專利名稱：：用于治療病理性血管生成和血管通透性的組合物和方法用于治療病理性血管生成和血管通透性的組合物和方法關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)資助的政府支持下做出，批予號(hào)為1R01HL77671-01。政府在本發(fā)明中具有確定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：盡管任何脊椎動(dòng)物器官系統(tǒng)的脈管系統(tǒng)的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，由一群生長(zhǎng)因子和導(dǎo)向信號(hào)精心安排(Jain等，2003)，但最近的研究已經(jīng)極大地增加了我們對(duì)調(diào)控血管生成的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的理解。例如，越來越清楚，指導(dǎo)軸突路徑和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的分子程序，在產(chǎn)生成熟血管網(wǎng)絡(luò)的高度立體模式中，具有重要的作用(Carmeliet等，2005;Urness等，2004;以及Jones等2007)。在哺乳動(dòng)物中被稱為血管發(fā)生(vasculogenesis)的血管發(fā)育起始階段中，內(nèi)皮細(xì)胞分化、遷移并接合，形成中央軸向管、背主動(dòng)脈和主靜脈。第二個(gè)階段被稱為血管生成(angiogenesis)，其特征為從初生叢萌發(fā)新血管，形成成熟的循環(huán)系統(tǒng)。VEGF(或VPF)對(duì)于這前兩個(gè)階段都是關(guān)鍵的血管發(fā)生過程中內(nèi)皮細(xì)胞的分化和存活，以及血管生成過程中的增殖和通透性。在該血管生成重構(gòu)之后，內(nèi)皮分泌血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的召集和分化。然后，血管平滑肌細(xì)胞分泌血管生成素，它確保內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞之間適當(dāng)?shù)南嗷プ饔?。最后，血管平滑肌?xì)胞沉積基質(zhì)蛋白，例如彈性蛋白，它抑制血管平滑肌細(xì)胞的增值和分化，從而穩(wěn)定了成熟的血管。因此，為了建立和維持成熟的血管網(wǎng)絡(luò)，血管的內(nèi)皮和平滑肌室必須通過自分泌和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)相互作用。形成血管內(nèi)皮的內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙(細(xì)胞連接)根據(jù)組織的類型和生理狀態(tài)受到嚴(yán)格調(diào)控。例如，在成熟的血管床中，內(nèi)皮細(xì)胞的行為不是彼此獨(dú)立的；相反，它們形成了單層，防止蛋白、流體(flud)和細(xì)胞從內(nèi)皮腔移動(dòng)到周圍組織中。即使在發(fā)育好之后，血管系統(tǒng)也持續(xù)暴露于引起受傷、局部缺血和炎癥的事件、狀況或病原體中，它們通常導(dǎo)致細(xì)胞因子和血管生成因子的釋放，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。VEGF最初是基于它誘導(dǎo)血管滲漏的能力，作為血管通透因子(VPF)而被描述、純化和克隆的。VEGF導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接去穩(wěn)定，產(chǎn)生內(nèi)皮通透性，刺激內(nèi)皮增殖和遷移，和促進(jìn)血管的萌發(fā)和水腫。這些功能用于使穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)解構(gòu)，產(chǎn)生滲漏的新血管。在許多情況下，希望響應(yīng)損傷、局部缺血和炎癥釋放細(xì)胞因子和血管生成因子，因?yàn)檫@樣的響應(yīng)導(dǎo)致恢復(fù)性或愈合過程的啟動(dòng)。但是，過度的血管生成和血管滲漏(例如內(nèi)皮高通透性)加強(qiáng)了幾種疾病和病理狀況的病理學(xué)。例如，在發(fā)達(dá)國家，視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管床中的病理性血管生成和內(nèi)皮高通透性，是災(zāi)難性視覺喪失的最常見原因。新的以及功能障礙的血管滲漏、出血或刺激纖維變性，這些又能促成水腫、出血、或危及視覺的視網(wǎng)膜脫落。共有這種發(fā)病機(jī)理的主要疾病包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、非增殖性糖尿病性黃斑水腫(DME)和與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)(Dorrell等，2007;Afzal等，2007)。有大約一千五百萬年齡超過65歲的美國人患有AMD，這些患者中的10%將由于脈絡(luò)膜新生血管而經(jīng)歷視覺喪失。此外，超過一千六百萬美國人患有糖尿病，超過400,000新患者患有視網(wǎng)膜水腫或新生血管。鑒于接下來20年中，全世界目前數(shù)量為2億的糖尿病患者可能會(huì)加倍，這些患者中超過8%將患有微血管并發(fā)癥，將會(huì)經(jīng)歷糖尿病性眼病引起的視覺喪失的患者數(shù)量不幸有快速增加的趨勢(shì)。盡管流行程度低于DR、DME和AMD，但早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)和缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(IRVO)也與視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管床中的病理性血管生成和內(nèi)皮高通透性有關(guān)，并且缺少有效的治療方法。除了眼疾之外，病理性血管生成也與腫瘤的形成和生長(zhǎng)相關(guān)。腫瘤血管生成是滲透到腫瘤的生長(zhǎng)中、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和氧并除去廢物的血管網(wǎng)絡(luò)的增殖。隨著血管生成，腫瘤的生長(zhǎng)不斷進(jìn)行，沒有它，腫瘤的生長(zhǎng)停止。腫瘤的血管生成實(shí)際上隨著惡性腫瘤細(xì)胞釋放將信號(hào)傳送到周圍正常宿主組織的分子而開始。這種信號(hào)傳導(dǎo)激活了宿主組織中的某些基因，這些基因又制造蛋白，以促進(jìn)新血管的生長(zhǎng)。血管生成受到活化劑和抑制劑分子的調(diào)控。在正常條件下，抑制劑占優(yōu)勢(shì)，阻斷生長(zhǎng)。但是，在腫瘤形成和生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞釋放出血管生成活化劑，導(dǎo)致這些活化劑的數(shù)量/濃度增加。血管生成活化劑的這種增加引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，最終形成新血管。有十種以上不同的蛋白以及幾種較小的分子已經(jīng)被鑒定為"血管生成性的"。在這些分子中，兩種蛋白對(duì)于腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)似乎是最重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。VEGF和bFGF由許多種癌細(xì)胞和某些類型的正常細(xì)胞產(chǎn)生。VEGF和bFGF首先在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部合成，然后分泌到周圍組織中。當(dāng)它們遇到內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們與位于細(xì)胞外表面上、被稱為受體的特異性蛋白結(jié)合。VEGF或bFGF與其適合的受體的結(jié)合激活了一系列中繼蛋白(relayproteins)，將信號(hào)傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞的核中。核信號(hào)最終促使一組基因制造出新的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)所需的產(chǎn)物。內(nèi)皮細(xì)胞被VEGF或bFGF的活化啟動(dòng)了一系列朝向產(chǎn)生新血管的步驟。首先，活化的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，這是一類特殊的降解酶。這些酶然后從內(nèi)皮細(xì)胞釋放到周圍組織中。MMPs分解了填充在細(xì)胞之間的空間、由蛋白和多糖形成的細(xì)胞外基質(zhì)支持物質(zhì)。該基質(zhì)的分解使得內(nèi)皮細(xì)胞可以遷移。當(dāng)它們遷移到周圍組織中時(shí)，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞開始分裂并組織成中空的管子，逐漸演變成成熟的血管網(wǎng)絡(luò)。以有害的血管通透性為特征的其它疾病和病癥包括，例如與腦腫瘤有關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、麥格綜合征(Meigs'syndrome)、肺炎、腎病綜合征、心包腔積液、胸膜腔積液、急性肺損傷、炎性腸病、中風(fēng)中的局部缺血/再灌注損傷、心肌梗塞、以及導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokinestorm)的感染性和非感染性疾病。盡管細(xì)胞因子風(fēng)暴是健康和強(qiáng)有力的免疫系統(tǒng)的全身性表現(xiàn)，但它是通過快速增殖和高度活化的T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞引起的過度增大的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致了超過150種炎性介質(zhì)(細(xì)胞因子，氧自由基以及凝血因子)的釋放。血清中的促炎細(xì)胞因子(例如腫瘤壞死因子-a，白介素-l和白介素-6)和抗炎性細(xì)胞因子(例如白介素-10和白介素-l受體拮抗劑)都升高了，這些細(xì)胞因子激烈的并通常是致命的相互作用被稱為"細(xì)胞因子風(fēng)暴"。細(xì)胞因子風(fēng)暴可以在許多感染性和非感染性疾病中發(fā)生，包括例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血病、禽流感、天花、以及全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)。在沒有及時(shí)干預(yù)的情況下，細(xì)胞因子風(fēng)暴可以導(dǎo)致永久性肺損傷，在許多情況下導(dǎo)致死亡。許多患者將發(fā)生ARDS，其特征為與容積過載(voumeoverload)無關(guān)的肺水腫，或左心室功能減退。促成細(xì)胞因子風(fēng)暴的疾病的末期癥狀可能包括下面的一種或多種高血壓，心動(dòng)過速，呼吸困難，發(fā)燒，局部缺血或組織灌注不足，無法控制的出血，嚴(yán)重代謝失調(diào)，以及多系統(tǒng)器官衰竭。促成細(xì)胞因子風(fēng)暴的感染造成的死亡通常可歸因于由細(xì)胞因子風(fēng)暴造成的癥狀，因此，不是直接由相關(guān)的病原體引起。例如，在嚴(yán)重流感感染例如禽流感或"鳥流感"中的死亡，典型情況下是ARDS的結(jié)果，它由病毒感染引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴所致。由于與血管生成和血管通透性有關(guān)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)上集中了許多關(guān)注。能夠降低VEGF介導(dǎo)的血管生成和血管水腫的產(chǎn)品目前已有銷售，并可用于患者。例如，抗VEGF抗體Ranibizumab(Lucentis)，Bevacizumab的抗體片段(Avastin)，其本身為VEGF抗體(Rosenfeld等，2006;Brown等，2006)，是可商購的，用于AMD的治療。這種產(chǎn)品的開發(fā)和成功，激發(fā)了對(duì)于治療與病理性血管生成或內(nèi)皮高通透性有關(guān)的疾病和病癥的替代策略的巨大商業(yè)興趣。用于抑制VEGF信號(hào)傳導(dǎo)的其它方法包括，例如，抗VEGF適配體、可溶性VEGF受體胞外結(jié)構(gòu)域、受體酪氨酸激酶抑制劑、以及針對(duì)VEGF或其受體的siRNA。對(duì)于AMD來說，這樣的策略已經(jīng)顯示出有前景。然而，對(duì)于治療與病理性血管生成和血管滲漏有關(guān)的其它疾病的類似方法，仍然存在著巨大的興趣。此外，因?yàn)閂EGF僅僅是對(duì)血管生成和血管通透性有貢獻(xiàn)的許多血管生成、通透性和炎性因子中的一個(gè)，所以影響VEGF功能性以及其它血管生成、通透性和炎性因子功能性的鑒定途徑以及開發(fā)方法，一直具有價(jià)值。發(fā)明概述總的來說，本文描述了用于抑制血管通透和病理性血管生成的化合物、組合物和方法。本文還描述了用于生產(chǎn)和篩選能夠抑制血管通透和病理性血管生成的化合物和組合物的方法。藥物組合物包括在本文描述的組合物中。本文描述的組合物可用于例如抑制血管通透和病理性血管生成的方法，包括抑制由特定的血管生成、通透性和炎性因子例如VEGF、bFGF和凝血酶誘導(dǎo)的血管通透和病理性血管生成的方法。本文還提供了用于治療特定疾病和病癥的方法。通過參考具體說明，包括實(shí)施例和材料與方法，權(quán)利要求書，附圖包括附圖簡(jiǎn)述，本文提供的說明的其它方面將變得明了。附圖簡(jiǎn)述結(jié)合在本說明書中并構(gòu)成了本說明書的一部分的附圖，說明了所公開的方法和組合物的幾個(gè)實(shí)施方案，并與說明書結(jié)合在一起，用于解釋本公開的方法和組合物的原理。本文中使用的術(shù)語"模擬物"是指不含活性Slit蛋白的假制備物。圖1顯示了Robo4介導(dǎo)的血管導(dǎo)向需要受體的胞質(zhì)尾區(qū)。顯示了48hpfTG(fli:egfp)yl胚胎的共聚焦顯微鏡結(jié)果，(A)未注射的，(B)注射了robo4嗎啉代，(C)robo4嗎啉代和野生型鼠robo4RNA，以及(D)robo4嗎啉代和robo4AtailRNA。定量顯示在圖7中。圖1E顯示了在robo4morphant胚胎中血管導(dǎo)向缺陷的模型。在左側(cè)和右側(cè)圖組中分別顯示了5X和20X圖像。DLAV-背部縱向吻合血管。PAV二脊索旁血管。DA^背主動(dòng)脈。PCV:后主靜脈。圖2顯示了Robo4依賴性的趨觸性抑制需要胞質(zhì)尾區(qū)的氨基末端半部。圖2A顯示了在趨觸性遷移分析中使用的cDNA構(gòu)建體的示意圖。TM代表跨膜結(jié)構(gòu)域。CC0和CC2是在Robo家族成員中發(fā)現(xiàn)的保守細(xì)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。HA^血凝素表位。圖2B和圖2C顯示了HEK293細(xì)胞用GFP和指定的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，并在36小時(shí)后在用5pg/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2包被的膜上進(jìn)行趨觸性遷移。Robo4構(gòu)建體的表達(dá)通過Western印跡進(jìn)行證實(shí)(小插圖)。結(jié)果表示成平均值士SE。圖3顯示了在HEK293細(xì)胞中，Robo4與Hic-5和樁蛋白的相互作用。圖3A顯示了HEK293細(xì)胞用Robo4胞質(zhì)尾區(qū)-HA和Hic-5-V5、或空載體(pcDNA3)和Hic-5-V5共轉(zhuǎn)染。Robo4用HA抗體免疫沉淀，Hic-5使用V5抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖3B顯示了用針對(duì)Hic-5和樁蛋白的抗體來探測(cè)來自Cho-Kl、HEK293和NIH3T3細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液。圖3C顯示了HEK293細(xì)胞用樁蛋白-V5和Robo4胞質(zhì)尾區(qū)-HA或空載體(pcDNA3)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。Robo4從細(xì)胞裂解液中用HA抗體免疫沉淀，樁蛋白使用V5抗體通過western印跡進(jìn)行檢觀!J。圖3D顯示了HEK293細(xì)胞用全長(zhǎng)的Robo4-HA和樁蛋白-V5轉(zhuǎn)染，并用Slit2刺激5分鐘。Robo4從細(xì)胞裂解液中用HA抗體免疫沉淀，樁蛋白使用V5抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖4顯示了樁蛋白與Robo4通過Robo4依賴性的趨觸性抑制所需的新基序發(fā)生相互作用。圖4A顯示了在B圖塊中顯示的pulldown分析中使用的GST-Robo4融合蛋白的示意圖。圖4B顯示了從大腸桿菌(E.coli)中純化GST-Robo4融合蛋白，并與重組純化的樁蛋白溫育。樁蛋白使用樁蛋白特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖4C顯示了在圖D中描述的pulldown分析中使用的GST-Robo4融合蛋白的示意圖。圖4D顯示了從大腸桿菌中純化GST-Robo4融合蛋白，并與重組純化的樁蛋白溫育。樁蛋白使用樁蛋白特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖4E顯示了從大腸桿菌中純化GST-Robo4野生型或GST-Robo4APIM，并與重組純化的樁蛋白或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的Mena-V5溫育。樁蛋白和Mena分別使用樁蛋白特異性單克隆抗體和V5抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖4F顯示了HEK293細(xì)胞用GFP和指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并在36小時(shí)后在用5|ig/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2包被的膜上進(jìn)行趨觸性遷移。Robo4構(gòu)建體的表達(dá)通過Western印跡進(jìn)行證實(shí)(小插圖)。結(jié)果表示成平均值土SE。圖5顯示了Robo4通過使Rac失活來抑制細(xì)胞鋪展。圖5A、圖5D和圖5G顯示了HEK293細(xì)胞用GFP和指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并在36小時(shí)后在用5嗎/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2包被的蓋玻片上進(jìn)行細(xì)胞鋪展分析。結(jié)果表示成平均值士SE。圖5B和圖5E顯示了HEK293細(xì)胞用指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并在36小時(shí)后鋪在用5嗎/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2包被的皿上。在溫育5分鐘后，將細(xì)胞裂解，用GST-PBD沉淀GTP墨Rac。Rac使用Rac特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖5H顯示了將HUVEC與Slit2溫育60分鐘，用25ng/mlVEGF刺激5分鐘，裂解，并用GST-PBD沉淀GTP-Rac。Rac使用Rac特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。(C)和(F)粘附誘導(dǎo)的以及(I)VEGF誘導(dǎo)的Rac活化的Sm2依賴性抑制，通過密度計(jì)量法進(jìn)行定量。結(jié)果表示成平均值iSE。圖6顯示了樁蛋白ALim4突變體不與Robo4相互作用，或不支持Slit2-Robo4介導(dǎo)的抑制細(xì)胞鋪展。圖6A顯示了用于B、C和D圖塊中的樁蛋白構(gòu)建體的示意圖。圖6B顯示了將HEK293細(xì)胞用Robo4胞質(zhì)尾區(qū)-HA和樁蛋白-V5、或空載體(pcDNA3)和樁蛋白-V5進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。使用HA抗體將Robo4從細(xì)胞裂解液中免疫沉淀，樁蛋白使用V5抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖6C顯示了將HEK293細(xì)胞用Robo4胞質(zhì)尾區(qū)-HA與野生型樁蛋白-V5或樁蛋白ALim4-V5進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。Robo4用HA抗體進(jìn)行免疫沉淀，樁蛋白使用V5抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖6D顯示了在HEK293細(xì)胞中使用siRNA將內(nèi)源樁蛋白敲除，并用野生型雞樁蛋白或雞樁蛋白ALim4進(jìn)行重構(gòu)。敲除和重構(gòu)使用樁蛋白抗體通過western印跡進(jìn)行可視化，并通過密度計(jì)量法進(jìn)行定量。測(cè)得樁蛋白的表達(dá)為野生型水平的35%。圖6E顯示了進(jìn)行過敲除/重構(gòu)的HEK293細(xì)胞，在用5i!g/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2包被的蓋玻片上進(jìn)行鋪展分析。結(jié)果表示成平均值iSE。圖7顯示了樁蛋白相互作用基序是排斥性血管導(dǎo)向所需要的。圖7A顯示了在未注射的(n=66)、注射了robo4嗎啉代(n=56)、robo4嗎啉代和野生型鼠robo4RNA(n=60)、robo4嗎啉代和robo4AtailRNA(n=17)、以及robo4嗎啉代禾口robo4APIMRNA(n-45)的TG(fli:egfp)yl胚胎中，定量血管模式形成的缺陷。代表性圖像顯示在圖l中。圖7B顯示了抑制細(xì)胞遷移、鋪展和Rac活化的Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)軸的模型。圖8顯示了在斑馬魚胚胎中剪接阻斷性嗎啉代抑制了robo4的表達(dá)。圖8A顯示了斑馬魚(Daniorerio)中robo4基因座和編碼的Robo4蛋白的示意圖。剪接阻斷性嗎啉代靶向的外顯子被標(biāo)明，用于擴(kuò)增robo4cDNA的引物的位置也被標(biāo)明。圖8B顯示了從未注射的胚胎和用robo4剪接阻斷性嗎啉代注射的胚胎分離的RNA，并用于反轉(zhuǎn)錄cDNA。然后將cDNA用于擴(kuò)增robo4，得到的片段通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并用溴化乙錠染色進(jìn)行可視化。圖9顯示了Hic-5是一種Robo4相互作用蛋白。圖9A顯示了全長(zhǎng)Hic-5和從酵母雙雜交篩選回收的cDNA克隆的示意圖。圖9B顯示了將釀酒酵母(s.cerevisiae)菌株P(guān)J694-A用指定的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并鋪于不含亮氨酸和色氨酸、或不含亮氨酸、色氨酸、組氨酸和丙氨酸的合成培養(yǎng)基上。將能夠在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落點(diǎn)在同樣培養(yǎng)基上，復(fù)制平板培養(yǎng)，并照相或用于(3-半乳糖苷酶分析。圖10顯示了樁蛋白相互作用基序位于Robo4胞質(zhì)尾區(qū)中CC0和CC2之間。鼠Robo4蛋白的示意圖以及包含樁蛋白相互作用基序的氨基酸的鑒定。圖11顯示了Robo4胞質(zhì)尾區(qū)不抑制Cdc42的活化，也不與srGAPl相互'作用。圖11A顯示了將表達(dá)Robo4的HEK293細(xì)胞鋪于包被有5!ig/ml纖連蛋白與模擬制備物或Slit2的細(xì)菌培養(yǎng)皿上。在5分鐘溫育后，將細(xì)胞裂解，用GST-PBD沉淀GTP-Cdc42。Cdc42用Cdc42特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖11B顯示了將HEK293細(xì)胞用指定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，然后用HA抗體對(duì)Robol/Robo4進(jìn)行免疫沉淀。srGAPl使用FlagM2抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。圖12顯示出slit減少了早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，它是影響糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病和與衰老相關(guān)的黃斑變性的因子的FDA標(biāo)準(zhǔn)。圖12A顯示了接受模擬制備物的野生型小鼠與接受Slit蛋白的小鼠相比，視網(wǎng)膜的新生血管百分?jǐn)?shù)。與野生型小鼠相比，在用Slit處理的小鼠中，新生血管減少了63%。N=6，P<0.003。圖12B顯示了接受模擬制備物的野生型小鼠與接受鹽水對(duì)照的小鼠相比，視網(wǎng)膜的新生血管百分?jǐn)?shù)。N=5，P<0.85。圖12C顯示了基因敲除小鼠與Slit處理的小鼠相比，視網(wǎng)膜的新生血管百分?jǐn)?shù)。N=l。圖13顯示了slit和導(dǎo)向因子(netrin)能夠降低VEGF誘導(dǎo)的皮膚通透性。圖14顯示了slit能夠降低VEGF介導(dǎo)的視網(wǎng)膜通透性。圖15顯示了腦信號(hào)蛋白樣的VEGF增加皮膚通透性。圖16顯示出Robo4通過抑制Arf6阻斷了Rac依賴性的突出活性。穩(wěn)定表達(dá)allb或alIb-Robo4胞質(zhì)尾區(qū)的CHO-K1細(xì)胞被鋪于包被有纖連蛋白或纖連蛋白和纖維蛋白原的皿上，裂解，并使用GST-GGA3沉淀GTP-Arf6。Arf6使用Arf6特異性單克隆抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)(參見圖16A)。將穩(wěn)定表達(dá)allb或alIb-Robo4胞質(zhì)尾區(qū)的CHO-K1細(xì)胞用GFP與空載體或GIT1-PBS共轉(zhuǎn)染，并在包被有纖連蛋白或纖連蛋白和纖維蛋白原的載玻片上進(jìn)行鋪展分析。GFP陽性細(xì)胞的區(qū)域使用ImageJ測(cè)定，誤差線表示SEM(參見圖16B)。將HEK293細(xì)胞用GFP和指定的構(gòu)建體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，36小時(shí)后在纖連蛋白與模擬制備物或Slit2蛋白上進(jìn)行鋪展分析(參見圖16C)。在所有的圖塊中，誤差線表示平均值土SE。Robo4和ARNO的表達(dá)通過western印跡進(jìn)行證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。將HEK293細(xì)胞用GFP和指定的構(gòu)建體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，36小時(shí)后鋪于用纖連蛋白與模擬制備物或Slit2蛋白包被的皿上。將GTP-Rac用GST-PBD沉淀，Rac用Racl特異性單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)(參見圖16D)。圖17顯示了免疫沉淀反應(yīng)的結(jié)果，證實(shí)了Robo4受體與Slit配體的結(jié)合。圖17A顯示了來自未轉(zhuǎn)染的人類胚胎腎細(xì)胞(HEK)、用帶有myc表位標(biāo)簽的Slit(Slit-myc)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞、用帶有HA表位標(biāo)簽的Robo4(Robo4-HA)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞、以及用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(對(duì)照-HEK)的細(xì)胞裂解液的免疫沉淀結(jié)果。Slit-myc細(xì)胞裂解液的Western印跡分析用作對(duì)照，證明了Slit蛋白的質(zhì)量為大約210kD，與以前的報(bào)道一樣(第l道)。在將Slit-myc和Robo4-HA細(xì)胞裂解液混合后并用抗HA抗體免疫沉淀后，也用抗myc抗體通過Western印跡分析來檢測(cè)Slit-myc蛋白(第6道)。該相互作用的特異性通過使用裂解液的所有其它組合時(shí)不能檢測(cè)到Slit蛋白所證實(shí)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用了同樣量的裂解液。在第2-6道中較下的條帶對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白重鏈。圖17B顯示了來自未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(HEKCM)、用帶有myc表位標(biāo)簽的Slit轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(Slit-mycCM)、用帶有HA表位標(biāo)簽的Robo4的N端可溶性胞外結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(NRobo4-HACM)、以及用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(對(duì)照-HEKCM)的條件培養(yǎng)基的免疫沉淀結(jié)果。在Slit-mycCM中通過抗myc抗體檢測(cè)到了全長(zhǎng)Slit-myc蛋白(210KD)及其C-末端蛋白水解片段(70KD)(第1道)。與圖17A中相同，在將Slit-myc和Robo4-HA條件培養(yǎng)基混合后并用抗HA抗體免疫沉淀后，也通過Western印跡檢測(cè)到了Slit-myc蛋白(第6道)。該相互作用的特異性由使用條件培養(yǎng)基的所有其它組合時(shí)沒有Slit蛋白所證實(shí)。如圖17C-圖17F所示，Slit蛋白與表達(dá)Robo4的細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)合。Slit-myc蛋白的結(jié)合使用抗myc抗體和Alexa594結(jié)合的抗小鼠抗體來檢測(cè)。在Robo4-HEK細(xì)胞的表面(圖17F)而不是對(duì)照-HEK細(xì)胞的表面(圖17D)上檢測(cè)到了結(jié)合。圖18顯示了Robo4表達(dá)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的和以柄細(xì)胞為中心的。圖18A顯示了從P5Robo4+/AP小鼠制備的視網(wǎng)膜輔片(flatmounts)，并對(duì)內(nèi)皮粘蛋白(內(nèi)皮細(xì)胞)、NG2(周細(xì)胞)和堿性磷酸酶(AP;Robo4)進(jìn)行染色。在左上圖中指向右邊的最頂部箭頭指示了頂端細(xì)胞，其余的箭頭表明周細(xì)胞(NG2陽性)。"T"也表示頂端細(xì)胞。圖18B顯示了從成年Robo4+^小鼠制備的視網(wǎng)膜輔片，并對(duì)NG2(周細(xì)胞)和AP(Robo4)進(jìn)行了染色，在圖18B中包含的箭頭指示周細(xì)胞(NG2陽性)。圖18C顯示了使用特異性針對(duì)PECAM、Robol和Robo4的引物，在指定的樣品上進(jìn)行的定量RT-PCR(qPCR)的結(jié)果。當(dāng)用于圖18C時(shí)"HAEC"表示人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；"HMVEC"表示人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞；"HASMC"表示人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。圖18D顯示了使用針對(duì)Robo4、VE-鈣粘著蛋白、平滑肌肌動(dòng)蛋白和ERK1/2的抗體，探測(cè)來自HMVEC和HASMC的全細(xì)胞裂解液的結(jié)果。圖19顯示出Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制了VEGF-A誘導(dǎo)的遷移、管形成、通透性和Src家族激酶(SFK)的活化。從Robo4+"和Robo4AP/AP小鼠分離到的肺內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)被用于內(nèi)皮細(xì)胞遷移(圖19A)、管形成(圖19B)、體外通透性(圖19C)、Miles分析(圖19D)和視網(wǎng)膜通透性分析(圖19E)。將人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞在存在模擬制備物或Slit2蛋白的情況下，用VEGF-A刺激5分鐘，裂解，并使用磷酸-VEGFR2抗體進(jìn)行western印跡(圖19F)，使用磷酸-Src抗體進(jìn)行western印跡(圖19G)，以及Rac活化分析(圖19H)。在所有圖中，*代表p0.05，"代表p〈0.005，"M戈表p〈0.0005，NS表示"不顯著"，誤差線表示SEM。圖20顯示出Robo4信號(hào)傳導(dǎo)在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病("OIR")的動(dòng)物模型中和在脈絡(luò)膜新生血管("CNV")的動(dòng)物模型中抑制病理性血管生成。對(duì)新生的Robo4+"和Robo4AP/AP小鼠進(jìn)行氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病，并用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-葡聚糖(綠色)進(jìn)行灌注。對(duì)于每種情況制備視網(wǎng)膜輔片，通過熒光顯微鏡進(jìn)行分析。箭頭表示病理性血管生成的區(qū)域(圖20A到圖20D)。對(duì)在圖20A到圖20D中觀察到的病理性血管生成的定量提供在圖20E中。在CNV模型中，對(duì)2-3月齡的Robo4+"和Robo4AWAP小鼠進(jìn)行激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管化。制備脈絡(luò)膜輔片，用同工凝集素染色，通過共聚焦顯微鏡分析(圖20F到圖201)。對(duì)在圖20F到圖20I中觀察到的病理性血管生成的定量提供在圖20J中。在所有圖中，*代表卩<0.05，"代表p〈0.005，***代表p<0.0005，NS表示"不顯著"，誤差線表示SEM。圖21顯示出Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制了bFGF誘導(dǎo)的血管生成和凝血酶刺激的內(nèi)皮通透性過高。在執(zhí)行提供了圖21A中顯示的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中，在存在bFGF與模擬制備物或Slit2蛋白的情況下，在基質(zhì)膠上對(duì)鼠的肺內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行管形成分析。在執(zhí)行提供了圖21B中顯示的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中，在纖連蛋白包被的Transwells上進(jìn)行了凝血酶誘導(dǎo)的通透性分析。圖22顯示出Robo4信號(hào)傳導(dǎo)在急性肺損傷模型中降低了損傷和炎癥。將小鼠暴露于氣管內(nèi)LPS,并用Slit蛋白或模擬制備物處理。在支氣管肺泡灌洗液(BAL)中炎性細(xì)胞和蛋白的濃度明顯通過Slit蛋白處理被降低了。圖23顯示了Slit蛋白的不同構(gòu)建體，并顯示出小到Slit2-Dl(40kD)的重組Slit肽也具有活性。在圖23A中，描述了Slit蛋白的不同構(gòu)建體。標(biāo)出了四個(gè)富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域(LRR)、表皮生長(zhǎng)因子同源區(qū)域(EGF)和C末端標(biāo)簽(MYC/HIS)。在圖23B中顯示了不同Slit構(gòu)建體(2nM)對(duì)VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制。圖24顯示了按照禽流感的小鼠模型，施用Slit蛋白對(duì)感染了禽流感病毒的小鼠的存活率的影響。圖25顯示了在實(shí)施例14中描述的敲除小鼠的基因組性狀。發(fā)明的具體說明公開了可用于本公開的方法和組合物、可以與它們一起使用、可用于制備它們、或是它們的產(chǎn)物的材料、組合物和成分。這些以及其它的材料被公開在本文中，并應(yīng)該理解，當(dāng)這些材料的組合、子集、相互作用、分組等被公開時(shí)，盡管可能沒有明確地公開這些化合物的各種個(gè)體和集合性組合和排列中每一個(gè)的特定意義，但每一個(gè)都被具體考慮到了并描述在本文中。例如，如果公開并討論了多肽，并且討論了可以對(duì)包含該多肽的許多分子進(jìn)行的許多修飾，那么該多肽和修飾的每種和所有的可能組合和排列都被具體地考慮到了，除非明確表示不是這樣。因此，如果公開了一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F，并且公開了組合的分子的一個(gè)例子A-D，那么即使沒有對(duì)每個(gè)都進(jìn)行單獨(dú)的敘述，但每個(gè)都被從個(gè)體上和集合上考慮到了。因此，在這個(gè)例子中，每種組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F都被具體考慮到了，并且應(yīng)該被認(rèn)為是從A、B和C;D、E和F;以及示例的組合A-D的公開內(nèi)容中被公開了。同樣地，它們的任何子集或組合也被具體地考慮到并公開了。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亞組被具體地考慮到了，并且應(yīng)該被認(rèn)為從A、B和C;D、E和F;以及示例的組合A-D的公開內(nèi)容中被公開了。這種概念被應(yīng)用于本申請(qǐng)的所有方面，包括但不限于在制造和使用本公開組合物的方法中的步驟。因此，如果存在多種可以執(zhí)行的其它步驟，那么應(yīng)該理解，這些其它步驟中的每一個(gè)可以用本公開方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合執(zhí)行，并且每種這樣的組合被具體地考慮到了，應(yīng)該被認(rèn)為是被公開了。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到、或者使用不逾越常規(guī)的實(shí)驗(yàn)就能夠確定出本文描述的方法和組合物的具體實(shí)施方案的許多等效體。這樣的等效體旨在被所附的權(quán)利要求所包含。應(yīng)該理解，所公開的方法和組合物不限于描述的具體方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。還應(yīng)該理解，在本文中使用的術(shù)語僅僅是出于描述具體實(shí)施方案的目的，不打算對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制，本發(fā)明的范圍僅僅受到所附的權(quán)利要求書的限制。除非另有定義，在本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本說明書背景中
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員所通常理解的意義。必須指出，在本文和所附權(quán)利要求書中使用的沒有量詞指示的名詞包含該詞的復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確表示不是。因此，例如指稱"多肽"包含多個(gè)這樣的多肽，指稱"該多肽"是指一個(gè)或多個(gè)多肽及其本
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的專業(yè)人員已知的等價(jià)物，等等。"可選的"或"可選地"是指隨后描述的事件、情況或材料可以發(fā)生或存在或可以不發(fā)生或存在，該描述包含了事件、情況或材料發(fā)生或存在的情形，和它不發(fā)生或不存在的情形。在本文中，范圍可以表示為從"大約"一個(gè)特定值和/或到"大約"另一個(gè)特定值。當(dāng)表述這樣的范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從一個(gè)特定值和/或到另一個(gè)特定值。同樣地，當(dāng)通過在前面使用"大約"將值表示成約略值時(shí)，應(yīng)該理解為特定值形成了另一個(gè)實(shí)施方案。還應(yīng)該理解，每個(gè)范圍的終點(diǎn)顯然既與另一個(gè)終點(diǎn)相關(guān)，又獨(dú)立于另一個(gè)終點(diǎn)。還應(yīng)該理解，在本文中公開了許多值，本文中的每個(gè)值，除了該值本身之外，也被公開成"大約"該特定值。例如，如果公開了值"io"，那么"大約10"也被公開了。還應(yīng)該理解，當(dāng)公開值時(shí)，"小于或等于"該值、"大于或等于該值"以及值之間的可能范圍，也被公開了，這是專業(yè)技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)了解的。例如，如果公開了值"10"，那么"少于或等于10"以及"大于或等于10"也被公開了。還應(yīng)該理解，在整個(gè)申請(qǐng)中，數(shù)據(jù)以多種不同的格式提供，該數(shù)據(jù)代表了終點(diǎn)和起始點(diǎn)，以及數(shù)據(jù)點(diǎn)的任何組合范圍。例如，如果公開了具體數(shù)據(jù)點(diǎn)"10"和具體數(shù)據(jù)點(diǎn)15，則應(yīng)該理解大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15，以及10到15之間，被認(rèn)為是公開了。還應(yīng)該理解，兩個(gè)具體單位之間的每個(gè)單位也被公開了。例如，如果10和15被公開了，那么11、12、13和14也被公開了。本文使用的術(shù)語"對(duì)象"是指任何給藥的靶。對(duì)象可以是脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物。因此，對(duì)象可以是人類。術(shù)語沒有指定具體的年齡或性別。因此，成年和新生對(duì)象以及胎兒，不論是雄性還是雌性，都打算被涵蓋?；颊呤侵富加屑膊』虿“Y的對(duì)象。術(shù)語"患者"包括人類和獸醫(yī)對(duì)象。"抑制"是指活性、反應(yīng)、病癥、疾病或其它生物學(xué)參數(shù)的降低。這可以包括但不限于完全消除活性、反應(yīng)、病癥或疾病。這也可以包括例如與天然或?qū)φ账较啾龋够钚?、反?yīng)、病癥或疾病降低了10%。因此，降低可以是與天然或?qū)φ账较啾龋?0、20、30、40、50、60、70、80、卯、100%或具體陳述的百分率之間的任何降低量。"促進(jìn)"是指活性、反應(yīng)、病癥、疾病或其它生物學(xué)參數(shù)的增加。這可以包括但不限于活性、反應(yīng)、病癥或疾病的起始。這也可以包括例如與天然的或?qū)φ账较啾龋够钚?、反?yīng)、病癥或疾病增加10%。因此，活性、反應(yīng)、病癥、疾病或其它生物學(xué)參數(shù)的增加，可以是與天然或?qū)φ账较啾龋?0、20、30、40、50、60、70、80、90、100%或以上，包括具體陳述的百分率之間的任何增加量。術(shù)語"治療有效的"是指使用的組合物的量是緩解疾病或病癥的一種或多種病因或癥狀的充分量。這種緩解只要求降低或改變，而不必需是消除。術(shù)語"載體"是指化合物、組合物、物質(zhì)或結(jié)構(gòu)，當(dāng)與化合物或組合物組合時(shí)，出于其打算的應(yīng)用或目標(biāo)，幫助或促進(jìn)這些化合物或組合物的制備、儲(chǔ)存、施用、投送、有效性、選擇性或任何其它特征。例如，可以選擇載體以最小化活性成分在對(duì)象中的任何降解，并最小化在對(duì)象中的任何不良副作用。術(shù)語"調(diào)控序列"是指通常在基因座編碼區(qū)的100-1000千堿基(kb)內(nèi)、影響基因表達(dá)的序列，但是它們也可以離編碼區(qū)更遠(yuǎn)。這種對(duì)表達(dá)的調(diào)控包括基因的轉(zhuǎn)錄，以及信使RNA的翻譯、剪接和穩(wěn)定性。術(shù)語"可操作地連接"是指毗鄰位置，在所述位置中所描述的成分處于允許它們以目的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子與編碼序列是可操作地連接的。術(shù)語"可操作地連接"可以是指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的排列)與第二個(gè)核酸序列之間的功能性聯(lián)系，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)第二個(gè)序列的相應(yīng)核酸的轉(zhuǎn)錄。"分離的"，當(dāng)用于描述本文公開的生物分子時(shí)，是指例如已經(jīng)從其天然環(huán)境的成分中被鑒定和分離和/或回收的肽、蛋白或核酸。其天然環(huán)境的污染成分是通常將干擾被分離的分子的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可以包括酶、激素以及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)物質(zhì)。分離和純化本文描述的生物分子的方法在本
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中是已知的和可用的，本
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的普通專業(yè)人員可以根據(jù)需要被分離或純化的物質(zhì)，確定適合的分離和純化方法。盡管分離的生物分子通常將使用至少一個(gè)純化步驟來制備，但在本文中使用時(shí)，"分離的"也可以是指例如在重組細(xì)胞中原位的肽、蛋白、抗體或核酸物質(zhì)，即使是表達(dá)在同源的細(xì)胞類型中。此外，當(dāng)使用術(shù)語"分離的"、"基本上純的"和"基本上均質(zhì)的"來描述單體蛋白時(shí)，它們?cè)诒疚闹锌梢曰Q使用。當(dāng)至少大約60%到75%的樣品表現(xiàn)出單一的多肽序列時(shí)，單體蛋白基本上是純的。通常，基本上純的蛋白可以占蛋白樣品的大約60-90%W/W，需要時(shí)，基本上純的蛋白可以大于大約90%、大約95%或大約99%純。蛋白的純度或同質(zhì)性可以由本
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眾所周知的多種方法來顯示，例如蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后在凝膠染色后使單一的多肽條帶可視化。出于某些目的，可以使用HPLC或本
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眾所周知的其它用于純化的方法來提供更高的分辨率。在通篇本說明書的說明和權(quán)利要求中，單詞"包含(comprise)"，是指"包括但不限于"，并不打算排除例如其它的添加物、成分、整數(shù)或步驟。本文中使用的"血管通透性"是指小分子(例如離子、水、營養(yǎng)物質(zhì))、大分子(例如蛋白和核酸)或甚至整個(gè)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞在它們通向炎癥位點(diǎn)的路上)通過血管壁的能力。術(shù)語"病原性"或"病原性狀態(tài)"是指與健康、正?；蛴行顟B(tài)的任何偏離，這可以是疾病、病癥、事件或受傷的結(jié)果。蛋白和肽在本文中使用的術(shù)語"蛋白"和"肽"，單純是指廣義的多肽分子，不用于指任何特定大小、長(zhǎng)度或分子量的多肽分子。蛋白變異體和衍生物對(duì)于本
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的專業(yè)人員來說是非常了解的，并可以包括氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列的修飾通常屬于三種類型中的一種或多種取代、插入或缺失變異體。插入包括氨基和/或羧基末端的融合以及序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入一般是比氨基或羧基末端融合更小的插入，例如，一到四個(gè)殘基左右。免疫原性融合蛋白衍生物，例如在實(shí)施例中描述的那些，是通過體外交聯(lián)將大得足以賦予免疫原性的多肽與靶序列融合、或通過用編碼融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)化重組細(xì)胞培養(yǎng)物來制造的。缺失的特征為從蛋白序列中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。通常，在蛋白分子內(nèi)任何一個(gè)位點(diǎn)上缺失不超過大約2到6個(gè)殘基。這些變異體的制備一般是通過編碼蛋白的DNA中的核苷酸的位點(diǎn)特異性誘變，從而產(chǎn)生編碼變異體的DNA，然后將在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA。用于在具有已知序列的DNA中的預(yù)定位點(diǎn)上制造取代突變的技術(shù)是眾所周知的，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸取代一般為單個(gè)殘基，但是也可以一次發(fā)生在許多不同位置上；插入通常在大約1到IO個(gè)氨基酸殘基左右；缺失在大約1到30個(gè)殘基的范圍內(nèi)。缺失或插入優(yōu)選在鄰近的對(duì)上進(jìn)行，即缺失兩個(gè)殘基或插入兩個(gè)殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可以被組合，以獲得最終的構(gòu)建體。突變絕不可以將序列放置到閱讀框之外，并且優(yōu)選不產(chǎn)生能產(chǎn)生mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。取代變異體是其中至少一個(gè)殘基被除去、并且在其位置中插入了不同殘基的變異體。這樣的取代一般按照下面的表1來做出，被稱為保守取代。表1:氨基酸取代，原始?xì)埢纠谋Ｊ厝〈醮霸诼?
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中已矢口。AlaSerArgLys;GinAsnGn;HisAspGluCysSerAsn，LysAspProAsn;GlnLeu;Vallie;ValArg;GinLeu;lieMet;Leu;TyrThrSerTyrTrp;Phelie;Leu_功能或免疫學(xué)特征的顯著改變通過選擇比表i中的取代保守性低的取代來產(chǎn)生，即選擇在維持下面特性的作用方面差異更明顯的殘基:(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)上分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。一般來說，預(yù)計(jì)對(duì)蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生最大改變的取代，將是下面的取代，其中(a)親水性殘基，例如絲氨酸或蘇氨酸殘基，取代了(或被取代成)疏水性殘基，例如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸殘基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代了(或被取代成)任何其它的殘基；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基，取代了(或被取代成)具有負(fù)電的殘基，例如谷氨酸或天冬氨酸殘基；或(d)具有大體積側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸，取代了(或被取代成)不具有側(cè)鏈的殘基，例如甘氨酸，在這種情況下，(e)通過增加硫化和/或糖基化的位點(diǎn)的數(shù)量。例如，將一個(gè)氨基酸殘基用另一個(gè)生物學(xué)和/或化學(xué)上類似的殘基代替，被本
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的專業(yè)人員稱為保守取代。例如，保守取代將是用一個(gè)疏水殘基替代另一個(gè)疏水殘基，或用一個(gè)極性殘基替代另一個(gè)極性殘基。取代包括組合，例如Gly，Ala;Val，Ile，Leu;Asp，Glu;Asn，Gln;Ser，Thr;Lys，Arg;禾卩Phe，Tyr。每個(gè)明確公開的序列的這種保守取代變異體，包含在本文提供的嵌合多肽中。取代或缺失誘變可用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位點(diǎn)。也可希望缺失半胱氨酸或其它有可能的殘基。缺失或取代可能的蛋白水解位點(diǎn)例如Arg，可以通過例如缺失堿性殘基中的一個(gè)或用谷氨酰胺或組氨酸殘基取代一個(gè)來實(shí)現(xiàn)。某些翻譯后衍生作用是重組宿主細(xì)胞作用于被表達(dá)的多肽的結(jié)果。谷氨酰胺和天冬酰胺殘基在翻譯后經(jīng)常被脫酰胺形成相應(yīng)的谷氨酸和天冬氨酸殘基?；蛘?，這些殘基在輕度酸性條件下被脫酰胺。其它的翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基基團(tuán)的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的鄰-氨基基團(tuán)的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties(蛋白結(jié)構(gòu)與分子性質(zhì))，W.H.Freeman&Co.,SanFranciscopp79-86[1983])，N-末端胺的乙酰化，以及在某些情況下，C-末端羧基的酰胺化。應(yīng)該理解，確定本文公開的蛋白和肽的變異體和衍生物的一種方式，是通過根據(jù)與特定已知序列的同源性/同一性來確定變異體和衍生物。具體公開的是與所述序列具有至少70%或75%或80%或85%或90%或95%同源性的本文公開的這些以及其它蛋白的變異體。本
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的專業(yè)人員容易了解如何確定兩個(gè)蛋白的同源性。例如，可以在將兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)使得同源性在最高水平后計(jì)算同源性。計(jì)算同源性的另一種方法可以通過已發(fā)表的算法來進(jìn)行。用于比較的最佳序列比對(duì)可以通過Smith禾PWaterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))的局部同源性算法、Needl函n和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同源性比對(duì)算法、Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988))的相似性搜索方法、通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(威斯康辛遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)，或通過目觀!j檢查來進(jìn)行。對(duì)于核酸來說，可以獲得同樣類型的同源性，例如通過在Zuker，M.Science244:48-52,1989;Jaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706-7710,1989;Jaeger等，MethodsEnzymol.183:281-306，1989中公開的算法，在此至少以其與核酸比對(duì)有關(guān)的材料引為參考。應(yīng)該理解，對(duì)保守突變和同源性的描述可以以任何組合方式組合在一起，例如與特定序列具有至少70%同源性的實(shí)施方案，其中變異體是保守突變。因?yàn)楸菊f明書討論了各種不同的蛋白和蛋白序列，應(yīng)該理解，能夠編碼那些蛋白序列的核酸也被公開了。這將包括所有與特定蛋白序列有關(guān)的簡(jiǎn)并序列，即所有其序列編碼一種特定蛋白序列的核酸，以及所有編碼蛋白序列的公開變異體和衍生物的核酸，包括簡(jiǎn)并核酸。因此，盡管每個(gè)具體的核酸序列可能沒有在本文中寫出，但應(yīng)該理解，事實(shí)上通過公開的蛋白序列，每個(gè)和所有的序列都在本文中公開和描述了。應(yīng)該理解，有眾多氨基酸和肽的類似物可以摻入到公開的組合物中。例如，存在眾多的D型氨基酸或與表1中顯示的氨基酸具有不同功能性取代基的氨基酸。公開了天然存在的肽的相反立體異構(gòu)體以及肽類似物的立體異構(gòu)體。通過為tRNA分子裝載選擇的氨基酸，以及將利用例如琥珀密碼子的遺傳構(gòu)建體工程化，以將類似氨基酸以位點(diǎn)特異性方式插入到肽鏈中，這些氨基酸能夠容易地被摻入到多肽鏈中(Thorson等，MethodsinMolec.Biol.77:43-73(1991);Zoller，CurrentOpinioninBiotechnology,3:348-354(1992);Ibba,Biotechnology&GeneticEnginerringReviews13:197-216(1995);Cahill等，TIBS，14(10):400-403(1989);Benner，TIBTech,12:158-163(1994);Ibba禾口Hennecke，Bio/technology,12:678-682(1994),所有上述文獻(xiàn)至少以其與氨基酸類似物相關(guān)的材料在此引為參考)。可以生產(chǎn)類似于肽、但是不能通過天然的肽鍵連接的分子。例如，用于氨基酸或氨基酸類似物的鍵可以包括CH2NH-、—CH2S-、—CH2—CH2—、—CH=CH—(順式和反式)、—COCH2--、—CH(OH)CH2—和—CHH2SO—(這些以及其它鍵可以在下面的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)Spatola,A.F.inChemistryandBiochemistryofAminoAcids，Peptides,andProteins,(氨基酸、肽和蛋白的化學(xué)和生物化學(xué)生化)B.Weinstein主編，MarcelDekker,NewYork,p.267(1983);Spatola，A.F.,VegaData(March1983):Vol.1,Issue3,PeptideBackboneModifications(generalreview)(月太骨架修飾)(綜述)；Morley,TrendsPharmSci(1980)pp.463-468;Hudson,D.等，IntJPeptProtRes14:177-185(1979)(—CH2NH—、CH2CH2—);Spatola等，LifeSci38:1243-1249(1986)(--CHH2—S);HarmJ.Chem.SocPerkinTrans.I307-314(1982)(—CH—CH—，順式和反式)；Almquist等，J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(—COCH2—););Jennings-White等，TetrahedronLett23:2533(1982)(--COCH2—);Szelke等，EuropeanAppln,EP45665CA(1982):97:39405(1982)(—CH(OH)CH2—);Holladay等，Tetrahedron.Lett24:4401-4404(1983)(—C(OH)CH2—);以及HrubyLifeSci31:189-199(1982)(—CH2—S—);每個(gè)文獻(xiàn)在此引為參考。特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH--。應(yīng)該理解，肽類似物在成鍵原子之間可以具有一個(gè)以上的原子，例如P-丙氨酸、？氨基丁酸等。氨基酸類似物和類似物和肽類似物通常具有增強(qiáng)的或所需的性質(zhì)，例如更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更高的化學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的藥學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效力、功效等)、改變的特異性(例如廣譜的生物活性)、降低的抗原性，等等。D-氨基酸可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽，因?yàn)镈-氨基酸本身不被肽酶識(shí)別。將保守序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸用同樣類型的D-氨基酸系統(tǒng)取代(例如用D-賴氨酸代替L-賴氨酸)，可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可用于環(huán)化或?qū)蓚€(gè)或多個(gè)肽連接到一起。這對(duì)于將肽限制為特定的構(gòu)象是有益的。(Rizo禾口GieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，在此引為參考)。核酸本文公開了多種基于核酸的分子。公開的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物構(gòu)成。這些以及其它分子的非限制性例子在本文中進(jìn)行了討論。應(yīng)該理解，例如，當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表達(dá)的mRNA通常將由A、C、G和U構(gòu)成。同樣應(yīng)該理解，例如，如果通過例如外源投送將反義分子引入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，反義分子由降低反義分子在細(xì)胞環(huán)境中降解的核苷酸類似物構(gòu)成，將是有利的。核苷酸是含有堿基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通過它們的磷酸部分和糖部分產(chǎn)生核苷間鍵而連接在一起。核苷酸的堿基部分可以是腺嘌吟-9-基(A)、胞嘧啶-l-基(C)、鳥嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-l-基(U)和胸腺嘧啶-l-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五價(jià)的磷酸。核苷酸的非限制性例子是3'-AMP(3'-腺苷一磷酸)或5'-GMP(5'-鳥苷一磷酸)。核苷酸類似物是含有對(duì)堿基、糖或磷酸部分的某些類型修飾的核苷酸。對(duì)堿基部分的修飾包括對(duì)A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶堿基的天然和合成的修飾，例如尿嘧啶-5-基(.psi.)、次黃嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌吟-9-基。修飾的堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它垸基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它垸基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫羥、8-硫垸基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤和3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。其它的堿基修飾可以在例如美國專利No.3,687,808;Englisch等，AngewandteChemie(應(yīng)用化學(xué))，InternationalEdition,1991,30,613禾卩Sanghvi,Y.S.,Chapter15,AntisenseResearchandApplications,pages289-302(《反義研究和應(yīng)用》，第15章，289-302頁)，Crooke，S.T.和Lebleu，B.主編，CRCPress,1993中找到。某些核苷酸類似物，例如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶，可以增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。很多時(shí)候，堿基的修飾可以與例如糖的修飾例如2'-0-甲氧基乙基相組合，以獲得獨(dú)特的性質(zhì)，例如增加雙鏈體穩(wěn)定性。有眾多的美國專利例如4，845，205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5，367，066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941，它們?cè)敿?xì)地描述了堿基修飾的范圍。這些專利每個(gè)都在此引為參考。核苷酸類似物也可以包括糖部分的修飾。對(duì)糖部分的修飾包括對(duì)核糖和脫氧核糖的天然修飾以及合成修飾。糖的修飾包括但不限于在2'位置的下列修飾OH，F(xiàn)，O-，S-或N-垸基；O-、S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-垸基-O-垸基，其中垸基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C,到C,o垸基或C2到Cu)烯基和炔基。2'糖修飾也包括但不限于-0[(CH2)nO]mCH3、-0(CH2)nOCH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0(CH2)n-ONH^P-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m從1到大約10。其它在2'位置上的修飾包括但不限于Q到d。低級(jí)烷基、取代的低級(jí)垸基、垸芳基、芳垸基、O-垸芳基或O-芳垸基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅垸基、RNA裂解基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、改進(jìn)寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或改進(jìn)寡核苷酸的藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)，以及其它具有類似性質(zhì)的取代基。類似的修飾也可以在糖的其它位置上進(jìn)行，特別是3'末端核苷酸上或2'-5'連接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置上。修飾的糖也包括那些在橋接性環(huán)的氧上含有修飾例如CH2和S的糖。核苷酸糖類似物也可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分來代替呋喃戊糖。有許多美國專利講述了這些修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備，例如4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5，591，722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，每個(gè)專利在此以其全文引為參考。核苷酸類似物也能夠在磷酸部分上被修飾。修飾的磷酸部分包括但不限于可以被修飾、使得兩個(gè)核苷酸之間的鍵含有下列成分的修飾磷酸基團(tuán)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基垸基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基垸基膦酸酯、硫羰基垸基磷酸三酯和硼垸磷酸酯。應(yīng)該理解，兩個(gè)核苷酸之間的這些磷酸或修飾磷酸的鍵可以通過3'-5'連接或2'-5'連接，鍵可含有顛倒的極性例如3'-5'變?yōu)?'-3'或2'-5'變?yōu)?'-2'。各種鹽、混合鹽和游離酸的形式也包括在內(nèi)。大量的美國專利講述了如何制造和使用含有修飾的磷酸的核苷酸，并且包括但不限于3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，每個(gè)專利在此引為參考。應(yīng)該理解，核苷酸類似物只需要含有單個(gè)修飾，但是也可以在一個(gè)部分內(nèi)或不同部分之間含有多個(gè)修飾。核苷酸取代物是具有與核苷酸類似的功能性質(zhì)，但是不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸取代物是以沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogsteen方式識(shí)別核酸，但卻通過磷酸部分之外的部分連接到一起的分子。核苷酸取代物當(dāng)與適當(dāng)?shù)陌泻怂嵯嗷プ饔脮r(shí)，能夠形成符合雙螺旋類型的結(jié)構(gòu)。核苷酸取代物是磷酸部分和/或糖部分已經(jīng)被替代的核苷酸或核苷酸類似物。核苷酸取代物不含有標(biāo)準(zhǔn)的磷原子。磷酸的取代物可以是，例如，短鏈烷基或環(huán)垸基核苷間鍵、混合的雜原子和垸基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵。這些包括了具有下列成分的取代物嗎啉代鍵(一部分從核苷的糖部分形成)，硅氧垸骨架，硫化物、亞砜和砜骨架，甲乙?；?formacetyl)和硫代甲乙?；羌埽瑏喖谆滓阴；土虼滓阴；羌?，含有烯烴的骨架，氨基磺酸骨架，亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，以及其它具有混合的N、O、S和CH2成分的部分。許多美國專利公開了如何制備和使用這些類型的磷酸替代物，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，每個(gè)專利在此引為參考。還應(yīng)該理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分都可以被替代，例如被酰胺類型鍵(氨基乙基甘氨酸)(PNA)替代。美國專利5,539,082、5,714,331和5,719,262講述了如何制造和使用PNA分子，每個(gè)專利在此引為參考。(也參見Nielsen等，Science,1991,254,1497-1500)。將其它類型的分子(結(jié)合物)連接到核苷酸或核苷酸類似物上以增強(qiáng)例如細(xì)胞攝取，也是可能的。結(jié)合物可以被化學(xué)連接到核苷酸或核苷酸類似物上。這樣的結(jié)合物包括但不限于脂部分例如膽固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86:6553-6556)、膽酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994，4，1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306-309;Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let"1993，3,2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、月旨肪鏈例如十二垸二醇或H"^—垸殘基(Saison-Behmoaras等，EMBOJ.,1991,10，1111-1118;Kabanov等，F(xiàn)EBSLett"1990,259,327-330;Svi薩huk等，Biochimie,1993,75，49-54)、磷脂例如二-十六烷基-消旋甘油或三乙銨1,2-二-0-十六烷基-消旋甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995，36,3651-3654;Shea等，Nucl.AcidsRes"19卯，18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995，14,969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995,36,3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-氧基膽固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996,277,923-937)。許多美國專利講述了這樣的結(jié)合物的制備，包括但不限于美國專利Nos.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5，112，963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，每個(gè)專利在此引為參考。沃森-克里克相互作用是核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的沃森-克里克面上的至少一種相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的沃森-克里克面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、N1和C6位置，以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。Hoogsteen相互作用是發(fā)生在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen面上的相互作用，該面暴露在雙鏈DNA的大溝中。Hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的N7位置和C6位置上的反應(yīng)性基團(tuán)(NH2或0)。i.核酸序列本文提供了各種各樣的序列，這些序列一部分可以從www.pubmed.gov的Genbank獲得。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員了解如何分辨序列的差異和不同，以及如何調(diào)整與特定序列相關(guān)的組成和方法以適應(yīng)其它相關(guān)的序列。針對(duì)給出了本文公開信息以及本
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已知的任何序列，可以設(shè)計(jì)引物和/或探針。ii.雜交/選擇性雜交術(shù)語雜交一般是指至少兩個(gè)核酸分子、例如引物或探針與基因之間的序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。序列驅(qū)動(dòng)的相互作用是指在兩種核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物之間、以核苷酸特異性方式發(fā)生的相互作用。例如，G與C的相互作用或A與T的相互作用是序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。通常，序列驅(qū)動(dòng)的相互作用發(fā)生在核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面上。兩個(gè)核酸的雜交受到許多本
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專業(yè)人員已知的條件和參數(shù)的影響。例如，鹽濃度、pH和反應(yīng)的溫度都影響兩種核酸分子是否將雜交。兩個(gè)核酸分子之間選擇性雜交的參數(shù)對(duì)于本
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的專業(yè)人員來說是熟知的。例如，在某些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件可以被定義為嚴(yán)緊的雜交條件。例如，雜交的嚴(yán)緊性受到雜交和清洗步驟中任何一個(gè)或二者的溫度和鹽濃度的控制。例如，獲得選擇性雜交的雜交條件可以包括在高離子強(qiáng)度溶液中(6XSSC或6XSSPE)、在比Tm(一半的分子與它們的雜交配偶體解離時(shí)的解鏈溫度)低大約12-25°C的溫度下雜交，然后在選擇的溫度和鹽濃度的組合下進(jìn)行清洗，使得清洗溫度比Tm低大約5°C到大約20°C。溫度和鹽條件可以容易地在預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過經(jīng)驗(yàn)確定，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中固定在濾膜上的參比DNA樣品與標(biāo)記的目標(biāo)核酸雜交，然后在不同嚴(yán)緊性的條件下清洗。對(duì)于DNA-RNA和RNA-RNA雜交來說，雜交溫度一般較高?？梢允褂蒙厦婷枋龅幕虬凑毡?br>技術(shù)領(lǐng)域：
已知的條件來獲得嚴(yán)緊性。(Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkel等，MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，在此至少以其與核酸雜交有關(guān)的材料引為參考)。DNA:DNA雜交的優(yōu)選嚴(yán)緊雜交條件可以是在6XSSC或6XSSPE中在大約68。C(在水性溶液中)雜交，然后在大約68。C下清洗。如果需要，雜交和清洗的嚴(yán)緊性可以根據(jù)所需的互補(bǔ)程度的降低而相應(yīng)降低，此外，還取決于在其中搜索可變性的任何區(qū)域中G-C或A-T的豐度。同樣地，如果需要，雜交和清洗的嚴(yán)緊性也可根據(jù)所需同源性的增加而相應(yīng)增加，此外，還取決于其中需要高同源性的任何區(qū)域中G-C或A-T的豐度，這都是本
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中已知的。確定選擇性雜交的另一種方法是檢査一種核酸與另一種核酸結(jié)合的量(百分率)。例如，在某些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件將是受限核酸的至少大約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%與未受限核酸結(jié)合時(shí)的條件。通常，未受限的引物將過量例如10或100或1000倍。這種類型的分析可以在受限的和未受限的引物都比它們的Kd低例如10倍或100倍或1000倍、或只有一種核酸分子是10倍或100倍或1000倍、或一種或兩種核酸分子均高于它們的Kd的條件下進(jìn)行。確定選擇性雜交的另一種方法是通過在需要雜交來促進(jìn)所需的酶法操作的條件下，檢查實(shí)現(xiàn)酶法操作的引物的百分率。例如，在某些實(shí)施方案中，選擇性雜交條件是在促進(jìn)酶法操作的條件下，至少大約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物被酶法操作時(shí)的條件，例如，如果酶法操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件將是至少大約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物分子被延伸時(shí)的條件。優(yōu)選的條件還包括制造商建議的條件、或本
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中指定為適合酶執(zhí)行操作的條件。正如同源性一樣，要理解，本文中公開了各種用于確定兩種核酸分子之間的雜交水平的方法。應(yīng)該理解，這些方法和條件在兩種核酸分子之間可提供不同的雜交百分率，但是除非另有指明，滿足任何方法的參數(shù)就足夠了。例如，如果需要80%的雜交，只要雜交發(fā)生在這些方法中任何一個(gè)要求的參數(shù)中，就被認(rèn)為在本文中公開了。應(yīng)該理解，本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員了解，如果組成或方法合起來或單獨(dú)地滿足了這些用于確定雜交的標(biāo)準(zhǔn)中的任何一個(gè)，它就是本文公開的組成或方法。iii.功能性核酸功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，例如結(jié)合靶分子或催化特定的反應(yīng)。功能性核酸分子被分成下面的類別，這并不意味著限制。例如，功能性核酸包括反義分子、適配體、核酶、三鏈體形成分子、RNAi和外部引導(dǎo)序列。功能性核酸分子可以用作靶分子具有的特定活性的影響劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑和刺激劑，或者功能性核酸分子可以不依賴于任何其它的分子而具有新的活性。功能性核酸分子能夠與任何大分子相互作用，例如DNA、RNA、多肽或烴鏈。因此，功能性核酸可以與本文公開的任何導(dǎo)向信號(hào)或其受體的mRNA、基因組DNA或多肽相互作用。功能性核酸通常被設(shè)計(jì)成基于耙分子與功能性核酸分子之間的序列同源性而與其它核酸相互作用。在其它情況下，功能性核酸分子和靶分子之間的特異性識(shí)別不是基于功能性核酸分子與靶分子之間的序列同源性，而是基于允許發(fā)生特異性識(shí)別的三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。反義分子被設(shè)計(jì)成通過正規(guī)或非正規(guī)的堿基配對(duì)與耙核酸分子相互作用。反義分子與靶分子的相互作用被設(shè)計(jì)成通過例如RNAseH介導(dǎo)的RNA-DNA雜交體的降解來促進(jìn)靶分子的降解?；蛘?，反義分子被設(shè)計(jì)成破壞正常情況下將在靶分子上發(fā)生的加工功能，例如轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。反義分子可以根據(jù)靶分子的序列來設(shè)計(jì)。關(guān)于通過發(fā)現(xiàn)靶分子的最易接近區(qū)域來優(yōu)化反義功效，存在著眾多的方法。示例性的方法是體外選擇實(shí)驗(yàn)和使用DMS和DEPC的DNA修飾研究。優(yōu)選，反義分子與靶分子結(jié)合的解離常數(shù)(kd)小于或等于10—6、10—8、10-1()或10—12。有助于設(shè)計(jì)和使用反義分子的方法和技術(shù)的代表性樣本可以在下面非限制性列舉的美國專利中找到5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5，856，103、5,919,772、5,955,590、5,9卯,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6，025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319禾口6,057,437。適配體(aptamer)是優(yōu)選以特定方式與耙分子相互作用的分子。典型的適配體是長(zhǎng)度為15-50堿基的小核酸，折疊成確定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如莖環(huán)結(jié)構(gòu)或G-四集體。適配體可以結(jié)合小分子例如ATP(美國專利5,631,146)和茶堿(美國專利5,580,737)，以及大分子例如反轉(zhuǎn)錄酶1(美國專利5,786,462)和凝血酶(美國專利5,543,293)。適配體可以與靶分子非常緊密地結(jié)合，具有小于10'12的kd。優(yōu)選適配體與靶分子結(jié)合的kd小于10—6、10—8、10—1()或10'12。適配體可以以非常高度的特異性與靶分子結(jié)合。例如，己經(jīng)分離到這樣的適配體，其對(duì)于靶分子和只在分子的單個(gè)位置上有差別的另一種分子之間的結(jié)合親和性上，差異超過10000倍(美國專利5,543,293)。優(yōu)選，適配體與靶分子的kd比與背景結(jié)合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或IOO，OOO倍。優(yōu)選當(dāng)對(duì)例如多肽進(jìn)行比較時(shí)，背景分子是不同的多肽。如何制造和使用適配體以結(jié)合各種不同的靶分子的代表性例子，可以在下面非限制性列舉的美國專利中找到5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6，001，988、6，011，020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776禾P6,051，698。核酶是能夠催化分子內(nèi)或分子間化學(xué)反應(yīng)的核酸分子。因此，核酶是催化性核酸。優(yōu)選，核酶催化分子間反應(yīng)?；谠谔烊幌到y(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的核酶，有許多不同類型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶類型的反應(yīng)，例如錘頭核酶(例如但不限于下面的美國專利5,334,711、5,436,330、5,616,466、5，633，133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5，998，203，Ludwig和Sproat的WO9858058，Ludwig禾卩Sproat的WO9858057，以及Ludwig禾卩Sproat的WO9718312)，發(fā)夾核酶(例如但不限于下列美國專利5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)，以及四膜蟲核酶(例如但不限于下列美國專利5,595,873和5，652，107)。還存在許多不是在天然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的核酶，但其己經(jīng)被工程化以重新催化特定的反應(yīng)(例如但不限于下列美國專利5,580,967、5,688,670、5,807,718禾口5,910,408)。優(yōu)選的核酶裂解RNA或DNA底物，但更優(yōu)選裂解RNA底物。核酶通常通過識(shí)別并結(jié)合靶底物、隨后進(jìn)行裂解，來裂解核酸底物。這種識(shí)別往往主要是基于正規(guī)或非正規(guī)的堿基對(duì)相互作用。這種性質(zhì)使得核酶成為靶特異性裂解核酸的特別好的候選物，因?yàn)榘械孜锏淖R(shí)別是基于靶底物的序列。如何制造和使用核酶以催化各種不同反應(yīng)的代表性例子可以在下面非限制性列舉的美國專利中找到5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906禾Q6,017,756。形成三鏈體的功能性核酸分子是能夠與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當(dāng)三鏈體分子與靶區(qū)域相互作用時(shí)，形成了被稱為三鏈體的結(jié)構(gòu)，其中三條DNA鏈依賴于沃森-克里克和Hoogsteen堿基配對(duì)形成復(fù)合體。三鏈體分子是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡軌蛞愿哂H和性和特異性與靶區(qū)域結(jié)合。優(yōu)選三鏈體形成分子與靶分子結(jié)合的kd小于l(T6、l(T8、10—1()或10—12。如何制造和使用三鏈體形成分子以結(jié)合各種不同靶分子的代表性例子，可以在下面非限制性列舉的美國專利中找到5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。外部引導(dǎo)序列(EGSs)是與靶核酸分子結(jié)合、形成復(fù)合體的分子，該復(fù)合體被RNaseP識(shí)別，該酶裂解靶分子。EGSs能夠被設(shè)計(jì)成特異性耙向選擇的RNA分子。RNAseP在細(xì)胞內(nèi)幫助加工轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。通過使用EGS導(dǎo)致靶RNA:EGS復(fù)合體模擬天然tRNA底物，能夠召集細(xì)菌RNAseP，來事實(shí)上裂解任何RNA序列。(Yale的WO92/03566，以及Forster和Altaian,Science238:407-409(19卯))。同樣地，可以利用真核EGS/RNAseP指導(dǎo)的RNA裂解，來裂解真核細(xì)胞內(nèi)的所需靶。(Yuan等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA89:8006-8010(1992);Yale的WO93/22434;Yale的WO95/24489;Yuan和Altaian,EMBOJ14:159-168(1995);以及Carrara等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:2627-2631(1995))。如何制造和使用EGS分子以促進(jìn)各種不同耙分子的裂解的代表性例子可以在下面非限制性列舉的美國專利中找到5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。通過RNA干擾(RNAi)也可以以高度特異性的方式有效地使基因表達(dá)沉默。這種沉默最初是隨著加入雙鏈RNA(dsRNA)而觀察到的(Fire，A.等，(1998)Nature,391，806811)(Napoli，C等，(1990)PlantCell2,279289)(Hannon，GJ.(2002)Nature,418,244251)。一旦dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，它被類RNaseIII的酶Dicer裂解成雙鏈小干擾RNAs(siRNA)，它們的長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸，在3'末端含有2個(gè)核苷酸的突出端(Elbashir,S.M.等,(2001)GenesDev.,15:188-200)(Bernstein,E.等，(2001)Nature,409,363366)(Hammond,S.M.等，(2000)Nature,404:293-296)。在ATP依賴性步驟中，siRNAs整合到多亞基蛋白復(fù)合體中，該復(fù)合體通常被稱為RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，其將siRNAs導(dǎo)向革巴RNA序列(Nykanen,A.等，(2001)Cell,107:309321)。siRNA雙鏈體在某些點(diǎn)解開，并且看來反義鏈保持與RISC結(jié)合，并通過內(nèi)切和外切核酸酶的組合指導(dǎo)互補(bǔ)mRNA序列的降解(Martinez,J.等，(2002)Cell,110:563-574)。但是，siRNA的作用或siRNA或其應(yīng)用不限于任何類型的機(jī)制。還公開了可用于RNAi或RNA干擾的核酸。據(jù)認(rèn)為，RNAi涉及RNA干擾(RNAi)的兩步機(jī)制起始步驟和效應(yīng)劑步驟。例如，在第一個(gè)步驟中，輸入的雙鏈(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，例如21-23個(gè)核苷酸的"引導(dǎo)序列"。RNA復(fù)制似乎能夠發(fā)生在整個(gè)動(dòng)物中。然后，通常，引導(dǎo)RNAs可以整合到能夠降解RNA的蛋白R(shí)NA復(fù)合體——核酸酶復(fù)合體中，該復(fù)合體已經(jīng)被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。在第二個(gè)效應(yīng)劑步驟中，該RISC復(fù)合體的作用是破壞由引導(dǎo)RNA通過堿基配對(duì)相互作用識(shí)別的mRNAs。RNAi包括通過任何方式將雙鏈RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，從而觸發(fā)了引起耙RNA降解的事件。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的形式。公開了能夠在RNAi中起作用的RNA發(fā)夾。對(duì)于制造和使用RNAi分子的描述，參見例如Hammond等，NatureRevGen2:110-119(2001);Sharp,GenesDev15:485-490(2001);Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13959-13964(1998)，它們均在此以其全文和至少與RNAi分子的投送和制造有關(guān)的材料引為參考。RNAi己經(jīng)被顯示在多種細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用，優(yōu)選將要在RISC復(fù)合體內(nèi)用作靶向序列的RNA分子較短。例如，長(zhǎng)度小于或等于50或40或30或29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)核苷酸。這些RNA分子在相對(duì)于將被裂解的靶RNA的3'或5'末端上也可以具有突出端。這些突出端的長(zhǎng)度可以是至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個(gè)核苷酸。RNAi在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞例如小鼠ES細(xì)胞中起作用。短干擾RNA(siRNA)是能夠誘導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默、從而降低或甚至抑制基因表達(dá)的雙鏈RNA。在一個(gè)例子中，在siRNA和耙RNA二者之間序列相同的區(qū)域中，siRNA觸發(fā)了同源RNA分子、例如mRNAs的特異性降解。例如，WO02/44321公開了當(dāng)與3'突出末端堿基配對(duì)時(shí)，siRNAs能夠序列特異性降解靶mRNAs，該專利在此以其制造這些siRNAs的方法引為參考。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，序列特異性基因沉默可以使用模擬酶切丁酶(dicer)產(chǎn)生的siRNAs的合成、短雙鏈RNAs來實(shí)現(xiàn)(Elbashir,S.M.等，(2001)Nature,411:494-498)(Ui-Tei，K.等，(2000)FEBSLett479:79-82)。siRNA可以是化學(xué)或體外合成的，或者可以是短雙鏈發(fā)夾狀RNAs(shRNAs)在細(xì)胞內(nèi)被加工成siRNAs的結(jié)果。合成的siRNAs—般使用算法和常規(guī)的DNA/RNA合成儀來設(shè)計(jì)。供應(yīng)商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、GlenResearch(Sterling,Virginia)、MWBBiotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado)禾卩Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA也可以在體外使用試劑盒來合成，例如Ambion的SILENCERsiRNA構(gòu)建試劑盒。本文公開了根據(jù)本文公開的炎性介質(zhì)的序列，按照上面的描述設(shè)計(jì)的任何siRNA。從載體生產(chǎn)siRNA更常見是通過shRNA的轉(zhuǎn)錄來進(jìn)行的。用于生產(chǎn)含有shRNA的載體的試劑盒是現(xiàn)成的，例如Imgenex的GeneSuppressor構(gòu)建試劑盒和Invitrogen的BLOCK-iT可誘導(dǎo)RNAi質(zhì)粒和慢病毒載體。本文公開了根據(jù)本文公開的炎性介質(zhì)的序列，按照上面的描述設(shè)計(jì)的任何shRNA。iv.載體轉(zhuǎn)化載體可以是用于將基因投送到細(xì)胞中的任何核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或作為投送基因的總策略的一部分，例如作為重組反轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的一部分(Ram等，CancerRes.53:83-88,(1993))。本文中使用的質(zhì)?；虿《据d體，是將公開的核酸、例如編碼scFvs的核酸不受降解地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中的試劑，并包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在它被投送進(jìn)去的細(xì)胞中產(chǎn)生基因表達(dá)。病毒載體是例如腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)元營養(yǎng)性病毒、辛德畢斯病毒(Sindbis)和其它RNA病毒，包括具有HIV骨架的這些病毒。還優(yōu)選的是與這些病毒具有共同的性質(zhì)、使得它們適合于用作載體的任何病毒家族。反轉(zhuǎn)錄病毒包括莫洛尼鼠白血病病毒MMLV，以及表現(xiàn)出MMLV作為載體的所需性質(zhì)的反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠比其它病毒載體攜帶更大的遺傳載荷，即轉(zhuǎn)入基因或標(biāo)記基因，因此是普遍使用的載體。但是，它們?cè)诜窃鲋承约?xì)胞中不是同樣有用。腺病毒載體相對(duì)穩(wěn)定并容易操作，具有高的滴度，和能夠以氣溶膠制劑投送，并可以感染非分裂性細(xì)胞。痘病毒載體很大，具有幾個(gè)用于插入基因的基因座，它們是熱穩(wěn)定的，能夠在室溫下儲(chǔ)存。優(yōu)選的實(shí)施方案是已經(jīng)被工程化、從而抑制了由病毒抗原引發(fā)的宿主生物體免疫應(yīng)答的病毒載體。優(yōu)選的這種類型載體將攜帶白介素8或10的編碼區(qū)。病毒載體可以具有比將基因?qū)爰?xì)胞的化學(xué)或物理方法更高的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)。通常，病毒載體包含非結(jié)構(gòu)早期基因、結(jié)構(gòu)晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄本、復(fù)制和包殼所必需的反向末端重復(fù)序列，以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)被工程化成載體時(shí)，病毒通常被除去了一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將基因或基因/啟動(dòng)子盒插入到病毒基因組中代替除去的病毒DNA。這種類型的構(gòu)建體可以攜帶多達(dá)大約8kb的外源遺傳物質(zhì)。除去的早期基因的必要功能通常由細(xì)胞系提供，所述細(xì)胞系已經(jīng)被工程化以反式表達(dá)早期基因的基因產(chǎn)物。v.反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒是屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科的動(dòng)物病毒，包括任何類型、亞科、屬或趨向性。反轉(zhuǎn)錄病毒載體總體被Verma，I.M.描述在《微生物學(xué)-1985》中的"用于基因轉(zhuǎn)化的反轉(zhuǎn)錄病毒載體"中(Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232,Washington,(1985))，在此引為參考。使用反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因治療的方法的例子描述在美國專利Nos.4,868,116和4,980,286，PCT申i青WO90/02806和WO89/07136，以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))中，其講述的內(nèi)容在此引為參考。反轉(zhuǎn)錄病毒基本上是其中包裝有核酸貨物的包裹。伴隨核酸貨物攜帶有包裝信號(hào)，它確保被復(fù)制的子代分子將有效包裝到包裝外殼中。除了包裝信號(hào)，還需要許多順式分子用于復(fù)制，并包裝復(fù)制的病毒。通常，反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有g(shù)ag、pol和env基因，它們參與了蛋白衣殼的制造。一般來說，正是gag、pol和env基因被將要被轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的外源DNA代替。反轉(zhuǎn)錄病毒一般含有用于整合到包裝衣殼中的包裝信號(hào)，為gag轉(zhuǎn)錄單元的啟動(dòng)提供信號(hào)的序列，反轉(zhuǎn)錄所必需的元件包括與反轉(zhuǎn)錄的tRNA引物結(jié)合的引物結(jié)合位點(diǎn)，在DNA合成過程中指導(dǎo)RNA鏈切換的末端重復(fù)序列，用作DNA合成中第二條鏈合成的引發(fā)位點(diǎn)的富嘌呤5'到3'LTR序列，以及靠近LTRs末端、能夠使反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA狀態(tài)插入片段插入到宿主基因組中的特定序列。除去gag、pol和env基因允許大約8kb的外源序列插入到病毒基因組中，變成被反轉(zhuǎn)錄，并經(jīng)復(fù)制被包裝到新的反轉(zhuǎn)錄病毒粒子中。根據(jù)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的大小，核酸的量足夠用于投送一個(gè)到多個(gè)基因。優(yōu)選，在插入片段中，與其它基因一起包含有正或負(fù)的選擇性標(biāo)記。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)反轉(zhuǎn)錄病毒載體中復(fù)制機(jī)制和包裝蛋白已經(jīng)被除去(gag、pol和env)，載體一般通過將它們放置在包裝細(xì)胞系中來產(chǎn)生。包裝細(xì)胞系是已經(jīng)用含有復(fù)制和包裝機(jī)制、但缺少任何包裝信號(hào)的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。當(dāng)攜帶有選擇的DNA的載體被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞系中時(shí)，通過輔助細(xì)胞順式提供的機(jī)制，含有目標(biāo)基因的載體被復(fù)制并包裝到新的反轉(zhuǎn)錄病毒粒子中。所述機(jī)制的基因組不被包裝，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙俦匾男盘?hào)。vi.腺病毒載體復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建已有描述(Berkner等，J.Virology61:1213-1220(1987);Massie等，Mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmad等，J.Virology57:267-274(1986);Davidson等，J.Virology61:1226-1239(1987);Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"(通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和PCR分析產(chǎn)生和鑒定重組腺病毒)，BioTechniques15:868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的好處是，它們能夠擴(kuò)散到其它細(xì)胞類型的程度受到限制，因?yàn)樗鼈兛梢栽谧畛醣桓腥镜募?xì)胞中復(fù)制，但是不能形成新的感染性病毒粒子。已經(jīng)顯示，重組腺病毒在直接地體內(nèi)投送到氣管上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)和許多其它組織位點(diǎn)后，獲得了高效率的基因轉(zhuǎn)移(Morsy,J.Clin.Invest.92:1580-1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381-387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085-1092(1993);Moullier，NatureGenetics4:154-159(1993);LaSalle，Science259:988-990(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129-25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993);Zabner，NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner,Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287-1291(1993);和Ragot,J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重組腺病毒通過與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后病毒以與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒相同的方式，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用被內(nèi)化，從而實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(Chardo麵t和Dales,Virology40:462-477(1970);Brown禾口Burlingham:J.Virology12:386-396(1973);Svensson禾口Persson,J.Virology55:442-449(1985);Seth等，J.Virol.51:650-655(1984);Seth等，Mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Varga等，J.Virology65:6061-6070(1991);Wickham等，Cell73:309-319(1993))。病毒載體可以是基于腺病毒的載體，其中E1基因已經(jīng)被除去，這些病毒粒子在細(xì)胞系例如人類293細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，E1和E3基因都從腺病毒基因組中被除去。vii.腺相關(guān)病毒載體另一種類型的病毒載體基于腺相關(guān)病毒(AAV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是優(yōu)選的載體，因?yàn)樗軌蚋腥驹S多細(xì)胞類型，并且對(duì)于人類沒有致病性。AAV類型的載體可以運(yùn)輸大約4到5kb,并且已知野生型AAV穩(wěn)定地插入到19號(hào)染色體中。腺相關(guān)病毒(AAV)是細(xì)小病毒科的成員，該病毒科的特征為單鏈線性DNA基因組，以及二十面體形狀的小衣殼，直徑測(cè)量為大約20nm。AAV首先被描述為培養(yǎng)一種猿猴腺病毒——猿猴病毒15的組織培養(yǎng)物的污染物，并被發(fā)現(xiàn)依賴于腺病毒才能獲得可測(cè)量的復(fù)制。這導(dǎo)致了它的名稱，腺相關(guān)病毒，以及它被分類在依賴病毒(Dependovirus)屬中(綜述在Hoggan，M.D.ProgMedVirol12(1970)211-39中)。AAV是腺病毒樣品的常見污染物，并已經(jīng)從人類病毒樣品(AAV2、AAV3、AAV5)、猿猴病毒15感染的細(xì)胞樣品(AAV1、AAV4)、以及禽(AAAV)(Bossis,I.和Chiorini,J.A.JVirol77(2003)6799-810)、牛、犬和羊腺病毒的原種與實(shí)驗(yàn)室腺病毒5型的原種(AAV6)中分離到。從恒河猴的心臟組織通過PCR擴(kuò)增了跨越AAV7和AAV8的整個(gè)rep-capORFs的DNA(Gao,G.P.等，ProcNatlAcadSciUSA99(2002)11854-9)。除了AAVs1和6之夕卜，所有克隆到的AAV分離株表現(xiàn)出血清學(xué)上的差異。已經(jīng)克隆了9個(gè)分離株，并從每個(gè)分離到的病毒產(chǎn)生了重組病毒原種。AAV2是表征得最好的腺相關(guān)病毒，并將根據(jù)AAV原型進(jìn)行討論。AAV2的基因組由4780個(gè)核苷酸的線性單鏈DNA構(gòu)成。DNA的兩極以相等的效率被AAV包裹。AAV2基因組含有2個(gè)開放閱讀框架(ORF)，名為rep和cap。repORF編碼非結(jié)構(gòu)性蛋白，該蛋白對(duì)于病毒DNA復(fù)制、包裝和AAV整合來說是必需的。capORF編碼病毒衣殼蛋白。repORF從位于圖單位P5和P19的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。rep轉(zhuǎn)錄本在接近repORF的3'末端含有內(nèi)含子，能夠被更替剪接。因此，repORF被表達(dá)為4個(gè)部分重疊的蛋白，按照它們的分子量被稱為Rep78、68、52和40。c叩ORF從位于P40的單一啟動(dòng)子表達(dá)。通過更替的剪接和使用更替的ACG起始密碼子，cap被表達(dá)成衣殼蛋白VP1-3，它們的大小從65-86kDa。VP3是最豐富的衣殼蛋白，占AAV2衣殼的80。/。。所有的病毒轉(zhuǎn)錄本在圖單位96的polyA信號(hào)處終止。在生產(chǎn)型AAV2感染期間，從p5啟動(dòng)子開始、編碼Rep78的未剪接mRNAs是第一個(gè)可檢測(cè)到的病毒轉(zhuǎn)錄本。在感染過程中，從P5、P19和P40的表達(dá)分別增加到1:3:18。剪接的轉(zhuǎn)錄本的水平對(duì)于P5、P19產(chǎn)物來說增加到50%，對(duì)于P40表達(dá)的RNA來說增加到90%(Mouw，M.B.禾口Pintel,DJ.JVirol74(2000)9878-88)。AAV2基因組在兩側(cè)以145個(gè)核苷酸(nt)的反向末端重復(fù)序列(ITRs)結(jié)束。ITR的125個(gè)nt構(gòu)成了回文序列，其中含有2個(gè)各為21個(gè)nt的內(nèi)部回文序列。ITR可以自身折回以產(chǎn)生僅有7個(gè)未配對(duì)堿基的T-型發(fā)夾。ITR的莖含有Rep結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，以及被Rep進(jìn)行位點(diǎn)和鏈特異性裂解的序列——末端解離位點(diǎn)(TRS)。ITR對(duì)于AAV2基因組的復(fù)制、整合是必需的，并含有包裝信號(hào)。單鏈AAV2基因組被包裝到直徑為大約20-25nm的無外膜的二十面體形狀的衣殼中。病毒粒子由26。/。DNA和74%蛋白構(gòu)成，密度為1.41g/cm3。AAV2粒子極其穩(wěn)定，能夠耐受在60°C加熱1小時(shí)、極端的pH和用有機(jī)溶劑抽提。Rep蛋白參與了AAV2復(fù)制的幾乎每個(gè)步驟，包括AAV2基因組復(fù)制、整合和包裝。Rep78和Rep68具有ATPase、3'-5'解旋酶、連接酶和切割活性，并與DNA特異性結(jié)合。Rep52和Rep40表現(xiàn)出參與包裹過程，并編碼ATPase和3'-5'解旋酶活性。突變分析表明了Rep78的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。N-末端的225個(gè)氨基酸參與DNA結(jié)合、DNA切割和連接。Rep78和Rep68以相似的效率識(shí)別ITR和ITR的線性截短形式中的GCTC重復(fù)基序(Chiorini，J,A.等，JVirol68(1994)7448-57)。Rep78和Rep68具有序列和鏈特異性的內(nèi)切核酸酶活性，在末端解離位點(diǎn)(TRS)處裂解ITR)。Rep的內(nèi)切核酸酶活性依賴于核苷三磷酸的水解和金屬陽離子的存在。Rep78和68也能夠以不依賴NTP的方式結(jié)合和裂解單鏈DNA。此外，Rep78催化源于AAV2復(fù)制起點(diǎn)的單鏈DNA底物一一即含有rep結(jié)合和末端解離元件的序列一一的重新連接。AAV2Rep78的中心區(qū)域，代表了Rep52和Rep40的N-末端，含有ATPase和3'-5'解旋酶活性以及核定位信號(hào)。解旋酶活性解開DNA-DNA禾PDNA-RNA雙鏈體，但是不能解開RNA-RNA。ATPase活性是組成性的，不依賴于DNA底物。Rep78的C-末端含有可能的鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠通過假底物抑制作用來抑制PKA及其同源物PRKX的細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。Rep68從剪接mRNA的翻譯而產(chǎn)生，所述剪接mRNA編碼Rep78的N-末端529個(gè)氨基酸，其與Rep68獨(dú)有的7個(gè)氨基酸(aa)融合，Rep68不抑制PKA或PRKX。除了這些生化活性之外，Rep可通過蛋白-蛋白相互作用影響細(xì)胞內(nèi)條件。Rep78與各種不同的細(xì)胞蛋白結(jié)合，包括轉(zhuǎn)錄因子如SP-1、高遷移率族非組蛋白的蛋白1(HMG-1)和抑癌蛋白p53。Rep的過表達(dá)導(dǎo)致多效性作用。Rep78破壞細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞和病毒癌基因的轉(zhuǎn)化。在易感細(xì)胞系中，Rep的過表達(dá)導(dǎo)致凋亡和細(xì)胞死亡。幾種Rep78的活性對(duì)細(xì)胞毒性有貢獻(xiàn)，包括其組成性ATPase活性，干擾細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白相互作用。AAV感染的第一步是與細(xì)胞表面結(jié)合。AAV2的受體和共同受體包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1和avp5整合素，但是對(duì)于AAV5的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)來說需要N-連接的2,3-連接的唾液酸(Walters,R.W.等，JBiolChem276(2001)20610-6)。在HeLa細(xì)胞中，熒光標(biāo)記的AAV2粒子顯示出在網(wǎng)格蛋白包被的小窩中通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在感染后IO分鐘內(nèi)，超過60%被結(jié)合的病毒被內(nèi)化。觀察到標(biāo)記的AAV粒子已經(jīng)從內(nèi)體逃逸，通過細(xì)胞質(zhì)運(yùn)往細(xì)胞核，并在可能通過核孔復(fù)合體(NPC)進(jìn)入細(xì)胞核之前，在細(xì)胞核周圍聚集。已經(jīng)在細(xì)胞核中檢測(cè)到了AAV2粒子，表明脫殼發(fā)生在核內(nèi)(Bartlett等，JVirol74(2000)2777-85;Sanlioglu等，JVirol74(2000)9184-96)。AAV5在HeLa細(xì)胞中主要通過網(wǎng)格蛋白包被的小泡被內(nèi)化，但是也有少部分在未包被的小窩中。AAV粒子也在細(xì)胞間通過高爾基體運(yùn)輸(Bantel-Schaal,U.等，JVirol76(2002)2340-9)。表明在進(jìn)入細(xì)胞核之前，發(fā)生了至少一部分AAV5的脫殼，因?yàn)樵诤酥胁荒軝z測(cè)到完整的AAV5粒子(Bantel-Schaal等，2002)。脫殼后，單鏈基因組或者通過前導(dǎo)鏈合成、或者通過相反極性的輸入DNA退火，被轉(zhuǎn)變成雙鏈體DNA。AAV的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)。在與輔助病毒例如腺病毒、單純性皰疹病毒或細(xì)胞肥大病毒共感染期間，AAV能夠進(jìn)行有效的生產(chǎn)性復(fù)制。由腺病毒提供的輔助病毒功能已經(jīng)被很詳細(xì)研究。在組成性表達(dá)腺病毒E1A和E1B基因的人類胚胎腎細(xì)胞293細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了足以允許重組AAV復(fù)制的E2A、E4和VA的早期腺病毒基因產(chǎn)物。Allen等報(bào)道了在僅僅用E4orf6表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，有效生產(chǎn)rAAV是可能的(Alien,J.M.等，MolTher1(2000)88-95)。E1A刺激了S期的進(jìn)入，并通過與pRB家族的蛋白相互作用導(dǎo)致E2F的釋放，來失活Gl/S邊界的pRB限制點(diǎn)，從而誘導(dǎo)了期外DNA合成(綜述在Ben-Israel,H.和Kleinberger,T.FrontBiosci7(2002)Dl369-95中)。這導(dǎo)致誘導(dǎo)或活化了參與核苷酸合成和DNA復(fù)制的酶。因?yàn)槠谕釪NA合成是強(qiáng)凋亡信號(hào)，因此需要抗凋亡功能。ElB-19k是Bcl-2的同系物，ElB-55k是p53的拮抗劑。這兩種蛋白都具有抗凋亡功能。E4orf6與ElB-55k形成復(fù)合體，導(dǎo)致p53的降解。它也被報(bào)道引起了S期停止(Ben-Israel和Kleinberger,2002)。E2A編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白，這似乎對(duì)于DNA復(fù)制來說不是必需的，但是影響基因表達(dá)(Chang和Shenk，JVirol64(1990)2103-9)。VA轉(zhuǎn)錄單元影響AAV2RNA的穩(wěn)定性和翻譯(Janik等，Virology168(1989)320-9)。E1A對(duì)于AAV2基因表達(dá)具有更直接的效應(yīng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子YY-1結(jié)合并抑制病毒P5啟動(dòng)子。E1A解除了這種轉(zhuǎn)錄阻斷。還沒有發(fā)現(xiàn)晚期Ad基因產(chǎn)物對(duì)于AAV2的復(fù)制是必需的。輔助病毒的主要功能似乎是產(chǎn)生一種細(xì)胞環(huán)境，其具有活躍的DNA復(fù)制機(jī)制和阻斷的促凋亡功能，以允許高水平的AAV復(fù)制，而不是直接參與AAV復(fù)制。viii.大有效載荷的病毒載體使用大的人類皰疹病毒進(jìn)行的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了一種方法，通過該方法，大的異源DNA片段可以被克隆、繁殖和建立在允許用皰疹病毒感染的細(xì)胞中(Sun等，Naturegenetics8:33-41，1994;Cotter禾口Robertson,.CurrOpinMolTher5:633-644，1999)。這些大的DNA病毒(單純性皰疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV))，具有將"50kb的人類異源DNA片段投送到特定細(xì)胞中的潛力。EBV重組體能夠?qū)⒋蠖蜠NA維持在被感染的B細(xì)胞中作為附加體DNA。攜帶有高達(dá)330kb的人類基因組插入片段的單個(gè)克隆，表現(xiàn)出遺傳穩(wěn)定性。這些附加體的維持需要特定的EBV核蛋白，EBNA1，其是在用EBV感染的過程中組成性表達(dá)的。此外，這些載體可用于轉(zhuǎn)染，其中大量的蛋白可以在體外短時(shí)產(chǎn)生。皰疹病毒的擴(kuò)增子系統(tǒng)也被用于包裝>220kb的DNA片段，并用于感染能夠?qū)NA穩(wěn)定維持為附加體的細(xì)胞。其它有用的系統(tǒng)包括，例如，復(fù)制型和宿主限制性的非復(fù)制型痘苗病毒載體。ix.不基于核酸的系統(tǒng)公開的組合物可以以各種方式投送到靶細(xì)胞。例如，組合物可以通過電穿孔、或通過脂轉(zhuǎn)染、或通過磷酸鈣沉淀來投送。投送機(jī)制的選擇部分取決于靶細(xì)胞類型以及投送是例如發(fā)生在體內(nèi)還是體外。因此，例如，組合物可以包含脂類，例如脂質(zhì)體，例如陽離子脂質(zhì)體(例如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子脂質(zhì)體。如果需要，脂質(zhì)體還可以包含蛋白，以便于靶向特定的細(xì)胞。施用含有化合物和陽離子脂質(zhì)體的組合物，可以施用于流入靶器官的血液，或吸入到呼吸道中以到達(dá)呼吸道中的耙細(xì)胞。對(duì)于脂質(zhì)體來說，參見例如Brigham等，Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1:95-100(1989);Feigner等，Proc.Natl.Acad.SciUSA84:7413-7417(1987);美國專利No.4，897,355。此外，化合物可以作為能夠耙向特定細(xì)胞類型例如巨噬細(xì)胞的微膠囊的成分來施用，或其中微膠囊中化合物的擴(kuò)散或化合物的投送被設(shè)計(jì)成特定的速度或劑量。在包括將外源DNA施用和攝取到對(duì)象細(xì)胞中的上述方法(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)中，將組合物投送到細(xì)胞可以通過各種不同的機(jī)制。例如，投送可以通過脂質(zhì)體，使用可商購的脂質(zhì)體制備物例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec,Inc.,Madison,WI)，以及其它按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
的標(biāo)準(zhǔn)程序開發(fā)的脂質(zhì)體。此外，公開的核酸或載體可以通過電穿孔投送到體內(nèi)，該技術(shù)可以從Genetronics,Inc.(SanDiego,CA)獲得，以及通過利用SONOPORATION機(jī)器(ImaRxPharmaceuticalCorp.,Tucson,AZ)。材料可以在溶液、懸浮液中(例如摻入到微粒、脂質(zhì)體或細(xì)胞中)。它們可以通過抗體、受體或受體配體耙向特定的細(xì)胞類型。下面的參考文獻(xiàn)是使用該技術(shù)將特定蛋白靶向腫瘤組織的例子(Senter等，BioconjugateChem.,2:447-451,(1991);Bagshawe,K.D.，Br.J.Cancer,60:275-281,(1989);Bagshawe等，Br.J.Cancer,58:700-703，(1988);Senter等，BioconjugateChem.,4:3-9，(1993);Battelli，等，CancerImmunol.Immunother.，35:421-425，(1992);Pietersz禾卩McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992);以及Roffler等，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。這些技術(shù)可用于各種其它的特定細(xì)胞類型。介質(zhì)例如"stealth"和其它抗體偶聯(lián)的脂質(zhì)體(包括靶向結(jié)腸癌的脂類介導(dǎo)藥物)，受體介導(dǎo)的通過細(xì)胞特異性配體的DNA定向，淋巴細(xì)胞指導(dǎo)的腫瘤定向，以及高度特異性的治療性反轉(zhuǎn)錄病毒在體內(nèi)耙向鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。下面的參考文獻(xiàn)是使用該技術(shù)將特定蛋白革巴向腫瘤組織的例子(Hughes等，CancerResearch,49:6214-6220，(1989);以及Litzinger禾口Huang，BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179-187,(1992))。一般來說，受體組成性地或配體誘導(dǎo)地參與胞吞途徑。網(wǎng)格蛋白包被的小窩中的這些受體簇，通過網(wǎng)格蛋白包被的小泡進(jìn)入細(xì)胞，通過受體在其中被分類的酸化內(nèi)體，然后或者重新循環(huán)到細(xì)胞表面成為細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，或者在溶酶體中降解。內(nèi)化途徑起到各種功能，例如營養(yǎng)攝取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的機(jī)會(huì)進(jìn)入、配體的解離和降解、以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體參加一種以上的細(xì)胞內(nèi)途徑，這依賴于細(xì)胞類型、受體濃度、配體的類型、配體價(jià)以及配體的濃度。受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子和細(xì)胞機(jī)理已經(jīng)被綜述(Brown和Greene,DNAandCellBiology10:6,399-409(簡(jiǎn)))。被投送到細(xì)胞并整合在宿主細(xì)胞基因組中的核酸，通常含有整合序列。這些序列往往是病毒相關(guān)的序列，特別是在使用基于病毒的系統(tǒng)時(shí)。這些病毒整合系統(tǒng)，也可以整合到將要使用不基于核酸的投送系統(tǒng)例如脂質(zhì)體投送的核酸中，以便包含在投送系統(tǒng)中的核酸可以整合到宿主基因組中。其它用于整合到宿主基因組中的通用技術(shù)包括，例如，被設(shè)計(jì)用于促進(jìn)與宿主基因組的同源重組的系統(tǒng)。通常，這些系統(tǒng)依賴于將要表達(dá)的核酸側(cè)翼的序列與宿主細(xì)胞基因組中的耙序列具有足夠的同源性，使得載體核酸和靶核酸之間的重組得以發(fā)生，從而導(dǎo)致被投送的核酸整合到宿主基因組中。這些促進(jìn)同源重組所必需的系統(tǒng)和方法對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說是已知的。x.體內(nèi)/離體(ExVivo)如上所述，組合物可以在可藥用的載體中施用，并可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的各種機(jī)制體內(nèi)和/或離體投送到對(duì)象的細(xì)胞中(例如攝入裸露的DNA，脂質(zhì)體融合，通過基因槍肌肉內(nèi)注射DNA，胞吞作用等)。如果使用離體的方法，可以按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的標(biāo)準(zhǔn)方案將細(xì)胞或組織取出并維持在體外。通過任何基因轉(zhuǎn)移機(jī)制、例如磷酸鈣介導(dǎo)的基因投送、電穿孔、微注射或蛋白脂質(zhì)體，可以將組合物導(dǎo)入到細(xì)胞中。然后可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞按照細(xì)胞或組織類型的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行輸注(例如在可藥用載體中)，或等位移植回對(duì)象。用于將各種細(xì)胞移植或輸注到對(duì)象中的標(biāo)準(zhǔn)方法是已知的。xi.表達(dá)系統(tǒng)被投送到細(xì)胞中的核酸通常含有表達(dá)控制系統(tǒng)。例如，插入到病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)中的基因通常含有啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，以幫助控制所需基因產(chǎn)物的表達(dá)。啟動(dòng)子一般是在位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)固定的位置上發(fā)揮作用的DNA序列。啟動(dòng)子含有RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和響應(yīng)元件。a.病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制載體在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動(dòng)子可以從各種來源獲得，例如病毒的基因組，例如多形瘤病毒，猿猴病毒40(SV40)，腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒，乙肝病毒和最優(yōu)選的巨細(xì)胞病毒，或來自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，例如(3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子作為SV40的限制性片段方便易得，所述片段還含有SV40的病毒復(fù)制原點(diǎn)(Fiers等，Nature,273:113(1978))。人類巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子作為HindIIIE限制性片段方便易得(Greenway,P丄等，Gene18:355-360(1982))。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動(dòng)子也可用于本文中。增強(qiáng)子一般是指不是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的固定距離發(fā)揮功能、而是可以在轉(zhuǎn)錄單位的5'(Laimins,L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3'方向(Lusky，M丄.等，Mol.CellBio.3:1108(1983))的DNA序列。此外，增強(qiáng)子可以在內(nèi)含子內(nèi)部(Banerji，J丄.等，Cell33:729(1983))，以及在編碼序列本身中(Osborne,T.F.等，Mol.CellBio.4:1293(1984))。它們的長(zhǎng)度通常在10到300bp之間，它們以順式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的作用是增強(qiáng)從鄰近的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子通常也含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的響應(yīng)元件。啟動(dòng)子也可以含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的響應(yīng)元件。增強(qiáng)子通常決定基因表達(dá)的調(diào)控。盡管目前已經(jīng)知道許多來自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列，但人們通常將使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子進(jìn)行通用表達(dá)。優(yōu)選的例子是在復(fù)制原點(diǎn)晚期側(cè)(bp100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制原點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤病毒增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以通過光或觸發(fā)它們功能的特定化學(xué)事件來特異性激活。系統(tǒng)可以用試劑例如四環(huán)素和地塞米松進(jìn)行調(diào)控。還存在通過暴露于輻照例如Y輻照、或烷基化化療藥物來增強(qiáng)病毒載體基因表達(dá)的途經(jīng)。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)可以用作組成性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，以最大化將被轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元區(qū)域的表達(dá)。在某些構(gòu)建體中，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)在所有真核細(xì)胞類型中都是有活性的，即使它僅僅在特定細(xì)胞類型中的特定時(shí)間下表達(dá)。這種類型的優(yōu)選啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)和反轉(zhuǎn)錄病毒載體LTR。已經(jīng)顯示，所有特異性調(diào)控元件均能夠被克隆并用于構(gòu)建表達(dá)載體，以在特定細(xì)胞類型例如黑素瘤細(xì)胞中進(jìn)行選擇性表達(dá)。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子已經(jīng)被用于在神經(jīng)膠質(zhì)來源的細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因。在真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類或有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體也可以含有終止可影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄所必需的序列。這些區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中的多聚腺苷化區(qū)段。3'非翻譯區(qū)也包含轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選，轉(zhuǎn)錄單元也含有多聚腺苷化區(qū)域。該區(qū)域的一個(gè)好處是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單元將會(huì)像mRNA—樣被加工和運(yùn)輸?shù)目赡苄?。多聚腺苷化信?hào)在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和使用已經(jīng)建立起來。優(yōu)選在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源多聚腺苷化信號(hào)。在某些轉(zhuǎn)錄單元中，多聚腺苷化區(qū)域源于SV40早期多聚腺苷化信號(hào)，并由大約400個(gè)堿基組成。還優(yōu)選被轉(zhuǎn)錄的單位含有單獨(dú)或與上述序列組合的其它標(biāo)準(zhǔn)序列，以增加從構(gòu)建體的表達(dá)或構(gòu)建體的穩(wěn)定性。b.標(biāo)記病毒載體可以含有編碼標(biāo)記產(chǎn)物的核酸序列。該標(biāo)記產(chǎn)物被用于確定基因是否被投送到細(xì)胞中，以及一旦投送后是否正在表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記基因是編碼p-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因，以及綠色熒光蛋白。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記可以是選擇性標(biāo)記。適合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記的例子是二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸腺嘧啶激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這樣的選擇性標(biāo)記被成功轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞如果置于選擇壓力下，將可以存活。有兩種廣泛使用的不同類別的選擇性方案。第一類是基于細(xì)胞的代謝和使用缺乏不依賴于補(bǔ)加培養(yǎng)基而生長(zhǎng)的能力的突變細(xì)胞系。兩個(gè)例子是CHODHFR—細(xì)胞和小鼠LTK—細(xì)胞。這些細(xì)胞在不添加營養(yǎng)物質(zhì)例如胸腺嘧啶或次黃嘌呤的情況下缺乏生長(zhǎng)能力。因?yàn)檫@些細(xì)胞缺乏完整的核苷酸合成途徑所必需的某些基因，除非在補(bǔ)加培養(yǎng)基中提供缺少的核苷酸，否則它們不能存活。補(bǔ)加培養(yǎng)基的替代方案是將完整的DHFR或TK基因引入到缺乏相應(yīng)基因的細(xì)胞中，從而改變它們的生長(zhǎng)需求。沒有用DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的個(gè)體細(xì)胞將不能在未補(bǔ)加的培養(yǎng)基中存活。第二類是顯性篩選，是指在任何類型的細(xì)胞中使用、并且不需要使用突變的細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用藥物來停止宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。具有新基因的那些細(xì)胞將表現(xiàn)出蛋白所賦予的藥物抗性，從而在選擇中存活。這樣的顯性篩選的例子使用了藥物新霉素(SouthernP.和Berg,P.，J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.禾口Berg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B.等，Mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。這三個(gè)例子使用了在真核細(xì)胞控制下的細(xì)菌基因，以分別賦予對(duì)適當(dāng)?shù)乃幬颎418或新霉素(geneticin)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素)的抗性。其它包括新霉素類似物G418和嘌呤霉素。導(dǎo)向信號(hào)細(xì)胞遷移參與了多樣的形態(tài)發(fā)生過程，包括血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的成型(Lauffenburger和Horwitz,1996,Ridley等，2003)。為了執(zhí)行這些發(fā)育程序，遷移細(xì)胞必需對(duì)細(xì)胞外環(huán)境中存在的正和負(fù)導(dǎo)向信號(hào)作出反應(yīng)，重新組織其肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。這些信號(hào)對(duì)細(xì)胞遷移的影響受到細(xì)胞表面上的跨膜受體的補(bǔ)體、以及由特定信號(hào)激活的多樣的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的指令。神經(jīng)和血管網(wǎng)絡(luò)的形成具有共同的分子信號(hào)，這使伸出長(zhǎng)距離的復(fù)雜任務(wù)降為基于細(xì)胞外環(huán)境中的這些特定信號(hào)導(dǎo)航一系列短區(qū)段的較簡(jiǎn)單的任務(wù)。導(dǎo)向信號(hào)分為四種吸引劑和排斥劑，它們可以起短程(是細(xì)胞或基質(zhì)相關(guān)的)或長(zhǎng)程(是可擴(kuò)散的)作用。中間的靶通常是誘引軸突的長(zhǎng)程吸引性信號(hào)、或排斥已經(jīng)進(jìn)入靶的軸突或防止它們?nèi)歼M(jìn)入的短程或長(zhǎng)程排斥信號(hào)的來源。在中間靶之間，軸突和血管往往通過細(xì)胞沿著組織通道制造的吸引性信號(hào)和通過防止它們進(jìn)入周圍組織的排斥信號(hào)來引導(dǎo)通過組織通道。本文中使用的"導(dǎo)向信號(hào)"是可以作用以吸引或排斥神經(jīng)元或血管的導(dǎo)航或形成的分子。導(dǎo)向信號(hào)，例如軸突導(dǎo)向信號(hào)，通常被分類成"吸引性"或"排斥性"。但是，這是一種簡(jiǎn)單化，因?yàn)椴煌妮S突對(duì)于給定的信號(hào)有不同的反應(yīng)。此外，同樣的軸突生長(zhǎng)錐可以根據(jù)時(shí)機(jī)、與同樣的或其它的信號(hào)的已有經(jīng)歷、以及發(fā)現(xiàn)信號(hào)的環(huán)境，對(duì)給定的信號(hào)改變其反應(yīng)。因此，一方面中，導(dǎo)向信號(hào)對(duì)于特定的細(xì)胞可以是吸引性導(dǎo)向信號(hào)。另一方面中，導(dǎo)向信號(hào)對(duì)于特定的細(xì)胞可以是排斥性導(dǎo)向信號(hào)。本文公開的"導(dǎo)向信號(hào)"可以是在細(xì)胞外作用于細(xì)胞受體的蛋白。但是，也公開了能夠在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)作用、以吸引或排斥神經(jīng)元或血管導(dǎo)航的分子，包括核酸和小分子。因此，例如，當(dāng)在本文中公開了導(dǎo)向信號(hào)受體的配體時(shí)，能夠調(diào)節(jié)所述受體的活性或表達(dá)的分子也被公開了。因此，例如，公開了能夠改變本文公開的導(dǎo)向信號(hào)的受體或其信號(hào)傳導(dǎo)分子的基因表達(dá)的組合物，例如功能性核酸。一方面中，這些分影響子與本文公開的傳統(tǒng)蛋白引導(dǎo)分子相同的細(xì)胞受體和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。另一方面，這些分子可以通過本文公開的篩選方法來鑒定。導(dǎo)向信號(hào)可以根據(jù)引導(dǎo)軸突的能力來鑒定。生長(zhǎng)中的軸突在被稱為生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)尖端具有高度能動(dòng)的結(jié)構(gòu)，能夠"嗅出"細(xì)胞外環(huán)境中指示軸突向哪條路生長(zhǎng)的信號(hào)。這些信號(hào)，被稱為導(dǎo)向信號(hào)，可以固定在一個(gè)位置，或者是可擴(kuò)散的；它們可以吸引或排斥軸突。對(duì)于軸突來說，生長(zhǎng)錐含有識(shí)別這些導(dǎo)向信號(hào)并將信號(hào)解釋成趨化性反應(yīng)的受體。普遍的理論框架是，當(dāng)生長(zhǎng)錐"感應(yīng)"到導(dǎo)向信號(hào)時(shí)，受體激活生長(zhǎng)錐中的各種信號(hào)傳導(dǎo)分子，最終影響細(xì)胞骨架。如果軸突的生長(zhǎng)錐感應(yīng)到了導(dǎo)向信號(hào)的梯度，生長(zhǎng)錐中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)不對(duì)稱地發(fā)生，使得細(xì)胞骨架的變化不對(duì)稱地發(fā)生，生長(zhǎng)錐轉(zhuǎn)為朝向或遠(yuǎn)離導(dǎo)向信號(hào)。遺傳和生化方法的組合導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了幾種重要類別的引導(dǎo)分子和它們的受體。導(dǎo)向因子及其受體DCC和UNC5，是能夠作用于吸引或排斥軸突的分泌分子。Slits是分泌蛋白，通常通過與Robo(Roundabout)類受體結(jié)合，排斥神經(jīng)生長(zhǎng)錐。肝配蛋白(Ephrins)是細(xì)胞表面受體，活化其它細(xì)胞表面上的Eph受體。這種相互作用可以是吸引性的或排斥性的。在某些情況下，肝配蛋白也可以用作受體，將信號(hào)傳導(dǎo)到表達(dá)的細(xì)胞中，而Ephs作為配體。信號(hào)傳導(dǎo)到帶有肝配蛋白和Eph的細(xì)胞中，被稱為"雙向信號(hào)傳導(dǎo)"。許多類型的腦信號(hào)蛋白主要是軸突排斥物，并激活被稱為叢蛋白(Plexins)和神經(jīng)氈蛋白(Neuropilins)的細(xì)胞表面受體的復(fù)合體。此外，許多其它類型的細(xì)胞外分子被生長(zhǎng)錐用于適當(dāng)?shù)貙?dǎo)航，包括發(fā)育性形態(tài)發(fā)生素，例如BMPs、Wnts、Hedgehogs以及FGFs;細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子例如NCAM、Ll和層粘連蛋白(laminin);生長(zhǎng)因子例如NGF，以及神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)物例如GABA。因此，如本文所公開，排斥性信號(hào)可以是例如roundabout受體的配體或?qū)蛞蜃邮荏w的配體。xii.Unc5和導(dǎo)向因子導(dǎo)向因子被鑒定為化學(xué)吸引劑，通過與DCC(在結(jié)腸直腸癌中缺失)家族的受體結(jié)合，將軸突導(dǎo)向中線。導(dǎo)向因子也與軸突排斥有牽涉，這是由Unc5家族的受體單獨(dú)作用或與DCC受體一起作用而介導(dǎo)的效應(yīng)。此外，DCC-Unc5異二聚體可以在與單獨(dú)的Unc5受體相比更長(zhǎng)的范圍內(nèi)介導(dǎo)排斥。導(dǎo)向因子1與四種哺乳動(dòng)物Unc5受體之一的Unc5b，也調(diào)控血管的導(dǎo)向。Unc5b在內(nèi)皮頂細(xì)胞中表達(dá)。在小鼠中，喪失Unc5b導(dǎo)致頂細(xì)胞絲狀假足的異常延伸和許多血管的過度分支。在體內(nèi)用導(dǎo)向因子1處理培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞或生長(zhǎng)中的血管，誘導(dǎo)了絲狀假足的回縮。Unc5b在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞排斥中的作用通過在斑馬魚胚胎中分析發(fā)育中的節(jié)間血管(ISV)得到了證實(shí)。導(dǎo)向因子構(gòu)成了與細(xì)胞外基質(zhì)分子層粘連蛋白相關(guān)的、在系統(tǒng)發(fā)生上保守的導(dǎo)向信號(hào)家族。在脊椎動(dòng)物中已經(jīng)鑒定了四種分泌導(dǎo)向因子雞、小鼠、斑馬魚和人類中的導(dǎo)向因子-l;雞中的導(dǎo)向因子-2;小鼠和人類中的導(dǎo)向因子-3;以及小鼠和人類中的導(dǎo)向因子-4。所有的導(dǎo)向因子在結(jié)構(gòu)上都與層粘連蛋白的短臂相關(guān)，并含有層粘連蛋白VI和V結(jié)構(gòu)域。所有的導(dǎo)向因子也含有帶正電荷的C-末端結(jié)構(gòu)域，被稱為NTR模塊。導(dǎo)向因子-1、-2和-3與層粘連蛋白的7鏈更緊密相關(guān)。相反，導(dǎo)向因子-4與層粘連蛋白的(3鏈更緊密相關(guān)。已經(jīng)鑒定到兩種導(dǎo)向因子受體家族，它們指示遷移的方向。這兩個(gè)家族都屬于受體的免疫球蛋白(Ig)超家族。在脊椎動(dòng)物中，在結(jié)腸癌中缺失(DCC)的家族它們含有6個(gè)細(xì)胞外纖連蛋白III型重復(fù)序列，以及4個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)同源性區(qū)域(P1、P2和P3)，它們介導(dǎo)與其它受體例如UNC5b(Pl)禾卩Robol(P3)的相互作用。UNC5家族有4個(gè)成員，UNC5a(UNC5H1)、UNC5b(UNC5H2)、UNC5c(UNC5H3)，含有細(xì)胞外的兩個(gè)Ig和兩個(gè)血小板反應(yīng)蛋白I型(Tspl)結(jié)構(gòu)域，以及細(xì)胞內(nèi)的ZU-5、DCC結(jié)合和C-末端死亡結(jié)構(gòu)域。在功能上，DCC家族介導(dǎo)了對(duì)導(dǎo)向因子-1的吸引，而UNC5家族通過與DCC形成導(dǎo)向因子-1依賴性復(fù)合體而介導(dǎo)排斥。兩個(gè)家族的成員都顯示出作為依賴性受體起作用，并在缺乏和不存在配體的情況下誘導(dǎo)凋亡。xiii.腦信號(hào)蛋白和神經(jīng)氈蛋白/叢蛋白正如本文公開的，某些腦信號(hào)蛋白可以通過叢蛋白起作用而增加血管通透性。因此，在公開的組合物和方法的某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)不是腦信號(hào)蛋白。在公開的組合物和方法的某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)不是叢蛋白或神經(jīng)氈蛋白的配體。但是，正如本文公開的，腦信號(hào)蛋白3E通過叢蛋白Dl起作用，抑制血管的通透性。因此，在某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)可以是腦信號(hào)蛋白3E。在某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)可以是叢蛋白Dl的配體。腦信號(hào)蛋白是被分泌的導(dǎo)向信號(hào)，能夠長(zhǎng)程擴(kuò)散(3類)，但是在某些情況下具有受限的擴(kuò)散，或者是膜結(jié)合的并作為短程導(dǎo)向信號(hào)起作用。腦信號(hào)蛋白最廣為人知的是作為排斥劑，但是依賴于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)核苷酸水平，腦信號(hào)蛋白3A(Sema3A)也可以起化學(xué)吸引劑的作用。腦信號(hào)蛋白通過下述多聚體受體復(fù)合體傳導(dǎo)信號(hào)膜結(jié)合的腦信號(hào)蛋白與叢蛋白結(jié)合，但是分泌的3類腦信號(hào)蛋白與神經(jīng)氈蛋白結(jié)合，它與叢蛋白作為非信號(hào)傳導(dǎo)的共同受體發(fā)揮作用。這種規(guī)律的例外是分泌的Sema3E，它與叢蛋白Dl(Plxndl)直接結(jié)合。此外，膜錨定的Sema7A通過活化整合素刺激軸突延伸。腦信號(hào)蛋白及其受體也調(diào)節(jié)血管的導(dǎo)向和分支。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)各種神經(jīng)氈蛋白和叢蛋白受體。Sema3A抑制內(nèi)皮片狀偽足和血管的形成。神經(jīng)氈蛋白2在靜脈和淋巴管中表達(dá)，而神經(jīng)氈蛋白1廣泛表達(dá)在發(fā)育中的血管系統(tǒng)中。神經(jīng)氈蛋白也牽涉在血管成型中，但是這可能反映了它們?cè)谡{(diào)節(jié)VEGF中而不是在腦信號(hào)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，因?yàn)樯窠?jīng)氈蛋白也是特定VEGF同工型(VEGF165)的受體，并調(diào)節(jié)VEGF受體的活性。此外，VEGF165與Sema3A競(jìng)爭(zhēng)與神經(jīng)氈蛋白的結(jié)合。正如本文公開的，腦信號(hào)蛋白3E通過叢蛋白Dl起作用，抑制血管的通透性。因此，在某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)可以是腦信號(hào)蛋白3E。在某些情況下，排斥性導(dǎo)向信號(hào)可以是叢蛋白Dl的配體。xiv.肝配蛋白和Ephs另一類重要的短程軸突導(dǎo)向分子是Eph受體酪氨酸激酶及其肝配蛋白配體。哺乳動(dòng)物中的13種Eph受體被分類成A(EphAl-8)和B(EphBl-4禾t!EphB6)亞家族。8種肝配蛋白受體包括肝配蛋白Al-5，它們通過糖基-磷脂酰肌醇錨束縛到膜上，以及肝配蛋白Bll-3，它們含有跨膜和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。肝配蛋白A配體與EphA受體結(jié)合，肝配蛋白B配體與EphB受體結(jié)合；在家族之間僅觀察到中等程度的交叉反應(yīng)；例如，EphA4與某些B類的肝配蛋白結(jié)合。Eph受體和肝配蛋白在表達(dá)Eph受體(正向信號(hào)傳導(dǎo))或肝配蛋白B配體(反向信號(hào)傳導(dǎo))的細(xì)胞中發(fā)動(dòng)雙方向信號(hào)傳導(dǎo)。通過視網(wǎng)膜地形學(xué)投影(topogr叩hicretinotectalprojection)研究，肝配蛋白首先被鑒定為排斥性軸突導(dǎo)向分子，隨后被暗示在其它布線過程(wiringprocesses)中作為負(fù)性和正性信號(hào)。Eph-肝配蛋白信號(hào)也控制血管的發(fā)育。這些導(dǎo)向分子中的一些屬于首先發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈或靜脈中選擇性表達(dá)的因子。在歷史上，據(jù)推測(cè)，血液動(dòng)力學(xué)壓力差調(diào)控了高壓血管分化成動(dòng)脈和低壓血管分化成靜脈。但是，在小鼠中進(jìn)行的表達(dá)分析和功能缺失研究表明，EphB4和肝配蛋白B2分別在發(fā)育的靜脈和動(dòng)脈中表達(dá)，對(duì)于它們的維持是關(guān)鍵的。這些研究表明，排斥性的肝配蛋白B2-EphB4信號(hào)傳導(dǎo)——正向的和反向的一一都可以防止靜脈和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的混合，確保了"類似"內(nèi)皮細(xì)胞的組裝，并為動(dòng)脈-靜脈邊界劃分界限。排斥性的肝配蛋白-Eph信號(hào)為血管導(dǎo)航通過組織邊界航行提供短程導(dǎo)向信號(hào)。例如，肝配蛋白B2排斥表達(dá)EphB3/EphB4的ISVs進(jìn)入體節(jié)。但是，肝配蛋白-Eph相互作用在其它情況下也可以提供吸引性信號(hào)并誘導(dǎo)毛細(xì)血管萌發(fā)。例如，肝配蛋白B配體和EphBs在相同血管中鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞上的近分泌表達(dá)，可以為建立接觸依賴性通訊提供雙方向信號(hào)，并促進(jìn)血管的裝配、萌發(fā)和成熟。例如，肝配蛋白A配體也可以起血管形態(tài)發(fā)生的正調(diào)控劑的作用。EphA2/肝配蛋白Al信號(hào)傳導(dǎo)已經(jīng)被顯示出抑制了VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管通透性，并且已經(jīng)牽涉在糖尿病型視網(wǎng)膜病中治療新生血管和血管通透性異常(Ojima等，2006)。因此，在公開的用于抑制血管通透性的組合物和方法的某些情況下，排斥性信號(hào)不是Eph或肝配蛋白受體的配體。在其它情況下，公開的組合物除了Eph或肝配蛋白受體的配體之外，包含至少一種導(dǎo)向信號(hào)。xv.Slits禾口Roundabouts排斥性導(dǎo)向信號(hào)的著名例子是Slit家族的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。Slit最初是在軸突導(dǎo)向缺陷的遺傳篩選中，在果蠅胚胎的中線上鑒定的(Seeger等，1993;Kidd等，1998;Battye等，1999;Kidd等，1999)。隨后，在脊椎動(dòng)物中克隆到了三個(gè)進(jìn)化上保守的Slit基因，它們編碼的蛋白排斥軸突(Brose等，1999;Li等，1999)，并促進(jìn)感覺性軸突的樹枝狀分枝(Wang等，1999)。遺傳和生化研究已經(jīng)證實(shí)，Robo家族的跨膜蛋白起到Slit蛋白的受體的作用。與slit類似，robo也是在果蠅的軸突導(dǎo)向缺陷的遺傳篩選中發(fā)現(xiàn)的(Seeger等，1993)。在脊椎動(dòng)物中己經(jīng)鑒定了4種Robos，其中Robo1-3主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)(Marillat等，2002)。相反，Robo4，也被稱為MagicRoundabout,專門表達(dá)在胚胎小鼠的血管系統(tǒng)(Park等，2003)、胎盤動(dòng)脈(Huminiecki等，2002)以及各種人類惡性腫瘤的腫瘤內(nèi)皮中(Huminiecki等，2002;Seth等，2005)。Robo4與Robo1-3的進(jìn)一步區(qū)別在于它的不同序列神經(jīng)元Robos的胞外結(jié)構(gòu)域含有5個(gè)免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域和3個(gè)纖連蛋白m型(FNin)重復(fù)序列，而Robo4含有兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FNIII重復(fù)序歹"Huminiecki等，2002;Park等，2003)。此外，Robo1-3具有4個(gè)保守的細(xì)胞質(zhì)(CC)基序，CC0、CC1、CC2禾nCC3(Kidd等，1998;Zallen等，1998)，其中Robo4中只存在CC0和CC2(Huminiecki等，2002;Park等，2003)。Robo在神經(jīng)系統(tǒng)中促進(jìn)導(dǎo)向決定的能力依賴于Slit刺激的受體下游的特定生化程序的激活。在果蠅、線蟲(C.elegans)和哺乳動(dòng)物中對(duì)Slit依賴性排斥的分析己經(jīng)鑒定到了在神經(jīng)系統(tǒng)中Robo信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介導(dǎo)物。在果蠅中，Abelson(Abl)酪氨酸激酶和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Enabled(Ena)參與了調(diào)控Robo的排斥活性(Bashaw等，2000)。其它在果蠅中的研究鑒定到了RacGTPase活化蛋白(GAP)，它參與了Robo介導(dǎo)的氣管細(xì)胞和軸突的排斥(Lundstrom等，2004;Hu等，2005)。在線蟲中，從遺傳分析中已經(jīng)顯露出Ena在調(diào)節(jié)Slit信號(hào)傳導(dǎo)中的直接功能(Yu等，2002)。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元中，Robol相互作用蛋白srGAPl對(duì)于Slit依賴性排斥前體細(xì)胞從室管膜前下區(qū)遷移是必需的(Wong等，2001)。這些機(jī)制性的研究不僅開始闡釋了神經(jīng)元Robos下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且這樣的研究已經(jīng)為受體的排斥性活性提供了解釋。與神經(jīng)系統(tǒng)相反，關(guān)于血管系統(tǒng)中的Slit-Robo信號(hào)傳導(dǎo)了解得很少，并且盡管有有分量的證據(jù)表明Slit-Robo信號(hào)傳導(dǎo)抑制了神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(Wu等，1999;Zhu等，1999;Wu等，2001;Park等，2003;Seth等，2005)，但幾項(xiàng)最近的報(bào)告提出，Robos能夠以Slit依賴性和Slit非依賴性的方式促進(jìn)血管生成。例如，據(jù)報(bào)道，Robol的Slit2刺激在體外誘導(dǎo)了遷移和管形成，并在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤的血管生成(Feng等，2004)。此外，最近的研究顯示，用可溶性Robo4胞外結(jié)構(gòu)域阻斷Robo4的活性，在體外抑制了遷移和管形成，這與Robo4在血管生成過程中的正性作用相一致。此外，該研究報(bào)告了Slit蛋白不與Robo4結(jié)合，從而暗示了受體具有未知的配體(Suchting等，2004)。Robo4促血管生成的這種觀念，也已經(jīng)從最近的數(shù)據(jù)中浮現(xiàn)出來，這些數(shù)據(jù)顯示，Robo4的過表達(dá)不依賴Slit就增加了內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移(Kaur等，2006)。這些似乎不一致的觀察強(qiáng)調(diào)了需要確定Slit-Robo信號(hào)傳導(dǎo)在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能性意義和機(jī)制。正如本文公開的，Slit2是Robo4的配體，Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行負(fù)調(diào)控，并抑制血管通透性。具體來說，本文提供的講述確立了Slit2在內(nèi)皮細(xì)胞中通過活化Robo4引發(fā)排斥性信號(hào)，定義了一個(gè)為這種活性負(fù)責(zé)的新信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)。正如本文描述的，Robo4的Slit2活化抑制了Rac活化，從而抑制了Rac啟動(dòng)或介導(dǎo)的細(xì)胞活動(dòng)性和細(xì)胞鋪展。本文提供的講述還建立起Robo4和連接蛋白樁蛋白之間的Slit2依賴性聯(lián)合，本文詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了生化和細(xì)胞生物學(xué)證據(jù)，表明這種相互作用對(duì)于細(xì)胞遷移、鋪展和Rac活化的Robo4依賴性抑制是關(guān)鍵的。具體來說，正如本文講述的，Robo4的活化發(fā)動(dòng)了樁蛋白對(duì)GIT1的活化，接著，GIT1又抑制了ARF6。Robo4的活化保護(hù)了內(nèi)皮的屏障功能，阻斷了VEGF受體下游的VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，并減少了血管滲漏和病理性血管生成。重要的是，Robo4活化不僅阻斷了VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，而且抑制了來自多種血管生成、通透性和炎性因子包括凝血酶和bFGF的信號(hào)傳導(dǎo)。正如也在本文中公開的，Robo4-樁蛋白信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于斑馬魚中胚胎血管的適當(dāng)發(fā)育來說是必需的。這些公開的與Robo4活化有關(guān)的關(guān)系和結(jié)果，允許產(chǎn)生如本文所述用于調(diào)節(jié)和細(xì)胞操縱的新靶。本文中使用的"調(diào)節(jié)"包括改變靶的活性，本文使用的"操縱"包括改變細(xì)胞的狀態(tài)。血管通透性其特征為不利的血管通透性的疾病和紊亂包括例如與腦腫瘤相關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、麥格綜合征(Meigs'syndrome)、肺炎、腎病綜合征、心包腔積液和胸膜腔積液。因此，提供了治療或預(yù)防這些或與血管通透性增加或水腫有關(guān)的任何其它疾病的方法。例如，抑制水腫的形成對(duì)于處于例如炎癥、過敏性疾病、癌癥、腦中風(fēng)、心肌梗塞、心肺功能不足、腎衰竭和視網(wǎng)膜病等情況下的患者的總體結(jié)果來說，將是有益的。此外，因?yàn)樗[是組織缺氧的普遍后果，因此也可以推論，抑制血管滲漏代表了治療組織缺氧的潛在方法。例如，由病理性狀況(例如血栓形成)或醫(yī)學(xué)干預(yù)(例如心麻痹、器官移植和血管成形術(shù))中斷的血液流動(dòng)，可以使用血管滲漏抑制劑進(jìn)行急性和預(yù)防性治療。中風(fēng)和心肌梗塞后的局部缺血/再灌注損傷，其特征也是血管通透性和水腫。組織灌注不足導(dǎo)致永久性局部缺血后血管源性的水腫，它是由于血管通透性增加而發(fā)生的。組織灌注是氧化的血液由于動(dòng)脈的開放和血液在動(dòng)脈中的流動(dòng)而到達(dá)給定組織的度量。組織血管形成可能由于阻塞而被破壞，或者可選地，可能是由于受影響位點(diǎn)上游的血管滲漏或出血導(dǎo)致的血流損失所致。在急性心肌梗塞、腦中風(fēng)、外科血管再生術(shù)和組織血管形成被破壞的其它條件期間組織灌注的不足，是造成患者病癥后果的關(guān)鍵因素。水腫可以引起各種類型的傷害，包括血管枬塌和電功能受損，特別是在心臟中。但是，隨后的再灌注在某些患者中也能造成類似的損傷，導(dǎo)致治療上的矛盾。盡管疏通阻塞的血管或者修復(fù)或替換受損的血管是必要的，但隨后發(fā)生的再灌注，在某些情況下，可以導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷。同樣地，在旁路手術(shù)期間，必需使心臟停止跳動(dòng)并使患者掛上心臟泵。例如，某些經(jīng)歷了旁路手術(shù)的患者，事實(shí)上可能經(jīng)歷病癥的惡化("泵后綜合征征")，這可能是手術(shù)期間停止心臟功能過程中局部缺血的結(jié)果。動(dòng)脈阻塞可能引起血流減少，但即使是除去阻塞使開放動(dòng)脈之后，如果不能發(fā)生組織再灌注，可能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷。例如，血凝塊的破壞可以觸發(fā)一連串事件，導(dǎo)致喪失組織灌注，而不是獲得灌注。以不利的血管通透性為特征的其它疾病和紊亂，包括例如可以導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的感染性和非感染性疾病。細(xì)胞因子風(fēng)暴可以由多種感染性和非感染性疾病促成，包括例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血病、禽流感、天花、以及全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)。病理性血管生成血管生成和血管生成相關(guān)的疾病受到細(xì)胞增殖的緊密影響。在本文中使用的術(shù)語"血管生成"是指在組織或器官中產(chǎn)生新的血管。在正常生理?xiàng)l件下，人類或動(dòng)物只有在非常特定的限定情況下才經(jīng)歷血管生成。例如，血管生成通常在傷口愈合、胎兒和胚胎發(fā)育、以及黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤的形成中才觀察到。本文中定義的術(shù)語"內(nèi)皮"是指襯在槳膜腔、淋巴管和血管中的一薄層扁平細(xì)胞。這些細(xì)胞在本文中被定義為"內(nèi)皮細(xì)胞"。術(shù)語"內(nèi)皮抑制活性"是指分子總體抑制血管生成的能力。抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖也導(dǎo)致抑制血管生成。受控的和不受控的血管生成都被認(rèn)為都以同樣的方式開始。被基底膜包圍著的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞形成了毛細(xì)血管。隨著基底膜被內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放的酶侵蝕，開始血管生成。然后，襯在血管腔的內(nèi)皮細(xì)胞通過基底膜突出。血管生成刺激物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通過被侵蝕的基底膜遷移。遷移中的細(xì)胞形成從親代血管抽出的"萌芽"，其中內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷了有絲分裂和增殖。內(nèi)皮的萌芽彼此融合，形成了毛細(xì)環(huán)，產(chǎn)生了新的血管。新的血管也可以部分通過血管發(fā)生而形成。血管發(fā)生與血管生成的差別在于內(nèi)皮細(xì)胞的來源。血管發(fā)生包括召集被稱為成血管細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞。這些成血管細(xì)胞可以來自循環(huán)或來自組織。血管發(fā)生受到與血管生成類似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。因此，本文使用的術(shù)語"血管生成"可以與血管發(fā)生互換使用，從而調(diào)節(jié)血管生成的方法也可以調(diào)節(jié)血管發(fā)生?？梢砸杂谰眯允д{(diào)或不受調(diào)節(jié)的血管生成為特征的病理性血管生成，在多種疾病狀態(tài)、腫瘤轉(zhuǎn)移和內(nèi)皮細(xì)胞的異常生長(zhǎng)中發(fā)生，并支持在這些情況下中觀察到的病理性損傷。其中存在病理性血管生成的多種疾病狀態(tài)已經(jīng)在一起分組為血管生成依賴性的、血管生成相伴的、血管生成相關(guān)的疾病。這些疾病是異常或不利的細(xì)胞增殖、特別是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的結(jié)果。由異?；虿恍枰膬?nèi)皮細(xì)胞增殖介導(dǎo)的疾病和過程，包括但不限于血管瘤、實(shí)體腫瘤、白血病、腫瘤轉(zhuǎn)移、毛細(xì)血管擴(kuò)張性牛皮癬硬皮病、化膿性肉芽腫、心肌血管生成、斑塊新生血管化、冠狀動(dòng)脈側(cè)枝、缺血性肢體血管生成、角膜病、虹膜發(fā)紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、晶體后纖維膜增生癥、非增殖性糖尿病型黃斑水腫(DME)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新生血管化、衰老相關(guān)的黃斑變性(AMD)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(IRVO)、傷口愈合、消化性潰瘍、骨折、瘢痕瘤、血管發(fā)生、造血、排卵、月經(jīng)和胎盤形成。組合物本文提供了用于在組織中抑制血管通透性和病理性血管生成的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的組合物含有Unc5或在結(jié)腸直腸癌中缺失(DCC)的受體的配體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，Unc5或DCC的配體可以是能夠通過Unc5或DCC受體起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何組合物或分子。在本文中使用的術(shù)語"通過受體起作用"是指組合物與受體的結(jié)合促進(jìn)了受體的活性。例如，組合物可以含有Unc5或DCC的配體，它們通過Unc5或DCC受體起作用，激活Gitl對(duì)ARF6的抑制。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物可以含有Unc5或DCC的配體，它們通過Unc5或DCC受體起作用，激活樁蛋白對(duì)Gitl的活化。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的組合物可以含有模擬Unc5或DCC受體激活樁蛋白對(duì)Gitl的活化的組合物或分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物包含Unc5的配體，其中配體是導(dǎo)向因子，例如人類導(dǎo)向因子l、導(dǎo)向因子2、導(dǎo)向因子4、導(dǎo)向因子Gl或?qū)蛞蜃覩2和嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)導(dǎo)向因子l、導(dǎo)向因子3、導(dǎo)向因子4、導(dǎo)向因子Gl或?qū)蛞蜃覩2，或其片段或變異體，它們結(jié)合并活化Unc5b以抑制ARF6。例如導(dǎo)向因子配體可以含有選自SEQIDNO:17、SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25的氨基酸序列，或這些氨基酸序列結(jié)合Unc5b的變異體或片段。這樣的氨基酸序列片段的長(zhǎng)度至少大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Unc5b的導(dǎo)向因子配體可以含有與選自SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25的氨基酸序列或其與Unc5b結(jié)合的片段具有至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物可以含有Eph的配體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，組合物含有能夠通過Eph受體起作用以抑制Rac被VEGF活化的Eph的配體。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，組合物含有能夠通過Eph受體起作用以活化Gitl對(duì)ARF6的抑制的Eph的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本說明的組合物可以含有能夠通過Eph受體起作用以激活Eph對(duì)Gitl的活化的任何組合物或分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物可以含有模擬Eph受體以激活樁蛋白對(duì)Gitl的活化的任何組合物或分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的組合物含有Robo4受體的配體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，Robo4的配體可以是能夠通過Robo4起作用對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行負(fù)調(diào)控的任何組合物或分子。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，Robo4的配體可以是能夠通過Robo4起作用以抑制血管通透性的任何組合物或分子。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，Robo4的配體可以是能夠通過Robo4起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何組合物或分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物包含Robo4受體的配體，其中配體能夠通過Robo4起作用以啟動(dòng)樁蛋白對(duì)GITl的活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物包括Robo4受體的配體，其中配體能夠通過Robo4起作用以活化Gitl對(duì)ARF6的抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物包含Robo4受體的配體，其中配體通過Robo4起作用的方式導(dǎo)致下列效應(yīng)中的一種或多種保護(hù)內(nèi)皮屏障功能，阻斷VEGF受體下游的VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，抑制血管滲漏，抑制病理性血管生成，多種血管生成、通透性和炎性因子的信號(hào)抑制。當(dāng)本發(fā)明的組合物包含Robo4的配體時(shí)，配體是結(jié)合Robo4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的任何組合物或分子。或者，Robo4的配體能夠是通過Robo4受體起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何組合物或分子。此外，Robo4的配體能夠是通過Robo4受體起作用以活化Gitl對(duì)ARF6的抑制的任何組合物或分子。此外，Robo4的配體能夠是通過Robo4受體起作用以激活樁蛋白對(duì)Gitl的活化的任何組合物或分子。在另一種情況下，Robo4的配體能夠是模擬Robo4受體以激活樁蛋白對(duì)Gitl的活化的任何組合物或分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本說明的組合物中包含的Robo4的配體含有長(zhǎng)度為大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400個(gè)氨基酸的分離的多肽。當(dāng)本文描述的組合物包含Robo4的配體時(shí)，這樣的配體可以是Slit，例如Slit2、或其結(jié)合并活化Robo4的片段或變異體。在具體的實(shí)施方案中，Slit配體或其片段或變異體，結(jié)合并活化Robo4的方式，導(dǎo)致了下列一種或多種效應(yīng)抑制ARF6;保護(hù)內(nèi)皮屏障功能；阻斷VEGF受體下游的VEGF信號(hào)傳導(dǎo)；抑制血管滲漏；抑制病理性血管生成；以及多種血管生成、通透性和炎性因子的信號(hào)抑制。例如，Robo4的配體可以包含選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、以及SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一個(gè)的氨基酸序列或其結(jié)合Robo4的片段。例如，這樣的氨基酸序列的片段的長(zhǎng)度至少大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。Robo4的配體可以含有與選自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、以及SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一個(gè)的氨基酸序列或其結(jié)合Robo4的片段具有至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約100%的序列同一性的氨基酸序列。Slit的片段可以含有Slit的N-末端區(qū)域。例如，Robo4的配體可以含有Slitl的1-1132位氨基酸(SEQIDNO:36)、Slit2的1-1121位氨基酸(SEQIDNO:37)、Slit3的1-1118位氨基酸(SEQIDNO:38)或在圖23中圖示的并在SEQIDNO:39到SEQIDNO:47中詳細(xì)描述的N-末端片段中的任何一個(gè)。在具體的實(shí)施方案中，Robo4的配體可以含有基本上由選自SEQIDNO:36到SEQIDNO:47任何一個(gè)中的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。在某些實(shí)施方案中，正如在SEQIDNO:39到SEQIDNO:47的氨基酸序列中反映的那樣，包含在本發(fā)明組合物中的Slit片段不包含最N-末端的氨基酸。例如，氨基酸序列可以缺少天然Slit的大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或ioo個(gè)N-末端氨基酸。在其它實(shí)施方案中，sm片段可以不包含天然Slit最C-末端的大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氮基酸。例如，Robo4的配體可以含有基本上由Slit1的281-511位氨基酸(SEQIDNO:15)或Slit2的271-504位氨基酸(SEQIDNO:16)構(gòu)成的多肽。因此，Robo4的配體可以包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其結(jié)合Robo4的片段。Robo4的配體可以含有與SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其結(jié)合Robo4的片段具有至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以含有Robo4的能夠激活樁蛋白活化Gitl的片段。因此，本文提供了含有Robo4的樁蛋白結(jié)合序列的分離的多肽，其中多肽不含全長(zhǎng)Robo4。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，樁蛋白結(jié)合序列可以含有氨基酸序列SEQIDNO:27或其結(jié)合樁蛋白的片段或變異體。例如，片段的長(zhǎng)度可以是至少大約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。氨基酸序列SEQIDNO:27的片段或變異體可以含有與SEQIDNO:27或其結(jié)合樁蛋白的片段具有至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約卯％、至少大約95%或至少大約100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的組合物含有的分離的多肽包含Robo4的樁蛋白結(jié)合序列(PBS)，其中所述多肽由下式定義R、PBS-R2其中W和W獨(dú)立是H、酰基、NH2、氨基酸或肽，其中多肽不包含全長(zhǎng)Robo4。PBS可以由與SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少10個(gè)殘基的片段具有至少80%序列同源性的氨基酸序列組成。本文還提供了編碼本文公開的任何多肽的分離的核酸。因此，提供了編碼含有Robo4的樁蛋白結(jié)合序列的多肽的分離的核酸，其中多肽不含有全長(zhǎng)Robo4。還提供了含有SEQIDNO:2或其長(zhǎng)度為至少30個(gè)殘基的片段的分離的核酸，其中所述核酸不編碼全長(zhǎng)的Robo4。藥物組合物本文描述的組合物，例如本文公開的配體、蛋白和肽，可以配制在藥物組合物中。例如，這樣的組合物可以與可藥用的載體混合，以提供適合治療施用的劑型。在本文中使用的"可藥用的"是指不是生物學(xué)上或其它方面不利的物質(zhì)，即所述物質(zhì)可以與所述組合物(例如所需的配體、蛋白、肽、核酸、小分子治療藥等)一起給對(duì)象施用，而不會(huì)引起任何不想要的生物學(xué)效應(yīng)、或以有害的方式與包含它的藥物組合物中的任何其它成分發(fā)生相互作用。載體自然應(yīng)該選擇成使活性成分在對(duì)象中的任何降解最小化，并使在對(duì)象中的任何不利的副作用最小化，這是本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟知的。物質(zhì)可以在溶液、懸浮液中(例如，慘入到微粒、脂質(zhì)體、或細(xì)胞中)。它們可以通過抗體、受體或受體配體靶向特定的細(xì)胞類型。下面的參考文獻(xiàn)是使用這種技術(shù)將特定蛋白靶向腫瘤組織的例子(Senter等，BioconjugateChem.,2:447-451，(1991);Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60:275-281,(1989);Bagshawe等，Br.J.Cancer,58:700-703,(1988);Senter等，BioconjugateChem.，4:3-9,(1993);Battelli,等，CancerImmunol.Immunother.，35:421-425,(1992);Pietersz禾口McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992);以及Roffler等，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。介質(zhì)例如"stealth"和其它抗體偶聯(lián)的脂質(zhì)體(包括耙向結(jié)腸癌的脂類介導(dǎo)藥物)，受體介導(dǎo)的通過細(xì)胞特異性配體的DNA定向，淋巴細(xì)胞指導(dǎo)的腫瘤定向，以及高度特異性的治療性反轉(zhuǎn)錄病毒在體內(nèi)靶向鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。下面的參考文獻(xiàn)是使用該技術(shù)將特定蛋白靶向腫瘤組織的例子(Hughes等，CancerResearch,49:6214-6220,(1989);以及Litzinger和Huang,BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179-187,(1992))。一般來說，受體組成性地或受配體誘導(dǎo)地參與胞吞途徑。網(wǎng)格蛋白包被的小窩中的這些受體簇，通過網(wǎng)格蛋白包被的小泡進(jìn)入細(xì)胞，通過酸化的內(nèi)體，受體在其中被分類，然后或者重新循環(huán)到細(xì)胞表面，成為儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，或者在溶酶體中降解。內(nèi)化途徑具有各種不同的功能，例如營養(yǎng)攝取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的機(jī)會(huì)進(jìn)入、配體的解離和降解、以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體參加一種以上的細(xì)胞內(nèi)途徑，這依賴于細(xì)胞類型、受體濃度、配體的類型、配體價(jià)以及配體濃度。受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子和細(xì)胞機(jī)理已經(jīng)被綜述(Brown和Greene,DNAandCellBiology10:6，399-409(1991))。適合的載體和它們的配制描述在A.R.Gennaro編著的《Remington:藥物科學(xué)與實(shí)踐》第19版中(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)，MackPublishingCompany,Easton,PA1995)。通常，在配方中使用適當(dāng)量的可藥用鹽以賦予制劑等滲性。可藥用載體的例子包括但不限于鹽水、林格(Ringer's)液和葡聚糖溶液。溶液的pH優(yōu)選從大約5到大約8，更優(yōu)選從大約7到大約7.5。其它的載體包括持續(xù)釋放制劑例如含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)是造型制品的形式，例如薄膜、脂質(zhì)體或微粒。對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說，顯然根據(jù)例如給藥途徑和所施用的組合物的濃度，某些載體可能是更優(yōu)選的。藥物載體對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說是已知的。這些最典型是存在用于給人類用藥的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括溶液例如無菌水、鹽水、以及生理pH下的緩沖溶液。組合物可以肌內(nèi)或皮下給藥。其它化合物將按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行給藥。藥物組合物除了選擇的分子之外，還可以包含載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。藥物組合物也可以包含一種或多種活性成分，例如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。用于腸胃外給藥的制劑包含無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、乙醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流體和營養(yǎng)物補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格葡萄糖溶液的那些)等。防腐劑和其它添加劑也可以存在，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。用于局部給藥的制劑可以包括油膏、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)的藥物載體、水性、粉末或油狀基質(zhì)、增稠劑等，可以是必要的或適宜的。用于口服給藥的組合物包括粉末或顆粒、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、袋劑或片劑。增稠劑、香料、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是需要的。某些組合物可能可以作為可藥用的酸或堿加成鹽施用，酸或堿加成鹽的形成是通過與無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸以及有機(jī)酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和富馬酸進(jìn)行反應(yīng)，或與無機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀和有機(jī)堿例如單、二和三垸基和酰基胺和取代的乙醇胺進(jìn)行反應(yīng)。方法本文提供了篩選或評(píng)估抑制血管通透性或病理性血管生成的藥劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括確定所述藥劑影響Robo4介導(dǎo)的Gitl活化的能力。例如Robo4介導(dǎo)的Gitl活化可以通過下面的步驟來測(cè)定，所述步驟包括將表達(dá)Robo4的第一種細(xì)胞與候選藥劑相接觸，將基本上與第一種細(xì)胞相同但是基本上缺乏Robo4的第二種細(xì)胞與候選藥劑相接觸，并在第一種和第二種細(xì)胞中分析Gitl的活化，其中在第一種細(xì)胞中檢測(cè)到的Gitl活化與第二種細(xì)胞相比更高，表明了所述藥劑的Robo4介導(dǎo)的Gitl活化。正如本文公開的，Robo4介導(dǎo)的Gitl活化導(dǎo)致ARF6失活。ARF6參與VEGF介導(dǎo)的Rac活化，Rac活化Pak，Pak活化MEK，MEK活化ERK，ERK促進(jìn)血管通透性。因此，正如本文公開的，可以通過檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的任何成分被激活還是失活，來分析Gitl的活化。因此，可以通過檢測(cè)ARF6失活、Rac失活、Pak失活、MEK失活或ERK失活來分析Robo4介導(dǎo)的Gitl活化。應(yīng)該理解，任何其它已知的或新發(fā)現(xiàn)的監(jiān)控這種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的方法可以用于公開的方法中。還提供了篩選或評(píng)估能夠抑制血管通透性的藥劑的方法，包括確定所述藥劑抑制ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的能力。例如，Robo4介導(dǎo)的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的抑制通過下面的步驟來確定，包括將表達(dá)Robo4的第一種細(xì)胞與候選藥劑相接觸，將基本上與第一種細(xì)胞相同但是基本上缺乏Robo4的第二種細(xì)胞與候選藥劑相接觸，并在第一種和第二種細(xì)胞中分析ARF6、Rac、Pak、MEK、ERK或其組合的抑制，其中在第一種細(xì)胞中檢測(cè)到的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的活化與第二種細(xì)胞相比更低，表明所述藥劑的Robo4介導(dǎo)的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK抑制。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白例如Rac、Pak、MEK、ERK的活化能夠通過檢測(cè)所述蛋白的磷酸化來分析。用于檢測(cè)蛋白磷酸化的基于細(xì)胞的和無細(xì)胞的分析方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的，包括使用抗體，所述抗體包括例如抗磷酸絲氨酸(ChemiconAB1603)(Chemicon,Temecula,CA)、抗磷酸蘇氨酸(ChemiconAB1607)和抗磷酸酪氨酸(ChemiconAB1599)。也可以產(chǎn)生特異性針對(duì)磷酸化形式DDX-3的位點(diǎn)特異性抗體。產(chǎn)生和使用所述抗體的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是眾所周知的。本文公開的分析方法可以在基本上不存在VEGF、TNF、凝血酶或組胺的情況下進(jìn)行?；蛘?，公開的分析方法可以在存在生物活性量的VEGF、TNF、凝血酶或組胺的情況下進(jìn)行。蛋白的"活性"包括例如轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞內(nèi)易位、分泌、被激酶磷酸化、被蛋白酶裂解、與其它蛋白的嗜同性和嗜異性結(jié)合、泛素化作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的篩選方法是篩選分析，例如高通量篩選分析。因此，接觸步驟可以是基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的分析。例如，可以將血管內(nèi)皮細(xì)胞與候選藥劑在體內(nèi)、離體或體外接觸。細(xì)胞可以在單層培養(yǎng)物中，但是優(yōu)選組成上皮。細(xì)胞可以在體外或原位進(jìn)行分析，或可以在體外對(duì)所述細(xì)胞的蛋白提取物進(jìn)行分析，以檢測(cè)活化的(例如磷酸化的)Rac、Pak、MEK、ERX。內(nèi)皮細(xì)胞也可以被工程化以表達(dá)報(bào)道基因構(gòu)建體，其中將細(xì)胞與候選藥劑接觸，并評(píng)估報(bào)道基因的表達(dá)。本文中也考慮了使用其它這類基于細(xì)胞的和無細(xì)胞的分析。例如，小分子、氨基酸或核酸模擬物對(duì)血管通透性或病理性血管生成的影響，可以在表達(dá)Robo4的內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行評(píng)估，并與缺少Robo4的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行比較。一般來說，可以從天然產(chǎn)物或合成的(或半合成的)提取物或化學(xué)文庫中，按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法來鑒定候選藥劑。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會(huì)理解，待測(cè)提取物或化合物的準(zhǔn)確來源對(duì)于本發(fā)明的篩選程序來說不是關(guān)鍵的。因此，事實(shí)上任何數(shù)量的化學(xué)提取物或化合物都可以使用本文描述的示例性方法進(jìn)行篩選。這樣的提取物或化合物的例子包括但不限于基于植物、真菌、原核生物或動(dòng)物的提取物、發(fā)酵液和合成的化合物，以及現(xiàn)有化合物的修飾?，F(xiàn)有大量的方法可用于產(chǎn)生任何數(shù)量的化學(xué)化合物的隨機(jī)或定向的合成(例如半合成或全合成)，這些化合物包括但不限于基于糖類、脂類、肽、多肽和核酸的化合物。合成的化合物文庫是可商購的，例如從BrandonAssociates(Merrimack,NH)禾口AldrichChemical(Milwaukee,WI)?；蛘?，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的文庫，可以從許多來源商購，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、HarborBranchOceangraphicsInstitute(Ft.Pierce,Fla.)禾口PharmaMar，U.S.A.(Cambridge,Mass.)。此外，如果需要，可以按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
己知的方法，例如通過標(biāo)準(zhǔn)的提取和分級(jí)方法，來產(chǎn)生天然的和合成生產(chǎn)的文庫。此外，如果需要，任何文庫或化合物都容易使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)、物理或生物化學(xué)方法進(jìn)行修飾。此外，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領(lǐng)域的專業(yè)人員容易理解，只要有可能，用于去復(fù)制(dereplication)(例如分類學(xué)去復(fù)制、生物學(xué)去復(fù)制和化學(xué)去復(fù)制，或其任何組合)或消除其效應(yīng)已知的物質(zhì)的復(fù)制體或重復(fù)體的方法，應(yīng)該被使用。當(dāng)發(fā)現(xiàn)粗提物具有所需的活性時(shí)，必需對(duì)陽性前導(dǎo)提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)，以分離引起觀察到的效應(yīng)的化學(xué)組分。因此，提取、分級(jí)和純化過程的目標(biāo)是在粗提物中仔細(xì)表征和鑒定具有刺激或抑制血管通透性活性的化學(xué)實(shí)體。本文描述的用于在化合物的混合物中檢測(cè)活性的同樣分析可用于純化活性成分并測(cè)試其衍生物。對(duì)這類異源提取物進(jìn)行分級(jí)和純化的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中是已知的。如果需要，已顯示出是治療有用的藥劑的化合物，可以按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法進(jìn)行化學(xué)修飾。被鑒定為具有治療價(jià)值的化合物，然后可以使用動(dòng)物模型針對(duì)希望調(diào)節(jié)血管通透性的疾病或病癥進(jìn)行分析。本文還提供了用于在對(duì)象中抑制血管通透性的方法。正如本文中詳細(xì)描述的，Robo4的活化抑制了血管通透性、抑制了Rac被VEGF的活化、保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能、阻斷了VEGF受體下游的VEGF信號(hào)傳導(dǎo)、抑制了血管滲漏、并抑制了多種血管生成、通透性和炎性因子。正如本文確定的，Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的活化，通過起動(dòng)樁蛋白對(duì)GIT1的活化，這接著又導(dǎo)致GIT1對(duì)ARF6的抑制，來實(shí)現(xiàn)這樣的效應(yīng)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的抑制血管通透性的方法包括施用治療有效量的Robo4的配體，其中這樣的配體導(dǎo)致GITl對(duì)ARF6的抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的配體是本文描述的Slit蛋白。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)象所經(jīng)歷的和通過施用治療有效量的Robo4配體治療的血管通透性，與選自可以導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的感染性和非感染性疾病的疾病狀態(tài)有關(guān)，這些疾病包括，例如，移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血病、禽流感、天花、和全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)、中風(fēng)和心肌梗塞后的局部缺血/再灌注損傷、與腦腫瘤有關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、麥格綜合征、肺炎、腎病綜合征、心包腔積液和胸膜腔積液、炎癥、過敏性疾病、癌癥、腦中風(fēng)、心肌梗塞、心肺功能不足、腎衰竭和視網(wǎng)膜病。本文提供了在對(duì)象中抑制病理性血管生成的方法。正如本文中詳細(xì)描述的，Robo4的活化抑制了多種炎性、通透性和血管生成因子的效應(yīng)。還是如本文確定的，Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的活化，起動(dòng)了樁蛋白對(duì)GIT1的活化，這接著又導(dǎo)致了GIT1對(duì)ARF6的抑制。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的抑制病理性血管生成的方法包括施用治療有效量的Robo4的配體，其中這樣的配體導(dǎo)致了GIT1對(duì)ARF6的抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用的配體是本文描述的Slit蛋白。在具體的實(shí)施方案中，對(duì)象所經(jīng)歷的和通過施用治療有效量的Robo4配體治療的病理性血管生成，與選自下列的疾病狀態(tài)有關(guān)血管瘤、實(shí)體腫瘤、白血病、腫瘤轉(zhuǎn)移、毛細(xì)血管擴(kuò)張性牛皮癬硬皮病、化膿性肉芽腫、心肌血管生成、斑塊新生血管化、冠狀動(dòng)脈側(cè)枝、缺血性肢體血管生成、角膜病、虹膜發(fā)紅、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、晶體后纖維膜增生癥、非增殖性糖尿病型黃斑水腫(DME)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性新生血管化、衰老相關(guān)的黃斑變性(AMD)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(IRVO)、傷口愈合、消化性潰瘍、骨折、瘢痕瘤、血管發(fā)生、造血、排卵、月經(jīng)和胎盤形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防禽流感的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述禽流感或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述ARDS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述SIRS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述RDS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防腫瘤形成或生長(zhǎng)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述腫瘤形成或生長(zhǎng)或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防呼吸窘迫綜合征(RDS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述RDS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(IRVO)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述IRVO或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的非增殖性糖尿病型黃斑水腫(DME)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述DME或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述ROP或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述DR或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的濕型黃斑變性(AMD)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述AMD或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的局部缺血的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述局部缺血或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的出血性中風(fēng)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述出血性中風(fēng)或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的再灌注損傷例如在心肌梗塞和中風(fēng)中觀察到的再灌注損傷的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述再灌注損傷或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的皮膚血管缺陷或畸形的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述缺陷或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象的皮膚施用治療有效量的roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防禽流感的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述禽流感或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述ARDS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的酉己《本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述SIRS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述GVHD或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)、例如roundabout-4(Robo4)受亍本的酉己〈本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防腫瘤形成或生長(zhǎng)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述腫瘤形成或生長(zhǎng)或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防呼吸窘迫綜合征(RDS)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述RDS或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞(IRVO)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述IRVO或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的非增殖性糖尿病型黃斑水腫(DME)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述DME或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roimdabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述ROP或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受<本的配{本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述DR或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的濕型黃斑變性(AMD)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述AMD或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的局部缺血的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述局部缺血或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的出血性中風(fēng)的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述出血性中風(fēng)或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的再灌注損傷例如在心肌梗塞和中風(fēng)中觀察到的再灌注損傷的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述再灌注損傷或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療或預(yù)防對(duì)象的皮膚血管缺陷或畸形的方法，其中所述方法包括鑒定患有所述斑點(diǎn)或處于罹患風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象，以及給對(duì)象的皮膚施用治療有效量的排斥性導(dǎo)向信號(hào)，例如roundabout-4(Robo4)受體的配體。適合于與本文描述的方法結(jié)合使用的配體包括，例如，本文描述的配體。例如，在具體的實(shí)施方案中，本文描述的與Robo受體包括Robo4受體相關(guān)的組合物，以及與Unc5或結(jié)腸直腸癌中缺失的(DCC)受體相關(guān)的組合物，可以在本發(fā)明的方法中用作配體。更具體來說，例如，本文描述的slit化合物可用作配體，用于激活Robo4并實(shí)現(xiàn)本文描述的方法的治療效益。在某些情況下，對(duì)象通過醫(yī)學(xué)診斷來鑒定。例如，患有糖尿病型視網(wǎng)膜病和黃斑變性的對(duì)象，可以通過觀察眼睛中的過量血管來鑒定。急性肺損傷可以通過在不存在充血性心力衰竭情況下的肺水腫來診斷。缺血性中風(fēng)可以通過神經(jīng)圖像和成像(MRI禾nCT)來診斷。其它已知的或新發(fā)現(xiàn)的醫(yī)學(xué)測(cè)定可用于鑒定對(duì)象以用于本公開的方法。此外，對(duì)象可以通過遺傳易感性來鑒定。例如，使患者對(duì)衰老相關(guān)的黃斑變性易感的基因已經(jīng)被鑒定(KleinRJ等，2005;YangZ等，2006;DewanA等，2006)。同樣地，使患者對(duì)腦中血管畸形易感的遺傳突變已經(jīng)被鑒定(PlummerNW等，2005)。其它已知的或新發(fā)現(xiàn)的遺傳測(cè)定可用于鑒定對(duì)象以用于本公開的方法中。本文公開的核酸和多肽分子、以及任何執(zhí)行本公開的方法所必需的組合物，除非另有特別指示，可以使用本
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的專業(yè)人員已知的、用于該特定試劑或化合物的任何方法來制備。例如，核酸例如要用作引物的寡核苷酸，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成方法來制備，或者可以使用酶法或任何其它已知的方法來生產(chǎn)。這樣的方法范圍可以從標(biāo)準(zhǔn)的酶法消化然后進(jìn)行核苷酸片段分離(參見例如，Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)第5,6章)，到純粹的合成方法，例如使用Milligen或Beckman系統(tǒng)lPlusDNA合成儀(例如，Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自動(dòng)化合成儀或ABI380B型)通過氰乙基亞磷酰胺方法?？捎糜谥苽涔押塑账岬暮铣煞椒ㄒ脖籌kuta等，Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)(磷酸三酯和亞磷酸三酯方法)和Narang等，MethodsEnzymol.，65:610-620(1980)(磷酸三酯方法)描述。蛋白核酸分子可以使用已知的方法來制備，例如由Nielsen等，Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)描述的方法。一種生產(chǎn)本文描述的公開蛋白的方法是通過蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)，將兩個(gè)或多個(gè)肽或多肽連接在一起。例如，可以使用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，應(yīng)用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化學(xué)法，化學(xué)合成肽或多肽(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員可以容易地認(rèn)識(shí)到，例如，對(duì)應(yīng)于本公開蛋白的肽或多肽，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)反應(yīng)來合成。例如，可以合成肽或多肽，并且不將其從合成樹脂上裂解下來，但是可以合成肽或蛋白的另一個(gè)片段，然后從樹脂上裂解下來，從而暴露出另一個(gè)片段上被功能性阻斷的端基。通過肽縮合反應(yīng)，這兩個(gè)片段可以通過肽鍵分別在它們的羧基和氨基末端共價(jià)連接，以形成抗體或其片段(GrantGA(1992)《合成的肽用戶指南》(SyntheticPeptides:AUserGuide)，W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992);BodanskyM和TrostB.，主編(1993)《肽合成原理》(PrinciplesofPeptideSynthesis)，Springer-VerlagInc.,NY(在此至少以其與肽合成有關(guān)的材料引為參考)?；蛘撸幕蚨嚯陌凑毡疚牡拿枋鲈隗w內(nèi)獨(dú)立地合成。一旦分離后，這些獨(dú)立的肽或多肽可以被連接，通過類似的肽縮合反應(yīng)形成肽或其片段。例如，克隆的或合成的肽段的酶法連接允許將相對(duì)短的肽片段連接起來，產(chǎn)生較大的肽片段、多肽或全蛋白結(jié)構(gòu)域(AbrahmsenL等，Biochemistry,30:4151(1991))?；蛘?，合成的肽的天然化學(xué)連接，可用于從較短的肽片段合成性地構(gòu)建大的肽或多肽。該方法由兩步驟化學(xué)反應(yīng)構(gòu)成(Dawson等，通過天然化學(xué)連接合成蛋白(SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation)，Science,266:776-779(1994))。第一步是未保護(hù)的合成肽-硫酯與氨基末端含有Cys殘基的另一種未保護(hù)的肽片段進(jìn)行化學(xué)選擇性反應(yīng)，給出了硫酯連接的中間體作為最初的共價(jià)產(chǎn)物。不需要改變反應(yīng)條件，該中間體經(jīng)歷了自發(fā)的、快速的分子內(nèi)反應(yīng)，在連接位點(diǎn)處形成了天然的肽鍵(BaggioliniM等，(1992)FEBSLett.307:97-101;Clark-LewisI等，J.Biol.Chem.，269:16075(1994);Clark-LewisI等，Biochemistry,30:3128(1991);RajarathnamK等，Biochemistry33:6623-30(1994))?；蛘撸瑢⑽幢Ｗo(hù)的肽片段化學(xué)連接，由于化學(xué)連接在肽片段之間形成的鍵是非天然的(非肽)鍵(Schnolzer,M等，Science,256:221(1992))。這種技術(shù)已經(jīng)被用于合成蛋白結(jié)構(gòu)域的類似物，以及大量相對(duì)純的具有完全生物學(xué)活性的蛋白(deLisleMiltonRC等，《蛋白質(zhì)化學(xué)中的技術(shù)》(IV)(TechniquesinProteinChemistryIV)，AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。公開了用于制造本文公開的核酸以及用于制造可用于表達(dá)本文描述的蛋白和肽分子的核酸的方法。有各種各樣的方法可用于制造這些組合物，例如合成化學(xué)方法和標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法。應(yīng)該理解，制造這些以及其它公開的組合物的方法已具體公開。公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中顯示的序列的核酸，與控制所述核酸表達(dá)的序列連接起來。還公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將含有與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中顯示的序列具有80%同一性的序列的核酸分子，與控制所述核酸表達(dá)的序列連接起來。公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將所含的序列在嚴(yán)緊雜交條件下與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中顯示的序列雜交的核酸分子，與控制所述核酸表達(dá)的序列連接起來。公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將所含的序列編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一個(gè)中顯示的肽的核酸分子，與控制所述核酸分子表達(dá)的序列連接起來。公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將所含的序列編碼的肽與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一個(gè)中顯示的肽具有80%同一性的核酸分子，與控制所述核酸分子表達(dá)的序列連接起來。公開了通過下面的方法生產(chǎn)的核酸分子，該方法包括以可操作的方式，將所含的序列編碼的肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一個(gè)中顯示的肽具有80%同一性、并且其中任何變化都是保守變化的核酸分子，與控制核酸分子表達(dá)的序列連接起來。治療用藥本文公開的組合物，包括藥物組合物，可根據(jù)所需的是局部還是全身性治療、以及依要治療的區(qū)域，以多種方式給藥。例如，公開的組合物可以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、透皮、口服、腸胃外(例如靜脈內(nèi))、氣管內(nèi)、眼、陰道、直腸、鼻內(nèi)、局部等給藥，包括鼻內(nèi)局部給藥或吸入給藥。組合物的腸胃外給藥，如果采用的話，一般特征是注射。注射劑可以制備成常規(guī)的形式，為液體溶液或懸浮液、適合在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或?yàn)槿橐?。用于腸胃外給藥的修改方法包括使用緩釋或持續(xù)釋放的系統(tǒng)，以維持恒定的劑量。參見例如美國專利No.3,610,795，在此引為參考。本文公開的組合物可以向處于血管通透性或病理性血管生成風(fēng)險(xiǎn)下的患者或?qū)ο箢A(yù)防性給藥。因此，方法還能包括在施用本文公開的組合物之前，鑒定處于血管通透性或病理性血管生成風(fēng)險(xiǎn)下的個(gè)體。所需組合物的準(zhǔn)確量將根據(jù)對(duì)象的物種、年齡、體重和總體情況、被治療的過敏性疾病的嚴(yán)重性、使用的具體核酸或載體、其給藥模式等，在對(duì)象與對(duì)象之間不同。因此，不可能為每種組合物指定準(zhǔn)確的量。例如，施用組合物的有效劑量和時(shí)間計(jì)劃可以通過經(jīng)驗(yàn)確定，做出這樣的決定在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)范圍內(nèi)。所施用組合物的劑量范圍要大到足以產(chǎn)生影響癥狀疾病的所需效應(yīng)。劑量不應(yīng)該大到以至于引起不利的副作用，例如不想要的交叉反應(yīng)、過敏反應(yīng)等。一般來說，劑量將隨著患者的年齡、狀況、性別、患病程度、給藥途經(jīng)、或者治療方案中是否包含其它藥物而變化，可以由本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來確定。在任何禁忌癥的事件下，劑量由個(gè)體醫(yī)生進(jìn)行調(diào)整。劑量可以變化，可以每天施用一劑或多劑，為期一天或幾天。在文獻(xiàn)中可以找到對(duì)于給定類型的藥物產(chǎn)品的適合劑量的指導(dǎo)。例如，選擇抗體的適合劑量的指導(dǎo)可以在關(guān)于抗體的治療性應(yīng)用的文獻(xiàn)中找到，例如《單克隆抗體手冊(cè)》(HandbookofMonoclonalAntibodies),Ferrone等主編，NogesPublications,ParkRidge,NJ.，(1985)第22章禾口303-357頁;Smith等，《人類診斷和治療中的抗體》(AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy),Haber等主編，RavenPress,NewYork(1977)pp.365-389。單獨(dú)使用肽或蛋白治療藥劑的典型每日劑量可在每天大約1pg/kg到最多100mg/kg體重的范圍內(nèi)，這取決于上面提到的因素。例如，本文公開的配體、蛋白、肽和導(dǎo)向信號(hào)的濃度在對(duì)象體內(nèi)可以在大約lpM到lOO^M的范圍內(nèi)，包括大約lpM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、大約10pM、大約20nM、大約30nM、大約40nM、大約50nM、大約60nM、大約70nM、大約80nM、大約90nM、或大約100nM、大約l(iM、2)iM、3pM、4pM、5pM、6fiM、7|iM、8pM、869pM、大約10pM、大約20^M、大約30|iM、大約40pM、大約50pM、大約60nM、大約70(iM、大約80pM、大約90pM、或大約100pM。實(shí)施例下面提供的實(shí)施例僅僅是出于說明的目的，不打算以任何方式對(duì)本文描述的組合物和方法的范圍進(jìn)行限制。在每種情況下，除非另有指明，標(biāo)準(zhǔn)的材料和方法被用于執(zhí)行在所提供的實(shí)施例中描述的工作。所有在本說明書中引用的專利和文獻(xiàn)參考在此以其全文引為參考。除非另有指明，本發(fā)明的實(shí)踐運(yùn)用了化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們都在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)范圍之內(nèi)(參見例如Maniatis，T.等，(1982)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Sambrook,J.等(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(第二版)(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Ausubel,F.M.，等(1992)，《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),(J.WileyandSons,NY);Glover，D.(1985)《DNA克隆》(I和II)(DNACloning,IandII)(OxfordPress);Anand,R.(1992)《復(fù)雜基因組的分析技術(shù)》)TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes)，(AcademicPress);Guthrie,G.和Fink，G.R.(1991)《酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指導(dǎo)》(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)(AcademicPress);Harlow和Lane(1988)《抗體實(shí)驗(yàn)室指南》(Antibodies:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Jakoby,W.B.禾口Pastan,I.H.(主編)(1979)《細(xì)胞培養(yǎng).酶學(xué)方法》，第58巻(CellCulture.MethodsinEnzymology，Vol.58)(AcademicPress,Inc.,HarcourtBraceJovanovich(NY);《核酸雜交》(NucleicAcidHybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins主編，1984);《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(TranscriptionAndTranslation)(B.D.Hames&S.J.Higgins主編，1984);《動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)》(CultureOfAnimalCells)(R.I.Freshney，AlanR.Liss,Inc.,1987);《固定細(xì)胞和酶》(ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRLPress,1986);B.Perbal，《分子克隆實(shí)踐指導(dǎo)》(APracticalGuideToMolecularCloning)(1984);《專論，酶學(xué)方法》(thetreatise,MethodsInEnzymology)(AcademicPress,Inc.,N.Y.);《用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(GeneTransferVectorsForMammalianCells)(J.H.Miller禾口M.P.Calos主編，1987,ColdSpringHarborLaboratory);酶學(xué)方法(MethodsInEnzymology),154和155巻(Wu等主編)；《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology)(Mayer禾口Walker主編，AcademicPress,London,1987);《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(HandbookOfExperimentalImmunology),I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell主編，1986);Hogan等主編(1994)，《小鼠胚胎操作.實(shí)驗(yàn)室指南》(第二版)，(ManipulatingtheMouseEmbryo.ALaboratoryManual,2ndEdition)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.。用于人類基因作圖、包括人類1號(hào)染色體作圖的技術(shù)和材料的總體討論，提供在例如White和Lalouel(1988)Ann.Rev.Genet.22:259-279中。除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐運(yùn)用了化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。(參見例如Maniatis等，1982;Sambrook等，1989;Ausubel等，1992;Glover,1985;A腿d,1992;Guthrie和Fink,1991)。在本文中沒有任何東西將被解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有權(quán)利利用現(xiàn)有的發(fā)明使本公開內(nèi)容得以提前。沒有承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。對(duì)參考文獻(xiàn)的討論陳述了它們作者的主張，申請(qǐng)人保留挑戰(zhàn)所引用文件的準(zhǔn)確性和相關(guān)性的權(quán)利。應(yīng)該清楚地理解，盡管在本文中引用了大量出版物，但這些引用并不構(gòu)成承認(rèn)任何這些文獻(xiàn)形成了本
技術(shù)領(lǐng)域：
的通用知識(shí)的部分。實(shí)施例1Robo4為體內(nèi)血管導(dǎo)向所需在過去十年間，斑馬魚成為分析血管發(fā)育的有吸引力的模型(Weinstein，2002)，被選來研究Robo4在體內(nèi)的生物學(xué)重要性。為了抑制Robo4基因表達(dá)，使用了以前描述的靶向Robo4前mRNA外顯子10-內(nèi)含子10邊界的阻斷剪接的嗎啉代(Bedell等，2005)。為了證實(shí)Robo4嗎啉代的功效，從未注射和注射了嗎啉代的胚胎分離了RNA，使用位于靶外顯子側(cè)翼的引物通過RT-PCR進(jìn)行了分析(圖8A)。注射Robo4嗎啉代與未注射的對(duì)照相比，導(dǎo)致野生型RNA的完全丟失，表明了嗎啉型(morphant)斑馬魚無Robo4功能(圖8B)。TG(flil:egfp,斑馬魚胚胎在內(nèi)皮特異性flil啟動(dòng)子控制下表達(dá)綠色熒光蛋白，并允許在體內(nèi)詳細(xì)地觀察發(fā)育中的內(nèi)皮，被利用來評(píng)估嗎啉代介導(dǎo)的Robo4敲除對(duì)血管發(fā)育的后果(圖1A;Lawson和Weinstein，2002)。在48hpf時(shí)，注射了Robo4MO的胚胎表現(xiàn)出原始軸管(背主動(dòng)脈和后主靜脈)的野生型形成，以及分別表明血管發(fā)生和血管生成的背部縱向吻合血管和脊索旁血管，沒有受到Robo4水平降低的影響(圖1B，右圖)。但是，在Robo4嗎啉型中觀察到了節(jié)間血管體系結(jié)構(gòu)中的顯著程度的異常。在野生型胚胎中，節(jié)間血管起于背主動(dòng)脈，并朝向胚胎的背部表面生長(zhǎng)，緊挨著體節(jié)邊界。正是這種體節(jié)間的精確軌跡決定了節(jié)間血管的特征性人字形形狀(圖1A，右圖)。Robo4嗎啉型胚胎的節(jié)間血管沒有采取這種典型的型式，而是向錯(cuò)誤的方向生長(zhǎng)(圖1B，右圖白色箭頭表示異常的血管)。在48hpf時(shí)，60%注射了RoboMO的胚胎表現(xiàn)出這種缺陷，相比較而言在野生型胚胎中只有5%。重要的是，通過相位顯微鏡，不能將Robo4嗎啉型與對(duì)照胚胎區(qū)分開，表明觀察到的血管成型缺陷不是總的形態(tài)學(xué)擾亂的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)合在一起，證明了在斑馬魚血管發(fā)育過程中需要Robo4，并表明該受體的功能性結(jié)果引發(fā)了排斥性導(dǎo)向信號(hào)。實(shí)施例2Robo4的胞質(zhì)尾區(qū)為體內(nèi)血管導(dǎo)向所需接下來確定了在Robo4嗎啉型中觀察到的血管缺陷是否能夠通過重構(gòu)robo4來抑制。將robo4MO和耐受嗎啉代的野生型鼠Robo4RNA注射到TG(flil:egfp)yl胚胎中，在48hpf時(shí)分析血管的成型。在大約60%的嗎啉型胚胎中，Robo4RNA恢復(fù)了主干血管的典型型式，證實(shí)了基因敲除的特異性(圖1B和C，右圖)。robo4調(diào)控血管發(fā)育的能力可能是它傳遞細(xì)胞質(zhì)信號(hào)的能力的結(jié)果。為了證實(shí)這種想法，將Robo4MO和缺少了受體與細(xì)胞質(zhì)成分相互作用的部分的鼠Robo4突變體形式(robo4Atail)進(jìn)行共同注射，在48hpf時(shí)評(píng)估血管的體系結(jié)構(gòu)。與野生型Robo4RNA不同，robo4Atail不能挽救嗎啉型胚胎中的成型缺陷(圖1B和D，右圖)。這些數(shù)據(jù)證明，在Robo4的胞質(zhì)尾區(qū)中包含的信息對(duì)于斑馬魚胚胎發(fā)生過程中的血管導(dǎo)向是關(guān)鍵的。合在一起，這些體內(nèi)分析表明，Robo4活性是脊椎動(dòng)物血管發(fā)育過程中精確確定節(jié)間血管的軌跡所需要的。實(shí)施例3Robo4胞質(zhì)尾區(qū)為抑制趨觸性所需Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制了初級(jí)內(nèi)皮細(xì)胞朝向VEGF梯度遷移，以及異位表達(dá)Robo4的HEK293細(xì)胞朝向血清的遷移(Park等，2003;Seth等，2005)。除了可溶性生長(zhǎng)因子之外，固定的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如纖連蛋白在細(xì)胞的活動(dòng)性中發(fā)揮了重要作用(Ridley等，2003)，并且纖連蛋白的梯度可以在稱為趨觸性的過程中指導(dǎo)遷移。事實(shí)上，最近顯示，在早期斑馬魚胚胎中，纖連蛋白位于遷移的內(nèi)皮細(xì)胞附近(Jin等，2005)。Robo4為體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞正確遷移所需的觀察結(jié)果(圖1)，表明了Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)纖連蛋白誘導(dǎo)的趨觸性的能力。將HEK293細(xì)胞用Robo4或Robo4Atail轉(zhuǎn)染(圖2A)，在用纖連蛋白和Slit2的混合物包被的膜上進(jìn)行趨觸性遷移分析。Slit2抑制了表達(dá)Robo4而不是Robo4Atail的細(xì)胞的纖連蛋白誘導(dǎo)的遷移，證實(shí)了Robo4胞質(zhì)尾區(qū)對(duì)于受體的排斥性活性是關(guān)鍵的(圖2B)。接下來確定了Robo4胞質(zhì)尾區(qū)中抑制細(xì)胞遷移所需的區(qū)域。將HEK293細(xì)胞用Robo4缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)染(圖2A)，并進(jìn)行趨觸性遷移分析。表達(dá)Robo4-NH2、而不是表達(dá)Robo4-COOH的細(xì)胞的纖連蛋白依賴性遷移被Slit2抑制(圖2C)，證明了Robo4胞質(zhì)尾區(qū)的N-端一半對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)性來說是必需的和足夠的。實(shí)施例4樁蛋白家族成員是Robo4相互作用蛋白R(shí)obo4胞質(zhì)尾區(qū)中賦予功能性活性的區(qū)域的鑒定，允許對(duì)可以調(diào)控Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)成分進(jìn)行搜索。使用Robo4尾區(qū)的N-末端一半作為誘佴，對(duì)人類主動(dòng)脈cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選，鑒定了樁蛋白接頭蛋白家族的一個(gè)成員Hic-5，作為可能的Robo4相互作用蛋白(圖8)。為了證實(shí)這種相互作用，分離Hic-5質(zhì)粒，并將其與Robo4或空載體重新轉(zhuǎn)化到酵母中。只有共表達(dá)Robo4和Hic-5的菌株才能夠生長(zhǎng)在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，并誘導(dǎo)強(qiáng)有力的p-半乳糖苷酶活性(圖8B)。為了進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用，使用以Hic-5和Robo4胞質(zhì)尾區(qū)共轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。在表達(dá)Robo4和Hic-5的HEK293細(xì)胞的抗Robo4免疫沉淀物中發(fā)現(xiàn)了Hic-5，但是在只表達(dá)Hic-5的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)(圖3A)。合在一起，這些數(shù)據(jù)證明了在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Hic-5與Robo4細(xì)胞質(zhì)尾部特異性相互作用。Hic-5及其旁系同源物樁蛋白，可以表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性的表達(dá)(Turner,2000;Yuminamochi等，2003)。因此，確定了這些蛋白中的哪些在用于趨觸性遷移分析的細(xì)胞系HEK293細(xì)胞中表達(dá)。將CHO-Kl、HEK293禾t]NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞裂解物與針對(duì)Hic-5或樁蛋白的抗體進(jìn)行Western印跡分析，在所有細(xì)胞系中檢測(cè)到了樁蛋白，但是只在CHO-K1和NIH3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Hic-5(圖3B)。這不僅表明Hic-5和樁蛋白能夠與Robo4相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移，而且表明樁蛋白可能是HEK293細(xì)胞中的結(jié)合配偶體。從后一種想法著眼，使用表達(dá)樁蛋白和Robo4胞質(zhì)尾區(qū)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。正像用Hic-5觀察到的，在表達(dá)樁蛋白和Robo4的HEK293細(xì)胞的抗Robo4免疫沉淀物中鑒定到了樁蛋白，當(dāng)在僅表達(dá)樁蛋白的細(xì)胞中沒有(圖3C)。因?yàn)镾lit2是Robo4的生理配體(Park等，2003;Hohenester等，2006)，因此確定了Slit2刺激是否調(diào)控了Robo4和樁蛋白之間的相互作用。將表達(dá)Robo4的HEK293細(xì)胞在存在和不存在Slit2的情況下溫育。在存在Slit2的情況下，在Robo4免疫沉淀物中檢測(cè)到了內(nèi)源樁蛋白。與此形成鮮明對(duì)照的是，在不存在Slit2的情況下，在免疫沉淀物中沒有檢測(cè)到樁蛋白(圖3E)。因此，Robo4與Slit2的接合刺激了它與樁蛋白的結(jié)合。實(shí)施例5鑒定Robo4的樁蛋白相互作用基序?yàn)榱司_地確定Robo4中與樁蛋白相互作用所需的區(qū)域，產(chǎn)生了一系列跨越胞質(zhì)尾區(qū)的整個(gè)長(zhǎng)度的GST-Robo4融合蛋白(圖4A)。用純化的重組樁蛋白進(jìn)行的體外結(jié)合分析證明，Robo4尾區(qū)的氨基端一半(494-731)對(duì)于與樁蛋白的直接相互作用是必需的和充分的(圖4B)。然后產(chǎn)生了含有胞質(zhì)尾區(qū)的氨基端一半的大約70個(gè)氨基酸片段的4種其它的GST-Robo4融合蛋白(圖4C)。體外結(jié)合分析表明，樁蛋白選擇性地與Robo4尾區(qū)的位于CC0和CC2基序之間的片段(604-674;圖4D)相互作用。為了確定該Robo4區(qū)域是否是與樁蛋白相互作用所必需的，從胞質(zhì)尾區(qū)中刪除了604-674位氨基酸，并對(duì)該突變體GST-Robo4融合蛋白進(jìn)行了體外結(jié)合分析。盡管與樁蛋白的相互作用減弱了，但與已知的Robo4結(jié)合蛋白Mena的結(jié)合也減弱了，這表明消除604-674位氨基酸影響了Robo4尾區(qū)的構(gòu)象。為了避免這個(gè)問題，在該70個(gè)氨基酸的一段序列內(nèi)產(chǎn)生了較小的缺失，并進(jìn)行了另外的體外結(jié)合分析。用這種方法，鑒定到了缺少36個(gè)氨基酸(604-639;圖9)的突變GST-Robo4融合蛋白，它喪失了與樁蛋白的結(jié)合，但是保留了與Mena的結(jié)合(圖4E)。至此，該Robo4區(qū)域被稱為樁蛋白相互作用基序(PIM)。實(shí)施例6樁蛋白相互作用基序是Robo4依賴性的趨觸性抑制所需的接下來確定了Robo4的樁蛋白相互作用基序?qū)τ谑荏w的功能活性是否是重要的。通過位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)生了全長(zhǎng)Robo4的缺少604-639位氨基酸的突變形式(Robo4APIM)，并用于趨觸性遷移分析中。Robo4APIM不能介導(dǎo)Slit2指導(dǎo)的抑制朝向纖連蛋白梯度的遷移(圖4F)，證明了Robo4尾區(qū)的樁蛋白結(jié)合所必需的區(qū)域，對(duì)于Robo4依賴性抑制細(xì)胞遷移來說，同樣是需要的。實(shí)施例7Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制了細(xì)胞鋪展和粘附依賴性的Rac活化固定的Slit2抑制表達(dá)Robo4的細(xì)胞在纖連蛋白上遷移的能力，可能來自于對(duì)該ECM蛋白上粘附和/或鋪展的負(fù)調(diào)控。為了確定Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)是否影響了這些過程，將HEK293細(xì)胞用Robo4或空載體(pcDNA3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在纖連蛋白上進(jìn)行粘附和鋪展分析。盡管表達(dá)Robo4的細(xì)胞正常粘附于包被了纖連蛋白和Slit2的蓋玻片，但是與用pcDNA3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，它們的鋪展顯著減少(圖5A)。這些數(shù)據(jù)表明，Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞鋪展的途徑。細(xì)胞在ECM蛋白例如纖連蛋白上鋪展的能力，受到Rho家族的小GTPases活化的調(diào)控，其中包括Rho、Cdc42和Rac遷移(Nobes和Hall，1995;Nobes和Hall,1998)。在這些蛋白中，Rac在促進(jìn)導(dǎo)致細(xì)胞鋪展和遷移的肌動(dòng)蛋白聚合中發(fā)揮了基本的作用(Nobes和Hall，1995;Nobes和Hall，1998)。這種在Rac和細(xì)胞鋪展之間建立的關(guān)系表明，Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)可能抑制了Rac的粘附依賴性活化。為了評(píng)估這種可能性，將HEK293細(xì)胞用Robo4或pcDNA3進(jìn)行轉(zhuǎn)染，鋪板在用纖連蛋白和Slit2包被的皿上，用GST-PBDpulldown分析來分析Rac-GTP的水平。表達(dá)Robo4的細(xì)胞與用pcDNA3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表現(xiàn)出了粘附剌激的Rac活化顯著較低(圖5B和C)。為了證實(shí)這種93效應(yīng)的特異性，在表達(dá)Robo4的細(xì)胞中也檢測(cè)了Cdc42的活化，它們同樣暴露于Slit2(圖11A)。該結(jié)果得到了Robo4不與Robo1結(jié)合蛋白srGAPl----種已知的Cdc42的GTPase活化蛋白——相互作用的觀察結(jié)果的支持(圖11B)。總之，這些數(shù)據(jù)證明了Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)特異性抑制粘附誘導(dǎo)的Rac活化。實(shí)施例8樁蛋白相互作用基序是Robo4依賴性抑制細(xì)胞鋪展和Rac活化所需的接下來，評(píng)估了Robo4APIM是否能夠抑制纖連蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞鋪展和Rac活化。用Robo4APIM轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，鋪在纖連蛋白和Slit2包被的表面上，進(jìn)行鋪展或Rac分析。該突變形式的受體不能抑制細(xì)胞鋪展和粘附依賴性的Rac活化(圖5D、E和F)，證明了樁蛋白相互作用基序?qū)τ赗obo4的體外功能活性來說是必需的。為了證實(shí)細(xì)胞鋪展的Robo4依賴性抑制主要是由于抑制Rac活化，將HEK293細(xì)胞用Robo4和顯性活性形式的Rac——Rac(G12V)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行鋪展分析。表達(dá)Rac(G12V)的細(xì)胞耐受了Robo4依賴性抑制細(xì)胞鋪展(圖5G)，證明了Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)通過抑制Rac活性而阻斷鋪展。實(shí)施例9Slit2在初級(jí)人類內(nèi)皮細(xì)胞中抑制VEGF誘導(dǎo)的Rac活化Slit2抑制了幾種初級(jí)人類內(nèi)皮細(xì)胞系的VEGF刺激的遷移(Park等，2003)，并且Rac在VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中扮演了基本的角色(Soga等，2001a;Soga等，2001b)。因此，確定了Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)在內(nèi)源背景下是否能夠抑制Rac的活化。在存在和不存在Slit2的情況下，用VEGF刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并用GST-PBDpulldown分析來分析GTP-Rac水平。Slit2處理完全抑制了VEGF刺激的Rac活化(圖5H和I)，證明了內(nèi)源Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)了Rac的活化。實(shí)施例10樁蛋白的Lim4是與Robo4相互作用和Robo4依賴性抑制細(xì)胞鋪展所需的盡管Robo4APIM維持了它與Mena的相互作用(圖4E)，但是有可能這種突變干擾了Robo4與樁蛋白之外的蛋白的相互作用。為了專門解決這個(gè)問題，產(chǎn)生了與Robo4的結(jié)合被破壞的樁蛋白突變體。樁蛋白是調(diào)節(jié)蛋白，由N-末端的亮氨酸/天冬氨酸(LD)重復(fù)序列和C-末端的Lim結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(圖6A)。對(duì)從酵母雙雜交篩選回收的克隆的分析(參見圖9A)表明，Lim結(jié)構(gòu)域，特別是Lim3和Lim4，對(duì)于與Robo4的相互作用是重要的。為了證實(shí)這種想法，用Robo4尾區(qū)與樁蛋白-LD或樁蛋白-Lim共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。在Robo4免疫共沉淀物中發(fā)現(xiàn)了樁蛋白-Lim，但是沒發(fā)現(xiàn)樁蛋白-LD(圖6B)，證實(shí)了樁蛋白的Lim結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cRobo4的相互作用來說是必需的和充分的。為了闡明哪個(gè)Lim結(jié)構(gòu)域是與Robo4結(jié)合所需，從樁蛋白的羧基末端制造了系列缺失，與Robo4尾區(qū)共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。樁蛋白的Lim4結(jié)構(gòu)域缺失完全廢止了與Robo4的結(jié)合(圖6C)，證明樁蛋白的該區(qū)域?qū)τ谄渑cRobo4相互作用的能力是關(guān)鍵的。描繪樁蛋白上的Robo4結(jié)合位點(diǎn)，允許對(duì)樁蛋白在Robo4依賴性抑制細(xì)胞鋪展中的作用進(jìn)行直接評(píng)估。在HEK293細(xì)胞中使用siRNA將內(nèi)源性樁蛋白敲除，并用野生型雞樁蛋白(Ch-樁蛋白)或Ch-樁蛋白ALim4進(jìn)行重構(gòu)(圖6D)。然后將這些細(xì)胞在纖連蛋白和Slit2包被的蓋玻片上進(jìn)行鋪展分析。表達(dá)Ch-樁蛋白ALim4的細(xì)胞耐受Robo4依賴性抑制細(xì)胞鋪展，而表達(dá)Ch-樁蛋白的細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的細(xì)胞面積減少(圖6E)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了樁蛋白與Robo4的相互作用能夠使Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制細(xì)胞鋪展。實(shí)施例11樁蛋白相互作用基序是體內(nèi)血管導(dǎo)向所需的評(píng)估斑馬魚血管發(fā)育期間，對(duì)Robo4的樁蛋白相互作用基序的需求。正如前面描述的，95將robo4MO注射到TG(flil:egfp,胚胎中引起了節(jié)間血管的紊亂(參見圖IB)。共注射robo4APIMRNA加深了robo4MO引起的缺陷，而野生型robo4RNA抑制了這些缺陷(圖7A)。robo4Atail和robo4APIMRNA都不能挽救嗎啉型(morphant)胚胎中的血管成型缺陷，證實(shí)該36個(gè)氨基酸的樁蛋白相互作用基序是Robo4胞質(zhì)尾區(qū)中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)模塊。此外，這些數(shù)據(jù)表明，樁蛋白與Robo4之間的相互作用對(duì)于斑馬魚血管系統(tǒng)的適當(dāng)成型是必需的。實(shí)施例12我們測(cè)定到Robo4與樁蛋白相互作用和抑制突出活性，這促使我們確定Robo4是否影響了Arf6途徑。將表達(dá)alIb-Robo4:(33的細(xì)胞鋪于單獨(dú)的纖連蛋白、或纖連蛋白和纖維蛋白原上，并用GST-GGA3親和沉淀技術(shù)分析Arf6-GTP的水平。盡管纖連蛋白刺激了Arf6的活化，但纖維蛋白原降低了表達(dá)alIb-Robo4:(33的細(xì)胞中的Arf6-GTP水平(圖16A)。該結(jié)果證實(shí)了Robo4信號(hào)傳導(dǎo)抑制了Arf6的活化，并表明Robo4阻斷Rac活性的能力來自于它對(duì)Arf6的調(diào)控。接下來，我們分析了在Robo4依賴性抑制突出活性中對(duì)樁蛋白-GIT1復(fù)合體的需要。在蛋白的羧基末端上發(fā)現(xiàn)了GIT1上的樁蛋白結(jié)合序列(PBS)，并已經(jīng)顯示出阻止了GITl和樁蛋白的相互作用(Uemura等，2006)。將細(xì)胞用alIb-Robo4:(33與空載體或GIT1-PBS轉(zhuǎn)染，在纖連蛋白、或纖連蛋白和纖維蛋白原上進(jìn)行鋪展分析。正如前面描述的，表達(dá)alIb-Robo4:f33的細(xì)胞當(dāng)鋪于纖維蛋白原上時(shí)顯示出細(xì)胞面積降低，但是在用GIT1-PBS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中面積這種現(xiàn)象消失了(圖16B)。我們?cè)阡佊诶w連蛋白或纖連蛋白和Slit2上的表達(dá)全長(zhǎng)Robo4的細(xì)胞中重復(fù)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，與嵌合受體實(shí)驗(yàn)相似，GIT1-PBS阻止了Slit2依賴性減少細(xì)胞面積(圖16C)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了功能性樁蛋白復(fù)合體是Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)所需的。為了確定Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)是否通過失活A(yù)rf6抑制突出活性，我們將Arf6鳥嘌呤核苷交換因子ARNP與Robo4共轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行了鋪展分析。ARNO的過表達(dá)阻斷了Slit2降低細(xì)胞面積的能力，表明Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的主要作用是防止Arf6的GTP負(fù)載(圖16C)。如果ARNO恢復(fù)了表達(dá)Robo4的細(xì)胞在Slit2上鋪展的能力，我們推論它將同樣重建Rac響應(yīng)纖連蛋白的活化。事實(shí)上，ARNO的過表達(dá)在鋪于纖連蛋白和Slit2上的細(xì)胞中導(dǎo)致了正常水平的GTP-Rac(圖16D)。這些實(shí)驗(yàn)合在一起，證明了Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)使Arf6失活，導(dǎo)致了Rac活化的局部阻斷，并隨后抑制了細(xì)胞鋪展和遷移所必需的膜突出。實(shí)施例13免疫沉淀證實(shí)了Slit配體和Robo4受體之間的相互作用未感染的人類胚胎腎細(xì)胞(HEK)、用帶有myc表位標(biāo)簽的Slit轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(Slit-myc)、用帶有HA表位標(biāo)簽的Robo4轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(Robo4-HA)以及用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(對(duì)照-HEK)的細(xì)胞裂解液，進(jìn)行免疫沉淀。在將Slit-myc和Robo4-HA細(xì)胞裂解液混合并用抗HA抗體免疫沉淀后，用抗myc抗體通過Western印跡檢測(cè)Slit-myc蛋白(圖17A，第6道)。該相互作用的特異性通過使用所有其它的裂解液組合時(shí)不能檢測(cè)到Slit蛋白所證實(shí)(圖17A，第2-5道)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用了同樣量的裂解液。Slit-myc細(xì)胞裂解液的Western印跡分析被用作對(duì)照，證明了Slit蛋白與以前的報(bào)道相一致，具有大約210kD的分子量(圖17A，第l道)。圖17A第2-6道中顯示的較低條帶對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白重鏈。對(duì)來自未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(HEKCM)、用帶有myc表位標(biāo)簽的Slit轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(Slit-mycCM)、用帶有HA表位標(biāo)簽的Robo4的N-端可溶性胞外結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(NRobo4-HACM)、以及用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(對(duì)照-HEKCM)的條件培養(yǎng)基，也進(jìn)行了免疫沉淀。在Slit-mycCM中通過抗myc抗體檢測(cè)到了全長(zhǎng)Slit-myc蛋白(210KD)及其C-端蛋白水解片段(70KD)(圖17B，第1道)。在將Slit-myc和Robo4-HA條件培養(yǎng)基混合并用抗HA抗體免疫沉淀后，也通過Western印跡檢測(cè)到了Slit-myc蛋白(圖17B，第6道)。該相互作用的特異性由使用所有其它的條件培養(yǎng)基的組合時(shí)不能檢測(cè)到Slit蛋白所證實(shí)。如圖17C-圖17F所示，Slit蛋白與表達(dá)Robo4的細(xì)胞的質(zhì)膜結(jié)合。Slit-myc蛋白的結(jié)合可以使用抗myc抗體和Alexa594結(jié)合的抗小鼠抗體來檢測(cè)。正如可以在圖17D和圖17F中看到的，在Robo4-HEK細(xì)胞的表面(圖17F)而不是對(duì)照-HEK細(xì)胞的表面(圖17D)上檢測(cè)到了么±a實(shí)施例14Robo4敲除小鼠為了確定Robo4在體內(nèi)的功能意義，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生了敲除小鼠。為了生產(chǎn)敲除小鼠，運(yùn)用同源重組，將表達(dá)Robo4的基因的外顯子1到5用堿性磷酸酶(AP)報(bào)告基因代替。該等位基因Robo4AP，缺少編碼Robo4胞外結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白(IgG)重復(fù)序列的外顯子，這些外顯子據(jù)預(yù)測(cè)是與Slit蛋白相互作用所需要的。將Robo4WAP動(dòng)物互交，以產(chǎn)生靶等位基因純合的小鼠。關(guān)于小鼠的基因組結(jié)構(gòu)的圖示提供在圖25中。Robo4APZAP動(dòng)物是有生活力和生育力的，表現(xiàn)出血管系統(tǒng)的正常成型。這些數(shù)據(jù)表明，在發(fā)育的小鼠中，Robo4對(duì)于萌發(fā)中的血管生成不是必需的，并指出了在哺乳動(dòng)物內(nèi)皮中存在Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的可替代功能。在這些動(dòng)物中，檢測(cè)到堿性磷酸酶活性遍布發(fā)育中的胚胎和成年小鼠的所有血管床內(nèi)皮中，這證實(shí)了Robo4AP等位基因是Robo4表達(dá)的有效標(biāo)記物。實(shí)施例15Robo4活化穩(wěn)定了成熟血管專門含有柄細(xì)胞的鼠視網(wǎng)膜血管叢的中心區(qū)域，是成熟、腔化的血管的分化/穩(wěn)定表現(xiàn)型特征的例子。因此，我們推斷，Robo4在柄細(xì)胞中的表達(dá)，可能通過抑制由促血管生成因子例如VEGF-A刺激的過程而維持這種表現(xiàn)型。使用VEGF-A內(nèi)皮細(xì)胞遷移分析和VEGF-A管形成分析，評(píng)估了Robo4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)VEGF-A刺激的過程的影響。這兩種分析方法都常規(guī)用于體外研究血管生成。為了進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成分析，分離了來自Robo4+z+和Robo4APZAP小鼠的肺內(nèi)皮細(xì)胞，并使用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了它們的身份。然后將這些細(xì)胞用于VEGF-A依賴性內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成分析中。在這些分析中使用的Slit2分子是Slit2N(SEQIDNO:39)。正如圖19A和圖19B中所示，Slit2抑制了Robo4W+內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管形成。但是，在Robo4AP"P內(nèi)皮細(xì)胞中，Slit2的抑制活性喪失了。這些結(jié)果證實(shí)，Slit2以Robo4依賴性方式抑制了內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成，并表明Robo4被Slit2的活化可用于使成熟血管的血管內(nèi)皮穩(wěn)定化。實(shí)施例16Robo4活化保護(hù)了內(nèi)皮屏障功能在成熟的血管床中，內(nèi)皮細(xì)胞的行為不是彼此獨(dú)立的；相反，它們形成了單層，防止蛋白、流體和細(xì)胞從內(nèi)皮腔運(yùn)動(dòng)到周圍組織中。使用Transwell分析，體外模擬了這種屏障功能，以分析辣根過氧化物酶(HRP)運(yùn)輸穿過從Robo4+z+和Robo4^AP小鼠肺獲得的內(nèi)皮細(xì)胞的鋪滿細(xì)胞單層。用已知的通透性誘導(dǎo)因子VEGF-A刺激Robo4+"和Robo4AP/AP內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)了HRP在Transwell室下部中的積累。但是，如圖19C中所示，用Slit2蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))預(yù)處理細(xì)胞單層，在Robo4+"內(nèi)皮細(xì)胞中阻止了這種效應(yīng)，但是在Robo4AP"P內(nèi)皮細(xì)胞中沒有。接下來，評(píng)估了Slit2在體內(nèi)對(duì)內(nèi)皮屏障功能的影響。通過將伊文思藍(lán)注射到Robo4"+和Robo4AP/AP小鼠的尾靜脈中，進(jìn)行了Miles分析。然后在存在和不存在Slit2蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))的情況下將VEGF-A注射到真皮中。與體外分析類似，在Robo4+z+小鼠中，VEGF-A刺激的伊文思藍(lán)向真皮的滲漏能夠通過同時(shí)施用Slit2蛋白來防止，但是在Robo4AP"P小鼠中則不行(顯示在圖19D中)。這些觀察被擴(kuò)展到評(píng)估Slit2抑制VEGF-A誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮通透性過高的能力中。具體來說，發(fā)現(xiàn)在Robo4+"小鼠中玻璃體內(nèi)注射VEGF-A誘導(dǎo)了伊文思藍(lán)從視網(wǎng)膜血管的滲漏。但是，在Robo4"+小鼠中，這樣的VEGF-A誘導(dǎo)的伊文思藍(lán)從視網(wǎng)膜血管的滲漏通過共注射Slit2蛋白Slit2N(SEQIDNO:39))被抑制(圖19E)。該實(shí)驗(yàn)在Robo4AP/AP小鼠的視網(wǎng)膜中進(jìn)行了重復(fù)，發(fā)現(xiàn)Robo4^AP對(duì)Slit2N(SEQIDNO:39)的處理具有耐受性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了Robo4在體外和體內(nèi)介導(dǎo)了Slit2依賴性抑制VEGF-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性過高。實(shí)施例17Robo4阻斷VEGF受體下游的VEGF信號(hào)傳導(dǎo)VEGF-A促進(jìn)血管生成和通透性的能力依賴于VEGFR2的活化，這是通過配體結(jié)合后的自身磷酸化而發(fā)生的。隨后，許多非受體酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶和小GTPases以空間和時(shí)間特異性方式被激活，執(zhí)行VEGF-A信號(hào)傳導(dǎo)。為了確定Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)與VEGF-A-VEGFR2途徑交叉，使用Slit2N(SEQIDNO:39)分析了VEGF-A禾PISlit2刺激后VEGFR2的磷酸化。Slit2N(SEQIDNO:39)對(duì)VEGF-A-誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化沒有影響(圖19F)，表明Slit2-Robo4途徑一定在受體的下游與VEGF-A信號(hào)傳導(dǎo)相交。然后將注意力集中于Src家族的非受體酪氨酸激酶FynYes和Src上，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮閷?dǎo)VEGF-A誘導(dǎo)的血管生成和通透性中有被明確記錄的功能(Eliceiri等，2002;Eliceiri等，1999)。用Slit2N(SEQIDNO:39)處理內(nèi)皮細(xì)胞降低了VEGF-A刺激的c-Src磷酸化(圖19G)。最近，幾份報(bào)告顯示出，Src依賴性Rho家族小GTPase——Rac1的活化，對(duì)于VEGF-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和通透性是必要的(Gavard等，2006;Garrett等，2007)。用Slit2N(SEQIDNO:39)處理內(nèi)皮細(xì)胞單層，防止了VEGF-A依賴性的Racl活化(圖19H)。這些生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Slit2-Robo4途徑通過抑制Src-Racl信號(hào)傳導(dǎo)軸，抑制了VEGF-A誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和通透性過高。實(shí)施例18Robo4的活化在CNV和OIR模型中減少了血管滲漏和病理性血管生成氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)的鼠模型，其模擬在糖尿病型視網(wǎng)膜病和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病中觀察到的局部缺血誘導(dǎo)的血管生成，被用于研究Robo4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)視網(wǎng)膜血管病的影響。在該模型中，將P7小鼠在75%氧環(huán)境中維持5天，然后返回到25%氧中維持另外5天。感知氧缺乏起動(dòng)了視網(wǎng)膜中VEGF-A表達(dá)的快速增加，導(dǎo)致病理性血管生成(Ozaki等，2000;Werdich等，2004)。使用該模型對(duì)Robo4+"小鼠和Robo4AP/AP小鼠進(jìn)行了評(píng)估。在Robo4+/"j、鼠中，玻璃體內(nèi)施用Slit2N(SEQIDNO:39)明顯降低了血管生成，但是在Robo4AP/AP小鼠中沒有(圖20A-圖20E，其中箭頭表示病理性血管生成的區(qū)域)。此外，在暴露于高氧條件之后，Robo4AP"P小鼠與Robo4"+小鼠相比，顯示出了更具侵略性的血管生成(參見例如圖20A和20C)。除了描述的OIR模型之外，激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管化模擬與衰老相關(guān)的黃斑變性，通常被用于在小鼠中研究病理性血管生成(Lima等，2005)。在該模型中，用激光破壞Bruch膜，這使得下方的脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)穿入視網(wǎng)膜下色素上皮。為了辨別Robo4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)這種病理性過程的影響，對(duì)8-12周齡的Robo4+"和Robo4AP^P小鼠進(jìn)行激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管化，然后在玻璃體內(nèi)注射Slit2N(SEQIDNO:39)。與在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病的小鼠模型中獲得的結(jié)果類似，玻璃體內(nèi)施用Slit2N在Robo4"+小鼠中減少了血管生成，但是在Robo4AP/AP小鼠中沒有(參見圖20F-圖20J)。合在一起，氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病和脈絡(luò)膜新生血管化模型表明，具有不同特征的兩種血管床，一種是緊密的血腦屏障，另一種是有孔的內(nèi)皮，通過Slit2-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)的活化得到保護(hù)，免受病理性損傷。實(shí)施例19Robo4抑制了來自多種使成熟血管去穩(wěn)定化的因子的信號(hào)傳導(dǎo)評(píng)估了Robo4被Slit2分子的活化對(duì)bFGF、血管生成因子和凝血酶活性以及內(nèi)皮通透性因子的影響。如圖21所示，Slit2N(SEQIDNO:39)阻斷了bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮管形成和凝血酶誘導(dǎo)的通透性。這些研究證明了Slit-Robo4信號(hào)傳導(dǎo)能夠抑制由多種血管生成和通透性因子誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，并支持了Slit-Robo4途徑保護(hù)成熟的血管床免于多種血管生成、通透性因子和細(xì)胞因子影響的概念。為了加強(qiáng)Robo4信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)血管系統(tǒng)免于多種血管生成、通透性因子和細(xì)胞因子影響的了解，在急性肺損傷的小鼠模型中評(píng)估了Slit2N(SEQIDNO:39)對(duì)Robo4活化的影響。在該模型中，通過氣管內(nèi)給藥給小鼠施用細(xì)菌內(nèi)毒素LPS。暴露于細(xì)菌內(nèi)毒素導(dǎo)致了細(xì)胞因子風(fēng)暴，引起肺血管床的災(zāi)難性去穩(wěn)定作用和產(chǎn)生非心源性肺水腫(Matthay等，2005)。在氣管內(nèi)施用LPS后，將小鼠用Slit2N(SEQIDNO:39)或模擬制備物處理，后者是用作對(duì)照的假蛋白提取物。如圖22中所示，來自用Slit2N(SEQIDNO:39)處理的小鼠的支氣管肺泡灌洗液(BAL)中的炎性細(xì)胞和蛋白的濃度，與用模擬制備物處理的小鼠中相比，明顯較低。這些結(jié)果證實(shí)，在這些環(huán)境下，活化性Robo4提供了有力的血管穩(wěn)定作用，并表明Slit2-Robo4是強(qiáng)有力的血管穩(wěn)定作用途徑，其功能是保護(hù)成熟內(nèi)皮的完整性，并抗拒極端形式的細(xì)胞因子風(fēng)暴維持血管的穩(wěn)態(tài)。實(shí)施例20施用Slit2蛋白在小鼠禽流感模型中降低了死亡率在下面的實(shí)施例中，分析了Slit蛋白對(duì)禽流感病毒感染的小鼠存活率的影響。共120只雌性BALB/c小鼠鼻內(nèi)接種了50|il1:400稀釋的禽流感病毒株H5N1/Duck/Mn/1525/81。本實(shí)施例中使用的小鼠從CharlesRiver獲得，平均體重在18-20克的范圍內(nèi)。參考表2，將小鼠隨機(jī)分成六籠，每籠20只小鼠，對(duì)每組每天進(jìn)行治療，共5天。在治療期間和之后，觀察存活(死亡)和體重。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>簡(jiǎn)單來說，如表2所示，第l組用生理鹽水溶液(PSS)陰性對(duì)照進(jìn)行處理。2組和3組用模擬制備物處理。4組和5組用不同濃度的Slit蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))處理。作為陽性對(duì)照，6組的20只小鼠腹膜內(nèi)用利巴韋林75mg/kg/天進(jìn)行處理，用PSS調(diào)整到總體積0.1ml。分析的結(jié)果顯示在圖24中，并詳述在表3中。在23天后，在4組和5組中用Slit蛋白處理的小鼠與1組、2組和3組中沒有接受Slit蛋白的小鼠相比，具有較低的死亡率。4組的小鼠，用每劑12.5pgSlit處理，具有25。/。的存活率。5組的小鼠，用每劑1.25pgSlit處理，具有50%的存活率。與4組和5組的存活性相反，在1組中用PSS處理的陰性對(duì)照小鼠中，只有5%(1/20)存活過23天。表3顯示了接種后14天，1組、2組和3組的存活者的平均體重明顯低于4組和5組中Slit處理的存活者。此外，在Slit處理濃度較低的5組的10/20個(gè)小鼠，在21天時(shí)存活，體重平均為17.6克，幾乎與17.7克的起始平均體重一樣高。因此，那些用Slit蛋白處理的感染小鼠，能夠比未處理的小鼠更好地維持它們的體重。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表3(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>實(shí)施例21Slit蛋白的片段起活化Robo4的作用圖23顯示了Slit2蛋白的各種構(gòu)建體。正如本文已經(jīng)描述的那樣，150kD蛋白Slit2N(SEQIDNO:39)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)模型中是有效的，包括Miles分析、視網(wǎng)膜通透性分析、管形成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移、以及在眼疾病的OIR和CNV模型中。此外，正如在圖23中所示，(40kD)蛋白SlitDl(SEQIDNO:42)禾BSlit2N(SEQIDNO:39)構(gòu)建體在VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移分析中顯示出與全長(zhǎng)Slit2(SEQIDNO:40)相似的活性。材料和方法試劑HEK293和COS-7細(xì)胞以及所有IMAGE克隆來自ATCC。SP6和T7MessageMachine試劑盒來自Ambion。HUVEC、EBM-2和bullet試劑盒來自Cambrex。酵母雙雜交質(zhì)粒和試劑來自Clontech。FBS來自Hyclone?？笻A親和基質(zhì)、Fugene6和蛋白酶抑制劑混合物來自Roche。山羊抗小鼠HRP和山羊抗兔HRP第二抗體來自JacksonImmunoResearch?？筕5抗體、DAPI、DMEM、Lipofectamine2000、青霉素-鏈霉素、SuperscriptIII試劑盒、Trizol禾tlTrypLEExpress來自Invitrogen?？笷lagM2、磷酸化酶抑制劑混合物、大豆胰蛋白酶抑制劑和無脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)來自Sigma。人類纖連蛋白來自BiomedicalTechnologies禾口Invitrogen。CostarTranswells禾口AmiconUltra-15濃縮柱來自Fisher。Rosetta2大腸桿菌來自Novagen。谷胱甘肽-Sepharose4B、親本pGEX-4Tl禾BECLPLUS來自Amersham-Pharmacia。考馬斯藍(lán)禾QPVDF來自BioRad。Quickchange位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖衼碜許tratagene。正常大鼠IgG瓊脂糖結(jié)合物來自SantaCmz。Robo4嗎啉代來自GeneTools。用于PCR的寡核苷酸來自UniversityofUtahCoreFacility。Alexa564-鬼筆環(huán)肽、抗GFP和山羊抗兔Alex488來自MolecularProbes。低熔點(diǎn)瓊脂糖來自NuSieve。T7體外轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒來自Promega。分子生物學(xué)Robo4-HA、Slit2-Myc-His和雞樁蛋白質(zhì)粒以前已有描述(Park等，2003;Nishiya等，2005)。Robo4-NH2從Robo4誦HA擴(kuò)增并克隆到pcDNA3-HA的EcoRV/Notl中。Robo4-COOH從Robo4-HA通過重疊延伸PCR擴(kuò)增，并克隆至ljpcDNA3-HA的EcoRV/Notl中。人類Robo4胞質(zhì)尾區(qū)的氨基端一半(AA465-723)通過PCR擴(kuò)增并克隆到pGBKT7的(EcoRI/BamHI)中。鼠Robo4片段通過PCR擴(kuò)增并克隆到pGEX-4Tl的BamHI/EcoRI中。鼠Hic-5、Mena和樁蛋白(包含缺失)從IMAGE克隆通過PCR擴(kuò)增，并克隆到pcDNA3-V5的EcoRV/Notl中。GST-Robo4APIM和全長(zhǎng)Robo4APIM通過使用QuickChange,對(duì)相關(guān)的野生型構(gòu)建體進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變來產(chǎn)生。所有構(gòu)建體的完整性通過在UniversityofUtahCoreFacility進(jìn)行測(cè)序來證實(shí)。胚胎培養(yǎng)和斑馬魚原種斑馬魚，Daniorerio，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行維持(Westerfield，2000)。發(fā)育階段使用在28.5°C孵產(chǎn)生的胚胎標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行(Kimmel等，1995)。在本研究中使用的Tg(fli:EGFP)yl轉(zhuǎn)基因斑馬魚系描述在Lawson和Weinstein，2002中。成像的胚胎在24hpf后用0.2mMl-苯基-2-硫脲(PTU)處理以防止色素形成。robo4的反義缺失將針對(duì)robo4的外顯子10/內(nèi)含子10剪接位點(diǎn)的反義嗎啉代寡核苷酸(MO)(5'-tttttagcgtacctatgagcagtt-3'，SEQIDNO:28)分別溶解在1XDanieau's緩沖液中，濃度為5ng/nl。注射前，將嗎啉代在65。C加熱5分鐘，短時(shí)冷卻，與可忽略量的染料混合以監(jiān)測(cè)注射的效率，將大約lnl注射到l-2細(xì)胞階段的胚胎的流動(dòng)卵黃中。反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR:從20個(gè)未注射和20個(gè)注射了robo4MO的胚胎中使用Trizol試劑提取RNA，隨后的cDNA合成使用SuperscriptIII進(jìn)行，由隨機(jī)六聚體和寡聚dT引物的混合物引發(fā)。通過PCR從cDNA擴(kuò)增robo4，在夕卜顯子8中使用正向引物(5'陽caacaccagacacttacgagtgcc-3'，SEQIDNO:29)和在外顯子12中使用反向弓l物(5'-ttcgaaggccagaattctcctggc-3'，SEQIDNO:30)，采用的參數(shù)如下(94。C4分鐘，94。C30秒，58。C30秒，68。C45秒，68。Cl分鐘)。為了鑒定PCR反應(yīng)的線性范圍，對(duì)cDNA進(jìn)行了23、25、27和30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。從所有樣品使用正向引物(5'-cccaaggccaacagggaaaa，SEQIDNO:31)和反向引物(5'-ggtgcccatctcctgctcaa陽3'，SEQIDNO:32)擴(kuò)增了(3-肌動(dòng)蛋白，以控制cDNA的輸入量。全胚胎間接免疫熒光簡(jiǎn)單來說，將年齡匹配的24和48hpf的胚胎脫絨毛膜，并在4%PFA/4。/。蔗糖/PBS中在4°C固定過夜。然后將胚胎在PBS/0.1%Tween-20中清洗，用無水甲醇脫水，在PBS-Tween20中重新水化，在PBS/1%Triton-X中進(jìn)一步通透化，在PBS/1%Triton-X/2%BSA中漂洗，在室溫下在PBS/1%Triton-X/2%BSA/10%綿羊血清/1%DMSO中阻斷，然后在含有IgG純化的抗GFP(1:400稀釋)的阻斷溶液中在4°C溫育過夜。第二天，將胚胎在PBS/1%Tdton-X/2%BSA中大力清洗，然后在含有山羊抗兔Alexa488結(jié)合的第二抗體(l:200稀釋)的阻斷溶液中在4。C溫育過夜。下一天，將胚胎在PBS/1%Triton-X/2%BSA中徹底清洗，然后包埋在含有1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的PBS中，在Leica共焦顯微鏡下照相，使用AdobePhotoshop軟件進(jìn)行處理。細(xì)胞培養(yǎng)HEK293和COS-7細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中。人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)在添加有10%FBS的EGM-2中。按照常規(guī)，使用傳代2-5代之間的HUVEC。轉(zhuǎn)染HEK293禾卩COS-7細(xì)胞用Fugene6或Lipofectamine2000按照制造商提供的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。制備濃縮的Slit2蛋白將COS-7細(xì)胞用空pSECTAG2或pSECTAG2::hSlit2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS清洗兩次，與6ml鹽萃取緩沖液(10mMHEPES，pH7.5，1MNaCl禾PIX蛋白酶抑制劑)在25°C溫育15分鐘。重復(fù)進(jìn)行鹽萃取，將樣品以10，000rpm離心20分鐘，以沉淀細(xì)胞碎片。將上清液加樣到AmiconUltra-15濃縮柱/截止值100kDa，并離心直到12ml鹽萃取液減少到大約500^1。濃縮的蛋白制備物通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析，并在4。C儲(chǔ)存最多一周。使用這種方案，通常獲得的Slit2的濃度為20-50|ig/ml。除了從用Slit2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備濃縮的蛋白之外，對(duì)于用空載體(pSECTAG2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞液執(zhí)行了同樣的方案。得到的制備物被稱為"模擬"制備物，它在所有分析Slit2作用的實(shí)驗(yàn)中被用作對(duì)照。趨觸性遷移分析將轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞用TrypLEExpress從組織培養(yǎng)皿中取出，用含有0.1%胰蛋白酶抑制劑、0.2。/。無脂肪酸BSA的108DMEM或EBM-2清洗一次，并用含有0.2%BSA的相關(guān)培養(yǎng)基清洗兩次。對(duì)洗過的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并重新懸浮成0.3x1()S個(gè)細(xì)胞/ml。將1.5x105個(gè)細(xì)胞裝入下表面用5pg/ml纖連蛋白預(yù)包被的12|imCostartranswells的室上部中。通過用0.5pg/mlSlit2或等量的模擬制備物進(jìn)行共同包被，來分析Slit2對(duì)趨觸性的影響。允許細(xì)胞遷移進(jìn)行6小時(shí)，然后用棉拭子除去transwell上表面上的細(xì)胞。將下表面上的細(xì)胞用4%甲醛固定5分鐘，用PBS清洗三次。對(duì)于HEK293細(xì)胞來說，通過在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)6個(gè)IOX的視野，對(duì)下表面上GFP陽性細(xì)胞(HEK293)的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于數(shù)據(jù)顯示和隨后的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來說，在纖連蛋白/模擬物包被的膜上遷移細(xì)胞的數(shù)量被視為100%。進(jìn)行了至少兩次重復(fù)進(jìn)行的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。酵母雙雜交分析將pGBKT7::hRobo4465-723轉(zhuǎn)化到酵母菌株P(guān)J694A中，產(chǎn)生了PJ694A-Robo4。將人類主動(dòng)脈cDNA文庫克隆到捕獲質(zhì)粒pACT2中，然后轉(zhuǎn)化到PJ694A-Robo4中。將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株鋪于SD-Leu-Trp(-LT)上以分析轉(zhuǎn)化效率，鋪于SD-Leu-Trp-His-Ade(-LTHA)上以鑒定推測(cè)的相互作用蛋白。然后通過濾紙?zhí)嵘治?filterliftassay)測(cè)試在SD-LTHA上能夠生長(zhǎng)的酵母菌株的卩-半乳糖苷酶表達(dá)。從能夠在SD-LTHA上生長(zhǎng)并表達(dá)P-半乳糖苷酶的酵母菌株分離捕獲質(zhì)粒，在UniversityofUtahCoreFacility進(jìn)行測(cè)序。免疫沉淀在50mMpH7.4的Tris-Cl、50mMNaCl、ImMDTT、0.5%TritonX-IOO、磷酸酶和蛋白酶抑制劑中制備細(xì)胞裂解物，以14K離心20分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)，用與瓊脂糖珠子結(jié)合的正常IgG進(jìn)行60分鐘的澄清，并在4。C下與瓊脂糖珠子結(jié)合的相關(guān)抗體溫育2小時(shí)。將沉淀物在裂解緩沖液中徹底清洗，重新懸浮在2X樣品緩沖液中(125mMpH6.8的Tris-Cl、4%SDS、20%甘油、0.04%溴酚藍(lán)禾口1.4M2-巰基乙醇)。GSTPullDown分析帶有pGEX-4Tl::mRobo4的Rosetta2大腸桿菌生長(zhǎng)到OD600為0.6，然后用0.3mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。在30°C、220rpm3-4小時(shí)后，通過超聲將細(xì)胞裂解在20mMTris-ClpH7.4、1%TritonX-lOO、1昭/ml溶菌酶、lmMDTT和蛋白酶抑制劑中。將GST-融合蛋白捕獲在谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B上，用不含溶菌酶的裂解緩沖液清洗一次，然后用結(jié)合/清洗緩沖液(50mMTris-ClpH7.4、150mMNaCl、lmMDTT、1%TritonX-100、0.1%BSA和蛋白酶抑制劑)清洗兩次。將GST-融合蛋白與60nM純化的重組樁蛋白在4。C溫育過夜，在結(jié)合/清洗緩沖液中徹底清洗，重新懸浮在2X樣品緩沖液中。Western印跡將免疫沉淀物和GST-融合蛋白在100°C溫育2分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜與含有5%脫脂奶粉的PBS+0.1%Tween20(PBST)(PBST-M)在25°C溫育60分鐘。將阻斷的膜與第一抗體(1:2000的抗FlagM2;I:IO，OOO稀釋的抗HA;1:500的抗Hic-5;1:10,000的抗樁蛋白；1:1,000的抗Rac和1:500的抗Cdc42)在PBST-M中于25。C溫育60分鐘，或在4。C溫育過夜。將膜在PBST中清洗3x10分鐘，然后與第二抗體(1:10,000的山羊抗小鼠或山羊抗兔辣根過氧化物酶)在25°C溫育60分鐘。將膜在PBST中清洗3x10分鐘，并用ECLPLUS可視化。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯Mena-V5用T7QuickCoupled體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)按照制造商的說明書進(jìn)行合成。鋪展分析將轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞鋪于用5pg/ml纖連蛋白包被的蓋玻片上。在5%C02和37°C下溫育30分鐘后，將細(xì)胞用冰冷的PBS清洗3次，用3.7%甲醛在室溫固定IO分鐘。然后將細(xì)胞用0.2%TritonX-100通透化3分鐘，用PBS+0.1%Tween20(PBST)清洗3次，與10pg/ml羅丹明-鬼筆環(huán)肽在室溫溫育1小時(shí)。在用PBS-T清洗3次后，將蓋玻片放置在Pro-LongGold中，通過共焦顯微鏡進(jìn)行分析。使用ImageJ在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了150個(gè)細(xì)胞的總面積。siRNA介導(dǎo)的樁蛋白的擊倒使用LipofectAMINE2000，按照制造商的說明書，將HEK293細(xì)胞用lOOnMsiRNA雙鏈體(5'-CCCUGACGAAAGAGAAGCCUAUU-3'，SEQIDNO:33和5'-UAGGCUUCUCUUUCGUCAGGGUU-3'，SEQIDNO:34)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，處理細(xì)胞，以用于生化分析或細(xì)胞鋪展分析。樁蛋白的重構(gòu)通過用編碼雞樁蛋白的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)，該載體在siRNA耙位點(diǎn)中具有核苷酸序列5'-CCCCTACAAAAGAAAAACCAA-3'(SEQIDNO:35)。擊倒和重構(gòu)可以通過用樁蛋白抗體的western印跡進(jìn)行觀察，并通過密度計(jì)量法進(jìn)行定量。Rac和Cdc42活化分析將轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)皿上分離，在DMEM+0.2%BSA中保持懸浮1小時(shí)，鋪于用5pg/ml纖連蛋白包被的細(xì)菌培養(yǎng)皿上5分鐘。然后將細(xì)胞用冰冷的PBS清洗兩次，并在50mMTrispH7.0、500mMNaCl、lmMMgCl2、lmMEGTA、lmMDTT、0.5%NP-40、1X蛋白酶抑制劑、1X磷酸酶抑制劑和20|ig/mlGST-PBD中裂解。將裂解液在14,000rpm離心5分鐘，將上清液與30pl谷胱甘肽瓊脂糖在4°C溫育30分鐘。在用裂解緩沖液清洗3次后，將結(jié)合的蛋白用2X樣品緩沖液洗脫。Rac和Cdc42用特異性針對(duì)每種蛋白的抗體通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。將Rac活化水平按照總的Rac進(jìn)行歸一化，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的最高值被指定為值為1。Robo4AP/AP小鼠的產(chǎn)生和基因分型將Robo4靶向載體電穿孔(electroporated)到胚胎干(ES)細(xì)胞中。將所靶向的等位基因是雜合的ES細(xì)胞注射到胚泡中，然后轉(zhuǎn)移到假孕的雌性中。通過深淺環(huán)紋顏色的存在鑒定嵌合雄性，并與C57BL/6雌性交配，以產(chǎn)生ES細(xì)胞衍生的后代?；蛐屯ㄟ^尾部DNA的Southern印跡分析來證實(shí)。使用來自耳穿孔或尾巴樣品的基因組DNA，在下列條件下進(jìn)行PCR基因分型94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，40個(gè)循環(huán)。使用下面的兩條引物對(duì)Robo4進(jìn)行基因分型5'cccttcacagacagactctcgtatttcc3'(正向)禾口5'cccagacctacattaccttttgccg3'(反向)，下面兩條引物用于AP:5'ggcaacttccagaccattggcttg3'(正向)禾口5'ggttaccactcccactgacttccctg3'(反向)。胚胎和表達(dá)分析胚胎的階段確定、原位雜交、石蠟切片和全胚胎PECAM-1免疫組織化學(xué)分析按照以前的描述i進(jìn)行。對(duì)于Northern印跡分析來說，在用TRIZOL分離后，每道上樣20嗎總RNA。使用primeItII隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Stratagene)，產(chǎn)生了34-標(biāo)記的探針。肺裂解物使用裂解緩沖液制備[P/。NP-40，150mMNaCl，50mMTris-Cl(pH7.5)，1mMEDTA和蛋白酶抑制劑混合物(Roche)]。來自肺裂解物的Robo4蛋白按照以前的描述使用多克隆抗Robo4抗體通過Western印跡分析來檢測(cè)。堿性磷酸酶(AP)染色將胚胎或組織在含有4%多聚甲醛和2mMMgCb的PBS中于4°C震蕩固定過夜。將樣品在PBST(PBS，0.5%Tween20)中清洗3次，每次15分鐘。將內(nèi)源堿性磷酸酶在含有2mMMgCh的PBS中于65°C失活90分鐘，然后在AP緩沖液U00mMTris-ClpH9.5，100mMNaCl，50mMMgCl2，0.1%Tween20，2mM左旋咪唑)中清洗兩次，每次15分鐘。對(duì)于胚胎來說，染色在BM紫底物(BoehringerMannheim)中進(jìn)行，對(duì)于成年組織來說，在NBT/BCIP中進(jìn)行。染色在含有5mMEDTA的PBS中終止。AP染色后的全胚胎免疫組織化學(xué)按照以前的描述，在固定和切片的視網(wǎng)膜上進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)染色。染色在EDTA-5mMPBS中終止。將視網(wǎng)膜在PBS中清洗兩次，在4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖鹽水中在室溫下后固定5分鐘，然后在PBS中清洗2次。在PBlec(PBS，pH6.8，1%Triton-X100，O.lmMCaCl，O.lmMMgCl，O.lmMMnCl)中溫育2小時(shí)后，將視網(wǎng)膜與抗體在4°C溫育過夜。使用兔抗NG2抗體(1:200;Chemicon)標(biāo)記周細(xì)胞，使用大鼠抗endomucin(克隆V.7C7，由DietmarVestweber友情提供；1:20稀釋)標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞。在PBS-T中(PBS,pH7.4，1%Triton-XlOO)清洗3次后，將樣品與結(jié)合了合適熒光染料--AlexaFluor488或568(MolecularProbes;Invitrogen)的第二抗體在PBS中溫育。在清洗和在4%PFA中短時(shí)后固定后，將視網(wǎng)膜使用Mowiol/DABCO(Sigma-Aldrich)展平和固定在蓋玻片上。樣品通過常規(guī)的光學(xué)和熒光顯微鏡進(jìn)行分析，使用了裝備有ZeissAxiocamHRc數(shù)字照相機(jī)的ZeissStereomicroscopeStemiSV11Bioquad，還通過使用ZeissLSMMeta510的激光共焦激光掃描顯微鏡，進(jìn)行分析。AP染色用633nmHeNe激光器和反射組件加以可見化。數(shù)字照片使用Volocity(4.0Improvision)進(jìn)行處理，并在AdobePhotoshopCS2中進(jìn)行匯編。免疫組織化學(xué)全胚胎三重免疫熒光共焦顯微術(shù)按照以前的描述3進(jìn)行。簡(jiǎn)單來說，使用了針對(duì)PECAM、NP1、CX40、2H3、BFABP和aSMA的抗體來標(biāo)記E15.5處Robo4+Z+或Robo4-A胚胎的四肢皮膚。構(gòu)建重組Slit片段的表達(dá)載體計(jì)劃的表達(dá)載體描繪在圖23中。編碼所有片段的DNA被克隆到pSECTAG2載體(Invitrogen)中，共有下面的特征CMV啟動(dòng)子，Kozak共有序列，myc/histag框內(nèi)融合，以及牛生長(zhǎng)激素的polyA序列。Fc融合通過用重組形式的人類IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域代替myc/his表位而產(chǎn)生，在該Fc結(jié)構(gòu)域中補(bǔ)體活化和效應(yīng)細(xì)胞相互作用結(jié)構(gòu)域已經(jīng)分別被IgG4和IgG2序列代替(Katoh等，2005;Armour等，1999)。重組Slit片段和Slit片段-Fc融合蛋白從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分離。所需的構(gòu)建體被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，通過Zeocin抗性進(jìn)行篩選。表達(dá)Robo4的HEK細(xì)胞上Robo4激動(dòng)劑的結(jié)合和活性將表達(dá)Robo4-HA(Robo4-HEK)或只有pcDNA3載體(對(duì)照-HEK)的穩(wěn)定細(xì)胞系接種到用100pg/ml聚L-賴氨酸預(yù)先包被的6孔培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞與HEKCM或Slit-mycCM在37°C溫育。在與條件培養(yǎng)基溫育1小時(shí)后，接著在PBS中清洗3次，將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定20分鐘。然后將細(xì)胞在PBS中清洗3次，與小鼠抗myc抗體(SantaCruzBiotech)和抗小鼠Alexa594結(jié)合的第二抗體(MolecularProbes)溫育。那些激動(dòng)劑與Robo4結(jié)合以抑制遷移的能力，按照ParkKW,MorrisonCM,SorensenLK等，"Robo4isavascular-specificreceptorthatinhibitsendothelialmigration,"(Robo4是抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的血管特異性受體)DevBiol2003;261(l):251-67中的描述進(jìn)行。鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的分離鼠內(nèi)皮細(xì)胞的分離已經(jīng)在以前4描述。將綿羊抗大鼠IgGDynal珠子(DynalBiotech)與抗PECAM-1或抗ICAM-2單克隆抗體(BDPharmingen)以每lOOjtiL珠子5抗體結(jié)合。珠子被預(yù)先包被并儲(chǔ)存在4。C(4xl()8個(gè)珠子/mL含有0.1%BSA的PBS)，最多2周。肺從三只成年小鼠獲得。將肺葉與可見的支氣管和縱隔結(jié)締組織切開。將肺在50mL冷的分離培養(yǎng)基(20%FBS-DMEM)中清洗以除去紅細(xì)胞，用剪刀剪碎，在25mL預(yù)溫?zé)岬哪z原酶(2mg/mL，Worthington)中在37°C下消化45分鐘，同時(shí)輕輕搖動(dòng)。通過用連接有14號(hào)金屬套管的60cc注射器抽吸12次，將消化的組織解離，然后通過無菌的70pm—次性細(xì)胞過濾器(Falcon)進(jìn)行過濾。將懸浮液在4°C以400xg離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在2ml冷PBS中，然后與PECAM-1包被的珠子(15pL/mL細(xì)胞)在室溫溫育10分鐘。使用磁性分離器回收珠子結(jié)合的細(xì)胞，將其在分離培養(yǎng)基中清洗，然后重新懸浮在完全培養(yǎng)基中(EGM-2MV,Lonza)。將細(xì)胞鋪于單用纖連蛋白包被的75-cm^且織培養(yǎng)瓶中，在溫育過夜后除去未粘附的細(xì)胞。將粘附的細(xì)胞用PBS清洗，并加入15ml完全培養(yǎng)基。隔日用完全培養(yǎng)基給培養(yǎng)的細(xì)胞補(bǔ)料。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到70%到80%鋪滿時(shí)，將它們用胰蛋白酶-EDTA分開，重新懸浮在2mlPBS中，并使用ICAM-2結(jié)合的珠子(15^L/mL細(xì)胞)進(jìn)行第二次分揀。按前述清洗細(xì)胞和鋪板。第2到5代被用于功能分析。細(xì)胞培養(yǎng)將人類表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC，Cambrex)生長(zhǎng)在EGM-2MV中，使用第3和6次之間。免疫細(xì)胞化學(xué)在細(xì)胞鋪板之前，將8孔室載片(Lab-Tek)用1.5pg/cm2的纖連蛋白包被2小時(shí)。將鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞鋪于完全培養(yǎng)基EGM-2MV中，37°C過夜(100,000個(gè)細(xì)胞/孔)。然后將細(xì)胞在PBS中清洗3次，在室溫下在4%多聚甲醛中固定IO分鐘。在PBS中另外清洗3次后，將細(xì)胞在含有1%TritonX-100的PBS中室溫下清洗15分鐘，然后在PBST中(含有0.1%TritonX-100的PBS)清洗3次。然后將細(xì)胞在含有2。/。BSA的PBS中室溫下阻斷20分鐘，并與第一抗體在2%BSA中室溫下溫育1小時(shí)，第一抗體是大鼠抗PECAM-1(Pharaiigen)，兔抗VonWillebrand因子(vWF)(DAKO)。在與第一抗體溫育后，將細(xì)胞在PBST中清洗，并與第二抗體在2。/。BSA中于室溫溫育1小時(shí)，第二抗體是AlexaFluor488驢抗大鼠IgG和AlexaFluor594驢抗兔IgG(MolecularProbes)。將細(xì)胞在PBST中清洗一次，在PBS中清洗一次，固定在Vectashield固定培養(yǎng)基中(VectorLaboratories)，通過共焦顯微鏡照相。熒光激活的細(xì)胞分揀(FACS):通過在37°C短時(shí)胰蛋白酶處理(不超過2分鐘)，將鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞從培養(yǎng)皿分開。通過加入含有在EBM-2+0.1°/。BSA中的胰蛋白酶抑制劑，使蛋白裂解終止。將細(xì)胞在FACS緩沖液中(不含Ca2+和Mg2+的PBS+0.1。/。BSA)清洗兩次，然后重新懸浮在lmLFACS緩沖液中。細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)分析以兩步免疫熒光染色來進(jìn)行。將細(xì)胞與純化的單克隆抗體大鼠抗PECAM-1、兔抗vWF在4°C溫育30分鐘。然后將細(xì)胞在FACS緩沖液中清洗兩次，并重懸浮在lmLFACS緩沖液中。然后將細(xì)胞與熒光第二抗體AlexaFluor488驢抗大鼠IgG和AlexaFluor594驢抗兔IgG(MolecularProbes)在4°C溫育30分鐘。將細(xì)胞再次清洗兩次，重懸浮在lmLFACS緩沖液中，用FACS進(jìn)行分析。細(xì)胞遷移分析將細(xì)胞用CellTrackerGreenCMFDA(MolecularProbes)標(biāo)記1小時(shí)，清洗，然后在添加了0.1%BSA的EBM-2中饑餓過夜。將細(xì)胞用胰蛋白酶處理，清洗，并重新懸浮到300,000個(gè)細(xì)胞/mL。將100pL細(xì)胞懸浮液(30，000個(gè)細(xì)胞)上樣到已經(jīng)在兩面用5嗎/mL人類纖連蛋白包被的8卞mHTSFluoroBlock濾膜(BDFalcon)上。將測(cè)試因子在EBM-2/0.1%BSA中稀釋，并放置在室下部中。在37°C溫育3小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡(Axiovert200)上對(duì)每個(gè)孔的兩個(gè)5X視野進(jìn)行照相。通過對(duì)熒光細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)來計(jì)算遷移細(xì)胞的數(shù)量。Robo4+z+細(xì)胞的基線遷移被設(shè)定為1。數(shù)據(jù)被表示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三份平行樣的平均值iS.E.。管形成分析管形成分析按照以前的描述5進(jìn)行。簡(jiǎn)單來說，將從Robo4+z+和Robo4APZAP小鼠分離的肺內(nèi)皮細(xì)胞鋪于基質(zhì)膠包被的48孔皿的孔中，在0.5%血清中饑餓過夜。然后將細(xì)胞用0.48nMVEGF-A在不存在或存在Slit2的情況下刺激3.5小時(shí)，然后進(jìn)行照相。使用ImageJ軟件測(cè)定平均管長(zhǎng)度。數(shù)據(jù)被表示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的兩份平行樣的平均值iS.E.。體外通透性分析將從Robo4悟和Robo4AP"P小鼠分離的肺內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)鋪于用1.5嗎/cr^人類纖連蛋白預(yù)先包被的3.0pmCostartranswells上，并生長(zhǎng)至鋪滿。將細(xì)胞饑餓過夜，用0.3nMSlit2預(yù)處理30-60分鐘，然后用2.4nMVEGF-A刺激3.5小時(shí)。在室頂部加入辣根過氧化物酶(HRP)，終濃度為100叫/ml，在30分鐘后將培養(yǎng)基從室下部移除。將等份試樣與0.5mM愈創(chuàng)木酚、50mMNa2HPO^n0.6mM11202溫育，通過測(cè)量在470nm的吸光度來確定鄰苯二胺的形成。單層的基本通透性被設(shè)定為100%。數(shù)據(jù)被表示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三份平行樣的平均值iS.E.。VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜通透性視網(wǎng)膜通透性按照53中的描述進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)單來說，將8-10周齡的小鼠用阿佛丁(2-2-2三溴乙醇，0.4mg/g;AcrosOrganics，MorrisPlains,NJ)麻醉。對(duì)小鼠目艮內(nèi)注射1.4uL35.7ug/mL的VEGF-A(R&DSystemsInc.Minneapolis,MN)禾口50ngSlit2N(SEQIDNO:39)。在對(duì)側(cè)眼中注射等體積的模擬制備物。按照指示，施用了其它條件的1.4uL鹽水、模擬制備物或slit。六小時(shí)后，經(jīng)過尾靜脈對(duì)小鼠靜脈內(nèi)注射60mg/mL的伊文思藍(lán)50uL。兩小時(shí)后，將小鼠處死，用檸檬酸緩沖的多聚甲醛進(jìn)行灌注以除去靜脈內(nèi)的伊文思藍(lán)。將眼睛摘除，剝離出視網(wǎng)膜。在0.3mL甲酰胺中在70°C將伊文思藍(lán)染料洗脫18小時(shí)。將提取液超速離心通過5kD的濾膜2小時(shí)。測(cè)定620nm的吸光度。在740nm測(cè)定背景吸光度，并將其減掉。Robo4的腺病毒表達(dá)按照以前的描述通過腺病毒對(duì)Robo4進(jìn)行表達(dá)。Miles分析將伊文思藍(lán)注射到6-8周齡的小鼠的尾靜脈中，30分鐘后，將鹽水、或10ngVEGF-A在不存在和存在100ngSlit2的情況下注射到真皮中。在另外30分鐘后，進(jìn)行穿孔活組織檢查，在60°C將伊文思藍(lán)從真皮組織中洗脫18小時(shí)到甲酰胺中。離心后，在620nm測(cè)量吸光度。在鹽水注射的動(dòng)物中觀察到的真皮通透性的量被設(shè)定為1。數(shù)據(jù)被表示為每次處理的5只個(gè)體小鼠個(gè)體的兩份平行樣的平均值士S.E.(每只動(dòng)物總共注射6次)。視網(wǎng)膜通透性視網(wǎng)膜通透性按照以前的描述8進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)單來說，將8-10周齡的小鼠用阿佛丁(2-2-2三溴乙醇，0.4mg/g;AcrosOrganics,MorrisPlains,NJ)麻醉。對(duì)小鼠眼內(nèi)注射1.4^L35.7嗎/mL的VEGF誦A(R&DSystemsInc.Minneapolis,MN)和50ngSlit2。在對(duì)側(cè)眼中注射等體積的模擬物。按照指示，施用其它條件。六小時(shí)后，經(jīng)過股靜脈對(duì)小鼠施用60mg/mL的伊文思藍(lán)50pL。兩小時(shí)后，將小鼠處死，用檸檬酸緩沖的甲醛進(jìn)行灌注以除去靜脈內(nèi)的伊文思藍(lán)。將眼睛摘除，剝離出視網(wǎng)膜。在0.4mL甲酰胺中在70°C將伊文思藍(lán)染料洗脫18小時(shí)。將提取液超速離心通過5kD的濾膜2小時(shí)。測(cè)定620nm處的吸光度。在740nm測(cè)定背景吸光度，并將其減掉。數(shù)據(jù)被表示為每個(gè)基因型的5只小鼠個(gè)體的平均值iS.E.。生物化學(xué)分析將HMVEC在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)至鋪滿，在EBM-2+0.2%BSA中饑餓過夜。第二天，將細(xì)胞用50ng/mLVEGF-A刺激5分鐘，用冰冷的PBS清洗兩次，在50mMTrispH7.4、150mMNaCl、10mMMgCl2、lmMDTT、10%甘油、l%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1。/。SDS、1X蛋白酶抑制劑、IX磷酸酶抑制劑中裂解。將裂解液與2X樣品緩沖液混合，通過SDS-PAGE分離，并用1:1000稀釋的針對(duì)磷酸化VEGFR2、磷酸化p42/44和磷酸化Src(CellSignaling)的抗體進(jìn)行探測(cè)。對(duì)于Rac活化分析來說，產(chǎn)生粗的膜制備物9，并將GTP-Rac用20叫/mlGST-PBD沉淀。在用裂解緩沖液清洗3次后，將結(jié)合的蛋白用2X樣品緩沖液洗脫。Racl使用單克隆抗體(BDBiosciences)通過western印跡進(jìn)行檢測(cè)。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變簡(jiǎn)單來說，P7幼仔和哺乳的母親被放置在75%氧中，這通過Pro-OX氧控制器(BioSpherix,Redfield,NY)維持。在P12時(shí)將幼仔取出，眼內(nèi)注射Slit2N(SEQIDNO:39)激動(dòng)劑或模擬制備物，后者用作對(duì)照條件。在P17時(shí)處死小鼠，通過左心室灌注lml50mg/ml的FITC-葡聚糖(Sigma,St.Louis,MO)。將眼睛摘除，在4%多聚甲醛中固定30分鐘，產(chǎn)生了視網(wǎng)膜輔片。用Axiovert200熒光顯微鏡(CarlZeiss，Thornwood,NY)拍照。新生血管化用AxioVision軟件進(jìn)行定量，該軟件計(jì)算每個(gè)區(qū)域血管化的量(CarlZeiss,Thornwood，NY)。數(shù)據(jù)被表示為每個(gè)基因型的5只小鼠個(gè)體的平均值±S.E.。激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管化將2-3月齡的小鼠用阿佛丁(2-2-2三7臭乙酉享，0.4mg/g;AcrosOrganics,MorrisPlains,NJ)麻醉，用1%托吡卡胺(Alcon,FortWorth,TX)散瞳。用帶有狹縫燈投送系統(tǒng)的IridexOcuLightGL532nm激光光凝固器(Iridex,MountainView,CA)，從距離視神經(jīng)盤3個(gè)盤直徑的3、6和9點(diǎn)鐘方向產(chǎn)生了3個(gè)灼傷，參數(shù)如下150mW功率，75um光點(diǎn)大小和0.1秒的持續(xù)時(shí)間。在使用激光時(shí)產(chǎn)生泡，Bruch膜的破裂是獲得CNV的重要因素；因此，只有產(chǎn)生了泡的灼傷包含在本研究中。在激光處理后立即以及3天后，對(duì)小鼠玻璃體內(nèi)注射50ngSlit2N(SEQIDNO:39)。在另一只眼內(nèi)通過玻璃體內(nèi)注射給予相等體積的模擬制備物。激光處理1周后，將小鼠處死，產(chǎn)生脈絡(luò)膜輔片。使用生物素結(jié)合的同工凝集素(Sigma,St.Louis，MO)和德克薩斯紅結(jié)合的鏈親和素(Sigma,St.Louis,MO)對(duì)CNV進(jìn)行染色。輔片使用ZeissLSM510共焦顯微鏡(Zeiss,Thornwood,NY)進(jìn)行檢査，CNV使用ImageJ軟件(NIH，Bethesda，MD)進(jìn)行定量。參考文獻(xiàn)AfzalA,ShawLC，LjubimovAV,BoultonME,SegalMS，GrantMB.Retinalandchoroidalmicroangiopathies:Therapeuticopportunities.(視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的微血管病治療機(jī)遇)MicrovascRes2007.ArmourKL,ClarkMR,HadleyAG，WilliamsonLM.RecombinanthumanIgGmoleculeslackingFcgammareceptorIbindingandmonocytetriggeringactivities.(缺少受體I結(jié)合和單核細(xì)胞觸發(fā)活性的重組人類IgG分子)，EurJImmunol1999;29(8):2613隱24.Bashaw,G.J.,Kidd,T.,Murray,D.，Pawson,T.，andGoodman,CS.(2000》Repulsiveaxonguidance:AbelsonandEnabledplayopposingrolesdownstreamoftheroundaboutreceptor.(排斥性軸突導(dǎo)向Abelson和Enabled在roundabout受體下游發(fā)揮相反的作用)，Cell101，703-715.Battye,R.,Stevens,A.，andJacobs,J.R.(1999).AxonrepulsionfromthemidlineoftheDrosophilaCNSrequiresslitfunction.(軸突從果蠅CNS中線的排斥需要slit功能)Development126,2475-2481,BattyeR,StevensA,PerryRL,JacobsJR.RepellentsignalingbySlitrequirestheleucine-richrepeats.(Slit的排斥性信號(hào)傳導(dǎo)需要富含亮氨酸的重復(fù)序列)，JNeurosci2001;21(12):4290-8.Bedell,V.M.,Yeo,S.Y.,Park,K.W.,Chung.J.,Seth,P.,Shivalingappa，V.,Zhao，J.,Obara，T.，Sukhatme，V.P.,Drummond,I.A"Li，D.Y.禾卩Ramchandran，R.(2005),(roundabout4isessentialforangiogenesisinvivo.(roundabout4是體內(nèi)血管生成必需的)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,6373-6378.Brooks,P.C,Clark，R.A.禾口Cheresh,D.A.(1994).Requirementofvascularintegrinalphavbeta3forangiogenesis.(血管生成需要血管整合素avp3)Science264,569-571.Brooks,P.C,Montgomery,A.M.,Rosenfeld，M.，Reisfeld，R.A.,Hu，T.,Klier,G.禾卩Cheresh,D.A.(1994).Integrinalphavbeta3antagonistspromotetumorregressionbyinducingapoptosisofangiogenicblo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的對(duì)象，以及(b)給對(duì)象的視網(wǎng)膜施用與神經(jīng)元受體和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的排斥性導(dǎo)向信號(hào)。19.在對(duì)象中使用排斥性信號(hào)或模擬物治療對(duì)象的方法，包括(a)鑒定具有用VEGF阻斷劑、TNF阻斷劑、組胺阻斷劑或凝血酶阻斷劑治療的適應(yīng)征的對(duì)象，以及0)給對(duì)象施用與神經(jīng)元受體和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的排斥性導(dǎo)向信號(hào)。20.權(quán)利要求15、16、17、18或19的方法，其中排斥性導(dǎo)向信號(hào)是roundabout受體、Unc5受體、DCC受體、再生蛋白受體、DSCAM受體或ICAM-2受體的配體。21.權(quán)利要求20的方法，其中配體是Slit2。22.包含roundabout-4(Robo4)的樁蛋白結(jié)合序列的分離的多肽，其中所述多肽不包含全長(zhǎng)Robo4。23.權(quán)利要求22的分離的多肽，其中樁蛋白結(jié)合序列由SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少IO個(gè)殘基的片段組成。24.10到400個(gè)氨基酸的分離的多肽，包含SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少IO個(gè)殘基的片段。25.10到400個(gè)氨基酸的分離的多肽，包含的氨基酸序列與SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少IO個(gè)殘基的片段具有至少80%的序列同源性。26.包含roundabout-4(Robo4)的樁蛋白結(jié)合序列(PBS)的分離的多肽，其中所述多肽由下式構(gòu)成Ri-PBS-R2其中W和I^獨(dú)立地是H、酰基、NH2、氨基酸或肽，其中所述多肽不包含全長(zhǎng)Robo4。27.權(quán)利要求26的分離的多肽，其中PBS由與SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少10個(gè)殘基的片段具有至少80%的序列同源性的氨基酸序列組成。28.分離的多肽，基本上由與SEQIDNO:27或其長(zhǎng)度為至少10個(gè)殘基的片段具有至少80%序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成。29.分離的核酸，編碼權(quán)利要求22、24、26或28的多肽。30.分離的核酸，編碼的多肽包含roundabout-4(Robo4)的樁蛋白結(jié)合序列，其中所述多肽不包含全長(zhǎng)Robo4。31.分離的核酸，包含SEQIDNO:2或其長(zhǎng)度為至少30個(gè)殘基的片段，其中所述核酸不編碼全長(zhǎng)roundabout-4(Robo4)。32.載體，包含權(quán)利要求29、30或31的分離的核酸。33.促進(jìn)組織中血管生成的方法，包括將含有權(quán)利要求22、24、26或28的多肽的組合物投送到組織的內(nèi)皮細(xì)胞中。34.促進(jìn)組織中血管生成的方法，包括將含有權(quán)利要求29、30或31的核酸的組合物投送到組織的內(nèi)皮細(xì)胞中。35.促進(jìn)組織中血管生成的方法，包括給組織施用含有權(quán)利要求32的載體的組合物，其中所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明描述了用于抑制血管通透和病理性血管生成的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還描述了用于生產(chǎn)和篩選能夠抑制血管通透和病理性血管生成的化合物和組合物的方法。本發(fā)明描述的組合物包括藥物組合物。本發(fā)明描述的組合物可用于例如抑制血管通透和病理性血管生成的方法，包括抑制由特定的血管生成、通透性和炎性因子例如VEGF、bFGF和凝血酶誘導(dǎo)的血管通透和病理性血管生成的方法。本發(fā)明還提供了用于治療特定疾病和病癥的方法。文檔編號(hào)A61K38/16GK101600451SQ200780050885公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2007年12月11日優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日發(fā)明者克里斯托弗·瓊斯,尼亞爾·隆東,迪安·李申請(qǐng)人:猶他大學(xué)研究基金會(huì)