專利名稱：衍生自干細胞的微泡(MVs)用于制備用于受損或損傷組織或器官的內(nèi)皮/上皮再生的藥物 ...的制作方法
衍生自干細胞.的微詢.(mvs)用干制備用干■損或損傷組tq 或官的內(nèi)Jt / iiJtS生的藥物的用徐、以及相關(guān)體夕卜禾口
體內(nèi)方法本發(fā)明一般包括在組織再生領(lǐng)域中，并且特別地它涉及內(nèi)皮和上皮再生。在復(fù)雜器官中，內(nèi)皮和上皮區(qū)室之間的串?dāng)_(cross-talk)在分化、功能和修復(fù)中 相關(guān)。在損傷后，形態(tài)修復(fù)和功能恢復(fù)依賴于內(nèi)皮和上皮細胞二者的再生，進而恢復(fù)細胞間 相互作用。內(nèi)皮細胞源于外胚層胚層，并且代表血液和血管壁之間的第一個界面。它們代表 的整體體重，具有關(guān)于動脈約28m2的表面和在毛細管中具有280m2的表面。已知血管內(nèi)
皮具有廣泛范圍的生物活性，例如介質(zhì)分泌、物理應(yīng)激測知、血管調(diào)節(jié)(vasoregulation)、 炎性細胞粘附和外滲的神經(jīng)元_體液控制和調(diào)節(jié)。上皮細胞源于內(nèi)胚層胚層，并大量存在于大多數(shù)器官，其中它們獲得特定功能。在 腎中，上皮細胞已經(jīng)分化成特定結(jié)構(gòu)(具有再吸收和分泌原尿的特化功能的近和遠端腎小 管細胞以及具有調(diào)節(jié)選擇滲透性的特化功能的腎小球上皮細胞)。在肝中，上皮細胞主要 構(gòu)成肝小葉的解剖功能單位。這種結(jié)構(gòu)特化產(chǎn)生膽紅素和膽汁鹽，這尤其是特定新合成產(chǎn) 物。在胰腺中，幾種類型的上皮細胞特化分泌和處理不同激素(即用于胰島素分泌的3細 胞)。上皮和內(nèi)皮細胞是關(guān)于幾種損傷機制的靶，所述損傷機制可以導(dǎo)致急性或慢性器 官功能障礙。在器官水平上的修復(fù)過程依賴于內(nèi)皮和上皮細胞在損傷位點處去分化、增殖 且最后遷移以及最終再分化的能力，從而確保完全的形態(tài)和功能恢復(fù)。例如，在急性腎小管 壞死后，這是缺血或中毒事件后的臨床相關(guān)事件，修復(fù)事件需要增殖和最后分化成2種細 胞類型的成熟細胞(1，2)。在腎小球疾病中，從損傷的恢復(fù)與腎小球結(jié)構(gòu)的血管重塑基本上 相關(guān)。更詳細地，已顯示在腎小球疾病的再生期過程中發(fā)生的新血管發(fā)生還影響足狀突細 胞的功能恢復(fù)，所述足狀突細胞是調(diào)節(jié)腎小球選擇滲透性的高度分化的上皮細胞(3)。在急 性血管損傷的許多模型中，內(nèi)皮細胞的再生對組織和切割功能恢復(fù)有幫助，這也與器官的 上皮功能組分修復(fù)相關(guān)。骨髓衍生的間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞(EPCs)通過粘附分子信 號優(yōu)先召募至血管缺血位點(4，5)。迄今為止，治療內(nèi)皮/上皮損害或損傷的現(xiàn)有方法已基于下述的使用1)作用于2 種細胞類型中的兩者或之一的生長因子；2)使用間充質(zhì)干細胞或EPC的細胞治療。然而， 現(xiàn)有方法具有許多缺點。生長因子的使用具有高生產(chǎn)成本和需要獲得不同生長因子合適組合的生物效應(yīng) 的缺點。干細胞治療的使用具有給出關(guān)于所施用細胞的控制喪失的固有危險，在它們已植 入接受者中后，具有潛在的致瘤危險或不適當(dāng)分化。例如，已在腎小球腎炎的實驗?zāi)Ｐ椭袌?告在損傷腎小球內(nèi)的脂肪形成分化(6)。本發(fā)明人目前已發(fā)現(xiàn)衍生自干細胞的微泡(MVs)代表超過現(xiàn)有方法用于治療內(nèi) 皮/上皮損害或損傷的有利替代方法，因為它們的使用不具有上述缺點。此外，衍生自干細 胞的微泡具有再生內(nèi)皮和上皮組織損害或損傷的能力的事實是完全未預(yù)料到的。事實上，在現(xiàn)有技術(shù)(7)中已知衍生自內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的微泡能夠促進來自內(nèi)皮細胞的血管發(fā) 生和毛細血管樣結(jié)構(gòu)形成。例如從W02005121369還已知來自供體細胞的微泡或合成微泡 能夠用于修飾與微泡接觸的細胞。一般地，修飾至少部分通過微泡的RNA實現(xiàn)，但它也可以 通過微泡的脂質(zhì)組分、微泡的膜相關(guān)肽或微泡的細胞溶質(zhì)肽實現(xiàn)。然而，從未公開或暗示衍生自許多類型干細胞包括EPCs的微泡促進內(nèi)皮和上皮 組織再生的組合能力。由于其再生能力，在本發(fā)明中使用的干細胞衍生的MVs可以用于組織修復(fù)，特別 是用于在組織損害或損傷后的內(nèi)皮/上皮再生。在本發(fā)明內(nèi)采用的MVs可以用于體外和體 內(nèi)應(yīng)用。關(guān)于體內(nèi)應(yīng)用，干細胞衍生的MVs已顯示共享許多共同生物效應(yīng)，這使得它們特 別適合于在人應(yīng)用中用作藥物用于腎和肝修復(fù)，特別是用于治療急性腎衰竭(ARF)和急性 肝衰竭(AHF)。事實上，在本發(fā)明中采用的MVs已顯示在從急性腎小管損傷的恢復(fù)，從急性 腎小球腎炎的恢復(fù)，以及在促進腎小球毛細血管再生和肝細胞增殖中有效，從而在ARF和 AHF治療中具有極大利益。腎在急性損傷發(fā)作后恢復(fù)的能力對在醫(yī)院背景下的患者發(fā)病率和死亡率具有關(guān) 鍵影響(8，9)。當(dāng)例如在膿毒癥中暴露于內(nèi)源細胞因子，暴露于內(nèi)源或外源毒素例如肌紅蛋 白或氨基糖苷和放射造影劑、或腎缺血發(fā)作時，腎小管細胞對損傷特別敏感(10)。從急性腎 損傷恢復(fù)依賴于腎小管再生且再次獲得正常功能的能力(2)?；颊吣挲g和損傷嚴重度可能 制約恢復(fù)。在腎損傷的嚴重或反復(fù)發(fā)作后，恢復(fù)可以受損或甚至失敗，導(dǎo)致關(guān)于長期透析的 需求和患者死亡率的增加(11)。腎小管上皮細胞的壞死和喪失是急性腎衰竭(ARF)中的最 常見事件，并且在急性腎衰竭后腎功能的恢復(fù)依賴于壞死腎小管細胞由功能腎小管上皮的 替換(2)。上皮和內(nèi)皮再生的缺乏或減少可能誘發(fā)管-間質(zhì)瘢痕形成和慢性腎疾病。關(guān)于 對于腎損傷的生理學(xué)應(yīng)答的研究表明在創(chuàng)傷已發(fā)生后，腎小管細胞去分化并且獲得間充質(zhì) 表型。去分化細胞隨后遷移到其中腎小管細胞經(jīng)歷壞死、凋亡或脫離伴隨腎小管基底膜剝 落的區(qū)域。這個過程隨后為細胞增殖并且最終為其后續(xù)分化成具有組織完整性恢復(fù)的功能 上皮細胞(2)。還已暗示腎的間質(zhì)包含能夠促成腎修復(fù)的成人腎干細胞(12)。腎小球損傷 通常隨后為發(fā)展為硬化病變，因為腎小球細胞具有就腎小管而言的有限再生。毛細血管喪 失是發(fā)展為晚期腎衰竭的幾種不同腎小球疾病中的常見事件(13)。因此，本發(fā)明的一個方面是干細胞衍生的微泡用于制備用于內(nèi)皮/上皮再生的藥 物的用途。在一個優(yōu)選實施方案中，藥物針對腎損傷例如急性腎衰竭(ARE)的治療。在另一個優(yōu)選實施方案中，藥物針對肝損傷例如急性肝衰竭(AHF)的治療?？紤]到干細胞衍生的微泡(MV)抑制凋亡且促進細胞增殖的能力，這些MVs也特別 適合于用于抑制由細胞生長抑制劑誘導(dǎo)的凋亡，從而減少癌癥化學(xué)治療的副作用。因此，本發(fā)明的另一個方面是干細胞衍生的微泡用于制備用于抑制由細胞生長抑 制劑誘導(dǎo)的凋亡的藥物的用途。細胞生長抑制劑是例如紫杉醇、來那度胺(Lenalidomide)、Pomalidomide、表 柔比星、5FU、舒尼替尼(Sunitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、卡紐替尼(Canertinib)、環(huán) 磷酰胺、羥基紅比霉素、來那度胺/地塞米松、Pomalidomide/地塞米松、卡鉬、米托蒽醌(mitoxantron)、奧沙利鉬、多西他賽、長春烯堿(vinorelbin)。本發(fā)明的藥物適當(dāng)?shù)赝ㄟ^靜脈內(nèi)輸注進行施用，并且它可以以適合于施用包括在 約30至120 u g/kg接受者體重之間的微泡量的劑型制備。接受者是能夠?qū)崿F(xiàn)內(nèi)皮/上皮 再生需要治療的任何患者，例如受ARF或AHF影響的人。如本文所使用的，表達“衍生自干細胞的微泡(MV) ”指至少部分衍生自干細胞的膜 顆粒。依次，術(shù)語“干細胞”包括任何未分化或部分未分化的細胞，其能夠增殖(自我更新) 和分化(可塑)，從而替換已達到其生命周期終點的特化細胞譜系的成熟細胞。如在本說明 書中使用的，術(shù)語“干細胞”包括具有無限自我更新能力和多能可塑性的干細胞，以及具有 多潛能或單向可塑性和在某些情況下有限自我更新能力的祖細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在本發(fā)明中使用的干細胞衍生的MVs衍生自選 自內(nèi)皮祖細胞(EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、腎祖細胞CD133+、成人肝干細胞(HLSC)的干 細胞。在本發(fā)明中使用的衍生自干細胞的微泡一般是球形形狀的，并且具有在lOOnm至 5 u m、更一般地0. 2至1 y m范圍內(nèi)的直徑。如果顆粒形狀不是球形的，那么上述值指顆粒 的最大尺度。本發(fā)明中使用的微泡得自其的干細胞可以如在說明書的實驗部分中所述的進行 分離。微泡(MVs)隨后可以如在說明書的實驗部分中公開的通過超速離心得自經(jīng)分離的干 細胞的上清液。經(jīng)分離的MVs隨后可以通過在極低溫度一般在-80°C下，在具有一種或更多種冷 凍保護劑的懸浮液中冷凍貯存直至使用。合適的冷凍保護物質(zhì)是例如二甲亞砜(DMS0)和 甘油。DMS0以細胞懸浮液體積濃度的使用確保細胞的良好保存和對再輸注患者的有限 毒性效應(yīng)。可以引用的其他物質(zhì)是細胞外冷凍保護劑，即在細胞表面上作用的高分子量物 質(zhì)，形成減少細胞內(nèi)脫水的緊密屏障?？梢砸昧u乙基淀粉作為例子。經(jīng)分離的MVs隨后 可以用于制備藥物。本發(fā)明人在體外和體內(nèi)對經(jīng)分離的干細胞衍生的MVs進行測試。在體內(nèi)執(zhí)行的實 驗包括鼠類中毒ARF模型和通過靜脈內(nèi)注射抗Thy-1抗體誘導(dǎo)的大鼠腎小球腎炎的實驗?zāi)Ｐ汀Ｏ率鰧嶒灢糠痔峁﹥H用于舉例說明。材料與方法細胞制備內(nèi)皮祖細胞(EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)和CD133腎祖細胞的分離和表征EPC通過密度離心從來自健康供體的外周血單核細胞分離，并且在纖連蛋 白包被(coated)的培養(yǎng)瓶上在內(nèi)皮細胞基本培養(yǎng)基-2(Clonetics，Biowhittaker， ffalkersville, MD)中鋪平板，所述培養(yǎng)基補充有5% FBS、VEGF、FGF-2、EGF和胰島素樣生 長因子-1。如先前所述，通過FACS、蛋白質(zhì)印跡、基因微陣列分析和在Matrigel包被平板 上的血管生成性質(zhì)的功能評估來研究內(nèi)皮特性(5)。如先前所述分離且培養(yǎng)人間充質(zhì)干 細胞(hMSCs) (4)。如先前所述獲得來自8周大小鼠股骨和脛骨的鼠類MSCs (mMSCs) (14)。 細胞以 20-40xl06 細胞/9. 5cm2 的密度在 a -MEM(Invitrogen, Paisley, Scotland)中鋪 平板，所述a-MEM補充有10% FCS、10%馬血清(兩者都來自Euroclone，ffetherby, UK)、2mM L-谷氨酰胺、lOOii g/ml鏈霉素和100IU/mL青霉素(全部來自Sigma, St Louis, MO, USA)。在72小時后去除非貼壁細胞群體，并且用新鮮培養(yǎng)基將貼壁層洗滌1次。細胞具 有典型的紡錘形外觀，并且通過間充質(zhì)干細胞標(biāo)記的表達和分化成骨細胞和脂肪細胞的能 力證實MSC表型，如所述的(14)。腎祖細胞得自從手術(shù)摘除腎獲得的皮質(zhì)正常部分。在解 剖和經(jīng)由分級系列的網(wǎng)孔后，使用MACS系統(tǒng)(MiltenyiBiotec, Auburn, California)，通 過磁性細胞分選從腎小管部分中分離CD133+細胞。在60% DMEM LG(Invitrogen、Paisly、 United Kingdom), 40% MCDB-201，伴隨lx胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、lx亞油酸2-磷酸鹽、 1(T9M地塞米松、10_4抗壞血酸2-磷酸鹽、100U青霉素、1，000U鏈霉素、10ng/ml EGF和10ng/ ml PDGF-BB(全部來自 Sigma-Aldrich，St. Louis, Missoury)以及 2 % FCS(EuroClone, ffetherby, United Kingdom)的存在下，CD133+細胞在纖連蛋白上鋪平板(12)。所選擇的 細胞缺乏造血標(biāo)記的表達，并且表達PAX-2——胚胎腎標(biāo)記，暗示其腎起源。腎組織衍生 的CD133+細胞和個別細胞的克隆能夠在體外擴增以及有限自我更新和分化成上皮或內(nèi) 皮細胞。在FGF-4(10ng/ml)和HGF(20ng/ml) (Sigma)的存在下獲得體外上皮分化。在 Endothelial Cell AttachmentFactor (Sigma)上在具有 VEGF(lOng/ml) (Sigma)和 10 % FCS 的 EBM 培養(yǎng)基(Cambrex Bio Science, Baltimore, Maryland)中培養(yǎng)細胞獲得內(nèi)皮分 化(12)。在SCID小鼠中的皮下植入后，未分化細胞形成表達腎上皮標(biāo)記的腎小管結(jié)構(gòu)。MYs從干細胞中的分離和表征MVs得自在剝奪FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的不同祖細胞培養(yǎng)物的上清液(7)。在2，000g 下離心20分鐘去除碎片后，將無細胞上清液在100，000g(Beckman Coulter Optima L-90K 超離心機)下在4°C下離心1小時，在無血清培養(yǎng)基中洗滌，并且提交在相同條件下的二次 超速離心。根據(jù)制造商的說明書(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)通過鱟 (Limulus)試驗排除內(nèi)毒素污染。所獲得的MVs如下進行分析FACS分析MVs的大小通過FACS (Becton Dickinson)進行測定。不同大小(1、2、 3、4、6、10和15 ii m,Molecular Probes, Invitrogen)的珠用作大小標(biāo)記，并且使用用于FSC 和SSC參數(shù)的對數(shù)尺度執(zhí)行分析。掃描和透射電子顯微鏡檢杳MVs在Karnowski固定劑中加以固定，在乙醇中脫 水，在玻璃表面上干燥，并且通過噴射包被用金進行包被。樣品在掃描Jeol T300電子顯微 鏡中進行檢查。經(jīng)由次級電子在15-25mm的工作距離和20_25kV的加速電壓下獲得圖像。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作對Karnovsky’ s固定、四氧化鋨后固定和在環(huán)氧樹脂中包埋的組織執(zhí)行透射 電子顯微鏡檢查。超薄切片用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛進行染色，并且用JEM 1010電子顯微鏡 進行檢查?；蜿嚵蟹治鲇糜谘芯康蛲龅娜薌Earray試劑盒(GEArray Q seriesHuman Apoptosis, SuperArray Inc.，Bethesda, MD)用于表征在用MVs處理的腎小管細胞中的 基因表達。從不同實驗匯集的RNA用作模板用于生物素化探針合成。使用堿性磷酸酶底 物OTP-Star通過化學(xué)發(fā)光信號檢測基因表達，并且根據(jù)制造商的指導(dǎo)直接獲得。使用 Quantity one程序(Life Science)執(zhí)行密度計分析，并且用GEArray分析儀程序分析來分 析原始數(shù)據(jù)。體內(nèi)模型鼠類中毒ARF模型
通過肌內(nèi)注射7. 5ml/kg 體重的 50%甘油溶液(Sigma，St. Louis, M0)在 C57B1/6 小鼠中誘導(dǎo)急性中毒腎小管損傷，如先前所述(14)。通過測定血清肌酸酐和尿素水平 (Beckman Instruments Inc. , Fuller ton, CA)來評估腎功能。腎小管損傷的峰值在甘油注 射后3天發(fā)生(14)。在距離ARF誘導(dǎo)3、6、10和15天后處死小鼠，以便評估最大損傷和腎 小管再生時期。腎進行福爾馬林固定和石蠟包埋用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。Thy-1腎小球腎炎的實驗樽型通過在第0天時將250 u g/100g重量的抗Thyl-1抗體(Ab)靜脈內(nèi)施用到6周大 雌性Lewis大鼠的股靜脈內(nèi)誘導(dǎo)腎小球腎炎(GN)。對照動物接受相同體積的鹽水注射代替 抗Thyl. 1 Ab。在第2天時，當(dāng)已可檢測出蛋白尿時，將30 yg EPC衍生的MVs注射到對側(cè) 股靜脈中。對照動物接受相同量的僅媒介物(經(jīng)修飾的M199培養(yǎng)基Ifepes加上1 % DMS0) 的注射。每天評估蛋白尿、血清和尿肌酸酐/尿素(24小時尿液采集)。小鼠在下述天數(shù) D4、D7、D14時處死。每個實驗組包括9只大鼠。體外實騎人腎小管細胞分離和培養(yǎng)人TEC(PTEC)的原代培養(yǎng)物得自通過手術(shù)操作從受腎癌影響的患者中摘除的腎 (15)。通過用雜交AdenO5/SV40病毒感染產(chǎn)生的PTEC永生化細胞系用于證實且擴展用原 代腎小管細胞執(zhí)行的實驗。細胞用包含10% FCS(Hyclone, Logan, Utah)和2mM谷氨酰胺 (GIBC0)的 RPMI 1640 (GIBC0, Grand Island, NY)生長。細胞增殖測定細胞以8000細胞/孔種植到96孔板內(nèi)在包含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基中，并且使 得貼壁。使用ELISA試劑盒(Roche Applied Science)，作為摻入細胞DNA內(nèi)的5_溴_2_脫 氧尿苷(BrdU)檢測DNA合成。簡言之，將10yM BrdU加入細胞，在含或不含10 % FCS的 DMEM中溫育18小時。細胞隨后用0. 5M乙醇/HC1固定，并且與核酸酶一起溫育以消化DNA。 使用抗BrdU過氧化物酶綴合的mAb檢測摻入DNA內(nèi)的BrdU，并且用可溶性生色底物顯現(xiàn)。 光密度用ELISA閱讀器在405nm下進行測量。凋亡測定使用TUNEL測定分析(ApopTag Oncor, Gaithersburg, MD)評估凋亡。在不同促 凋亡刺激后，使細胞懸浮于PBS中，在溶于PBS pH 7.4中的低聚甲醛中于4°C固定15 分鐘，在PBS中洗滌2次，隨后在預(yù)冷卻的乙醇-乙酸2 1中于-20°C后固定5分鐘。樣 品用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)進行處理。細胞隨后用具有熒光素的加溫抗地高辛配基 綴合物進行處理，并且在室溫下溫育30分鐘。在包含1 y g/ml碘化丙啶的培養(yǎng)基中固定樣 品，并且通過免疫熒光分析細胞。結(jié)果表示為與紅色熒光發(fā)出細胞(總細胞)比較的綠色 熒光發(fā)出細胞(凋亡細胞)百分比。半胱天冬酶3-8-9活性的檢測基于在從由半胱天冬酶識別的標(biāo)記底物DEVD-pNA切割后生色團對硝基苯胺鹽 (pNA)的分光光度計測量檢測，通過ELISA (Chemicon, Temecula, CA)評估半胱天冬酶3_8_9 的活性。用合適反應(yīng)緩沖液稀釋腎小管裂解物，并且以50M的終濃度加入DEVD-pNA。樣品 隨后在自動化ELISA閱讀器中在405nm波長下進行分析。每次實驗一式三份地執(zhí)行。FACS 分析
對于FACS分析，用EDTA使細胞從組織培養(yǎng)板脫離，用lx PBS洗滌2次，并且在 4°C下用針對不同分子的一抗或無關(guān)對照抗體染色1小時。細胞與Alexa Fluor綴合的二抗 于4°C溫育45分鐘。細胞在低聚甲醛中固定，并且實施FACS分析(Becton Dickinson, Mountain View, CA)。蛋白質(zhì)印跡分析對于蛋白質(zhì)印跡分析，用EDTA使細胞脫離，并且用包含1 % Triton-X-100、10 u M/ ml亮抑酶肽、10 uM苯甲基磺酰氯(PMSF)和100U/ml抑肽酶的50mM Tris-HCl裂解緩沖液 進行裂解。在腎小管裂解物在15000xg下離心后，通過Bradford法測量上清液的蛋白質(zhì)含 量對30 yg蛋白質(zhì)/泳道實施十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)， 并且電印跡到硝酸纖維素膜濾紙(filter)上。印跡隨后用5%脫脂乳在20mM Tris-HCl (pH 7. 5)，500mM NaCl 加上 0. 1 % Tween 中封閉。膜在 4°C 下與以 500ng/ml 濃度針對 Akt、P_Akt、 Bcl-xL (全部來自 Santa Cruz Biotechnology)或Pax_2 的抗體溫育過夜。在用 0. 1 % Tween 充分洗滌后，印跡用HRP綴合的蛋白質(zhì)A(200ng/ml，Amersham, Buckingamshire, UK)RT染 色1小時，再次用0. 1 % Tween洗滌，用ECL檢測試劑(Amersham)顯色，并且暴光于X-Omat 膠片(Eastman Kodak, Rochester, NY)。經(jīng)上皮電阻(TER)的評估經(jīng)上皮電阻(TER)用作上皮極性指示。細胞在膠原包被的聚碳酸酯膜(Corning Costar Corp.，Cambridge, MA)上在transwells中鋪平板，并且允許在加入不同刺激前達 到匯合。上皮伏特-歐姆儀(EV0M ；WorldPrecision Instruments, Inc. , Sarasota, FL)用 于測定TER值，如先前所述(12)。所有測量一式三份地執(zhí)行，并且對于膜面積進行標(biāo)準(zhǔn)化。FITC綴合的白蛋白攝取的檢測在腎小管細胞與50mg/ml FITC綴合的人白蛋白在37°C下溫育2小時后研究蛋白 質(zhì)攝取。在FITC-白蛋白攻擊后，細胞用冰冷的PBS充分洗滌3次，并且通過FACS進行分 析。遷移和形態(tài)發(fā)生測定遷移作為腎小管細胞在其下遷移到在匯合單層中產(chǎn)生的傷口內(nèi)的速度進行評估， 以便模擬物理應(yīng)激條件。在Nikon倒置顯微鏡下在密封封閉溫箱中在37°C下觀察細胞運 動性。使用 Micro-Image 分析系統(tǒng)(CastiImaging srl, Venezia, Italy)，在以 30 分鐘間 隔數(shù)字保存不同圖像后分析遷移。通過標(biāo)記超過30個細胞的核位置/視野評估細胞遷移。 速度平均值計算為在觀察起點和終點之間的直線距離除以觀察時間的比。在所選擇的實驗 中和對于形態(tài)發(fā)生測定，將分散的腎小管細胞種植到先前用20y g/ml纖連蛋白、IV型膠原 或Matrigel包被的板上。PTEC在SCID小鼠中的皮下Matrigel植入執(zhí)行PTEC在Matrigel塞中的皮下植入，以評估干細胞衍生的MVs在體內(nèi)的腎小 管產(chǎn)生(tubulogenic)效應(yīng)。簡言之，除去生長因子的Matrigel (Becton Dickinson)維持 在_20°C下直至使用，并且僅在植入前即刻在4°C下過夜解凍。使5000細胞重懸浮于不含 FCS的250 yl新鮮培養(yǎng)基中，并且在不同刺激的存在下，使用冷卻吸管端固定至在冰上的 500 ill Matrigel。將所有樣品s. c.植入SCID小鼠的后肢內(nèi)。1周后，處死小鼠，并且回收 Matrigel塞用于檢查。
內(nèi)皮-腎小管夾心共培養(yǎng)為了檢查與不同刺激溫育的HMEC對腎小管活力的作用，應(yīng)用共培養(yǎng)模型。HMEC在 24孔板上在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下鋪平板24小時。隨后在10 u g/ml EPC衍生MVs的存在或不存 在下，對HMEC實施血清剝奪24或48小時。在上述條件下溫育后，抽取培養(yǎng)基，通過lx PBS 充分洗滌貼壁細胞，并且用RPMI 1 1稀釋的200ul生長因子減少Matrigel ;(BD)用作覆 蓋，并且允許在37°C下30分鐘膠化。其后，向每個孔中加入lxlO4腎小管細胞，以完成夾心 共培養(yǎng)。共培養(yǎng)在血清剝奪的條件下溫育另外24至48小時。在溫育結(jié)束時，對腎小管細 胞實施基于XTT的測定(Sigma)數(shù)據(jù)作為3次不同實驗的平均值士SD給出。免疫熒光和免疫細胞化學(xué)使用下述抗體執(zhí)行細胞熒光分析，抗體全部是FITC或PE綴合的抗⑶133-1 單克隆 Ab(mAb) (Miltenyi Biotec)、抗 CD44 和抗人 HLAI 類 mAbs (Sigma)、抗 CD31 和抗 CD105mAbs(Serotec Inc,Oxford,United Kingdom)、抗KDR mAb(R&D System、Minneapolis, Minnesota) ； Muc-18mAb (Chemicon International, Temecula, California) > CD29> 抗-CD33、抗-CD34、抗-CD45、抗-CD73、抗-CD90、抗-CD 117mAbs(Becton Dickinson, San Jose, California)。抗 VE 丐粘蛋白 mAb 由 Guido Tarone (University of Torino) 友情提供。FITC或PE小鼠未免疫同種型IgG(Dako，Copenhagen, Denmark)用作對照。對 在腔室玻片上培養(yǎng)的細胞執(zhí)行間接免疫熒光，在包含2%蔗糖的4%低聚甲醛中固定，并 且需要時用H印es-Triton-X lOOBuffer進行滲透化處理。還對在液氮中速凍的人或小 鼠組織執(zhí)行免疫熒光，以3-ym切片切割，并且在包含2%蔗糖的3. 5%低聚甲醛中固定。 使用下述抗體抗Na-Cl共轉(zhuǎn)運蛋白、抗氨肽酶A和抗堿性磷酸酶多克隆山羊AbS(Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, California)、兔抗緊密連接蛋白(Z0)_1 多克隆 Ab (Santa Cruz Biotechnology)、山羊抗 VWF 禾口兔抗 Pan-Cytokeratin Abs (Sigma)、抗波 形蛋白和抗E鈣粘蛋白mAbs(Dako)、抗EMA mAb (Chemicon International)、多克隆兔抗 PAX2Ab (Covance, Princeton, New Jersey) PE-綴合的抗 CD133 (Miltenyi Biotec)和抗增 殖細胞核抗原(PCNA)、FITC綴合的抗HLA I和抗鈣粘蛋白D-28K mAbs (Sigma) 0對照小鼠、 兔或山羊未免疫免疫球蛋白用作對照。需要時，F(xiàn)ITC綴合的抗小鼠、兔或山羊IgG(Sigma) 用作二抗。如所述的(7)對在10%緩沖福爾馬林中固定且在石蠟中包埋的組織執(zhí)行免疫細 胞化學(xué)。使用Leika TCS SP2型號共焦顯微鏡(Heidelberg，Germany)執(zhí)行共焦顯微鏡檢 查。加入Hoechst 33258染料(Sigma)用于核染色。統(tǒng)計分析不同實驗操作的所有數(shù)據(jù)表示為平均值士 SD。適當(dāng)時，通過AN0VA用紐科二氏 (Newmann-Keuls)多重比較檢驗執(zhí)行統(tǒng)計分析。MMMVs的特征用1、2、4和6iim珠作為關(guān)于衍生自人EPC、MSC和⑶133腎祖細胞MVs的大小內(nèi) 部標(biāo)準(zhǔn)的FACS分析用于測定其大小，并且證實衍生自不同干細胞/祖細胞群體的MVs具有 相似大小。觀察到的大多數(shù)MVs低于與1 y m珠對應(yīng)的FSC信號(

圖1A)。掃描和透射電子 顯微鏡檢查顯示MVs的球形形態(tài)，并且證實其大小在0.2-1 ym之間(圖1B)。經(jīng)由次級電 子在15-25mm的工作距離和20_30kV的加速電壓下獲得圖像。通過FACS分析，MVs顯示已
9知由相應(yīng)干細胞/祖細胞質(zhì)膜表達的粘附分子的表達(圖1C)。EPC、MSC衍生的MVs和駐 留腎⑶133+祖細胞共享⑶44、⑶29的表達，但對于ICAM-1、a 4整聯(lián)蛋白和a 5整聯(lián)蛋白 的表達不同。這些結(jié)果指出MVs在其表面上表達它們源于其的細胞質(zhì)膜的幾個決定簇。先 前已顯示粘附分子的表達在MVs摻入靶細胞中是有幫助的。MVs對腎細胞的體外牛物效應(yīng)腎小管損傷是缺血或中毒起源的急性腎衰竭(ARF)的標(biāo)志。此外，已顯示小管周 毛細血管的內(nèi)皮細胞損害促成在缺血后的腎損害延伸(16)。因此我們研究從干細胞中釋放 的MVs對近端腎小管上皮細胞系(PTEC)的作用。衍牛自鼠類間充質(zhì)干細胞』(mMSCs)的MVs抑制由順鉑i秀導(dǎo)的PTEC凋亡發(fā)現(xiàn)就與僅媒介物一起溫育的對照而言，PTEC與增加劑量的衍生自鼠類間充質(zhì) 干細胞(mMSCs)的MVs—起溫育顯著減少由順鉬誘導(dǎo)的凋亡。MVs與RNA酶一起溫育取消 (abrogate)對凋亡的抗性。所獲得的結(jié)果顯示于圖2中。通過TUNEL測定作為與0. 5 y g/ ml順鉬24小時溫育后的凋亡細胞百分比(黑色柱)評估凋亡。PTEC與僅媒介物或各種 劑量的MVs—起溫育。陰影柱顯示未用順鉬處理的對照。結(jié)果表示為3次實驗的平均值 士 1SD。執(zhí)行用Durmet’ s多重比較檢驗的方差分析*MVs與僅媒介物比較？ < 0. 05。誦過用MVs處理的PTECs的PCNA(增葙細胞j亥杭原)表汰指示細胞J曾葙的i秀導(dǎo)衍生自mMSC的MVs誘導(dǎo)經(jīng)由PTECs的PCNA表達。5xl04細胞/孔腎小管細胞在 DMEM+5% BSA中與10 u g/ml MVs或僅媒介物一起溫育24小時，并且通過共焦顯微鏡檢查 評估PCNA的表達。所獲得的結(jié)果顯示關(guān)于在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PTEC中PCNA核染色 的不存在，和在與衍生自mMSC的MVs溫育后通過PTEC的PCNA核表達。執(zhí)行3次實驗，結(jié) 果相似。衍生自人成人腎祖細胞CD133+的MVs能夠抑制由順鉑誘導(dǎo)的PTECs凋亡并且支 持腎小管上皮細胞增殖就與僅媒介物一起溫育的對照而言，PTEC與衍生自成人腎祖細胞⑶133+的不同 劑量(1、5和lOyg/mDMVs —起溫育顯著抑制由順鉬誘導(dǎo)的凋亡(圖3)。通過TUNEL測 定作為與0. 5 u g/ml順鉬24小時溫育后的凋亡細胞百分比(黑色柱)評估凋亡。PTEC與 僅媒介物或各種劑量的MVs—起溫育。陰影柱顯示未用順鉬處理的對照。結(jié)果表示為3次 實驗的平均值士 1SD。執(zhí)行用Durmet's多重比較檢驗的方差分析*MVs與僅媒介物比較p < 0. 05。衍生自人腎祖細胞⑶1331的MVs能夠誘導(dǎo)PTECs的細胞增殖就對照而言，PTEC與衍生自人腎祖細胞⑶133+的2個不同劑量MVs (15和30 u g/ ml) 一起溫育48小時顯著促進腎小管上皮細胞的細胞增殖。8000細胞/孔與10 y M BrdU 一起加入96孔板內(nèi)，在DMEM中與僅媒介物或不同劑量的MVs —起溫育。細胞隨后用0. 5M 乙醇/HC1固定，并且與核酸酶一起溫育以消化DNA。使用抗BrdU過氧化物酶綴合的mAb檢 測摻入DNA內(nèi)的BrdU，并且用可溶性生色底物顯現(xiàn)。光密度用ELISA閱讀器在405nm下進 行測量。結(jié)果表示為3次實驗的平均值士 1SD。結(jié)果在圖4中舉例說明。與MVs —起溫育在48小時溫育后誘導(dǎo)經(jīng)由PTEC的PAX2和波形蛋白表達，指出獲 得未成熟表型的PTEC去分化衍生自人腎祖細胞CD133的MVs誘導(dǎo)PTECs的去分化。5xl04細胞/孔PTECs在DMEM+5% BSA中與衍生自人腎祖細胞⑶133的10 u g/ml MVs或僅媒介物一起溫育24小時， 并且通過共焦顯微鏡檢查評估PAX2和波形蛋白的表達。用衍牛自MSC或HLSC的MVs處理的人肝細胞』的細胞贈葙和凋亡測涼衍生自間充質(zhì)干細胞(MSC)或成人肝干細胞(HLSC)的MVs能夠支持人肝細胞的
增殖；就與僅媒介物一起溫育的對照而言，肝細胞與衍生自MSC或HLSC的不同劑量(10、 25和50 u g/ml)MV 一起溫育72小時促進細胞增殖。如圖5中所示，5000細胞/孔與10 y M BrdU 一起加入96孔板內(nèi)，在DMEM中與僅媒介物或不同劑量的MV —起溫育。細胞隨后用 0. 5M乙醇/HC1固定，并且與核酸酶一起溫育以消化DNA。使用抗BrdU過氧化物酶綴合的 mAb檢測摻入DNA內(nèi)的BrdU，并且用可溶性生色底物顯現(xiàn)。光密度用ELISA閱讀器在405nm 下進行測量。結(jié)果表示為3次實驗的平均值士 1SD。執(zhí)行用Durmet’ s多重比較檢驗的方 差分析*MVs與僅媒介物比較p < 0. 05。結(jié)果明確顯示來自MSC和HLSC的MVs能夠刺激 成熟人肝細胞的體外增殖，暗示對肝再生的潛在作用。用衍牛自HLSC的MVs處理的人腎小管細胞』的凋亡測丨定如先前所述使用TUNEL測定分析來評估人腎小管上皮細胞的凋亡。簡言之，對細 胞實施末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶[TdT]介導(dǎo)的切口末端標(biāo)記(TUNEL)測定分析，使用順鉬 (2 u g/ml)作為用于誘導(dǎo)凋亡的陽性對照。細胞在PBS中洗滌，在溶于PBS，pH 7.4中的1% 低聚甲醛中固定，與TdT酶和地高辛配基-dNTP —起溫育，在PBS中洗滌，并且用溶于PBS 中的抗地高辛配基-FITC抗體和用碘化丙啶(lyg/ml)復(fù)染。通過倒置UV顯微鏡檢查顯 現(xiàn)在凋亡細胞中的FITC標(biāo)記DNA片段。通過使用攝像機獲得的圖像的數(shù)字分析計數(shù)細胞， 陽性凋亡細胞表示為在10X倒置顯微鏡視野中計數(shù)的總細胞百分比。在這個測定中使用的 MVs濃度是10、15、30ii g/ml，持續(xù)48小時。圖6顯示在10、15、30 u g/ml下用來自HLSC的MVs刺激的人腎小管上皮細胞的凋 亡百分比。衍生自HLSCs的MVs以劑量依賴性方式刺激人腎小管上皮細胞的增殖，這是原 代細胞培養(yǎng)物，限制于極少代。刺激增殖的MVs濃度是10、15、30i!g/ml。在由順鉬誘導(dǎo)的 凋亡的情況下，衍生自HLSCs的MVs在刺激增殖的相同濃度下抑制人腎小管上皮細胞的凋亡。EPC衍生的MV對PTEC發(fā)揮增殖和抗凋亡作用PTEC與增加劑量的MVs (1-5 u g/ml) 一起溫育。MVs在溫育12小時后誘導(dǎo)增殖效 應(yīng)，在24-48小時后在PTEC中具有進一步增加(圖7)。MV誘導(dǎo)的增殖在1 P g/ml的劑量 下顯著增加，并且在50 u g/ml的劑量下到達峰值(圖7)。圖7顯示由MVs對PTEC誘導(dǎo)的 增殖作用。數(shù)據(jù)來自基于XTT分析的PTEC時間過程增殖測定。MVs在考慮的所有時間點 (12、24、48小時)下誘導(dǎo)顯著劑量依賴性的增殖增加。數(shù)據(jù)表示為3次不同實驗的平均值 士SD。執(zhí)行具有紐科二氏多重比較檢驗的AN0VA。我們研究MVs對在不同有害條件下培養(yǎng)的PTEC的抗凋亡作用。如由TUNEL測定 顯示的(圖8)，MVs顯著減少在血清剝奪條件下、與5 u g/ml順鉬、1 y g/ml FK506或炎性 細胞因子(20ng/ml TNF-a和20ng/ml IFN-y )培養(yǎng)的PTEC凋亡。圖8舉例說明執(zhí)行的 TUNEL測定結(jié)果，顯示10 u g/ml MVs對暴露于血清剝奪(媒介物/FCS-)、順鉬(CIS5 u g/ ml)、FK 506(1 u g/ml)或炎性細胞因子(s印tic :20ng/ml TNF-a 禾口 20ng/ml IFN- y )的PTEC的抗凋亡作用。數(shù)據(jù)表示為3次不同實驗的平均值士SD。執(zhí)行具有紐科二氏多重比 較檢驗的AN0VA。基因陣列分析證實MVs調(diào)節(jié)編碼線粒體和死亡受體凋亡途徑分子的基因表達。特 別地，MVs誘導(dǎo)抗凋亡Bcl-XL、Bcl-2和FLIP的上調(diào)，以及幾種促凋亡基因例如Fas、Fas-配 體(Fas-L)、Bax、TNF和TRAIL的下調(diào)。此外，在腎小管上皮細胞中在炎癥損傷過程中超表 達的⑶40基因是下調(diào)的，暗示MVs對PTEC的抗炎作用。⑶40的下調(diào)通過FACS分析加以證 實。圖9顯示在10 u g/ml MVs的存在或不存在下，用順鉬(5 u g/ml)刺激的PTECs的基因 陣列分析結(jié)果。基因表達變化百分比涉及PTEC凋亡。結(jié)果作為就僅順鉬而言，在暴露于順 鉬+MVs的PTEC中的基因表達密度計分析之間的比給出。看家基因(0-肌動蛋白，GAPDH) 用作關(guān)于密度計分析的參考。執(zhí)行3次實驗，結(jié)果相似。與lOng/ml MVs—起溫育誘導(dǎo)在順鉬處理的iTEC中半胱天冬酶3-8和9活性的 顯著減少。這些結(jié)果指出線粒體和受體介導(dǎo)的凋亡途徑的伴隨抑制。圖10顯示ELISA測 定結(jié)果，顯示在順鉬處理24小時的PTEC上由10 u g/ml MVs誘導(dǎo)的半胱天冬酶3_8和9活 性中的顯著減少。數(shù)據(jù)表示為3次不同實驗的平均值士SD。執(zhí)行具有紐科二氏多重比較檢 驗的ANOVA。在共培養(yǎng)模型中評估內(nèi)皮產(chǎn)生因子對PTEC存活的旁分泌作用，所述共培養(yǎng)模型 特征在于通過Matrigel與PTEC上層分開的內(nèi)皮細胞層。在10 y g/ml MVs的存在或不存 在下，通過血清剝奪24或48小時誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷，隨后為在其上種植PTEC的生長因子減少 Matrigel的分層。在不存在MVs的情況下，在24和48小時后PTEC活力顯著減少。相比之 下，用MVs的內(nèi)皮刺激阻止活力減少。這些結(jié)果暗示MVs刺激促進PTEC存活的內(nèi)皮細胞的 旁分泌作用。所獲得的結(jié)果在圖11中舉例說明，涉及在內(nèi)皮-PTEC共培養(yǎng)模型中的PTEC活 力評估。在10 y g/ml MVs的存在或不存在下，通過血清剝奪24或48小時誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷， 隨后為在其上種植PTEC的生長因子減少Matrigel的分層。數(shù)據(jù)表示為3次不同實驗的平 均值士SD。執(zhí)行具有紐科二氏多重比較檢驗的ANOVA。我們研究MVs對在10 u g/ml MVs的存在下不含F(xiàn)CS培養(yǎng)24小時的人PTEC中的 間充質(zhì)標(biāo)記波形蛋白和Pax-2——胚胎腎中存在的蛋白質(zhì)表達的作用。MVs誘導(dǎo)PTEC中的 波形蛋白和Pax-2表達。5xl04細胞/孔PTEC在DMEM+5% BSA中與衍生自EPC的10 u g/ ml MVs 一起溫育24小時，并且通過共焦顯微鏡檢查評估PAX2和波形蛋白的表達。MV誘導(dǎo)PTEC遷移我們評估在纖連蛋白、IV型膠原或Matrigel包被板上種植的分散PTEC的活動性， 模擬其中PTEC應(yīng)遷移以重新建立的腎小管完整性的微觀環(huán)境。我們通過對分散PTEC的時 滯顯微鏡檢查研究MVs對細胞遷移的作用。發(fā)現(xiàn)與PTEC的自發(fā)運動性對應(yīng)的基線遷移速 率對于整個觀察期(12小時)維持穩(wěn)定，從不超過3-4 ym/小時。MVs誘導(dǎo)自發(fā)性遷移的顯 著增加，這在早至2小時時達到峰值，并且在所有觀察期自始至終對所有細胞外基質(zhì)保持 顯著較高。圖12顯示MVs對在細胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的PTEC遷移的作用。與10iig/ml MSP 一起溫育顯著增加在板上培養(yǎng)的PTEC遷移，所述板先前用20 u g/ml人纖連蛋白、IV型膠 原或進行包被。數(shù)據(jù)作為3次不同實驗的速度平均值(ym/小時)士SD給出。MVs維持在順鉑處理PTEC的上皮單層中的功能完整性給順鉬處理PTEC添加MVs重新建立細胞極性，如通過經(jīng)上皮抵抗力分析評估的。圖13顯示MVs對順鉬誘導(dǎo)的經(jīng)上皮電阻(TER)改變的作用。在不同實驗條件下PTEC TER——細胞極性標(biāo)記的分析順鉬(CIS 5ug/ml)顯著減少TER值，(CIS與媒介物比較 < 0. 05)，而MVs (10或50 ii g/ml)恢復(fù)正常TER值。數(shù)據(jù)作為3次不同實驗的平均TER值 士SD給出。TER值對于在實驗操作中使用的膜面積進行標(biāo)準(zhǔn)化。執(zhí)行具有紐科二氏多重比 較檢驗的AN0VA。此外，在MVs的存在下，順鉬處理的PTEC保存完全分化小管的一般分子例如堿性 磷酸酶和氨肽酶A的表達，并且重新建立內(nèi)皮受體megalin的存在，可能負責(zé)維持這些細 胞內(nèi)在化FITC標(biāo)記白蛋白的能力的現(xiàn)象。通過免疫熒光研究由MV處理的PTEC的內(nèi)吞受 體megalin的表達，通過比較在5 u g/ml順鉬或5 u g/ml順鉬+10 u g/ml MVs的存在下的 megalin表達。放大率xlOO。核用0. 5mg/ml Hoechst進行復(fù)染。執(zhí)行3次實驗，結(jié)果相似。圖14顯示MVs對FITC-白蛋白通過PTECs內(nèi)在化的作用。在PTEC單層與50mg/ ml FITC綴合的人白蛋白在37°C下溫育2小時后研究蛋白質(zhì)攝取。在FITC-白蛋白攻擊 后，PTEC用冰冷的PBS充分洗滌3次，并且通過FACS進行分析。黑色曲線顯示就對照(空 心曲線)而言的白蛋白內(nèi)在化。A顯示經(jīng)由5 y g/ml順鉬處理PTEC的FITC-白蛋白攝?。?B顯示經(jīng)由用10ii g/ml MVs刺激的5ii g/ml順鉬處理PTEC的FITC-白蛋白攝取。執(zhí)行 Kolomogorov Smirnov統(tǒng)計分析。執(zhí)行3次實驗，具有相似結(jié)果。MVs i秀導(dǎo)在Matrigel句,被板卜.培養(yǎng)的PTEC的分I形杰發(fā)牛和在體內(nèi)的腎小管發(fā) 生在Matrigel包被板上不含F(xiàn)CS培養(yǎng)24小時的PTECs形成囊樣(Cyst-like)結(jié) 構(gòu)。10 ii g/ml MVs的添加導(dǎo)致PTECs的分支形態(tài)發(fā)生。將PTECs皮下注射到SCID小鼠中 的Matrigel塞內(nèi)。這些細胞自發(fā)形成低數(shù)目的腎小管樣結(jié)構(gòu)，其在10 y g/ml MVs的存在下 顯著增加。相比之下，順鉬完全抑制分支形態(tài)發(fā)生，觸發(fā)由MV刺激恢復(fù)的凋亡。在lOyg/ ml MVs的存在或不存在下，評估在Matrigel包被板上培養(yǎng)的PTECs形態(tài)發(fā)生。在24小時 后，未受刺激的PTECs形成囊樣結(jié)構(gòu)，而MVs誘導(dǎo)分散和分支形態(tài)發(fā)生。還評估皮下注射到 SCID小鼠中的Matrigel塞內(nèi)的PTEC的體內(nèi)腎小管發(fā)生。未受刺激的細胞僅形成少數(shù)腎小 管樣結(jié)構(gòu)，其在10 y g/ml的存在下顯著增加。MVs在體內(nèi)的腎小管發(fā)生作用是劑量依賴性的。圖15顯示MV誘導(dǎo)的體內(nèi)腎小管 發(fā)生的定量。在用不同劑量MVs處理且皮下注射到小鼠中的PTEC的10個非連續(xù)Matrigel 切片(xlOO放大率)中執(zhí)行腎小管樣結(jié)構(gòu)的計數(shù)。7天后處死小鼠，并且通過熒光顯微鏡檢 查觀察Matrigel塞。數(shù)據(jù)表達為在3次不同實驗中計數(shù)的腎小管樣結(jié)構(gòu)平均數(shù)目/視野 (放大率xlOO)。巨噬細胞刺激蛋白質(zhì)(MSP 10ng/ml)——關(guān)于PTEC的營養(yǎng)因子用作陽性 對照。淋巴細胞與PTEC單層的減少粘附細胞因子處理的PTEC增強淋巴細胞粘附，模擬在ARF過程中在體內(nèi)發(fā)生的炎癥反 應(yīng)。給用細胞因子刺激的PTEC添加MVs顯著抑制與PTEC的淋巴細胞粘附，暗示MVs的抗 炎作用。圖16 在10 u g/ml MVs的存在或不存在下，PTEC單層與僅媒介物或炎性細胞因 子(20ng/ml TNF-a和20ng/mlIFN_ y ) —起溫育6小時。在PTEC單層的充分洗滌后，加 入1x104PKH2標(biāo)記的人淋巴細胞，并且在輕輕攪拌的條件下在37°C下溫育1小時。通過經(jīng)
13由PBS的3次洗滌去除非貼壁細胞，并且通過熒光顯微鏡檢查在xlOO放大率下計數(shù)貼壁細 胞，并且表示為細胞數(shù)目/視野。數(shù)據(jù)是3次不同實驗的平均值士SD。衍牛自EPC的MVs能夠i秀導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細胞』(GECs)的細胞j曾葙和彳本外血管發(fā)牛。衍生自EPC的MV能夠誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細胞(GEC)的細胞增殖和體外血管發(fā)生。就 對照而言，GEC與衍生自EPC的不同劑量MV(10、15和30 u g/ml) 一起溫育48小時顯著促 進GEC的細胞增殖。如圖17中所示，GEC(在96孔板內(nèi)8000細胞/孔)與10 y M BrdU — 起加入，在DMEM中與僅媒介物或不同劑量的MV —起溫育。細胞隨后用0. 5M乙醇/HC1固 定，并且與核酸酶一起溫育以消化DNA。使用抗BrdU過氧化物酶綴合的mAb檢測摻入DNA 內(nèi)的BrdU，并且用可溶性生色底物顯現(xiàn)。光密度用ELISA閱讀器在405nm下進行測量。結(jié) 果表示為3次實驗的平均值士 1SD。此外，不同劑量的MV(10、15和30iig/ml)誘導(dǎo)在Matrigel上溫育6小時的GEC 中的體外血管發(fā)生。MYs對腎修復(fù)的體內(nèi)牛物效應(yīng)MYs 麵■臓側(cè)、■_靴為了測定衍生自來自C57/BL6小鼠成年骨髓的MSCs的MVs是否能夠促進從急性 腎損傷的恢復(fù)，用高滲甘油的肌內(nèi)注射在雌性C57/BL6小鼠中誘導(dǎo)ARF。甘油誘導(dǎo)肌溶解 和溶血，從而使組織特別是腎暴露于大量肌紅蛋白和血紅蛋白。在這個鼠類模型中，如通過 血清肌酸酐和BUN測量的，腎功能在甘油施用后1-4天之間是損傷的。在我們的設(shè)置中， 7. 5ml/kg甘油的肌內(nèi)注射誘導(dǎo)血清肌酸酐和BUN的顯著增加，這在第3天時達到峰值，在第 10天時降低，并且在第21天時標(biāo)準(zhǔn)化。就給予鹽水的甘油處理的小鼠而言，在接受甘油后 第3天時，衍生自MSC或1x106MSCS的MV的靜脈內(nèi)注射在第5天時顯著減少血清肌酸酐和 BUN(圖 18 和圖 19)。圖18顯示MVs保護甘油處理的小鼠免于腎功能衰退。在未處理(黑色柱)或在第 3天時用6iig MVs(白色柱)或1X106MSC (陰影柱)處理的用甘油誘導(dǎo)ARF的小鼠中的血 液尿素氮(BUN)評估。結(jié)果表示為3次個別實驗的平均值士SD，并且執(zhí)行ANOVA :*p < 0. 05圖19涉及在具有甘油誘導(dǎo)ARF、未處理(黑色柱)或在第3天時用6iig MVs (白 色柱)或1X106MSC(陰影柱)處理的小鼠中的肌酸酐評估。結(jié)果表示為3次個別實驗的平 均值士 SD，并且執(zhí)行ANOVA :*p < 0. 05在具有甘油誘導(dǎo)ARF的小鼠中在第5天時顯著的腎小管上皮損傷是顯而易見的。 在具有甘油誘導(dǎo)ARF的小鼠中觀察到的形態(tài)改變包括空泡形成、刷狀緣喪失和腎小管上皮 細胞的廣泛壞死和腎小管透明管型形成。當(dāng)MVs注射到甘油處理小鼠中時，腎小管病變由 于腎小管再生而較不嚴重，并且管再表達刷狀緣。MVs促進實驗誘導(dǎo)的腎小球損傷的再生為了測定衍生自人EPC的MV是否能夠誘導(dǎo)腎小球再生，使用腎小球腎炎的Thy-1 模型，其特征在于急性抗體介導(dǎo)的腎小球損傷在這個模型中，抗Thy-1抗體誘導(dǎo)腎小球膜 溶解伴隨腎小球毛細血管喪失和炎癥細胞累積。腎小球損傷與蛋白尿相關(guān)。通過在第0天 時將250 u g/100g重量的抗Thyl-1抗體(Ab) i. v.施用到6周大雌性Lewis大鼠的股靜脈 內(nèi)誘導(dǎo)腎小球腎炎(GN)。對照動物接受相同體積的鹽水注射代替抗Thyl. lAb。在第2天 時，當(dāng)已可檢測出蛋白尿時，將30 ygEPC衍生的MVs注射到對側(cè)股靜脈中。對照動物接受相同量的僅媒介物(經(jīng)修飾的M199培養(yǎng)基Ifepes加上DMS0)的注射。每天評估蛋白 尿、血清和尿肌酸酐/尿素(24小時尿液采集)。小鼠在下述天數(shù)D4、D7、D14時處死。每 個實驗組包括9只大鼠。如圖20中所示，MV的施用顯著減少在具有Thy-IGN的大鼠中的蛋白尿。組織學(xué)分 析顯示在具有Thy-IGN的大鼠中存在毛細血管壁的發(fā)散損傷，伴隨微動脈瘤形成和炎癥細 胞的存在。腎小球毛細血管的喪失也由關(guān)于減少的RECA抗原染色指出，所述RECA抗原是 內(nèi)皮標(biāo)記。此外，觀察到近端和遠端腎小管的發(fā)散損傷伴隨在腎小管腔內(nèi)的蛋白管型。用 MV處理的大鼠腎的組織學(xué)檢查證實在第4天時減少的腎小球和腎小管損傷壞死，以及在第 7天時如RECA抗原和腎小管細胞刷狀緣的正常分布檢測的腎小球毛細血管再生。通過電子 顯微鏡檢查證實毛細血管損傷經(jīng)由MV處理的抑制，這證實在MV處理大鼠中完整內(nèi)皮細胞 層的存在和足突狀細胞足突的正常分布。相比之下，在未用MV處理的大鼠中觀察到由于損 傷內(nèi)皮經(jīng)由炎癥細胞的吞噬作用的MV膨脹和內(nèi)皮細胞脫落。此外，存在足突的消失?？傊?，用MV處理Thy-IGN抑制蛋白尿、腎小球炎癥病變且促進腎小球毛細血管再 生和恢復(fù)。結(jié)論
所獲得的實驗結(jié)果暗示衍生自不同起源干細胞例如內(nèi)皮祖細胞、間充質(zhì)、肝和腎 干細胞的MVs，能夠?qū)⑸镄盘栟D(zhuǎn)移給腎成熟細胞，導(dǎo)致靶細胞的去分化，獲得未成熟表型 連同對凋亡刺激的抗性以及遷移和增殖能力。駐留細胞的去分化、其遷移和增殖是關(guān)于在 腎小管和腎小球損傷后的修復(fù)事件的關(guān)鍵需求。事實上，實驗急性腎小管壞死和抗體介導(dǎo) 的腎小球損傷的處理導(dǎo)致加速功能和形態(tài)恢復(fù)。因此，可以提議衍生自干細胞的MVs用于 在不同腎小管和腎小球病理狀態(tài)中的再生治療。使用MVs而不是干細胞的優(yōu)點是避免干細 胞的潛在致瘤效應(yīng)，避免免疫抑制需要和無限體外產(chǎn)生的可能性。參考文獻1.Bonventre JV, Weinberg JM. Recent advances in thepathophysiology of ischemic acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003Aug ； 14(8) :2199_210.2. Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of survivingepithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003 Jun ； 14Suppl 1 :S55-61.3.Iruela-Arispe L, Gordon K, Hugo C, Duijvestijn AM, ClaffeyKP, Reilly M, Couser WG, Alpers CE, Johnson RJ. Participation ofglomerular endothelial cells in the capillary repair of glomerulonephritis. Am J Pathol. 1995 Dec ； 147 (6) 1715-27.4. Herrera MB, Bussolati B, Bruno S, Morando L, Maurie11o-Romanazzi G, Sanavio F, Stamenkovic I, Biancone L, CamussiG. Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means ofCD44 following acute tubular injury. Kidney Int. 2007 Aug ；72 (4) :430_41.5.Biancone L, Cantaluppi V, Duo D, Deregibus MC, Torre C, CamussiG. Role of L-selectin in the vascular homing of peripheral blood-derivedendothelial progenitor cells. J Immunol. 2004 Oct 15 ；173(8) :5268_74.
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權(quán)利要求
干細胞衍生的微泡(MV)用于制備用于內(nèi)皮/上皮再生的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物用于治療腎損傷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述藥物用于治療急性腎衰竭(ARF)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物用于治療肝損傷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述藥物用于治療急性肝衰竭(AHF)。
6.干細胞衍生的微泡(MV)用于制備用于抑制由細胞生長抑制劑誘導(dǎo)的凋亡的藥物的 用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述細胞生長抑制劑選自紫杉醇、來那度胺、 Pomalidomide、表柔比星、5FU、舒尼替尼、拉帕替尼、卡紐替尼、環(huán)磷酰胺、羥基紅比霉素、來 那度胺/地塞米松、Pomalidomide/地塞米松、卡鉬、米托蒽醌、奧沙利鉬、多西他賽、長春烯 堿及其任何組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的用途，其中所述微泡由其衍生的干細胞選自內(nèi)皮祖細 胞(EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、腎祖細胞CD133+、成人肝干細胞(HLSC)及其任何組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中所述藥物是適合于通過靜脈內(nèi)輸注施用的 劑型。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的用途，其中所述藥物是適合于以30至120μg/kg體 重的量施用微泡的劑型。
11.藥物組合物，其包括在藥學(xué)上可接受的媒介物或稀釋劑中的有效量的一種或更多 種干細胞衍生的微泡(MVS)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述微泡由其衍生的干細胞選自內(nèi)皮祖細胞 (EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、腎祖細胞CD133+、成人肝干細胞(HLSC)及其任何組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的藥物組合物，其是適合于通過靜脈內(nèi)輸注施用的劑型。
14.根據(jù)權(quán)利要求11、12或13的藥物組合物，其是適合于以30至120μ g/kg體重的量 施用微泡的劑型。
15.受損或損傷組織或器官的內(nèi)皮/上皮再生的體外方法，其包括用有效量的干細胞 衍生的微泡(MVs)處理所述受損或損傷組織或器官。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述微泡由其衍生的干細胞選自內(nèi)皮祖細胞 (EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、腎祖細胞CD133+、成人肝干細胞(HLSC)及其任何組合。
17.受損或損傷組織或器官的內(nèi)皮/上皮再生的體內(nèi)方法，其包括給有此需要的患者 施用有效量的干細胞衍生的微泡(MVs)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其用于治療腎損傷。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其用于治療急性腎衰竭(ARF)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其用于治療肝損傷。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其用于治療急性肝衰竭(AHF)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17-21中任一項的方法，其中所述微泡通過靜脈內(nèi)輸注施用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述微泡以30至120μ g/kg體重的量施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自干細胞的微泡(MVs)用于制備用于受損組織或器官的內(nèi)皮/上皮再生的藥物，和/或用于抑制由細胞生長抑制劑誘導(dǎo)的凋亡的用途。微泡由其獲得的干細胞優(yōu)選選自內(nèi)皮祖細胞(EPCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、腎祖細胞CD133+、成人肝干細胞(HLSC)及其任何組合。微泡可以在體外和體內(nèi)應(yīng)用中使用，例如受損組織或器官的再生，以及腎損傷和肝損傷特別是急性腎衰竭(ARF)和急性肝衰竭(AHF)的治療。
文檔編號A61P13/12GK101854941SQ200780101326
公開日2010年10月6日 申請日期2007年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者G·卡姆西, M·C·A·德雷吉布斯, V·坎塔盧皮 申請人:弗雷森紐斯醫(yī)療護理德國有限責(zé)任公司