專利名稱：基于內(nèi)皮細胞表面抗原的腫瘤疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及腫瘤免疫疫苗的制備，可應用于腫瘤治療以及預防其復發(fā)的藥品。
背景技術(shù)：
手術(shù)方法和化學療法對腫瘤治療的有限性，使得針對腫瘤患者的新治療方法的進一步開發(fā)變得迫切?，F(xiàn)在，人們特別關(guān)注抗血管生成療法，其原理M于抑制肺瘤血管的生長。
腫瘤的發(fā)展有兩個主要階段血管前期和血管期。在第一個階段，腫瘤通過擴散作用從病人血管中獲得營養(yǎng)和氧氣而生長，這使得腫瘤的生長被限制在不足幾個立方毫米的空間之內(nèi)。接下來腫瘤的生長需要過渡至第二個階段，這個階#爻為月中瘤血管化(tumor vascularisation) (Folkman J" "What is evidence thattumors are angiogenesis dependent " J. Natl. Cancer Inst" 1990, v.82, 4-6)。血管的出現(xiàn)極大地加強了肺瘤的營養(yǎng)，這導致腫瘤的快速生長，并增大了其轉(zhuǎn)移的可能性(Hanahan D., Folkman J. "Patterns and emerging mechanisms of theangiogenic switch during tumorigenesis". Cell, 1996， v. 86, 353-364 )?？寡苌晌镔|(zhì)的應用可預防肺瘤血管生長以及相應地抑制生長的第二階萃爻。
預防腫瘤生長， 一個眾所周知的方法是給患者接種疫苗以克服針對位于血管內(nèi)膜上內(nèi)皮細胞(EC)的免疫耐受性。細胞和體液的細胞毒作用引起內(nèi)皮細胞的死亡，這阻礙了肺瘤血管的形成，并進而破壞了惡性細胞。已知有各種制備這種疫苗的抗原的方法；和本發(fā)明最接近的是基于適當?shù)膬?nèi)皮細胞抗原的疫苗。
文獻資料表明獲得疫苗的方法是基于對異種內(nèi)皮細胞的利用，即使用另一生4勿物種的內(nèi)皮細月包(Wei Y" "Immunotherapy of tumors with xenogeneic
4endothelial cells as a vaccine", Nature Medicine, 2000, v. 6， 1160-1166)。這些疫苗的缺點是異種抗原的存在以及實際上壓載抗原(ballast antigens)的存在，這
從已知的基于異體抗原的疫苗來源來看，這種疫苗是由同一物種的其他生物細胞產(chǎn)生的(如Scappaticci F.A., Nolan G.P" "Induction of anti-tumor immunityin mice using a syngeneic endothelial cell vaccine" Anticancer Res., 2003, v. 23，1165-1672，文章作者比較了內(nèi)皮細胞疫苗的不同變種)。疫苗中異體抗原的出現(xiàn)，也會降低對內(nèi)皮細胞特異性抗原免疫反應的強度及特異性。
最接近的類似物在Okaji Y等的論文中有描述("Vaccination with autologousendothelium inhibits angiogenesis and metastasis of colon cancer throughautoimmunity", Cancer Sci.， 2004, v. 95, 1， 85-90)。后一種方法應用了內(nèi)皮細月包。上述方法使用了自身內(nèi)皮細胞，即從免疫后的機體中分離的細胞或來源于遺傳基因相同的機體的細胞(例如同系老鼠的細胞)。這樣的疫苗可產(chǎn)生強度最高和特異性最佳的免疫反應，這決定了其治療效果。但是，所有的來源于整體的細胞的疫苗都包含有大量的壓載物質(zhì)(ballastmaterial),即胞漿蛋白、碳水化合物和脂類。壓載物(Ballast substances)可明顯減少疫苗中抗原的量，而這些抗原才是免疫系統(tǒng)的潛在的作用目標(胞內(nèi)抗原不能影響免疫系統(tǒng))。應該注意到， 一種已知的制備疫苗的方法不會引起對腫瘤血管中內(nèi)皮細胞的特異性免疫應答。
本發(fā)明的目的是提供一種制備基于內(nèi)皮細胞抗原的腫瘤疫苗的方法，以克服機體對肺瘤血管內(nèi)皮細胞的免疫耐受性。本發(fā)明的基礎在于正常組織血管內(nèi)皮細胞和肺瘤內(nèi)皮細胞之間公知的區(qū)別。其中，正常組織血管內(nèi)皮細胞生理條件下處于的靜息狀態(tài)；而腫瘤內(nèi)皮細胞是處于激活，即指處于活躍地增殖和轉(zhuǎn)移的狀態(tài)。已知與正常組織血管中的內(nèi)皮細胞相比，激活的內(nèi)皮細胞中許多特異性蛋白的表達增多，如avP3(Gladson C丄.et al.， Am. J. Pathol., 1996， v. 148,1423-1434), E-選擇素(E畫selectin) (Volm M. et al., Clin. Cancer Res" 2000， v. 6,3236-3240)，內(nèi)皮糖蛋白(endoglin) (Burrows F. et al., Clin. Cancer Res" 1995， v.1, 1623-1634),內(nèi)皮p垂液酸蛋白(endosyalin) (Takahashi K. et al., J. Clin. Invest"1994， v. 93, 2357-64)和血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF-receptor) (Boocock C.et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, v. 87, 506-516)。 一些蛋白表達譜的差異可以從專利 US2006210975 , US2005142138 , US2006127902和國際申諱-WO2004091383中得知。本發(fā)明的重點是內(nèi)皮細胞表面的差異，特別是嗜中性細月包素(neutrophillins )、整合素(integrins)、受體(receptors)等，這些4吏4尋抗原對腫瘤血管內(nèi)皮細胞具有特異性(見國際申請WO2004001004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所達到的技術(shù)效果在于通過克服了機體對腫瘤血管內(nèi)皮細胞的免疫耐受性，而破壞胂瘤血管，從而提高了對腫瘤疾病的治療效果。也就是說克服免疫耐受性就是針對激活內(nèi)皮細胞的，這使得損害特異性地針對腫瘤血管。
上述技術(shù)效果，可通過本發(fā)明所提供的利用內(nèi)皮細胞制備腫瘤疫苗的方法而實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，用蛋白酶對活的內(nèi)皮細胞進行不使細胞死亡的處理；收集釋放的抗原；經(jīng)過一段時間后對所述活的細胞進行重復處理，該段間隔的時間足以使得細胞表面抗原恢復；積聚表面抗原直至達到滿足疫苗接種的劑量；控制制備的疫苗質(zhì)量。
激活的所述內(nèi)皮細胞可以為從腫瘤血管中新分離的內(nèi)皮細胞。
如果從肺瘤血管分離的內(nèi)皮細胞數(shù)量不夠，本發(fā)明所提供方法也可以包括通過培養(yǎng)來增殖所述內(nèi)皮細胞的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
所述激活的內(nèi)皮細胞可從腫瘤血管中分離，并在能保持其激活狀態(tài)的條件下培養(yǎng)。
所述內(nèi)皮細胞的激活可通過與腫瘤細胞共培養(yǎng)來維持。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述內(nèi)皮細胞的激活狀態(tài)可以通過與腫瘤組織片段進行培養(yǎng)來維持。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實施例，激活的所述內(nèi)皮細胞取自病人自身腫瘤血管。根據(jù)本發(fā)明的再一實施例，激活的所述內(nèi)皮細胞可取自不同患者的腫瘤血
6所述內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)也可通過體外與腫瘤細胞進行共同培養(yǎng)而激活。 所述內(nèi)皮細胞可由患者自身的腫瘤細胞激活。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實施例，所述內(nèi)皮細胞可被其他患者的腫瘤細胞激活。 內(nèi)皮細胞可由適當?shù)姆瘟黾毎导せ睢?br> 根據(jù)本發(fā)明的另 一實施例，所述內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)可通過體外加入激活因子 來激活。在這種情況下，所述內(nèi)皮細胞可由至少一種激活因子激活。特別是4皮
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)激活。
根據(jù)本發(fā)明的另 一實施例，所述內(nèi)皮細胞可通過體外加入來自腫瘤細胞培 養(yǎng)的條件培養(yǎng)液而激活。
免疫應答可以通過在表面抗原中加入佐劑而實現(xiàn)。


以下通過具體實施方式
和附圖來進一步說明本發(fā)明。

如下 圖1為本發(fā)明疫苗制備的大體流程圖2為第一和第二實^^組以及對照組中，BALB/c小鼠中肝癌細胞H22的 生長曲線圖(腫瘤直徑用士標準偏差表示)；
圖3為第一組(A)、第二組(B)和對照組(C)的小鼠腫瘤組織的組織 切片，以及相應的血管生成指數(shù)(AI);腫瘤血管壁呈深色(與彩色照片中的 棕色相對應)。
具體實施例方式
圖l所示為本發(fā)明的具體實施方式
?；畹膬?nèi)皮細胞分離自通過活檢或手術(shù) 取得的肺瘤組織。將活的內(nèi)皮細胞用于原代培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細胞。需要時對細 胞進行培養(yǎng)以達到足夠數(shù)量。
本發(fā)明所述方法，不僅可以通過使用初始就處于激活狀態(tài)的腫瘤血管內(nèi)皮 細胞來實現(xiàn)，也可通過使用處于靜息狀態(tài)的正常血管內(nèi)皮細胞，還可以通過使 用采用各種方式激活的內(nèi)皮細胞來實現(xiàn)。
7本發(fā)明中，接下來至關(guān)重要的一步，是在溫和(不使細胞死亡)的條件下 用蛋白酶處理活的細胞。
為了得到滿足疫苗接種劑量的抗原，將胰蛋白酶處理細胞的程序重復若干 次，其間間隔幾小時到幾天，此段時間對表面抗原的修復是必須的。疫苗積聚 是通過特定疫苗制備的特定工藝進行的，即，這些抗原可以根據(jù)其組成進行純 化、濃縮、分析，也可進行修飾或與佐劑混合以增強免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明所述的制備抗原疫苗的方法，具有如下優(yōu)點 -具有自體疫苗的所有優(yōu)點，即其相對于特定患者具有特異性； -具有多價疫苗的所有優(yōu)點，即抗原多樣性；
-在免疫接種后，內(nèi)皮細胞(最好使用激活的內(nèi)皮細胞)表面抗原疫苗的 富集，可以克服免疫接種帶來的對腫瘤血管內(nèi)皮細胞的免疫耐受性；
-本方法可通過積聚抗原而得到滿足疫苗接種劑量的抗原，而不是通過內(nèi) 皮細胞的增殖。這是非常重要的，因為在體外增殖期間原代細胞培養(yǎng)會逐漸改 變其抗原結(jié)構(gòu)，使其無法用于疫苗接種。
根據(jù)本發(fā)明得到的表面抗原，其實際應用取決于表達在血管內(nèi)皮細胞表面 (包括腫瘤)的蛋白質(zhì)片段的特征，也就是說氨基S^列及其修飾(如糖基化) 的特征。根據(jù)本發(fā)明所得到的激活的內(nèi)皮細胞表面抗原，其應用是由表達于內(nèi) 皮細胞表面，即腫瘤血管呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)片段的特征所決定的。
眾所周知，腫瘤的生長離不開肺瘤血管化。積聚和純化的內(nèi)皮細胞表面抗 原(優(yōu)選激活的)與能增強免疫反應的佐劑相混合一并注入人體或動物體內(nèi)。 由于細胞和體液免疫反應的作用，使得注入體內(nèi)的抗原失活，因而肺瘤血管中 已有的或新出現(xiàn)的內(nèi)皮細胞會被交叉破壞，這決定了免疫接種的治療和預防效 果。為了發(fā)揮免疫反應的最大作用，可重復注射表面抗原。
以下為實現(xiàn)本發(fā)明所述方法的實施例一，采用人肝癌細胞H22接種于小 鼠，基于自體激活的內(nèi)皮細胞制備腫瘤疫苗。
依據(jù)Belloni等的方法，從BALB/c小鼠肝臟血管中獲得自體內(nèi)皮細胞進 行培養(yǎng)。(Microvasc. Res., 1992, vol. 43， 20-45)在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中以1 : 3的 比例加入來自H22細胞的條件培養(yǎng)基來激活內(nèi)皮細胞。在激活的第5-7天后，根據(jù)以下方案，利用內(nèi)皮細胞制備表面抗原。
1. 從裝有培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細胞的細胞瓶中移除生長培養(yǎng)基，用無菌生理 溶液(體積為生長培養(yǎng)基體積的一半)沖洗單層細胞不少于三次。沖洗的目的 是去除殘留的生長培養(yǎng)基。
接下來至關(guān)重要的一步是用上述細胞所必需濃度的蛋白酶處理細胞，其
中，蛋白酶選擇胰蛋白酶(活性~ 3000U/mg )。
2. 將0.0001%的胰蛋白酶溶液加入到單層細胞中，加入量為每25cm2細胞 并瓦的表面lml溶液。
3.37。C下孵育細胞瓶，在孵育到5-7分鐘時，移出含有已分離的表面抗原 的胰蛋白酶溶液。
4. 加入新制備的含有血清(通常10%)的生長培養(yǎng)基，再接著進行培養(yǎng)。
5. 為了使積聚的表面抗原達到疫苗接種的劑量，經(jīng)過24小時，重復步驟 1-4,通過檢查培養(yǎng)激活的內(nèi)皮細胞的適配性，來控制疫苗質(zhì)量，以得到腫瘤 血管特異性抗原。
用胰蛋白酶處理細胞的條件可以極不相同，例如處理時間可以從幾分鐘到 數(shù)十分鐘，胰蛋白酶的濃度可以從0.00001%到0.5%，這些條件分別針對各內(nèi) 皮細胞的原代培養(yǎng)。如果胰蛋白酶的活性不同于說明書中提供的活性，可以根 據(jù)其活性來推算其正確的濃度比例。
在用胰蛋白酶處理以前，應對細胞進行快速沖洗，例如用生理溶液，以去 除殘留的生長培養(yǎng)基。經(jīng)胰蛋白酶處理后，釋放出的抗原為表面蛋白片段，可 以用任何適當?shù)姆椒ㄊ占@些蛋白片段，如用移液器傾析。
在細胞培養(yǎng)期間，與任何培養(yǎng)細胞一樣，內(nèi)皮細胞的抗原組成會發(fā)生變化， 這會使得細胞培養(yǎng)的抗原與患者腫瘤血管的內(nèi)皮細胞表面抗原之間產(chǎn)生差異。 為了避免制備出不適合的疫苗，抗原積聚中內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的適當性，按照歐亞 專利No.009326"測試細胞培養(yǎng)質(zhì)量的方法"所述進行評定。
眾所周知，用不會使細胞死亡的一定濃度的蛋白酶處理細胞，會引起細胞 表面抗原的分離(見歐亞專利No.009325"腫瘤疫苗、制備腫瘤疫苗的方法以
9及抗腫瘤免疫治療法")。因此根據(jù)本發(fā)明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶使得內(nèi)皮 細胞表面抗原釋放到溶液中。在胰蛋白酶的作用下釋》文的內(nèi)皮細胞表面抗原 (表面蛋白片段)，大部分適用于免疫接種，用于腫瘤患者的免疫接種。
注意，最好在細胞脫離細胞瓶表面之前收集含有細胞表面蛋白分離出的抗 原的胰蛋白酶溶液，這樣會避免細胞出現(xiàn)在抗原溶液中，從而避免了不必要的 純化步驟。
必需的蛋白酶在合適的濃度下處理細胞后不會使其死亡，由此可用胰蛋白 酶重復處理原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，從而積聚得到疫苗接種所需劑量的抗原。
在用胰蛋白酶處理細胞的間隔期間，根據(jù)方案培養(yǎng)細胞(如在37。C的C02 培養(yǎng)箱中，用含有血清的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，以保持添加物的激活狀態(tài))。
根據(jù)疫苗的制備技術(shù)處理積聚的表面抗原，即可經(jīng)過純化、濃縮、組成分 析，也可經(jīng)修飾或者與佐劑混合以增強免疫原性。
在本發(fā)明的其他實施例中，用胰蛋白酶處理細胞的步驟可與細胞的接種步 驟(用胰蛋白酶處理細胞，細胞釆集和分離)相結(jié)合。
胰蛋白酶溶液可用無菌生理溶液制備，也可用任何適當?shù)柠}溶液或緩沖液 制備。
在本發(fā)明的其他實施例中，可采用其他蛋白酶來代替胰蛋白酶，如胰凝乳 蛋白酶(chemotrypsin)、蛋白酶K等。
本發(fā)明所述制備腫瘤疫苗的方法可用于各種類型的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，尤其是 基于基質(zhì)(matrix)或基于底物(substrate)培養(yǎng)；也可用于不同組合的共培 養(yǎng)以及新分離的內(nèi)皮細胞。
下面進一 步地在實施例二中描述采用人結(jié)腸癌血管中分離出的激活的內(nèi) 皮細胞進行原代培養(yǎng)，來制備肺瘤疫苗的方法。
1、 在外科切除肺瘤手術(shù)期間取一塊結(jié)腸肺瘤組織，將其放入內(nèi)有含抗生 素的RPMI 1640培養(yǎng)基的無菌管中，送至實-驗室。
2、 在無菌條件下將肺瘤組織轉(zhuǎn)移至有蓋培養(yǎng)皿(Petri dish)中，用器械 去除壞死部分、血塊、殘留脂肪以及結(jié)締組織。3、 將腫瘤組織用剪刀剪成小片。
4、 將腫瘤組織的碎片在37。C下置于0.2。/。的膠原酶溶液中，所用溶液體積 足以覆蓋腫瘤片段。
5、 移去膠原酶溶液，用PBS溶液輕輕沖洗肺瘤組織碎片。
6、 加入3ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，用移液管強力吹打，使得肺瘤組織碎 片分解成小的細胞團塊。
7、 較大的團塊沉于底部，余下的細胞被轉(zhuǎn)移到一個新的試管中，并在室 溫下以170g離心。
8 、用RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞團重新懸浮。
9、 在室溫條件下，lml的細胞懸浮液在Percoll梯度下以670g離心20分鐘。
10、 收集Percoll梯度密度在1.033-1.047范圍內(nèi)(與內(nèi)皮細胞相符)的細 胞碎片，加入10ml的RPMI 1640,重新懸浮混合物，然后以170g離心5分鐘
后收集細胞。
11、 將內(nèi)皮細胞重新懸浮于生長培養(yǎng)基(RPMI 1640,肝磷脂，內(nèi)皮生長 因子，腫瘤細胞條件培養(yǎng)液，10%的胎牛血清)中，并在培養(yǎng)細胞并瓦中培養(yǎng)。
12、 從瓶中移除生長培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基一半體積的生理溶液或者PBS溶 液沖洗細胞三次。沖洗后應將來自生長培養(yǎng)基中的血清清除。
13、 將0.0001%的胰蛋白酶溶液(酶活性~ 3000U/mg )加入到細胞中， 加入量為每25cm2細胞瓶的面積lml溶液。
14、 37。C孵育細胞瓶。在孵育到5至7分鐘時，收集含有所釋放的表面抗 原的溶液。從細胞瓶中移除溶液期間，內(nèi)皮細胞應緊貼瓶底。如果一部分細胞 由于胰蛋白酶的作用脫離了細胞瓶壁而漂浮于液體中，則需對溶液以400g離 心5分鐘，取無細胞的上清備用。
15、 為滅活具有內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)細胞瓶中剩余的胰蛋白酶的活性，應加入 新的含有小牛血清的培養(yǎng)基，并繼續(xù)在37。C以及5% C02的條件下孵育。
16、 由步驟14獲得的溶液在45。C條件下進行利用真空濃縮機進行濃縮。 濃縮前應用適當方法對溶液脫鹽，如反相色譜法、凝膠過濾法等。
ii17、為了得到所需數(shù)量的抗原，經(jīng)過幾小時到幾天的時間間隔，重復步驟 12-16。在這期間，制備疫苗的質(zhì)量通過評定內(nèi)皮細胞與患者肺瘤血管抗原特 異性的適配性來控制。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述內(nèi)皮細胞，與同該內(nèi)皮細胞分離出的相同 腫瘤來源的腫瘤細胞共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，所述內(nèi)皮細胞，與其他患者來源的腫瘤細胞 共培養(yǎng)，或者與特定的肺瘤細胞系共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，所述內(nèi)皮細胞，與用以分離該內(nèi)皮細胞的肺 瘤片段共培養(yǎng)，或與其他病人的腫瘤片段共培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，所述激活的內(nèi)皮細胞來自其他病人(同種異 體內(nèi)皮細胞)。
根據(jù)本發(fā)明得到的培養(yǎng)內(nèi)皮細胞表面抗原， 一定對供體肺瘤內(nèi)皮細胞有特 異性。但是細胞培養(yǎng)改變了細胞表型，這是因為體外不可能創(chuàng)造與腫瘤細胞在 患者身體內(nèi)相同的生長條件。因此，應以強制手段控制用以疫苗接種的積聚抗 原的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的適配性，并根據(jù)上述歐洲專利"檢測細胞培養(yǎng)質(zhì)量的方法" 中所述方法進行。
為了確定根據(jù)本發(fā)明而得疫苗的抗肺瘤活性，利用小鼠進行模型試驗，選 擇三組年齡和體重相同的BALB/c小鼠(每組6只雄性)。
根據(jù)實施例一，采用自體的激活和非激活的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)，得到抗原。將 分離的抗原用葡聚糖凝膠(Sephadex) G-10進行凝膠過濾脫鹽，繼而用真空 濃縮器濃縮。
給小鼠皮下注射1百萬肝癌細胞H22。注射后第七天，預先將抗原與完全 弗氏佐劑以1 : 1 (體積比)的比例混合，取150嗎給小鼠以皮下注射的方式 進行疫苗接種。隨后每周一次用完全弗氏佐劑進行免疫接種，持續(xù)4周。第一 實驗組的動物用本發(fā)明實施例一制備的疫苗進行接種，也就是用自體的激活的 內(nèi)皮細胞。第二實驗組的動物用本發(fā)明實施例一制備的疫苗接種，但是所用為 自體的非激活內(nèi)皮細胞。對照組注射相同量的混合有完全弗氏佐劑的PBS。
在接種胂瘤后三個月，分別觀察對照組和試驗組的生長狀況。測量結(jié)果(見圖2)顯示，實驗組動物體內(nèi)的腫瘤縮小并消失，這證明含有內(nèi)皮細胞表面抗
原的疫苗有顯著的抗腫瘤效果，基于激活的內(nèi)皮細胞的表面抗原加工而成的疫 苗顯示出更明顯的效果。
為了證實疫苗的抗血管機制，通過對死亡的腫瘤血管壁的組織切片和免疫
酶法，來檢測對照組和試驗組的腫瘤血管生成指數(shù)(每1000個胂瘤細胞的血 管數(shù)量)。
在接種后的第30天，分離新鮮腫瘤組織碎片，用含10%曱醛的PBS (pH7.0-7.2)溶液固定，用石蠟包埋。制備成4pm厚的切片用于免疫組化^見 察。為顯示血管，切片用標準的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶試劑，用鼠 抗人CD31抗體染色。用乙醇去除石蠟。使用3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧 化物酶的活性。用含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS來阻止抗體的非特異性 結(jié)合。隨后將切片與CD31的一抗、生物素標記的小鼠IgG抗體和抗生物素蛋 白鏈霉素-生物素-過氧化物酶復合物共同孵育。切片用新制備的二氨基聯(lián)苯胺 染色，用蘇木素復染(poststain)。每步之后，用PBS沖洗切片。根據(jù)上述方 法對陰性對照組切片染色時，其中 一抗用小鼠IgG替代。
圖3示出了第一試^r組(A)、第二試-險組(B)和對照組(C)中的腫瘤 組織切片，這些試驗組相對應的血管生成指數(shù)(AI)分別為16、 32和80。這 一事實證實，用內(nèi)皮細胞表面抗原進行疫苗接種，具有抑制血管化作用的效果， 需要注意的是激活的內(nèi)皮細胞具有更強的抑制效果。
需要強調(diào)的是動物實驗的結(jié)果并不受到所使用的動物的限制，由于免疫反 應的機理在人和動物都是相同的。
抗原的使用方法和其每公斤體重的使用劑量，保證了其在人類免疫療法中 的作用，但是針對每一個病人，免疫治療方案(劑量，重復注射的次數(shù)和佐劑 的使用)可以根據(jù)每個特殊病人進行個性化，綜合考慮疾病的發(fā)展、腫瘤疾病 的階段、腫瘤的血管化程度、機體對伴行于化學療法的明顯的抗原免疫反應的 能力等。
以下說明如何得到基于內(nèi)皮細胞表面抗原的腫瘤疫苗，該疫苗是根據(jù)本發(fā) 明的實施例二而制備的，用于人的抗腫瘤疫苗接種。
13疫苗包含lmg抗原混合物(根據(jù)本發(fā)明實施例二而制備)溶于0.5ml的 PBS中，并與1ml的佐劑山小星蒜堿(Montanide) ISA-51 ( Syntex廠基于水 油乳濁液和角豊烯、PlunoricL121、吐溫-80而制成的佐劑)相混合。
給患者皮下注射一個劑量的疫苗，每周一次，持續(xù)三周以及每月一次，持 續(xù)五個月。
免疫接種的效果通過對注射的表面抗原的免疫的強度來評估。在注射2-3 天后，針對注射抗原的過敏性反應通過注射局部紅斑的尺寸來衡量。以首次注 射后局部出現(xiàn)的紅斑尺寸作為基數(shù)。經(jīng)過重復疫苗接種，過敏反應明顯強化， 證明免疫反應的發(fā)展。
可以采用靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射疫苗，也可注射不含佐劑的疫苗。
使用根據(jù)本發(fā)明提供的方法制備的疫苗后，免疫反應的發(fā)生是由于疫苗中 含有內(nèi)皮細胞表面抗原。疫苗中存在的許多抗原，即表面蛋白片段，可對所有 的、表面蛋白上有與之相同的氨基Sl/f列的細胞產(chǎn)生免疫反應。
根據(jù)本發(fā)明，用患者自身的激活的內(nèi)皮細胞和用其他患者的內(nèi)皮細胞制備 的腫瘤疫苗，均可具有效果。
上述兩種情況都可達到治療效果，這是因為來自不同患者的腫瘤血管的內(nèi) 皮細胞表面上，具有相同的氨基酸序列。而且，使用根據(jù)所述方法制備的自體 疫苗時，效果更為明顯，這是因為疫苗含有的抗原對特定患者的肺瘤血管內(nèi)皮 細胞具特定性。
使用來自正常組織的靜息的和通過各種方法激活的內(nèi)皮細胞，均可達到治 療效果。這是由于所有內(nèi)皮細胞均具有的相同的表面抗原，也是由于通過各種 方法激活的內(nèi)皮細胞的抗體組分變化具有部分相同的特性。
應當注意，根據(jù)本發(fā)明所述方法制得的疫苗，使用時與單價疫苗相比，治 療效果可提高許多倍。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法制備的疫苗，在使用中可以克服機體對腫瘤血管內(nèi) 皮細胞的免疫耐受性，這是由于疫苗富含對肺瘤血管內(nèi)皮細胞具有特異性的抗 原。
這種情況是因為用蛋白酶對細胞進行處理，蛋白酶處理細胞的這些細胞蛋白酶濃度是活性的(非致死的)?；钚缘牡鞍酌笣舛鹊氖褂?，能僅使內(nèi)皮細胞 表面抗原分離，而不會使細胞死亡。細胞死亡會伴隨質(zhì)膜損壞，從而導致疫苗 被細胞質(zhì)成分污染，特別是被大量胞內(nèi)蛋白污染，這些蛋白對疫苗接種來說是 無益的。這會減少已知的疫苗中的特異性肺瘤血管抗原的量，引發(fā)非靶向性免 疫反應，從而降低表面抗原的特異性。
由于使用富含表面抗原的疫苗，本發(fā)明所提供的疫苗可提高抗腫瘤治療的 效果。
此外，免疫療法效果的提高，也可通過積聚^目同內(nèi)皮細胞活的抗原制備 而成的表面抗原來實現(xiàn)。這種制備腫瘤疫苗的方法，可以通過每次使用蛋白酶 處理，獲得實際上成分不變的抗原，并且積聚抗原使得其量滿足免疫接種所需。 可以通過控制疫苗質(zhì)量，來保證僅對特定腫瘤血管有特異性的抗原混合入疫苗。
因此，本發(fā)明提供了獲得內(nèi)皮細胞表面抗原的方法，利用此抗原可以對腫 瘤疾病進行免疫接種治療。
1權(quán)利要求
1、一種腫瘤疫苗的制備方法，包括用蛋白酶在不使細胞死亡的溫和條件下處理活的內(nèi)皮細胞；收集釋放的細胞表面抗原；用蛋白酶重復處理所述活的內(nèi)皮細胞，間隔的時間足以使得表面抗原被所述內(nèi)皮細胞恢復；積聚釋放的抗原，直至達到所需的抗原數(shù)量；控制疫苗質(zhì)量。
2、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞為激活的內(nèi)皮細胞。
3、 如權(quán)利要1或2所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞為從腫瘤組織血管中新分離出來的內(nèi)皮細胞。
4、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞經(jīng)過培養(yǎng)使其增殖。
5、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
6、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細胞是從腫瘤血管中分離的，并在保持所述內(nèi)皮細胞激活狀態(tài)的條件下培養(yǎng)。
7、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 6中任意一項所述的制備方法，其中，培養(yǎng)過程中所述內(nèi)皮細胞的激活狀態(tài)是通過與肺瘤細胞共同培養(yǎng)而維持的。
8、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 6中任意一項所述的制備方法，其中，培養(yǎng)過程中所述內(nèi)皮細胞的激活狀態(tài)是通過與腫瘤組織片段共同培養(yǎng)而維持的。
9、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細胞為取自病人自身腫瘤血管的內(nèi)皮細胞。
10、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，激活的所述內(nèi)皮細胞為取自其他病人肺瘤血管的內(nèi)皮細胞。
11、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)是通過體外與腫瘤細胞共同培養(yǎng)而激活的。
12、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞是被患者自身的腫瘤細胞激活的。
13、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞是^L其他患者的腫瘤細胞激活的。
14、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 11中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞是被肺瘤細胞系激活的。
15、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)是通過體外在生長培養(yǎng)基中加入激活物質(zhì)而激活的。
16、 如斥又利要求l、 2、 4、 15中^f壬意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞被至少 一種激活因子激活。
17、 如權(quán)利要求l、 2、 4、 16中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞是一皮血管內(nèi)皮生長因子激活的。
18、 如權(quán)利要求l、 2、 4中任意一項所述的制備方法，其中，所述內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)是通過體外加入來自腫瘤細胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液而激活的。
19、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述表面抗原中加入佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用內(nèi)皮細胞制備腫瘤疫苗的方法，該方法包括在不使細胞死亡的溫和條件下，用蛋白酶處理活的內(nèi)皮細胞；收集分離出的表面抗原；再次用蛋白酶重復處理活的內(nèi)皮細胞，間隔的時間長度足以使得內(nèi)皮細胞表面抗原恢復；收集釋放出的抗原，直至達到所需數(shù)量；控制疫苗質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)效果在于，由于克服了對腫瘤血管內(nèi)皮細胞的機體免疫耐受性，從而破壞了腫瘤血管，提高了腫瘤疾病的治療效果。也就是說克服免疫耐受性就是針對激活的內(nèi)皮細胞，從而使得免疫系統(tǒng)的破壞作用主要針對腫瘤血管。
文檔編號A61K38/00GK101663042SQ200780052639
公開日2010年3月3日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫 申請人:彼得·詹里耶維奇·盧克霍夫