專利名稱：多肽有機(jī)化合物及其在異種移植中的應(yīng)用的制作方法
多肽有機(jī)化合物及其在異種移植中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本案為申請(qǐng)?zhí)?006100501640的分案申請(qǐng)，本發(fā)明屬有機(jī)化合物，主要涉 及多肽類有機(jī)化合物，尤其是關(guān)于人工合成的多肽有機(jī)化合物及其在異種移植 中的應(yīng)用。 技術(shù)背景醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使人類同種器官移植成為了可能。由于人體器官的來源不 足，大量的病人得不到急需的器官，利用豬的器官代替人體器官是目前研究的 熱點(diǎn)。但由于豬的細(xì)胞表面存在異種抗原表位Gal-oc-l, 3-Gal能與人體內(nèi)預(yù)存 的天然抗體結(jié)合產(chǎn)生超急性排斥反應(yīng)，從而導(dǎo)致異種器官移植的失敗。人們?cè)?努力尋找一種方法可以封閉或清除人天然抗a -Gal抗體，為異種器官移植開辟 途徑。噬菌體展示技術(shù)是一種能夠篩選與靶分子結(jié)合的特異性多肽的有力工 具，已成功運(yùn)用于抗原表位，特異性受體激動(dòng)劑或抑制劑和疫苗的研究。在本 實(shí)驗(yàn)中我們利用噬菌體展示技術(shù)，對(duì)兩種肽庫，線性7肽庫和C7C文庫，進(jìn)行 了親和篩選。線性7肽庫中展示的多肽沒有結(jié)構(gòu)限制，具有相對(duì)柔性的結(jié)構(gòu)。 C7C肽庫展示的多肽由于有一對(duì)二硫鍵的限制而形成環(huán)狀，構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定。同 時(shí)采用兩種肽庫進(jìn)行篩選，目的在于比較由于結(jié)構(gòu)不同而造成的篩選出的多肽 在氨基酸序列上的差異。由于抗B型血單克隆抗體有結(jié)合a -Gal抗原表位的特 性，因此我們以抗B型血單克隆抗體為靶分子，篩選出能夠模擬a-Gal抗原表 位的多肽，可以特異地阻斷天然抗a-Gal抗體，可以用于異種器官移植超急性 排斥反應(yīng)。目前臨床常用的免疫抑制劑有環(huán)孢素A、糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰 胺等，可以降低整體的免疫反應(yīng)，但對(duì)異種器官移植超急性排斥反應(yīng)無效，并 且有多種副作用，如常見的就有骨髓抑制、肝腎毒性、上消化道出血、脫發(fā)等 等。我們篩選到的多肽化合物可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應(yīng)， 但不影響人體的整體免疫反應(yīng)，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服目前臨床上異種器官移植術(shù)中出現(xiàn)的排斥反應(yīng)，設(shè)計(jì) 并提供一種多肽有機(jī)化合物。本發(fā)明提供的多肽有機(jī)化合物，選自a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h八種中的一種，能與抗B型血單克隆抗體特異性結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。本發(fā)明提供的多肽有機(jī)化合物a的氨基酸序列為-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser，分子量為915. 96 ;多肽有機(jī)化合物b的氨基 酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963. 06;多肽有機(jī)化合 物c的氨基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763. 86;多 肽有機(jī)化合物d的氨基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys， (其中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963. 15;多 肽有機(jī)化合物e的氨基酸序列為Cys-His-11 e-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其 中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07;多肽有 機(jī)化合物f的氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中 第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031. 18;多肽有機(jī) 化合物g的氨基酸序列為Cys-His-Gin-Thr-Pro_Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第 l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987. 13;多肽有機(jī)化 合物h的氨基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1 位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951. 14。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供多肽有機(jī)化合物a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h在制 備治療器官移植術(shù)中控制異種移植中超急性排斥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有① 本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物，由于分子組成只有7 9個(gè)氨基酸，故可以 用人工化學(xué)合成方法大量合成，可以得到大量較純的小肽。② 能與人體內(nèi)預(yù)存的抗豬抗原的抗體特異性結(jié)合，從而封閉它的作用， 可以抑制豬器官移植至人體時(shí)發(fā)生的超急性排斥反應(yīng)。③ 本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗a -Gal抗體的結(jié)合位 點(diǎn)是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由于作用位點(diǎn)特異性不強(qiáng) 而帶來的副作用。④ 由于本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物的組成氨基酸數(shù)量較少，開發(fā)成藥物后容 易被機(jī)體利用而起效。


圖1為三種線性多肽與水蘇糖競(jìng)爭(zhēng)性與抗B單克隆抗體結(jié)合的ELISA抑制 率曲線圖。圖2為五種C7C環(huán)肽與水蘇糖競(jìng)爭(zhēng)性與抗B單克隆抗體結(jié)合的ELISA抑制 率曲線圖。圖3為多肽化合物抑制人天然抗體引起的豬紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合以下實(shí)施例及附圖作進(jìn)一步說明。實(shí)施例l:用抗B型血單克隆抗體作為靶蛋白，用噬菌體展示技術(shù)篩選得 到陽性噬菌體克隆。噬菌體展示技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)將合成的一組一定長(zhǎng)度的隨機(jī)序列 寡核苷酸片段克隆到特定表達(dá)載體中，使其表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在 噬菌體表面。由于肽庫中包含了該長(zhǎng)度小肽的所有可能的氨基酸排列順序，每 一個(gè)噬菌體表面蛋白呈現(xiàn)其中的一種肽段，便于篩選；篩選到的噬菌體，可以 通過細(xì)菌擴(kuò)增。用噬菌體肽庫感染大腸桿菌，使重組入噬菌體的隨機(jī)的寡核苷 酸片段在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制，并在噬菌體的外殼蛋白中表達(dá)出來。然后，把靶蛋 白包被在酶標(biāo)板上。用此噬菌體肽庫與靶蛋白混合后，洗板。如果噬菌體上的 外殼蛋白能與靶蛋白結(jié)合，就不會(huì)被洗掉。最后用酸或親和洗脫液把噬菌體洗 脫下來。連續(xù)這樣篩3-4輪，就能篩出與耙蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的噬菌體。測(cè)此噬 菌體的DNA序列得到重組寡核苷酸的序列，亦知道了相應(yīng)的多肽的序列。然后 可通過人工化學(xué)合成的方法得到多肽。本發(fā)明提供的多肽有機(jī)化合物，包括a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h八種，能 與抗B型血單克隆抗體特異性結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。本發(fā)明提供的多肽有機(jī)化合物a的氨基酸序列為 Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser,分子量為915. 96 ;多肽有機(jī)化合物b的氨基 酸序列為Phe-His-Glu-Phe-Trp-Pro-Thr，分子量為963. 06;多肽有機(jī)化合 物c的氨基酸序列為Ser-Met-Leu-Asp-Thr-Pro-Thr，分子量為763. 86;多 肽有機(jī)化合物d的氨基酸序列為Cys-Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys， (其中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為963. 15;多 肽有機(jī)化合物e的氨基酸序列為Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr-Ala-Cys，(其 中第l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為902.07;多肽有 機(jī)化合物f的氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，(其中 第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1031. 18;多肽有機(jī) 化合物g的氨基酸序列為Cys-His-Gin-Thr-Pro-Leu-Ser-Thr-Cys，(其中第 l位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為987. 13;多肽有機(jī)化合物h的氨基酸序列為Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr-Leu-Thr-Cys，(其中第1 位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為951. 14。實(shí)施例2:水蘇糖競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)方法在96孔酶標(biāo)板中包被100 W抗B型血單克隆抗體4 0C過夜， 用5% BSA 37 0C封閉2小時(shí)，然后用TBS洗板3次，加入100 m陽性噬菌體 和終濃度分別為100、 20、 4、 0. 8、 0. 16、 0. 032 mM的水蘇糖混合液反應(yīng)1小 時(shí),另設(shè)不加水蘇糖的陽性噬菌體液作為空白對(duì)照。用含0. 1% Tweeri 20的TBS 洗板6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13抗體，結(jié)合1小時(shí)，用含0. 1% Tween 20的TBS洗板6次，TMB進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。計(jì)算抑制率 按照公式[A柳(-s)-A45。(+s)]/A45。(-s) X100%， A45。(-s)為未加水蘇糖的吸光度， A45。(+s)為加入水蘇糖的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果水蘇糖能有效的抑制多肽與抗體的結(jié)合，說明水蘇糖與多肽結(jié) 合于抗體的同一位置，即a-Gal抗原表位結(jié)合位點(diǎn)。這說明了陽性克隆很可能 就結(jié)合在水蘇糖與抗B型血單克隆抗體結(jié)合的位點(diǎn)。結(jié)果參見圖l， 2，。實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)，總體來說，水蘇糖對(duì)環(huán)肽比線性多肽抑制率要高，說明篩選的線性多肽 比環(huán)狀多肽對(duì)抗體的親和力強(qiáng)。以上實(shí)例說明了多肽有機(jī)化合物與抗B單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)(a-Gal結(jié) 合位點(diǎn))是特異性的，正好起到封閉抗B單克隆抗體作用，從而避免了由于作 用位點(diǎn)特異性不強(qiáng)而帶來的副作用。實(shí)施例3:多肽抑制人血清與豬紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)試驗(yàn)方法先把制備好的新鮮線豬紅細(xì)胞懸浮在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液 中備用。在U型血凝板的孔里，40W多肽用磷酸緩沖液依次逐孔倍比稀釋后， 每孔分別加入40W適當(dāng)稀釋的A型人血清和1%的豬紅細(xì)胞。然后把此 的混合液在室溫下先用震蕩器震蕩1分鐘，再靜置1小時(shí)后觀察凝集結(jié)果。如 果紅細(xì)胞沉淀到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，則此為沒有凝集。如果紅細(xì) 胞形成一網(wǎng)絡(luò)，并不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點(diǎn)，此為出現(xiàn)凝集。試驗(yàn)設(shè) 空白、陽性和陰性對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果此多肽預(yù)先能與A型人血清中的抗a-Gal抗體結(jié)合，使其失活。 這樣此抗體就不能再與豬紅細(xì)胞上的Gal-a-l， 3-Gal抗原結(jié)合，從而阻斷人 抗ot-Gal抗體引起的豬紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。結(jié)果參見圖3。在圖3中，A1 A2，H1 H2， 01 02均是空白對(duì)照，用40W 1%的豬紅細(xì)胞和80W磷酸鹽緩沖液 混勻后靜置l小時(shí)，紅細(xì)胞沉于凝集板底部，出現(xiàn)光滑圓點(diǎn)，此結(jié)果表明沒有 出現(xiàn)凝集。A3 A4， H3 H4， 03 04為陽性對(duì)照，用鄉(xiāng)l 1%的豬紅細(xì)胞， 1%人血清，和磷酸鹽緩沖液混勻后靜置1小時(shí)，紅細(xì)胞沒有下沉呈現(xiàn)光 滑圓點(diǎn)，而是呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝集。B， B'兩條均為水蘇糖抑制豬紅細(xì) 胞凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在1 4孔中依次加入了 用磷酸鹽緩沖液稀釋的不同 濃度的水蘇糖(濃度依次為200 mM, 40函，8 mM， 1. 6 mM)，然后加入4014 1% 的豬紅細(xì)胞和40W 1%人血清，混勻后靜置l小時(shí)。B1 B2、 B， 1 B， 2沒有 出現(xiàn)凝集，B3、 B' 3開始有網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，有明顯凝集的現(xiàn)象，說明水蘇糖 能抑制由人夭然抗a-Gal抗體誘發(fā)的豬紅細(xì)胞凝集。Cl-4和C'卜4為噬菌體 展示肽a抑制豬紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在1 4孔中依次加入了用磷酸鹽緩 沖液稀釋的不同濃度的噬菌體(濃度依次為0. 1 mM， 0. 02 mM， 0. 004 mM， 0. 0008 raM) 40 W，再加入40 W淺的豬紅細(xì)胞和40 W 1%人血清，混勻后靜置1 小時(shí)。Cl， C， 1沒有出現(xiàn)凝集，C2， C' 2開始有網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，有明顯凝 集的現(xiàn)象。E1-4和E， 1-4，11-4和I， 1-4，J1-4和J， 1-4， K1-4和K， 1-4， L1—4和L， 1一4, M1-4禾卩M， 1-4， Pl-4禾B P， 1—4， Q1—4和Q， 1—4，分別是噬 菌體展示肽b， h， e， k， d， g， c， f的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)方法和噬菌體濃度如 前。除了噬菌體展示肽k(其氨基酸序列為Ser-Ser-Thr-lie-Ala-Asn-Thr)， 各噬菌體克隆均能在0. 1 mM濃度下有效地抑制凝血，噬菌體展示肽k可能對(duì) 抗體結(jié)合能力不足，未能明顯抑制凝血。G1-4和N1-4為未經(jīng)過篩選的野生型 噬菌體(陰性對(duì)照)，分別來自線性7肽庫和C7C肽庫，均出現(xiàn)凝集。D1-4和 D' 1-4, F1-4和F' 1-4， R1-4和R' 1-4分別是化學(xué)合成的多肽a， b, f的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)方法如前，多肽濃度均依次為20 mM， 4 mM， 0. 8mM, 0. 16mM，可 見多肽a和b在濃度為4mM時(shí)可抑制凝血，而多肽f需要的濃度是20mM。 Sl-4 為陰性對(duì)照，加入的多肽序列為Cys-Val-Gin-Pro-Ser-His-Ser-Ser-Cys，均 出現(xiàn)凝集；上述結(jié)果重復(fù)3次，呈現(xiàn)良好的一致性。以上實(shí)例用形象而直接的方式說明了多肽有機(jī)化合物除了能與抗B單克隆 抗體結(jié)合外，還能與人體內(nèi)預(yù)存的抗豬抗原的抗體(抗(x-Gal抗體)特異性結(jié) 合，從而封閉它的作用，可以抑制人天然抗體(抗a-Gal抗體)觸發(fā)的異種移 植超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最 大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明， 而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及的序列 <210> 1 <211>7 <212> PRT <213>人工序歹Li <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>1Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser 1 5<210>2 <211>7 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>2Phe-His隱Glu國(guó)Phe-Trp-Pro-Thr 1 5<210>3 <211>7 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>3Ser-Met-Leu-Asp-Thr陽Pro-Thr 1 5<210> 4 <211>9 <212> PRT <213>人工序列<220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>4Cys陽Leu-Pro-Thr-Ile-Thr-Asn-Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)<210> 5 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>5Cys-His-Ile-Leu-Gly-Ser-Thr陽Ala-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)<210>6 <211>9 <212〉 PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>6Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser陽Leu-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)<210>7 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備<400>7Cys陽His-Gln-Thr-Pro陽Leu-Ser陽Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)<210> 8 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)，用于異種移植過程中超急性排斥反應(yīng)抑制劑的制備 <400>8Cys-Lys-Pro-Thr-Ser-Thr隱Leu-Thr-Cys 1 5(其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵)
權(quán)利要求
1.一種多肽有機(jī)化合物，其特征是提供的多肽有機(jī)化合物選自氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為1031.18的多肽有機(jī)化合物f。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽有機(jī)化合物在制備治療器官移植術(shù)中控制 異種移植中超急性排斥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多肽有機(jī)化合物，選自氨基酸序列為Cys-His-Pro-Thr-Trp-Ser-Ser-Leu-Cys，其中第1位的Cys與第9位的Cys之間形成二硫鍵，分子量為1031.18的多肽有機(jī)化合物f，能與抗B型血單克隆抗體特異性結(jié)合，溶于水，各氨基酸之間通過肽鍵相連。本發(fā)明的多肽有機(jī)化合物能與人體內(nèi)預(yù)存的抗豬抗原的抗體特異性結(jié)合，從而封閉它的作用；可以特異地阻斷異種器官移植超急性排斥反應(yīng)，與人體內(nèi)預(yù)存的天然抗α-Gal抗體的結(jié)合位點(diǎn)是特異性的，正好起到封閉抗體作用，但不影響人體的整體免疫反應(yīng)，可避免常用免疫抑制劑引起的副作用。
文檔編號(hào)A61P37/06GK101230093SQ20081000131
公開日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者嚴(yán)志焜, 詹金彪, 許林海, 郎建社 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)