，通過形成免疫親和素-鈣通道復(fù)合物來抑制電壓依賴型鈣通道的功能的方法可用于治療、預(yù)防和/或緩解鈣通道病癥的癥狀。為了能更易于了解本發(fā)明，本文和實施方式通篇將較為詳細(xì)地描述某些術(shù)語。鈣通道為允許C^+離子從細(xì)胞外液受控進(jìn)入細(xì)胞中的跨膜多亞基蛋白質(zhì)。最常見的鈣通道類型為電壓依賴型。動物體內(nèi)諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元、周圍神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞(包括骨骼肌、心肌以及靜脈和動脈平滑肌細(xì)胞)等"可興奮"細(xì)胞具有電壓依賴型鈣通道。電壓門控鈣通道允許Ca^離子流入細(xì)胞中，并且通常需要去極化以使具有所述通道的細(xì)胞內(nèi)側(cè)與浸泡細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境之間的電位差達(dá)到某種程度。根據(jù)電壓門控鈣通道的電生理學(xué)和藥理學(xué)特性，已將其分為L-、N-、P/Q-、R-和T型(評述于凱特蘿(Catterall),2000;霍格納德(Huguenard)1996;多芬A.C.(Dolphin,A.C.)(2003)藥理學(xué)評述(P/^nwaco/og/ca/iev/ews)55:607-627中)。L陽、N-和P/Q型通道可在正電位(高電壓門控)處活化。T型(或低電壓門控)通道描述一大類在負(fù)電位處瞬時活化且對靜息電位的變化高度敏感的分子。高電壓門控鈣通道是由四種不同的多肽構(gòu)成on、(X25、l3和Y(斯蒂(Stea)等人，1994;凱特蘿(Catterall),2000中評述)。|3亞基(本文中也稱為"CACB1")為由至少四種已知的單獨(dú)基因編碼的可溶性細(xì)胞內(nèi)蛋白，所述基因各自加工成多個剪接變異體。在各實施例中，P亞基具有以下一個或多個特征(i)天然存在的哺乳動物(例如，人類或嚙齒動物)pl亞基的氨基酸序列或其片段，例如，如圖11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)或其片段；(ii)與圖11A-中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)實質(zhì)上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳動物(例如，人類或嚙齒動物)Pl亞基核苷酸序列或其片段編碼的氨基酸序列，例如由如圖11A-11J中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:1-10)或其片段編碼的氨基酸序列；(iv)由與圖11A-11J中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:1-10)或其片段實質(zhì)上同源的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(v)由天然存在的Pl亞基核苷酸序列的簡并核苷酸序列或其片段(例如，圖11A-11J中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:1-10)或其片段)編碼的氨基酸序列；或(vi)在嚴(yán)格條件(例如，高嚴(yán)格度條件)下與上述核苷酸序列中的一種序列雜交的核苷酸序列。在一些實施例中，(3亞基或其功能性變異體(例如片段)展現(xiàn)天然存在的序列的一種或多種活性，包括(但不限于)(i)形成如本文所述的復(fù)合物；(ii)與a亞基相互作用(例如，結(jié)合)；(iii)促進(jìn)電壓門控鈣通道(例如ai亞基)定位或穿梭到細(xì)胞質(zhì)膜；(iv)調(diào)節(jié)所述通道的門控(例如，改變活化和失活動力學(xué)，引起I-V曲線向左移動，和在單通道水平上，誘導(dǎo)通道開放可能性的增加)；或(v)控制一種或多種本文所述的基因(例如，鈣流入通道、NMDA受體、纖溶酶原活化劑(PLAU)、SHT3R通道)的轉(zhuǎn)錄活性。在其它實施例中，卩亞基具有與以下文獻(xiàn)中所揭示的序列實質(zhì)上一致的序列鮑威爾(Powers)等人，(1992)生物化學(xué)雜志U別o/.C&附.)267(32):22967-22972;柯林(Collin)等人，(1993)循環(huán)研究雜志(0>c.M)72(6):1337-1344;霍根K.(Hogan,K.)等人，(1999)辦經(jīng)辨學(xué)遞訪(jVewmycz'.)277(2)，111-114;弗維爾(Foell)等人，(2004)生理學(xué)與基因組學(xué)(尸w'o/.Ge畫/")17(2),183-200(人類(31和(32亞基)；托貝(Toba)等人，(2005)歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志7Ve薩c/.)22(1),79-92(鼠科卩l(xiāng)亞基同功異形體)；謝里科夫(Serikov)等人，(2002)生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究(歷oc&m.5/op/z,MOm麵.)293(5),1405-1411;浦瑞南(Pragnell)等人，(1991)歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)盟通訊(尸五AS丄e".)291(2),253-258;卡西爾(Cahill)等人，(2000)神經(jīng)科學(xué)雜志(,TVewmycO20(5),1685-1693(2000)(牛卩l(xiāng)、2和3亞基)；羅森菲爾德(Rosenfeld)等人，(1993)神經(jīng)學(xué)年鑒(4"".iVewra/.)33(1),113-120;塔韋奧克(Taviaux)等人，(1997)人類遺傳學(xué)(Hw附.100(2),151-154(人類p2和|34亞基基因)；柯利拉菲特(Colecraft)等人，(2002)生理學(xué)雜志(J.P/^z'o/.)(倫敦(Lond.))541(第2部分)，435-452(人類卩2a、2c、2d和2e亞基)；奧帕托瓦斯基(Opatowsky)等人，(2003)生物化學(xué)雜志(/飾/.C/z綴)278(52),52323-52332(大鼠卩2亞基)；雅瑪達(dá)(Yamada)等人，(2001)生物化學(xué)雜志U腸/.C/z緩)276(50),47163-47170(2001)(大鼠卩2亞基)；斯特勞斯伯格(Strausberg)等人，(2002)美國國家科學(xué)院院刊(iWAS(/.S.A)99(26),16899-16903(人類(33亞基、鼠科(34亞基)；村上(Murakami)等人，(1996)歐洲生物化學(xué)雜志(￡w./5foc/ze附.)236(1),138-143(1996)(鼠科鈣通道卩3亞基)；雅瑪達(dá)(Yamada)等人，(1995)基因組學(xué)(Ge"ow/)27(2),312-319(人類鈣通道al亞基(CACNL1A2)和卩亞基(CACNLB3)基因)；陳(Chen)等人，(2004)自然(Nature)429(6992)，675-680(人類|34亞基)；海爾頓(Helton)等人，(2002)神經(jīng)科學(xué)雜志(乂iVewYwc/.)22(5),1573-1582(2002)(卩4亞基)；貝都(Badou)等人，(2005)科學(xué)(S"'匿e)307(5706),117-121(2005)(鈣通道(34亞基)；所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式并入本文中。其它(3亞基序列揭示于基因庫登錄號NP..666235、Q9Y698、Q02641、Q9MZL3和P54288—2中。免疫親和素為可溶性胞漿蛋白，其與免疫親和素配體形成復(fù)合物，而所述復(fù)合物又充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中所涉及的其它細(xì)胞靶的配體。免疫親和素的種類包括親環(huán)素和FK506結(jié)合蛋白(例如，F(xiàn)KBP)，諸如FKBP-12禾PFBBP-52。環(huán)孢菌素A(CyclosporinA)是結(jié)合親環(huán)素的大環(huán)內(nèi)酯類免疫親和素配體。應(yīng)了解，諸如美立霉素、FK506、FK520和雷帕霉素等其它大環(huán)內(nèi)酯類免疫親和素配體也結(jié)合FKBP。FK506、FK520和雷帕霉素與FKBP的結(jié)合通常是通過聚酮分子的結(jié)構(gòu)類似的區(qū)段(稱為"FKBP結(jié)合結(jié)構(gòu)域")發(fā)生。己在人類基因組中發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于超過兩打FKBP的基因序列(道南(Doman)等人，醫(yī)藥化學(xué)當(dāng)前論題(Cwr.7bp.C/zew.)3,1392-1409(2003))。這些基因序列在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)組織中的表達(dá)比在免疫組織中高10-50倍(萊昂斯(Lyons)等人，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.A^wocO15,2985-2994(1995))，并且在神經(jīng)疾病發(fā)作后，這些序列的表達(dá)也會增加(紀(jì)平(Kihira)等人，神經(jīng)病理學(xué)(A^wra;^Ao/ogv)22,269-274(2002))。有趣的是，據(jù)報導(dǎo)，F(xiàn)KBP12、FKBP12.6和FKBP52都為通道門控FKBP蛋白，其調(diào)節(jié)雷諾定受體(RYR)(黃(Huang)等人，美國國家科學(xué)院院刊(iVoc.Ato/.乂cad.Sci.C/&4.)103,3456-3461(2006))、肌醇1,4,5-三磷酸受體(IP3R)(卡梅隆(Cameron)等人，美國國家科學(xué)院院刊(iVoc.Ato/.^cadOSA)92,1784-1788(1995))和瞬時受體電位通道(TRPC)(辛金斯(Sinkins)等人，生物化學(xué)雜志(/.祝o/.C/2em.)279,34521-34529(2004))。FKBP52和FKBP51與介導(dǎo)雌激素、雄激素和糖皮質(zhì)激素下游反應(yīng)的三類類固醇受體復(fù)合物締合(斯泰納(Steiner)等人，美國國家科學(xué)院院刊(Prac.胸/.v4cadSc,'.園.)94,2019-2024(1997))。核FKBP25經(jīng)由與組蛋白去乙酰酶、酪蛋白激酶II、核仁素(nucleolin)和轉(zhuǎn)錄因子YY1締合來調(diào)控基因表達(dá)(姚(Yao)和楊(Yang),癌癥藥耙研究最新進(jìn)展(Cwr.OmcerTarge")5,595-610(2005))。FKBP38組成性失活并位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。有趣的是，F(xiàn)KBP38與Bcl-2結(jié)合需要高含量的&2+和鈣調(diào)蛋白(CaM)(埃德里奇(Edlich)等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(五MBOJ)24,2688-2699(2005))。免疫親和素配體通過破壞天然含F(xiàn)KBP復(fù)合物(古德(Gold)藥物代謝研究("wgMefa6.31,649-663(1999);埃德里奇(Edlich)等人，生物化學(xué)雜志(/所o/.C/zew.)281，14961-14970(2006))并通過形成諸如FKBP12-FK506-轉(zhuǎn)神經(jīng)素(calcineurin)或FKBP12-雷帕霉素-雷帕霉素的哺乳動物靶(mTOR)等新復(fù)合物(基辛格(Kissinger)等人，自然378,641-644(1995);崔(Choi)等人，科學(xué)(Sc/e"ce)273,239-42(1996))來引起各種下游生物活性。FKBP52是免疫親和素FK506結(jié)合種類的成員。FK506與糖皮質(zhì)激素受體(GR)相關(guān)FKBP52的結(jié)合導(dǎo)致響應(yīng)地塞米松(dexamethasone)而增加GR的核轉(zhuǎn)位以及GR介導(dǎo)的基因表達(dá)的增強(qiáng)(桑切斯(Sanchez)和寧(Ning)(1996)方法酶學(xué)方法指南(M"/oA:^Cow;"m'oMMe仇)9:188-200)。諸如FKBP52禾PCyP40等免疫親和素以及諸如PP5、p60和Mas70p等非免疫親和素蛋白具有一個或多個結(jié)合hsp90的三角四肽重復(fù)(TPR)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的TPR結(jié)構(gòu)域(拉塔伊恰克(Ratajczak)等人，(1993)生物化學(xué)雜志(/5z'o/.C/e附.)268:13187-13192)。蛋白質(zhì)中TPR結(jié)構(gòu)域的數(shù)量似乎與其hsp90結(jié)合親和力相關(guān)。鄰接TPR結(jié)構(gòu)域的區(qū)域也參與結(jié)合，例如FKBP52的殘基232-271(拉塔伊恰克(Ratajczak)和卡雷羅(Carrello)(1996),同上文)。在一些實施例中，免疫親和素具有以下一個或多個特征(i)天然存在的哺乳動物(例如，人類或嚙齒動物)FKBP52的氨基酸序列或其片段，例如，如圖12A-12D中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:11-14)或其片段；(ii)與圖12A-12D中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:11-14)實質(zhì)上同源的氨基酸序列或其片段；(iii)由天然存在的哺乳動物(例如，人類或嚙齒動物)FKBP52核苷酸序列或其片段編碼的氨基酸序列，例如由如圖12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:11-14)或其片段編碼的氨基酸序列；(iv)由與圖12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:11-14)或其片段實質(zhì)上同源的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(v)由天然存在的FKBP52核苷酸序列的簡并核苷酸序列或其片段(例如，圖12A-12D中所示的核苷酸序列(SEQIDNO:11-14)或其片段)編碼的氨基酸序列；或(vi)在嚴(yán)格條件(例如，高嚴(yán)格度條件)下與上述核苷酸序列中的一種序列雜交的核苷酸序列。在一些實施例中，F(xiàn)KBP52或其功能性變異體(例如片段)展現(xiàn)天然存在的序列的一種或多種活性，包括(但不限于)形成如本文所述的復(fù)合物；結(jié)合FK506;響應(yīng)地塞米松而增加糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)位；增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的基因表達(dá)；和/或結(jié)合熱休克蛋白，例如hsp90。FKBP52的例示性氨基酸和核苷酸序列揭示于以下文獻(xiàn)中桑切斯(Sanchez)等人,(19卯)生物化學(xué)(mochemistry)29(21),5145-5152;和皮蒂(Peattie)等人，(1992)美國國家科學(xué)院院刊(proc.Ato/.乂c^.S"89(22),10974-10978，兩篇文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式并入本文中。在一個實施例中，本發(fā)明的卩亞基或免疫親和素多肽包括(但不限于)來自任何動物物種(包括人類、嚙齒動物)的天然多肽的片段以及其(人類和非人類)多肽和其片段的變異體(例如，功能性變異體)，條件是所述多肽具有與個別天然多肽相同的生物活性。在一個實施例中，"片段"包含在成熟天然多肽的序列內(nèi)的區(qū)域。非全長(3亞基或免疫親和素(例如FKBP52)的任何形式都可用于本發(fā)明的方法和組合物中，條件是其仍具有功能，例如，保留天然存在的序列的至少一種活性(例如，保留形成如本文所述的復(fù)合物的能力)。非全長(3亞基可通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼全長p亞基蛋白的多聚核苷酸的相應(yīng)片段而產(chǎn)生。這些相應(yīng)多聚核苷酸片段也為本發(fā)明的一部分?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生如上文所述的經(jīng)修飾多聚核苷酸，所述技術(shù)包括適當(dāng)需要的缺失突變體的構(gòu)造、定點(diǎn)突變誘發(fā)法或使用適當(dāng)寡聚核苷酸引物進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)。多肽或其片段的"變異體"(諸如，(31亞基或FKBP52的變異體)包括嵌合蛋白、經(jīng)標(biāo)記蛋白(例如，放射性標(biāo)記的蛋白)、融合蛋白、突變蛋白、具有類似(例如，實質(zhì)上類似)序列的蛋白質(zhì)(例如，具有氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失、插入的蛋白質(zhì))、蛋白質(zhì)片段、模擬物，只要所述變異體具有天然蛋白質(zhì)的至少一部分氨基酸序列或具有大部分序列與天然蛋白一致的氨基酸序列的至少一部分即可。"功能性變異體"包括保留天然蛋白質(zhì)的至少一種功能(例如，保留使免疫親和素配體與如本文所述的復(fù)合物相互作用和/或形成所述復(fù)合物的能力)的變異體。"嵌合蛋白"或"融合蛋白"為編碼多肽的第一氨基酸序列與第二氨基酸序列的融合物，其中所述第一與第二氨基酸序列并非作為單一多肽鏈的一部分天然存在。如本文所使用，術(shù)語"實質(zhì)上類似"(或"實質(zhì)上"或"充分""同源"或"一致")在本文中用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足量與第二氨基酸或核苷酸序列一致或相同(例如，具有類似側(cè)鏈，例如保守氨基酸取代)的氨基酸殘基或核苷酸，以致第一與第二氨基酸或核苷酸序列具有類似活性。與本文所揭示的序列類似或同源(例如，至少約85%序列一致性)的序列也為本申請案的一部分。在一些實施例中，序列一致性可為約卯％、91%、92%、93%、94%、95°/。、96%、97%、98%、99%或更高。另外，當(dāng)核酸區(qū)段在選擇性雜交條件(例如，高嚴(yán)格度雜交條件)下與所述鏈的互補(bǔ)序列雜交時，會存在顯著一致性。核酸可存在于全細(xì)胞中、細(xì)胞溶解產(chǎn)物中或以部分純化或?qū)嵸|(zhì)上純形式存在。兩個序列之間"同源性"或"序列一致性"(所述術(shù)語在本文中可互換使用)的計算如下進(jìn)行。比對序列以達(dá)到最佳比較的目的(例如，為了實現(xiàn)最佳比對，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或兩者中引入空位，并且出于比較的目的，可忽略非同源序列)。通常，為進(jìn)行比較而比對的參考序列的長度為參考序列長度的至少30%、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、甚至更優(yōu)選至少60%且甚至更優(yōu)選至少70%、80%、90%、100%。隨后比較對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄械奈恢帽坏诙蛄兄邢鄳?yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則所述分子在此位置處一致(如本文所使用，氨基酸或核酸"一致性"與氨基酸或核酸"同源性"等效)。兩個序列之間的一致性百分比隨所述序列所共有的一致位置的數(shù)量而變化，其中需考慮為獲得兩個序列的最佳比對而需要引入的空位的數(shù)量和各空位的長度。序列的比較和兩個序列之間一致性百分比的測定可使用數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)。在一個實施例中，使用尼德曼(Needleman)和伍斯奇(Wunsch)((1970)分子生物學(xué)(J.Mol.Biol.)48:444-453)算法來測定兩個氨基酸序列之間的一致性百分比，所述算法已并入GCG軟件包中的市售GAP程序中，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。在另一實施例中，使用GCG軟件包中的市售GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、3070或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。測定同源性百分比通常使用的參數(shù)為Blossum62得分矩陣，其中空位罰分為12，空位延伸罰分為4且移碼空位罰分為5。還可使用E.梅耶斯(E.Meyers)和W.米勒(W.Miller)((1989)生物科學(xué)中的計算機(jī)應(yīng)用(C4B/aS)4:11-17)算法來測定兩個氨基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120殘基權(quán)重表，空位長度罰分為12且空位罰分為4。如本文所使用，術(shù)語"在嚴(yán)格條件下雜交"描述雜交和洗滌的條件。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知嚴(yán)格條件，并且所述條件可見于現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程(Cwre加iVWoco"/"Mo/固/"油gy),約翰威立父子出版公司(JohnWiley&Sons),紐約(N.Y.)(1989),6.3.1-6.3.6中。此文獻(xiàn)中描述了水性和非水性方法并且可使用任一種方法。嚴(yán)格雜交條件的實例為在約45'C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨后在50'C下以0.2XSSC、0.1%SDS洗滌一次或多次。另一嚴(yán)格雜交條件的實例為在約45'C下在6XSSC中雜交，隨后在55r下以0.2XSSC、0."/。SDS洗滌一次或多次。另一嚴(yán)格雜交條件的實例為在約45'C下在6XSSC中雜交，隨后在6(TC下以0.2XSSC、0.P/。SDS洗滌一次或多次。通常，嚴(yán)格雜交條件為在約45'C下在6XSSC中雜交，隨后在65"C下以0.2XSSC、0.1%SDS洗滌1次或20次以上。更常見的是，所使用的高嚴(yán)格度條件為在65'C下在0.5M磷酸鈉、7。/。SDS中雜交，隨后在65'C下以0.2XSSC、1%SDS洗漆一次或多次。應(yīng)了解，本文所揭示的多肽的變異體可能具有其它保守或非必需氨基酸取代，這不會明顯影響抗原結(jié)合或其它免疫球蛋白功能。"保守氨基酸取代"為氨基酸殘基由具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的取代。所屬領(lǐng)域中已確定具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、卩分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。"非必需"氨基酸殘基為可由雜交抗體的野生型序列發(fā)生改變并且不會消除或更優(yōu)選實質(zhì)上不改變生物活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基則會引起所述變化。免疫親和素配體免疫親和素配體與免疫親和素結(jié)合以活化其它細(xì)胞靶，主要是免疫和神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞靶。數(shù)種免疫親和素為免疫抑制性的，例如環(huán)孢菌素A、FK506和雷帕霉素，而其它較低免疫抑制性免疫親和素則展現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)活性。舉例來說，美立霉素為實質(zhì)上非免疫抑制性的，并且在活體外展現(xiàn)明顯的神經(jīng)保護(hù)活性(何M.(He,M.)等人，US2005/0272133，2005年12月8日公開；和格拉斯安尼E.(Graziani,E.)等人，US2005/0197356，2005年9月8日公開)。通過本發(fā)明方法鑒別或用于本發(fā)明方法中的免疫親和素配體優(yōu)選為實質(zhì)上非免疫抑制性的，但保留所需活性，例如神經(jīng)營養(yǎng)活性。優(yōu)選的免疫親和素配體能增加如本文所述的復(fù)合物的形成，和/或降低FKBP和/或鈣通道活性。在一些實施例中，免疫親和素配體在mTOR結(jié)合結(jié)構(gòu)域處經(jīng)修飾。據(jù)悉，雷帕霉素的mTOR結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于大環(huán)核心，圖1A中約1-7位和27-36位處。舉例來說，免疫親和素配體可在雷帕霉素主鏈的l位和4位具有雜原子取代基(圖1A)。在其它實施例中，雷帕霉素類似物在l位、2位、3位和/或4位具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1A)。所述雷帕霉素類似物揭示于2006年6月22日自U.S.S.N.11/300,839公開的共同轉(zhuǎn)讓的共同代決的公開申請案U.S.2006/0135549中，所述申請案的標(biāo)題為"雷帕霉素類似物和其在治療神經(jīng)病癥、增生性病癥和炎癥性病癥方面的用途(RapamycinAnaloguesandtheUsesThereofintheTreatmentofNeurological,Proliferative,andInflammatoryDisorders)",其完整內(nèi)容以引用的方式并入本文中。在一個實施例中，雷帕霉素類似物具有式I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>在上述式中，R,與R2為不同的獨(dú)立基團(tuán)，并且選自O(shè)R3和N(R3.)(R3..);或Ri與R2不同，經(jīng)由單鍵連接且選自O(shè)和NR3。R3、R3,和R3"獨(dú)立地選自H、d到C6垸基、d到Q經(jīng)取代烷基、C3到Q環(huán)烷基、經(jīng)取代C3到Cs環(huán)烷基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基和經(jīng)取代雜芳基。R4和R4.(a)獨(dú)立地選自H、OH、0(d到C6垸基)、O(經(jīng)取代d到Q垸基)、O(酰基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)和鹵素；或(b)—起形成與O鍵結(jié)的雙鍵。R5、R6和R7獨(dú)立地選自H、OH和OCH3。118與119經(jīng)由(i)單鍵連接且都為CH2，或經(jīng)由(ii)雙鍵連接且都為CH。R,5選自00、CHOH禾nCH2，且n為1或2;或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽、前藥或代謝物。在其它實施例中，Ri與R2經(jīng)由單鍵連接且選自0和NR3。在另一實施例中，&為O且112為NR3。在一個實施例中，113.或113.,為芳基或經(jīng)取代芳基，或經(jīng)取代苯環(huán)。在另一實施例中，R3.或Rr處的經(jīng)取代苯基包括具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>R10、Ru、R12、Ru和Rm獨(dú)立地逸自H、d到C6垸基、經(jīng)取代d到06烷基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基、經(jīng)取代雜芳基、鹵素、?；?、OH、O(烷基)、O(經(jīng)取代烷基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)、O(?；?、NH2、NH(烷基)、NH(經(jīng)取代垸基)、NH(芳基)、NH(經(jīng)取代芳基)和NH(?；?。在其它實施例中，R3、R3或Rr為任選經(jīng)1或2個選自d到C6垸基和鹵素的取代基取代的苯基。在其它實施例中，R3、&,或113..為任選經(jīng)1或2個甲基或氯基取代基取代的苯基，例如苯基和3-甲基，4-氯苯基。在一個實施例中，R4或R4,為OH或O(?；?，例如其中所述?；鶠槿芜x經(jīng)垸基取代的-C(O)-，具體說來，其中烷基可為直鏈或支鏈并且例如任選經(jīng)諸如芳香族雜環(huán)(諸如吡啶基)等雜環(huán)取代。實例為在其它實施例中，式I的雷帕霉素類似物包括R5、R6和R7為OCH3的雷帕霉素類似物，雷帕霉素主鏈的17-22位的含氮環(huán)為哌啶環(huán)或Ri5為羰基的雷帕霉素類似物。在一個實施例中，雷帕霉素類似物具有式Ia:其中R卜R2、Rs和R9如上文所述加以定義。在另一實施例中，雷帕霉素類似物具有下式Ib:在式Ib中，R獨(dú)立地選自H、d到Q垸基、經(jīng)取代d到C6垸基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基、經(jīng)取代雜芳基、鹵素、?；?、OH、O(烷基)、O(經(jīng)取代烷基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)、O(?；?、NH2、NH(垸基)、NH(經(jīng)取代垸基)、NH(芳基)、NH(經(jīng)取代芳基)和NH(酰基)，并且m為l到5。特定雷帕霉素類似物描述于本文中，并且包括9，27-二羥基-3-{2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基]-l-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8,12,14,20,26-六甲基-37-苯基-4，9,10,12,13,14,15,18，21,22,23,24,25，26,27,32，33,34,34a-十九氫-3H-23,27-環(huán)氧基-18,15-(環(huán)氧基亞氨基)吡啶并[2,l-c][l,4]氧雜氮雜環(huán)三^^一烷-l,5,ll，28，29(6H，31H)-戊酮；9，27-二羥基-3-{2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基]-l-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6,8，12,14,20,26-六甲基-37-苯基-4,9,10,12,13,14,15,16，17,18,21，22,23,24,25,26，27,32,33,34,34a-二—^一氫陽3H-23,27隱環(huán)氧基-18，15-(環(huán)氧基亞氨基)卩比啶并[2,l-c][l,4]氧雜氮雜環(huán)三^^"一烷-l，5,ll,28,29(6H,31H)-戊酮；37-(4-氯-3-甲基苯基)-9,27-二羥基-3-{-2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基甲基乙基}-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-4，9,10,12,13,14,15,18,21，22,23，24,25，26,27,32,33,34,34a-十九氫-3H-23,27-環(huán)氧基-18,15-(環(huán)氧基亞氨基)卩比啶并[2，l-c][l,4]氧雜氮雜環(huán)三^"^一垸-l,5,ll,28,29(6H,31H)-戊酮；37-(2,6-二氯苯基)-9,27-二羥基-3-{2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基]-1-甲基乙基}-10,2卜二甲氧基-6,8，12,14,20,26-六甲基-4,9，10，12,13,14，15,18,21,22,23,24,25，26,27,32，33,34,34a-十九氫-3H-23,27-環(huán)氧基-18,15-(環(huán)氧基亞氨基)吡啶并[2,l-c][l,4]氧雜氮雜環(huán)三i^一烷-1,5,11,28,29(6H,3IH)-戊酮；9,27-二羥基-3-{-2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基]-l-甲基乙基}-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-37-苯基-4,9,10，12，13,14，15，18,21，22,23，24,25，26，27,32,33,34，34a-十九氫-3H-23，27-環(huán)氧基-18,15-(環(huán)氧基亞氨基)卩比啶并[2,l-c][l,4]氧雜氮雜環(huán)三^^一烷-l,5,ll,28,29(6H,31H)-戊酮與2,2-二甲基-3-(吡啶-2-基)-丙酸的酯；37-(2,6-二氯苯基)-9,27-二羥基-3-{-2-[4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基甲基乙基}-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-4，9，10,12,13，14,15,18,21,22,23,24,25,26，27,32,33,34,34a-十九氫-3H-23,27-環(huán)氧基-18,15-(環(huán)氧基亞氨基)吡啶并[2,1<][1，4]氧雜氮雜環(huán)三"|^一烷-l,5，U，28，29(6H,31H)-戊酮；或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽、前藥或代謝物。本發(fā)明不限于這些說明性化合物。在另一實施例中，特定化合物包括下述各物雷帕霉素I雷帕霉素II本申請案通篇所提及的雷帕霉素類似物I和II是從上圖左式開始，分別由第一和第二化學(xué)結(jié)構(gòu)表示。雷帕霉素類似物還包括&與R2經(jīng)由單鍵連接，R!為O，R2為NR3，R3為苯基，R4為OH，Rs-R7為OCH3且118和R9為HC=CH的化合物；R！為OR3，R2為N(R3,)(Rr)，R3為H，Rr為H，R3.,為苯基，R4為OH，R5-R7為OCH3且118和R9為H2C-CH2的化合物；Ri和R2經(jīng)由單鍵連接，R!為O，R2為NR3，R3為苯基，R4為OH，R5-R7為OCH3且Rs和R9為H2C-CH2的化合物；R!和R2經(jīng)由單鍵連接，Ri為O,R2為NR3，R4為OH，R5-R7為OCH3，Rs和Rg為HCK:H且R3為下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>Ri和R2經(jīng)由單鍵連接，Ri為O，R2為NR3，R4為OH，115-117為OCH3，R8和R9為HC=CH且R3為下式的化合物Ri和R2經(jīng)由單鍵連接，Ri為O，112為NR3,R3為苯基，Rs-R7為OCH3,118和R9為HC二CH且R4為下式的化合物以及R!和R2經(jīng)由單鍵連接，Rt為O，112為NR3，R4為OH,R5-R7為OCH3，R8和R9為H2C-CH2且R3為下式的化合物所述化合物可含有一個或多個不對稱碳原子，并且一些化合物可含有一個或多個不對稱(手性)中心且因此能產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。盡管并未關(guān)于立體化學(xué)予以展示，但當(dāng)所述化合物可含有一個或多個手性中心時，優(yōu)選至少一個手性中心具有S-立體化學(xué)。因此，所述化合物包括所述光學(xué)異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體；以及外消旋和拆分的對映異構(gòu)純的立體異構(gòu)體；以及R與S立體異構(gòu)體的其它混合物，和其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、代謝物和前藥。術(shù)語"烷基"在本文中用于指具有1到10個碳原子且合意地約1到8個碳原子的直鏈和支鏈飽和脂肪族烴基。術(shù)語"烯基"在本文中用于指具有一個或多個碳碳雙鍵且含有約2到10個碳原子的直鏈和支鏈烷基。在一個實施例中，術(shù)語烯基是指具有1或2個碳碳雙鍵且具有2到約6個碳原子的垸基。術(shù)語"炔基"在本文中用于指具有一個或多個碳碳三鍵且具有2到8個碳原子的直鏈和支鏈垸基。在另一實施例中，術(shù)語炔基是指具有1或2個碳碳三鍵且具有2到6個碳原子的烷基。術(shù)語"環(huán)垸基"在本文中用于指具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)且具有約4到10個碳原子或約5到8個碳原子的如前文所述的烷基。術(shù)語"經(jīng)取代烷基"、"經(jīng)取代烯基"和"經(jīng)取代炔基"分別是指具有一個或多個取代基的垸基、烯基和炔基，所述取代基包括(不限于)鹵素、CN、OH、N02、氨基、芳基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷基羧基和芳基硫基，所述基團(tuán)可任選經(jīng)例如1到4個包括以下基團(tuán)的取代基取代鹵素、CN、OH、N02、氨基、垸基、環(huán)烷基、烯基、炔基、垸氧基、芳氧基、垸基氧基、烷基羰基、垸基羧基、氨基烷基和芳基硫基。這些取代基可連接到烷基、烯基或炔基的任一碳上，只要所述連接構(gòu)成穩(wěn)定化學(xué)部分即可。如本文所使用，術(shù)語"芳基"是指例如具有6-20個碳原子的芳香族系統(tǒng)，其可包括單環(huán)或者稠合或鍵聯(lián)在一起的多個芳香環(huán)(例如，2個或3個)，其中所述稠合或鍵聯(lián)環(huán)的至少一部分形成共軛芳香族系統(tǒng)。芳基可包括(但不限于)苯基、萘基、聯(lián)苯、蒽基、四氫萘基、菲基、茚、苯并萘基、芴基和咔唑基。術(shù)語"經(jīng)取代芳基"是指經(jīng)一個或多個包括以下基團(tuán)的取代基取代的芳基鹵素、CN、OH、N02、氨基、垸基、環(huán)垸基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、垸基氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳基硫基，所述基團(tuán)可任選經(jīng)取代。在一個實施例中，經(jīng)取代芳基是經(jīng)1到4個包括以下基團(tuán)的取代基取代鹵素、CN、OH、N02、氨基、烷基、環(huán)烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、垸基羰基、垸基羧基、氨基烷基禾口芳基硫基o如本文所使用，術(shù)語"雜環(huán)"是指穩(wěn)定的4元到7元單環(huán)或多環(huán)雜環(huán)，其為飽和、部分飽和或完全不飽和的，包括芳香族基團(tuán)，諸如吡啶基。雜環(huán)具有碳原子和一個或多個包括氮、氧和硫原子的雜原子。在一個實施例中，雜環(huán)在環(huán)主鏈中具有1到4個雜原子。當(dāng)雜環(huán)在環(huán)主鏈中含有氮或硫原子時，所述氮或硫原子可經(jīng)氧化。術(shù)語"雜環(huán)"還指雜環(huán)與芳基環(huán)稠合得到的例如具有9到20個環(huán)成員的多環(huán)。雜環(huán)可經(jīng)由雜原子或碳原子與芳基環(huán)連接，條件是所得雜環(huán)結(jié)構(gòu)在化學(xué)上穩(wěn)定。所屬領(lǐng)域中已知多種雜環(huán)基團(tuán)，并且所述基團(tuán)包括(不限于)含氧環(huán)、含氮環(huán)、含硫環(huán)、含混合雜原子的環(huán)、含雜原子的稠環(huán)和其組合。含氧環(huán)包括(但不限于)呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、吡喃酮基和二氧雜環(huán)己烯基環(huán)。含氮環(huán)包括(不限于)吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、吡啶基、哌啶基、2-氧代哌啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、氮雜卓基、三嗪基、吡咯烷基和氮雜卓基環(huán)。含硫環(huán)包括(不限于)噻吩基和二硫醇基環(huán)。含混合雜原子的環(huán)包括(但不限于)氧硫雜環(huán)戊烯基(oxathiolyl)、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁三唑基、二噁唑基、噁噻唑基、氧硫雜環(huán)戊烯基、噁嗪基、噁噻嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、硫代嗎啉基亞砜、氧雜卓基(oxepinyl)、硫雜卓基(thiepinyl)和二氮雜卓基環(huán)。含雜原子的稠環(huán)包括(但不限于)苯并呋喃基、硫茚(thionaphthene)、吲哚基、氮茚基(benazazolyl)、purindinyl、吡P南并吡咯基、異H引唑基、茚洛秦基(indoxazinyl)、苯并噁唑基、鄰苯甲內(nèi)酰胺基(anthranilyl)、苯并吡喃基、喹啉基、異喹啉基、benzodiazonyl、萘啶基(naphthyWdiny1)、苯并噻吩基、吡啶并吡啶基、苯并噁嗪基、氧雜蒽基(xanthenyl)、吖啶基和嘌呤基環(huán)。如本文所使用，術(shù)語"經(jīng)取代雜環(huán)"是指具有一個或多個包括以下基團(tuán)的取代基的雜環(huán)基團(tuán)鹵素、CN、OH、N02、氨基、垸基、環(huán)垸基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、垸基羰基、烷基羧基、氨基垸基和芳基硫基，所述基團(tuán)可任選經(jīng)取代。在一個實施例中，經(jīng)取代雜環(huán)基團(tuán)是經(jīng)1到4個取代基取代。術(shù)語"?；?是指-C(O)-基團(tuán)，其在碳原子處經(jīng)取代。酰基可經(jīng)取代，或為末端?；T如HC(O)-基團(tuán)。取代基可包括上文關(guān)于垸基所述的任一取代基，即一個或多個包括(不限于)鹵素、CN、OH、N02、氨基、芳基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷基羧基和芳基硫基的取代基，所述基團(tuán)可任選經(jīng)取代。實例包括-C(O)-烷氧基(例如，-OMe或-OEt)或-C(O)-垸基，其中烷基可為直鏈或支鏈且任選經(jīng)例如雜環(huán)基(諸如吡啶基)取代。如本文所使用，術(shù)語"烷氧基"是指O(烷基)基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過氧原子且所述烷基任選經(jīng)取代。如本文所使用，術(shù)語"芳氧基"是指O(芳基)基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過氧原子且所述芳基任選經(jīng)取代。如本文所使用，術(shù)語"烷基氧基"是指烷基OH基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過所述垸基。如本文所使用，術(shù)語"芳基硫基"是指S(芳基)基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過硫原子且所述芳基可任選經(jīng)取代。如本文所使用，術(shù)語"烷基羰基"是指C(O)(垸基)基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過羰基部分的碳原子且所述烷基任選經(jīng)取代。如本文所使用，術(shù)語"烷基羧基"是指C(O)O(垸基)基團(tuán)，其中連接點(diǎn)是通過羧基部分的碳原子且所述烷基任選經(jīng)取代。如本文所使用，術(shù)語"氨基垸基"是指仲胺和叔胺，其中連接點(diǎn)是通過氮原子且所述烷基任選經(jīng)取代。所述烷基可為相同或不同的。如本文所使用，術(shù)語"鹵素"是指氯、溴、氟或碘基。雷帕霉素類似物可由雷帕霉素原料制備。雷帕霉素原料優(yōu)選包括(不限于)雷帕霉素、去甲雷帕霉素(norrapamydn)、去氧雷帕霉素、去甲基雷帕霉素或去甲氧基雷帕霉素，或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽、前藥或代謝物。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇可用于制備本發(fā)明的新穎雷帕霉素類似物的適當(dāng)雷帕霉素原料。術(shù)語"去甲基雷帕霉素"是指一類缺少一個或多個甲基的雷帕霉素化合物。可根據(jù)本發(fā)明使用的去甲基雷帕霉素的實例包括29-去甲基雷帕霉素(美國專利第6,358,969號)、7-0-去甲基-雷帕霉素(美國專利第6,399,626號)、17-去甲基雷帕霉素(美國專利第6,670,168號)和32-0-去甲基雷帕霉素等。術(shù)語"去甲氧基雷帕霉素"是指一類缺少一個或多個甲氧基的雷帕霉素化合物，且包括(不限于)32-去甲氧基雷帕霉素。雷帕霉素類似物可通過將雷帕霉素原料與親雙烯體組合來制備。術(shù)語"親雙烯體"是指與1,3-二烯反應(yīng)得到[4+2]環(huán)加成產(chǎn)物的分子。本發(fā)明所用的親雙烯體優(yōu)選為任選經(jīng)取代的亞硝基苯。多種亞硝基苯可用于本發(fā)明中，并且其包括亞硝基苯、2,6-二氯亞硝基苯和l-氯-2-甲基-4-亞硝基苯等。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇將有效制備本發(fā)明的雷帕霉素類似物的亞硝基苯的量。優(yōu)選利用過量的亞硝基苯，并且更優(yōu)選亞硝基苯與雷帕霉素原料的比例為5:1。然而，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所測定，也可利用甚至1:1、2:1或3:1的亞硝基苯與雷帕霉素的比例。亞硝基苯與雷帕霉素原料是在溶劑中組合。所述溶劑優(yōu)選能在接觸時即溶解亞硝基苯和/或雷帕霉素，或當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時溶解亞硝基苯和雷帕霉素。可用于本發(fā)明中的溶劑包括(不限于)二甲基甲酰胺、二噁烷(諸如對二噁院)、氯仿、醇(諸如甲醇和乙醇)、乙酸乙酯、水、乙腈、四氫呋喃、二氯甲垸和甲苯，或其組合。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地根據(jù)雷帕霉素原料和亞硝基苯的溶解性以及溶劑與所述物質(zhì)的反應(yīng)性來選擇適當(dāng)溶劑。所用溶劑的量視反應(yīng)規(guī)模而定，且具體說來，視反應(yīng)混合物中存在的雷帕霉素原料和亞硝基苯的量而定。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠易于測定所需溶劑的量。通常，將含有亞硝基苯、雷帕霉素原料和溶劑的溶液保持在高溫下，且優(yōu)選保持在不會促進(jìn)雷帕霉素和亞硝基苯分解的溫度下。在一個實施例中，將所述溶液保持在約30'C到約7(TC且優(yōu)選約5(TC的溫度下。將所述組分加熱一段足以允許雷帕霉素與亞硝基苯發(fā)生反應(yīng)的時間。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)將能夠易于監(jiān)測在加熱過程中反應(yīng)的進(jìn)程，并由此測定進(jìn)行反應(yīng)所需的時間量。在一個優(yōu)選實施例中，將雷帕霉素和亞硝基苯與對二噁烷組合，并保持在約50'C的溫度下。雷帕霉素類似物的分離和純化在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)，并包括色譜法，包括(不限于)高效液相色譜(HPLC)，諸如反相HPLC和正相HPLC，以及尺寸排阻色譜；和再結(jié)晶。獲得雷帕霉素類似物后，即可使其還原以形成較為飽和的雷帕霉素類似物。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)還原劑。優(yōu)選可使用氫化試劑來實現(xiàn)雷帕霉素類似物的還原。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)氫化試劑。通常利用支撐物、優(yōu)選碳支撐物等承載的過渡金屬催化劑或過渡金屬在存在氫氣的情況下進(jìn)行還原。在優(yōu)選實施例中，在存在氫氣的情況下，使用碳載鈀金屬進(jìn)行還原。雷帕霉素類似物的還原通常是在溶劑中進(jìn)行。多種溶劑可用于還原，且包括(不限于)醇，諸如甲醇。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠視氫化催化劑和所還原的雷帕霉素類似物而定容易地選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)溶劑。溶劑的量視反應(yīng)規(guī)模而定且具體說來，視所還原的雷帕霉素類似物的量而定。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可易于測定本發(fā)明中所用的氫化試劑的量。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠測定并調(diào)整進(jìn)行還原和形成較為飽和的本發(fā)明的雷帕霉素類似物所需的氫化試劑的量。此外，可利用多種設(shè)備來進(jìn)行本發(fā)明的氫化，并且所述設(shè)備包括帕爾設(shè)備(Parrapparatus)等。用于氫化的具體設(shè)備的選擇將在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。制備本發(fā)明的雷帕霉素類似物的優(yōu)選方法概述于下文的方案1中方案1其中R!、R2、R4、R4、R6、R7、R,5和n在上文中經(jīng)定義。可利用由醫(yī)藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的酸或堿得到的醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽、前藥或代謝物形式的雷帕霉素類似物。這些鹽包括(但不限于)以下與諸如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等礦物酸或無機(jī)酸以及諸如乙酸、草酸、琥珀酸和馬來酸等有機(jī)酸形成的鹽。其它鹽包括與諸如鈉、鉀、鈣或鎂等堿金屬或堿土金屬形成的酯、氨基甲酸酯形式和其它常規(guī)"前藥"形式的鹽，當(dāng)所述鹽以此類形式投與時，其會在活體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性部分。雷帕霉素類似物的其它合成途徑和特征提供于上文所參考的2006年6月22日公開的共同轉(zhuǎn)讓的共同代決的公開申請案US2006/0135549的實例1-3中，所述申請案的標(biāo)題為"雷帕霉素類似物和其在治療神經(jīng)病癥、增生性病癥和炎癥性病癥方面的用途"?？捎糜诒景l(fā)明方法中的雷帕霉素類似物的其它實例揭示于2006年6月22日自U.S.S.N.11/300,941公開的共同持有的公開申請案U.S.2006/0135550中，所述申請案的標(biāo)題為"雷帕霉素衍生物和其在治療神經(jīng)病癥方面的用途(RapamycinDerivativesandtheUsesThereofintheTreatmentofNeurologicalDisorders)",其完整內(nèi)容以引用的方式并入本文中。在其它實施例中，免疫親和素配體為美立霉素類似物?？捎糜诒景l(fā)明方法中的美立霉素類似物的實例包括揭示于例如U.S.2005/0197379、U.S.2005/0272133、U.S.2005/0197356、WO2005/084673、WO2005/085257以及以下共同持有的臨時申請案中的美立霉素類似物2005年3月23日申請的U.S.S.N.60/664,483，其標(biāo)題為"美立霉素衍生物和其用途(MeridamycinDerivativesandUsesThereof)"(通過USPTOPAIR公開可用)；和2006年3月7日申請的U.S.S.N.60/779,940，其標(biāo)題為"用于治療神經(jīng)變性病癥的美立霉素類似物(MeridamycinAnaloguesfortheTreatmentofNeurodegenerativeDisorders)"。(所有專利的完整內(nèi)容都以引用的方式并入本文中。)所揭示的免疫親和素配體的某種神經(jīng)營養(yǎng)作用可通過形成本文所述的復(fù)合物來介導(dǎo)。在一個實施例中，美立霉素類似物具有U.S.2005/0197379中的化合物I的化學(xué)式。已證實，若干上述雷帕霉素和美立霉素類似物在所培養(yǎng)的皮層、多巴胺能和脊髓神經(jīng)元中具有有效的神經(jīng)營養(yǎng)(例如，神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生和/或刺激神經(jīng)突起生長)活性。免疫親和素復(fù)合物一方面，本發(fā)明涉及免疫親和素復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)。在一些實施例中，所述復(fù)合物包括免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)、免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)或其功能性變異體和鈣通道亞基(例如，電壓門控L型鈣通道(31亞基)或其功能性變異體。如本文所使用，術(shù)語"結(jié)合"和"復(fù)合物形成"是指兩個或兩個以上分子(例如多肽、大環(huán)內(nèi)酯類等)的直接或間接締合。直接締合可例如包括在生理條件下的共價、靜電、疏水、離子和/或氫鍵相互作用。間接締合包括例如兩個或兩個以上分子是復(fù)合物的一部分但不具有直接相互作用。在一個實施例中，分子之間的締合足以在生理條件下保持穩(wěn)定復(fù)合物。本發(fā)明的復(fù)合物可以經(jīng)分離、重組或純化形式獲得。作為"蛋白質(zhì)"或"復(fù)合物"的修飾語的術(shù)語"經(jīng)純化"或"經(jīng)分離"是指一種或多種蛋白質(zhì)的制劑，所述蛋白質(zhì)實質(zhì)上不含通常在細(xì)胞或細(xì)胞溶解產(chǎn)物中與其締合的其它蛋白質(zhì)。舉例來說，短語"實質(zhì)上不含"涵蓋包含小于40%、30%、20%(以干重計)的污染蛋白質(zhì)且通常包含小于5%的污染蛋白質(zhì)的制劑。當(dāng)提及用于產(chǎn)生重構(gòu)蛋白質(zhì)混合物的組分蛋白質(zhì)制劑時，"經(jīng)純化"或"經(jīng)分離"意思指所述分子是在實質(zhì)上不存在諸如其它蛋白質(zhì)(尤其可實質(zhì)上掩蔽、減小、混亂或改變純制劑形式的組分蛋白質(zhì)的特性或其在標(biāo)的重構(gòu)混合物中的功能的其它蛋白質(zhì))等其它生物大分子的情況下存在。如本文所使用，術(shù)語"經(jīng)純化"或"經(jīng)分離"優(yōu)選指存在至少80干重％、通常在85干重％的范圍內(nèi)、更通常95-99干重％或更高百分比的相同類型的生物大分子(但也可存在水、緩沖劑和其它小分子、尤其分子量低于5000的分子)。在一個實施例中，所述復(fù)合物或蛋白質(zhì)實質(zhì)上不含純化材料，例如基質(zhì)或其它材料。在其它實施例中，所述復(fù)合物或蛋白質(zhì)與純化材料締合。術(shù)語"重組""蛋白質(zhì)"或"復(fù)合物"是指形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)，其可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。一般說來，將編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA插入適當(dāng)表達(dá)載體中，接著使用所述表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(在本文中也稱為"重組細(xì)胞")以產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。此外，關(guān)于編碼重組蛋白的重組基因的短語"源自"意欲包括在"重組蛋白"的含義內(nèi)，所述蛋白質(zhì)含有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列，或通過天然存在的蛋白質(zhì)的突變(包括取代、插入和缺失)所產(chǎn)生的與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列類似的氨基酸序列。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種復(fù)合物，其是例如通過從包含所述復(fù)合物的組分的細(xì)胞(例如，天然存在的細(xì)胞或重組細(xì)胞，例如免疫親和素處理的細(xì)胞)提取而制備得到?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域中已知的任何方法實現(xiàn)細(xì)胞提取。舉例來說，可通過諸如離心、凝膠過濾、離子交換色譜、親和色譜和/或親和純化等一系列常規(guī)蛋白質(zhì)純化步驟，從細(xì)胞提取出復(fù)合物。通常優(yōu)先選擇不會解離復(fù)合物的純化步驟和條件。如隨附實例中所述，可使用溶解緩沖液(例如，6ml;50mMTris(pH7.4)、250mMNaCl、5mMEDTA、50mMNaF、lmMNa3V04、1%NonidetP40(NP40)、0.1%巰基乙醇和2%蛋白酶抑制劑混合物)。舉例來說，可如傅雷茲(Fretz)等人((1991)美國化學(xué)學(xué)會雜志(乂Jm.C&m.Soc.)113:1409)所述，制備將免疫親和素配體(例如，雷帕霉素類似物)連接到樹脂的親和基質(zhì)。在一個實施例中，可使用親和凝膠10(Affi-gdlO)樹脂，通過氨基-苯基-丁酸來制備親和基質(zhì)(圖1)。簡單地說，可通過用諸如二碳酸二烯丙酯等保護(hù)基處理來保護(hù)氨基-苯基-丁酸的氨基。可在CH2C12中利用PhOP(0)Cl2DMF復(fù)合物來活化所得復(fù)合物的酸基。反應(yīng)中止后，可例如通過HPLC純化酯產(chǎn)物，并例如通過MS和NMR加以表征。在去除烯丙基氧基羰基后，可將產(chǎn)物的氨基連接到親和凝膠10(Affigel-10)基質(zhì)?？上礈焖糜H和凝膠-免疫親和素配體親和基質(zhì)并加以儲存。提取后，可將細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分試樣與諸如親和凝膠10-免疫親和素配體等親和珠?；旌??？衫缭?-20%SDS-PAGE凝膠上對珠粒進(jìn)行分析?？上鞍踪|(zhì)譜帶，并通過例如FT-ICR-MS分析進(jìn)一步分析。在其它實施例中，可通過純化諸如大腸桿菌(￡.co/O等細(xì)胞中表達(dá)的重組多肽，并在活體外重構(gòu)復(fù)合物來制備復(fù)合物。在某些實施例中，復(fù)合物的一種或多種組成多肽是由細(xì)胞的內(nèi)源基因表達(dá)。在某些實施例中，復(fù)合物為重組復(fù)合物，其中一種或多種組成多肽是由重組核酸表達(dá)。在某些實施例中，本發(fā)明還包括經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中所述復(fù)合物中至少一種多肽經(jīng)標(biāo)記。舉例來說，所述標(biāo)記為可檢測標(biāo)記，其可選自例如放射性同位素、熒光化合物、酶和酶輔因子中的一者或多者。在另一實施例中，標(biāo)記促進(jìn)多肽的純化、分離或檢測。標(biāo)記可為聚組氨酸、FLAG、Glu-Glu、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白(thioredoxin)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。在一個實施例中，經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)為FKBP52。在另一實施例中，經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)為鈣通道亞基。可通過適當(dāng)?shù)挠H和純化(例如，如上文所述，或通過在六組氨酸標(biāo)簽的情況下使復(fù)合物與鎳或銅樹脂接觸，在GST標(biāo)簽的情況下使復(fù)合物與谷胱甘肽樹脂接觸)來純化經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物或其組分。在某些實施例中，本發(fā)明的復(fù)合物為水溶性形式("可溶性復(fù)合物")。舉例來說，可溶性復(fù)合物可包括免疫親和素和/或鈣通道亞基的可溶性細(xì)胞質(zhì)部分。在其它實施例中，復(fù)合物可能不易溶于水或為膜締合形式。舉例來說，包含具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的復(fù)合物通常不可溶于水?？衫缰苽浒|(zhì)、清潔劑和/或其它組分的脂質(zhì)微團(tuán)、清潔劑微團(tuán)或混合微團(tuán)形式的不可溶復(fù)合物。也可制備作為細(xì)胞的膜部分的不可溶復(fù)合物。膜部分可為粗膜部分，其中所述膜部分是例如通過離心或過濾簡單地與細(xì)胞的可溶部分分離。可進(jìn)一步例如通過針對復(fù)合物的一種或多種蛋白質(zhì)中存在的親和標(biāo)簽的親和純化來純化膜部分。當(dāng)復(fù)合物以脂質(zhì)雙層形式存在時，所述脂質(zhì)雙層可例如為小泡(任選倒轉(zhuǎn)，即其中通常在細(xì)胞外的表面向內(nèi)面向小泡的內(nèi)部)或平坦雙層。結(jié)晶形式的復(fù)合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實施例中，使復(fù)合物交聯(lián)?？墒褂媒宦?lián)試劑來制備交聯(lián)復(fù)合物，所述交聯(lián)試劑可為多官能或雙官能試劑。所述試劑包括二胺類的化合物，諸如六亞甲基二胺、二氨基辛烷、乙二胺、4-(4-N-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酰肼鹽酸鹽(MPBH)、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-l-羧基-酰肼鹽酸鹽(M2C2H)和3-(2-吡啶基二硫基)丙酰肼(PDPH)和其它胺烯烴。此類交聯(lián)劑的實例為戊二醛、琥珀醛、辛二醛和乙二醛。其它多官能交聯(lián)劑包括鹵基-三嗪，例如氰尿酰氯；鹵基-嘧啶，例如2,4,6-三氯/溴-嘧啶；脂肪族或芳香族單-或二羧酸的酸酐或鹵化物，例如，馬來酸酐、(甲基)丙烯酰氯、氯乙酰氯；N-羥甲基化合物，例如N-羥甲基-氯乙酰胺；二異氰酸酯或二異硫氰酸酯，例如亞苯基-1,4-二異氰酸酯；和氮丙啶。其它交聯(lián)劑包括環(huán)氧化物，諸如二環(huán)氧化物、三環(huán)氧化物和四環(huán)氧化物。關(guān)于其它可用交聯(lián)試劑的代表性清單，例如參看皮爾斯目錄和手冊(PierceCatalogandHandbook)，皮爾斯化學(xué)品公司(PierceChemicalCompany)，洛克路德(Rockford),111.(1997);以及S.S.王(S.S.Wong),蛋白質(zhì)連結(jié)和交聯(lián)化學(xué)(ChemistryofProteinConjugationandCross-Linking)，CRC出版社，佛羅里達(dá)州博卡拉頓(BocaRaton，F(xiàn)la.)(1991)。另外，可使用可逆交聯(lián)劑?？赡娼宦?lián)劑的實例描述于T.W.格林(T.W.Green),有機(jī)合成中的保護(hù)基(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)，約翰威立父子出版公司(JohnWiley&Sons)(編)(1981)中。用于可逆保護(hù)基的任一種策略都可并入適于在產(chǎn)生能夠可逆、受控溶解的碳水化合物交聯(lián)糖蛋白晶體的過程中的至少一種交聯(lián)的交聯(lián)劑中。各種方法列于應(yīng)用化學(xué)國際版(英文)(AngewandteChmieIntl.Ed.Engl.),35，第2056頁(1996)中有關(guān)本主題的沃曼(Waldmann)評述中。其它類型的可逆交聯(lián)劑為含二硫鍵的交聯(lián)劑。本發(fā)明另外提供調(diào)節(jié)(例如，增加)本文所述的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性的方法。所述方法包括使免疫親和素(例如FKBP52，例如人FKBP52)或其功能性變異體和電壓門控L型鈣通道亞基(例如|31亞基，例如人(31亞基)或其功能性變異體與免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)在允許形成所述復(fù)合物的條件下接觸。接觸步驟可在活體外，例如在細(xì)胞溶解產(chǎn)物或重構(gòu)系統(tǒng)中發(fā)生?；蛘?，可對例如人類或動物個體(例如，活體內(nèi)動物模型)等個體中存在的細(xì)胞(例如，神經(jīng)元或心血管細(xì)胞)執(zhí)行所述方法。本發(fā)明的方法還可用于培養(yǎng)的細(xì)胞。舉例來說，可在活體外培養(yǎng)細(xì)胞(例如，純化或重組細(xì)胞)，并且可通過將免疫親和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素類似物)加入培養(yǎng)基中來實現(xiàn)接觸步驟。通常，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。在一些實施例中，所述細(xì)胞為神經(jīng)元細(xì)胞或心血管細(xì)胞。在一些實施例中，所述細(xì)胞為重組細(xì)胞，例如宿主細(xì)胞。所述方法包括(i)將一種或多種編碼免疫親和素和/或鈣通道亞基的多聚核苷酸引入細(xì)胞中；(ii)使所述細(xì)胞與免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)接觸；(iiO由此形成復(fù)合物。宿主細(xì)胞另一方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，其包含一個或多個編碼本文所揭示的復(fù)合物的一種或多種多肽成分的核酸。在一個實施例中，宿主細(xì)胞含有第一核酸，其包括編碼免疫親和素(例如FKBP52，例如，如本文所述的哺乳動物FKBP52)或其功能性變異體的核苷酸序列；和/或第二核酸，其包括編碼電壓門控L型鈣通道亞基(例如卩l(xiāng)亞基，例如，如本文所述的哺乳動物pi亞基)或其功能性變異體的核苷酸序列。在一個實施例中，第一核酸包含編碼如圖13A-13B所示的氨基酸序列(SEQIDNO:6-7)的核苷酸序列或與所述序列實質(zhì)上一致的序列。在其它實施例中，第二核酸包含編碼如圖12A-12E所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1-5)的核苷酸序列或與所述序列實質(zhì)上一致的序列。"宿主細(xì)胞"、"重組細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"為在本文中可互換使用的術(shù)語。應(yīng)了解，所述術(shù)語不僅指特定個體細(xì)胞，而且還指所述細(xì)胞的子代或潛在子代。由于在傳代過程中可能因突變或環(huán)境影響而發(fā)生某些修飾，故所述子代事實上可能與母細(xì)胞不一致，但其仍包括在如本文所使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。術(shù)語"重組核酸"包括包含至少兩個在自然界中不會一起存在的序列的任何核酸?？衫缭诨铙w外通過使用分子生物學(xué)方法，或例如在活體內(nèi)通過利用同源或非同源重組在新染色體位置插入核酸來產(chǎn)生重組核酸。在一些實施例中，可例如使用宿主細(xì)胞來純化、制造或研究蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。可例如任選使用宿主細(xì)胞在分析方案(諸如下文所述的分析方案)中測試化合物。在某些實施例中，本發(fā)明復(fù)合物的多肽的重組表達(dá)可單獨(dú)進(jìn)行，并且可由此形成復(fù)合物。在另一實施例中，所述本發(fā)明復(fù)合物的多肽的重組表達(dá)可在同一細(xì)胞中進(jìn)行，并且可由此形成復(fù)合物。用于重組表達(dá)的適當(dāng)宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，諸如大腸桿菌、浚拔芽^,^虜廣C7oWnW/www.入俊卓應(yīng)蘑虜a^e"dowo"w平久'潔母,澄激潘應(yīng),'房座潘應(yīng)f諾i^7久.浙鐒晃動激潘應(yīng)，諾*成纖麥潘應(yīng)、浙fi瓶媳、f/937潘應(yīng)^或,它前單核細(xì)胞細(xì)胞系J浙^房論嵐##潘應(yīng)欲應(yīng)入為進(jìn)行宿主細(xì)胞表達(dá)，可將重組核酸操作性連接到表達(dá)構(gòu)筑體中的一個或多個調(diào)控序列。調(diào)控核苷酸序列通常應(yīng)適于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。對于多種宿主細(xì)胞，多類適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列為所屬領(lǐng)域中已知。通常，所述一個或多個調(diào)控核苷酸序列可包括(但不限于)啟動子序列、前導(dǎo)序列或信號序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或活化子序列。本發(fā)明涵蓋如所屬領(lǐng)域中已知的組成性或可誘導(dǎo)啟動子。所述啟動子可為天然存在的啟動子，或組合一個以上啟動子元件的雜合啟動子。表達(dá)構(gòu)筑體可存在于細(xì)胞附加體(諸如質(zhì)粒)上，或表達(dá)構(gòu)筑體可插入染色體中。在優(yōu)選實施例中，表達(dá)載體含有允許選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基因為所屬領(lǐng)域眾所周知，并將隨所使用的宿主細(xì)胞變化。表達(dá)載體還可包括融合結(jié)構(gòu)域(通常由表達(dá)載體提供)，因此本發(fā)明的重組多肽表達(dá)為具有所述融合結(jié)構(gòu)域的融合多肽的形式。融合結(jié)構(gòu)域的主要優(yōu)點(diǎn)在于其有助于鑒別和/或純化所述融合多肽，并且還能增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和總產(chǎn)率?？贵w另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合本文所揭示的復(fù)合物的抗體，或其抗原結(jié)合片段。在某些實施例中，所述抗體能增加本文所揭示的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性。在其它實施例中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能減少或抑制本文所揭示的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性。例示性抗體分子包括完全免疫球蛋白分子或其含有例如抗原結(jié)合位點(diǎn)的部分(包括45所屬領(lǐng)域中稱為F(ab)、F(ab')、F(ab')2、人類化嵌合抗體和F(v)的免疫球蛋白分子的部分)。可通過所屬領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。(柯勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)(1975)自然(A^fwe)256,495-497;坎貝爾(Campbell)"卓^"靨拔沐犮術(shù)，喊齒動激^7乂^^;^)^游虔/吝/〃表,(Mo"oc/o"a/J",/6o辦7fec/z"o/ogy,Ae/Vocwc,/owawt/C7wra"en'za//owawd//w附aw//少6"'c/o附(xy)",伯屯頁(Burdon)等人(編)(1985)"主激眾學(xué)/〃i^f全激學(xué)^"術(shù)(Za6orW。o;7fec/zm々w^5/oc/em/W7Mo/ecw/ar5z'o/ogy)",第13巻，愛思唯爾科技出版公司(ElsevierSciencePublishers)，阿姆斯特丹(Amsterdam);哈洛維(Harlow)和拉尼(Lane)(編)(1988)"拔沐試驗宜手I(顛'6oc^"丄a6ora—Ma畫/)〃，冷7突港幼版教(ColdSpringHarborPress),紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y);所有所述文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式并入本文中?？墒褂帽景l(fā)明的經(jīng)純化復(fù)合物或其多肽組分使動物免疫，從而獲得與復(fù)合物特異性反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體?？墒褂猛暾麖?fù)合物或全長多肽組分作為免疫原，或使用其片段來獲得所述抗體。也可使用較小的多肽片段來使動物免疫。另外，肽免疫原可在羧基末端含有半胱氨酸殘基，并且與諸如鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)等半抗原連結(jié)?？赏ㄟ^用硫酸酪氨酸殘基置換酪氨酸殘基來產(chǎn)生其它肽免疫原。所屬領(lǐng)域中已知合成所述肽的方法，如例如奧斯貝爾(Ausbel)等人(編)(1987)現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程(/"CwreWiVo/ocoAy/"Mo/ecw/w,約翰威立父子出版公司(JohnWileyandSons)(紐約州紐約(NewYork，N.Y.))中所述?？赏ㄟ^如以下文獻(xiàn)中所揭示的所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)來產(chǎn)生經(jīng)修飾抗體或其抗原結(jié)合片段例如，伍德(Wood)等人，國際公開案WO91/00906;庫契拉帕底(Kucherlapati)等人，國際公開案WO91/10741;朗伯格(Lonberg)等人,國際公開案WO92/03918;肯(Kay)等人，國際公開案WO92/03917;朗伯格(Lonberg)等人(1994)自然(胸訓(xùn))368:856-59;格林(Green)等人(1994)自然-遺傳學(xué)(胸.G匿O7:13-21;莫里森(Morrison)等人(1994)美國國家科學(xué)院院刊(Prac.Ato/.Xcac/.U.S.A.)81:6851-55;布魯格曼(Bruggeman)等人(1993)免疫學(xué)時代()7:33-40;圖瓦盧(Tuaillon)等人(7，美國國家科學(xué)院院刊(Prac.Ato/.爿cad.Sc/.U.S.A.)卯:3720-24;布魯格曼(Bruggeman)等人(1991)歐洲免疫學(xué)雜志(￡wr.乂/附/mmo/.)21:1323-1326;拉瑞克(Larrick)等人(1991)生物技術(shù)(Ao"c/mz々ww)11:152-56;羅賓遜(Robinson)等人，國際專利申請案PCT/US86/02269;阿卡拉(Akira)等人歐洲專利申請案184,187;朝美(Taniguchi),歐洲專利申請案171,496;莫里森(Morrison)等人，歐洲專利申請案173,494;紐伯格(Neuberger)等人，國際公開案WO86/01533;卡比利(Cabilly)等人，美國專利第4,816,567號；貝特(Better)等人(1988)科學(xué)(Sc/e"ce)240:1041-43;劉(Liu)等人(1987)美國國家科學(xué)院院刊(Prac.淑/.U.S.A.)84:3439-43;劉(Liu)等人(1987)免醫(yī)學(xué)雜志(■/./國腸/.)139:3521-26;孫(Sun)等人(1987)美國國家科學(xué)院院刊(iVoc.iVa".Jcat/.Sc!'.U.S.A.)84:214-18;西村(Nishimura)等人(1987)癌癥研究(Ca"c.i仏)47:999-1005;伍德(Wood)等人(1985)自然(淑訓(xùn))314:446-49,'席瓦(Shaw)等人(1988)美國癌癥研究所雜志(/Ato/.Oj"cw/"W.)80:1553-59;莫里森(Morrison)(1985)科學(xué)(Sc/e腦)229:1202-07;奧伊(Oi)等人(1986)生物技術(shù)(歷orec/zm々w")4:214;和奎恩(Queen)等人，美國專利第5,585,089號、第5,693,761號和第5,693,762號，所有所述文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式并入本文中。這些方法包括分離、處理和表達(dá)編碼來自重鏈或輕鏈中至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知所述核酸的來源，并且例如可從產(chǎn)生抗預(yù)定靶的抗體的雜交瘤獲得所述核酸來源。隨后，可將編碼重組抗體的重組DNA或其片段克隆到適當(dāng)表達(dá)載體中。用于鑒別調(diào)節(jié)復(fù)合物形成的測試化合物的分析另一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別測試化合物的方法或分析，所述測試化合物可調(diào)節(jié)(例如，抑制或增加)包括測試化合物、免疫親和素和鈣通道亞基的復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性。所述方法或所述分析包括使包括免疫親和素或其功能性變異體和卩亞基或其功能性變異體的樣本與測試化合物在允許形成復(fù)合物的條件下接觸；相對于參考樣本(例如，未暴露于測試試劑的對照樣本，或暴露于雷帕霉素的對照樣本)，檢測與測試化合物接觸的樣本中復(fù)合物的存在。在存在測試化合物的情況下復(fù)合物的含量相對于參考樣本中復(fù)合物含量的變化(例如，增加或降低)表明，所述測試化合物能影響(例如，增加或降低)所述復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性。優(yōu)選測試化合物使復(fù)合物的形成相對于參考樣本增加例如約1.5、2、5、10倍或更高?？衫鐝募?xì)菌、放線菌(例如，吸水鏈霍葳)、酵母或其它有機(jī)體(例如，天然產(chǎn)物)獲得測試化合物；以化學(xué)方法產(chǎn)生(例如，小分子，包括肽模擬物)或通過重組產(chǎn)生測試化合物。舉例來說，可由天然存在或以遺傳學(xué)方式修飾的鏈霉慮—^^產(chǎn)生聚酮，如例如U.S.2005/0272133、U.S.2005/0197379中所述?；蛘?，可通過化學(xué)合成得到經(jīng)修飾形式的本文所揭示的雷帕霉素和美立霉素類似物。本發(fā)明的復(fù)合物允許產(chǎn)生新的經(jīng)修飾大環(huán)內(nèi)酯，例如經(jīng)修飾形式的本文所揭示的雷帕霉素和美立霉素類似物。可使用經(jīng)純化復(fù)合物來測定三維晶體結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)可用于建立分子間相互作用模型。舉例來說，可測定復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并且可通過使用所屬多種分析形式可滿足此目的，并且根據(jù)本揭示案，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員仍將能夠理解本文中未明確描述的分析。接近諸如形成蛋白質(zhì)復(fù)合物、酶促活性等條件的分析形式可以多種不同形式發(fā)生，且其包括基于例如經(jīng)純化蛋白質(zhì)或細(xì)胞溶解產(chǎn)物等無細(xì)胞系統(tǒng)的分析，以及利用完整細(xì)胞的基于細(xì)胞的分析?？墒褂煤喴椎慕Y(jié)合分析來檢測抑制或增強(qiáng)復(fù)合物的各組分之間的相互作用或復(fù)合物與底物的結(jié)合的化合物。在某些實施例中，本發(fā)明提供重構(gòu)蛋白質(zhì)制劑，其包括復(fù)合物的多肽以及所述復(fù)合物的一種或多種相互作用多肽。在一個實施例中，將所有組分或復(fù)合物同時加入反應(yīng)混合物中。在其它實施例中，通過依次添加各組分，例如形成免疫親和素與鈣通道的混合物，并添加免疫親和素配體，來制備反應(yīng)混合物?；蛘撸蓪⒚庖哂H和素配體加入免疫親和素或鈣通道中。可使用各組分的任何次序或組合。本發(fā)明的分析包括經(jīng)標(biāo)記的活體外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫分析等。在一個實施例中，樣本為細(xì)胞溶解產(chǎn)物或重構(gòu)系統(tǒng)。重構(gòu)復(fù)合物可包含至少半純化蛋白質(zhì)的重構(gòu)混合物。半純化是指已預(yù)先將重構(gòu)混合物中所用的蛋白質(zhì)與其它細(xì)胞蛋白分離。舉例來說，相比細(xì)胞溶解產(chǎn)物，復(fù)合物形成中所涉及的蛋白質(zhì)是以相對于混合物中的所有其它蛋白質(zhì)至少50%的純度存在于混合物中，且更優(yōu)選以90-95%純度存在。在某些實施例中，通過混合高純度蛋白質(zhì)來得到重構(gòu)蛋白質(zhì)混合物，因此重構(gòu)混合物中實質(zhì)上不含可能干擾或以其它方式改變測量復(fù)合物組裝和/或解體的能力的其它蛋白質(zhì)(諸如細(xì)胞來源的蛋白質(zhì))。在某些實施例中，可在適于容納反應(yīng)物的任何容器中實現(xiàn)在存在和不存在候選化合物的情況下進(jìn)行的分析。實例包括微量滴定盤、試管和微量離心管。在某些實施例中，可發(fā)生藥物篩選分析，所述分析將根據(jù)測試化合物干擾本發(fā)明復(fù)合物的組裝、穩(wěn)定性或功能的能力來檢測測試化合物。復(fù)合物的檢測和定量提供一種測定化合物抑制(或增強(qiáng))各組分之間的相互作用的功效的方式?？赏ㄟ^由使用各種濃度的測試化合物獲得的數(shù)據(jù)產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線來評定化合物的功效。此外，還可進(jìn)行對照分析來提供基線以供比較。在對照分析中，復(fù)合物的形成是在不存在測試化合物的情況下定量。在某些實施例中，可通過多種技術(shù)來檢測復(fù)合物中任何兩個多肽之間的締合或復(fù)合物與底物多肽之間的締合，所述技術(shù)中的多者已在上文中有效描述。舉例來說，可例如使用可檢測標(biāo)記的蛋白質(zhì)(例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記)，藉由免疫分析或藉由色譜檢測來定量對于復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)。還可使用表面等離子共振系統(tǒng)(諸如，自拜厄克國際公司(BiacoreInternationalAB)(瑞典烏普薩拉(U卯sala,Sweden))可得的表面等離子共振系統(tǒng))來檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。在某些實施例中，可將復(fù)合物的一種多肽固定以促進(jìn)使復(fù)合物與未復(fù)合形式的一種多肽分離，并且適應(yīng)分析的自動化。本文中已描述親和基質(zhì)或珠粒，其含有允許復(fù)合物的其它組分與不可溶基質(zhì)結(jié)合的免疫親和素配體(或復(fù)合物的其它組分)。在有助于形成復(fù)合物的條件下培育測試化合物。培育后，洗滌珠粒以去除任何未結(jié)合的相互作用蛋白質(zhì)，并直接測定基質(zhì)珠粒所結(jié)合的放射性標(biāo)記(例如，將珠粒放入閃爍檢測器中)，或例如當(dāng)使用微量滴定盤時，在使復(fù)合物解離后在上清液中測定所述放射性標(biāo)記?；蛘?，在洗掉未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，可將復(fù)合物自基質(zhì)解離，通過SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，并使用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)，由所述凝膠測定基質(zhì)結(jié)合部分中所見的相互作用多肽的含量。另外，可使用培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，經(jīng)純化的培養(yǎng)細(xì)胞或重組細(xì)胞)來進(jìn)行分析。舉例來說，可使用雙雜交分析(也稱為相互作用陷阱分析(interactiontrapassay))來檢測復(fù)合物中任何兩個多肽的相互作用，且隨后檢測抑制或增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的測試化合物(也參看，美國專利第5，283，317號;W094/10300;澤沃斯(Ze醒)等人，(1993)細(xì)胞(Ce〃)72:223-232;瑪杜拉(Madura)等人，(1993)生物化學(xué)雜志(乂編.CA縫)268:12046-12054;巴瑞爾(Barrel)等人，(1993)生物技術(shù)(5/Wec/zm々w")14:920-924;和巖辦l(Iwabuchi)等人，(1993)腫瘤學(xué)(O"cog簡)8:1693-1696)，所有所述文獻(xiàn)的內(nèi)容都以引用的方式并入本文中。在測試化合物和天然提取物文庫的許多藥物篩選程序中，都需要高通量分析以便使在指定時間段內(nèi)所調(diào)查的化合物的數(shù)量最大化。以無細(xì)胞系統(tǒng)(諸如，可利用純化或半純化蛋白質(zhì)或溶解產(chǎn)物產(chǎn)生的無細(xì)胞系統(tǒng))進(jìn)行的本發(fā)明的分析通常優(yōu)選作為"初步"篩選，這是因為，所述分析的產(chǎn)生能允許快速顯現(xiàn)并相對容易地檢測測試化合物所介導(dǎo)的分子靶的變化。此外，在活體外系統(tǒng)中通?？珊雎詼y試化合物的細(xì)胞毒性和/或生物可用性作用，而分析的焦點(diǎn)主要集中于，在與其它蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的變化或分子靶的酶促特性改變方面可能表現(xiàn)的藥物對分子靶的作用。在某些實施例中，蛋白質(zhì)復(fù)合物的活性可包括(不限于)蛋白質(zhì)復(fù)合物形成，這可通過免疫沉淀和共沉淀蛋白質(zhì)的分析或者親和純化和共純化蛋白質(zhì)的分析來評定。還可使用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的分析來測定復(fù)合物的形成。彼此極為接近的具有適當(dāng)發(fā)射和激發(fā)光譜的熒光分子可展現(xiàn)FRET。對熒光分子加以選擇以使一個分子(供體分子)的發(fā)射光譜與另一分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊。通過在供體激發(fā)光譜范圍內(nèi)的適當(dāng)強(qiáng)度的光來激發(fā)供體分子。隨后，供體以熒光形式發(fā)射所吸收的能量。通過受體分子使其產(chǎn)生的熒光能淬滅。FRET可表現(xiàn)為來自供體的熒光信號的強(qiáng)度的降低、其激發(fā)態(tài)的壽命的縮短和/或在受體的較長波長(較低能量)特征下再發(fā)射熒光。當(dāng)以物理方式分離熒光蛋白時，F(xiàn)RET效應(yīng)有所減小或經(jīng)消除?；贔RET的分析描述于美國專利第5,981,200號中，所述專利的內(nèi)容以引用的方式并入本文中。一般說來，當(dāng)篩選分析為結(jié)合分析(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合、化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合等)時，一個或多個分子可與標(biāo)記連接，其中所述標(biāo)記可直接或間接提供可檢測信號。各種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、特異性結(jié)合分子、粒子(例如，磁性粒子)等。特異性結(jié)合分子包括諸如生物素與抗生蛋白鏈菌素、地高辛(digoxin)與抗地高辛等對。對于特異性結(jié)合的成員，通常利用能根據(jù)已知程序進(jìn)行檢測的分子來標(biāo)記互補(bǔ)成員。篩選分析中可包括多種其它試劑。這些試劑包括如鹽、中性蛋白(例如白蛋白)、清潔劑等用于促進(jìn)最佳蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用的試劑?？墒褂酶纳品治龉πУ脑噭?，諸如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌化合物等。各組分的混合物是以提供必要結(jié)合的任何次序添加。培育是在任何適當(dāng)溫度下，通常在介于4與40'C之間的溫度下進(jìn)行。對培育期加以選擇以得到最佳活性，但也可對其進(jìn)行優(yōu)化以促進(jìn)快速高通量的篩選。在某些實施例中，可進(jìn)一步分析測試化合物以鑒別出調(diào)節(jié)鈣通道活性的化合物。舉例來說，可通過在將具有功能性鈣通道(例如，異源通道)的真核細(xì)胞暴露于含有測試化合物和鈣通道選擇性離子的溶液時，測試所述細(xì)胞的鈣通道活性，并將所測量的鈣通道活性與在不含有測試化合物的溶液中的相同細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)上一致的對照細(xì)胞的鈣通道活性相比較，來測量測試化合物的作用。在一個實施例中，將細(xì)胞保持在具有當(dāng)鈣通道打開時足以提供內(nèi)部電流的鈣通道選擇性離子濃度的溶液中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知實踐所述分析的方法。舉例來說，關(guān)于應(yīng)用非洲爪蟾(Xem^M/fleWs)卵母細(xì)胞和乙酰膽堿受體的類似方法，參看密示納(Mishina)等人，(1985)自然(Atowe)313:364;諾達(dá)(Noda)等人，(1986)自然(淑匿)322:826-828;克羅迪奧(Claudio)等人，(1987)科學(xué)(Sc/e"ce)238:1688-1694。這些分析都是基于表達(dá)功能性鈣通道的細(xì)胞，并且功能性(諸如以電生理學(xué)方式)測量測試化合物通過異源功能性通道增強(qiáng)、拮抗或以其它方式調(diào)節(jié)鈣通道選擇性離子(諸如C^+或Ba++)流動幅度和持續(xù)時間的能力。在一個實施例中，可直接(諸如，以電生理學(xué)方式)測定流過細(xì)胞的重組鈣通道的電流量；或在另一實施例中，可通過監(jiān)測50在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生并且以鈣(或其它)離子依賴性方式受到直接影響的獨(dú)立反應(yīng)，來測定所述電流量?？蓪⒃u定鈣通道活性的任何方法與本文所述的方法組合使用。舉例來說，在用于測試化合物調(diào)節(jié)鈣通道活性的能力的方法的一個實施例中，通過所述化合物在對鈣通道選擇性離子敏感并且使用表達(dá)異源鈣通道且還含有可操作性連接到編碼指示蛋白的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄控制元件以供表達(dá)的真核細(xì)胞的反應(yīng)中所作的調(diào)節(jié)，來測量電流量。用于轉(zhuǎn)錄指示基因的轉(zhuǎn)錄控制元件在細(xì)胞中會對鈣通道選擇性離子(諸如C^+和Ba+)作出響應(yīng)。所述基于轉(zhuǎn)錄的分析的細(xì)節(jié)例如描述于PCT國際專利申請案第PCT/US91/5625號中。在其它實施例中，可利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知且在本文中例示說明的測量鈣通道活性的電生理學(xué)方法達(dá)成所述目的?？墒褂萌魏嗡龇椒ㄒ员銠z測功能性鈣通道的形成并表征所得電流的動力學(xué)和其它特征。在其它實施例中，可將藥理學(xué)研究與電生理學(xué)測量組合，以便進(jìn)一步表征鈣通道。一般說來，可通過檢測給定的測試化合物影響以下一種或多種作用的能力來分析所述化合物在神經(jīng)系統(tǒng)中的活性促進(jìn)神經(jīng)突起生長；保護(hù)神經(jīng)元免于被化學(xué)處理損害；促進(jìn)神經(jīng)元或神經(jīng)元細(xì)胞生長；恢復(fù)喪失或受損的與神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織或器官有關(guān)的運(yùn)動、功能或認(rèn)知能力；或使神經(jīng)元再生。舉例來說，可通過所屬領(lǐng)域中已知的方法來分離和培養(yǎng)經(jīng)分離的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，多巴胺能、皮層、DRG細(xì)胞培養(yǎng)物)(例如，參看龐(Pong)等人，(1997)神經(jīng)化學(xué)雜志UA^wrac/zem.)69:986-994;龐(Pong)等人，(2001)實驗神經(jīng)學(xué)(五x/7A^/ra/.)171(1):84-97)?？墒褂萌?例如)US2005/0197356(描述展示分別測量所培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元中3H-多巴胺吸收和神經(jīng)絲蛋白含量的改變的實例)中所述的技術(shù)認(rèn)可的技術(shù)，檢測并定量測定神經(jīng)元活性、分化、存活的改變?；蛘?，可在所培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞系(例如，祌經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系、嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)、Fll)中表征神經(jīng)元活性?；铙w外活性可用于鑒別可用于治療和/或緩解多種人類神經(jīng)變性病況的藥劑，所述神經(jīng)變性病況包括(但不限于)帕金森氏?。话⑵澓Ｄ喜?；肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)、外傷性損傷、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、糖尿病性神經(jīng)病、與諸如化療等藥物治療有關(guān)的神經(jīng)病、局部缺血或局部缺血誘發(fā)的損傷、中風(fēng)等。檢測神經(jīng)元活性的方法例如包括神經(jīng)保護(hù)分析，其中將測試化合物防止谷氨酸神經(jīng)毒性的能力。還可分析感覺神經(jīng)元培養(yǎng)物(DRG)的神經(jīng)突起生長，并分析其神經(jīng)營養(yǎng)活性。用免疫親和素配體處理所培養(yǎng)的細(xì)胞，且隨后分析新的神經(jīng)突起纖維的存在。免疫組織化學(xué)可有助于如與對照相比較時神經(jīng)突起的觀測和定量。已研發(fā)出多種動物模型和細(xì)胞培養(yǎng)分析，并且其可取決于與疾病治療(包括上文所述的人類疾病)的臨床相關(guān)性。以下各參考文獻(xiàn)可用作這些分析的來源，并且所有所述參考文獻(xiàn)都是以全文引用的方式特別地并入本文中以達(dá)成所述目的斯坦納(Steiner)等人，美國國家科學(xué)院院刊(iVoc.A^McfldSWf/.S.A)94:2019-2024(1997);漢密爾頓(Hamilton)等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(祝oorg朋.C/zew.丄e仏)7:1785-1790(1997);麥克馬洪(McMahon)等人，神經(jīng)生物學(xué)新觀點(diǎn)(5:616-624(1995);蓋希(Gash)等人，自然(淑匿)380:252-255(1996);杰拉奇(Gerlach)等人，歐洲藥理學(xué)雜志一分子藥理學(xué)部分(￡w.乂P/mmaco/-Mo/.戶/zarmaco/)208:273-286(1991);安普費(fèi)爾(Apfel)等人，腦研究(5ra/"i仏)634:7-12(1994);王(Wang)等人，藥理學(xué)和實驗治療學(xué)研究(/P/zawmco/Ex;.T7zera/.)282:1084-1093(1997);古德(Gold)等人，實驗神經(jīng)學(xué)(Ex/7.JVewra/.)147:269-278(1997);霍伏爾(Hoffer)等人，神經(jīng)傳導(dǎo)雜志(/A^wa/7>a"^0/"譜邦_/49:1-10(1997);和李恩斯(Lyons)等人，美國國家科學(xué)院院刊(iWAS)91:3191-3195(1994)。治療和預(yù)防用途另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)表達(dá)免疫親和素(例如，F(xiàn)KBP52)或其功能性變異體和電壓門控L型鈣通道亞基(例如，(31亞基)或其功能性變異體的細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)的功能(例如，鈣通道活性(例如，電壓門控鈣通道活性))的方法。在一個實施例中，鈣通道或FKBP52活性或表達(dá)受到抑制。在鈣通道活性受到抑制的實施例中，優(yōu)選刺激神經(jīng)突起生長和/或存活。通常，用于本發(fā)明方法中的細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞(例如，神經(jīng)元或心血管細(xì)胞)。在一些實施例中，所述方法包括使細(xì)胞與免疫親和素配體(例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物)在允許形成本文所述的復(fù)合物的條件下接觸，由此抑制鈣通道活性。在相關(guān)實施例中，所述方法包括使細(xì)胞(例如，多巴胺能、膽堿能、皮層和脊髓神經(jīng)元細(xì)胞)與鈣通道P亞基(例如，電壓門控L型鈣通道pi亞基)的拮抗劑接觸。所述拮抗劑也可為鈣通道(3亞基的活性和/或表達(dá)的抑制劑。如本文所使用，術(shù)語"拮抗劑"是指降低、抑制或以其它方式減小鈣通道卩亞基(例如，|31亞基)的一種或多種生物活性的試劑。拮抗作用未必表示完全消除鈣通道(3亞基的生物活性。在一個實施例中，所述拮抗劑為免疫親和素配體，例如，如本文所述的雷帕霉素或美立霉素類似物。通常，免疫親和素配體是以足以形成包括配體、免疫親和素或其功能性變異體和鈣通道亞基或其功能性變異體的復(fù)合物和/或使所述復(fù)合物穩(wěn)定的量投與。在其它實施例中，拮抗劑為52鈣通道P亞基的轉(zhuǎn)錄抑制劑，例如，如本文中較詳細(xì)描述的核酸抑制劑(例如RNAi)。本發(fā)明的方法可以在培養(yǎng)基中的細(xì)胞進(jìn)行?；蛘撸鳛槔缁铙w內(nèi)(例如治療或預(yù)防)方案的一部分，可對個體中存在的細(xì)胞(例如，神經(jīng)元細(xì)胞或心血管細(xì)胞)、或在動物個體(例如，活體內(nèi)動物模型))內(nèi)執(zhí)行所述方法。因此，本發(fā)明涵蓋治療或預(yù)防個體的與鈣通道功能障礙有關(guān)的病癥的方法。所述方法包括對個體投與足以形成包括免疫親和素配體、免疫親和素或其功能性變異體和鈣通道亞基或其功能性變異體的復(fù)合物和/或使所述復(fù)合物穩(wěn)定的量的免疫親和素配體(例如，雷帕霉素或美立霉素類似物)，由此治療或預(yù)防所述病癥。所述方法可任選包括以下步驟鑒別(例如，評估、診斷、篩選和/或選擇)具有患一種或多種與涉及鈣通道功能障礙的病癥有關(guān)的癥狀的風(fēng)險或具有所述癥狀的個體。所述個體可為例如罹患神經(jīng)變性病癥或心血管病癥的哺乳動物，例如人類。舉例來說，所述個體為罹患選自以下一者或多者的病癥的人類(例如，人類患者)中風(fēng)、帕金森氏病、偏頭痛、小腦性共濟(jì)失調(diào)、心絞痛、癲癇、高血壓、局部缺血或心律失常。如本文所使用，術(shù)語"個體"意欲包括人類和非人類動物。優(yōu)選人類動物包括患有以異常鈣通道活性為特征的病癥的人類患者。術(shù)語"非人類動物"包括脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、嚙齒動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。所述個體可為例如罹患神經(jīng)變性病癥或心血管病癥的哺乳動物，例如人類。短語免疫親和素配體的"治療有效量"是指在對個體(例如，人類患者)投與單次或多次劑量后，能有效治療個體的藥劑的量。術(shù)語"治療"包括治愈病癥、降低病癥的一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度、緩解病癥的一種或多種癥狀，或延長個體的存活期超過在不存在所述治療的情況下所預(yù)期的存活期。類似地，短語免疫親和素配體的"預(yù)防有效量"是指在對個體(例如，人類患者)投與單次或多次劑量后，能有效預(yù)防或延遲病癥(例如，如本文所述的病癥)的發(fā)作或復(fù)發(fā)的發(fā)生的藥劑的量?？蓡为?dú)投與免疫親和素配體(例如，雷帕霉素類似物)，或可將其與一種或多種藥劑(例如治療劑)組合投與。在此情況中，術(shù)語"組合"意思指各藥劑是實質(zhì)上同時(同時或依次)給與。如果依次給與，則在開始投與第二化合物時，優(yōu)選仍能在治療部位檢測到有效濃度的兩種化合物中的第一化合物。在一個實施例中，第二藥劑為鈣通道拮抗劑，例如L型鈣通道拮抗劑。L型鈣通道拮抗劑的實例包括二氫吡啶；苯基垸基胺(例如，維拉帕米(verapamil)、加洛帕米(gallpamil)和噻帕米(thiapamil));苯并硫氮雜卓；二苯基丁基哌啶類抗精神分裂癥神經(jīng)安定藥(例如匹莫齊特(pimozide)、fluspiridine、五氟利多(penfluridol)和氯哌莫齊(clopimozide));以及硝苯地平(nifedipine)、卡馬西平(carbamazepine)、地爾硫卓(diltiazem)、尼卡地平(nicardipine)、尼莫i也平(nimodipine)禾口'尼群i也平(nitredipine)。與鈣通道功能障礙有關(guān)的例示性病癥包括中風(fēng)；帕金森氏病；偏頭痛(例如，先天性偏頭痛)；小腦性共濟(jì)失調(diào)；心絞痛；癲癇；高血壓；局部缺血(例如，心肌缺血)；心律失常；中風(fēng)；頭部外傷或脊髓損傷，或其它腦部、周圍神經(jīng)、中樞神經(jīng)或神經(jīng)肌肉系統(tǒng)損傷；慢性、神經(jīng)性或急性疼痛；情緒障礙；精神分裂癥；抑郁癥；焦慮癥；精神?。凰幬锍砂a；酒精依賴和尿失禁。與鈣(Ca2+)離子通道功能障礙有關(guān)的其它病況的實例包括(但不限于)惡性高熱癥、中央軸突癥(centralcoredisease)、兒茶酚胺多形性室速(cathecolaminergicpolymorphicventriculartachycardia)和2型致心律失常性右心室心肌病(ARVD-2)?？墒褂帽景l(fā)明方法治療的神經(jīng)病癥的實例包括阿茲海默氏?。缓嗤㈩D氏病(Huntington'sdisease);脊髓損傷；外傷性腦損傷；路易體癡呆(Lewybodydementia);皮克氏病(Pick'sdisease);尼曼-匹克病(Niewmann-Pickdisease);淀粉樣血管?。坏矸蹣幽X血管?。蝗硇缘矸蹣幼冃圆。槐鶏u型遺傳性腦出血伴淀粉樣變(hereditarycerebralhemorrhagewithamyloidosisoftheDutchtype);包涵體肌炎；輕度認(rèn)知障礙；唐氏綜合癥(Down'ssyndrome);和神經(jīng)肌肉病癥，包括肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)性硬化，和肌營養(yǎng)不良，包括裘馨氏肌營養(yǎng)不良(Duchennedystrophy)、貝克型肌營養(yǎng)不良(Beckermusculardystrophy)、面肩胛臂(蘭迪二氏(Landouzy-Dejerine))肌營養(yǎng)不良和肢帶型肌營養(yǎng)不良(LGMD)。免疫親和素配體還可用作神經(jīng)保護(hù)和/或神經(jīng)再生試劑，例如以便在一種上述病況和/或損傷、中風(fēng)或其它外傷發(fā)作后保留某種神經(jīng)和/或神經(jīng)肌肉或其它功能?？芍委煹钠渌难懿“Y的實例包括(但不限于)充血性心力衰竭；心律失常綜合癥，包括陣發(fā)性心動過速、遲后去極化、室性心動過速、猝死心動過速、運(yùn)動誘發(fā)的心律失常、長QT綜合癥和雙向性心動過速；血栓性病癥，包括動脈心血管血栓性病癥、靜脈心血管血栓性病癥和心室中的血栓性病癥；動脈粥樣硬化；再狹窄；周圍動脈疾病；冠狀動脈旁路移植手術(shù)；頸動脈疾??；動脈炎；心肌炎；心血管炎癥；血管炎癥；冠心病(CHD);不穩(wěn)定型心絞痛(UA);難治性不穩(wěn)定型心絞痛；穩(wěn)定型心絞痛(SA);慢性穩(wěn)定型心絞痛；急性冠狀動脈綜合癥(ACS);首次或復(fù)發(fā)型心肌梗塞；急性心肌梗塞(AMI);心肌梗塞；非Q波心肌梗塞；非STE心肌梗塞；冠狀動脈疾?。蝗毖孕呐K?。蝗毖遭?；短暫性缺血發(fā)作；中風(fēng)；周圍動脈閉塞??；靜脈血栓；深靜脈血栓癥；血栓性靜脈炎；動脈栓塞；冠狀動脈血栓癥；腦動脈血栓癥；腦栓塞；腎栓塞；肺栓塞；由以下因素引起的血栓癥(a)人工瓣膜或其它植入物、(b)留置導(dǎo)管、(C)支架、(d)心肺旁路、(e)血液透析或(f)將血液暴露于促進(jìn)血栓癥的人工表面的其它程序；由動脈粥樣硬化、手術(shù)或手術(shù)并發(fā)癥、長期固定、動脈纖顫、先天性血栓形成體質(zhì)、癌癥、糖尿病、藥物或激素作用和妊娠并發(fā)癥引起的血栓癥；心律失常，包括室上性心律失常、房性心律失常、房性早搏、心房纖顫；心臟病心血管藥物手冊(份WD^a7fexAooA:o/CaW畫扁/wMWc/weJ>,第2巻集，第6版，2001,尤金布朗瓦爾德(EugeneBrau匪ld),道格拉斯P.澤普斯(DouglasP.Zipes),皮特里布(PeterLibby),道格拉斯D.澤普斯(DouglasD.Zipes)以及其藥物制備中所列的其它疾病。在另一實施例中，心血管疾病是選自以下一種或多種疾病動脈粥樣硬化；冠心病(CHD);再狹窄；周圍動脈疾病；冠狀動脈旁路移植手術(shù)；頸動脈疾??；動脈炎；心肌炎；心血管炎癥；血管炎癥；不穩(wěn)定型心絞痛(UA);難治性不穩(wěn)定型心絞痛；穩(wěn)定型心絞痛(SA);慢性穩(wěn)定型心絞痛；急性冠狀動脈綜合癥(ACS);心肌梗塞；或急性心肌梗塞(AMI),包括首次或復(fù)發(fā)型心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高心肌梗塞和ST段抬高心肌梗塞。免疫親和素配體的量或劑量需求可視病況、所呈現(xiàn)的癥狀的嚴(yán)重程度和所治療的特定個體而變化。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地測定遵循本文所述的方法所需的免疫親和素配體的量。優(yōu)選免疫親和素配體的劑量足以形成包括所述配體、免疫親和素或其功能性變異體和鈣通道亞基或其功能性變異體的復(fù)合物和/或使所述復(fù)合物穩(wěn)定。在一些實施例中，可遵循本發(fā)明的教示，在活體外測試所述劑量。在一個實施例中，投與約0.5到200mg、約0.5到100mg、約0.5到約75mg。在另一實施例中，投與約1到約25mg。在另一實施例中，投與約0.5到約10mg，尤其當(dāng)與另一藥劑組合使用時如此投與。在另一實施例中，投與約2到約5mg。在另一實施例中，投與約5到約15mg。治療可以低于產(chǎn)生所需作用所需的劑量并且通常低于免疫親和素配體的最佳劑量的配體劑量起始。此后，可增加劑量直到在所述情況下達(dá)到最佳作用。確切劑量將由投藥醫(yī)生根據(jù)由所治療的個別個體獲得的經(jīng)驗確定。一般說來，最適宜投與通常會提供有效結(jié)果而不引起任何不利或有害副作用的濃度的組合物。在某些組合物中，使用核酸拮抗劑來減少編碼鈣通道卩亞基(例如，Pl亞基)的內(nèi)源基因的表達(dá)。在一個實施例中，核酸拮抗劑為靶向編碼鈣通道P亞基的mRNA的siRNA。還可使用其它類型的拮抗性核酸，例如dsRNA、核糖酶、三螺旋形成劑或反義核酸。在一些實施例中，可將核酸拮抗劑導(dǎo)向鈣通道P亞基的下游效應(yīng)靶。siRNA為任選包括突出端的小雙鏈RNA(dsRNA)。舉例來說，siRNA的雙鏈區(qū)為約18到25個核苷酸長，例如約19、20、21、22、23或24個核苷酸長。通常，siRNA序列與靶mRNA完全互補(bǔ)。具體說來，可使用dsRNA和siRNA使哺乳動物細(xì)胞(例如，人類細(xì)胞)的基因表達(dá)沉默。siRNA還包括具有29個堿基對的莖和2個核苷酸的3'突出端的短發(fā)夾RNA(shRNA)。例如，參看克萊門斯(Clemens)等人，(2000)美國國家科學(xué)院院刊(尸亂胸/.爿ca"c/.,)97:6499-6503;比利(Billy)等人，(2001)美國國家科學(xué)院院刊(P亂淑/.jca"c/."&4)98:14428-14433;巴希爾(Elbashir)等人，(2001)自然(Atowe.)411:494-8;楊(Yang)等人，(2002)美國國家科學(xué)院院刊(Prac.淑/.^cac/.Scz..99:9942-9947;塞科拉斯(Siolas)等人，(2005),自然生物技術(shù)(淑.5/o&c/z"o/.)23(2):227-31;20040086884;U.S.20030166282;20030143204;20040038278和20030224432。反義試劑可例如包括約8個到約80個核堿基(即，約8個到約80個核苷酸)，例如約8個到約50個核堿基或約12個到約30個核堿基。反義化合物包括核糖酶、外部引導(dǎo)序列(EGS)寡聚核苷酸(寡聚酶)，和與靶核酸雜交并調(diào)節(jié)其表達(dá)的其它短催化性RNA或催化性寡聚核苷酸。反義化合物可包括與靶基因序列互補(bǔ)的至少8個連續(xù)核堿基的伸長。寡聚核苷酸無需與其靶核酸序列100%互補(bǔ)以實現(xiàn)特異性雜交。當(dāng)寡聚核苷酸與耙的結(jié)合干擾耙分子的正常功能，從而引起失效，并且存在足夠的互補(bǔ)程度以在需要特異性結(jié)合的條件下(即，在活體內(nèi)分析或治療性治療的情況下，在生理條件下；或在活體外分析的情況下，在進(jìn)行所述分析的條件下)避免寡聚核苷酸與非靶分子序列的非特異性結(jié)合時，認(rèn)為寡聚核苷酸可特異性雜交。反義寡聚核苷酸與mRNA(例如，編碼鈣通道p亞基的mRNA)的雜交可干擾mRNA的一種或多種正常功能。mRNA受干擾的功能包括所有關(guān)鍵功能，諸如所述RNA轉(zhuǎn)位到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)；由所述RNA翻譯蛋白質(zhì)；得到一種或多種mRNA物質(zhì)的RNA剪接；和所述RNA可能涉及的催化活性。反義寡聚核苷酸與RNA的雜交還可干擾特定蛋白質(zhì)與RNA的結(jié)合。例示性反義化合物包括與靶核酸(例如，編碼鈣通道卩亞基的mRNA)特異性雜交的DNA或RNA序列?；パa(bǔ)區(qū)可延伸約8個到約80個核堿基。所述化合物可包括一個或多個經(jīng)修飾核堿基。經(jīng)修飾核堿基可例如包括5-取代的嘧啶，諸如5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶和C5-丙炔基嘧啶(諸如C5-丙炔基胞嘧啶和C5-丙炔基尿嘧啶)。其它適當(dāng)?shù)慕?jīng)修飾核堿基包括N、(d-d2)垸基氨基胞嘧啶和NN、(CrCn)二烷基氨基胞嘧啶。經(jīng)修飾核堿基還可包括7-取代的8-氮雜-7-去氮嘌呤和7-取代的7-去氮嘌呤，諸如7-碘-7-去氮嘌呤、7-氰基-7-去氮嘌呤、7-氨基羰基-7-去氮嘌呤。這些核堿基的實例包括6-氨基-7-56碘-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氰基-7-去氮嘌呤、6-氨基-7-氨基羰基-7-去氮嘌呤、2-氨基-6-羥基-7-碘-7-去氮嘌呤、2-氨基-6-羥基-7-氰基-7-去氮嘌呤和2-氨基-6-羥基-7-氨基羰基-7-去氮嘌呤。此外，包括N、甲基氨基腺嘌呤和N氣N^二甲基氨基腺嘌呤在內(nèi)的N6-(CrC12)烷基氨基嘌呤和NS,N、(Crd2)二烷基氨基嘌呤也為適當(dāng)?shù)慕?jīng)修飾核堿基。類似地，其它6-取代的嘌呤(例如包括6-硫鳥嘌呤)也可構(gòu)成適當(dāng)?shù)慕?jīng)修飾核堿基。其它適當(dāng)?shù)暮藟A基包括2-硫尿嘧啶、8-溴腺嘌呤、8-溴鳥嘌呤、2-氟腺嘌呤和2-氟鳥嘌呤。任一上述經(jīng)修飾核堿基的衍生物也是適當(dāng)?shù)摹Ｈ我磺笆龌衔锏娜〈砂–rC3o烷基、C2-C30烯基、C2-C30炔基、芳基、芳垸基、雜芳基、鹵基、氨基、酰胺基、硝基、硫基、磺酰基、羧基、烷氧基、烷基羰基、烷氧羰基等o也可獲得有關(guān)其它類型的核酸試劑的說明。例如，參看美國專利第4,987,071號、第5,116，742號和第5,093,246號；伍爾夫(Woolf)等人，(1992)美國國家科學(xué)院院刊(尸麼7Va"爿cac/Sc/"&4);及乂AA^4羅〃DAC4"wtoeweiAC4DiVv4),D.A.彌爾頓(D.A.Melton)編，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.)(1988);89:7305-9;漢斯霍夫(Haselhoff)和杰拉奇(Gerlach)(1988)自然(iVWw/r)334:585-59;海倫尼C.(Helene,C.)(1991)抗癌藥物設(shè)計"""ca"cwZ>wgDm.)6:569-84;海倫尼(Helene)(1992)紐約科學(xué)院年報(乂"".Jcac/.Sc,'.)660:27-36;和馬赫爾(Maher)(1992)生物分析(歷ocw;^w)14:807-15。醫(yī)藥組合物一方面，本發(fā)明包括制備含有一種或多種免疫親和素配體的醫(yī)藥組合物的方法。在其它實施例中，揭示含有本文所述的復(fù)合物的醫(yī)藥組合物。如本文所使用，含有"一種免疫親和素配體"或"所述免疫親和素配體"的組合物意欲涵蓋含有一種或多種免疫親和素配體的組合物。所述組合物可通過若干不同途徑投與哺乳動物個體，且合意地以固體或液體形式經(jīng)口投與?？赏ㄟ^將免疫親和素配體與一種或多種上述組分摻合來形成含有免疫親和素配體的固體形式，包括片劑、膠囊和囊片。在一個實施例中，組合物的各組分是以干法或濕法摻合。在另一實施例中，各組分是通過干法制粒。在另一實施例中，將各組分懸浮或溶解于液體中，并加入適于投與哺乳動物個體的形式中?？赏ㄟ^將免疫親和素配體溶解或懸浮于適于投與哺乳動物個體的液體中，來形成含有免疫親和素配體的液體形式。可使用醫(yī)藥有效量的免疫親和素配體來調(diào)配適于所需遞送途徑的任何形式的含有免疫親和素配體的本文所述的組合物。舉例來說，可通過諸如經(jīng)口、皮膚、透皮、支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、不經(jīng)腸、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道、直腸、舌下、顱內(nèi)、硬膜外、氣管內(nèi)等途徑，或通過持續(xù)釋放來遞送本發(fā)明的組合物。優(yōu)選經(jīng)口遞送。還可使用本發(fā)明的口服劑量的片劑組合物來制造含有所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫親和素配體衍生物(包括(但不限于)酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、醚、肟、碳酸酯等)的口服劑量的片劑。免疫親和素配體的醫(yī)藥有效量可視特定化合物、遞送模式、所治療的病況的嚴(yán)重程度和組合物中所用的任何其它活性成分而變化。還可調(diào)整給藥方案以提供最佳治療反應(yīng)。可每日遞送若干分次劑量，例如1天2到4次的分次劑量；或可遞送單次劑量。然而，如治療情況的緊急性所指示，可按比例降低或增加劑量。在一個實施例中，遞送是基于每日、每周或每月。在另一實施例中，遞送是基于每日遞送。然而，可在定期遞送的基礎(chǔ)上降低或增大每日劑量?？蓪⒚庖哂H和素配體與一種或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑組合，所述載劑或賦形劑包括(不限于)與本發(fā)明的組合物可相容的固體和液體載劑。所述載劑包括佐劑、糖漿、酏劑、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、表面活性劑、制粒劑、崩解劑、軟化劑、金屬螯合劑、pH值調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑和其組合等。在一個實施例中，將免疫親和素配體與金屬螯合劑、pH值調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑和粘合劑組合。佐劑可包括(不限于)調(diào)味劑、著色劑、防腐劑和補(bǔ)充抗氧化劑，所述抗氧化劑可包括維生素E、抗壞血酸、丁基化羥基甲苯(BHT)和丁基化羥基苯甲醚(BHA)。粘合劑可包括(不限于)纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、微晶纖維素、非晶體纖維素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯垸酮(聚維酮(povidone),PVP)、明膠、阿拉伯膠(gumarabic和acacia)、聚乙二醇、淀粉、糖(諸如蔗糖、高嶺土、右旋糖和乳糖)、膽固醇、黃芪膠、硬脂酸、明膠、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、鯨蠟硬脂醇、鯨蠟醇、鯨蠟酯蠟、糖酐酯(dextrate)、糊精、單油酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇和明膠等。在一個實施例中，粘合劑為聚維酮、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素或明膠。在另一實施例中，所述粘合劑為聚維酮。潤滑劑可包括硬脂酸鎂、輕質(zhì)無水硅酸、滑石、硬脂酸、月桂基硫酸鈉和硬脂酰富馬酸鈉等。在一個實施例中，潤滑劑為硬脂酸鎂、硬脂酸或硬脂酰富馬酸鈉。在另一實施例中，潤滑劑為硬脂酸鎂。58制粒劑可包括(不限于)二氧化硅、微晶纖維素、淀粉、碳酸鈣、果膠、交聯(lián)聚維酮(crospovidone禾口polyplasdone)等。崩解劑可包括交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、淀粉、羧甲基纖維素、經(jīng)取代羥丙基纖維素、碳酸氫鈉、磷酸鈣、檸檬酸鈣、淀粉乙醇酸鈉、預(yù)膠化淀粉或交聯(lián)聚維酮等。在一個實施例中，崩解劑為交聯(lián)羧甲基纖維素鈉。軟化劑可包括(不限于)硬脂醇、貂油、鯨蠟醇、油醇、月桂酸異丙酯、聚乙二醇、橄欖油、凡士林、棕櫚酸、油酸和肉豆蔻酸肉豆蔻酯。表面活性劑可包括聚山梨醇酯、脫水山梨糖醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)或月桂基硫酸鈉。在一個實施例中，表面活性劑為月桂基硫酸鈉。金屬螯合劑可包括生理學(xué)上可接受的螯合劑，包括依地酸(edeticacid)、蘋果酸或富馬酸。在一個實施例中，金屬螯合劑為依地酸。還可利用pH值調(diào)節(jié)劑將含有免疫親和素配體的溶液的pH值調(diào)整到約4到約6。在一個實施例中，將含有免疫親和素配體的溶液的pH值調(diào)整到約pH4.6。pH值調(diào)節(jié)劑可包括生理學(xué)上可接受的試劑，包括檸檬酸、抗壞血酸、富馬酸或蘋果酸和其鹽。在一個實施例中，pH值調(diào)節(jié)劑為檸檬酸?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的填充劑包括無水乳糖、微晶纖維素、甘露糖醇、磷酸鈣、預(yù)膠化淀粉或蔗糖。在一個實施例中，填充劑為無水乳糖。在另一實施例中，填充劑為微晶纖維素。在一個實施例中，通過片劑、囊片或膠囊、微膠囊、可分散散劑、顆粒劑、懸浮液、糖漿、酏劑和氣霧劑經(jīng)口遞送含有免疫親和素配體的組合物。合意地，當(dāng)經(jīng)口遞送含有免疫親和素的組合物時，通過片劑和硬質(zhì)或液體填充膠囊來進(jìn)行遞送。在另一實施例中，可經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、不經(jīng)腸和腹膜內(nèi)遞送無菌可注射溶液、懸浮液、分散液和可流動以致易于注射的散劑形式的含有免疫親和素配體的組合物。所述可注射組合物在制造和儲存條件下為無菌且穩(wěn)定的，并且不具有諸如細(xì)菌和真菌等微生物的污染作用。在另一實施例中，可經(jīng)直腸遞送常規(guī)栓劑形式的含有免疫親和素配體的組合物。在另一實施例中，可經(jīng)陰道內(nèi)遞送常規(guī)栓劑、乳膏、凝膠、環(huán)或經(jīng)涂布宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)形式的含有免疫親和素配體的組合物。在另一實施例中，可經(jīng)由涂布或浸漬支撐結(jié)構(gòu)(即，能夠支撐醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑且含有本發(fā)明化合物的框架，例如用于脈管系統(tǒng)中的血管支架或分流管、冠狀動脈支架、周圍血管支架、導(dǎo)管、動-靜脈移植物、旁路移植物和藥物遞送球囊)來遞送含有免疫親和素配體的組合物。在一個實施例中，適于使用的涂層包括(但不限于)聚合物涂層，其由實質(zhì)上溶解本發(fā)明化合物的任何聚合材料構(gòu)成。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知支撐結(jié)構(gòu)和涂布或浸漬方法，例如美國專利第6,890,546號中所述的支撐結(jié)構(gòu)和方法，且其并不限制本發(fā)明。在另一實施例中，可經(jīng)鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)遞送氣霧劑形式的含有免疫親和素配體的組合物。這些游離堿或醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽形式的活性化合物的溶液或懸浮液是在適當(dāng)混有諸如羥丙基纖維素等表面活性劑的水中制備。也可在甘油、液體聚乙二醇和其于油中的混合物中制備分散液。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。適于注射使用的醫(yī)藥形式包括無菌水溶液或水性分散液，以及供即時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌散劑。在所有情況下，所述形式都為無菌的且可流動以致易于注射。其在制造和儲存條件下穩(wěn)定，并能防止諸如細(xì)菌和真菌等微生物的污染作用。載劑為例如含有水、乙醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、其適當(dāng)混合物和植物油的溶劑或分散介質(zhì)。本發(fā)明還提供含有免疫親和素配體的試劑盒或包裝。本發(fā)明的試劑盒可包括所述配體和如上文所論述的適于投與哺乳動物個體的載劑。所述試劑盒還可含有制備免疫親和素配體所需的試劑。包含復(fù)合物、其組分和/或試劑和使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。提供以下實例以說明本發(fā)明，且所述實例并不限制本發(fā)明的范圍。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，盡管以下實例中對特定試劑和條件進(jìn)行略述，但仍可進(jìn)行意欲涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的修改。實例1.雷帕霉素I和II的合成FK506和雷帕霉素與其個別蛋白質(zhì)靶的復(fù)合物產(chǎn)生免疫抑制活性，這在慢性神經(jīng)變性治療過程中是不合需要的(蘭姆(Lam)等人，生物化學(xué)雜志(/所o/.C&肌)270，26511-22(1995))。因此，為了研發(fā)非免疫抑制性免疫親和素配體，由雷帕霉素與亞硝基苯在C1,C3二烯處發(fā)生[4+2]環(huán)加成，以便在存留完整FKBP結(jié)合部分的同時破壞與mTOR的相互作用(如下文較為詳細(xì)地描述)，從而來制備雷帕霉素類似物I和II(圖1A)。霧齡霉^:類淑激/游會成化學(xué)試劑都購自西格瑪-阿德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美國密蘇里州圣路易斯(St.Louis，MO,USA))。在緩慢加熱下，將雷帕霉素(0.3g，0.328mmol)溶解于5mL甲苯中。向此溶液中逐滴加入亞硝基苯(0.1g，3eq)于5mL甲苯中的溶液。在70。C下，將反應(yīng)混合物攪拌16小時，且隨后經(jīng)由反相高效液相色譜(HPLC)(柱250x20mmYMCODS-A，具有50x20的保護(hù)裝置；流動相80%到85%甲醇:水，持續(xù)40分鐘，流速=20mL/min)色譜分離產(chǎn)物，得到0.139g產(chǎn)物(42。/。產(chǎn)率，tR=12.1min，分析型HPLC條件柱二YMCODS-AS-3120埃，流動相/梯度95%水(+0.025%甲酸)/乙腈(+0.025%甲酸)到5%水，持續(xù)6分鐘，在5%下保持9分鐘，流速=0.30mL/min)。巾-NMR(500MHz,CD3CN):S7.29(m,2H,H57),7.02(m,2H,H56),6.90(m，1H,H58),6.25(m,1H,H2),5.65(m,1H,H3)，5.25(m,1H,H29),5.16(m，1H,H5),5.12(m,1H,H25),5.07(m，1H,H4),4.37(m,1H,H22),4.09(m,1H,H31),3.95(m,1H,H32),3.74(m,1H，H9),3.69(m,1H,Hl),3.59(m,1H,31-OH),3,44(m,1H,H28),3.44(m,1H,H28),3.33(s,3H,Me54),3.29(m,3H,Me53),3.27(m,1H,H42)，3.07(m,1H,H34),3.06(s,3H,Me52),2.94(m,1H,H18),2.86(m，1H,H41),2.84(m,1H,H26),2.64(m,1H,H26'),2.14(m,1H,H21),2.09(m,1H,H12),2.05(m,1H,H40),2.01(m,1H,H36),.2.00(m,1H,H35),1.87(m，1H,H37),1.85(m,1H,H43),1.81(m,1H，H21'),1.78(s,3H,Me48)，1.74(m,1H,H19),1.74(m,1H,H20),1.69(m,1H,H8),1.64(m,1H,H44)，1.63(m,1H,H8'),1.60(m,1H,Hll)，1.55(m,1H,H44'),1.51(s,3H,Me45),1.43(m,2H,H10),1.42(m,1H,H19')，1-39(m,1H,H20'),1.37(m,1H,H39)，1.27(m,1H,H38),1.12(d,3H,Me50),1.06(d,3H,Me47),1.04(m,1H,H38'),1.03(d,3H,Me49),0.89(d,3H,Me51),0.83(d,3H,Me46),0.63(m，1H,H40');13C-NMR(125MHz,CD3CN):S215.4(s,C33),209.5(s,C27),198.5(s,C15),170.6(s,C23),166.4(s,C16),149.2(s,C55),139.9(s,C6)，138.7(s,C30),130.0(d，C57),128.0(d,C3),127.9(d,C29),127.2(d,C5)，127.0(d,C2),121.5(d,C58)，116.1(d,C56),99.5(s,C13),87.3(d,C32),85.2(d,C41),84.8(d,C7),78.2(d,C31),77.0(d,C25),74.5(d,C42),68.4(d,C4)，68.3(d,C9),60.3(d，CI),58.6(q,C53)，57.4(d,C22),56.9(q,C54),56.1(q,C52),46.9(d,C28),42.8(d，C34),41.7(t,C26),39.5(t,C18)，39.5(t,C8),38.6(t，C35)，38.5(t,C38),37.5(d,C36),35.6(d,C12),35.3(t,C40),33.9(d，C37),33.8(d,C39),32.9(t,C43),32.2(t,CIO),32.2(t,C44),28.2(t,C21),27.7(t,Cll),25.1(t，C19),21.6(t,C20),18.5(q,C50),18.0(q,C49)，16.7(q，C51),16.3(q,C46),16.0(q，C47),12.4(q，C48),10.8(q,C45);FT-ICRMS/z人[M+H]+C"H85N2Ch4的計算值1021.59954;實驗值1021.59780。蒙齡霉#類敘笏//游會成在18mm試管中，將雷帕霉素類似物I(0.29g，0.284mmol)溶解于7mL甲醇中，并加入一勺尖的Pd/C催化劑(阿德里奇公司(Aldrich))。在2.0個大氣壓的H2下，在帕爾設(shè)備上將混合物氫化15分鐘。經(jīng)由反相HPLC(柱250x20mmYMCODS-A，具有50x20的保護(hù)裝置；流動相80%甲醇:水，持續(xù)15分鐘，隨后達(dá)到85%持續(xù)5分鐘，隨后在85%下保持20分鐘，流速=20mL/min)色譜分離產(chǎn)物，得到0.089g產(chǎn)物(31%產(chǎn)率，tR=12.6min，分析型HPLC條件柱=YMCODS-AS-3120埃，流動相/梯度95%水(+0.025%甲酸)/乙腈(+0.025%甲酸)到5%水，持續(xù)6分鐘，在5%下保持9分鐘，流速=0.30mL/min)H-NMR(500MHz,CD3CN):.57.25(m,2H,H57),6.91(m,2H,H56),6.79(m,1H,H58)，5.44(m，1H,H29),5.35(m,1H,H5),5.24(m，1H,H25),5.11(m,1H,H22),4.50(m,1H,H4),4.42(m,1H，13-OH),4.00(m,1H,H31),3.80(m,1H,H9),3.77(m,1H，H32),3.67(m,1H,H7),3.57(m，1H,31-OH)，3.43(m,1H,H28),3.35(m,1H,H18),3.35(s,3H,Me54),3.34(m,1H，Hl),3.32(m,1H,H18')，3.32(s，3H,Me53),3.27(m,1H，H42),3.16(m,1H,H34),3.08(s,3H,Me52),3.00(m,1H,42-OH),2.87(m,1H,H41),2.79(m,1H，H26),2.71.(m,1H,H26')，2.29(m，1H,H21),2.18(m,1H,H36),2.10(m,1H，H40)，1.95(m,1H,H35),1.95(m,1H,H37),1.86(m,1H,H43),1.85(m,1H，H2),1.85(m,1H，H3),1.82(m,1H，H12),1.79(m,1H,H2')，1.77(m，1H,腦)，1.71(m,1H，H8)，1.69(m,1H,H19),1.68(m,1H，H21')，1.66(s,3H，Me48),1.64(m,1H,H44),1.63(m,1H,H8'),1.61(m,1H,H10),1.60(m,2H,Hll)，1.50(m，1H，Me45),1.46(m,1H,H3'),1.43(m,1H,H19'),1.39(m,1H，H20)，1.39(m,1H,H39)，1.35(m，1H，H10'),1.29(m,1H,H38),1.26(m,1H，H43'),1.13(d,3H,Me47),1.12(m,1H,H38'),1.07(d,3H，Me49),1.03(m,1H,H35'),1.03(d,3H，Me46),1.00(m,1H,H44'),0.97(d,3H,Me50),0.91(d,3H,Me51),0.66(m,1H,H40');13C-NMR(125MHz,CD3CN):5216.1(s,C33),210.3(s,C27)，198.3(s,CI5),170.3(s，C23),168.3(s，C16),149.9(s，C55)，139.9(s，C30)，139.4(s,C6),130.2(d,C57),129.4(d,C5)，128.1(d,C29),119.7(d,C58),114.2(d,C56),98.4(s,C13),88.5(d,C32),85.4(d,C41),85.0(d,C7)，77.7(d,C31),76.3(d,C25)，74.8(d，C42),72.3(d,C4)，68.5(d,C9),60.0(d,CI),59.2(q,C53),57.1(q,C54),56.0(q,C52),52.0(d，C22),46.5(d,C28),45.1(t,C18),42.7(d,C34)，42.1(t,C26),40.8(t,C35),39.1(t,C38),38.3(t,C8),35.7(t，C40),35.0(d,C12),34.3(d,C37),34.1(d,C39),33.1(t，C43),32.5(t,C44),32.1(t,CIO),32.0(d,C36),29.1(t,Cll),28.0(t,C21),26.8(t,C3),25.9(t,C19),21.7(t,C20)，20.6(t,C2),19.0(q,C49),17.5(q，C47),17.4(q,C50),16.8(q,C46),16.4(q,C51),13.1(q,C48),10.4(q,C45);FT-ICRMSf>w/z」.'[M+H]+Cs7H87N20!4的計算值:1023.61519;實驗值1023.61722。^裕霉素類敘欽/,//游主激活性方泫摔經(jīng)魏生長雄量使用2%多聚甲醛將皮層神經(jīng)元固定5分鐘，隨后使用4%多聚甲醛固定5分鐘。在62阻斷溶液(PBS中的0.2。/。曲通-X(Triton-X)+1.5%正常山羊血清)中培育細(xì)胞，隨后加入初級抗體(抗神經(jīng)元III類p微管蛋白)(TUJ1)(科文斯革新抗體公司(CovanceInnovativeAntibodies),加利福尼亞州伯克利(Berkeley,CA))和二級抗體(AlexaFluor488山羊抗小鼠)(分子探針公司(MolecularProbes),加利福尼亞州卡爾斯巴(Carlsbad,CA))。各步驟都在室溫下進(jìn)行1小時。在埃雷斯肯HCS讀取器(ArrayScanHCSReader)(賽羅米公司(Cellomics)，賓夕法尼亞州匹茲堡(Pittsburgh,PA))上，使用神經(jīng)元細(xì)胞壓型生物分析軟件(NeuronalProfilingBioapplication)來分析各條件下的總神經(jīng)突起生長。辦經(jīng)i存活分叛^伊經(jīng)^歪/^￡￡/&^在37'C下，將培養(yǎng)物用4%多聚甲醛固定30分鐘。通過用含有0.3%曲通X-100和5%胎牛血清(FBS)的PBS培育45分鐘來阻斷非特異性結(jié)合。隨后，在4。C下將培養(yǎng)物與抗神經(jīng)絲蛋白(200kD)單克隆抗體(1:1000，克隆RT-97,嘉美功公司(Chemicon)，加利福尼亞州特曼庫拉(Temecula,CA))—起培育整夜。洗滌后，施用過氧化酶連結(jié)的二級抗體(1:1000，維特萊布公司(VectorLabs)，加利福尼亞州伯林格姆(Burlingame,CA))并保持2小時。三次洗滌后，將過氧化酶底物K-BlueMax(尼奧公司(Neogen),肯塔基州勒辛頓(Lexington,KY);楊(Young)等人，1999)加入培養(yǎng)物中，并在回轉(zhuǎn)式振蕩器上培育10分鐘。過氧化酶底物極易溶于K-BlueMax溶液中。隨后，易于使用美國分子儀器公司(MolecularDevices)的SpectramaxPlus比色板讀取器在650nm下測量光學(xué)密度。通過使用RosetteSep，根據(jù)制造商的說明(干細(xì)胞技術(shù)有限公司(StemCellTechnologies,Inc.),英屬哥倫比亞溫哥華市(Vancouver,BritishColumbia)))進(jìn)行負(fù)選擇而從周圍血淋巴細(xì)胞純化人CD4+T細(xì)胞。如布萊爾(Blair)等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),160:12,1998中所述，用抗CD3Ab(l嗎/107個微球)和抗CD28Ab(0.5|xg/107個微球)涂布甲苯磺?；罨拇判晕⑶?戴諾公司(Dynal)，紐約長島(GreatNeck,NY))。使用鼠科IgG使微球的結(jié)合能力達(dá)到飽和(總蛋白質(zhì)=5^8/107個微球)。將涂有蛋白質(zhì)的微球加入純CD4+T細(xì)胞(2x106個細(xì)胞/毫升，比率l個珠粒:l個細(xì)胞)中，并在RPMI、10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺培養(yǎng)基中活化72小時。采集細(xì)胞，洗滌并在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)整夜，并如本納特(Be皿ett)等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)170:711,2003中所述，用IL-2進(jìn)行再刺激。簡單說來，對整夜靜止的細(xì)胞進(jìn)行重新計數(shù)，將其涂于(105個細(xì)胞/孔)平底96孔微量滴定盤上，并在存在增加濃度的化合物的情況下，用lng/mL人IL-2(安迪生物科技公司(R&DSystems),明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))進(jìn)行刺激。在培養(yǎng)物再刺激后72小時，用每孔1^Ci氚化的胸苷對板進(jìn)行脈沖標(biāo)記，并培育6-16小時的時期。翁論如上文所述，由雷帕霉素與亞硝基苯在Cl,C3二烯處發(fā)生[4+2]環(huán)加成，以便在存留完整的化合物FKBP結(jié)合部分的同時破壞與mTOR的相互作用，從而制備雷帕霉素類似物I和II(圖1A)。與雷帕霉素(IC5o=0.005pM)相比，化合物II在達(dá)到1)iM時也未檢測到對于IL-2刺激的CD4+T細(xì)胞增殖的抑制。此外，已發(fā)現(xiàn)，如通過神經(jīng)絲蛋白ELISA所測量，化合物I在所培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中能促進(jìn)神經(jīng)元存活(圖1B)，并且在皮層神經(jīng)元(圖1C)和F-11細(xì)胞(圖1D)中都能促進(jìn)神經(jīng)突起生長。重要的是，在缺血性中風(fēng)的瞬時中腦動脈閉塞模型中，10mg/kg和30mg/kg的化合物2分別使梗塞體積明顯降低24%和23%(參看US06/0135549的實例9)。已知這些化合物的治療潛力，故鑒別這些化合物的細(xì)胞靶以評估其在促進(jìn)神經(jīng)元存活和神經(jīng)突起生長方面的作用。實例2.親和基質(zhì)的化學(xué)合成和制備為鑒別靶蛋白，根據(jù)傅雷茲(Fretz)等人(同上文)所公開的方法，通過使雷帕霉素類似物I、雷帕霉素類似物II和美立霉素類似物經(jīng)由氨基-苯基-丁酸與親和凝膠10樹脂連接來制備含有所述化合物的親和基質(zhì)(圖2)。簡單說來，通過在室溫下用二噁烷:水(3:1，50ml)中的二碳酸二烯丙酯(1200^M)處理3小時而用烯丙基氧基羰基保護(hù)氨基-苯基-丁酸(1200mg)的氨基。在4。C下，用CH2C12(lml)中的PhOP(0)Cl2DMF復(fù)合物活化所得4-(對N-Alloc-氨基苯基)丁酯(80mg)的酸基，并在室溫下，在存在吡啶(90|iM)的情況下，使所述酸基與雷帕霉素類似物I(80mg)的42-羥基反應(yīng)30分鐘。用甲醇中止反應(yīng)，并通過HPLC純化酯產(chǎn)物(純度為99%)，且通過MS和NMR加以表征。通過用THF(1,2ml)中的Pd(PPh3)4(2mg)和雙甲酮(7mg)處理來去除酯產(chǎn)物(40mg)的烯丙基氧基羰基，隨后在存在THF中的2%吡啶的情況下，使產(chǎn)物的氨基與親和凝膠-10基質(zhì)(4ml)連接。用乙醇、水和乙醇胺50mMHepes(pH8.0)緩沖液洗滌所得親和凝膠-雷帕霉素類似物I親和基質(zhì)，并將其儲存于40%乙醇中。使用類似方法來制備含有雷帕霉素類似物II、美立霉素類似物(U.S.2005/0197379中作為化合物I揭示)、FK506和雷帕霉素的親和基質(zhì)。實例3.耙蛋白的親和沉淀使用實例2中所制備的基質(zhì)，從F-ll(大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRG)與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的雜合物)細(xì)胞沉淀出靶蛋白(普拉提卡D.(Platika,D.)等人，(1985)美國國家科學(xué)院院刊(iVoc.Ato/.爿cadSdUSA)82:3499-3503)。實驗^在具有5%<302的37'C恒溫箱中，使Fll細(xì)胞在75cn^透氣培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充有10%FBS和1%pen/Strep的DMEM培養(yǎng)基中生長。當(dāng)80%匯合時，釆集細(xì)胞，并用PBS緩沖液洗滌。將溶解緩沖液(6ml;50mMTris(pH7.4)、250mMNaCl、5mMEDTA、50mMNaF、lmMNa3V04、1%諾納德P40(NP40)、0.1%巰基乙醇和2%蛋白酶抑制劑混合物)加入109個細(xì)胞中。通過迫使細(xì)胞通過26號針使其破裂，并且在4'C下離心15min，隨后收集S-100上清液。在4。C下，將等分試樣(2ml)與親和珠粒(100-150^U;諸如親和凝膠IO、親和凝膠10-FK506和親和凝膠10-雷帕霉素類似物I)混合整夜。用溶解緩沖液(2ml)且隨后用PBS(2ml)洗滌后，在4-20%SDS-PAGE凝膠上對珠粒進(jìn)行分析。圖2展示以下泳道Fll細(xì)胞溶解產(chǎn)物、空白(蛋白質(zhì)與親和凝膠-10珠粒結(jié)合)、FK506(蛋白質(zhì)與親和凝膠-10-FK506珠粒結(jié)合)、雷帕霉素類似物II(蛋白質(zhì)與親和凝膠-10-雷帕霉素類似物I珠粒結(jié)合)、標(biāo)記(蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品)。切下蛋白質(zhì)譜帶(圖3)且在30。C下，用消化緩沖液(30^1;0.2%NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3嗎)消化整夜。在C18樹脂上純化所得肽，并提交用于FT-ICR-MS分析。手動編輯FT-ICR-MS數(shù)據(jù)并用于搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。結(jié)果展示于圖4中并具有以下得分。FK506結(jié)合蛋白(FKBP52)(P30416，得分94，期望值9.6e-05);59kDa譜帶的MS數(shù)據(jù)2753.35;1710.94;2215.13;2363.15;1298.71;1215,59;1000.51;1000.46;1790.93;1381.70;2746.36;1316.71;和1171.60。電壓依賴性L型鈣通道卩亞基(Q8R3Z5-03-00-00，得分133，期望值le-09);52kDa譜帶的MS數(shù)據(jù)651.38;663.39;779.54;853.55;1014.50;1347.75;1217.78;1346.67;1297.75;1231.77;877.52;853.47;919.48;1014.56;1041.63;1217.74;1231.74;1296.84;869.58(主要)。使約60kDa譜帶的13個片段與FKBP52蛋白的部分序列匹配，其中p值為9.6e-5;并使約50kDa譜帶的19個片段與電壓門控L型鈣通道的pl亞基(CACB1)的部分序列匹配。其它極少量組分為骨架蛋白(肌動蛋白和肌球蛋白)。因此，鑒別出免疫親和素FKBP52和CACB1為雷帕霉素類似物I的結(jié)合候選物。,驗5在另一實驗中，在具有5%(302的37'C恒溫箱中，使F11細(xì)胞在75ci^透氣培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充有10%FBS和1%pen/Strep的DMEM培養(yǎng)基中生長。當(dāng)80%匯合時，采集細(xì)胞，并用PBS緩沖液洗滌。向3x1()8個細(xì)胞中加入溶解緩沖液(2ml;50mMTris(pH7.4)、250mMNaCl、5mMEDTA、50mMNaF、lmMNa3V04、1%諾納德P40、0.1%巰基乙65醇和2%蛋白酶抑制劑混合物)，并在(C下離心15分鐘，隨后收集其S-100上清液。在4'C下，將等分試樣(2ml)與親和珠粒(100-150pl)—起培育。用溶解緩沖液(2ml)且隨后用PBS緩沖液(2ml)洗滌后，通過SDS-PAGE對珠粒進(jìn)行分析。切下蛋白質(zhì)譜帶(圖3)且在3(TC下，用消化緩沖液(30^1;0.2%NH4HCO3)中的胰蛋白酶(0.3嗎)消化。將所得肽(2pl)裝載到FT-ICR-MS的納米電噴霧針尖中，并與甲醇(2pl)中的1%甲酸混合。在納米電噴霧針尖與玻璃毛細(xì)管之間施加約-800V的高電壓。使用HPTuningMix對所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行外部校準(zhǔn)，并將其用于NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的Mascot搜索。根據(jù)置信度(p值)選擇合理的蛋白質(zhì)候選物。對于蛋白質(zhì)免疫印跡分析，通過SDS-PAGE分離出沉淀的蛋白質(zhì)，通過電印跡(100V,lhr)將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用抗CACNB1或抗FKBP4抗體進(jìn)行免疫印跡，并通過3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)染色使其顯現(xiàn)。翁論如圖5A所示，在雷帕霉素類似物I和II的下拉部分中都發(fā)現(xiàn)三個強(qiáng)譜帶(220kDa、60kDa禾Q50kDa)和兩個極弱譜帶(25kDa禾H12kDa)。使用各譜帶的FT-ICR-MS譜來進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的Mascot搜索(參看下表1)。FKBP52(古德B.G.(Gold,B.G.)藥物代謝研究("ragMWa6.iev.)31,649-663(1999))和電壓門控L型鈣通道(VGCC)的卩l(xiāng)亞基(CACNB1)(奧帕托瓦斯基Y.(OpatowskyY.)等人，#經(jīng)元(TVewra")42,387-399(2004))。電壓依賴性鈣通道p亞基功能核心和其與cxl相互作用結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析巳鑒別作為雷帕霉素類似物I和II的主要靶，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡確定其存在(圖5B)。在弱譜帶中鑒別出FKBP25和FKBP12，而在所有部分中都發(fā)現(xiàn)肌球蛋白和肌動蛋白，這表明其與樹脂非特異性結(jié)合。表l.結(jié)合雷帕霉素類似物I和II的蛋白質(zhì)的FT-ICR-MS分析<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>實例4.通過蛋白質(zhì)免疫印跡和動力學(xué)分析表征沉淀的耙方法克廣浙表達(dá)置資基茵以^券合分析使用英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亞州卡爾斯巴(Carlsbad,CA))所開發(fā)的通路克隆方法(Gatewaycloningmethod)，將cac"W/CACNB4、y^戶3/FKBP25、y^p4/FKBP52、ppzW、";z/和_/MpS/FKBP38基因克隆到pDEST17(N-His6標(biāo)簽)載體中。由pDEST17-CACNBl使用QuikChange定點(diǎn)突變誘發(fā)試劑盒(吉泰公司(Stratagene)，加利福尼亞州拉霍亞(LaJolla,CA))產(chǎn)生His6-CACNBl:rGG54S7X4。在Ni-NTA柱(凱杰公司(Qiagen)，加利福尼亞州瓦倫西亞(Valencia,CA))上純化His6標(biāo)記的蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE分析，蛋白質(zhì)展現(xiàn)高于95%的純度，并新鮮使用所述蛋白質(zhì)。在存在2mMCa2+禾H5CaM的情況下測試FKBP38(阿爾德里奇F.(Edlich,F.)等人，生物化學(xué)雜志U萬z'o/.C/ze附.)281,14961-14970(2006))。通過SDS-PAGE，根據(jù)與空白親和凝膠10珠粒相比較，保留在雷帕霉素類似物II基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的量來測量與雷帕霉素類似物II的結(jié)合。在使各純化蛋白質(zhì)(10^M)與["C]-雷帕霉素類似物I(10^M,241Ci/mo1)在37'C下反應(yīng)后，通過定量經(jīng)由T叩TipP-4柱與所述蛋白質(zhì)共洗脫的14C放射性來測量與雷帕霉素類似物I的結(jié)合。通過用雷帕霉素類似物I(1^M)滴定His6-CACNB1.rG05"7^4蛋白(0-8^M)來測量雷帕霉素類似物I所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)熒光淬滅。動力學(xué)分析通過測定0.1ml含有50mMHepes(pH7.4)、0.1%Tween-20、(0-10^M)免疫親和素配體、3nM[3H]-FK506(87Ci/mmol)禾卩(5nM)酶的反應(yīng)混合物中保留在螯合Ni的FLASH板上的3HFK506的量，來測量免疫親和素配體與Hiss標(biāo)記的FKBP12和FKBP52蛋白的結(jié)合。在25。C下，一式三份進(jìn)行反應(yīng)達(dá)30分鐘。使用卡列拉斯(Carreras)(分析生物化學(xué)(^"a/.5z'oc/^w.)298，57-61(2001))所描述的方法計算Kd。以下在本文所述實例中所用的材料是從以下市售來源獲得抗體是來自艾賓公司(Abeam)(馬薩諸塞州劍橋(Cambridge,MA))。培養(yǎng)基、人ORF克隆(cac"W、cac"W、/^)/^、A^S、p;/F和；^/D)、質(zhì)粒(pDEST17)和SUPERSCRIPT⑧系統(tǒng)都來自英杰公司(加利福尼亞州卡爾斯巴(Carlsbad,CA))。蛋白質(zhì)純化試劑盒來自皮爾斯公司(Pieres)(伊利諾斯州洛克夫(Rockford,IL))或凱杰公司(Qiagen)(加利福尼亞州瓦倫西亞(Valencia,CA))。TOPTipP-4柱來自格萊金公司(Glygen)(馬里蘭州哥倫比亞(Columbia,MD))。螯合Ni的Flash板和[3H]-FK506來自珀金愛爾默生命科學(xué)公司(PerkinElmerLifeScience)(馬薩諸塞州波士頓(Boston,MA))。PCR試劑和親和凝膠10來自伯樂公司(BioRad)(加利福尼亞州赫拉克勒斯(Hercules,CA))。大鼠基因組2302.0GENECHIP⑧來自AFFYMETRTX(加利福尼亞州圣克拉拉(SantaClara,CA))。FT-ICR-MS分析是在布魯克公司(Bruker)(馬薩諸塞州畢萊卡(Billerica,MA))的裝備有主動防護(hù)9.4特斯拉超導(dǎo)磁體(activelyshielded9.4Teslasuperconductingmagnet)(英國麥吉克科技有限公司(MagnexScientificLtd.,UK))和外部布魯克APOLLOESI源的APEXIIFT-ICR質(zhì)譜儀上進(jìn)行。翁論表2展示FK506和雷帕霉素以可相當(dāng)?shù)挠H和力與FKBP12和FKBP52結(jié)合(Ko(FKBP12)/Kd(FKBP52)分別為0.46和0.23)。相比之下，與FKBP12相比，化合物2展示明顯優(yōu)選與FKBP52結(jié)合(Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)=229)。由于化合物2具有與雷帕霉素相同的供FKBP結(jié)合的甲基哌啶部分，并且修飾位點(diǎn)在遠(yuǎn)端，故這是出乎意料的。X射線結(jié)構(gòu)已展示，F(xiàn)KBP52和FKBP12的異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域極為類似(吳(Wu)等人,美國國家科學(xué)院院刊(尸racAto"cac/Sdf/&4.)101,8348-53(2004))，并且其活性位點(diǎn)殘基的序列比對展示僅一個氨基酸的差異(FKBP12中的His87相對于FKBP52中的Serl18)(道南(Dornan)等人，醫(yī)藥化學(xué)當(dāng)前論題(Cwr.7b/.Met/.C//em.)3,1392-1409(2003))。已知雷帕霉素和其類似物因關(guān)于酰胺鍵旋轉(zhuǎn)而以一組主要和次要的分解構(gòu)象體形式存在(凱斯勒(Kessler)等人，瑞士化學(xué)學(xué)報(//e/v.C/n'm.76，117-130(1993))。另一部分NO-苯基部分影響大環(huán)內(nèi)酯構(gòu)象體的總?cè)后w，而所述群體又影響免疫親和素選擇性。這一觀察似乎與化合物2對不同但同源的免疫親和素的結(jié)合親和力存在明顯差異相一致，似乎與所報導(dǎo)的雷帕霉素與FK506之間關(guān)于FKBP25的結(jié)合親和力的明顯差異相符(蓋勒特(Galat)等人，主激發(fā)術(shù)31,2427-2434(1992))。這展示增強(qiáng)與特定FKBP結(jié)合的雷帕霉素的非骨架修飾。為進(jìn)一步驗證化合物對免疫親和素和相關(guān)親環(huán)素的特異性，已測量化合物l和化合物2與經(jīng)純化的重組FKBP25、FKBP38、親環(huán)素F(PPID)、親環(huán)素D(PPIF)的結(jié)合。這些耙是根據(jù)化合物2的活體內(nèi)活性(見下頁)進(jìn)行選擇，因為據(jù)報導(dǎo)，這些靶在中風(fēng)模型中極為重要(阿爾德里奇(Edlich)等人，主激化學(xué)雜,吉aAW.C//ewJ281，14961-14970(2006);拜尼斯(Baines)等人，^然^Vc^^d434，658-662(2005);阿爾德里奇(Edlich)等人，歐洲分子生物學(xué)雜志(五M50從)24，2688-2699(2005))。[14C]-1與各種推定的靶的結(jié)合結(jié)果展示于圖5C中。在10pM濃度下，["C]-1與FKBP結(jié)合良好，與PPID結(jié)合較弱，并且與PPIF和FKBP38/Ca2+/CaM的結(jié)合可忽略不計。化合物268還以類似的選擇性概況結(jié)合FKBP52、FKBP25和FKBP12(圖5D，表2)。表2.免疫親和素配體與FKBP12和FKBP52的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>利用親和純化鑒別其它主要結(jié)合蛋白并通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析來證實(圖6A)，CACNB1為一種與原代神經(jīng)元中L型C^+通道相關(guān)的e亞基。為進(jìn)一步驗證這一作為化合物1和2的結(jié)合搭配物的特定亞基，測定化合物與VGCCp4亞基(CACNB4)和C末端截短的CACNB1的結(jié)合(圖6B)。通過從CACNB1去除51個C末端殘基，制備得到重組ms6-CACNBl.'rGG5^K^蛋白。由于全長CACNB4的序列與CACNB1同源，故也測試與全長CACNB4的結(jié)合(奧帕托瓦斯基Y.(Opatowsky,Y.)等人，神經(jīng)元(ATewra)42，387-399(2004))。在10濃度下，["C]-化合物1與突變His6-CACNBl.TGG54Sr^l結(jié)合較弱，且與CACNB4的結(jié)合可忽略不計。為進(jìn)一步確認(rèn)化合物1與His6-CACNBl:rGG54S7^4突變體的結(jié)合，測量由化合物1所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)熒光淬滅。圖6C展示線性劑量反應(yīng)曲線，表明化合物1與CACNB1結(jié)合?；衔?還以類似選擇性概況結(jié)合CACNB1(圖6D).也使用相應(yīng)抗體，通過蛋白質(zhì)免疫印跡來確認(rèn)雷帕霉素類似物I的藥物靶或結(jié)合候選物(免疫親和素FKBP52和CACB1)的存在。通過4-20%SDS-PAGE凝膠來分離親和珠粒上的蛋白質(zhì)，并在100V下將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上并保持1小時。利用阻斷溶液、初級抗體(抗FKBP52或抗Ca"通道卩l(xiāng)亞基抗體；1:200稀釋)和二級抗體(過氧化酶連結(jié)的抗兔IgG抗體；1:1000稀釋)使膜顯現(xiàn)印跡。如圖8所示，在TMB染色后觀測靶蛋白的存在。蛋白質(zhì)免疫印跡分析證實，兩種蛋白質(zhì)都與雷帕霉素類似物I結(jié)合，但都不與空白珠粒結(jié)合。在雷帕霉素類似物I珠粒和FK506珠粒部分中檢測到FKBP52，但在空白珠粒中未檢測到。僅在雷帕霉素類似物I珠粒部分中檢測到電壓依賴性L型鈣通道pl亞基。這表明雷帕霉素類似物I特異性結(jié)合FKBP52和電壓門控L型鈣通道pl亞基。實例5.新穎復(fù)合物FKBP52-雷帕霉素類似物l-C通道Pl亞基的形成使用共免疫沉淀來研究FKBP52、雷帕霉素類似物I與電壓門控鈣通道pl亞基的復(fù)合物的形成。簡單說來，在4'C下，將Fll細(xì)胞溶解產(chǎn)物的等分試樣(1.8ml)分別與0、5和50^M雷帕霉素類似物I混合5小時。將抗FKBP52抗體以1:200稀釋度加入各等分試樣中，并在4'C下培育5小時。隨后加入蛋白質(zhì)A珠粒(50-100^M)以使締合抗FKBP52抗體的復(fù)合物沉淀。用PBS緩沖液洗滌珠粒上免疫沉淀的蛋白質(zhì)，在4-20%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分離，將其轉(zhuǎn)印到PVDF中，并用抗Ca^通道(31亞基抗體(1:500稀釋)進(jìn)行免疫印跡，以檢測(31亞基。翁論.結(jié)果展現(xiàn)于圖7中。在不存在雷帕霉素類似物I的情況下，(^2+通道pl亞基不與FKBP52—起沉淀，這表明(^2+通道pi亞基不與FKBP52締合。在存在雷帕霉素類似物1(5pM)的情況下，大量C^+通道(31亞基與FKBP52共免疫沉淀，表明形成復(fù)合物。然而，過量的雷帕霉素類似物I(50nM)會降低沉淀的(31亞基的量，表明形成較少量的復(fù)合物，這可能是由于在有限量的溶解產(chǎn)物中FKBP52和(31亞基上的化合物結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和所引起。實例6.復(fù)合物形成與神經(jīng)突起生長相關(guān)使用神經(jīng)絲蛋白ELISA來測量在不存在或存在雷帕霉素類似物I的情況下生長的Fll細(xì)胞的神經(jīng)突起生長。簡單說來，使Fll細(xì)胞在不補(bǔ)充有10%FBS、1%pen/Strep和雷帕霉素類似物I(0、5或50pM)的DMEM中生長96小時。在37'C下，將細(xì)胞用4%多聚甲酸固定30分鐘。通過用含有0.3%曲通X-100和5%胎牛血清(FBS)的PBS培育45分鐘來阻斷非特異性結(jié)合。隨后，在4'C下將培養(yǎng)物與抗神經(jīng)絲蛋白(200kD)單克隆抗體(1:1000)—起培育整夜。洗滌后，施用過氧化酶連結(jié)的抗小鼠二級抗體(1:1000)并保持2小時。三次洗滌后，將過氧化酶底物K-BlueMax加入培養(yǎng)物中并培育10分鐘。在650nm下測定光學(xué)密度。翁論結(jié)果展現(xiàn)于圖8中。用5雷帕霉素類似物I處理的細(xì)胞展現(xiàn)比用50pM雷帕霉素類似物I或無化合物對照處理的細(xì)胞高4-5倍的神經(jīng)絲蛋白含量，表明在5iaM雷帕霉素類似物I下存在強(qiáng)神經(jīng)突起生長。這與在存在相同濃度的雷帕霉素類似物I的情況下的復(fù)合物形成直接相關(guān)。實例7.在用雷帕霉素類似物處理后，F(xiàn)-ll細(xì)胞中鈣通道電生理學(xué)特性的評估方法。全欲應(yīng)^yf欽記錄使用膜片鉗技術(shù)的全細(xì)胞配置，從而在室溫下使用EPC-9放大器(HEKA儀器科技公司(HEKA,InstrutechCorp.))，利用來自HEKA的采集和分析程序Pulse-PulseFit(德國蘭博瑞(Lambrecht,Germany))來記錄細(xì)胞中的鈣電流。電極是使用P-S7拉制器(薩特儀器公司(SutterInstrument))制造。當(dāng)填充記錄溶液(140mMCsCl、10mMEGTA、10mMHEPES、5mMMgCl2、2MATP、1mMcAMP，pH7.2)時，電極的電阻為2-5MQ。標(biāo)準(zhǔn)的浸漬記錄溶液為含有10mMHEPES、10mM右旋糖和4mMBaCl2的無Ca2+和Mg^的HBSS(pH7.4)。在3kHz下過濾電流，并記錄保持在-90mV下的細(xì)胞的內(nèi)部Ca2+電流，其中以10mV自-80mV去極化階躍至60mV，歷時50ms。碧論CACNB1為一種與原代神經(jīng)元中的L型Ca^通道締合的pl亞基(畢奇勒(Pichler)等人，生物化學(xué)雜志(/腸/.CW)272，13877-13882(1997))。己知卩l(xiāng)b、卩3和卩4亞基能增強(qiáng)L型Ca^通道電流，而|32亞基則起到負(fù)面作用(奧帕托瓦斯基(Opatowsky)等人，神經(jīng)元(A^"raw)42,387-399(2004);斯奇杰特(Schjott)等人，生物化學(xué)雜志(/歷o/.C/zem.)278,33936-33942(2003))。如果雷帕霉素類似物與(31亞基的結(jié)合能抑制此亞基的功能，則預(yù)期L型C^+電流會降低。因此，測量在用雷帕霉素類似物1處理后，F(xiàn)-ll細(xì)胞中Ca^通道的電生理學(xué)特性。所記錄的F-ll細(xì)胞中的全細(xì)胞Ca^電流不會受化合物1的短時間浸浴液應(yīng)用(10min應(yīng)用；在此時間內(nèi)，F(xiàn)K506抑制Ca^電流)影響，因此將細(xì)胞暴露于5pM1達(dá)2小時，且隨后將其與媒劑處理的對照相比較。此處理范例使所述細(xì)胞中所檢測的(^2+電流明顯降低，以致電流密度從6.5+/-0.5pA/pF降低到3.2+/-0.3pA/pF，降幅達(dá)49%(圖9A)。還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506對C^+電流產(chǎn)生與關(guān)于Ca^電流的鈣神經(jīng)素依賴性作用所述類似的作用(電流降低到2.9+/-0.1pA/pF，降幅達(dá)55%)(安恒(Yasutsune)等人，英國藥理學(xué)雜志(Bn'似/zJow"a/o/T/zarmaco/ogy)126(3),717-729(1999);?？履釥朖.(Fauconnier,j.)等人，美國生理學(xué)雜志心臟和循環(huán)生理學(xué)"mJP/^/o/HeaWOcP/^Wo/.)288，H778-H786(2005))。在與大量化合物1組合的情況下，這需要在隨后的實驗中借助于記錄膜片移液管將所述化合物直接加入細(xì)胞中。從實現(xiàn)全細(xì)胞配置時開始(時間0)，經(jīng)由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞中的化合物1的內(nèi)部施用立即對<^2+電流產(chǎn)生抑制作用，在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到電流阻斷的穩(wěn)態(tài)水平。有趣的是，化合物在F-ll中的作用是極有價值的，但作為DRG與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的雜合物，已知N-和L型Ca"通道的表達(dá)譜隨個別F-ll細(xì)胞而不同(伯蘭德LM.(Boland,LM.)等人，生遝學(xué)染,吉(Jow"a/o/P/^z'o/ogy)420，223-245(1990))。如通過用BAY-K5552(L型阻斷劑)進(jìn)行抑制所測定，一些細(xì)胞(圖9C)主要含有L型(^2+通道，而其它細(xì)胞(圖9D)主要含有受coCTXMVIIA(N型阻斷劑)抑制的N型通道。圖9C展示在響應(yīng)BAY-K5552的細(xì)胞中，用化合物1處理能降低Ca^電流，而圖9D中說明不響應(yīng)化合物1的細(xì)胞如何含有對coCTXMVIIA敏感的Ca^電流。在圖9C的情況下，內(nèi)部施用化合物1(10pM)能在IO分鐘內(nèi)使Ca^電流平均降低46+/-1.8%(圖9C)。在明顯響應(yīng)coCTXMVIIA的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)電流的明顯降低(圖9D)。在所培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上進(jìn)行雷帕霉素類似物對C^+電流的作用的進(jìn)一步驗證。當(dāng)阻斷N型Ca^通道并將化合物2(10^M)加入內(nèi)部移液管溶液中時，IO分鐘后，電流緩慢抑制達(dá)74.5+A8.8(圖9E、F)。這一作用至少部分歸因于L型通道的抑制，因為N-和L型(^2+通道的阻斷使所述抑制降低到僅為細(xì)胞中殘余電流的21.3+/-4.4%(圖9F)。實例8.用雷帕霉素類似物處理后的轉(zhuǎn)錄譜方法存錄譜由E16大鼠胚胎制備皮層祌經(jīng)元。在涂板24小時后，用10^M免疫親和素配體和相應(yīng)媒劑處理培養(yǎng)物。處理4小時、12小時、24小時和48小時后，溶解細(xì)胞。用RNEASY微型試劑盒(QIAGEN)提取各樣本的總RNA。使用SUPERSCRIPT系統(tǒng)(INVITROGEN),由2pg各RNA樣本合成雙鏈cDNA，純化，在活體外轉(zhuǎn)錄，以在存在生物素標(biāo)記的UTP和CTP的情況下使用T7RNA聚合酶來制備生物素標(biāo)記的cRNA。如制造商所推薦，將分成片段的cRNA與大鼠基因組2302.0GENECHIP(AFFYMETRIX,加利福尼亞州圣克拉拉(SantaClara,CA))雜交。根據(jù)制造商的方案，在FluidicsStation450上對雜交陣列進(jìn)行染色，且隨后在AFFYMETRIX⑧掃描儀上進(jìn)行掃描。使用AFFYMETRIXMAS5.0軟件產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)。在英杰提公司(Ingenuity)中分析轉(zhuǎn)錄譜。茲論為進(jìn)一步分析雷帕霉素類似物結(jié)合的下游結(jié)果，獲得用10nM雷帕霉素類似物I或II處理的大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄譜表明，在雷帕霉素類似物I或II處理后，<^2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑完全下調(diào)(參看表3A)。雷帕霉素類似物I引起諸如VGCC、瞬時受體電位通道、谷氨酸受體的N-甲基D-天冬氨酸亞型(NMDA)和SHT3R通道等主要質(zhì)膜Ca"流入通道的下調(diào)。在這些通道中，Cf經(jīng)由NMDA通道流入為導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要事件(高希(Ghosh)等人，科學(xué)(Sc&"ce)268,239-247(1995))。已知能裂解NMDA肽并活化Ca2+流入的纖溶酶原活化劑(PLAU)(塔尼利斯(Traynelis)等人，自然醫(yī)藥(Ato.MecO7,17-18(2001))明顯下調(diào)(經(jīng)雷帕霉素類似物I處理的情況下下調(diào)-40倍；經(jīng)雷帕霉素類似物II處理的情況下下調(diào)-10倍)；這很可能降低通過NMDA通道的鈣流入。另外，IP3受體的下調(diào)可能降低內(nèi)部儲存的Ca^釋放，并且鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白激酶的下調(diào)(例如PNCK，-20倍)將減少胞漿C+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所觀察到的Ca"流入和Ca"信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的減弱對于治療中風(fēng)和外傷性腦損傷極為重要，這是因為，一般認(rèn)為神經(jīng)元中C^+過載是引發(fā)Ca2+依賴性過程，從而最終導(dǎo)致祌經(jīng)元死亡的關(guān)鍵事件(高希(Ghosh)等人，科學(xué)(&k"")268,239-247(1995))。此外，細(xì)胞Ca2+含量降低可通過Bcl2(阿爾德里奇(Edlich)等人，生物化學(xué)雜志(乂5/a/.C/2e肌)281,14961-14970(2006))或PPID締合的線粒體透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(白恩斯(Baines)等人，自然(Wafwe)434,658-662(2005))的FKBP38ZCa2+/CaM活化來抑制細(xì)胞凋亡。觀察到膽固醇生物合成基因的明顯上調(diào)(例如LSS，+13倍)，表明類固醇受體活化(王(Wang)等人，脂質(zhì)研究雜志U"p^i^&)47,778-786(2006))(參看表3B)。已報導(dǎo)類固醇激素或格爾德霉素(geldanamydn)能刺激祌經(jīng)突起生長，由于類固醇受體可通過FK506活化，故雷帕霉素類似物I和II與FKBP52的結(jié)合可能活化類固醇受體并促進(jìn)神經(jīng)突起生長。表3A:鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑基因<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>基因符號基因名2相對于DMSO的改變倍數(shù)2相對于DMSO的p值1相對于DMSO的改變倍數(shù)l相對于DMSO的p值位置家族BcAMP依賴性，調(diào)控，II型，卩RAP1BRAP1B，RAS致癌基因家族成員-1.330.002-1.29<0扁細(xì)胞質(zhì)酶TPM1原肌球蛋白1(a)-2.830.002-2.55<0週細(xì)胞質(zhì)其它TPM3原肌球蛋白3-1.990.001-2.04<0扁細(xì)胞質(zhì)其它TRPC1瞬時受體電位陽離子通道，亞家族C，成員1-1.080.33-1.210.033質(zhì)膜離子通道TRPC3瞬時受體電位陽離子通道，亞家族C，成員3-1.950扁-2.40.015質(zhì)膜離子通道TRPC4瞬時受體電位陽離子通道，亞家族C，成員4-5.420.023-4.560扁質(zhì)膜離子通道TRPV6瞬時受體電位陽離子通道，亞家族V，成員61.73<0週1.65<0駕質(zhì)膜離子通道表3B:固醇生物合成路徑基因基因符號基因名2相對于DMSO的改變倍數(shù)2相對于DMSO的p值1相對于DMSO的改變倍數(shù)1相對于DMSO的P值位置家族CYP27B1細(xì)胞色素P450，家族27，亞家族B，多肽l-1.380.008-1.270.055細(xì)胞質(zhì)酶DHCR77-脫氫膽固醇還原酶1.730扁1.84<0.001細(xì)胞質(zhì)酶EBP依莫帕米(emopamil)結(jié)合蛋白(固醇異構(gòu)酶)1.320.0341.450.012細(xì)胞質(zhì)酶FDFT1法呢基-二磷酸法呢基轉(zhuǎn)移酶11.890.0011.94<0週細(xì)胞質(zhì)酶77<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>實例IO.電壓門控L型鈣通道pi亞基的減少刺激神經(jīng)突起生長使用RNAi技術(shù)來降低CACB1(Ca2+通道卩1亞基)禾PFKBP4(TFKBP52)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并通過生長表型來檢查生物作用。方法#經(jīng)元禁蕎激簡單說來，由胚齡為15天(E15)的大鼠胚胎(斯普拉-道來大鼠(Sprague-Dawley)，査爾斯河實驗室公司(CharlesRiverLaboratories),馬薩諸塞州威爾明頓(Wilmington,MA))制備皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物。收集胚胎，去除其腦部，并在無(^2+和Mg^的冰冷的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中解剖皮層。將解剖的皮層組織碎片匯集在一起，并轉(zhuǎn)移到伊爾氏平衡鹽溶液(Earle'sbalancedsaltsolution)(沃斯辛頓生物化學(xué)品公司(WorthingtonBiochemical),新澤西州弗里霍爾德(Freehold,NJ))中含有20IU/ml木瓜蛋白酶的酶解離培養(yǎng)基中，且在37'C下培育30分鐘。酶促解離后，抽吸出木瓜蛋白酶溶液，并在含有2,000IU/mlDNase和10mg/ml卵類粘蛋白(ovomucoid)蛋白酶抑制劑的完全培養(yǎng)基[具有B-27補(bǔ)充(吉凱公司(Gibco)，紐約長島(GrandIsland,NY))、100IU/ml青霉素(penicillin)、100|ag/ml鏈霉素(streptomycin)、3.3pg/ml岈腸霉素(aphidicolin)、0,5mM谷氨酸的Neurobasal培養(yǎng)基]中，用燒邊的巴氏移液管(fire-polishedPasteurpipette)機(jī)械地濕磨組織。嚴(yán)/e皮層摔經(jīng)元^WiAC4游潔好存染對于各條件，利用200ngsiGLO層粘連蛋白A/CsiRNA(達(dá)哈麥肯RNA技術(shù)公司(DharmaconRNATechnologies),科羅拉多州博爾德(Boulder,CO))、L型鈣通道pl亞基siRNA(GGAGAAGUACAAUAAUGACTT(SEQIDNO:15)(有義鏈)和GUCAUUAUUGUACUUCUCCTT(SEQIDNO:16)(反義鏈))或FKBP4siRNA(CCUAGCUAUGCUUUUGGCATT(SEQIDNO:17)(有義鏈)和UGCCAAAGCAUAGCUAGGTT(SEQIDNO:18)(反義鏈))(安比隆公司(Ambion,Inc.),得克薩斯州奧斯汀(Austin,TX))，使用程序DC-104在96孔Shuttle核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(艾瑪斯生物系統(tǒng)公司(amaxabiosystems),馬里蘭州蓋瑟斯伯格(Gaithersburg,MD))上轉(zhuǎn)染5x105個皮層神經(jīng)元。將25pl各轉(zhuǎn)染反應(yīng)物加入涂有聚D-賴氨酸的96孔(每一實驗4個孔)中。將轉(zhuǎn)染過的皮層神經(jīng)元保持培養(yǎng)24小時。將用零亂的siRNA、層粘連蛋白A/C、CACNB1或FKBP52siRNA處理的皮層神經(jīng)元溶解于含有蛋白酶抑制劑混合液和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中，并使用布萊克福德分析(Bradfordassay)(伯樂實驗室公司(Bio-RadLaboratories)，加利福尼亞州赫拉克勒斯(Hercules,CA))測量蛋白質(zhì)濃度。將每一條件下2嗎蛋白質(zhì)裝載到各孔中，并經(jīng)由SDS-PAGE分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上并與抗層粘連蛋白A/C(奧普斯特公司(Upstate))、CACNB1(艾比姆公司(abeam),馬薩諸塞州劍橋(Cambridge,MA))或FKBP52(圣塔克魯茲生物技術(shù)公司(SantaCruzBiotechnology,Inc.))的抗體一起培育并以肌動蛋白(西格瑪公司(Sigma))作為裝載對照。顯現(xiàn)譜帶，并使用奧德賽紅外成像系統(tǒng)(OdysseyInfraredImagingSystem)和奧德賽軟件(利克生物科技公司(Li-CorBiosciences),內(nèi)布拉斯州林肯(Lincoln,NE))進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)表達(dá)敲除(knockdown)是計算為隨零亂siRNA表達(dá)百分比變化的與肌動蛋白的比率。翁論為進(jìn)一步證實雷帕霉素類似物I或II對FKBP52和CACNB1的抑制有助于神經(jīng)突起生長和神經(jīng)元存活，利用針對層粘連蛋白A/C(用作對照)、FKBP52、CACNB1或FKBP52+CACNB1的siRNA轉(zhuǎn)染大鼠皮層神經(jīng)元，并在24小時后測量總神經(jīng)突起生長。總神經(jīng)突起生長在CACNBlsiRNA處理的神經(jīng)元中相比對照基本上沒有變化，但在FKBP52siRNA-(對照的125±12%)和FKBP52+CACNB1siRNA處理(對照的126±14%)的神經(jīng)元中明顯增加(圖10A)，表明FKBP52的抑制作用刺激神經(jīng)突起生長。同時，還通過ELISA分析來定量神經(jīng)絲蛋白表達(dá)，從而評定siRNA對神經(jīng)元存活的影響。神經(jīng)元存活百分比在CACNB1siRNA處理的細(xì)胞中相比對照有所降低(對照的80±3%)，且在FKBP52siRNA處理的細(xì)胞中略有增加(對照的112±2%)，且在FKBP52+CACNB1siRNA處理的細(xì)胞中明顯增加(對照的152±2%)(圖IOB),表明減少FKBP52和CACNB1能促進(jìn)神經(jīng)元存活。進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡來驗證siRNA處理在24小時后降低皮層神經(jīng)元中層粘連蛋白A/C、CACNB1或FKBP52蛋白的表達(dá)。代表性印跡展示于圖10C中。層粘連蛋白A/C的表達(dá)降低79.21±13.68%，CACNB1的表達(dá)降低70.79±20.79%，且FKBP52的表達(dá)降低86.83±7.03%(n=3)。這些實驗表明，雷帕霉素類似物I與FKBP52和電壓門控L型鈣通道(31亞基形成新穎復(fù)合物。復(fù)合物的形成抑制PI亞基的活性，并刺激神經(jīng)突起生長。其還表明，通過修飾雷帕霉素的mTOR結(jié)合區(qū)所制備的兩種實質(zhì)上非免疫抑制性的免疫親和素配體雷帕霉素類似物I和II(艾伯漢姆(Abraham)等人，免疫學(xué)研究年鑒(/附mw"o/.)14,483-510(1996))展現(xiàn)有效的神經(jīng)突起生長活性。親和純化揭示，二者都與免疫親和素FKBP52和L型電壓依賴性Ca"+通道的|31亞基(CACNB1)結(jié)合。雷帕霉素類似物1I對于FKBP52(相對于FKBP12)的結(jié)合選擇性比雷帕霉素高687倍。此外，用所述化合物處理的大鼠皮層神經(jīng)元展現(xiàn)<^2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的全面下調(diào)，并且在經(jīng)處理的F-ll細(xì)胞中觀察到L型C^+通道的部分抑制。大鼠皮層神經(jīng)元中FKBP52禾n/或CACNBl的遺傳減少促進(jìn)神經(jīng)突起生長和神經(jīng)元存活。在不受理論束縛的情況下，申請者相信，免疫親和素配體能通過調(diào)節(jié)(^2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)潛在地保護(hù)神經(jīng)元免于經(jīng)歷(^2+誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并通過經(jīng)由FKBP52結(jié)合活化類固醇受體來促進(jìn)神經(jīng)突起生長。這一新穎神經(jīng)保護(hù)80作用機(jī)制為許多疾病的治療提供有價值前景。本申請案通篇引用的所有參考文獻(xiàn)、未決專利申請案和公開的專利都以引用的方式清楚地并入本文中。等效物所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將僅使用常規(guī)實驗就能認(rèn)識到或能夠確定本文所述的本發(fā)明的特定實施例的許多等效物。預(yù)期所述等效物也涵蓋于以下權(quán)利要求書中。權(quán)利要求1.一種經(jīng)純化復(fù)合物，其包含免疫親和素配體以及(i)免疫親和素或其功能片段和/或(ii)鈣通道亞基或其功能片段中的一者或兩者。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述免疫親和素配體為在雷帕霉素主鏈的1位和4位具有雜原子取代基的雷帕霉素類似物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述免疫親和素配體為具有式I的雷帕霉素類似物Ri和R2為不同的獨(dú)立基團(tuán)，并且選自由OR3和N(R3.)(R3.,)組成的群組；或R,和R2不同、經(jīng)由單鍵連接并且選自由0和NR3組成的群組；R3、R3.和R3.,獨(dú)立地選自由H、d到C6烷基、d到C6經(jīng)取代垸基、C3到(38環(huán)烷基、經(jīng)取代C3到Q環(huán)烷基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基和經(jīng)取代雜芳基組成的群組；R4和R4':(a)獨(dú)立地選自由H、OH、O(Q到Q垸基)、O(經(jīng)取代d到Q烷基)、O(酰基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)和鹵素組成的群組；或(b)—起形成與O鍵結(jié)的雙鍵；R5、R6和R7獨(dú)立地選自由H、OH和OCH3組成的群組；R8與R9(0經(jīng)由單鍵連接且都為CH2，或(ii)經(jīng)由雙鍵連接且都為CH;其中:RH選自由C二O、CHOH和CH2組成的群組；n為l或2;或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述雷帕霉素類似物的Ri為O，且R2為NR3。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述雷帕霉素類似物的R!為OR3，且R2為N(R3')(R3")。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述雷帕霉素類似物的R3、R3.或R3-為芳基或經(jīng)取代芳基。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述雷帕霉素類似物的所述芳基或經(jīng)取代芳基具有以下結(jié)構(gòu)其中R10、Ru、R12、Ru和R"獨(dú)立地選自由H、d到C6垸基、經(jīng)取代d到Q烷基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基、經(jīng)取代雜芳基、鹵素、酰基、OH、O(烷基)、O(經(jīng)取代烷基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷基)、NH(經(jīng)取代烷基)、NH(芳基)、NH(經(jīng)取代芳基)和NH(?；?組成的群組。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述免疫親和素配體為選自由以下組成的群組的雷帕霉素類似物9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述免疫親和素為FKBP52或其功能片段，其具有與圖12A-12D中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:11-14)至少95%—致或一致的序列。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)純化復(fù)合物，其中所述鈣通道亞基為電壓門控L型鈣通道Pl亞基或其功能片段，其具有與圖UA-11J中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)至少95%—致或一致的序列。11.一種重組宿主細(xì)胞，其包含第一重組核酸，所述第一重組核酸包含編碼具有圖12A-12D中所示氨基酸序列(SEQIDN0:11-14)的FKBP52的核苷酸序列；和/或第二重組核酸，所述第二重組核酸包含編碼具有圖11A-11J中所示氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)的電壓門控L型鈣通道pi亞基的核苷酸序列。12.—種抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求l所述的經(jīng)純化復(fù)合物。13.—種鑒別測試化合物的方法，所述測試化合物使包括所述測試化合物以及(i)免疫親和素和/或(ii)電壓門控L型鈣通道(31亞基中的一者或兩者的復(fù)合物的形成增加，所述方法包含使免疫親和素或其功能片段和/或卩l(xiāng)亞基或其功能片段與測試化合物在允許形成所述復(fù)合物的條件下接觸；相對于參考物，檢測在存在所述測試化合物的情況下所述復(fù)合物的存在；其中在存在所述測試化合物的情況下所述復(fù)合物的含量相對于在所述參考物中所述復(fù)合物的含量的增加表明，所述測試化合物使復(fù)合物形成增加。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中樣本為細(xì)胞溶解產(chǎn)物、重構(gòu)系統(tǒng)，其包含培養(yǎng)的細(xì)胞或動物個體中的細(xì)胞。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述復(fù)合物形成的增加是通過檢測以下一者或多者來測定所述復(fù)合物的實際形成的增加；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變；鈣通道活性的降低；或神經(jīng)元活性的改變。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述神經(jīng)元活性的改變被檢測為存活、分化或神經(jīng)突起生長中的一者或多者的增加。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述測試化合物為從天然存在或經(jīng)修飾吸水鏈霉菌(S.hygrosccjpicus)獲得的聚酮。18.—種通過權(quán)利要求13所述的方法鑒別的化合物。19.一種使復(fù)合物形成增加的方法，所述復(fù)合物包括免疫親和素配體以及(i)免疫親和素或其功能性變異體和/或(ii)鈣通道亞基或其功能性變異體中的一者或兩者，所述方法包含使免疫親和素或其功能片段和/或電壓門控L型鈣通道卩l(xiāng)亞基或其功能片段與免疫親和素配體在使所述復(fù)合物形成增加的條件下接觸。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述接觸步驟是在細(xì)胞溶解產(chǎn)物、重構(gòu)系統(tǒng)或培養(yǎng)的細(xì)胞或動物個體中發(fā)生。21.—種降低細(xì)胞中電壓門控鈣通道活性和/或FKBP52活性的方法，其包含使表達(dá)FKBP52或其功能片段和/或所述電壓門控L型鈣通道(31亞基或其功能片段中的一者或兩者的細(xì)胞與免疫親和素配體在允許所述免疫親和素配體與所述FKBP52或其片段和/或所述亞基或其片段中的一者或兩者結(jié)合的條件下接觸，由此抑制所述鈣通道活性。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述接觸步驟包含將所述免疫親和素配體加入培養(yǎng)的哺乳動物神經(jīng)元或心血管細(xì)胞中。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述接觸步驟包含對個體投與一定量的所述免疫親和素配體，所述量足以形成所述免疫親和素配體與所述FKBP52或其片段和/或所述亞基或其片段中的一者或兩者的復(fù)合物。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述投與所述個體的免疫親和素的量是通過在活體外測試誘導(dǎo)復(fù)合物形成所需的免疫親和素配體的量來測定。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其進(jìn)一步包含鑒別具有患一種或多種與涉及L型鈣通道功能障礙的病癥有關(guān)的癥狀的風(fēng)險或具有所述癥狀的個體。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述個體為罹患神經(jīng)變性病癥或心血管病癥的哺乳動物。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述免疫親和素配體是與L型鈣通道拮抗劑組合投與。28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述免疫親和素配體為在雷帕霉素主鏈的1位和4位具有雜原子取代基的雷帕霉素類似物。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述雷帕霉素類似物具有式I:其中R,和R2為不同的獨(dú)立基團(tuán)，并且選自由OR3和N(R3,)(Rr)組成的群組；或f^和R2不同，經(jīng)由單鍵連接并且選自由0和NR3組成的群組；R3、113,和113,,獨(dú)立地選自由H、d到C6烷基、d到Q經(jīng)取代垸基、C3到Cg環(huán)垸基、經(jīng)取代C3到C8環(huán)垸基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基和經(jīng)取代雜芳基組成的群組；R4禾口R4':(a)獨(dú)立地選自由H、OH、0(d到C6烷基)、0(經(jīng)取代d到C6垸基)、O(酰基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)和鹵素組成的群組；或(b)—起形成與O鍵結(jié)的雙鍵；R5、Rs和R7獨(dú)立地選自由H、OH和OCH3組成的群組；Rs與R9(i)經(jīng)由單鍵連接且都為CH2，或(ii)經(jīng)由雙鍵連接且都為CH;Ris選自由OO、CHOH和CH2組成的群組；n為l或2;或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述雷帕霉素類似物選自由以下組成的群組-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>31.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述FKBP52或其功能片段包含與圖12A-12D中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:11-12)至少95%—致或一致的氨基酸序列。32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述電壓門控L型鈣通道的(31亞基或其功能片段包含與圖11A-11J中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)至少95%—致的氨基酸序列。33.—種刺激神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突起生長和/或存活的方法，其包含使所述神經(jīng)元細(xì)胞與免疫親和素配體接觸，其中所述免疫親和素配體以引起以下一種或多種作用的濃度存在(i)下調(diào)f丐信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中至少一種組分的表達(dá)或活性；(ii)降低FKBP52活性或表達(dá)；(iii)降低或抑制L型鈣通道的活性或表達(dá)；(iv)活化糖皮質(zhì)激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；(v)誘導(dǎo)形成包含所述免疫親和素配體、FKBP52和/或(31亞基的復(fù)合物；和/或(vi)防止神經(jīng)元遭受鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述接觸步驟包含對個體投與一定量的所述免疫親和素配體，所述量足以形成包含所述免疫親和素配體以及FKBP52和/或(31亞基中的一者或兩者的復(fù)合物。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述投與所述個體的免疫親和素的量是通過在活體外測試誘導(dǎo)復(fù)合物形成所需的免疫親和素配體的量來測定。36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其進(jìn)一步包含鑒別具有患一種或多種與涉及L型鈣通道功能障礙的病癥有關(guān)的癥狀的風(fēng)險或具有所述癥狀的個體。37.—種治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病癥的方法，其包含對個體投與一定量的免疫親和素配體，所述量足以形成包括所述免疫親和素配體以及免疫親和素或其功能片段和/或鈣通道亞基或其功能片段中的一者或兩者的復(fù)合物，由此治療所述病癥。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述投與所述個體的免疫親和素的量是通過在活體外測試誘導(dǎo)復(fù)合物形成所需的免疫親和素配體的量來測定。39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其進(jìn)一步包含鑒別具有患一種或多種與涉及L型f丐通道功能障礙的病癥有關(guān)的癥狀的風(fēng)險或具有所述癥狀的個體。40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述個體為罹患神經(jīng)變性病癥或心血管病癥的哺乳動物。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述個體為罹患選自由以下組成的群組的病癥的哺乳動物中風(fēng)、帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、癲癇、心絞痛、心律失常和局部缺血。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述個體為罹患選自由以下組成的群組的病癥的哺乳動物偏頭痛、神經(jīng)性疼痛、急性疼痛、情緒障礙、精神分裂癥、抑郁癥、焦慮癥、小腦性共濟(jì)失調(diào)、遲發(fā)性運(yùn)動障礙、高血壓和尿失禁。43.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述免疫親和素配體是與L型鈣通道拮抗劑組合投與。44.根據(jù)權(quán)利要求33或37所述的方法，其中所述免疫親和素配體為具有式I的雷帕霉素類似物^巾Ri和R2為不同的獨(dú)立基團(tuán)，并且選自由OR3和N(R3,)(R3,')組成的群組；或Ri和R2不同、經(jīng)由單鍵連接并且選自由0和NR3組成的群組；R3、R3,和R3.,獨(dú)立地選自由H、d到Cs垸基、d到C6經(jīng)取代垸基、<33到Q環(huán)垸基、經(jīng)取代C3到C8環(huán)垸基、芳基、經(jīng)取代芳基、雜芳基和經(jīng)取代雜芳基組成的群組；R4禾口R4':(a)獨(dú)立地選自由H、OH、O(d到Q烷基)、O(經(jīng)取代d到C6烷基)、O(酰基)、O(芳基)、O(經(jīng)取代芳基)和鹵素組成的群組；或(b)—起形成與O鍵結(jié)的雙鍵；R5、Rs和R7獨(dú)立地選自由H、OH和OCH3組成的群組；Rs與R9(i)經(jīng)由單鍵連接且都為CH2，或(ii)經(jīng)由雙鍵連接且都為CH;R^選自由CK)、CHOH和CH2組成的群組；n為1或2;或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述雷帕霉素類似物選自由以下組成的群組46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述免疫親和素為FKBP52或其功能片段，其具有與圖12A-12D中所示氨基酸序列(SEQIDNO:11-14)至少95%—致或一致的氨基酸序列。47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述鈣通道亞基為電壓門控L型鈣通道的卩l(xiāng)亞基或其功能片段，其具有與圖11A-11J中所示氨基酸序列(SEQIDNO:1-10)至少95%—致或一致的氨基酸序列。48.—種刺激神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突起生長的方法，其包含使所述神經(jīng)元細(xì)胞與電壓門控L型鈣通道pi亞基的拮抗劑和/或FKBP52拮抗劑中的一者或兩者在降低所述Pl亞基或FKBP52的活性或表達(dá)的條件下接觸。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞選自由多巴胺能細(xì)胞、膽堿能細(xì)胞、皮層細(xì)胞和脊髓細(xì)胞組成的群組。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述拮抗劑為與所述卩l(xiāng)亞基和/或FKBP52形成復(fù)合物的免疫親和素配體。51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述拮抗劑為所述鈣通道P亞基或FKBP52的轉(zhuǎn)錄抑制劑。52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述拮抗劑為抗體。53.—種免疫親和素配體的用途，其用于制備供預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況的藥物。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的用途，其中所述免疫親和素配體為在雷帕霉素主鏈的1位和4位具有雜原子取代基的雷帕霉素類似物。55.—種免疫親和素配體與L型鈣通道拮抗劑的組合的用途，其用于預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況。56.—種根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一權(quán)利要求鑒別的化合物的用途，其用于制備供預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況的藥物。57.—種免疫親和素配體，其用于預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況。58.—種組合物，其包含免疫親和素配體和L型,丐通道拮抗劑，所述組合物用于預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況。59.—種根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一權(quán)利要求鑒別的化合物，其用于預(yù)防或治療與L型鈣通道功能障礙有關(guān)的病況。全文摘要本發(fā)明揭示免疫親和素配體和其作為鈣通道活性調(diào)節(jié)劑的用途。本發(fā)明還揭示對例如神經(jīng)變性病癥和心血管病癥等與鈣通道功能障礙有關(guān)的病況的篩選、治療和預(yù)防方法。文檔編號A61K38/17GK101626777SQ200780050592公開日2010年1月13日申請日期2007年1月29日優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日發(fā)明者凱文·蓬,埃德蒙·易德里斯·格拉齊亞尼,阮本方,馬克·羅伯特·鮑爾比申請人:惠氏公司