專利名稱：新的Aβ構(gòu)象異構(gòu)體選擇性抗Aβ球聚體的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療和診斷阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease) 的單克隆抗體。具體地講，本發(fā)明涉及稱為10F4和3C5的單克隆抗 體以及具有類似性質(zhì)的其它單克隆抗體(例如鼠、人或人源化單克隆抗 體)。
背景信息
1907年，內(nèi)科醫(yī)生愛羅斯*阿爾茨海默(Alois Alzheimer)最早描述 了癡呆形式的神經(jīng)病理學(xué)特征，后來為了紀(jì)念他，便將該病命名為阿 爾茨海默病(AD)。具體地講，AD是年長者癡呆中最常見的起因，65 歲以上人群的發(fā)病率約為10%。隨著年齡增大，發(fā)病率也上升。全球 大約有1500萬人罹患此病，預(yù)期隨平均壽命進(jìn)一步延長，再過幾十 年患病人數(shù)將增加約三倍。
從分子觀點(diǎn)來看，阿爾茨海默病(AD)的特征是聚集異常的蛋白質(zhì) 的沉積。在胞外淀粉狀蛋白斑的情況下，這些沉積主要由淀粉狀蛋白 P肽絲組成，在胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的情況下，主要由T蛋白組 成。淀粉狀蛋白P(AP)肽由P-淀粉狀蛋白前體蛋白被蛋白酶切割而產(chǎn) 生。這種切割通過名為a-分泌酶、(3-分泌酶和？分泌酶的幾種蛋白酶 的協(xié)同活性實(shí)現(xiàn)。切割產(chǎn)生多個長度不同的特定片段。淀粉狀蛋白斑 主要由長度為40個或42個氨基酸(AP40、 A^42)的肽組成。主要的切 割產(chǎn)物為A(340;然而，A(342具有強(qiáng)得多的毒性作用。與在阿爾茨海默病中觀察到的非常類似的大腦淀粉狀蛋白沉積物和認(rèn)知缺損也是
唐氏綜合征(Down's syndrome)(三體性21)的標(biāo)志，該病在出生時的發(fā) 生率為1/800。
Hardy和Higgins的淀粉狀蛋白級聯(lián)假說假定Ap(l-42)產(chǎn)生的增 加可導(dǎo)致初原纖維和原纖維(即Ap斑塊的主要組分)的形成，這些原纖 維是造成阿爾茨海默病癥狀的原因。盡管癡呆的嚴(yán)重程度與沉積的A卩 斑塊負(fù)載之間關(guān)聯(lián)性低下，但是這個假說至今仍受到支持。AD肺內(nèi) 可溶性A(3形式(其比起斑塊負(fù)載與AD癥狀更為相關(guān))的發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致了 對淀粉狀蛋白級聯(lián)假說被修正。
用Ap肽主動免疫導(dǎo)致斑塊形成減少，并且導(dǎo)致已有斑塊部分溶 解。同時，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型中導(dǎo)致認(rèn)知缺陷減輕。對于用針對 A卩肽的抗體的被動免疫，也發(fā)現(xiàn)了 A卩斑塊負(fù)載減少。用AN-1792 (聚 集的原纖維狀態(tài)下的A卩(l-42)肽)主動免疫的IIa期試驗(yàn)結(jié)果(ELAN Corporation Pic， South San Francisco, CA， USA和Dublin, UK)表明， 針對AP肽的免疫療法是成功的。在30名患者的分組中，通過MMSE 和DAD指數(shù)測定，具有陽性抗AP抗體效價的患者中，疾病進(jìn)程顯著 減緩。
然而，該研究因?yàn)槟X膜腦炎形式的嚴(yán)重副作用被中止(Bennett和 Holtzman， 2005， Neurology, 64， 10-12)。具體地講，腦膜腦炎的特 征是神經(jīng)炎癥和T細(xì)胞浸潤至腦部。據(jù)推測，這是由于注射作為抗原 的A卩(1-42)引起T細(xì)胞免疫應(yīng)答所致。在被動免疫之后，預(yù)期不會出 現(xiàn)這類免疫應(yīng)答。迄今為止，沒有可供參考的臨床數(shù)據(jù)。然而，關(guān)于 這種被動的免疫方法，由于在非常年老的APP23小鼠的臨床前研究， 引起對有關(guān)副作用狀況的顧慮，該小鼠5個月內(nèi)一周一次接受針對 A卩(1-42)N端表位的抗體。具體地講，與鹽水治療的對照動物相比， 這些小鼠表現(xiàn)出微出血數(shù)和嚴(yán)重程度增加(Pfeifer等，2002, Science, 298, 1379)。在非常年老(> 24個月)的Tg2576和PDAPP小鼠中也披 露了類似的微出血增加(Racke等，2005， J Neurosci, 25， 629-636;Wilcock等，2004, J. Neuroinflammation， 1(1):24; DeMattos等，2004, Neurobiol. Aging 25(S2):577)。在兩個小鼠品系中，抗體注射導(dǎo)致微出 血顯著增加。相比之下，針對Ap(l-42)肽中部區(qū)域的抗體不會引起微 出血(de Mattos等，出處同上)。未引起微出血與用不結(jié)合CAA形式 聚集的A卩肽的抗體治療有關(guān)(Racke等，J Ne畫ci， 25， 629-636)。 然而，尚不清楚導(dǎo)致APP轉(zhuǎn)基因小鼠微出血的確切機(jī)制。據(jù)推測，腦 淀粉樣蛋白血管病(CAA) 1起或至少加重大腦出血。CAA存在于幾乎 所有阿爾茨海默病腦部，約20。/o的病例被視作"嚴(yán)重CAA"。因此，被 動免疫應(yīng)當(dāng)以通過選出識別Ap肽中部區(qū)域或羧基端區(qū)域的抗體從而 避免微出血為目的。
國際專利申請公布號WO2004/067561披露了穩(wěn)定的A(3(l-42)寡 聚體(A(3(l-42)球聚體(globulomer))和針對該球聚體的特異性抗體。用 非特異性蛋白酶消化顯示，Ap球聚體可以從球狀核心結(jié)構(gòu)突出來的 親水N端開始消化(Barghorn等，2005, JNeurochem, 95， 834-847)。 這類N端截短的A卩球聚體(Ap(12-42)和Ap(20-42)球聚體)代表該寡聚 體AP的基本結(jié)構(gòu)單元，并且是主動免疫兔和小鼠導(dǎo)致高抗體效價的 十分有效的抗原(W02004/067561)。若干有關(guān)AD腦部中存在N端截 短的A(3形式的最新報道提出了其體內(nèi)病理作用的假說(Sergeant等， 2003， JNeurochem, 85, 1581-1591; Thal等，1999, JNeuropathol. Exp Neurol， 58， 210-216)。在體內(nèi)消化期間，可能涉及腦內(nèi)存在的某些蛋 白酶，例如中性溶酶(NEP24.11)或胰島素降解酶(IDE)(Selkoe, 2001， N函n， 32， 177-180)。
由此看來，十分急迫地需要即便有副作用(例如微出血)但副作用 也很小的阿爾茨海默病的療法。出于此類治療，相關(guān)患者能夠維持具 有功能和活動的生活方式達(dá)多年，在這以后可能無需這類治療。因此， 對于這類治療不僅意味著經(jīng)費(fèi)問題，而且還意味著"生活質(zhì)量"問題， 這不僅僅對于患者，而且還對于他們的護(hù)理人員而言。
10附圖簡述


圖1 (a)顯示不同抗A卩抗體(6E10、 3C5、 10F4)特異性的斑點(diǎn)印 跡分析。通過用Ap(12-42)球聚體(按照實(shí)施例I中所述方法制備)使小 鼠主動免疫后，篩選融合的雜交瘤細(xì)胞來獲得本文受試單克隆抗體(市 售6E10除外，Signet,目錄號9320)。對各A|3形式進(jìn)行連續(xù)稀釋， 并與相應(yīng)的單克隆抗體一起溫育以進(jìn)行免疫反應(yīng)
1. AJ3(l-42)單體，0.1%NH4OH
2. A卩(l-40)單體，0.1%NH4OH
3. AJ3(1畫42)單體，0.1%NaOH
4. A卩(l-40)單體，0.1%NaOH
5. A卩(l-42)球聚體
6. A(3(12-42)球聚體
7. A卩(20-42)球聚體
8. A卩(l-42)原纖維制備物
9. sAPPa (Sigma)(第 一斑點(diǎn)1 pmol)
圖1 (b)說明應(yīng)用強(qiáng)度光密度分析所做的定量評價。對于每種A卩 形式，僅評價對應(yīng)于最低抗原濃度的斑點(diǎn)，前提是其相對密度大于最 后清晰地目視辯別得出的Ap(l-42)球聚體斑點(diǎn)相對密度的20% (閾 值)。單獨(dú)地測定了每個斑點(diǎn)印跡的這個閾值。對于給定抗體，該值表 示A(3(l-42)球聚體的識別與各個A卩形式之間的關(guān)系。
圖2
圖2說明從阿爾茨海默病腦組織中免疫沉淀的A卩肽的結(jié)果。 圖2 (a)表示用于分析的患者材料詳述。
圖2 (b)i兌明A(3(l-40)-肽和Ap(l-42)肽的免疫沉淀量，用抗體 6E10、 3C5、 10F4和對照抗體IgG2b對不同患者腦樣品和對照腦樣品 進(jìn)行SELDI-MS分析定量測出。
ii圖2(c)i兌明A(3(l-40)肽和Ap(l-42)肽的相對免疫沉淀量，用抗體 3C5、 10F4和對照抗體IgG2b與全A卩抗體6E10比較，以百分比為單 位，對不同患者腦樣品和對照腦樣品進(jìn)行SELDI-MS分析定量測出。 將抗體6E10的A(3肽免疫沉淀的總量設(shè)為100%。
圖2(d)說明A卩肽的免疫沉淀量，通過用抗體6E10、 3C5、 10F4 和對照抗體IgG2b對不同患者腦樣品和對照腦樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分 析定量測出。
圖2 (e)說明A(3肽的相對免疫沉淀量，用抗體3C5、 10F4和對照 抗體IgG2b與全A卩抗體6E10比較，以百分比為單位，對不同患者腦 樣品和對照腦樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析定量測出?？贵w6E10免疫沉 淀的A卩肽的總量設(shè)為100%。
圖3 (a)表示以下成分考馬斯染色的SDSPAGE:
1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分子標(biāo)記蛋白)
2) A卩(l-42)原纖維制備物；對照
3) A卩(l-42)原纖維制備物十mAb6E10, 20小時，37°C
4) A(3(l-42)原纖維制備物+mAb6E10， 20小時，37°C
5) A卩(l-42)原纖維制備物+mAb3C5， 20小時，37°C，
6) A卩(l-42)原纖維制備物+mAb3C5, 20小時，37°C，
7) A(3(l-42)原纖維制備物+mAb 10F4， 20小時，37°C
8) A卩(l-42)原纖維制備物+mAblOF4, 20小時，37°C 圖3 (b)顯示體外抗體結(jié)合A(3-原纖維的光密度定量分析。
圖4
圖4顯示不同濃度的抗體與阿爾茨海默病(AD)患者或老年APP 轉(zhuǎn)基因小鼠新皮質(zhì)橫切片的結(jié)合情況。
圖4(a)表示通過剛果紅染色，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠系Tg2576和AD
，上清液 ，沉淀
上清液
沉淀 ，上清液 ，沉淀
12患者(RZ55)腦中，確認(rèn)淀粉狀蛋白沉積物在腦組織中為斑塊，在腦血 管中為腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)。
圖4(b)顯示在AD患者(RZ16)中僅用6G1和市售抗體6E10產(chǎn)生 的實(shí)質(zhì)A(3沉積(淀粉狀蛋白斑)的強(qiáng)染色，而10F4和3C5則顯示明顯 較弱的染色。所有抗體都在0.7 [xg/mL的濃度下測定。
圖4(c)表示TG2576小鼠中僅用6G1和市售抗體6E10產(chǎn)生.的實(shí) 質(zhì)A卩沉積(淀粉狀蛋白斑)的強(qiáng)染色，而10F4和3C5則顯示明顯較弱 的染色。所有抗體都在0.7嗎/mL的濃度下測定。
圖4(d)-圖4(g)顯示采用成像分析對組織學(xué)圖像中AP斑塊染色的 定量分析。從斑塊的灰度值減去背景組織的灰度值計(jì)算出光密度值 (0% =未染色)。(圖4(d)顯示Tg2576小鼠中0.7嗎/mL抗體的結(jié)合情 況。圖4(e)顯示APP/L小鼠中0.07-0.7嗎/mL抗體的結(jié)合情況。圖4(f) 顯示AD患者(RZ55)中0.7 pg/mL抗體的結(jié)合情況，圖4(g)顯示AD患 者(RZ16)中0.07-0.7 pg/mL抗體的結(jié)合情況。對市售抗體6E10 (starts) 和4G8(圓圈)以及抗體6G1、 10F4和3C5(對于對照，l個星號/圓圈 p<0.05， 2個星號/圓圈:p<0.01, 3個星號/圓圈:pO.OOl; ANOVA 后的事后Bonferroni t檢驗(yàn)pO.001)的染色之間的差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)評 價(圖4(d)和(e))。圖4(e)和圖4(g)中,顯示抗體10F4和3C5的染色總 比市售抗體6E10和4G8的明顯較弱(ANOVA pO.OO 1后的事后t檢驗(yàn) p<0.05)。
圖4(h)顯示僅用6G1和市售抗體6E10產(chǎn)生血管A卩沉積物(箭頭) 強(qiáng)染色，而用8F5或8C5染色則弱得多。所有抗體都在0.7 jag/mL的 濃度下測定。Tg2576小鼠中出現(xiàn)性質(zhì)上類似的情形(本文未顯示)。
圖5 (a)、圖5 (c)、圖5 (e)和圖5 (g)顯示由單克隆抗體6E10、 10F4、 3C5和8F5從阿爾茨海默病患者CSF中免疫沉淀的A(3(l-40)和 A卩(l-42)肽的量。4個阿爾茨海默病CSF樣品的結(jié)果見下((a)-編號為0504009的阿爾茨海默病患者；(c)=編號為30027的阿爾茨海默病 患者；(e):編號為30026的阿爾茨海默病患者；(g)=編號為26748015 的阿爾茨海默病患者)。
圖5 (b)顯示與由抗體6E10免疫沉淀的Ap肽的量相比，由抗體 10F4、 3C5和8F5從阿爾茨海默病患者CSF中免疫沉淀的A卩(l-40) 和A(3(l-42)肽的相對量，單位為百分比。將由mAb 6E10抗體免疫沉 淀的A卩肽的總量設(shè)為100%。 4個阿爾茨海默病CSF樣品的結(jié)果見下 ((b)-編號為0504009的阿爾茨海默病患者；(d)-編號為30027的阿爾 茨海默病患者；(f)4扁號為30026的阿爾茨海默病患者；(h)=編號為 26748015的阿爾茨海默病患者)。
圖5 (i)表示用于圖5(a)-5(i)分析的阿爾茨海默病患者CSF材料的 詳情。
圖6
圖6 (a)表示編碼本文稱為"3C5"的單克隆抗體的可變重鏈的 DNA序列(SEQ ID NO:l)。
圖6 (b)表示編碼本文稱為"3C5"的單克隆抗體的可變輕鏈的 DNA序列(SEQ ID NO:2)。
圖6 (c)表示編碼本文稱為"10F4"的單克隆抗體的可變重鏈的 DNA序列(SEQ ID NO:3)。
圖6 (d)表示編碼本文稱為"10F4"的單克隆抗體的可變輕鏈的 DNA序列(SEQ ID NO:4)。
圖7
圖7 (a)表示編碼本文稱為"3C5"的單克隆抗體的可變重鏈的氨基 酸序列(SEQ ID NO:5)。
圖7 (b)表示編碼本文稱為"3C5"的單克隆抗體的可變輕鏈的氨基 酸序列(SEQ ID NO:6)。
14圖7 (c)表示編碼本文稱為"10F4"的單克隆抗體的可變重鏈的氨 基酸序列(SEQ ID N0:7)。
圖7 (d)表示編碼本文稱為"10F4"的單克隆抗體的可變輕鏈的氨 基酸序列(SEQ ID NO:8)。(互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)在各所述序列中用下劃線 標(biāo)出)。
發(fā)明概述
本發(fā)明包括針對AP球聚體(A卩globulomer)的抗體，它在免疫療 法中改善患者的認(rèn)知行為，與此同時僅與腦內(nèi)Ap肽總量中的一小部 分反應(yīng)。該性質(zhì)防止了對大腦A卩平衡產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性千擾，并引起較少 的副作用。(例如在使用聚集原纖維狀態(tài)的A(3肽(ELAN Corporation Plc， South San Francisco, CA， USA和Dublin, UK)進(jìn)行主動免疫或 使用AN-1792 (聚集原纖維狀態(tài)的Ap(l-42)肽)進(jìn)行主動免疫的研究 中，觀察到在治療上引起爭議的腦體積縮小。此外，在該臨床試驗(yàn)中， 觀察到腦膜腦炎形式的嚴(yán)重副作用。)
具體地講，本發(fā)明通過提供對A(3球聚體具有高親和力的A卩球 聚體抗體，解決了上述的副作用問題。這些抗體能夠識別其它形式的 A卩肽，特別是單體、原纖維和sAPPa。此外，本發(fā)明的抗體可通過 僅結(jié)合非CSF的淀粉狀蛋白(3，從而鑒別腦脊液(CSF)的淀粉狀蛋白p。 另外，與已知抗體(即6E10)相比，本發(fā)明的抗體(例如10F4和3C5) 較少與AP斑塊和血管A(3結(jié)合。
具體地講，本發(fā)明包括對A|3( 1 -42)球聚體的親和力比對至少 一種 選自以下的淀粉狀P蛋白的親和力高的分離抗體a)腦脊液(CSF)中存 在的A卩(l-42)肽，和b) CSF中存在的A卩(l-40)肽。
本發(fā)明還包括對A(3(l-42)球聚體的結(jié)合親和力比對至少一種選 自以下的淀粉狀卩蛋白的結(jié)合親和力高的分離抗體a) A卩(l-42)單體， b) A(3(l-40)單體，c) A(3(l-42)原纖維，和d)可溶性淀粉狀前體蛋白a (soluble amyloid precursor protein-alpha, sAPPa)。比起CSF中存在的淀粉狀卩蛋白，該抗體結(jié)合非CSF中存在的淀粉狀(3蛋白的親和力較高。 上述抗體可以是例如鼠抗體、單克隆抗體、重組抗體、人抗體和 /或人源化抗體。此外，本發(fā)明抗體的任一種或多種可與至少一個表位 結(jié)合，該表位與單克隆抗體10F4(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏號PTA-7808的雜交瘤)或單克隆抗體3C5 (獲自標(biāo)注為美國典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406的雜交瘤)結(jié)合的一個或多個表位 相同。
另夕卜，本發(fā)明包括；包含SEQIDN0:5的分離抗體、包含SEQID NO:6的分離抗體以及同時包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的分離抗體。
此外，本發(fā)明包括包含SEQIDNO:7的分離抗體、包含SEQ ID NO:8的分離抗體以及同時包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的分離抗體。
本發(fā)明的上述抗體可包含至少一個選自以下的氨基酸序列a)單 克隆抗體(10F4)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤)的重鏈CDR3的氨基酸序列和輕鏈CDR3的氨基 酸序列，以及b)單克隆抗體(3C5)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏號PTA-7406的雜交瘤)的重鏈CDR3的氨基酸序列和輕鏈 CDR3的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明的上述抗體可包含至少一個選自以下的氨基酸序 列a)單克隆抗體(10F4)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤)的重鏈CDR2的氨基酸序列和輕鏈CDR2的氨基 酸序列，以及b)單克隆抗體(3C5)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏號PTA-7406的雜交瘤)的重鏈CDR2的氨基酸序列和輕鏈 CDR2的氨基酸序列。
同樣，本發(fā)明的抗體可包含至少一個選自以下的氨基酸序列a) 單克隆抗體(10F4)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤)的重鏈CDR1的氨基酸序列和輕鏈CDR1的氨基
16酸序列，以及b)單克隆抗體(3C5)(獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏號PTA-7406的雜交瘤)的重鏈CDR1的氨基酸序列和輕鏈 CDR1的氨基酸序列。
另外，本發(fā)明還包括包含至少一個選自以下氨基酸序列的CDR 的分離抗體a) SHYAWN ; b) YIDYSGSTRYLPSLKS ; C) GSGYFYGMDY ; d) HASQNINVWLS ; e) KASNLHT ; f) QQGQSYPYT ; g) NYL正；h) VINPGSGDTNYNENFKG ; i) GVITTGFDY; j) RASGNIHNYLA; k) NAKTLAD和1) QHFWSSPRT。
另外，本發(fā)明包括標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤以及由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤獲得或產(chǎn)生的單克隆抗體(10F4)。
本發(fā)明還包括標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406 的雜交瘤以及由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406的 雜交瘤獲得或產(chǎn)生的單克隆抗體(3C5)。
此外，本發(fā)明包括編碼上述抗體的分離的核酸分子。該分子的核 苷酸序列可包含至少一個選自以下的序列SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。本發(fā)明還包括包含所述分離的 核酸分子的載體以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。
另外，本發(fā)明包括制備抗體的方法，該方法包括將上述宿主細(xì)胞 在適于產(chǎn)生上述任一種抗體的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間。按照 該方法制備的抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還包括包含上述任一種或多種抗體的組合物。該組合物還 包含藥學(xué)上可接受的載體。
此外，本發(fā)明包括包含由至少 一個選自以下的核苷酸序列編碼的 氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO:l 、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4。該抗體可選自由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏號PTA-7406的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體和由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng) 物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體還可包含至少一個選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本發(fā)明還包括用于治療或預(yù)防需要這種治療或預(yù)防的患者的淀 粉樣變性(amyloidosis)的方法。該方法包括以足以實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防的 量給予患者一種或多種上述抗體(通過被動免疫)。淀粉樣變性可為例 如阿爾茨海默病或唐氏綜合征的淀粉樣變性。
本發(fā)明還包括與患有淀粉樣變性的患者腦中的淀粉狀|3蛋白的至 少一個表位結(jié)合的分離抗體。該抗體可通過例如ATCC保藏號選自 PTA-7406和PTA-7808的雜交瘤產(chǎn)生。
本發(fā)明還包括在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷阿爾茨海 默病的方法。該方法包括以下步驟從患者體內(nèi)分離出生物樣品(例如 CSF樣品或腦組織樣品)；使該生物樣品在足以形成抗原/抗體復(fù)合物 的條件下與一種或多種上述抗體接觸一段時間；檢測樣品中抗原/抗體 復(fù)合物的存在情況，復(fù)合物的存在表明在患者中診斷出阿爾茨海默 病。復(fù)合物的抗原可以為例如球聚體。
另外，本發(fā)明包括在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷阿爾茨 海默病的另一種方法。該方法包括以下步驟從患者體內(nèi)分離生物樣 品；在足以形成抗體/抗原復(fù)合物條件下使生物樣品與抗原接觸一段時 間；在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合的條件下，將綴合物加到所得抗 體/抗原復(fù)合物一段時間(其中所述綴合物包含連有能夠產(chǎn)生可檢測信 號的信號產(chǎn)生化合物的本發(fā)明的分離抗體)；通過^r測由信號產(chǎn)生化合 物產(chǎn)生的信號，來檢測可能存在于生物樣品中的抗體的存在情況，該 信號表明在患者中診斷出阿爾茨海默病。用于該測定法的抗原可以為 例如^求聚體。
此外，本發(fā)明包括在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷阿爾茨 海默病的其它方法。該方法包括以下步驟從患者體內(nèi)分離生物樣品； 在足以形成抗抗體/抗體復(fù)合物的條件下，使生物樣品與抗抗體(其中 所述抗抗體對一種或多種本發(fā)明抗體具有特異性)接觸一段時間，該復(fù)合物含有存在于生物樣品中的抗體；在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合 的條件下，將綴合物加到所得抗抗體/抗體復(fù)合物一段時間(其中所述 綴合物包含結(jié)合能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物的抗原)；檢測 由信號產(chǎn)生化合物產(chǎn)生的信號，該信號表明在患者中診斷出阿爾茨海 默病。
另外，本發(fā)明包括包含一種或多種本發(fā)明抗體和藥學(xué)上可接受的 佐劑的疫苗。
此外，本發(fā)明包括鑒定化合物的方法，所述化合物適于使預(yù)測將 發(fā)生阿爾茨海默病的患者主動免疫。該方法包括以下步驟在足以使 一種或多種化合物與一種或多種抗體結(jié)合的條件下，將一種或多種目 標(biāo)化合物暴露于一種或多種本發(fā)明抗體一段時間；然后鑒定出與一種 或多種抗體結(jié)合的那些化合物，所鑒定出的化合物可用于使預(yù)測將發(fā) 生阿爾茨海默病患者主動免疫。
本發(fā)明還包括診斷盒，該診斷盒包括一種或多種本發(fā)明的抗體以 及包含連有信號產(chǎn)生化合物的抗體的綴合物，其中綴合物的抗體不同 于診斷盒內(nèi)的一種或多種抗體。診斷盒中還可包括包裝說明書，它描 述了進(jìn)行測定所采用的步驟以及診斷盒的組分。
本發(fā)明還包括另一種診斷盒，該診斷盒包括針對一種或多種本發(fā) 明抗體的抗抗體和包含連有信號產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物。該抗原 可為例如球聚體。此外，還可包括包裝說明書，它描述了進(jìn)行測定所 采用的步驟以及診斷盒的組分。
發(fā)明詳述
如實(shí)施例1中所述，由用截短的球聚體Ap(12-42)進(jìn)行免疫設(shè)計(jì) 出本發(fā)明的抗體。具體地講，針對截短的(12-42)球聚體產(chǎn)生了單克隆 抗體3C5和10F4 (與針對A卩(l-42)球聚體制備的單克隆抗體8F5和 8C5形成對比)。與Barghom等所述方法(Barghorn等，J. Neurochem， 95， 834-847)和實(shí)施例3第6項(xiàng)中所述的方法(該項(xiàng)中(12-42)球聚體通
19l-42球聚體制備)相比，該Ap(12-42) 球聚體由AP 12-42肽直接制備。這兩種A(3(12-42)球聚體變體在其最 終的聚集模式上有所不同。由Ap(12-42)肽制備的一種只具有中間球 聚體形式(如WO2004/067561中所述的"寡聚體A"),由預(yù)先存在的 A卩(l-42)球聚體制備的另一種則是成熟的球聚體(如WO2004/067561 中所述的"寡聚體B")。
本發(fā)明的目的是提供針對AP球聚體的抗體，所述抗體在免疫療 法中改善患者的認(rèn)知行為，與此同時僅與腦內(nèi)AP肽總量中的一小部 分反應(yīng)。預(yù)期這可防止對大腦Ap平衡產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性干擾，并引起較少 的副作用(例如如上所述，在使用聚集原纖維狀態(tài)的Ap肽進(jìn)行主動免 疫的研究中(用AN1792的ELAN實(shí)驗(yàn))，觀察到在治療上引起爭議的 腦體積縮小。另外，在這個試驗(yàn)中，還觀察到腦膜腦炎形式的嚴(yán)重副 作用。本發(fā)明通過提供對A(3球聚體具有高親和力的球聚體特異性抗 體解決了這個問題。這些抗體能夠分辨出其它形式的Aj3肽，特別是 單體和原纖維。此外，這些抗體不與大腦脊液中的淀粉狀蛋白P結(jié)合 (或者相對于市售抗體(例如6E10) (Signet目錄號9320),以較低親和 力結(jié)合)。因此，本發(fā)明涉及對A(3球聚體具有結(jié)合親和力的抗體。
本文術(shù)語"AP(X-Y)，，是指人淀粉狀P蛋白的氨基酸位置X到氨基 酸位置Y (包括X和Y)的氨基酸序列，具體是指氨基酸序列 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (相當(dāng)于氨基酸位置l-43)的氨基酸位置X到氨基酸位置Y的氨基酸序 列或其天然存在的任何變體，特別是具有至少一個選自以下突變的氨 基酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish")、 E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch") 、 E22K ("Italian") 、 D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V, 其中編號與AP肽的啟始順序相對應(yīng)，包括位置X和位置Y在內(nèi)或具 有最多3個另外的氨基酸取代的序列，任何取代無一可妨礙球聚體形 成，優(yōu)選自氨基酸12或編號更高的X起到氨基酸42或編號更低的Y 止的部分沒有另外的氨基酸取代，更優(yōu)選自氨基酸20或編號更高的X
20起到氨基酸42或編號更低的Y止的部分沒有另外的氨基酸取代，最 優(yōu)選自氨基酸20或編號更高的X起到氨基酸40或編號更低的Y止的 部分沒有另外的氨基酸取代，本文"另外的"氨基酸取代是指不是天然 存在的與規(guī)范序列的任何偏差。
本文術(shù)語"A(3(l-42)"是指自人淀粉狀(3蛋白氨基酸位置1到氨基 酸位置42 (包括1和42)的氨基酸序列，具體是指氨基酸序列 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA 或其天然存在的任何變體，特別是具有至少一個選自以下突變的氨基 酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish") 、 E22G ("Arctic") 、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"), D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V,其中編 號與A卩肽的啟始順序相對應(yīng)，包括1和42兩者在內(nèi)，或者具有最多 3個另外氨基酸取代的序列，任何取代無一可妨礙球聚體形成，優(yōu)選 自氨基酸20到氨基酸42的部分沒有另外的氨基酸取代。同樣，本文 術(shù)語"Ap(l-40)"是指人淀粉狀P蛋白自氨基酸位置1到氨基酸位置40 (包括1和40)的氨基酸序列，具體是指氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV或其天然存在的任何 變體，特別是具有至少一個選自以下突變的氨基酸序列A2T、 H6R、 D7N、 A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"),和D23N ("Iowa"),其中編號與A(3肽的啟始順序相對應(yīng)， 包括1和40兩者在內(nèi)，或者具有最多3個另外的氨基酸取代的序列， 任何取代無一可妨礙球聚體形成，優(yōu)選自氨基酸20到氨基酸40的部 分沒有另外的氨基S臾取代。
本文術(shù)語"Ap(12-42)"是指人淀粉狀卩蛋白自氨基酸位置12到氨 基酸位置42 (包括12和42)的氨基酸序列，具體是指氨基酸序列 VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA或其天然存在的任 何變體，特別是具有至少一個選自以下突變的氨基酸序列A21G ("Flemish")、 E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian") 、 D23N ("Iowa")、 A42T和A42V，其中數(shù)值與A卩肽的始末位置相對應(yīng)，包括12和42兩者在內(nèi)，或者具有最多3個另外的氨基酸取代的序列， 無任何取代可妨礙球聚體形成，優(yōu)選自氨基酸20到氨基酸42的部分 沒有氨基酸取代。
本文術(shù)語"A卩(20-42)"是指人淀粉狀卩蛋白自氨基酸位置20到氨 基酸位置42同時包括20和42的氨基酸序列，特別是氨基酸序列F
具有至少一個選自以下的突變A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic")、 E22Q ("Dutch")、 E22K ("Italian"), D23N ("Iowa，，)、 A42T和A42V, 其中編號與A(3肽的啟始順序相對應(yīng)，包括20和42兩者在內(nèi)，或者 具有最多3個另外的氨基酸取代的序列，任何取代無一可妨礙球聚體 形成，優(yōu)選沒有任何另外的氨基酸取代。
本文術(shù)語"AP(X-Y)球聚體"即(A(3(X-Y)球狀寡聚體(globular oligomer))是指如上定義的球狀非共價締合的可溶性A(3(X-Y)肽，具有 均質(zhì)性和獨(dú)特的物理性質(zhì)。 一方面，AP(X-Y)球聚體是穩(wěn)定的非原纖 維狀寡聚裝配的AP(X-Y)肽，它通過與陰離子洗滌劑一起溫育獲得。 與單體和原纖維相比，這些球聚體的特征是明確的亞基裝配數(shù)(例如 WO2004/067561中所述的早期裝配形式，n=4-6，"寡聚體A"，后期裝 配形式，n=12-14，"寡聚體B")。球聚體具有三維球形結(jié)構(gòu)("熔球(molten globule)",參見Barghorn等，2005， JNeurochem, 95, 834-847)。它 們進(jìn)一步用下列一個或多個特征表征
-N端氨基酸X-23具有無選擇性蛋白酶(promiscuous protease)(例 如嗜熱菌蛋白酶或內(nèi)切蛋白酶GluC)的可切割性，產(chǎn)生截短形式的球 聚體；
-C端氨基酸24-Y具有無選擇性蛋白酶和抗體的不可及性；
-截短形式的這些球聚體維持所述球聚體的三維核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)
構(gòu)具有其球聚體構(gòu)象中的核心表位Ap(20-Y)的更好的可接近性。
按照本發(fā)明，特別是為了評價本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力，本文術(shù)
語"AP(X-Y)球聚體"具體是指通過例如下述實(shí)施例I中所述方法獲得
22的產(chǎn)物(另見WO 04/067561)。該方法可用來獲得A卩(l-42)球聚體、 A卩(12-42)球聚體和Ap(20-42)球聚體。優(yōu)選球聚體對神經(jīng)元細(xì)胞具有 親和力。優(yōu)選球聚體還具有神經(jīng)調(diào)制作用。按照本發(fā)明的另一個方面， 球聚體由11-16個Ap(X-Y)肽組成，最優(yōu)選由12-14個A(3(X-Y)肽組成。
按照本發(fā)明的另 一個方面，本文術(shù)語"A(3(X-Y)球聚體"是指基本 由AP(X-Y)亞基組成的球聚體，其中.如果12個亞基中的平均至少11 個為AP(X-Y)型則是優(yōu)選的，如果10%以下的球聚體包含任何非 A卩(X-Y)肽則是更優(yōu)選的，如果非A)3(X-Y)肽的含量低于檢測閾值則 是最優(yōu)選的。更準(zhǔn)確地講，本文術(shù)語"A卩(l-42)球聚體"是指基本由如 上定義的A卩(l-42)單元組成的球聚體；本文術(shù)語"Ap(12-42)球聚體"是 指基本由如上定義的Ap(12-42)單元組成的球聚體；本文術(shù)語 "A卩(20-42)球聚體"是指基本由如上定義的A(3(20-42)單元組成的球聚 體。
本文所用術(shù)語"交聯(lián)AP(X-Y)球聚體"是指通過球聚體組成單元的 交聯(lián)、優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)、更優(yōu)選乙醛交聯(lián)、最優(yōu)選戊二醛交聯(lián)由如上所 述的A(3(X-Y)球聚體獲得的分子。在本發(fā)明的另一個方面，交聯(lián)球聚 體基本為球聚體，其中各單元通過共價鍵至少部分連接，而不僅是通 過非共價相互作用聚集在一起。對于本發(fā)明的目的，交聯(lián)A卩(l-42)球 聚體特別為交聯(lián)A(3(l-42)寡聚體。
本文所用術(shù)語"A卩(X-Y)球聚體衍生物"具體是指通過共價連接有 利于檢測的基團(tuán)而被標(biāo)記的球聚體，所述基團(tuán)優(yōu)選熒光團(tuán)，例如異硫 氰酸熒光素、藻紅蛋白、維多利亞水母(Aequorea victoria)熒光蛋白、 Dictyosoma熒光蛋白或其任何組合或焚光活性衍生物；發(fā)色團(tuán)；化學(xué) 發(fā)光團(tuán)(chemoluminophore),例如螢光素酶，優(yōu)選北美螢火蟲(Photinus pyralis)螢光素酶、費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)螢光素酶或任何組合或其 化學(xué)發(fā)光活性衍生物；酶活性基團(tuán)，例如諸如辣根過氧化物酶等過氧 化物酶或其任何酶活性衍生物；電子致密基團(tuán)，例如諸如含金基團(tuán)等
23的含重金屬基團(tuán)；半抗原，例如苯酚衍生的半抗原；強(qiáng)抗原結(jié)構(gòu)，例如預(yù)測有抗原性的肽序列，例如通過Kolaskar和Tongaonkar算法預(yù)測有抗原性的肽序列；另一個分子的適配體；螯合基團(tuán)，例如六組氨?；?；調(diào)節(jié)特異性蛋白之間進(jìn)一步的相互作用的天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或天然衍生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，例如許多fos/jun對；磁性基團(tuán)，例如鐵磁基團(tuán)；或放射性基團(tuán)，例如包含'H、 "C、 32P、 353或1251或其任何組合的基團(tuán)；或通過共價或非共價高親和力相互作用標(biāo)注(flag)的球聚體，優(yōu)選與促進(jìn)鈍化、螯合、降解和/或沉淀的基團(tuán)共價連接，優(yōu)選用促進(jìn)體內(nèi)降解的基團(tuán)標(biāo)注，更優(yōu)選用泛素標(biāo)注，其中如果經(jīng)標(biāo)注的寡聚體在體內(nèi)裝配，則是特別優(yōu)選的；或者是指通過上述任何組合經(jīng)過修飾的球聚體。這類標(biāo)記基團(tuán)和標(biāo)注基團(tuán)以及用于使它們與蛋白質(zhì)連接的方法是本領(lǐng)域已知的。可以在球聚體化(globulomerization)之前、期間或之后進(jìn)行標(biāo)記和/或標(biāo)注。在本發(fā)明的另一個方面，球聚體衍生物是通過標(biāo)記和/或標(biāo)注反應(yīng)由球聚體得到的分子。相應(yīng)地，本文術(shù)語"Ap(X-Y)單體衍生物"具體是指如球聚體所述被標(biāo)記或被標(biāo)注的A(3單體。
本文術(shù)語"較大親和力"是指相互作用的程度，其中作為 一方面的未結(jié)合抗體和未結(jié)合球聚體與作為另 一方面的抗體-球聚體復(fù)合物之間的平衡更偏向于抗體-球聚體復(fù)合物。同樣，本文術(shù)語"較小親和力"是指相互作用的程度，其中作為 一方面的未結(jié)合抗體與未結(jié)合球聚體與作為另 一方面的抗體-球聚體復(fù)合物之間的平衡更偏向于未結(jié)合抗體和未結(jié)合球聚體。術(shù)語"較大親和力"與術(shù)語"較高親和力"同義，術(shù)語"較小親和力"與術(shù)語"較低親和力"同義。
本文術(shù)語"AP(X-Y)單體"是指分離形式的A(3(X-Y)肽，優(yōu)選基本上不參與和其它a卩肽的非共價相互作用的形式的a(3(x-y)肽。實(shí)際上，A(3(X-Y)單體通常以水溶液形式提供。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單體水溶液含有0.05%-0.2%、更優(yōu)選約0.1%NH4OH。在本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單體水溶液含有0.05%-0.2%、更優(yōu)選約0.1% NaOH。當(dāng)使用時(例如用于測定本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力)，適宜的是以適當(dāng)?shù)姆绞较♂屗鋈芤骸４送?，?br> 常適宜的是在制備溶液后2小時內(nèi)，特別在1小時內(nèi)，尤其在30分鐘內(nèi)使用所述溶液。
本文術(shù)語"原纖維"是指包含各個非共價締合的AP(X-Y)肽的集合體(assemblies)的分子結(jié)構(gòu)，在電子顯孩"竟下呈原纖維結(jié)構(gòu)，它與剛果紅結(jié)合，然后在偏振光下出現(xiàn)雙折散，其X射線衍射圖形為交叉卩結(jié)構(gòu)(cross-j3structure)。在本發(fā)明的另一個方面，原纖維是通過這樣的方法獲得的分子結(jié)構(gòu)，即包括在洗滌劑不存在時(例如在0.1 MHC1中)，合適的A(3肽自身誘導(dǎo)的聚合體的聚集，導(dǎo)致24個以上、優(yōu)選100個以上單元的聚集體的形成。該方法是本領(lǐng)域眾所周知的。Ap(X-Y)原纖維適宜以水溶液的形式使用。在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過以下方法制備原纖維水溶液將A(3肽溶于0.1。/。 NH4OH，用20mMNaH2PO4、 140 mM NaCl (pH 7.4)將其稀釋成l:4后，重調(diào)節(jié)pH至7.4，將溶液在37。C下溫育20小時后，按10000 g離心IO分鐘，重新懸浮于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)。
本文術(shù)語"Ap(X-Y)原纖維"是指基本由A(3(X-Y)亞基組成的原纖維，如果平均至少90%的亞基是Ap(X-Y)型，則是優(yōu)選的，如果至少98%的亞基是AP(X-Y)型的，則是更優(yōu)選的，如果非A(3(X-Y)肽的含量低于檢測閾值，則是最優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及抗體，所述抗體具有與所述單克隆抗體10F4和3C5中任一種的結(jié)合譜(binding profile)類似的結(jié)合語。具有類似于所述單克隆抗體中任一種的結(jié)合譜的抗體包括其結(jié)合的表位是與單克隆抗體10F4和3C5結(jié)合的表位相同的抗體。
本發(fā)明還涉及能夠與至少一種、優(yōu)選與所有選自10F4和3C5的抗體竟?fàn)幍目贵w。本文術(shù)語"竟?fàn)幙贵w"是指任何數(shù)目的靶向相同分子實(shí)體或者穩(wěn)定但非共價連接的超分子實(shí)體(優(yōu)選相同分子)的抗體，其中至少一種抗體能夠特異性地降低另一種抗體的可測量結(jié)合，優(yōu)選通過空間阻礙另外一種抗體接近其靶表位，或者通過誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定可降
25低靶標(biāo)對另 一種抗體親和力的靶實(shí)體構(gòu)象，更優(yōu)選通過結(jié)合緊密接近另 一種抗體的耙表位的表位、結(jié)合與另 一種抗體的靶表位重疊或與其相同的表位(最優(yōu)選結(jié)合重疊或相同的表位，特別是結(jié)合相同的表位)，來直接阻斷另一種抗體接近其靶表位。如果兩個表位有部分共同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選其氨基酸序列，則被稱為"重疊的"，如果其化學(xué)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選其氨基酸序列相同，則被稱為"相同的"。因此，本發(fā)明還涉
及其靶表位與選自10F4和3C5中的至少一種抗體的靶表位重疊、優(yōu)選相同的抗體。具有類似于所述單克隆抗體10F4和3C5任一種的結(jié)合譜的抗體，因此還包括包含所述單克隆抗體任一種的至少 一部分抗原結(jié)合部分的抗體。優(yōu)選，所述部分包含所述單克隆抗體任一種的至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。因此，按照本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及分別包含單克隆抗體10F4或3C5的重鏈CDR3的氨基酸序列和/或輕鏈CDR3的氨基酸序列的抗體。這類抗體的具體實(shí)例包括還分別包含單克隆抗體10F4或3C5的重鏈CDR2的氨基酸序列和/或輕鏈CDR2的氨基酸序列的抗體。甚至更具體地講，這類抗體包括還分別包含單克隆抗體10F4或3C5的重鏈CDR1的氨基酸序列和/或輕鏈CDR1的氨基酸序列的抗體。 一方面，本發(fā)明因此涉及包含重鏈的抗體，該重鏈中CDR3、 CDR2和/或CDR1結(jié)構(gòu)域包含單克隆抗體10F4或3C5的重鏈CDR3、 CDR2和/或CDR1的氨基酸序列。又一方面，本發(fā)明因此涉及包含輕鏈的抗體，該輕鏈中CDR3、 CDR2和/或CDR1結(jié)構(gòu)域分別包含單克隆抗體10F4或3C5的輕鏈CDR3、 CDR2和/或CDR1的氨基酸序列。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含至少兩個可變區(qū)CDR組(CDR set)。更優(yōu)選兩個可變區(qū)CDR組，選自VH 10F4 CDR組和VL10F4 CDR組；VH 3C5 CDR組和VL 3C5 CDR組(參見圖7a-7d)。
在另一個實(shí)施方案中，上文所公開的抗體還包含人接納體構(gòu)架(acceptor framework)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體為CDR移植抗體(CDR grafted antibody)。優(yōu)選CDR移植抗體包含一個或多個上文所公開的CDR。優(yōu)選CDR移植抗體包含人接納體構(gòu)架。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。優(yōu)選人源化抗體包含一個或多個上文所公開的CDR。更優(yōu)選人源化抗體包含三個或更多個上文所公開的CDR。最優(yōu)選人源化抗體包含六個上文所公開的CDR。在一個具體的實(shí)施方案中，CDR被摻到人接納體構(gòu)架的人抗體可變區(qū)。4尤選人4元體可變區(qū)為人共有可變區(qū)(consensus human variabledomain)。更優(yōu)選人接納體構(gòu)架在關(guān)鍵殘基處包含至少 一個構(gòu)架區(qū)氨基酸取代，其中關(guān)鍵殘基選自鄰接CDR的殘基；糖基化位點(diǎn)殘基；稀有殘基；能夠與CDR相互作用的殘基；規(guī)范殘基(canonical residue);重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)之間的接觸殘基；Vernier區(qū)內(nèi)的殘基及Chothia定義的可變重鏈CDRl與Kabat定義的第一重鏈構(gòu)架之間重疊區(qū)中的殘基。優(yōu)選人接納體構(gòu)架包含至少一個構(gòu)架區(qū)氨基酸取代，其中構(gòu)架的氨基酸序列與所述人接納體構(gòu)架的序列有至少65%同 一性，并包含至少70個與所述人接納體構(gòu)架相同的氨基酸殘基。又一方面，本發(fā)明涉及同時包含如上定義的重鏈和輕鏈的抗體。優(yōu)選抗體包含至少一個如上所述的可變區(qū)。更優(yōu)選抗體包含兩個如上所述的可變區(qū)，其中所述兩個可變區(qū)的氨基酸序列如圖7中所示。
另 一方面，本發(fā)明的抗體包含選自IgGl 、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、IgA、 IgD、 IgE重鏈恒定區(qū)和人IgGl Ala234 Ala235突變型恒定區(qū)。該抗體特別包含人恒定區(qū)。優(yōu)選包含IgGl重鏈恒定區(qū)的抗體。
在另一個實(shí)施方案中，抗體是糖基化的。優(yōu)選糖基化模式為人糖基化模式或本文所公開的任一種真核細(xì)胞所產(chǎn)生的糖基化沖莫式，特別是CHO細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合部分。這類抗原結(jié)合部分包括但不限于抗體的Fab片段、F(ab')2片段和單鏈Fv片段。此外，抗原結(jié)合部分為Fab'片段、Fv片段和二硫鍵連接的Fv片段。
本發(fā)明還提供編碼任一種本文所公開的抗體的分離核酸。又一個實(shí)施方案提供包含本文所公開的分離核酸的載體。所迷載體可特別選
27自pcDNA、 pTT (Durocher等，7Vwc/e/c/ asearc/ 2002,第30巻，第 2期)、pTT3 (具有另外多克隆位點(diǎn)的pTT)、 pEFBOS (Mizushima, S. 和Nagata, S., (1990)他c/e/cac^^艦rcA第18巻，第17期)、pBV、 pJV和pBJ。
另一方面，宿主細(xì)胞用本文所公開的載體轉(zhuǎn)染。優(yōu)選宿主細(xì)胞為 原核細(xì)胞。更優(yōu)選宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E. coli)。在一個相關(guān)的實(shí)施方 案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。優(yōu)選真核細(xì)胞選自原生生物細(xì)胞、動物 細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞。更優(yōu)選宿主細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，包括 但不限于CHO和COS;或真菌細(xì)胞，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細(xì)月包，例長口 Sf9 。
本發(fā)明另 一方面提供制備本發(fā)明抗體的方法，該方法包括在適于 產(chǎn)生抗體的條件下，將任一種本文所公開的宿主細(xì)胞或雜交瘤在培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。另一個實(shí)施方案提供通過本文所公開的方法獲得的抗體。 本發(fā)明抗體可通過已知方式獲得。總共含有由幾千億個不同的抗體種 類組成的抗體庫的B淋巴細(xì)胞，是哺乳動物免疫系統(tǒng)的組成部分。對 特定抗原的正常免疫應(yīng)答意味著篩選出所述抗體庫的一種或多種抗 體，該抗體與所述抗原特異性結(jié)合，免疫應(yīng)答的成功至少部分歸因于 所述抗體特異性識別(并最終消除)刺激性抗原并忽略所述抗體環(huán)境中 的其它分子的能力。特異性識別一種特定靶抗原的抗體的實(shí)用性帶動
了單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展。標(biāo)準(zhǔn)化雜交瘤技術(shù)目前可供產(chǎn)生對目標(biāo)抗 原具有專一特異性的抗體。最近，已經(jīng)開發(fā)出重組抗體技術(shù)，例如抗
體文庫的體外篩選。這些技術(shù)同樣使得能夠制備出對目標(biāo)抗原具有專 一特異性的抗體。
在本發(fā)明的方法中，目標(biāo)抗原可供在體內(nèi)或體外作用于抗體庫。 按照一個實(shí)施方案，通過用所述抗原對動物進(jìn)行體內(nèi)免疫接種，使抗 原作用于所述抗體庫。這種體內(nèi)方法另還包括由動物淋巴細(xì)胞建立許 多雜交瘤，選出分泌與所述抗原特異性結(jié)合的抗體的特定雜交瘤。待 免疫的動物可為例如小鼠、大鼠、兔、雛雞、駱駝(camelid)或綿羊，或者可為上述任一種動物的轉(zhuǎn)基因形式，例如，具有人免疫球蛋白基 因的轉(zhuǎn)基因小鼠，它在抗原刺激后產(chǎn)生人抗體?？梢员幻庖叩钠渌?br> 型的動物包括患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠，該小鼠用人外 周單核血細(xì)胞重建(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)，或用淋巴細(xì)胞或其祖 細(xì)胞重建；以及用致死全身輻照處理后，用得自患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺 陷(SCID)的小鼠的骨髓細(xì)胞保護(hù)以抵抗輻射，接著移植了人功能性淋 巴細(xì)胞的小鼠("Trimera"系統(tǒng))。待免疫的動物的另 一種類型是其編碼 目標(biāo)抗原的基因組內(nèi)源基因被關(guān)閉(敲除)(例如通過同源重組)的動物 (例如小鼠)，使得在用抗原免疫后，所述動物將所述抗原識別為外源 抗原。對用該方法產(chǎn)生的多克隆或單克隆抗體進(jìn)行表征，并采用已知 篩選方法(包括但不限于ELISA和斑點(diǎn)印跡技術(shù))選出。
按照另一個實(shí)施方案，通過用所述抗原篩選重組抗體文庫，使抗 原能夠體外作用于抗體庫。例如，可以在噬菌體表面或在酵母細(xì)胞表 面或在細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)重組抗體文庫。在多個實(shí)施方案中，重組抗 體文庫例如是scFv文庫或Fab文庫。按照另一個實(shí)施方案，抗體文庫 表達(dá)成RNA-蛋白融合物。
制備本發(fā)明抗體的另 一種方法包括體內(nèi)和體外方法的組合。例 如，通過用所述抗原在體內(nèi)使動物免疫后，用所述抗原體外篩選出由 所述動物的淋巴細(xì)胞制備的重組抗體文庫或單一結(jié)構(gòu)域抗體文庫(例 如含有重鏈和/或輕鏈的抗體庫)，使該抗原作用于抗體庫。按照另一 種方法，通過用所述抗原對動物進(jìn)行體內(nèi)免疫接種后，使由所述動物 的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的重組抗體文庫或單一結(jié)構(gòu)域文庫進(jìn)行親和力成 熟，來使抗原作用于抗體庫。按照另一種方法，通過用所述抗原對動 物進(jìn)行體內(nèi)免疫接種后，選出各個分泌目標(biāo)抗體的抗體生成細(xì)胞，由 所述選出細(xì)胞獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)所對應(yīng)的cDNA (例如通過 PCR)，在哺乳動物宿主細(xì)胞中體外表達(dá)所述重鏈和輕鏈可變區(qū)(這被 稱為選擇'淋巴纟田月包抗體法(selected lymphocyte antibody method)或 SLAM)，從而能夠進(jìn)一步選出并操縱所選出的抗體基因序列，使抗原
29作用于抗體庫。另外，可通過以下的克隆表達(dá)來選出單克隆抗體通 過在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重鏈和輕鏈的抗體基因，選出分泌具有所需 結(jié)合親和力的抗體的哺乳動物細(xì)胞。
用于產(chǎn)生抗體的本發(fā)明方法可用來制備各種類型的抗體。這些包 括單克隆抗體，特別是重組抗體，尤其重要的是人抗體、嵌合抗體、 人源化抗體和CDR移植抗體及其抗原結(jié)合部分。
本發(fā)明還涉及能夠產(chǎn)生(分泌)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā) 明的雜交瘤包括選自PTA-7808和PTA-7406的美國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏號標(biāo)注的雜交瘤和產(chǎn)生單克隆抗體10F4和3C5的雜交瘤。
值得注意的是，本發(fā)明的抗體還可與本文所述Ap球聚體以外的 A卩形式反應(yīng)(例如結(jié)合)。這些抗原可以是或不是寡聚體抗原或球聚體 抗原。因此，與本發(fā)明的抗體結(jié)合的抗原包括任何包含與本發(fā)明抗體 具有反應(yīng)性的球聚體表位的A|3形式。這類A(3形式包括截短和非截短 的A卩(X-Y)形式(其中X和Y如上定義)，例如A卩(20-42)、 A卩(20-40)、 A卩(12-42)、 A卩(12-40)、 A(3(l-42)和A(3(l-40)形式，條件是所述形式包 含球聚體表位。
本發(fā)明還涉及包含如上定義的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的 組合物。按照具體實(shí)施方案，所述組合物為包含本發(fā)明抗體或抗原結(jié) 合部分和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。如上定義的本發(fā)明抗體 或抗原結(jié)合部分優(yōu)選能夠體外和體內(nèi)中和與之結(jié)合的A(3球聚體或其 衍生物的活性。因此，所述抗體或抗原結(jié)合部分可用來例如在含有所
按照一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及抑制所述球聚體或其衍生物活性 的方法，該方法包括使本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分作用于球聚體或 其衍生物，從而抑制所述球聚體或其衍生物的活性。例如可以體外抑 制所述活性。例如，為了抑制所述樣品中所述球聚體或其衍生物的活 性，可將本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分加到例如得自受治療者或細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品的制備物中，該制備物含有或者疑似含有所述球聚體或其 衍生物?；蛘?，可以在個體體內(nèi)抑制球聚體或其衍生物的活性。因此， 本發(fā)明還涉及如上定義的抗體或抗原結(jié)合部分在制備用于治療或預(yù) 防淀粉樣變性、特別是選自阿爾茨海默病和唐氏綜合征淀粉樣變性的 淀粉樣變性的藥物組合物中的用途。因此，本發(fā)明所述用途的一個方 面是治療或預(yù)防有需要的受治療者的淀粉樣變性、特別是阿爾茨海默 病或唐氏綜合征淀粉樣變性的方法，該方法包括給予受治療者如上定 義的抗體或抗原結(jié)合部分。采用用于治療并尤其是預(yù)防淀粉樣變性， 特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性的所述抗體或抗原結(jié) 合部分，特別用于被動免疫。因此，在預(yù)防或治療有需要的受治療者 的淀粉樣變性、特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性的方法 中，給予受治療者抗體或抗原結(jié)合部分的 一個目的是針對淀粉樣變 性、特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性使受治療者被動免 疫。
如上定義的本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分優(yōu)選能夠在體外和體內(nèi)
檢測出與之結(jié)合的A卩球聚體或其衍生物。因此，所述抗體或抗原結(jié) 合部分可用于例如在含有所述球聚體或其衍生物的制備物中或者在 存在所述球聚體或其衍生物的個人或其它哺乳動物體內(nèi)，；險測所述球 聚體或其衍生物。
按照一個實(shí)施方案，本發(fā)明涉及檢測所述球聚體或其衍生物的方
生物，從而與所述球聚體或其衍生物結(jié)合(并進(jìn)而優(yōu)選形成包含抗體或 其抗原結(jié)合部分與球聚體或其衍生物的復(fù)合物)。例如可以體外檢測球 聚體。例如，為了在所述制備物中檢測出所述球聚體或其衍生物，可 將本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分加到制備物中，該制備物是例如得自 含有或疑似含有所述球聚體或其衍生物的受治療者或細(xì)胞培養(yǎng)物的 樣品?；蛘?，可以在個體體內(nèi)檢測球聚體或其衍生物。因此，本發(fā)明 還涉及如上定義的抗體或抗原結(jié)合部分在制備用于診斷淀粉樣變性、
31特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性的組合物中的用途。本 發(fā)明所述用途的一個方面是診斷疑似患有淀粉樣變性、特別是阿爾茨 海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性的受治療者患有淀粉樣變性、特別是 阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性的方法，該方法包括給予受治 療者如上定義的抗體或抗原結(jié)合部分，檢測包含抗體或抗原結(jié)合部分 與抗原的復(fù)合物的形成情況，復(fù)合物的存在表明受治療者患有淀粉樣 變性、特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性。本發(fā)明所述用 途的第二方面是診斷疑似患有淀粉樣變性、特別是阿爾茨海默病或唐
氏綜合征淀粉樣變性的受治療者患有淀粉樣變性，特別是阿爾茨海默 病或唐氏綜合征淀粉樣變性的方法，該方法包括從受治療者體內(nèi)采 樣，使樣品與抗體或抗原結(jié)合部分(如上定義)接觸，檢測包含抗體或 抗原結(jié)合部分與抗原的復(fù)合物的形成情況，復(fù)合物的存在表明受治療 者患有淀粉樣變性、特別是阿爾茨海默病或唐氏綜合征淀粉樣變性。
例如ELISA、斑點(diǎn)印跡法或BIA核心分析(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden和Piscataway, NJ)。有關(guān)進(jìn)一步描述可參見J6nsson， U.等(1993) Ann, Biol. Clin. 51:19-26; J6nsson，U.等(1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson， B.等(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131;以及 Johnnson， B.等(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。按照具體實(shí)施方案， 本文定義的親和力是指進(jìn)行斑點(diǎn)印跡法，并用光密度測定法對其進(jìn)行 評價而得到的數(shù)值。按照本發(fā)明的具體實(shí)施方案，通過斑點(diǎn)印跡法測 定結(jié)合親和力包括以下步驟將一定量的抗原(例如如上定義的 A(3(X-Y)球聚體、A(3(X-Y)單體或A(3(X-Y)原纖維)或者適宜時例如在 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)、 0.2 mg/mL BSA中適當(dāng)稀釋 至抗原濃度為例如訓(xùn)pmol/(iL、 10pmol/pL、 1 pmol/|aL、 0.1 pmol/|_iL 和0.01 pmol/^L的稀釋液點(diǎn)樣到硝化纖維素膜，然后將該膜用牛奶封 閉以防止非特異性結(jié)合，洗滌后，與目標(biāo)抗體接觸，接著后者通過酶 綴合的第二抗體和比色反應(yīng)進(jìn)行檢測；在規(guī)定抗體濃度下，抗體結(jié)合的量使得能夠測定出親和力大小。因此兩個不同抗體對一個靶標(biāo)的相 對親和力，或者一個抗體對兩個不同靶標(biāo)的相對親和力，在此定義為 在其他方面相同的斑點(diǎn)印跡條件下，用兩種抗體-把標(biāo)組合觀察到的與 靶標(biāo)結(jié)合的抗體相應(yīng)量的關(guān)系。不^f象基于蛋白質(zhì)印跡法的類似方法，
斑點(diǎn)印跡法可確定抗體對其天然構(gòu)象的給定靶標(biāo)的親和力；不像 ELISA方法，斑點(diǎn)印跡法不受在不同的耙標(biāo)和基質(zhì)之間的親和力差異 困擾，從而可對不同靶標(biāo)之間進(jìn)行更準(zhǔn)確的比較。
本文所用術(shù)語"Kd"是指本領(lǐng)域已知特定的抗體-抗原相互作用的 解離常數(shù)。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選為分離抗體。"分離抗體"是指具有如上所述的
術(shù)語"基本不含"是指抗體制備物中至少95%的抗體、優(yōu)選至少98%的 抗體、更優(yōu)選至少99%的抗體具有所需要的結(jié)合親和力。另外，分離 抗體可基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)試劑。
本發(fā)明的分離抗體包括單克隆抗體。本文所用"單克隆抗體"是指 共同具有共同的重鏈和共同的輕鏈氨基酸序列的抗體分子、抗體的制 備物，與含有不同的氨基酸序列的抗體混合物的"多克隆"抗體制備物 形成對比。單克隆抗體可通過若干新型技術(shù)制備，如噬菌體、細(xì)菌、 酵母或核糖體展示，以及通過以來源于雜交瘤的抗體為例的經(jīng)典方法 制備(例如通過雜交瘤技術(shù)制備的雜交瘤分泌的抗體，例如標(biāo)準(zhǔn)Kohler 和Milstein雜交瘤方法((1975) Nature 256:495-497)。因此，具有一致 序列的非來源于雜交瘤的抗體本文仍稱為單克隆抗體，盡管它可通過 非經(jīng)典的方法獲得，術(shù)語"單克隆"不局限于來源于雜交瘤的抗體，而 是用于指來源于一個核酸克隆的所有抗體。因此，本發(fā)明的單克隆抗 體包括重組抗體。本文所用術(shù)語"重組"是指兩段另外分開的序列通過 例如化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操縱各段分離的核酸而得到的任 何人工組合(combination)。具體地講，術(shù)語"重組抗體"是指通過重組 方法產(chǎn)生、表達(dá)、制備或分離的抗體，例如利用轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞的重
33組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)的抗體；從重組組合型抗體文庫分離的抗體；由 人免疫球蛋白基因所致轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離出的抗體(參見例 如Taylor, L. D.等(1992) M/c/. 20:6287-6295);或者其中將特
定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)與其它DNA序 列裝配在一起，以任何其它方式產(chǎn)生、表達(dá)、制備或分離的抗體。重 組抗體包括例如嵌合抗體、CDR移植抗體和人源化抗體。本領(lǐng)域技術(shù) 人員清楚，在異源系統(tǒng)中表達(dá)來源于常規(guī)雜交瘤的單克隆抗體需要產(chǎn) 生重組抗體，即使所得抗體蛋白的氨基酸序列沒有變化或者并無意改 變。
在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。按照多 個實(shí)施方案，抗體可包含全部由單個物種得到的氨基酸序列，例如人 抗體或小鼠抗體。按照其它實(shí)施方案，抗體可以是嵌合抗體或CDR 移植抗體或另 一形式的人源化抗體。
術(shù)語"抗體，，是指由四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈組 成的免疫球蛋白分子。各鏈通常通過二硫鍵彼此連接。每條重鏈由所 述重鏈可變區(qū)(本文簡寫為HCVR或VH)和所述重鏈恒定區(qū)組成。重 鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域CH1、 CH2和CH3組成。每條輕鏈由所述輕 鏈可變區(qū)(本文簡寫為LCVR或VL)和所述輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定 區(qū)由CL結(jié)構(gòu)域組成。VH和VL區(qū)可被進(jìn)一步分成超變區(qū)，超變區(qū)稱 為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，散布在稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的保守區(qū)內(nèi)。因此，每 個VH和VL區(qū)由3個CDR和4個FR組成，F(xiàn)R按照以下列順序從N 端至C端排列FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。該 結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱"抗體部分")是指本發(fā)明抗體 的一個或多個片段，所述一個或多個片段仍具有如上定義的結(jié)合親和 力。完全抗體的片段顯示能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的抗原結(jié)合功能。按照術(shù)語抗 體的"抗原結(jié)合部分"，結(jié)合片段的實(shí)例包括(i) Fab片段，即由VL、 VH、 CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，即包含通過二硫鍵在絞鏈區(qū)彼此連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和 CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的FL和VH區(qū)組成的Fv 片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成或者由VH、 CH1、 CH2、 DH3，或由VH、 CH2、 CH3組成的dAb片段(Ward等(l989) iVa似re 341:544-546);以及 (vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域即VL和VH， 由不同的基因編碼，但是它們還可使用合成接頭(例如聚G4S氨基酸序 列)和重組方法進(jìn)一步彼此連接，使之可制成單個蛋白鏈，其中VL和 VH區(qū)結(jié)合以形成單價分子(稱為單鏈Fv (ScFv);參見例如Bird等(l988) Sc/e"ce 242:423-426; Huston等(1988)尸rac. A/a".爿cac/. 5W. OS^ 85:5879-5883)。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"還意欲包含這類單鏈抗體。 本發(fā)明還包括其它形式的單鏈抗體例如"雙抗體，，。雙抗體是二價雙特 異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)成單條多肽鏈，但是采用很短 以致這兩個結(jié)構(gòu)域不能夠在同一鏈上結(jié)合的接頭，從而迫使所述結(jié)構(gòu) 域與不同鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見例如 Holliger， P.等(1993)尸rac. iVa". JcW. 90:6444-6448; Poljak，
R. J.等(1994) 5Vn/c似re 2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域是指重鏈 或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列為本領(lǐng) 域所知。
與另一種或多種蛋白質(zhì)或肽通過共價連接或非共價締合所形成的較 大的免疫黏附分子(immunoadhesion molecule)的組成部分。與這類免 疫黏附分子有關(guān)的是使用鏈霉抗生素核心區(qū)以制備四聚scFv分子 (Kipriyanov, S. M.等(1995) 爿w"6od/es awt/ 坊6nV/omos
6:93-101)，以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C端多聚組氨酰基(例如 六組氨?；?、標(biāo)簽以產(chǎn)生二價生物素化scFv分子(Kipriyanov, S. M. 等(1994)Mo/. /mww"o/. 31:1047-1058)。
術(shù)語"人抗體"是指其可變區(qū)和恒定區(qū)相當(dāng)于或得自人種系的免 疫球蛋白序列的抗體，例如參見Kabat等(1991) Se《we"c^ 0/尸raW朋o//mwwwo/ogz'ca/T^ereW,第五片反,美國衛(wèi)生和福利部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH出版號91-3242。然而，本發(fā)明的人 抗體可以含有不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如 通過體外隨機(jī)誘變或位點(diǎn)特異誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變而引入 的突變)，例如在CDR中，特別是在CDR3中。本發(fā)明的重組人抗體 具有可變區(qū)，并且還可含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)(參 見Kabat， E. A.等(1991) Segwewces o/尸ra^w o/ 7m騰wo/喂'ca/ /w&rns/，第五版，美國衛(wèi)生和福利部，NIH出版號91-3242)。然而按 照具體的實(shí)施方案，對這類重組人抗體進(jìn)行了體外誘變(或進(jìn)行了體細(xì) 胞體內(nèi)誘變，條件是所使用的動物是由于人Ig序列所致轉(zhuǎn)基因)，因 此重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，雖然與人種系 的VH和VL序列相關(guān)或衍生自人種系的VH和VL，但不是在人體內(nèi) 抗體種系庫內(nèi)天然存在的序列。按照具體的實(shí)施方案，該類型的重組 抗體是選擇性誘變或回復(fù)突變或兩者的結(jié)果。優(yōu)選誘變導(dǎo)致對靶標(biāo)的 親和力更大，和/或與親代抗體相比對非靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的親和力更小。
術(shù)語"嵌合抗體"是指含有得自 一個物種的重鏈和輕鏈可變區(qū)序 列以及得自另一個物種的恒定區(qū)序列的抗體，例如具有與人恒定區(qū)連 接的鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體。
術(shù)語"CDR移植抗體"是指包含得自 一個物種的重鏈和輕鏈可變 區(qū)序列^f旦其中VH和/或VL的一個或多個CDR區(qū)的序列被另一物種 的CDR序列置換的抗體，例如具有鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗體，該 抗體中一個或多個鼠CDR(例如CDR3)被人CDR序列置換。
術(shù)語"人源化抗體"是指含有得自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、 雛雞、駱駝、綿羊或山羊)重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列，但該序列中至少 一部分的VH和/或VL序列已改變，使得更為"類似于人"的抗體，即 與人種系的可變序列更相似。人源化抗體的一個類型是CDR移植抗 體，其中人CDR序列被插入非人類VH和VL序列以置換相應(yīng)的非人 類CDR序列。
36本文中術(shù)語"Kabat編號方式"、"Kabat定義"和"Kabat標(biāo)記"互換 使用。這些本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語，是指為比抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)或其 抗原結(jié)合部分中的其它氨基酸殘基更為可變(例如超變)的氨基酸殘基 編號的系統(tǒng)(Kabat等(1971) 4w打.M^ca《190:382-391和Kabat， E. A.等(1991) Se《Me"cay 尸roZe/"5 7mmw"o/og7'ca/ /"femy" 第五版, 美國衛(wèi)生和福利部，NIH出版號91-3242)。
本文所用術(shù)語"接納體(acceptor)"和"接納體抗體(acceptor antibody)"是指提供或編碼一個或多個構(gòu)架區(qū)的至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%或100%的氨基酸序列的抗體或核酸 序列。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語"接納體"是指提供或編碼一個或多個 恒定區(qū)的抗體氨基酸序列或核酸序列。在又一個實(shí)施方案中，術(shù)語"接 納體"是指提供或編碼一個或多個構(gòu)架區(qū)和一個或多個恒定區(qū)的抗體 氨基酸序列或核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，術(shù)語"接納體"是指提 供或編碼一個或多個構(gòu)架區(qū)的至少80%、優(yōu)選至少85%、至少90%、 至少95%、至少98%或100%的氨基@吏序列的人抗體氨基酸序列或核 酸序列。按照這個實(shí)施方案，接納體可含有至少l個、至少2個、至 少3個、至少4個、至少5個或至少10個不出現(xiàn)在人抗體一個或多 個特定位置上的氨基酸殘基。接納體構(gòu)架區(qū)和/或接納體恒定區(qū)可以例 如衍生自或得自種系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體(例如本領(lǐng) 域眾所周知的抗體、開發(fā)中的抗體或市售抗體)。
本文所用術(shù)語"CDR"是指抗體可變序列內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)。在重鏈 和輕鏈的每一個可變區(qū)中有3個CDR，在每個可變區(qū)中#:標(biāo)注為 CDR1、 CDR2和CDR3。本文所用術(shù)語"CDR組(CDR set)"是指存在于 能夠結(jié)合抗原的單個可變區(qū)的為一組的3個CDR。這些CDR的確切 界限根據(jù)系統(tǒng)不同而界定不同。由Kabat描述的系統(tǒng)(Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest美國國立衛(wèi)生研究院 (National Institutes of Health), Bethesda， MD (1987)和(1991))不僅提供 適用于抗體任何可變區(qū)的明確的殘基編號系統(tǒng)，而且還提供界定3個CDR的準(zhǔn)確的殘基界線。這些CDR可稱為Kabat CDR。 Chothia及同 事(Chothia和Lesk， J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)和Chothia等， Nature 342:877-883 (1989))發(fā)現(xiàn)Kabat CDR內(nèi)的某些亞部分采用幾乎 相同的肽骨架構(gòu)象，盡管在氨基酸序列水平上有相當(dāng)大的差異。這些 亞部分被稱為LI 、 L2和L3或HI 、 H2和H3，其中"L，，和"H，，分別表 示輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)。這些區(qū)可稱為Chothia CDR，具有與Kabat CDR 重疊的界線。Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))和MacCallum (J Mol Biol 262 (5):732-45(1996))披露了界定與Kabat CDR重疊的CDR的其 它界線。另外其它的CDR界線界定可能沒有嚴(yán)格遵照上述系統(tǒng)之一， 但雖然如此卻仍與Kabat CDR重疊，盡管根據(jù)特定殘基或殘基組或甚 至整個CDR不會嚴(yán)重影響抗原結(jié)合的預(yù)測或?qū)嶒?yàn)結(jié)果可以被縮短或 延長。本文所用方法可利用根據(jù)任何這類系統(tǒng)界定的CDR，盡管優(yōu)選 的實(shí)施方案使用Kabat或Chothia定義的CDR。本文所用術(shù)語"規(guī)范"殘基是指按照Chothia等人的界定，界定特 定規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)的CDR或構(gòu)架中的殘基(Chothia等，J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia等，J. Mol. Biol. 227:799 (1992))。按照 Chothia等人，許多抗體CDR的關(guān)鍵部分具有幾乎相同的肽骨架構(gòu)象， 盡管在氨基酸序列水平上有很大的差異。各規(guī)范結(jié)構(gòu)主要確定了形成 環(huán)的氨基酸殘基鄰接區(qū)段的一組肽主鏈扭角。本文所用術(shù)語"供體(donor)"和"供體抗體(donor antibody)"是指提 供一個或多個CDR的抗體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體抗體是 來自某物種的抗體，該抗體不同于從中獲得或衍生構(gòu)架區(qū)的抗體。在 人源化抗體的情況下，術(shù)語"供體抗體"是指提供一個或多個CDR的非 人抗體。本文所用術(shù)語"構(gòu)架"或"構(gòu)架序列"是指可變區(qū)減去CDR的剩余 序列。因?yàn)镃DR序列的準(zhǔn)確界定可以用不同的系統(tǒng)確定，因此構(gòu)架 序列的含義相應(yīng)可以有不同的解釋。六個CDR (輕鏈的CDR-Ll、 CDR-L2和CDR-L3和重鏈的CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3)還將每38條鏈的輕鏈和重鏈上的構(gòu)架區(qū)分成4個亞區(qū)(FR1 、 FR2、 FR3和FR4)， 其中CDR1位于FR1和FR2之間，CDR2位于FR2和FR3之間，CDR3 位于FR3和FR4之間。當(dāng)提及構(gòu)架區(qū)時，如果未指定如FR1、 FR2、 FR3或FR4等具體亞區(qū)，則是表示單條天然存在的免疫球蛋白鏈可變 區(qū)內(nèi)組合的FR。本文所用FR表示4個亞區(qū)之一，多個FR表示構(gòu)成 構(gòu)架區(qū)的4個亞區(qū)中的兩個或更多個。人重鏈和輕鏈接納體序列為本 領(lǐng)域所知。本文所用術(shù)語"種系抗體基因"或"基因片段"是指由非淋巴細(xì)胞所 編碼的免疫球蛋白序列，所述非淋巴細(xì)胞還未經(jīng)歷導(dǎo)致特定免疫球蛋 白表達(dá)的基因重排和突變的成熟過程(參見例如Shapiro等，Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis等，Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001))。由本發(fā)明不同實(shí)施方案提供的優(yōu)勢之一出于這樣發(fā) 現(xiàn)，即種系抗體基因比成熟抗體基因更可能保存物種中個體的本質(zhì)氨 基酸序列結(jié)構(gòu)特征，因此當(dāng)在該物種中使用時被視為非自身的可能性 更低。本文所用術(shù)語"關(guān)鍵"殘基是指對抗體、特別是人源化抗體的結(jié)合 特異性和/或親和力具有較大影響的可變區(qū)內(nèi)的某些殘基。關(guān)鍵殘基包 括但不限于一個或多個以下的殘基鄰接CDR的殘基、潛在的糖基 化位點(diǎn)(可為N-糖基化位點(diǎn)或O-糖基化位點(diǎn))、稀有殘基、能夠與抗原 相互作用的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、規(guī)范殘基、重鏈可 變區(qū)與輕鏈可變區(qū)之間的接觸殘基、Vernier區(qū)內(nèi)的殘基和在Chothia 定義的可變重鏈CDR1與Kabat定義的第一重《連構(gòu)架之間重疊的區(qū)域 中的殘基。本文所用術(shù)語"人源化抗體"具體地講是指免疫專一性結(jié)合目標(biāo) 抗原并包含基本為人抗體氨基酸序列的構(gòu)架(FR)區(qū)和基本為非人抗體 氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的抗體或其變體、衍生物、類似物或 片段。在CDR的情況下，本文所用術(shù)語"基本上"是指CDR的氨基酸 序列與非人抗體CDR氨基酸序列有至少80%、優(yōu)選至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。人源化抗體基本上包 含所有的至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域(Fab、 Fab'、 F(ab')2、 FabC、 Fv)，其中所有或基本上所有CDR區(qū)相當(dāng)于非人類免疫球蛋白(即供體 抗體)的CDR區(qū)，所有或基本上所有構(gòu)架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列 的構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選人源化抗體還包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū) (Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人源化抗 體含有輕鏈和至少重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。該抗體還可包括重鏈的CH1 區(qū)、絞鏈區(qū)、CH2區(qū)、CH3區(qū)和CH4區(qū)。在一些實(shí)施方案中，人源 化抗體只含有人源化輕鏈。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體只含有人 源化重鏈。在具體實(shí)施方案中，人源化抗體只含有人源化輕鏈可變結(jié) 構(gòu)域和/或人源化重鏈。人源化抗體可以選自任何類別的免疫球蛋白， 包括IgM、 IgG、 IgD、 IgA和IgE，以及任何亞類，包括但不限于IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。人源化抗體的構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)不需要與親代序 列的完全一致，例如，供體抗體CDR或共有構(gòu)架可通過取代、插入 和/或缺失至少一個氨基酸殘基來誘變，使得在該位點(diǎn)的CDR或構(gòu)架 殘基不與供體抗體或共有構(gòu)架完全一致。然而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方 案中，這類突變并不廣泛。通常至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至 少90%、最優(yōu)選至少95Q/。的人源化抗體殘基可與親代FR和CDR序列 的相一致。本文所用術(shù)語"共有構(gòu)架("consensus framework)"是指共有 免疫球蛋白序列中的構(gòu)架區(qū)。本文所用術(shù)語"共有免疫球蛋白序列 (consensus immunoglobulin sequence)"是指在才目關(guān)免疫J求蛋白序歹寸家 族中，由出現(xiàn)最頻繁的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(參見例如 Winnaker, Winnaker， From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各個 位置由該家族中在該位置上出現(xiàn)最頻繁的氨基酸占據(jù)。如果兩個氨基 酸出現(xiàn)頻率相等，則任一個都包括在共有序列中。本文所用"Vernier"區(qū)是指調(diào)整CDR結(jié)構(gòu)并微調(diào)以配合抗原的一 小組構(gòu)架區(qū)殘基，參見Foote和Winter (1992， J. Mol. Biol.224:487-499)。 Vernier區(qū)殘基形成位于CDR之下的層，可對CDR的 結(jié)構(gòu)和抗體的親和力產(chǎn)生影響。術(shù)語"表位"包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白的任何多肽決定簇 (polypeptide determinants在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括化學(xué)活 性表面成群的分子，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；⑶以?某些實(shí)施方案中，可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。 表位是抗體結(jié)合抗原的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，在蛋白質(zhì)和/或大分 子的復(fù)雜混合物中，當(dāng)抗體優(yōu)先識別其靶抗原時，則該抗體被稱為與 抗原特異性結(jié)合。本文所提及的術(shù)語"多核苷酸"是指兩個或更多個核苷酸的聚合 形式，核苷酸或?yàn)楹颂呛塑账幔驗(yàn)槊撗鹾塑账?，或?yàn)槿我环N核苷酸 類型的修飾形式。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA,但優(yōu)選為雙鏈 DNA。本文所用術(shù)語"分離多核苷酸"可指多核苷酸(例如基因組、cDNA 或合成源(syntheticorigin)或其任何組合的多核苷酸)，由于其來源，"分 離多核苷酸"不與隨"分離多核苷酸"一起在天然中存在的多核苷酸的 所有或部分締合；可與在天然情況下不連接的多核苷酸有效連接；或者在天然情況下不作為較大序列的組成部分存在。本文所用術(shù)語"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸 分子。 一種載體類型為"質(zhì)粒"，它是指其中可以連接另外DNA區(qū)段 的環(huán)狀雙鏈DNA。另一種載體類型是病毒載體，其中另外的DNA區(qū) 段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞 中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載 體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時可以整 合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些 載體能夠指導(dǎo)與之有效連接的基因表達(dá)。這類載體在本文稱為"重組表 達(dá)載體"(或簡單稱為"表達(dá)載體，，)。 一般而言，表達(dá)載體通常以質(zhì)粒形 式應(yīng)用于重組DNA技術(shù)中。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使載體形式。然而，本發(fā)明還包括其它形式的 發(fā)揮相同功能作用的表達(dá)栽體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄 病毒、腺病毒和腺伴隨病毒載體)。術(shù)語"有效連接"是指并列(juxtaposition),其中各組分處于允許它 們按其既定方式發(fā)揮功能的關(guān)系。與編碼序列"有效連接"的調(diào)控序列 以這樣方式連接，致使在與調(diào)控序列相適合的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的 表達(dá)。"有效連接"的序列包括與目標(biāo)序列鄰接的表達(dá)調(diào)控序列和起反 式作用或在遠(yuǎn)距離調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控序列。本文所用術(shù)語"表達(dá) 調(diào)控序列"是指實(shí)現(xiàn)其所連接的編碼序列的表達(dá)和加工所必需的多核 苦酸序列。表達(dá)調(diào)控序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動 子序列和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和聚腺苷酸 化信號；使胞質(zhì)mRNA穩(wěn)定的序歹ll;提高翻譯效率的序列(例如Kozak 共有序列)；提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；當(dāng)需要時增加蛋白質(zhì)分泌的序 列。這類調(diào)控序列的性質(zhì)隨宿主生物的不同而不同；在原核生物中， 這類調(diào)控序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合4立點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在 真核生物中，這類調(diào)控序列一般包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"調(diào) 控序列，，包括其存在對于表達(dá)和加工是必需的組分，并且還可包括其存 在是有利的其它組分，例如前導(dǎo)序列和融合陪伴序列(ftision partner sequence) o,本文定義的"轉(zhuǎn)化"是指使外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何方法。 可在天然或人工條件下，采用本領(lǐng)域眾所周少、口的各種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化可借助將外源核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞中的任何已知 方法。轉(zhuǎn)化方法一艮據(jù)待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來選擇，可包括但不限于病毒感 染、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染和粒子攻擊。這類"轉(zhuǎn)化的"細(xì)胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞，其中插入的DNA能夠作為自主復(fù)制質(zhì)粒或作為宿主染色體的 組成部分進(jìn)行復(fù)制。它們還包括在有限時間內(nèi)瞬時表達(dá)插入DNA或 RNA的細(xì)月包。本文所用術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡稱"宿主細(xì)胞")是指被導(dǎo)入外42源DNA的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)了解的是，這類術(shù)語不僅是指具體的受治療者 的細(xì)胞，而且還指這類細(xì)胞的子代。因?yàn)橛赏蛔兓颦h(huán)境影響所致可能 在隨后的子代中出現(xiàn)某些修飾，因此實(shí)際上這類子代可能與親本細(xì)胞 不同，但是仍包括在本文所用術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。優(yōu)選宿主細(xì) 胞包括選自任一生物界的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。優(yōu)選的真核細(xì)胞包括 原生生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞。最優(yōu)選宿主細(xì)胞包 括但不限于原核細(xì)胞系大腸桿菌；哺乳動物細(xì)胞系CHO、 HEK 293 和COS;昆蟲細(xì)胞系Sf9和真菌細(xì)胞釀酒酵母。
標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可應(yīng)用重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化(例 如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染)中?？砂凑丈a(chǎn)商的說明書或者按照本領(lǐng)域普遍通 用的方法實(shí)施酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。 一般可按照本領(lǐng)域眾所周知的常 規(guī)方法，并且按照所引用的各種普通參考文獻(xiàn)和較為專業(yè)的參考文獻(xiàn) 以及本說明書所論述的方法實(shí)施現(xiàn)有技術(shù)和方法。參見例如Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))。
本文已知和本文所用的"轉(zhuǎn)基因生物"是指具有含有轉(zhuǎn)基因的細(xì) 胞的生物，其中導(dǎo)入生物(或生物的前身(ancestor))的轉(zhuǎn)基因表達(dá)該生 物不會天然表達(dá)的多肽。"轉(zhuǎn)基因"是一種DNA構(gòu)建體，它穩(wěn)定和有 效地整合到細(xì)胞基因組，由此發(fā)育出轉(zhuǎn)基因生物，指導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因生物 的 一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)所編碼的基因產(chǎn)物。
制備本發(fā)明抗體的方法見下文。體內(nèi)方法、體外方法或兩者的組 合之間的區(qū)別也見下文。
體內(nèi)方法
根據(jù)所需的抗體類型，可使用不同的宿主動物進(jìn)行體內(nèi)免疫?？?以使用自身表達(dá)內(nèi)源形式的目標(biāo)抗原的宿主。或者，可使用使內(nèi)源形 式的目標(biāo)抗原缺失的宿主。例如，研究顯示，通過在相應(yīng)的內(nèi)源基因 中進(jìn)行同源重組而使某些特定內(nèi)源蛋白缺失的小鼠(例如敲除小鼠)對用來免疫接種小鼠的蛋白質(zhì)產(chǎn)生體液應(yīng)答，從而能夠用來產(chǎn)生抗該蛋
白質(zhì)的高親和力的單克隆抗體(參見例如Roes， J.等(1995)/ /mmimo/. M"Aods 183:231-237; Lunn， M. P.等(2000)/, A^wrac/ em, 75:404-412)。
多種非人類的哺乳動物是產(chǎn)生抗體的合適宿主，以便產(chǎn)生本發(fā)明 的非人抗體。它們包括例如小鼠、大鼠、雛雞、駱駝、兔、綿羊和山 羊(及其敲除形式)，盡管優(yōu)先選擇小鼠以產(chǎn)生雜交瘤。此外，可使用 表達(dá)人抗體庫的非人類宿主動物以產(chǎn)生基本上是針對人抗原的人抗 體，該抗體具有雙重特異性。這種非人類動物包括攜帶人免疫球蛋白 轉(zhuǎn)基因(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)和人/小鼠輻照嵌合體(irradiation chimera)的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，下面將有更詳細(xì)的描述。
按照一個實(shí)施方案，被免疫的動物為非人類哺乳動物，優(yōu)選小鼠， 其為通itA免疫球蛋白基因所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠，因而所述非人類哺 乳動物在抗原刺激時產(chǎn)生人抗體。通常將具有人種系構(gòu)型的免疫球蛋 白重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)基因?qū)氚l(fā)生了改變使得它們的內(nèi)源重鏈和輕鏈 基因座失活的這類動物中。如果這類動物用抗原(例如人抗原)刺激， 便產(chǎn)生來源于人免疫球蛋白序列的抗體(人抗體)?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)化雜交 瘤技術(shù)，由這類動物的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生人單克隆抗體。有關(guān)具有人免疫 球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠及其在制備人抗體中的應(yīng)用的更多描述，可參見 例如美國專利號5，939，598、 WO 96/33735、 WO 96/34096、 WO 98/24893 和WO 99/53049 (Abgenix Inc.)和美國專利號5,545,806、美國專利號 5,569,825、美國專利號5,625,126、美國專利號5,633,425、美國專利 號5,661,016、美國專利號5,770,429、美國專利號5,814,318、美國專 利號5,877,397和WO 99/45962 (Ge叩harm Inc.);另可參見MacQuitty, J丄和Kay， R. M. (1992) &&"ce 257:1188; Taylor, L. D.等(1992) M/c/e/c 爿"A 20:6287-6295; Lonberg, N.等(1994) iV^"^ 368:856-859; Lonberg，N.和Huszar, D. (1995) M Aev. /mmi/wo/. 13:65-93; Harding, F. A.和Lonberg, N. (1995) Aw". K764:536-546; Fishwild, D. M.等(1996) M^w"說o&c/mo/ogy 14:845-851; Mendez, M. J.等(1997)A/a&re Gewe"cs 15:146-156; Green, L. L.牙口 Jakobovits, A. (1998);乂五xp.
188:483-495; Green, L. L. (1999) / /wmw"o/. MeAoA 231:11-23; Yang, X. D.等(1999) 丄e^oc所o/. 66:401-410; Gallo, M. L.等(2000) / /mmimo/. 30:534-540。
按照另一個實(shí)施方案，被免疫的動物可為患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID)的小鼠，該小鼠用人外周單核血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或其祖細(xì)胞重 建。已經(jīng)證實(shí)這類被稱為嵌合hu-PBMCSCID小鼠的小鼠在響應(yīng)抗原 刺激時產(chǎn)生人免疫球蛋白。有關(guān)這些小鼠及其產(chǎn)生抗體的應(yīng)用的更多 描述，可參見例如Leader, K. A.等(1992) /mm簡o/ogy 76:229-234; Bombil， F.等(1996)/mmw"o&o/. 195:360-375; Murphy， W丄等(1996) iSe/w'". /wmtmo/. 8:233-241; Herz， U.等(1997)/"A J/r/ .爿〃ergy 7mwnmo/. 113:150-152; Albert, S. E.等(1997)丄/wmwwo/. 159:1393-1403; Nguyen, H.等(1997) Mzcro&o/. /附wwzo/. 41:901-907; Arai, K.等(1998) /^wwwo/. Af"/zoA 217:79-85; Yoshinari，K.和Ami, K. (1998) Z/j^nWoma 17:41-45; Hutchins, W. A.等(1999)/^6nV/owa 18:121-129; Murphy, W丄 等(1999) C"w. /畫,/. 90:22-27; Smithson， S. L.等(1999) Mo/. /wwwwo/. 36:113-124 ; Chamat, S.等(1999) /w/e". Ifeeas&y 180:268-277;以及Heard, C.等(1999) Mo/ec. 5:35-45。
按照另 一個實(shí)施方案，被免疫的動物是用致死劑量的全身輻照處 理，然后用患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠骨髓細(xì)胞保護(hù)以抵抗 輻照，接著移植了人功能性淋巴細(xì)胞的小鼠。可使用此類型的嵌合體 (稱為Trimem系統(tǒng))以產(chǎn)生人單克隆抗體，即通過用目標(biāo)抗原使所述小 鼠免疫，然后通過標(biāo)準(zhǔn)化雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體。有關(guān)這些小鼠 及其產(chǎn)生抗體的應(yīng)用的更多描述，可參見例如Eren, R.等(1998) /mmimo/ogK 93:154-161; Reisner， Y和Dagan， S. (1998) 7Ve"心 '說otec/mo/. 16:242-246; Ilan， E.等(1999)//印ato/ogy 29:553-562;以及 Bocher， W.O.等(1999)/mm柳o/ogy 96:634-641。
可通過標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)，例如最初由Kohler和Milstein披露的雜交瘤
45技術(shù)(1975, A/a/w" 256:495-497)，從體內(nèi)產(chǎn)生的抗體生成細(xì)胞開始， 以產(chǎn)生單克隆抗體(另見Brown等(1981) / /Awm/"o/127:539-46; Brown 等(1980)J歷o/CAew 255:4980-83; Yeh等(1976) iWJS76:2927-31;以 及Yeh等(1982)/W./ Owcw29:269-75)。制備單克隆抗體雜交瘤的技 術(shù)是眾所周知的(一4殳參見R. H爭Kenneth, A/o"oc/o""/」"^ ocfes: ^ 7Vevv Z)/weww'o/2 /" 5z.o/og7'ca/ Jwa/7jes, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) / Mo/.， 54:387-402; M. L. Gefter等(1977) 5bm加'c Ce〃 Ge"",， 3:231-36)。簡 單地講，無限增殖化細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與用本發(fā)明的Ap球聚體或
外周血淋巴細(xì)胞)融合，對所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行篩選， 以鑒定出產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。任何用于淋巴細(xì)胞和無 限增殖化細(xì)胞系融合的多種眾所周知的方案都可用于此目的(另見G. Galfre等(1977)A^wre 266:550-52; Gefter等，5"ow加'c Ce〃 ,引 用處同上；Lerner， 7a/e丄5Zo/. Afct/.,引用處同上；Kenneth, 7V/o"oc/o"a/ 爿"Wo^M,引用處同上)。另外，技術(shù)人員要了解的是，這類方法有 各種同樣有益的變化。通常無限增殖化細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)與 淋巴細(xì)胞來源于相同的哺乳動物物種。例如，可以通過使得自用本發(fā) 明免疫原性制備物免疫的小鼠淋巴細(xì)胞與無限增殖化小鼠細(xì)胞系融 合來建立鼠雜交瘤。優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是對含有次黃嘌呤、氨 基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。在沒 有融合配偶體時，多個骨髓瘤細(xì)胞系的任一種可用作融合配偶體，例 如P3-NSl/l-Ag4-l， P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。這些 骨髓瘤細(xì)胞系可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), Manassas, Virginia。通常使用聚乙二醇(PEG)，使HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與 小鼠脾細(xì)胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基，選出融合所得的雜交瘤細(xì) 胞，從而殺死未融合和無產(chǎn)物產(chǎn)出的融合骨髓瘤細(xì)胞(幾天后，未融合 的脾細(xì)胞因?yàn)闆]有轉(zhuǎn)化而死亡)。通過根據(jù)這類抗體對雜交瘤培養(yǎng)物上清液進(jìn)行篩選，鑒定出產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，例如采 用斑點(diǎn)印跡測定法以選出具有如上定義的結(jié)合親和力的抗體。單克隆
抗體10F4和3C5均采用上述體內(nèi)方法產(chǎn)生，這類抗體獲自如本文定 義的雜交瘤。
同樣，所述雜交瘤可用作編碼輕鏈和/或重鏈核酸的來源，以便重 組產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，更多詳情見下文。
體外方法
作為通過免疫和篩選以產(chǎn)生本發(fā)明抗體的替代方法，可通過篩選 重組組合的免疫球蛋白文庫來鑒定和分離本發(fā)明的抗體，從而分離出 具有所需結(jié)合親和力的免疫球蛋白文庫成員。用于產(chǎn)生和篩選展示文 庫的試劑盒是市售的(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號 27-9400-01;以及Stratagene SurfZAP⑧噬菌體展示試劑盒，目錄號 240612)。在許多實(shí)施方案中，展示文庫是scFv文庫或Fab文庫。已 大量記載用于篩了選重組抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)。對于產(chǎn)生和篩 選抗體展示文庫，使用起來特別有利的方法和化合物的實(shí)例可參見例 如McCafferty等，WO 92/01047、 US 5,969,108和EP 589 877 (具體描 述了 scFv展示);Ladner等,美國專利號5,223,409、美國專利號 5,403,484、美國專利號5,571,698、美國專利號5,837,500和EP 436 597 (例如描述了 pill融合物，);Dower等WO 91/17271、美國專利號 5,427,908、美國專利號5,580,717和EP 527 839 (具體描述了 Fab展示)； Winter等，國際公布號WO 92/20791和EP 368,684 (具體描述了用于 可變免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域序列的克隆)；Griffiths等，美國專利號 5,885,793和EP 589 877 (具體描述了使用重組文庫分離人抗體與人抗 原)；Garrard等，WO 92/09690 (具體描述了噬菌體表達(dá)技術(shù))；Knappik 等，WO 97/08320 (描述了人重組抗體文庫HuCal); Salfeld等，WO 97/29131 (描述了抗人抗原的重組人抗體的產(chǎn)生(人腫瘤壞死因子a)及 重組抗體的體外親和力成熟)以及Salfeld等，美國臨時專利申請?zhí)?0/126，603和在此基礎(chǔ)上的專利申請(同樣描述了針對人抗原(人白介素-12)的重組人抗體的產(chǎn)生及重組抗體的體外親和力成熟)。
有關(guān)重組抗體文庫篩選的進(jìn)一 步描述可參見學(xué)術(shù)出版物，例如Fuchs等(1991)所o/rec/mo/ogy 9:1370匿1372; Hay等(1992) //ww ^w幼o(hù)c///;^^omfiw 3:81醫(yī)85; Huse等(1989) S"e"ce 246:1275-1281; Griffiths等(1993)五M50 / 12:725-734 ; Hawkins等(1992) / Mo/說o/226:889-896; Clarkson等(1991) A/a/we 352:624-628; Gram等(1992)/WAS 89:3576-3580; Garrard等(1991)祝o/Tec/mo/ogy 9:1373-1377;Hoogenboom等(1991) 7Vmc A&s 19:4133-4137; Barbas等(1991)/WylS 88:7978-7982; McCafferty等iVa,we (1990) 348:552-554;以及Knappik等(2000) Mo/. Ao/. 296:57-86。
作為使用噬菌體展示系統(tǒng)的替代方法，重組抗體文庫可在酵母細(xì)胞表面或細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)。WO 99/36569披露了在酵母細(xì)胞表面表達(dá)的文庫的制備和篩選方法。WO 98/49286更詳盡地描述了在細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)的文庫的制備和篩選方法。在所有體外方法中，富含具有所需性質(zhì)的重組抗體的篩選方法構(gòu)成本發(fā)明方法的完整部分，該方法一般被稱為"淘選"，并且通常采取親和柱層析的形式，靶標(biāo)結(jié)構(gòu)連接在該柱的基質(zhì)上。然后優(yōu)選通過標(biāo)準(zhǔn)化斑點(diǎn)印跡測定法，對有希望的候選分子進(jìn)行個別鑒定，以確定其絕對親和力和/或相對親和力。
一旦對組合文庫的目標(biāo)抗體進(jìn)行了鑒定和充分地表征，便可通過標(biāo)準(zhǔn)化分子生物學(xué)技術(shù)分離出編碼所述抗體輕鏈和重鏈的DNA序列，例如通過對在文庫篩選期間分離出的展示包(display package)(例如噬菌體)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解可用來制備PCR引物的抗體輕鏈和重鏈基因的核苷酸序列。多種這類的序列可參見如H口Kabat， E. A.等(1991) Se《wewces o/ /Vo&//is o/ /附/m/wo/og/ca//"tems,，第五版，美國衛(wèi)生和福利部，NIH出版號91-3242和人種系VBASE序列數(shù)據(jù)庫。
可通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和重鏈的基因，來
48體，用一個或多個重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述載體攜帶編碼所述抗體的免疫球蛋白
輕鏈和重鏈的DNA片段，從而在宿主細(xì)胞中表達(dá)輕鏈和重鏈，并優(yōu)選它們被分泌到培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)?？蓮脑撆囵B(yǎng)基中分離出抗體。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化重組DNA方法以獲得抗體重鏈和輕鏈的基因，將所述基因插入重組表達(dá)載體中，將所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這類方法可參見例如Sambrook、Fritsch和Maniatis (主編)，A/o/ecw/ar C7om,wgv爿丄aZ orato/j Ma肌a/,第二版，Cold Spring Harbor, N. Y., (1989),Ausubel, F. M.等(主編)CM/Tewf尸ratoco/s Mo/ecw/ar 5!'o/ogy， GreenePublishing Associates, (1989)和Boss等，US 4，816，397。
一旦獲得編碼目標(biāo)抗體VH和VL區(qū)段的DNA片段，便可應(yīng)用例如標(biāo)準(zhǔn)化重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操縱所述DNA片段，以使可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。這些操縱包括將編碼VL的DNA片段或編碼VH的DNA片段與編碼另 一蛋白質(zhì)的另一DNA片段有效連接，例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭。術(shù)語"有效連接，，在本文的含義應(yīng)理解為2個DNA片段以這樣的方式連接，即由所述2個DNA片段編碼的氨基酸序列保留在讀框內(nèi)?？赏ㄟ^將編碼VH區(qū)的DNA與另一個編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、 CH2和CH3)的DNA分子有效連接，將編碼VH區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈的基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是眾所周知的(參見例如Kabat， E. A.等(1991)5"e《wewces o/ZVo/e/ws o//m wwo/og7'ca//"/emst 第五片反,美國衛(wèi)生和福利部，NIH出版號91-3242),可通過標(biāo)準(zhǔn)化PCR擴(kuò)增獲得淘選所述區(qū)的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是得自IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、IgM、 IgA、 IgE或IgD的恒定區(qū)，優(yōu)先選擇得自IgG的恒定區(qū)，特別是得自IgGl或lgG4的恒定區(qū)。為了獲得重鏈Fab片段的基因，可將編碼VH的DNA與僅編碼重鏈恒定區(qū)CHI的另一個DNA分子有效連接?？赏ㄟ^將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另 一個DNA分子有效連接，將編碼VL區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)化成全長輕鏈的基因(和Fab輕鏈的基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是眾所周知的(參見Kabat,E. A.等(1991) Se《we/ ces o/TVotoTw o/7mwMwo/og7'cfl//",ems/， 第五版,美國衛(wèi)生和福利部，NIH出版號91-3242)，可通過標(biāo)準(zhǔn)化PCR擴(kuò)增獲得DNA片4史淘選所述區(qū)(DNA fragment spanning said region)。輕鏈恒
定區(qū)可以是K區(qū)或X區(qū)，優(yōu)選為K恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，可將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭(例如氨基酉餅列(Gly4-Ser)3)的另 一片段有效連接，以使VH和VL序列表達(dá)成連續(xù)的單鏈蛋白，其中通過所述柔性接頭VL和VH區(qū)彼此連接在一起(參見Bird等(198S) 5We"ce 242:423-426; Huston等(1988)尸rac. A/a".爿cm/. 85:5879-5883; McCafferty等，TVa似w
(1990) 348:552-554)。
可通過上述方法，將如上所述的具有結(jié)合親和力的單結(jié)構(gòu)域VH和VL從單結(jié)構(gòu)域文庫中分離出來。具有所需結(jié)合親和力的二 VH單結(jié)構(gòu)域鏈(含或不含CH1)或二 VL鏈或一 VH鏈和一 VL鏈的一對，可按照本文所述用作本發(fā)明的抗體。
為了表達(dá)本發(fā)明的重組抗體或抗體部分，可將編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體，以便使基因與合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列有效連接。在這種情況下，術(shù)語"有效連接"應(yīng)理解為是指抗體基因在載體中以這樣的方式連接，以便使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列實(shí)現(xiàn)既定的調(diào)節(jié)所述抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。適當(dāng)選擇表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列，以便與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相適合。可將抗體輕鏈的基因和抗體重鏈的基因插入單獨(dú)的載體中，或者將兩種基因插入同一表達(dá)載體，這是常用的情況。通過標(biāo)準(zhǔn)化方法，將抗體基因插入表達(dá)載體(例如通過將抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制切割位點(diǎn)連接，或者如果不存在限制切割位點(diǎn)，則通過平端連接)。在插入輕鏈和重鏈序列之前，表達(dá)載體可能已攜帶了抗體恒定區(qū)的序列。例如，一種方法是，通過將VH和VL序列插入已具有分別編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使VH和VL序列轉(zhuǎn)化為全長抗體基因，從而
50使載體內(nèi)的VH區(qū)段與一個或多個CH區(qū)段有效連接，同時使載體內(nèi)的VL區(qū)段與CL區(qū)段有效連接。
又或者，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？蓪⑺隹贵w鏈的基因克隆至載體，從而使信號肽在讀框中與抗體鏈基因的N端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(例如來自非免疫球蛋白的信號肽)。除抗體鏈基因以外，本發(fā)明的表達(dá)載體可具有控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"是指包括啟動子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達(dá)調(diào)節(jié)元件(例如聚腺苷酸化信號)。這種調(diào)節(jié)序列可參見例J(口 Goeddel; 五xpr&s57'ow rec/mo/ogy.' Zw
五"27mo/ogy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)。 4支術(shù)人員要了解的是，包括選擇調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于例如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白質(zhì)表達(dá)的強(qiáng)度等因素。用于在哺乳動物宿主
蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如來源于以下病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)、猿病毒40 (SV40)(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步描述可參見例如Stinski的美國專利號5，168，062、 BeU等人的美國專利號4，510，245和Schaffher等人的美國專利號4,968,615。
除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可具有其它序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因有利于選出已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(參見例如Axel等人的美國專利號4,399,216、 4,634,665和5,179,017)。例如，常用的選擇標(biāo)記基因?yàn)橐巡迦胼d體的宿主細(xì)胞提供細(xì)胞毒藥物(例如G418、潮霉素或曱氨蝶呤)抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因(用于用曱氨蝶呤篩選/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418篩選)。對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，可通過標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)，使編碼所述重鏈和 輕鏈的一個或多個表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式
包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，例如 電穿孔、磷酸鉤沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管理論上可以在原核 或真核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的抗體，但優(yōu)選在真核細(xì)胞內(nèi)、特別是 在哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗體，因?yàn)樵谶@類真核細(xì)胞內(nèi)，特別是哺 乳動物細(xì)胞內(nèi)，正確折疊及裝配和分泌具有免疫活性抗體的概率都比 原核細(xì)胞的高。據(jù)報道，對于高產(chǎn)量活性抗體的生產(chǎn)，抗體基因的原 核表達(dá)是無效的(Boss, M. A.和Wood， CR. (1985) //wm/"o/ogy 7bc/a;; 6:12-13)。
用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細(xì)胞包括CHO 細(xì)胞(包括dhff CHO細(xì)胞，參見Urlaub和Cheasin， (1980)尸rac. A^//. 」cat/.5W. 77:4216-4220，該細(xì)胞與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，參 見例如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mo/.說o/. 159:601-621)、NS0 骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載 體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞時，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞直到在所述宿主細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)抗體，或者優(yōu)選抗體被分泌到宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基內(nèi)，來產(chǎn) 生抗體。然后可通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)純化方法，從培養(yǎng)基中分離出 抗體。同樣可使用宿主細(xì)胞以產(chǎn)生完整抗體的部分，例如Fab片段或 scFv分子。本發(fā)明當(dāng)然也包括上述方法的變通方法。例如，可能需要 用編碼本發(fā)明抗體輕鏈或重鏈中的任一個(但非兩者)的DNA轉(zhuǎn)染宿 主細(xì)胞。如果存在不需要用于結(jié)合目標(biāo)抗原的輕鏈，或者存在不需要 用于結(jié)合靶抗原的重鏈，則可以通過重組DNA技術(shù)，部分或完全除 去編碼該條輕鏈或該條重《連或者兩條鏈的DNA。由如此截短的DNA 分子表達(dá)的分子同樣也包括在本發(fā)明的抗體中。另外，可以通過標(biāo)準(zhǔn) 化化學(xué)方法，通過將本發(fā)明抗體與第二抗體交聯(lián)來產(chǎn)生雙功能抗體， 其中 一條重鏈和一條輕鏈為本發(fā)明的抗體，另 一重鏈和另 一輕鏈則對 不同于目標(biāo)抗原的抗原具有特異性。在用于重組表達(dá)本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的一個優(yōu)選系統(tǒng) 中，通過磷酸鉤介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，將同時編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組
表達(dá)載體導(dǎo)入dhff CHO細(xì)胞。在重組表達(dá)載體內(nèi)，抗體重鏈和輕鏈 的基因在所有情況下都與調(diào)節(jié)CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動子元件有效 連接，以便實(shí)現(xiàn)所述基因的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體還攜帶DHFR基因， 它可以用來通過應(yīng)用曱氨蝶呤篩選/擴(kuò)增，選出轉(zhuǎn)染有載體的dhfr-CHO細(xì)胞。對所選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使抗體重鏈和輕鏈得 以表達(dá)，并從培養(yǎng)基中分離出完整抗體。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化分子生物學(xué)技術(shù) 來制備重組表達(dá)載體，以轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)所述宿主 細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中獲得抗體。因此，本發(fā)明涉及合成本發(fā)明重組抗 體的方法，該方法通過將本發(fā)明的宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)直 到合成出本發(fā)明的重組抗體。該方法還包括從所述培養(yǎng)基中分離出所 述重組抗體。
作為通過噬菌體展示篩選重組抗體文庫的替代方法，可以采用本 領(lǐng)域技術(shù)工作人員已知的其它方法篩選大型組合文庫以鑒定出本發(fā) 明的抗體?；旧峡梢圆捎萌魏芜@樣的表達(dá)系統(tǒng)，即其中核酸與由其 編碼的抗體之間建立了緊密的物理連接，而且可通過它編碼的抗體性 質(zhì)，來篩選合適的核酸序列。在一類替代表達(dá)系統(tǒng)中，重組抗體文庫 以RNA-蛋白融合物的形式表達(dá)，參見Szostak和Roberts的WO 98/31700,以及Roberts, R. W.和Szostak, J. W. (1997)尸rac. A/fl".爿cat/.
[75^ 94:12297-12302。在該系統(tǒng)中，3'端攜帶噪羅霉素(一種肽基接 納體抗生素)的合成mRNA在體外翻譯后，產(chǎn)生了 mRNA與由之編碼 的肽或蛋白質(zhì)的共價融合物。因此，多種mRNA(例如組合文庫)復(fù)雜 混合物中的特定mRNA可根據(jù)所編碼的肽或蛋白質(zhì)(例如抗體或其部 分的肽或蛋白質(zhì))的性質(zhì)(例如所述抗體或其所述部分與A(3( 12-42)球 聚體或其衍生物的結(jié)合)而得以集中。編碼抗體或其部分的核酸序列以 及通過篩選所述文庫獲得的核酸序列，可按上述方式(例如在哺乳動物 宿主細(xì)胞內(nèi))通過重組方式進(jìn)行表達(dá)，或者另外可通過對mRNA-肽融合物進(jìn)行更多輪的篩選，將突變引入最初選出的序列，或者按上述方 式采用重組抗體的體外親和力成熟的其它方法，對其進(jìn)行進(jìn)一步的親 和力成熟。
體內(nèi)方法和體外方法的組合
這樣的方法，其中先使Ap(12-42)球聚體或其衍生物在宿主動物體內(nèi) 作用于抗體庫以刺激Ap(12-42)球聚體或衍生物-結(jié)合抗體的產(chǎn)生，然 后借助一種或多種體外技術(shù)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的抗體篩選和/或抗體成熟(即 最優(yōu)化)。按照一個實(shí)施方案，這類聯(lián)合方法可包括首先用所述 A卩(12-42)球聚體或其衍生物使非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、雛 雞、駱駝、綿羊或山羊或其轉(zhuǎn)基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激響應(yīng)抗 原的抗體，然后通過使用因所述Ap(12-42)球聚體或衍生物的作用而 在體內(nèi)受刺激的淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白序列，制備和篩選噬菌體展示 抗體文庫。該聯(lián)合方法的第一步可按上述方式結(jié)合體內(nèi)方法進(jìn)行，而 該方法的第二步可按上述方式結(jié)合體外方法進(jìn)行。使非人類動物超免 疫隨后體外篩選由所述受刺激淋巴細(xì)胞制備的噬菌體展示文庫的優(yōu) 選方法包括BioSite Inc.披露的方法，參見例如WO 98/47343、 WO 91/17271、 US 5,427,908和美國專利號5,580,717。
按照另一個實(shí)施方案，聯(lián)合方法包括首先用本發(fā)明的A|3(12-42) 球聚體或其衍生物使非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、雛雞、駱駝、 綿羊、山羊或敲除和/或其轉(zhuǎn)基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激響應(yīng)所 述A(3(12-42)球聚體或其衍生物的抗體，通過篩選雜交瘤(例如由免疫 動物制備)選出產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的淋巴細(xì)胞。由選出的克隆 分離出來的抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體的基因(通過標(biāo)準(zhǔn)化克隆方法，例如逆 轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，并進(jìn)行體外親和力成熟，從而改進(jìn)一個或 多個選出抗體的結(jié)合性質(zhì)。該方法的第 一步可按上式方式結(jié)合體內(nèi)方 法進(jìn)行，而該方法第二步可按上述方式結(jié)合體外方法，特別是通過用體外親和力成熟方法進(jìn)行，例如參見WO 97/29131和WO 00/56772。 在又一個聯(lián)合方法中，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的作為篩選 淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM)的方法，由各個分離的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生重組抗 體，可參見US 5,627,052、 WO 92/02551和Babcock， J. S.等(1996)尸rac. Mz" v4cad. 93:7843-7848。在該方法中，首先用A(3(12-42)球
聚體或其衍生物在體內(nèi)使非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、雛雞、駱 駝、綿羊、山羊或其轉(zhuǎn)基因形式或嵌合小鼠)免疫以刺激針對所述寡聚 體或衍生物的免疫應(yīng)答，然后通過用抗原特異性溶血斑測定法選出分 泌目標(biāo)抗體的各個細(xì)胞。為此，可使用接頭(例如生物素)使球聚體或
其衍生物或結(jié)構(gòu)相關(guān)的目標(biāo)分子與綿羊紅細(xì)胞偶聯(lián)，從而可通過采用
溶血斑測定法，鑒定具有適當(dāng)特異性的分泌抗體的各個細(xì)胞。在鑒定
出分泌目標(biāo)抗體的細(xì)胞后，通過反轉(zhuǎn)錄酶PCR從細(xì)胞中獲得輕鏈和重
鏈可變區(qū)的cDNA，然后，可使所述可變區(qū)可與合適的免疫球蛋白恒
定區(qū)(例如人恒定區(qū))聯(lián)合在哺乳動物宿主細(xì)胞(例如COS或CHO細(xì)胞)
內(nèi)表達(dá)。然后，可對轉(zhuǎn)染有得自體內(nèi)選出的淋巴細(xì)胞所擴(kuò)增的免疫球
蛋白序列的宿主細(xì)胞作進(jìn)一步的體外分析及體外篩選，例如通過擴(kuò)增
(spread out)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以分離出表達(dá)具有結(jié)合親和力的抗體的細(xì)胞。此
外還可對擴(kuò)增的免疫球蛋白序列進(jìn)行體外操縱。
可通過進(jìn)行基本上如上所述的斑點(diǎn)印跡法選出本文定義的具有
所需的親和力的抗體。簡單地講，將抗原與固體基質(zhì)連接，優(yōu)選按系 列稀釋點(diǎn)樣到硝化纖維素膜上。然后使固定化抗原與目標(biāo)抗體接觸
后，通過酶綴合的第二抗體和比色反應(yīng)對后者進(jìn)行檢測；在規(guī)定的抗 體和抗原濃度下，抗體結(jié)合的量使得能夠測定出親和力大小。因此兩 個不同抗體對一個靶標(biāo)的相對親和力，或者一個抗體對兩個不同靶標(biāo) 的相對親和力，在此定義為在其他方面相同的斑點(diǎn)印跡條件下，用兩 種抗體-扭標(biāo)組合觀察到的與靶標(biāo)結(jié)合的抗體相應(yīng)量的關(guān)系。與單克隆 抗體10F4或3C5結(jié)合相同表位的抗體可按領(lǐng)域已知方式獲得。
與如上所述抗體可進(jìn)行竟?fàn)幫?，如果靶結(jié)構(gòu)中的至少一個能夠特異性降低另 一個結(jié)構(gòu)的可測量結(jié)合，優(yōu)選通過提供重疊表位或相同 表位，更優(yōu)選為相同表位，則本文把這些不同的靶結(jié)構(gòu)稱為"竟?fàn)?特
定的抗體。憑借抗體對這類靶結(jié)構(gòu)的相對親和力，可將對靶實(shí)體(target entities)的竟?fàn)幱糜谥苯雍Y選抗體。因此相對親和力可通過用竟?fàn)帉?shí)驗(yàn) 來直接測定，其中使可分辨形式的竟?fàn)帉?shí)體(例如作了不同標(biāo)記的竟?fàn)?結(jié)構(gòu))與目標(biāo)抗體接觸，由與抗體結(jié)合的這些實(shí)體的相對量推導(dǎo)出的抗
體對這些實(shí)體中的每一個的相對親和力。可通過將需要對其親和力較 大的實(shí)體與固體基質(zhì)支持體連接，并將適當(dāng)量的、優(yōu)選摩爾濃度過量
的需要對其親和力較小的竟?fàn)帉?shí)體加入介質(zhì)中，利用這類竟?fàn)幹苯痈?集對靶實(shí)體具有所需相對親和力的抗體。因此，展現(xiàn)所需相對親和力
的抗體比其它抗體往往與基質(zhì)的結(jié)合更堅(jiān)固，并可在洗去不太需要的
形式后獲得，例如通過在低鹽濃度下洗滌后，使用高鹽濃度使其與靶
標(biāo)可逆地分離來收集被結(jié)合的抗體。若有需要，可進(jìn)行若干輪富集。
在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，其中抗體的基因型與該抗體物理
連接，例如，在雜交瘤或展示抗原的噬菌體或酵母細(xì)胞的集合體中，
可拯救相應(yīng)的基因型。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用改進(jìn)的斑點(diǎn)印跡法，其中固 定化抗原與用于抗體結(jié)合的溶解實(shí)體(solved entity)竟?fàn)?，以便可以?結(jié)合固定化抗原的百分比中推導(dǎo)出抗體的相對親和力?？梢圆捎贸Ｒ?guī) 技術(shù)，例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，從完整抗體產(chǎn)生抗體部分， 例如Fab和F(ab')2片^R。另外，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化重組DNA 4支術(shù)獲得抗 體、抗體部分和免疫黏附分子。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明抗體和任選藥學(xué)上合適的載體的藥物 (藥物組合物)。本發(fā)明的藥物組合物還含有至少一種另外的治療藥， 例如一種或多種用于治療可用本發(fā)明抗體緩解的疾病的另外的治療 藥。例如，如果本發(fā)明的抗體與本發(fā)明的球聚體結(jié)合，則藥物組合物 可另含有一種或多種另外的用于治療其中所述球聚體的活性是重要 的疾病的治療藥。藥學(xué)上合適的載體包括任何溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等，只要它們是生 理上相容的。藥學(xué)上可接受的載體包括例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽溶 液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。在許多情況下，優(yōu)先選用等滲 劑，例如糖、甘露醇或山梨醇等多元醇或還有氯化鈉。藥學(xué)上合適的 載體此外還含有相對少量的延長抗體半壽期或增加功效的輔助物質(zhì)， 例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。該藥物組合物可適于例如胃
腸外給藥。此時，抗體優(yōu)選制備成注射溶液劑，其中抗體含量為0.1-250 mg/mL。可以將注射溶液劑制成液體或凍干形式，劑型為遂石玻璃瓶 劑或小瓶劑、安瓿劑或加載注射劑(filled syringe)。緩沖劑可含有L-組氨酸(1-50 mM，優(yōu)選5-10 mM), pH為5.0-7.0,優(yōu)選6.0。更多合 適的緩沖劑包括但不限于琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀緩沖 劑。可以使用氯化鈉以調(diào)節(jié)溶液的張力至0-300 mM的濃度(對于液體 劑型優(yōu)選150 mM)。凍干劑型還可包括冷凍保護(hù)劑，例如蔗糖(例如 0-10%,優(yōu)選0.5-1.0%)。其它合適的冷凍保護(hù)劑為海藻糖和乳糖。凍 干劑型還可包括填充劑，例如甘露醇(例如1-10%，優(yōu)選2-4%)。液體 劑型和凍干劑型兩者中均可使用穩(wěn)定劑，例如L-曱碌u氨酸(例如51 -50 mM，優(yōu)選5-10mM)。其它合適的填充劑為甘氨酸和精氨酸。還可使 用表面活性劑，例如聚山梨酯80 (例如0-0.05%，優(yōu)選0.005-0.01%)。 其它表面活性劑為聚山梨酯20和BRIJ表面活性劑。
本發(fā)明的組合物可具有多種形式。包括液體劑型、半固體劑型和 固體劑型，例如液體溶液劑(例如注射溶液劑和不溶性溶液劑)、分散 劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于 既定給藥的類型和治療應(yīng)用。通常優(yōu)先選擇注射溶液劑或不溶性溶液 劑形式的組合物，例如與用于人類被動免疫的其它抗體相似的組合 物。優(yōu)選的給藥途徑為胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi))。 按照一個優(yōu)選的實(shí)施方案，抗體以靜脈內(nèi)輸注或靜脈內(nèi)注射給予。按 照另一個優(yōu)選的實(shí)施方案，抗體經(jīng)肌內(nèi)或皮下注射給予。在制備和保 存條件下，治療組合物通常必須是無菌和穩(wěn)定的。組合物可配成溶液劑、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或適于高濃度活性物質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)?？?通過將活性化合物(例如抗體)按需要的量摻入合適的溶劑中，需要時 與上述成分中的一種或成分組合一起摻入后，使所述溶液過濾除菌， 來制備無菌可注射溶液劑。 一般將活性化合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì) 的無菌溶媒中，適當(dāng)時摻入所需成分，來制備分散劑。在用于制備無 菌可注射溶液劑的充菌凍干粉情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和 噴霧干燥，該方法產(chǎn)生活性成分粉末，適當(dāng)時產(chǎn)生得自之前經(jīng)過濾除 菌溶液中的其它所需成分的粉末。可通過采用例如包衣材料(例如卵磷 脂)，在分散劑的情況下通過保持所需的粒徑或者通過使用表面活性 劑，來維持溶液恰當(dāng)?shù)牧鲃有浴？赏ㄟ^另外向組合物中摻入延緩吸收 的成分(例如一硬脂酸鹽和明膠)，來延長注射組合物的吸收。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法給予本發(fā)明的抗體，盡管 對于許多治療應(yīng)用，優(yōu)選的給藥類型為皮下注射、靜脈內(nèi)注射或輸注。 技術(shù)人員要了解的是，給藥途徑和/或類型取決于所需要的結(jié)果。按照 具體的實(shí)施方案，活性化合物可與保護(hù)化合物免于快速釋放的載體一 起制備，例如緩釋制劑或控釋制劑，包括植入劑、透皮硬膏劑和微膠 嚢化釋藥系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔铮缫蚁?乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這類制劑
的制備方法為本領(lǐng)域:技術(shù)人員所熟知；參見例如5kstoZ"W Qw加〃ec/ 7 e/醋e i>wg De/Zve/jJ. R. Robinson主編,Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
按照具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體可口服給予，例如溶于惰性 稀釋劑或可代謝食用載體中。抗體(以及如有需要的其它成分)還可包 封在硬質(zhì)或軟質(zhì)明膠膠嚢中、壓制成片劑或者直接加到食物中。對于 口服治療給藥，抗體可與賦形劑相混合，并以口服片劑、口含片劑、 膠嚢劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑等的形式使用。如果打算通過胃腸外 途徑以外的途徑給予本發(fā)明的抗體，則有必要從防止抗體鈍化的材料 中選出包衣材料。本發(fā)明還涉及在患有其中涉及淀粉狀P蛋白以及其中所述本發(fā)明 球聚體的活性是特別重要的疾病的個體體內(nèi)抑制本發(fā)明球聚體活性 的方法。所述方法包括給予個體至少一種本發(fā)明的抗體以抑制該抗體 與之結(jié)合的球聚體的活性。所述個體優(yōu)選為人類。對于個人的治療目 的，可給予本發(fā)明的抗體。另外，對于獸醫(yī)目的或在特定疾病動物模 型的拒架內(nèi)，可以將本發(fā)明抗體給予非人類哺乳動物。這類動物模型 可用于評價本發(fā)明抗體的治療功效(例如測定劑量和給藥時程)。
其中本發(fā)明球聚體起作用的疾病特別包括在其發(fā)生和/或發(fā)展中 涉及本發(fā)明球聚體的疾病。這類疾病是其中本發(fā)明的球聚體明顯是或 者推測是造成所述疾病病理的原因，或者是促成所述疾病發(fā)生和/或發(fā) 展的因素。因此，本文包括其中抑制本發(fā)明球聚體的活性可減輕/減緩 該疾病的癥狀和/或發(fā)展的這些疾病。這類疾病可通過例如患有特定疾 病的個體的生物體液中本發(fā)明球聚體濃度的升高(例如在血清、血漿、
CSF、尿液等中的濃度升高)得以證實(shí)。這可通過例如利用本發(fā)明的抗 體來檢測。本發(fā)明的球聚體特別是在涉及神經(jīng)變性成分、認(rèn)知缺陷、 神經(jīng)毒成分和炎癥成分的多種疾病的相關(guān)病理中起重要作用。
在本發(fā)明的另 一個方面，可以治療或預(yù)防的疾病包括與淀粉樣變 性有關(guān)的疾病。本文術(shù)語"淀粉樣變性"是指以體內(nèi)各種組織中特定蛋 白質(zhì)的異常折疊、成群、聚集和/或積累為特征的多種疾病(淀粉狀蛋 白、纖維狀蛋白質(zhì)及其前體)。在阿爾茨海默病和唐氏綜合征中，神經(jīng) 組織受到影響，在腦淀粉樣蛋白血管病(CAA)中，血管受到影響。本 發(fā)明藥物組合物可包括"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明抗體或 抗體部分。"治療有效量"是指在達(dá)到所需治療結(jié)果所必需的一段時間 內(nèi)的有效劑量。治療有效量的抗體或抗體部分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確 定，并可以隨例如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及抗體或抗 體部分在個體內(nèi)誘導(dǎo)所需應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還是 其中治療有益作用勝于任何抗體或抗體部分毒害作用的量。"預(yù)防有效 量"是指在達(dá)到所需預(yù)防結(jié)果所必需的一段時間內(nèi)的有效劑量。由于一般在疾病較早期前或在較早期時使用預(yù)防劑量，因此預(yù)防有效量將會 小于治療有效量。
另外，本發(fā)明包括預(yù)防或治療需要這種預(yù)防或治療的患者的阿爾 茨海默病的其它方法。該方法包括按足以實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療的量給予患 者上述疫苗的步驟。
此外，本發(fā)明包括鑒定化合物的方法，所述化合物適于使預(yù)測將
發(fā)生淀粉樣變性(例如阿爾茨海默病)的患者主動免疫。該方法包括 l)在足以使一種或多種化合物與一種或多種抗體結(jié)合的條件下，將一 種或多種目標(biāo)化合物暴露于一種或多種上述抗體中一段時間；2)鑒定 與一種或多種抗體結(jié)合的化合物，所鑒定出的化合物將用于使預(yù)測將 發(fā)生淀粉樣變性(例如阿爾茨海默病)的患者主動免疫。
在抗體診斷應(yīng)用的框架內(nèi)，特異性球聚體的定性或定量測定特別 用來診斷與疾病相關(guān)的淀粉狀蛋白(3形式。在這種情況下，特異性是 指能夠有足夠敏感度檢測特定球聚體或其衍生物或其混合物的可能 性。本發(fā)明抗體的檢測閾值濃度適宜小于10ng/mL樣品，優(yōu)選小于l ng/mL樣品，特別優(yōu)選小于IOO pg/mL樣品，這意味著每mL樣品最 小的球聚體濃度，表明了在任何情況下可通過本發(fā)明的抗體檢測出同 樣適宜的較低濃度。該檢測按免疫學(xué)方法進(jìn)行。大體上通過其中使用 抗體的任何分析或診斷實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，包括凝集技術(shù)和沉淀技術(shù)、免 疫測定法、免疫組織化學(xué)法和免疫印跡技術(shù)，例如蛋白質(zhì)印跡法或優(yōu) 選斑點(diǎn)印跡法。本發(fā)明還包括體內(nèi)方法，例如成像方法。
應(yīng)用免疫測定法是有利的。竟?fàn)幮悦庖邷y定法，即其中抗原和標(biāo) 記抗原(示蹤物)竟?fàn)幗Y(jié)合抗體的測定法；夾心免疫測定法，即其中特 異性抗體與抗原的結(jié)合情況用通常經(jīng)標(biāo)記的第二抗體檢測的測定法，
這兩種方法都是適用的。這些測定法或可以是勻相的，即無需分成固 相和液相，或者可以是多相的，例如將結(jié)合的標(biāo)記與未結(jié)合的標(biāo)記分 開(例如通過固相結(jié)合的抗體)。根據(jù)標(biāo)記和測定方法，各種多相和均 相免疫測定方式可分成各具體的類別，例如RIA (放射免疫測定法)、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)、FIA (熒光免疫測定法)、LIA (發(fā)光免 疫測定法)、TRFIA (時間分辨FIA)、 IMAC (免疫活化作用 (immunoactivation)) 、 EMIT (酶倍增免疫觀'J定(enzyme-multiplied immune test))、 TIA (比濁免疫測定法)、I-PCR (免疫PCR)。
對于本發(fā)明球聚體的定量測定而言，優(yōu)先選擇竟?fàn)幮悦庖邷y定 法，其中規(guī)定量的用作示蹤物的標(biāo)記球聚體衍生物與樣品球聚體(含有 未知量的未標(biāo)記的球聚體)竟?fàn)?，以定量測定與所使用的抗體的結(jié)合情 況。可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由所置換的示蹤物的量測定抗原的量，也就是 球聚體的量。
在可用于這些目的的標(biāo)記中，酶被證實(shí)是有利的。例如，可以采 用基于過氧化物酶，特別是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和P-D-半乳 糖苷酶的系統(tǒng)。例如，特異性底物對于這些酶而言是可利用的，特異 性底物的轉(zhuǎn)化可以用光度計(jì)監(jiān)測。合適的底物系統(tǒng)是以用于以下酶的 下列底物為基礎(chǔ)對于堿性磷酸酶為磷酸對硝基苯酯(p-NPP)、 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NPT)、固紅/萘酚-AS-TS磷酸；對于 過氧化物酶為2，2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯 二胺(OPT)、 3,3，,5,5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、5-氨基水楊 酸、3-二曱氨基苯曱酸(DMAB)和3-曱基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH);對 于(3-D-半乳糖苷酶為鄰硝基苯基-P-D-半乳糖苷(o-NPG)、對硝基苯基 -卩-D-半乳糖苷和4-曱基傘形?；交?methylumbelliphenyl)-P-D-半乳 糖苷(MUG)。在許多情況下，這些底物系統(tǒng)是市售即用的形式，例如 還可含有其它試劑(例如合適緩沖劑等)的片劑形式。所用示蹤物可以
是標(biāo)記的球聚體。在這個意義上，可通過標(biāo)記待測定的球聚體并將其 用作示蹤物，來測定特定的球聚體?？砂幢绢I(lǐng)域已知方式使用于制備 示蹤物的球聚體與標(biāo)記偶聯(lián)?？深愃频貐⒖家陨蠈Ρ景l(fā)明球聚體衍生 化的說明。另外，許多經(jīng)適當(dāng)修飾用于與蛋白質(zhì)綴合的標(biāo)記是可利用 的，例如綴合生物素的酶、綴合抗生物素蛋白的酶、綴合extravidin 的酶或綴合鏈霉抗生素的酶、被馬來酰亞胺活化的酶等。這些標(biāo)記可
61直接與寡聚體反應(yīng)，或者如有需要，與適當(dāng)衍生化球聚體反應(yīng)，得到 示蹤物。例如，如果使用鏈霉抗生素-過氧化物酶綴合物，則這首先需 要使球聚體生物素化。這適用于相應(yīng)的相反順序。為此，合適的方法 也為技術(shù)人員所知。
如果選擇多相免疫測定方式，則可通過將抗原-抗體復(fù)合物與支 持體結(jié)合來分離，例如通過與所述支持體偶聯(lián)的抗獨(dú)特型抗體，例如
針對兔IgG的抗體。合適的支持體，特別是用合適抗體包被的微量滴 定板是已知的，部分是市售的。
本發(fā)明還涉及含有如上所述至少一種抗體和其它組分的免疫測 定盒(immunoassay sets)。所述盒一般是包裝單元的形式，是用于進(jìn)行 本發(fā)明球聚體測定的工具(means)的組合。為了盡可能使處理簡化，所 述工具優(yōu)選以基本上即用的形式提供。有利的組合(arrangement)以診 斷合的形式供免疫測定之用。診斷合一般包括多個容器以分別放置各 組分。所有組分均可以即用稀釋液、作為用于稀釋的濃縮物或作為用 于溶解或混懸的干物質(zhì)或冷凍干燥物提供；可將各個組分或所有組分 冷凍或保存在室溫下直到使用。血清優(yōu)選驟激冰凍(例如在-20。C下)， 因而在這些情況下，臨用前，免疫測定優(yōu)選需保持在冰凍溫度以下。 提供給免疫測定法的其它組分決定于所述免疫測定法的類型。標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)、示蹤物(可能需要，或可能不需要)和對照血清一般與抗血清一 起提供。此外，還包括優(yōu)選抗體包被的微量滴定板、緩沖液(例如用于 測定、用于洗滌或用于底物轉(zhuǎn)化的緩沖液)以及酶底物本身。
實(shí)施室和醫(yī)院免疫測定法的普通原理以及作為輔助物(auxiliaries) 的抗體的制備和4吏用可參見例如Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow, E.和Lane, D.主編,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY， 1988)。
本發(fā)明還包括在疑似患有淀粉樣變性的患者中診斷淀粉樣變性 (例如阿爾茨海默病)的方法。該方法包括以下步驟l)由患者體內(nèi)分 離出生物樣品；2)在足以形成抗原/抗體復(fù)合物的條件下，使生物樣品與至少一種上迷抗體接觸一段時間；和3)檢測所述樣品中抗原/抗體復(fù) 合物的存在情況，復(fù)合物的存在表明在患者中診斷出淀粉樣變性(例如 阿爾茨海默病)。該抗原可以是例如球聚體或其部分或片段，所述部分 或片段具有與完整球聚體相同的功能性質(zhì)(例如結(jié)合活性)。
此外，本發(fā)明包括在疑似患有淀粉樣變性的患者中診斷淀粉樣變 性(例如阿爾茨海默病)的另一種方法。該方法包括以下步驟l)由患 者體內(nèi)分離出生物樣品；2)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物條件下，使 生物樣品與抗原接觸一段時間；3)在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合的 條件下，將綴合物加到所得抗體/抗原復(fù)合物中一段時間，其中綴合 物包含與能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物連接的上述抗體中 的一種抗體；和4)通過檢測由信號產(chǎn)生化合物產(chǎn)生的信號，來檢測 可能存在于生物樣品中的抗體，該信號表明在患者中診斷出淀粉樣 變性(例如阿爾茨海默病)。該抗原可以是球聚體或其部分或片段，所 述部分或片段具有與完整球聚體相同的功能性質(zhì)(例如結(jié)合活性)。 本發(fā)明包括在疑似患有淀粉樣變性(例如阿爾茨海默病)的患者中 診斷淀粉樣變性(例如阿爾茨海默病)的另一種方法。該方法包括以下 步驟l)由所述患者體內(nèi)分析出生物樣品；2)在足以形成抗抗體/抗體 復(fù)合物的條件下，使生物樣品與抗抗體(其中所述抗抗體對上述抗體中 的一種抗體有特異性)接觸一段時間，含有抗體的復(fù)合物存在于生物樣 品中；2)在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合的條件下，將綴合物加到所 得到的抗抗體/抗體復(fù)合物中 一段時間，其中綴合物包含與能夠產(chǎn)生可 檢測信號的信號產(chǎn)生化合物結(jié)合的抗原；和3)檢測由信號產(chǎn)生化合物 產(chǎn)生的信號，該信號表明在患者中診斷出淀粉樣變性(例如阿爾茨海默 病)。
本發(fā)明還包括診斷盒，所述診斷盒包括a)至少一種上述抗體， b)包含連接信號產(chǎn)生化合物的抗體的綴合物，其中綴合物中的抗體與 分離抗體不同。
本發(fā)明還包括診斷盒，所述診斷盒包括a)針對上述抗體之一的抗抗體，b)包含連接信號產(chǎn)生化合物的抗原的綴合物。該抗原可為球 聚體或其片段或部分，所述片段或部分具有與球聚體相同的功能特征
(例如結(jié)合活性)。
在本發(fā)明的一個診斷實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其部分被包被 在固相(或存在于液相)中。然后使試驗(yàn)樣品或生物樣品(例如全血、腦 脊液、血清等)與固相接觸。如果樣品中存在抗原(例如球聚體)，則該 抗原與固相上的抗體結(jié)合，然后通過直接或間接方法檢測。直接方法 包括僅檢測復(fù)合物本身的存在情況，繼而檢測抗原的存在。間接方法 中，將綴合物加到結(jié)合抗原中。綴合物包含第二抗體，第二抗體與連 接至信號產(chǎn)生化合物或標(biāo)記的結(jié)合抗原結(jié)合。如果第二抗體與結(jié)合抗 原結(jié)合，則信號產(chǎn)生化合物產(chǎn)生可測量的信號。因此該信號表明試驗(yàn) 樣品中存在抗原。用于診斷用免疫測定法的固相的實(shí)例是多孔材料和 無孔材料、乳膠顆粒、磁粉、微粒(參見美國專利號5,705,330)、微珠、 濾膜、微量滴定孔和塑料管。如有需要，根據(jù)所需測定形式的性能特 征確定固相材料的選擇和對綴合物中存在的抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記的 方法。
如上所述，綴合物(或指示試劑)可包含連接信號產(chǎn)生化合物或標(biāo) 記的抗體(或許為抗抗體，這取決于測定法)。此信號產(chǎn)生化合物或"標(biāo) 記"本身是可檢測的，或者可與 一種或多種其他化合物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測 產(chǎn)物。信號產(chǎn)生化合物的實(shí)例包括色原、放射性同位素(例如1251、 1311、 32P、 3H、 35S和14C)、化學(xué)發(fā)光化合物(例如吖啶鎖離子)、粒 子(可見粒子或熒光粒子)、核酸、螯合劑或催化劑例如酶(例如堿性磷 酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、(3-半乳糖香酶和核糖核酸酶)。 在使用酶的情況下(例如石威性磷酸酶或辣4艮過氧化物酶)，加入顯色底 物、熒光底物或發(fā)光底物導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測信號。還可使用其它檢測系 統(tǒng)，例如時間分辨焚光、內(nèi)反射熒光、擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和 拉曼光譜?？捎蒙鲜雒庖邷y定法測定的生物體液的實(shí)例包括血漿、全 血、干全血、血清、腦脊液或組織和細(xì)胞的水萃取物或組織和細(xì)胞的有機(jī)-水萃取物。
本發(fā)明還包括;險測試^r樣品中存在抗體的方法。該方法包括以下 步驟(a)在足以形成抗抗體/抗體復(fù)合物的時間和條件下，使疑似含有 抗體的試驗(yàn)樣品與對患者樣品中的抗體有特異性的抗抗體反應(yīng)，其中 抗抗體是與患者樣品中的抗體結(jié)合的本發(fā)明抗體；(b)將綴合物加到所 得抗抗體/抗體復(fù)合物中，該綴合物包含連有能夠產(chǎn)生可檢出測號的信 號產(chǎn)生化合物的抗原(它與抗抗體結(jié)合)；和(d)通過檢測由信號產(chǎn)生化 合物產(chǎn)生的信號，來檢測可能存在于試驗(yàn)樣品中的抗體的存在情況。 可使用包含針對抗抗體的抗體的對照或校準(zhǔn)物。
診斷盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明包括診斷 盒，該診斷盒用于在疑似患有阿爾茨海默病或其它以認(rèn)知受損為特征 的疾病的患者中測定抗原(例如球聚體)的存在情況。具體地說，用于 測定試驗(yàn)樣品中抗原存在情況的診斷盒包含a)本文定義的抗體或其 部分；和b)包含連有能夠產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物的第二抗 體(對抗原有特異性)的綴合物。診斷盒還裝有對照或校準(zhǔn)物以及包裝 說明書，所述對照或校準(zhǔn)物包括與抗原結(jié)合的試劑，所述包裝說明書 描述了進(jìn)行測定的方法。
本發(fā)明還包括用于檢測試驗(yàn)樣品中的抗體的診斷盒。診斷盒可裝 有a)對目標(biāo)抗體有特異性的抗抗體(例如本發(fā)明抗抗體中的一種)，和 b)如上定義的抗原或其部分。包含與抗原結(jié)合的試劑的對照或校準(zhǔn)物 也包括在內(nèi)。更準(zhǔn)確地講，診斷盒可包含a)對抗體有特異性的抗抗體 (例如本發(fā)明抗抗體中的一種)，和b)包含連有能夠產(chǎn)生可檢測信號的 信號產(chǎn)生化合物的抗原(例如球聚體)的綴合物。此外，診斷盒還包含 對照或校準(zhǔn)物以及包裝說明書，所述對照或校準(zhǔn)物包含與抗原結(jié)合的 試劑，說明書描述了診斷盒的組分及如何使用的方法。診斷盒還可裝 有容器，例如小瓶、瓶子或條帶(strip)，每個容器中裝有預(yù)設(shè)置的固相， 其它容器裝有相應(yīng)的綴合物。這些診斷盒也可裝有進(jìn)行測定所需要的 其它試劑的小瓶或容器，例如洗滌、處理和指示試劑。
65應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明不僅僅包括上述全長抗體，而且還包括其
部分或其片段，例如其Fab部分。另外，本發(fā)明包括在例如結(jié)合特異 性、結(jié)構(gòu)等方面與本發(fā)明抗體性質(zhì)相同的任何抗體。
本發(fā)明的優(yōu)勢
通過用Ap(12-42)球聚體(如實(shí)施例I中所述)免疫，可獲得不同的 單克隆抗體，它們對不同的A(3(l-42)寡聚體和Ap(X-42)寡聚體的耐受 性或識別程度有所不同，正如如上所述的竟?fàn)幮园唿c(diǎn)印跡法所測定的 一樣。這可供針對A|3寡聚體的抗體的研發(fā)之用，該抗體在認(rèn)知改善 作用、對其它AP形式所需的特異性與最小副作用特征之間具有最佳 關(guān)聯(lián)性。對于用于被動免疫中的單克隆抗體也是如此。這類免疫(主動 和被動免疫)的特異性策略的優(yōu)勢是不會引起針對A{3單體、聚集原纖 維狀態(tài)的AP肽或sAPPa的免疫應(yīng)答。該優(yōu)勢表現(xiàn)在下列幾個方面
1) 在不溶性A卩斑塊的形式中，聚集原纖維狀態(tài)下的A卩肽占阿 爾茨海默病腦整個A(3肽庫(pool)的主要部分。通過使抗A(3抗體與這 些斑塊反應(yīng)，引起Ap斑塊溶解而大量釋放出Ap被認(rèn)為是有害的。A卩 的這種大量釋放隨后可穿過血腦屏障，進(jìn)入血流，并可能增加微出血 的風(fēng)險。另外，在上述ELAN臨床實(shí)驗(yàn)中，由于6%的病例發(fā)生腦膜 腦炎，因此需要取消用原纖維A卩肽形式免疫的這種極端策略的臨床 試驗(yàn)。
2) 針對單體A(3肽形式的免疫應(yīng)答不是所需的，因?yàn)檠芯匡@示， 該形式可發(fā)揮認(rèn)知改善作用。
3) 針對sAPPa的免疫應(yīng)答也不是所需的。另外，sAPPa同樣顯 示出發(fā)揮認(rèn)知改善作用。
4) 要避免針對血管CAA形式的A卩肽的反應(yīng)，以避免不良的微 出血副作用(即與針對N端的肽的抗體相比，針對A(3中部而且還不與 以CAA形式聚集的A卩肽結(jié)合的抗體引起微出血較輕微，參見上文)。
5) 相對于病理生理上相關(guān)的AP種類，與AP寡聚體起特異性反應(yīng)的抗體具有較高的生物利用度，由于它們不與例如原纖維狀A(yù)卩或 單體A卩結(jié)合，所以對這些形式的A卩不存在治療效果。
再者，應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明的抗體(特別是10F4和3C5)不檢出 (detect)腦脊液中的淀粉狀蛋白(3 (或與市售抗體如6E10 (Signet目錄 號9320)相比結(jié)合親和力較低)。因此，由于CSF中淀粉狀蛋白的更 新率高，所以比起結(jié)合體內(nèi)(例如腦和CSF)所有淀粉狀蛋白卩的抗體， 不結(jié)合CSF中的淀粉狀蛋白卩的抗體防止了抗體的浪費(fèi)，并建立了一 個更有效和更有選擇性的系統(tǒng)。此外，本發(fā)明抗體的這個性質(zhì)使得能 夠減少抗體的給予量(對于被動免疫而言)，降低副作用的風(fēng)險(因?yàn)閯?量較低，所以使抗體限于靶標(biāo)上)，提高了功效，也提高了治療指數(shù)。 此外，微出血的風(fēng)險也得到降低。另外，由于抗體不檢出原纖維狀形 式的淀粉狀蛋白(3,所以與這類復(fù)合物形成有關(guān)的風(fēng)險也降低。 保藏材料信息
2006年2月28日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Bud叩estTreaty)條款，將 產(chǎn)生單克隆抗體3C5的雜交瘤(ML45-3C5.5C10)保存在美國典型培養(yǎng) 物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas ， Virginia 20110 ， 并指定為ATCC保藏號PTA-7406。 2006年8月16日，根據(jù)布達(dá)佩斯 條約條款，將產(chǎn)生單克隆抗體10F4的雜交瘤(ML43-10F4.3H8)保存在 美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110，并指定為ATCC保藏號PTA-7808。
可利用下列非限制性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。
實(shí)施例I
用于免疫的ABQ2-42)球聚體的制備
將A卩(12-42)合成肽(AnaSpec Inc.;批號40443)按40 mg/mL懸浮 于100% (體積/體積)的U，l,3,3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)中(5 mg在125 jaL HFIP中)，在37。C振蕩下溫育1小時以便完全溶解。HFIP起氫鍵斷鍵 劑(hydrogen-bond breaker)的作用，并用來消除A(3肽中預(yù)先存在的結(jié)
67構(gòu)不均一性。以10000 g離心10分鐘后，HFIP溶解Ap(12-42)的上清 液用6.1 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS) (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))稀釋后，加入625 pL 2% (重量/體積)十二烷基硫酸鈉(SDS) (水溶液)(終濃度為0.2% (重量/體積)SDS)，在37。C下溫育3小時。再 一次加入625 2% (重量/體積)十二烷基石克酸鈉(SDS)(水溶液)(終濃 度為04% (重量/體積)SDS)，再次在37°C下溫育3小時。該溶液用7 mL 水稀釋，在37。C下溫育16小時。以3000 g離心10分鐘后，上清液 進(jìn)一步用15 mL PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))稀釋 后，經(jīng)超濾濃縮(截留5kD)至0.65mL，用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、0.05。/。(重量/體積)SDS(pH7.4)在室溫下透析16小時，以10000 g離心10分鐘，回收包含A(3(12-42)球聚體的上清液。將樣品等分后 保存在-80'C下備用。
實(shí)施例II 單克隆抗體3C5和10F4的制備
用50嗎含實(shí)施例I中所述的A(3(12-42)球聚體的CFA (Sigma)對 Balb/c小鼠進(jìn)行皮下免疫，按一個月的間隔加強(qiáng)免疫兩次。收集脾臟， 通過PEG方法，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞按5:1比率融合。 以2xl()S細(xì)胞/mL， 200mL/孔，將融合細(xì)胞接種到96孔板的重氮絲氨 酸/次黃。票呤篩選培養(yǎng)基中。使細(xì)胞生長形成明顯的集落，通過直接 ELISA測定，分析上清液的A卩寡聚體反應(yīng)性。通過有限稀釋對分泌 抗AP寡聚體抗體的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，直到抗體表達(dá)趨于穩(wěn)定。
實(shí)施例III
抗AB球聚體抗體選擇性的斑點(diǎn)印跡譜
為了表征抗AP球聚體單克隆抗體的選擇性，研究了它們對不同 A卩形式的識別。為此，制備了補(bǔ)充有0.2 mg/mL BSA的含100 pmol/(iL-0.01 pmol/^L各種A卩形式的PBS系列稀釋液。將各樣品1 (aL點(diǎn)樣到硝化纖維素膜上。為了檢測，使用了相應(yīng)的抗體(0.2嗎/mL)。 使用過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG和染色試劑BM Blue POD底物 (Roche)，進(jìn)行了免疫染色。
用于斑點(diǎn)印跡的AB標(biāo)準(zhǔn)
1. A(3(l-42)單體，0.1%NH4OH
將1 mg A卩(l-42) (Bachem Inc.,目錄號H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NH4OH/H20 (新鮮配制)(=2 mg/mL)后，在室溫下立即振蕩30秒鐘， 得到澄清溶液。將該樣品保存在-20。C下備用。
2. A卩(l陽40)單體，0.1%NH4OH
將1 mg A卩(l-40) (Bachem Inc.,目錄號H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NH4OH/H20 (新鮮配制)(=2 mg/mL)后，在室溫下立即振蕩30秒鐘， 得到澄清溶液。將該樣品保存在-20。C下備用。
3. A卩(l-42)單體，0.1%NaOH
將2.5 mg A卩(l-42) (Bachem Inc.,目錄號H-1368)溶于0.5 mL 0.1% NaOH/H20 (新鮮配制)(=5 mg/mL)后，在室溫下立即振蕩30秒 鐘，得到澄清溶液。將該樣品保存在-20。C下備用。
4. AJ3(1墨40)單體、0.1%NaOH
將2.5 mg A(3(l-40) (Bachem Inc.，目錄號H-1368)溶于0.5 mL 0.1%NaOH/ H20 (新鮮配制)(=5 mg/mL)后，在室溫下立即振蕩30秒 鐘，得到澄清溶液。將該樣品保存在-20。C下備用。
5. A卩(l-42)球聚體
將A(3(1陽42)合成肽(H-1368， Bachem， Bubendorf， Switzerland) 以6 mg/mL懸浮于100% 1,1,1，3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，在37。C下 振蕩溫育1.5小時至完全溶解。HFIP起氫4建斷4建劑的作用，并用來消除Ap肽中預(yù)先存在的結(jié)構(gòu)不均一性。用SpeedVac蒸發(fā)除去HFIP， 將AP( 1 -42)以5 mM的濃度重新懸浮于二曱亞砜中，超聲處理20秒鐘。 將HFIP預(yù)處理的A卩(1-42)在磷酸緩沖鹽溶液(PBS) (20 mM NaH2P04、 140mMNaCl， pH 7.4)中稀釋至400 )iM，加入1/10 (體積)2%十二烷 基硫酸鈉(SDS)(水溶液)(終濃度為0.2% SDS)。在37。C下溫育6小時 產(chǎn)生16/20-kDaA卩(l-42)球聚體中間體(球狀寡聚體的短小形式)。通過 用3份體積的水進(jìn)一步稀釋并在37。C下溫育18小時，來產(chǎn)生 38/48-kDaA卩(l-42)球聚體。在以3000 g離心20分鐘后，樣品經(jīng)超濾 濃縮(截留30-kDa)，用5 mM NaH2P04、 35 mM NaCl (pH 7.4)透析， 以10000 g離心10分鐘，回收含有38/48-kDa A卩(l-42)球聚體的上清 液。作為透析的替代方法，可用9倍(體積/體積)過量冰冷的曱醇/乙酸 溶液(33%甲醇，4%乙酸)使38/48-kDa A卩(l-42)球聚體在4。C下沉淀1 小時。然后沉淀出38/48-kDa A卩(l-42)球聚體(16200 g， IO分鐘)，重 新懸浮于5mMNaH2P04、 35 mM NaCl (pH 7.4)，調(diào)節(jié)pH至7.4。
6. A卩(12陽42)球聚體
將2 mL按照實(shí)施例3.5 (見上文)制備的A卩(l-42)球聚體制備物與 38 mL緩沖液(5 mM磷酸鈉、35 mM氯化鈉(pH 7.4))和150 pl 1 mg/mL GluC內(nèi)切蛋白酶(Roche)的水溶液混合。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6 小時，隨后再次加入150 nL 1 mg/mL GluC內(nèi)切蛋白酶(Roche)的水溶 液。將反應(yīng)混合物在室溫下再攪拌16小時后，加入8 5 MDIFP (二 異丙基氟磷酸)溶液。用15mL30kDaCentriprep管使反應(yīng)混合物濃縮 至約1 mL。將濃縮物與9 mL緩沖液(5 mM磷酸鈉、35 mM氯化鈉(pH 7.4))混合后，再次濃縮至1 mL。在6。C下，濃縮物用1 L緩沖液(5 mM 磷酸鈉、35mMNaCl)在透析管中透析16小時。用1%濃度的SDS水 溶液調(diào)節(jié)透析液至SDS含量為0.1%。以10000 g離心10分鐘收集樣 品，棄去上清液。
707. A卩(20-42)球聚體
將按照實(shí)施例2.5 (見上文)制備的1.59 mL A卩(l-42)球聚體制備物 與38 mL緩沖液(50 mM MES/NaOH (pH 7.4))和200 |iL 1 mg/mL嗜熱 菌蛋白酶溶液(Roche)的水溶液相混合。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌 20小時。然后加入80 pi 100 mM EDTA溶液(pH 7.4)，另外用400 |il 1% 濃度的SDS溶液調(diào)節(jié)混合物至SDS含量為0.01%。用15 mL 30 kDa Centriprep管使反應(yīng)混合物濃縮至約1 mL。將濃縮物與9 mL緩沖液(50 mMMES/NaOH， 0.02 % SDS (pH 7.4))相混合，再次濃縮至1 mL。在 6。C下，濃縮物用1 L緩沖液(5mM磷酸鈉、35 mMNaCl)在透析管中 透析16小時。透析液用2%濃度的SDS溶液調(diào)節(jié)至SDS含量為0.1%。 以10000 g離心10分鐘收集樣品，棄去上清液。
8. A卩(l-42)原纖維
將1 mg A(3(l-42) (Bachem Inc.目錄號H-1368)溶于500 0.1% NH40H水溶液中(Eppendorff管)，將樣品在室溫下攪拌1分鐘。該新 鮮配制的A(3(l-42)溶液100 |iL用300 |iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl(pH7.4)中和。用1% HC1調(diào)節(jié)pH至pH 7.4。將樣品在37。C下溫 育24小時后，離心(畫0g， 10分鐘)。棄去上清液，用400^iL20mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)經(jīng)渦旋1分鐘使原纖維沉淀重新懸 浮。
9. sAPPa
由Sigma供應(yīng)(目錄號S9564; 25 mM NaH2P04; 140 mM
NaCl; pH7.4)。 sAPPa用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)、 0.2 mg/mL BSA稀釋至0.1 mg/mL (= 1 pmol/pL)。
斑點(diǎn)印跡法的材料 A|3標(biāo)準(zhǔn)液
A卩抗原用20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4) + 0.2 mg/mLBSA系列稀釋成
1) 100 pmol/|aL
2) 10 pmol/|-iL
3) 1 pmol/|aL
4) 0.1 pmol/(iL
5) 0.01 pmol/|iL
硝化纖維素
Trans-Blot轉(zhuǎn)移基質(zhì)(Transfer medium),純硝化纖維素膜(0.45 —;BIO-RAD
抗小鼠-POD:
目錄號715-035-150 (Jackson Immuno Research)
沖全測試劑
BM Blue POD底物，沉淀的(Roche)
牛血清白蛋白，(BSA):
目錄號A-7888 (SIGMA)
封閉試劑
含5%低脂牛奶的TBS
緩沖液 TBS
25 mM Tris/HCl緩沖液(pH 7.5) + 150mMNaCl
TTBS
25 mM Tris/HCl-緩沖液(pH 7.5)+ 150mMNaCl
+ 0.05%吐溫20 (Tween 20)
PBS + 0.2 mg/mL BSA
20 mM NaH2P04緩沖液(pH 7.4)
+ 140mM NaCl
+ 0.2 mg/mL BSA
抗體溶液I:
將0.2 ng/mL抗體用20 mL含1%低脂牛奶的TBS稀釋
抗體溶液II:
1:5000稀釋液
抗小鼠-POD/lQ/。低脂奶粉的TBS 斑點(diǎn)印跡法
1) 將1 ^L各個不同A卩標(biāo)準(zhǔn)液(5個系列稀釋)點(diǎn)樣到硝化纖維素 膜上，彼此距離約1 cm。
2) 在室溫(RT)下，使AP標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)在硝化纖維素膜上風(fēng)干至少 10分鐘(=斑點(diǎn)印跡法)。
3) 封閉
將斑點(diǎn)印跡與30 mL含5%低脂牛奶的TBS —起在室溫下溫育1.5 小時。
4) 洗滌
棄去封閉溶液，使斑點(diǎn)印跡與20 mL TTBS —起在室溫下振蕩溫 育IO分鐘。
5) 抗體溶液I:
棄去洗滌緩沖液，使斑點(diǎn)印跡與抗體溶液I一起在室溫下溫育2 小時。
736)洗滌
棄去抗體溶液I，使斑點(diǎn)印跡與20 mL TTBS —起在室溫下振蕩 溫育IO分鐘。
棄去洗滌溶液，使斑點(diǎn)印跡與20mLTTBS—起在室溫下振蕩溫 育IO分鐘。
棄去洗滌溶液，使斑點(diǎn)印跡與20 mL TBS —起在室溫下振蕩溫育 IO分鐘。
7) 抗體溶液II:
棄去洗滌緩沖液，使斑點(diǎn)印跡與抗體溶液II 一起在室溫下溫育過夜。
8) 洗滌
棄去抗體溶液II,使斑點(diǎn)印跡與20 mL TTBS —起在室溫下振蕩 溫育IO分鐘。
棄去洗滌溶液，使斑點(diǎn)印跡與20mLTTBS—起在室溫下振蕩溫 育IO分鐘。
棄去洗滌溶液，使斑點(diǎn)印跡與20mLTBS —起在室溫下振蕩溫育 IO分鐘。
9)顯影
棄去洗滌溶液。斑點(diǎn)印跡用10mLBMBluePOD底物顯影IO分 鐘。用水充分洗滌斑點(diǎn)印跡以終止顯影。應(yīng)用斑點(diǎn)強(qiáng)度光密度分析 (GS800光密度計(jì)(BioRad)和軟件包Quantity one, 4.5.0版(BioRad))進(jìn) 行定量評價。只對相對密度大于用視力清晰分辯得出的上一級 A卩(20-42)球聚體斑點(diǎn)相對密度的20。/。的斑點(diǎn)進(jìn)行評價。獨(dú)立測定了每 個斑點(diǎn)印跡的該閾值。對于給定抗體，計(jì)算值表明識別A(3(l-42)球聚 體與各個A卩形式之間的關(guān)系。
通過用Ap(12-42)球聚體(按照實(shí)施例I中所述方法制備)使小鼠主動免疫，隨后篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，獲得所測定的單克隆抗體(6E10 除外)。對各個A(3形式進(jìn)行系列稀釋，與各自的抗體一起溫育以進(jìn)行 免疫反應(yīng)。
1. A卩(l醫(yī)42)單體，0.1%NH4OH
2. A卩(l-40)單體，0.1%NH4OH
3. A卩(l畫42)單體，0.1%NaOH
4. A卩(l-40)單體，0.1%NaOH
5. A卩(l-42)球聚體
6. A卩(12-42)球聚體
7. A(3(20-42)球聚體
8. A卩(l-42)原纖維制備物
9. sAPPa (Sigma);(第一斑點(diǎn)1 pmol) 結(jié)果見圖1。
根據(jù)對斑點(diǎn)印跡結(jié)果的分析，抗A卩球聚體mAb 10F4和抗A卩 球聚體mAb 3C5對于Ap-球聚體形式(例如Ap(l-42)球聚體、A(3( 12-42) 球聚體和A(3(20-42)球聚體)具有高親和力。在一定程度上它們辨出其 它A卩形式(例如A卩單體)，但不顯著識別A卩(l-42)原纖維或sAPPa。 抗體10F4和3C5因此可稱作"抗A卩球聚體抗體"。
實(shí)施例IV
通過10F4和3C5檢測阿爾茨海默病腦中的AB-球聚體表位 A:提取方法
試劑清單 3。/。SDS緩沖液
一 50 mM Tris/HCl、 150 mM NaCl、 0.5。/o曲通(Triton) X100, 1 mM EGTA、 3%SDS、 1%脫氧膽酸鈉，pH7.4
完全蛋白酶承卩制劑混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail):
75—將1片完全抑制劑混合物(Complete Inhibitor Cocktail) (Roche Diagnostics GmbH;目錄號1697498)溶于1 mL水；新鮮配制
PMSF溶液
—500mMPMSF/曱醇
3%SDS提取緩沖液
一將1/100完全抑制劑混合物溶液加到3% SDS緩沖液中 —將1/500 PMSF溶液加到3% SDS緩沖液中 一提取緩沖液臨用前在室溫下制備
抗體
—mAb 10F4 —mAb 3C5
—mAb 6E10 (Signet;目錄號9320)
一mAblgG2b(對照抗體，針對合成半抗原產(chǎn)生，Dianova，克隆 NCG2B.01，目錄號DLN-05812)
方法
在室溫下，將0.2 g -80°。冷凍的人AD腦死后組織樣品和年齡匹 配的對照腦組織樣品加到1.8 mL新鮮配制的3% SDS提取緩沖液中。 立即將樣品用玻璃罐(glass potter)在冰浴上勾漿化。將勻漿樣品轉(zhuǎn)移到 反應(yīng)小瓶中，以10000 g離心5分鐘。小心地收集上清液(=3% SDS-腦提取物)，反應(yīng)小瓶在-8(TC下保存?zhèn)溆谩?br> B:帶有單克隆小鼠抗體Dynabead的活化
—小心地?fù)u動Dynabead (Dynabead M-280綿羊抗小鼠IgG， Invitrogen;目錄號112.02)的貯備懸液以防止起泡沫
—無菌條件下取出lmL，并轉(zhuǎn)移至1.5mL反應(yīng)小瓶中一 Dynabead用1 mL免疫沉淀(IP)-洗滌緩沖液(IP-洗滌緩沖液 PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4》、0.1。/。BSA)洗滌3次5 分鐘。在洗滌過程中，小心地棄去上清液，同時Dynabead被固定在 使用磁力分離器支架(magnetic separator stand, MSS)的反應(yīng)小瓶的一
側(cè)
—經(jīng)洗滌的Dynabead與40嗎A卩-抗體一起在1 mL PBS、 0.1% BSA中溫育
—通過在4。C下振蕩溫育過夜進(jìn)行活化
—活化的Dynabead用1 mL IP-洗滌緩沖液(PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1Q/。BSA)洗滌30分鐘4次(再用 MSS洗滌)
—將活化的Dynabead重新懸浮于1 mLPBS、 0.1%BSA、 0.02%
疊氮化鈉中；渦旋后，短暫離心
—將抗體活化的Dynabead保存在4。C下備用
C:免疫沉淀(IP)
—25 3% SDS-腦提取物用975 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.05%吐溫20 (pH 7.5)稀釋(=1:40稀釋液)。
—將下表中的25 各抗體活化的Dynabead與1 mL按1:40稀 釋的3% SDS-腦提取物一起溫育
■ 6E10-Dynabead
■ 3C5-Dynabead
■ 10F4-Dynabead
■ IgG2b-Dynabead
一在6。C下振蕩溫育過夜( 20小時)進(jìn)行免疫沉淀 —Dynabead用MPS固定化 一小心取出上清液并棄去 —Dynabead ^口下進(jìn)4亍'冼^條
■用500 |iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.5) + 0.1% BSA5分鐘兩次
■用5002 mM NaH2P04， 14 mM NaCl (pH 7.5) 3分鐘一次 ■重要事項(xiàng)在最后一次棄去洗滌緩沖液后，將反應(yīng)小瓶離心， 放回MSS上，小心吸出剩余的幾滴液體
■將10 pL 50% CH3CN、 0.5% TFA/H20加到反應(yīng)小瓶中，渦旋 ■將反應(yīng)小瓶在室溫下振蕩溫育10分鐘
■ Dynabead用MSS固定化
■小心取出上清液—IP-洗脫液)，上清液中包含免疫沉淀洗脫出 的A卩種類
D:表面增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì)譜(SELDI-MS):
—將1 (iL IP-洗脫液點(diǎn)樣到H4蛋白芯片陣列(Ciphergen;目錄 號C573-0028)上。
一使樣點(diǎn)在熱培育箱板上干燥 一 CHCA溶液
■ 5 mg CHCA溶于150 |iL乙腈+ 150 1% TFA =母液；在
-2(TC下保存
■母液10 用20 乙腈和20 1% TFA稀釋=CHCA工作
溶液
■將2pLCHCA工作溶液加到各樣點(diǎn)上
—使各樣點(diǎn)在熱的培育箱板上干燥，通過SELDI-MS(表面增強(qiáng) 激光解吸電離質(zhì)譜)進(jìn)行了分析
■條件激光強(qiáng)度200;靈敏度6;質(zhì)量范圍800Da-10000Da; 位置20-80;收集5個
b分析定量測定各個Ap質(zhì)量峰的MZ面積
E.免疫沉淀的AD-腦提取物的蛋白質(zhì)印跡分析 SDS-PAGE:SDS-樣品緩沖液 —0.3 g SDS
—4 mL 1 M Tris/HCl (pH 6.8) —8 mL甘油
_ 70 jiL 1%溴酚藍(lán)的乙醇溶液 —加水至50 mL
電泳緩沖液 —7.5 g Tris 一36g甘氨酸 _ 2.5 g SDS —加水至2.5 L
SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)
—18% Tris/甘氨酸凝膠(Invitrogen Inc.，目錄號EC65055BOX) 將5 (iL IP-洗脫液加到13 nL樣品緩沖液(300 [iL SDS-樣品緩沖液 + 10 1 M Tris-溶液/H20 + 20 |iL 85%甘油)中。將所得18 樣品點(diǎn) 樣到180/。Tris/甘氨酸凝膠(Invitrogenlnc.,目錄號EC65055BOX)上。 在20 mA恒流下進(jìn)行SDS-PAGE。
蛋白質(zhì)印跡法
電泳之后，使用半干印跡槽(Semi Dry Blotting chamber) (BioRad), 使凝膠在75 mA下經(jīng)45分鐘吸印到硝化纖維素膜(7.5 cm x 9 cm, 0.2 |im， BioRad)上。
印跡緩沖液 —6 g Tris 一28.1 g甘氨酸 一 500 mL曱醇
79—加水至2.5 L
蛋白質(zhì)印跡免疫染色 > 材料
—抗Ap抗體6E10 (Signet;目錄號9320)
—抗小鼠-POD(JacksonlmmunoResearch,目錄號715-035-150)
一 4僉測試劑
■ Super Signal West Pico Substmt (Pierce,目錄號34077) 一牛血清白蛋白(BSA， Serva，目錄號11926)
一低脂牛奶(Lasana) 一封閉試劑
■ 2% BSA的PBST溶液 —TBS:
■ 25 mM Tris/HCl
■ 150 mM NaCl緩沖液(Puffer)， (pH 7.5) —TTBS:
■ 25 mM Tris/HCl
■ 150 mM NaCl緩沖液(Puffer) 國0.05%吐溫20, pH7.5 一PBS:
■ 20 mM NaH2P04緩沖液
■ 140 mM NaCl緩沖液(pH 7.5) —PBST:
■ 20 mM NaH2P04緩沖液
■ 140 mM NaCl緩沖液 國0.05%吐溫20， pH7.5
一抗體溶液I:
■ 1 pg/mL 6E10 = 1:1000溶于20 mL 3%低脂牛奶的TBS溶液 一抗體溶液II:
80■ 1:10000稀釋的抗小鼠-POD,溶于20 mL 3。/。低脂牛奶的TBS
溶液 方法
1) 將蛋白質(zhì)印跡在PBS中沸騰10分鐘。
2) 封閉
—使蛋白質(zhì)印跡在6。C下與50mL封閉試劑一起溫育6小時。
3) 洗滌
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TTBS在室溫下洗滌10 分鐘。
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TBS在室溫下洗滌10分鐘。
4) 抗體溶液I:
_棄去洗滌溶液，使蛋白質(zhì)印跡與抗體溶液I 一起在室溫下溫 育4小時。
5) 洗滌
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TTBS在室溫下洗滌10 分鐘。
一棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50mLTTBS在室溫下洗滌10分鐘。
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TBS在室溫下洗滌10 分鐘。
6) 抗體溶液II:
一棄去洗滌溶液，蛋白質(zhì)印跡與抗體溶液n—起在室溫下溫育 i小時。
7) 洗滌
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TTBS在室溫下洗滌10 分鐘—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TTBS在室溫下洗滌10分鐘。
—棄去封閉溶液，蛋白質(zhì)印跡用50 mL TBS在室溫下洗涂10 分鐘。
8)顯影和定量分析 一棄去洗滌溶液。
—將2 mL Super Signal West Pico Substrate Enhancer和2 mL過
氧化物溶液相混合。
一將所得4 mL溶液加到蛋白質(zhì)印跡中，使該印跡避光溫育5分鐘。
一采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(VersaDoc， BioRad)對印跡進(jìn)行了分 析。在30秒鐘、97.5秒鐘、165秒鐘、232.5秒鐘和300秒鐘測定時 間(acquisition time)拍才蟲了 5張照片。
—用軟件包Quantity one, 4.5.0版(BioRad)，對照片上出現(xiàn)的A卩 蛋白條帶的不飽和印跡(強(qiáng)度x mm)進(jìn)行了分析。
結(jié)果見圖2。我們認(rèn)為本文所用3% (重量/體積)的提取方法提取 的是腦內(nèi)總AP肽庫的可溶性形式，因?yàn)榫彌_液組成不足以使聚集的 原纖維狀形式的A卩肽溶解。因此阿爾茨海默病腦提取物中與單克隆 抗體3C5和10F4結(jié)合的A卩肽是可溶性A3-肽。有研究認(rèn)為這些可溶 性A卩種類是阿爾茨海默病相關(guān)種類，因?yàn)樗鼈兣c該病嚴(yán)重性的關(guān)聯(lián) 程度比AD腦內(nèi)存在的Ap-斑塊形式的原纖維狀A(yù)卩的更高(Kuo等 1996， J.Biol. Chem. 271, 4077-4081; Lue等,1999, Am. J. Pathol. 155， 853-862)。因此，抗體10F4和3C5靶向該病相關(guān)A卩種類。另外，比 起總Af3-抗體6E10,單克隆抗體3C5和10F4僅與阿爾茨海默病腦提 取物中總的可溶性A(3庫中的較少部分(subfraction)結(jié)合。剩余的A卩-形式顯然不具有由3C5和10F4識別的A(3-球聚體表位。由于一般不 認(rèn)為這些Ap形式是致神經(jīng)病性的，所以有利的是，不用處理抗體攻 擊這些A(3形式以降低副作用，并且不降低CNS循環(huán)中抗體的有效濃度。因此，可降低治療抗體的劑量，就可得到較好的治療指數(shù)。
實(shí)施例V
通過抗AB球聚體抗體識別AB(l-42)原纖維的SDS-PAGE顯示的半定
量分析
A卩(l-42)原纖維制備物
將1 mg A卩(l陽42) (Bachem，目錄號H-1368)溶于500 0.1% NH4OH/H20后，在環(huán)境溫度下攪拌1分鐘。按10000 g將樣品離心5 分鐘。收集上清液。按照Bradford方法(BIO-RAD Inc.實(shí)驗(yàn)方法)測定 上清液中的A卩(l-42)濃度。
將100 pL A卩(l隱42)/0.10/。 NH4OH與300 pL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)相混合，用2% HC1調(diào)節(jié)pH為7.4。樣品然后在37°C 下溫育20小時。之后，樣品以10000 g離心10分鐘。棄去上清液， 將殘基與400 pL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)混合，通過 劇烈攪拌("渦旋")1分鐘重新懸浮，并以10000 g離心10分鐘。棄去 上清液，將殘余物與400 (iL 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4) 混合，通過劇烈攪拌("渦旋")1分鐘重新懸浮，以10000 g再次離心 IO分鐘。棄去上清液。將殘余物重新懸浮于380(iL20mMNaH2PO4、 140 mM NaCl (pH 7.4)后，劇烈攪拌("渦旋")。
結(jié)合抗Ap抗體與Ap(l-42)原纖維
40 A(3(l-42)原纖維制備物用160 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.05%吐溫20 (pH 7.4)稀釋，并在環(huán)境溫度下攪拌5分鐘，然 后使樣品以10000g離心10分鐘。棄去上清液，將殘余物重新懸浮于 95 (iL20mMNaH2PO4、 140mMNaCl、 0.05%吐溫20 (pH 7.4)中。通 過劇烈攪拌("渦旋")促使重新懸浮。將10 等分量的原纖維制備物與 下列成分各自相混合
a) 10 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4)b) 10 0.5 (ig/|aL 3C5，溶于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH
7.4)
c) 10 pL 0.5 (xg/VL 10F4，溶于20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH
7.4)
d) 10 0.5嗎/[xL 6E10 (Signet目錄號9320)，溶于20 mMNaH2P04、 140mMNaCl(pH7.4)
將樣品在37。C下溫育20小時后，以10000 g離心10分鐘。收集上清液，與20 SDS-PAGE樣品緩沖液混合?！独魵堄辔锱c50 (xL 20mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.025%吐溫20 (pH 7.4)混合，"渦旋"以便重新懸浮。接著，該樣品以10000 g再離心10分鐘。棄去上清液，殘余物與20 20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl、 0.025%吐溫20 (pH7.4)以及20 SDS-PAGE樣品緩沖液相混合。對于電泳，將樣品加到4-20。/。Tris/甘氨酸凝膠上。
SDS-PAGE參數(shù)
SDS樣品緩沖液0.3gSDS
4mL lMTris/HCl， pH 6. 88 mL甘油
1 mL含1%溴酚藍(lán)的乙醇加水至50mL
4-20% Tris/甘氨酸凝膠(Invitrogen目錄號EC6025BOX)
電泳緩沖液7.5gTris
36 g甘氨酸2.5gSDS加水至2.5 L
以20 mA恒《u進(jìn)4亍電;永。
84凝膠染色考馬斯藍(lán)R250結(jié)果見圖3。
不同的抗A卩抗體以及它們對A(3(l-42)原纖維的識別的半定量分
析
抗體、A卩(l-42)原纖維抗體重鏈、抗體輕鏈和Ap(l-42)單體的位置在凝膠旁邊標(biāo)明。由于Ap(l-42)原纖維的大小，它們不能進(jìn)入SDS-PAGE凝膠，可見到在凝膠槽中。
1. 標(biāo)記
2. A卩(l-42)原纖維制備物；對照
3. A卩(l-42)原纖維制備物；+mAb6E10; 20小時，37°C;上清液
4. A卩(l-42)原纖維制備物；+mAb6E10; 20小時，37°C;沉淀
5. A卩(l-42)原纖維制備物；十mAb3C5; 20小時，37°C;上清液
6. A卩(l-42)原纖維制備物；十mAb3C5; 20小時，37°C;沉淀
7. A卩(l-42)原纖維制備物；+mAblOF4; 20小時，37°C;上清液
8. A卩(l-42)原纖維制備物；十mAblOF4; 20小時，37°C;沉淀
通過測定離心后原纖維結(jié)合部分(沉淀部分)和上清液部分中的抗體重鏈的光密度(OD)值，經(jīng)SDS-PAGE分析對原纖維型A卩的相對結(jié)合進(jìn)行了評價。結(jié)合A(3原纖維的抗體可與Ap-原纖維共沉淀，因此存在于沉淀部分中，而非Ap-原纖維結(jié)合的(游離)抗體存在于上清液中。按照下式計(jì)算與Ap-原纖維結(jié)合的抗體的百分比
結(jié)合A(3-原纖維的抗體％ =
OD原纖維部分xlO()o/o/(OD 原纖維部分+ OD上清液部分)
結(jié)果見圖3。在共沉淀實(shí)驗(yàn)中，與識別和結(jié)合AA1-17之間線性A卩-表位的市售抗體6E10 (Signet目錄號9320)相比，A|3球聚體抗體3C5和10F4結(jié)合Ap(l-42)-原纖維的親和力較低。這由以下證據(jù)證實(shí)，即在與A卩(l-42)原纖維一起溫育后，在經(jīng)過沉淀步驟后，3C5和10F4抗體主要保留在上清液中，沒有因與A(3(l-42)原纖維結(jié)合而發(fā)生共沉淀。
在阿爾茨海默病腦內(nèi)，A(3原纖維是總AP肽庫的主要組分。這些原纖維通過用抗Ap-抗體攻擊，由于釋放高含量的A卩而不良副作用的風(fēng)險升高，這繼而可增加微出血的風(fēng)險。在用A卩肽的原纖維狀聚集體的主動免疫方法中觀察到微出血風(fēng)險升高(Bennett和Holtzman，2005， Neurology, 64, 10-12; OrgogozoJ, Neurology, 2003， 61,46-54;Schenk等，2004， Curr Opin Immunol， 16， 599-606)。
實(shí)施例VI
老年APP轉(zhuǎn)基因小鼠和阿爾茨海默病患者腦膜血管中淀粉狀蛋白斑塊形式和淀粉狀蛋白形式的原纖維狀A(yù)B肽與抗體10F4和3C5特異
性反應(yīng)的原位分析抗體10F4和3C5顯示原纖維狀A(yù)卩肽沉積物的染色減少，這表明其治療作用是由結(jié)合可溶性球聚體形式的A卩肽而不是結(jié)合原纖維
狀沉積形式的A(3肽來介導(dǎo)的。由于與原纖維狀A(yù)p肽結(jié)合的抗體可導(dǎo)致聚集體快速溶解，隨后增加可溶性Ap的濃度，這又是被認(rèn)為是有神經(jīng)毒的，并可能導(dǎo)致微出血，因此優(yōu)選作用于可溶性球聚體而不是單體的抗體療法。
方法
對于這些實(shí)驗(yàn)，使用了若干腦材料樣品得自2名AD患者(RZ16和RZ55)的皮質(zhì)組織和得自19月齡Tg2576小鼠(APPSWE # 001349，Taconic， Hudson, NY, USA)或12月齡APP/L小鼠(ReMYND， Leuven，Belgium)的皮質(zhì)組織。
這些小鼠過量表達(dá)帶有家族性阿爾茨海默病突變的人APP，在11月齡左右時，在腦實(shí)質(zhì)中形成(3-淀粉狀蛋白沉積物，在18月齡左右時，在較大腦血管中形成(3-淀粉狀蛋白沉積物。將動物深度麻醉，經(jīng)賁門注入O.l M磷酸緩沖鹽溶液(PBS)以沖洗血液。然后，開顱摘取大腦，縱向剖開。將一個腦半球經(jīng)驟冷冷凍，另一個用4%低聚曱醛中浸泡固定。浸泡固定的腦半球用30%蔗糖的PBS溶液浸泡進(jìn)行冷凍保護(hù)并裝在水凍切片機(jī)中。將整個前腦切成40pm的橫切片，收集到PBS中，用于隨后的染色步驟。
從Brain-Net, Munich, Germany獲得阿爾茨海默病患者的新皮質(zhì)樣品，為冷凍組織，在融化期間用4%低聚曱醛浸泡固定，接著像小鼠組織一樣進(jìn)行處理。
各切片采用下列方案用剛果紅染色
材料
—淀粉狀蛋白染色剛果紅診斷盒(Sigma-Aldrich; HT-60),由NaCl醇溶液、NaOH溶液和剛果紅溶液組成一染色杯
一顯微鏡載玻片SuperfrostPlus和蓋玻片—乙醇、二曱苯、包埋基質(zhì)
試劑
—NaOH按1:100用NaCl溶液稀釋，得到堿性鹽水一堿性鹽水按1:100用剛果紅溶液稀釋，得到堿性剛果紅溶液(用前15分鐘以內(nèi)制備，過濾)
一將切片鋪于載玻片，使之干燥
一在染色杯中，將載玻片先在堿性鹽水中溫育30-40分鐘，然后在堿性剛果紅溶液中溫育30-40分鐘
一用新鮮乙醇漂洗三次，用二曱苯包埋
使用Zeiss Axioplan顯微鏡(Zeiss， Jena, Germany)先對染色進(jìn)行拍照，然后進(jìn)行定量評價。紅色表示斑塊形式的淀粉狀蛋白沉積物和較大腦膜血管中的淀粉狀蛋白沉積物。稍后，對抗體染色的評價集中在這些結(jié)構(gòu)上。
按照下列方案，切片用含有0.07-0.7昭/ml相應(yīng)抗體的溶液溫育，以進(jìn)行染色
材料
一 TBST洗滌溶液(Tris緩沖鹽溶液與吐溫20; 10x濃縮物；DakoCytomation S3306, DAKO， Hamburg, Germany) 1:10在Aquabidest.中)
—0.3%11202/曱醇
—驢血清(Serotec， Dusseldorf, Germany), 5%在TBST中，作為封閉血清
一單克隆小鼠抗球聚體抗體按給定濃度在TBST中稀釋
—第二抗體生物素化驢抗小鼠抗體(Jacksonlmmuno/Dianova,
Hamburg, Germany; 715-065-150;按1:500在TBST中稀釋)
—StreptABComplex (DakoCytomation K 0377， DAKO, Hamburg,
Germany)
一過氧化物酶底物診斷盒二氨基聯(lián)苯胺(-DAB; SK-4100;Vector Laboratories, Burlingame， CA， USA)一 SuperFrost Plus顯微鏡載玻片和蓋玻片—無二曱苯包埋基質(zhì)(Medite, Burgdorf， Germany; X-traKitt)
方法
一將不固定的切片轉(zhuǎn)移到水冷的0.3% H202中，溫育30分鐘
一在TBST緩沖液中洗滌5分鐘
—與驢血清/TBST溫育20分鐘
—與第一抗體在室溫下溫育24小時
—在TBST緩沖液中洗滌5分鐘
—與封閉血清溫育20分鐘
—在TBST緩沖液中洗滌5分鐘—與第二抗體在環(huán)境溫度下溫育60分鐘
—在TBST緩沖液中洗滌5分鐘
—與StreptABComplex在環(huán)境溫度下溫育60分鐘
—在TBST緩沖液中洗滌5分鐘
—與DAB溫育20分鐘
一將切片鋪于載玻片，使載玻片風(fēng)干，用乙醇使載玻片脫水， 包埋載玻片
除了在顯微鏡下目視檢查切片外，另外通過應(yīng)用ImagePro5.0成 像分析系統(tǒng)，目測截取10個從組織學(xué)圖像隨機(jī)選出的斑塊，測定其 平均灰度值，從而對淀粉狀蛋白染色進(jìn)行定量分析。從淀粉狀蛋白斑 密度減去染色材料的平均背景密度，由灰色標(biāo)度值計(jì)算得出光密度值 (0%—周圍背景無斑塊染色，100%—未轉(zhuǎn)移(no tmnsmission)/最大染 色)。分別對抗體6E10/4G8和6G1之間，10F4和3C5之間進(jìn)行了 ANOVA統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)。
結(jié)果
下面描述的所有抗體染色的材料被證實(shí)是親剛果紅的 (congophilic)淀粉狀蛋白沉積物(圖4 (a))。偏好球聚體的抗體10F4和 3C5染色的實(shí)質(zhì)與腦膜親剛果紅的A卩肽沉積物在0.7 pg/mL的相同濃 度下，明顯比抗體6G1和6E10的少(圖4(b、 c、 h))。實(shí)質(zhì)淀粉狀蛋白 斑染色的定量分析顯示所有抗體都與斑塊結(jié)合(密度有統(tǒng)計(jì)顯著性地 超出對照)，與抗體10F4和3C5的結(jié)合顯著小于與參比抗體6E10的 結(jié)合(產(chǎn)生對A卩的N端序列的結(jié)合)，并小于或等于參比抗體4G8 (產(chǎn) 生對A卩的N端序列的結(jié)合)(圖4 (d-g))。
抗體10F4和3C5與淀粉狀蛋白沉積物的結(jié)合小于識別A卩單體 或AP序列組成部分的抗體的結(jié)合。用與原纖維狀A(yù)卩肽結(jié)合的抗體治 療可導(dǎo)致腦組織中淀粉狀蛋白斑的快速溶解，隨即增加可溶性A卩濃 度，這繼而又被認(rèn)為是有神經(jīng)毒的，并可能導(dǎo)致微出血，和/或血管淀粉狀蛋白的快速溶解，這也可能導(dǎo)致微出血。
的。、 。 7 、 、、 '''、 C、
實(shí)施例VII
與抗AB球聚體抗體10F4和3C5免疫沉淀后AD患者CSF中的內(nèi)源
AB(l-42)和AB(l-40)水平
得自AD-腦CSF的A卩種類與Dynabead M-280綿羊抗小鼠IgG 的免疫沉淀(IP)
下列mAb用Dynabead M-280綿羊抗小鼠IgG固定化 —rnAb6E10 (Signet Inc.;目錄號9320) —mAb 3C5 一 mAb 10F4 —mAb 8F5
Dynabead M-280綿羊抗小鼠IgG:
綿羊抗小鼠IgG (Invitrogen Inc.,目錄號112.02)與磁性微珠 (Dynabead)共價結(jié)合。
用單克隆小鼠抗體活化的Dynabead
—將Dynabead的貯備懸液(Dynabead M-280綿羊抗小鼠IgG， Invitrogen; Prod. No. 112.02)小心地振蕩以免起泡沫
—在無菌條件下取出lmL，并轉(zhuǎn)移到1.5mL反應(yīng)小瓶中
一 Dynabead用1 mL免疫沉淀(IP)-洗涂緩沖液(IP-洗滌緩沖液 PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1% (重量/體積)BSA) 洗滌3次5分鐘。
在洗滌過程中，小心地棄去上清液，而將Dynabead固定在使用 磁力分離器支架(MSS)上的反應(yīng)小瓶一側(cè)
—將經(jīng)洗滌的Dynabead與40呢A卩-抗體/1 mL PBS、 0.1% (重量/體積)BSA —起溫育，
—在4。C下振蕩溫育過夜進(jìn)行活化
—活化Dynabead用1 mL IP-洗滌緩沖液(PBS (20 mM NaH2P04、 140 mM NaCl (pH 7.4))、 0.1% (重量/體積)BSA)洗滌4次30分鐘(再用 MSS洗滌)
—將活化Dynabead用1 mL PBS、 0.1% (重量/體積)BSA、 0.02% (重量/體積)疊氮化鈉重新懸浮；渦旋后短暫離心 —將抗體活化的Dynabead保存在4。C下備用
CSF樣品制備物
將得自阿爾茨海默病患者的400 iaL CSF加到4 完全蛋白酶抑 制劑混合物(Rochelnc.目錄號1697498，將l片溶于lmL水)中，將 0.8 pL 500 mM PMSF溶于曱醇。10分鐘后，加入1.6 mL 20 mM NaH2P04、 140mMNaCl、 0.05%吐溫20 (pH 7.4) (PBST)。
得自人AD-CSF的A卩種類的免疫沉淀
將250 等分量的制成的CSF樣品加到25 (iL抗A卩-Dynabead 懸液中
—在6。C下攪拌16小時以進(jìn)行免疫沉淀。隨后微珠用1 mL PBS/0.1% (重量/體積)BSA洗滌3次5分鐘。最后用1 mL 10 mM Tris/HCL (pH 7.5)緩沖液洗滌一次3分鐘。在洗滌過程中，小心地棄 去上清液，同時將Dynabead固定在使用磁力分離器支架(MSS)上的反 應(yīng)小并瓦一側(cè)
在最終洗滌步驟后，徹底除去殘余上清液。
通過將25 |iL不含卩-巰基乙醇的樣品緩沖液(0.36 M Bistris、 0.16 M iV-二(羥乙基)甘氨酸、1% SDS (重量/體積)、15% (重量/體積)蔗糖、 0.004% (重量/體積)溴酚藍(lán))力口到Eppendorff管中，在加熱器上于95°C 加熱5分鐘，從Dynabead中除去Ap肽和各個抗體。冷卻至室溫后，將Dynabead固定在使用磁力分離器支架(MSS)的反應(yīng)小瓶一側(cè)，將上 清液轉(zhuǎn)移到另 一只Eppendorff管(IP洗脫液)中。
依次用尿素-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法對A(3免疫沉淀物進(jìn)行分析
按照文獻(xiàn)方法，先后用8M尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和蛋白 質(zhì)印跡分析對A(31-40和Api-42種類進(jìn)行了定量測定(前者參見H. W. Klafki等，Analytical Biochemistry 237， 24-29 (1996),后者參見J. Wiltfang等，J. of Neurochemistry 81， 481-496， 2002。在本實(shí)驗(yàn)方法 中只有兩個小的變動
1) 調(diào)節(jié)積層膠的SDS濃度至0.25% (重量/體積)而不是0.1% (重 量/體積)。
2) 對于蛋白質(zhì)印跡法，抗體1E8 (Senetek Drug Delivery Technologies Inc. St. Louis, MO, USA)用抗人淀粉狀蛋白卩(N) (82E1) 小鼠IgGmAb(IBL，目錄號10323)替換。
將15 |iL等分量的免疫沉淀樣品IP洗脫液加到8 M尿素PAGE 上。以100V開始電泳(15分鐘)，以60V持續(xù)電泳。當(dāng)負(fù)載染料的藍(lán) 色樣品電泳前緣距凝膠末端尚有0.5 cm時，停止電泳。
蛋白質(zhì)印跡方法
用7.5 cm x 9 cm硝化纖維0.45 (im (BioRad Inc.),在半干印跡槽 (BioRadInc.， 45分鐘，75mA)中進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
印跡緩沖液6gTris; 28.1g甘氨酸；500 mL甲醇；用水調(diào)至 2.5 L。
將硝化纖維印跡在PBS中于IO(TC煮沸10分鐘。在室溫下，通 過用50mL5。/。(重量/體積)BSA/BST處理1小時使印跡飽和，在用以 下緩沖液進(jìn)行2次洗滌步驟后，除去流動相用50 mL TTBS (25 mM Tris/HCl、 150mMNaCl緩沖液、0.05%吐溫20 (pH 7.5))，室溫下10 分鐘，接著用50mLTBS(25mMTris/HCl、 150 mM NaCl緩沖液(pH7.5))，室溫下IO分鐘。
對于進(jìn)一步顯色，從印跡上棄去最終的洗滌緩沖液，在6。C下， 加入15 mL抗體I溶液(0.2嗎/mL 82E1 = 1:500/3% (重量/體積)脫脂奶 粉(LasanaInc.)的15 mLTBS溶液)達(dá)20小時。棄去緩沖液后，進(jìn)行如 上所述的三次洗滌步驟。使印跡與抗體溶液II(抗小鼠-POD與15 mL 3% (重量/體積)脫脂奶粉的15mLTBS溶液的1:10000稀釋液)在室溫 下溫育1小時。通過如上所述的三次洗滌步驟后棄去緩沖液。
棄去最后的洗滌緩沖液后，使2 mL Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrat Enhancer與2 mL過氧化物溶液混合。將 新配制的溶液倒入避光預(yù)溫育5分鐘的印跡上。使用VersaDoc Imaging 系統(tǒng)(BioRad)記錄化學(xué)發(fā)光。
成像參數(shù)
曝光時間180秒鐘
30秒鐘、60秒鐘、120秒鐘和180秒鐘后拍照。 從曝光時間180秒鐘的照片得到結(jié)果。
與市售抗體6E10 (文獻(xiàn)指出不論構(gòu)象識別所有的A(3-形式)相比， 本發(fā)明的抗球聚體抗體10F4和3C5對阿爾茨海默病患者CSF中的 A卩(l-42)肽和A卩(l-40)肽具有較低的親和力。CSF A(3肽形式更新率高 (Bateman等，Nature Medicine, 2006， 12 (7):856-61),因此與疾病相 關(guān)的A卩種類不同。因此，在阿爾茨海默病被動免疫治療策略以降低 不良副作用風(fēng)險的情況下，不應(yīng)不靶向CSFAp-形式。值得注意的是， 在早期研究(Barghom等，J Neurochem. 2005; 95 (3): 834-847)中，抗 A卩-球聚體抗體8F5不識別并且不結(jié)合阿爾茨海默病患者CSF中的 A(3-肽。該項(xiàng)早期研究是使用夾心ELISA方法進(jìn)行的。相比之下，當(dāng) 使用上述免疫沉淀和尿素PAGE方法時，同一抗體8F5的確識別阿爾 茨海默病患者CSF中的A卩肽(參見圖5)。因此，夾心ELISA方法產(chǎn)生了假陰性結(jié)果；因此，對于檢測CSF中的A(3-肽，應(yīng)當(dāng)采用本文所 述免疫沉淀和尿素PAGE方法。
權(quán)利要求
1.一種分離抗體，所述抗體對Aβ(1-42)球聚體的親和力比對選自以下的至少一種淀粉狀β蛋白的親和力更高腦脊液(CSF)中存在的Aβ(1-42)肽和b)CSF中存在的Aβ(1-40)肽。
2. —種分離抗體，所述抗體對Ap(l-42)球聚體的結(jié)合親和力比對 選自以下的至少一種淀粉狀(3蛋白的結(jié)合親和力更高a) Ap(l-42)單 體，b) A(3(l-40)單體，c) A(3(l-42)原纖維和d)可溶性淀粉狀蛋白前體 蛋白a(sAPPa)。
3. 權(quán)利要求2的分離抗體，其中與結(jié)合CSF中存在的淀粉狀卩 蛋白的親和力相比，所述抗體以更小的親和力與非CSF中存在的淀粉 狀J3蛋白結(jié)合。
4. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體是單克隆 抗體。
5. 權(quán)利要求4的分離抗體，其中所述抗體是重組抗體。
6. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體是人抗體 或人源化抗體。
7. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體作為單克 隆抗體結(jié)合至少一個表位，所述單克隆抗體選自可獲自標(biāo)注為美國 典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤的單克隆抗體10F4和 可獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406的雜交瘤的 單克隆抗體3C5。
8. —種分離抗體，所述抗體包含SEQIDNO:5。
9. 一種分離抗體，所述抗體包含SEQIDNO:6。
10. 權(quán)利要求的分離抗體9，所述抗體還包含SEQIDNO:5。
11. 一種分離抗體，所述抗體包含SEQIDNO:7。
12. —種分離抗體，所述抗體包含SEQIDNO:8。
13. 權(quán)利要求12的分離抗體，所述抗體還包含SEQIDNO:7。
14. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體包含至 少一個選自以下的氨基酸序列a)單克隆抗體(10F4)的重鏈CDR3的 氨基酸序列和輕鏈CDR3的氨基酸序列，所述單克隆抗體可獲自標(biāo)注 為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤，和b)單克隆 抗體(3C5)的重鏈CDR3的氨基酸序列和輕鏈CDR3的氨基酸序列，所 述單克隆抗體可獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7406的雜交瘤。
15. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體包含至 少一個選自以下的氨基酸序列a)單克隆抗體(10F4)的重鏈CDR2的 氨基酸序列和輕鏈CDR2的氨基酸序列，所述單克隆抗體可獲自標(biāo)注 為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤，和b)單克隆 抗體(3C5)的重鏈CDR2的氨基酸序列和輕鏈CDR2的氨基酸序列，所 述單克隆抗體可獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7406的雜交瘤。
16. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的分離抗體，其中所述抗體包含至 少一個選自以下的氨基酸序列a)單克隆抗體(10F4)的重鏈CDR1的 氨基酸序列和輕鏈CDR1的氨基酸序列，所述單克隆抗體可獲自標(biāo)注 為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤，和b)單克隆 抗體(3C5)的重鏈CDR1的氨基酸序列和輕鏈CDR1的氨基酸序列，所 述單克隆抗體可獲自標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7406的雜交瘤。
17. —種分離抗體，所述分離抗體包含至少一個選自以下氨基酸 序歹'l的CDR : a) SHYA額；b) YIDYSGSTRYLPSLKS ; C) GSGYFYGMDY ; d) HASQ畫VWLS ; e) KASNLHT ; f) QQGQSYPYT ; g) NYLIE ; h) V證GSGDTNYNENFKG ; i) GVITTGFDY; j) RASGNIHNYLA; k) NAKTLAD和1) QHFWSSPRT。
18. —種雜交瘤，所述雜交瘤被標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏號PTA-7808。
19. 單克隆抗體(10F4),所述單克隆抗體可獲自標(biāo)注為美國典型 培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7808的雜交瘤。
20. —種雜交瘤，所述雜交瘤被標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏號PTA-7406。
21. 單克隆抗體(3C5)，所述單克隆抗體可獲自標(biāo)注為美國典型培 養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406的雜交瘤。
22. —種分離核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要 求2的抗體。
23. 權(quán)利要求22的分離核酸分子，其中所述分子的核苷酸序列包 含至少一個選自以下的序列SEQIDN0:1、 SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
24. —種載體，所述載體包含權(quán)利要求23的所述分離核酸分子。
25. —種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求24的所述載體。
26. —種制備抗體的方法，該方法包括將權(quán)利要求25的所述宿主 細(xì)胞在適于產(chǎn)生所述抗體的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間。
27. —種分離抗體，所述抗體用權(quán)利要求26的所述方法制備。
28. —種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1的所述抗體和權(quán)利 要求2的所述抗體或其組合。
29. 權(quán)利要求28的組合物，其中所述組合物是藥物組合物，并且 還包含藥學(xué)上可接受的載體。
30. —種單克隆抗體，所述抗體包含由至少一個選自以下的核苷 酸序列編碼的氨基酸序列SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3 和SEQ ID NO:4。
31. 權(quán)利要求30的分離抗體，其中所述抗體選自以下的單克隆抗 體由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號PTA-7406的雜交瘤產(chǎn) 生的單克隆抗體及由標(biāo)注為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號 PTA-7808的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。
32. 權(quán)利要求30的分離抗體，其中所述抗體包含至少一個選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:5、 SEQIDNO:6、 SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
33. —種用于治療或預(yù)防需要所述治療或預(yù)防的患者的淀粉樣變 性的方法，該方法包括以足以實(shí)現(xiàn)所述治療或預(yù)防的量給予所述患者 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述淀粉樣變性是阿爾茨海默病或 唐氏綜合征淀粉樣變性。
35. —種分離抗體，所述抗體與患有淀粉樣變性的患者腦內(nèi)的淀 粉狀P蛋白的至少一個表位結(jié)合。
36. 權(quán)利要求35的分離抗體，其中所述抗體由具有選自 PTA-7406和PTA-7808的ATCC保藏號的雜交瘤產(chǎn)生。
37. —種在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷該病的方法，該 方法包括以下步驟a. 從所述患者體內(nèi)分離出生物樣品；b. 在足以形成抗原/抗體復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與權(quán) 利要求1或權(quán)利要求2的所述分離抗體接觸一段時間；c. 檢測所述樣品中所述抗原/抗體復(fù)合物的存在情況，所述復(fù)合 物存在表明在所述患者中診斷出阿爾茨海默病。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述抗原是球聚體。
39. —種在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷該病的方法，該 方法包括以下步驟a. 從所述患者體內(nèi)分離出生物樣品；b. 在足以形成抗體/抗原復(fù)合物條件下，使所述生物樣品與抗原 接觸一段時間；c. 在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合的條件下，將所述綴合物加到 所得抗體/抗原復(fù)合物中一段時間，其中所述綴合物包含權(quán)利要求1或 權(quán)利要求2的所述分離抗體，所述分離抗體連有能夠產(chǎn)生可^r測信號 的信號產(chǎn)生化合物；和d.通過檢測所述信號產(chǎn)生化合物產(chǎn)生的信號，以檢測可能存在于 所述生物樣品中的抗體的存在情況，所述信號表明在所述患者中診斷 出阿爾茨海默病。
40. 權(quán)利要求28的方法，其中所述抗原是球聚體。
41. 一種在疑似患有阿爾茨海默病的患者中診斷該病的方法，該 方法包括以下步驟a. 從所述患者體內(nèi)分離出生物樣品；b. 在足以形成抗抗體/抗體復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與 抗抗體接觸一段時間，其中所述抗抗體對權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的 所述抗體有特異性，所述復(fù)合物含有存在于所述生物樣品中的抗體；c. 在足以使綴合物與結(jié)合抗體結(jié)合的條件下，將所述綴合物加到 所得到的抗抗體/抗體復(fù)合物中 一段時間，其中所述綴合物包含抗原， 所述抗原能夠與產(chǎn)生可檢測信號的信號產(chǎn)生化合物結(jié)合；和d. 檢測由所述信號產(chǎn)生化合物產(chǎn)生的信號，所述信號表明在所述 患者中診斷出阿爾茨海默病。
42. —種疫苗，所述疫苗包含a)權(quán)利要求1的所述分離抗體、 權(quán)利要求2的所述分離抗體或其組合，和b)藥學(xué)上可接受的佐劑。
43. —種鑒定化合物的方法，所述化合物適于使預(yù)測將發(fā)生阿爾 茨海默病的患者主動免疫，該方法包括以下步驟a) 在足以使所述一種或多種化合物與權(quán)利要求1或權(quán)利要求2 的所述分離抗體結(jié)合的條件下，將一種或多種目標(biāo)化合物暴露于權(quán)利 要求1或權(quán)利要求2的所述分離抗體中 一段時間；和b) 鑒定出與權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的所述分離抗體結(jié)合的化 合物，所述鑒定出的化合物可用于使預(yù)測將發(fā)生阿爾茨海默病的患者 主動免疫。
44. 一種診斷盒，所述診斷盒包括a)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的分離抗體，和b)包含連有信 號產(chǎn)生化合物的抗體的綴合物，其中所述綴合物的所述抗體不同于所述的分離抗體。
45. —種診斷盒，所述診斷盒包括a)抗權(quán)利要求1或權(quán)利要求2 的所述分離抗體的抗抗體，和b)包含連有信號產(chǎn)生化合物的抗原的綴 合物。
46. 權(quán)利要求46的診斷盒，其中所述抗原是球聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于治療和診斷阿爾茨海默病的單克隆抗體。具體地講，本發(fā)明涉及稱為10F4和3C5的單克隆抗體以及具有類似性質(zhì)的其它單克隆抗體(例如鼠、人或人源化單克隆抗體)。
文檔編號A61K39/395GK101652146SQ200780050665
公開日2010年2月17日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者A·R·施特里賓格, B·拉布科夫斯基, H·希倫, P·凱勒, S·巴霍恩, U·埃貝爾特 申請人:艾博特公司;艾博特股份有限兩合公司