專利名稱：：一種新的異穿心蓮內(nèi)酯磺化物、含有該磺化物的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的穿心蓮內(nèi)酯衍生物及包含該衍生物的組合物，及其制備方法和在制備抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：穿心蓮內(nèi)酉旨(androgmpholide)為穿心蓮(爿m/ragra//^/am'cw/ato(Burm.f.)Nees)中的二萜類化合物，分子式C2()H3()05，為無色方型或長方型結(jié)晶，m.p.230232。C,["]^-126°(C=0.2，H20)。味極苦，可溶于甲醇、乙醇、丙醇、吡啶中，微溶于氯仿、乙醚，難溶于水及石油醚。因穿心蓮內(nèi)酯不溶于水，給制備注射液帶來了困難。目前，有多種方法被用來制備穿心蓮內(nèi)酯的各種水溶性衍生物，以制備注射液，其中喜炎平注射液即為穿心蓮內(nèi)酯總磺化物制成的注射液，中國專利CN1162420C中公開了穿心蓮內(nèi)酯的磺化工藝，中國專利CN12卯838C進(jìn)一步公開了以該磺化工藝得到的穿心蓮內(nèi)酯總磺化物的物質(zhì)組成。該專利表明，該總磺化物含有至少11種以上的各種磺化物及其衍生物。因而難以制定產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并影響到產(chǎn)品的臨床療效。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是尋找一種新的水溶性穿心蓮內(nèi)酯磺化物及組合物，該磺化物及含有該磺化物的組合物的制備方法，所制得的化合物、組合物較"水溶性穿心蓮內(nèi)酯磺化工藝"(專利授權(quán)號CN1162420C)中得到的混合物有更好的質(zhì)量可控性。該磺化物及含有該磺化物的組合物與藥學(xué)上可用載體形成的藥物組合物可用于制備抗炎、拮抗炎癥因子、抗菌、解熱、抗病毒和抗腫瘤的藥物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種新化合物，符合下述通式(I)所示，及其鉀鹽、鈉鹽或銨鹽，其化學(xué)名稱為14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)環(huán)氧穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯；英文名稱為14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxyandrogmpholide-19-sulfonate;簡稱異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯；R可以為H、Na、K或NH4。一種藥物組合物，包含通式(I)所示的化合物、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E(化學(xué)名稱3,14，19-三羥基-8(9),12(13)-賴百當(dāng)二烯-15，16-內(nèi)酯-19-硫酸酯)、穿心蓮酸及穿心蓮內(nèi)酯，其重量比例為10%30%:30%75%:5%30%:5%30%，四種成分的總含量占組合物的重量比例290%。其中優(yōu)選異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯與穿心蓮內(nèi)酯磺化物E占組合物的重量比例^50%。一種藥物組合物，包含通式(I)所述的化合物、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E、穿心蓮酸及穿心蓮內(nèi)酯，其特征在于四種成分的色譜歸一化百分含量比例為10%30%:40%~75%:5%~15%:5%~15%。所采用的色譜分析條件如下色譜柱反相C18色譜柱，5^，250x4.6mm;流動(dòng)相A:乙腈-異丙醇l:2(v/v)流動(dòng)相B:水(含0.2%磷酸)流動(dòng)相流動(dòng)相A-流動(dòng)相B25%:75%(v/v);流速lmL/min柱溫3(TC;檢測波長225nm。上述組合物的制備方法包括以下歩驟(1)將濃硫酸與無水乙醇混合，加入穿心蓮內(nèi)酯單體粉末，充分?jǐn)嚢?，室溫?蘊(yùn)Y5(2)放置24小時(shí)后，加入氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值6—8;(3)加入乙醇溶液，攪拌過濾，濾渣以乙醇溶液洗滌；(4)回收乙醇溶液得水溶液，過濾得濾液；(5)濾液通過柱色譜，以O(shè)DS反相硅膠為固定相，以乙醇-水或甲醇-水進(jìn)行洗脫，回收溶劑，常規(guī)冷凍干燥或減壓干燥得組合物。其中步驟(1)中的濃硫酸與無水乙醇的體積比優(yōu)選為1:1，穿心蓮內(nèi)酯與無水乙醇的比例優(yōu)選為l:1(重量g:體積ml)。步驟(2)中使用的是20%—50%的氫氧化鈉水溶液。步驟(3)中使用的是90%_95%的乙醇溶液。步驟(5)中使用的是30%—35%的乙醇水或甲醇水溶液。一種藥物組合物，由上述化合物或組合物與藥學(xué)上可接受載體組成。一種藥物組合物，由上述化合物或組合物與注射用水組成。一種藥物組合物，由上述化合物或組合物與甘露醇或其他凍干粉針輔料組成。一種藥物組合物，由上述化合物或組合物與口服制劑輔料組成。本發(fā)明提供了異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及其制備方法，以及含有異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物，并且提供了含有它們的藥物組合物在制備抗炎、拮抗炎癥因子、抗菌、解熱、抗病毒和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯為一新化合物，結(jié)構(gòu)明確，較穿心蓮內(nèi)酯具有較好的水溶性，并且具有良好的抗菌、消炎、拮抗炎癥因子、抗病毒及抗腫瘤活性，本發(fā)明提供的含有異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、穿心蓮磺化物E、穿心蓮酸、穿心蓮內(nèi)酯的組合物較根據(jù)中國專利CN1162420C得到的穿心蓮內(nèi)酯總磺化物具有組成簡單，質(zhì)量可控的優(yōu)勢，在同等劑量下具有更好的治療效果。圖l含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、穿心蓮磺化物E、穿心蓮酸、穿心蓮內(nèi)酯的組合物的HPLC色譜圖圖2異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯紅外圖譜圖3異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯核磁共振氫譜圖4異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯核磁共振碳譜6圖5異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯質(zhì)譜圖6對內(nèi)毒素血癥兔血清TNF-a的影響(i土s，n=6:與模型組比*/><0.05，**尸<0.01)圖7組合物對內(nèi)毒素血癥兔血清IL-6的影響(±s，n=6，與模型組比*P<0.05，**尸<0.01)具體實(shí)施方式實(shí)施例l本實(shí)施例公開了異穿心蓮內(nèi)酯及含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、穿心蓮磺化物E、穿心蓮酸、穿心蓮內(nèi)酯的組合物的制備方法(1)穿心蓮內(nèi)酯總磺化物的制備(參照中國專利，專利授權(quán)號CNU62420C):取無水乙醇1000mL置反應(yīng)器中，緩慢滴加濃硫酸1000mL，攪勻，加入1000g穿心蓮內(nèi)酯，攪拌均勻后于室溫下放置72h。置水浴中加入乙醇1000mL，攪勻，調(diào)pH至7.0,加入乙醇，至含醇量達(dá)80%，靜置24h，加入少量活性炭，過濾，濾液回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥即得穿心蓮內(nèi)酯的總磺化物。(2)穿心蓮內(nèi)酯總磺化物經(jīng)柱色譜分離制備含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物取穿心蓮內(nèi)酯總磺化物50g，加水50mL使完全溶解，過濾，樣品液上預(yù)先處理好的ODS柱，先后用2倍柱體積的水和1.5倍柱體積的30%~35%甲醇水溶液水溶液進(jìn)行洗脫，繼續(xù)用1.5倍柱體積的30°/。~35%甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，并收集這部分的流出液，減壓回收醇后冷凍干燥即得。組合物的HPLC色譜圖見附圖l(PhenomenexlurmC18色譜柱(250x4.6mm，5nm)，柱溫3(TC，檢測波長225nm;流動(dòng)相A:乙腈-異丙醇1:2(v/v)，流動(dòng)相B:水(含0.2%磷酸)，流動(dòng)相流動(dòng)相A-流動(dòng)相B25:75(v/v)，流速lmL/min)。附圖1中保留時(shí)間8.17min、10.35min、11.67min、15.23min的色譜峰所對應(yīng)的化合物分別為異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E、穿心蓮酸和穿心蓮內(nèi)酯。該組合物經(jīng)制備型HPLC迸一步進(jìn)行分離，得異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的單體化合物。色譜條件為,.phenomenxlunaC18-ODS制備型色譜柱(250x21.2mm，5fim)，流動(dòng)相為乙腈-異丙醇-水8:16:76,流速8mL/min，檢測波長225nm。(3)異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)化學(xué)中文名稱14-去氧-8(R)-l2(S)-8(12)-環(huán)氧-穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯英文名稱14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxyandrographolide-19-sulfonate無色針晶(甲醇)，易溶于甲醇、水，微溶于丙酮，不溶于乙醚、乙酸乙酯。分子式C2QH3()08S，分子量430。ESI-MS:m/z429[M-Hr，m.p.202-203。C。IRma/Brcra":3462(OH),1748，1642(C=C-C<))，1227,985,824.雨R(MeOD)S:1.07(3H,s,H陽20),1.13(3H，s,H-17),1.21(3H,s,H-18),I.62(1H,m,H-9)，2.06(lH,m，H-ll),2.40(lH,dd，乒7.8，13.7Hz，H-11)，3.26(1H,ddJ:4.2,II.6Hz,H-3),4.15(1H，d,/=10.4Hz,H-19)，4.27(1H,d,J^10.4Hz,H-19),4.65(1H，m,H國12)，4.85(2H,brs，H-15)，7.43(1H,t，^1.6Hz,H-14).13CNMR(MeOD)S:16.57(C-20)，20.01(C-6),23.64(C-18),28.03(C-2)，31.93(C-17)，33.79(C-11)，36.99(010),40.82(C-1)，43.35(C-4)，53.83(C-5),37.35(C-7),59.58(C-9),70.40(C-19),72.36(C-15),74.26(C-12),80.18(C-3)，84.25(C-8),138.43(C-13),146.56(C-14),175.06(C-16).(4)異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的結(jié)構(gòu)鑒定該化合物的Kedde試劑反應(yīng)顯陽性，表明其中含有不飽和內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。ESI-MS顯示該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為w/z429([M-H]+)，結(jié)合^NMR和l3CNMR數(shù)據(jù)，推測化合物的分子式為C2CH3C)08S，為穿心蓮內(nèi)酯磺化物E的一種異構(gòu)體。iHNMR譜顯示有一個(gè)烯氫質(zhì)子信號S7.43(IH，t，J-1.6Hz，H-14);三個(gè)甲基質(zhì)子信號，分別在51.07,1.13及1.21;—對連氧亞甲基質(zhì)子信號54.85(2H,m,H-15)，一對連氧碳上的偕質(zhì)子信號54.15(1H,d,戶10.4Hz,H-19)和4.27(1H，d,40.4Hz,H-19;)，2個(gè)位于低場區(qū)的連氧次甲基質(zhì)子信號S3.26(lH，dd,J=4.2,11.6Hz,H-3)和4.65(1H,m，H-12);另外還有一組亞甲基上的偕質(zhì)子信號2.06(1H,m,H-ll)和2.40(1H,dd,^7.8，13.7Hz,H-11)，兩個(gè)質(zhì)子為典型的AB耦合系統(tǒng)，提示該亞甲基與手性中心相連。BC-NMR譜共給出20個(gè)碳原子的共振信號，結(jié)合DEPT及HSQC譜信息顯示，其中含i個(gè)內(nèi)酯羰基碳信號5175.06(s,C-16)、1對烯碳信號5138.43(s，C-13)，146.56(d,C-14)、3個(gè)甲基信號S31.93(C-17),23.64(C-18)，16.57(C-20)和5個(gè)連氧碳信號584.25(s,C-8),80.18(d，C-3),74.26(d,C-12)，72.36(t，C-15)及70.40(t，C-19)。進(jìn)一步與磺化物E的13C-NMR數(shù)據(jù)對照，其烯碳信號5129.08(s，C-13)和甲基碳信號S19.82(C-17)分別向低場位移10ppm至S138.43(s，C-13)，S31.93(C-17)處，并增加了連氧季碳信號S84.25(C-8)和連氧次甲基碳信號S74.26(d,C-12)，同時(shí)C-14的連氧次甲基碳信號566.70及A^間的兩個(gè)烯鍵季碳信號S130.26(C-8),137.98(C-9)消失。據(jù)此推測，磺化物E的C-14羥基脫水形成么12'13雙鍵，然后在雙鍵A8，9、厶12'13上發(fā)生水的加成反應(yīng)，C-8、C-12上的-OH進(jìn)一步脫水形成五員呋喃環(huán)，最終轉(zhuǎn)化為異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯。進(jìn)一步通過'H」HCOSY及HMBC譜可對13C-NMR和'H-NMR信號進(jìn)行歸屬。在化合物的C-8、C-12間形成了環(huán)氧結(jié)構(gòu)，從而使C-8、C-9和C-12成為手性碳。為進(jìn)一步確定該化合物的相對構(gòu)型，.進(jìn)一步進(jìn)行了NOESY譜分析。圖譜顯示其主要的相關(guān)峰有H-3/H18、H陽3/H-5、H-5/H國9和H-9/H-17，表明H-3，H-5,H-9和C-4位及C-8上連接的甲化合物中中主要的noesy基位于環(huán)的同一側(cè)；H-12/H-20、H-20/H-I9有相關(guān)峰，表明H-12與H-19及C-10上連接的甲基同在環(huán)的另一側(cè)。根據(jù)以上信息，并結(jié)合母體化合物穿心蓮內(nèi)酯的立體構(gòu)型，可以推斷磺化物Z的C-8和C-12分別為/構(gòu)型和S構(gòu)型，同時(shí)B/C環(huán)是順式稠合，命名14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)-環(huán)氧-穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯。文獻(xiàn)(SwapanPramanick.AndropanolideandIsoandrographolide，MinorDiterpenoidsfromAndrographispaniculata:StructureandX-rayCrystallographicAnalysisJ.Nat.Prod.2006,69,403-405)和專利(唐春山，葉文才、胡永美，楊小玲.中國專利，CN1290838C，2005.)分別報(bào)道了異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的母體化合物異穿心蓮內(nèi)酯及其8(》-型立體異構(gòu)體的。CNMR數(shù)據(jù)。與母體化合物異穿心蓮內(nèi)酯相比，磺化物Z的SC-19向高場位移近6ppm，其他各碳的化學(xué)位移變化小于4ppm，表明硫酸酯化確實(shí)發(fā)生在C-19位的羥基上。進(jìn)一步8(。-型立體異構(gòu)體進(jìn)行對照，磺化物.Z的SC-5，C-6,C-7均向高場區(qū)位移3-4ppm，C-ll、C-12向低場區(qū)位移約4ppm，而C-17的化學(xué)位移值變化較大，向低場區(qū)位移約10ppm，其它各碳信號化學(xué)位移值差異不大。這一結(jié)果表明，構(gòu)型對C-17位甲基碳的化學(xué)位移有著顯著的影響，也提示兩個(gè)化合物在C-17位甲基構(gòu)型上的差異。異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯與相關(guān)化合物的13C-NMR化學(xué)位移對照No.異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯異穿心蓮內(nèi)酯1118(5)-異構(gòu)體21磺化物E121140.8236.639.536.6428.0327.827.928.46380.1881.280.079.80443.3542.943.543.3353.8353.157.953.52620.0118.623.021.0637.3539.441.435.62884.2583.183.5130.26959.5858.459.5137.981036.9936.037.139.911133.7933.329.729.031274.2673.591.9149.5813138.43138.8137.2129.0814146.56143.7148.566.701572.3671.072.476.1316175.06173.1174.9172.731731.9332.021.619.821823.6423.223.323.301970.4064.671.070.752016.5716.815.520.35InCDC13，125MHz.SwapanPramanick.AndropanolideandIsoandrographolide，MinorDiterpenoidsfromXwcfrograptopcro'cw/ato:StructureandX-rayCrystallographicAnalysis■/Ato.尸mi2006,狄403-405.[2]InCD3OD,75MHz.唐春山，葉文才，胡永美，楊小玲.中國專利，CN1290838C，2005.實(shí)施例2異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯按實(shí)施例1方法制備，稱取lg，用葡萄糖等滲溶液約800mL溶解，加0.1%活性炭攪拌10分鐘，濾過，加葡萄糖等滲溶液至lOOOmL，濾過，用10。/。氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5-6.5，灌封(大容量注射液，規(guī)格為50mL/瓶、100mL/瓶、250mL/瓶、500mL/瓶)，于IO(TC滅菌30分鐘，經(jīng)澄明度檢查，包裝即得。10實(shí)施例3組合物按實(shí)施例l制備，稱取組合物25g,加注射用水600mL，攪拌溶解，加入25g甘露醇，攪拌溶解后，加注射用水至1000mL，混勻，用0.22pm微孔濾膜過濾，所得溶液分裝于7mL西林瓶中，每瓶2mL，蓋塞，放入凍干機(jī)中，按照設(shè)計(jì)的凍干曲線進(jìn)行冷凍干燥，得組合物凍干粉針(每支50mg)。實(shí)施例4組合物按實(shí)施例1制備，稱取組合物25g，用注射用水約800mL溶解，加0.1%活性炭攪拌IO分鐘，濾過，加注射用水至1000mL，濾過，，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5-6.5，濾過，濾液灌裝于10mL玻瓶中，于100'C滅菌30分鐘，經(jīng)澄明度檢査，包裝即得。試驗(yàn)例1:本試驗(yàn)例考察了異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯組合物溶解度按中國藥典(2005版)一部凡例中關(guān)于溶解度的試驗(yàn)法操作。穿心蓮內(nèi)酯由江西青峰藥業(yè)提供，異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯組合物按實(shí)施例1制備。分別稱取研成細(xì)粉的異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯組合物，置于25ml25:t2'C的水溶液中，每隔5分鐘強(qiáng)有力振搖30秒鐘，觀察30分鐘內(nèi)的溶解情況，如無目視可見的溶質(zhì)顆粒時(shí)，即視為完全溶解。測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)論異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物在水中的溶解度均大于500mg/ml。試驗(yàn)例21.試驗(yàn)?zāi)康臏y定異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物經(jīng)靜脈一次給藥小鼠的急性反應(yīng)和死亡情況。2.試驗(yàn)材料2.1試驗(yàn)藥物異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸.酯、含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物，按實(shí)施例1制備。使用前用生理鹽水配成濃度100mg/mL的溶液。穿心蓮內(nèi)酯總磺化物，根據(jù)中國專利CN1162420C制備2.2受試動(dòng)物ICR小鼠，體重18g20g，雌雄各半。3.試驗(yàn)條件給藥前后，實(shí)驗(yàn)小鼠雌雄分籠，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20i2'C，濕度45%-65%。4.試驗(yàn)方法及結(jié)果4.1方法取ICR小鼠80只，體重18-20g，雌雄各半，隨機(jī)均分為4組，每組20只。分別為對照組(生理鹽水，25ml/kg)、異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯組(2500mg/kg)、含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物組(2500mg/kg)、總磺化物組(2500mg/kg)。各組分別一次給小鼠尾靜脈注射相應(yīng)受試物25mL/kg。連續(xù)觀察兩周，記錄受試小鼠的行為、活動(dòng)、攝食量、體重、糞便、死亡等情況，對瀕死及死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行大體解剖，未死亡小鼠于兩周后處死進(jìn)行尸檢。4.2試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3個(gè)給藥組靜脈一次給藥后，當(dāng)天見其毛色光滑，活動(dòng)、攝食、糞便色澤及質(zhì)地正常，與對照組比較無明顯差異；且兩周內(nèi)無死亡及其他異?，F(xiàn)象發(fā)生；兩組同時(shí)處死后進(jìn)行尸檢，各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)經(jīng)肉眼觀察未見異常改變，與對照組比較無明顯差別。4.3試驗(yàn)結(jié)論經(jīng)靜脈一次給藥的最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果表明給藥后均無明顯的毒性反應(yīng)，兩周內(nèi)亦無死亡。試驗(yàn)例31.材料U藥物異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯的組合物，按實(shí)施例1制備。使用前用生理鹽水配制。穿心蓮內(nèi)酯總磺化物，根據(jù)中國專利CN1162420C制備。1.2動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，體重22-25g;清潔級新西蘭兔，體重2.5-3.0kg，均雌雄兼用，合格證號SYXK(魯)20030020。1.3試劑內(nèi)毒素(LPS),co//.Serotype0111:B4，Sigma，批號034K4105;2，4-二硝基苯酚，上?；瘜W(xué)試劑廠，批號20030312;營養(yǎng)瓊脂，中國藥品生物制品檢定所；地塞米松磷酸鈉注射液，泗水希爾康藥業(yè)有限公司，批號0403121;TNF-a、IL-6試劑盒，晶美生物工程有限公司(進(jìn)口分裝)。1.4菌株金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌，均由煙臺大學(xué)藥學(xué)院提供。1.5主要儀器酶標(biāo)儀，SynergyHT多功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司。1.6試驗(yàn)環(huán)境溫度25±3。C，濕度45%-65%。2.實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)論2.1對內(nèi)毒素引起的家兔體溫升高的抑制作用實(shí)驗(yàn)前兩天每日測家兔體溫1次，挑選體溫在38.0-39.5°C，且自身體溫變化小于0.3。C的新西蘭兔30只，2.5-3.0kg，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組6只。一組于左耳緣靜脈注射生理鹽水；二組于左耳緣靜脈注射異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、三組至五組分別于左耳緣靜脈注射組合物，高劑量300mg/kg，中劑量150mg/kg，低劑量75mg/kg。各組注射容積均為5mL/kg。于給藥前測量一次體溫作零時(shí)基礎(chǔ)體溫，給藥后立即于兔右耳緣靜脈注射內(nèi)毒素200EU/kg，測量給藥后lh,2h,3h,4h，6h時(shí)的體溫。結(jié)果見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.1.2結(jié)果顯示異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯150mg/kg、組合物300mg/kg及150mg/kg對內(nèi)毒素所致的新西蘭兔發(fā)熱均有良好的解熱作用，75mg/kg的解熱作用不明顯。2.2異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響取昆明種小白鼠80只，隨機(jī)分為8組。模型組、異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯高劑量組(50mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)、低劑量組(12.5mg/kg)、總磺化物高劑量組(50mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)、低劑量組(12.5mg/kg)、地塞米松陽性對照組(2mg/kg)。各組連續(xù)給藥三天，末次給藥后40min，將50)il二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面致炎，左耳不涂作為對照，致炎后lh脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9mm的打孔器分別在同一部位打下耳片，即時(shí)稱重，計(jì)算各組腫脹度及抑制率。腫脹度(rag)=左耳耳片重(mg)—右耳耳片重(mg)抑制率(％)=(模型組平均耳片重一給藥組平均耳片重)/模型組平均耳片重X100%2.結(jié)果對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(x土s，n二10)組別劑量(mg/kg)腫脹度(mg)抑制率(％)正常對照組-9.52±2.80-12.54.89±2.70*48.6異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯253.68±2.84**61.3503.11±1.09**67.312.59.17±2.493.7總磺化物258.41±2.8711.7506.97±2.8426.8地塞米松組0.252.75±2.89***71.1注與模型組比較*代0.05，**代0.01,^^代0.001。結(jié)論與模型組比較，異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯3個(gè)劑量可顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，同等劑量下而總磺化物卻無抑制作用。2.3對炎癥因子釋放的影響新西蘭兔36只，2.5-3.0kg，雌雄各半，隨機(jī)分為6組模型對照組，地塞米松組、生理鹽水對照組和組合物5、10、20mg/kg劑iri組，每組6只，耳緣靜脈給藥。模型組ivLPS2mg/kg，其余各組先ivLPS2mg/kg后立即iv緩慢注入相應(yīng)劑量的藥物或空白溶媒，給藥體積均為2ml/kg體重。給藥前(0h)及給藥后1、2、4、6、12h分別從耳中央動(dòng)脈采血，每次采血lml，釆血后補(bǔ)充等體積生理鹽水。分離血清用于細(xì)胞因子IL-6和TNF-a的測定。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。內(nèi)毒素血癥時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生過多的炎癥細(xì)胞因子是造成組織損傷的主要原因之一，其中最主要的是TNF-a和IL-6。由上圖可見，LPS攻擊兔后，模型組血清TNF-a和IL-6迅速升高，2h達(dá)峰值，TNF-a隨后迅速降低，6h已明顯降低，而IL-6降低緩慢，至6h還處于較高水平，至12h才降至較低水平。與模型組比，組合物能顯著降低TNF-a和IL-6的水平，并呈劑量依賴性，說明組合物能夠抑制內(nèi)毒素引起的炎性細(xì)胞因子TNF-a和IL-6的分泌。2.4抗菌作用用生理鹽水將組合物配成2%的注射液，微孔濾膜過濾除菌后作初始濃度，再用生理鹽水減半稀釋至1/2，1/4，1/8，1/16，1/32濃度。用注射用生理鹽水將注射用炎琥寧配制成2%注射液，過濾除菌后作初始濃度，再用生理鹽水減半稀釋至1/2，1/4,1/8，1/16,1/32濃度，分別吸取lmL于無菌試管內(nèi)，加入9mL營養(yǎng)瓊脂搖勻，接種細(xì)菌后于37'C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,觀察并記錄結(jié)果見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯及組合物具有較強(qiáng)的抗菌作用。2.5體外抗病毒作用2.5.1試藥將異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯制成濃度為10mg/mL的溶液。在使用時(shí)，將溶液用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度備用。2.5.2培養(yǎng)基在擴(kuò)增MDCK(來源于狗腎)、MA-104(來源于猴腎)與HEp-2細(xì)胞(來源于人咽癌)時(shí)使用10%胎牛血清E'-MEM。使用MDCK細(xì)胞作為流感病毒的宿主細(xì)胞，MA-104細(xì)胞用作輪狀病毒的宿主細(xì)胞，HEp-2細(xì)胞用作RS病毒的宿主細(xì)胞。2.5.3試驗(yàn)方法1)對流感病毒的作用將MDCK細(xì)胞平板接種在6孔平板上，密度為5xl05細(xì)胞/孔，在5%二氧化碳的條件下在35'C下培養(yǎng)過夜。將流感病毒(A/PR/8/34毒株)用無血清培養(yǎng)基稀釋至200PFU/mL，按0.5mL/孔的比率進(jìn)行感染和吸附達(dá)1小時(shí)。感染和吸附完成后，加入E'-MEM培養(yǎng)基，其中含有預(yù)定濃度的試藥以及0.6%高貴瓊脂、1%牛血清白蛋白和3ug/mL乙酰化胰蛋白酶。充分凝結(jié)后，將平板倒置，繼續(xù)培養(yǎng)3天。培養(yǎng)完成后，將存活細(xì)胞用1%中性紅染色，將細(xì)胞用10%福爾馬林固定，借助流水除去瓊脂培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)噬斑的數(shù)量。根據(jù)處理組和未處理組的噬斑數(shù)量計(jì)算對輪狀病毒的抑制率。2)對輪狀病毒的作用將MA-104細(xì)胞接種在6孔板上，密度為5xl()S細(xì)胞/孔，在5%二氧化碳的條件下在37'C下培養(yǎng)過夜。將用10ug/mL乙?；鹊鞍酌富罨胄r(shí)的輪狀病毒(Ku毒株)用無血清培養(yǎng)液稀釋至140PFU/mL，按0.5mL/孔的比率進(jìn)行感染和吸附達(dá)1小時(shí)。感染和吸附完成后，除去感染培養(yǎng)基，加入E'-MEM培養(yǎng)基，其中含有30ug/mL供試物、5ug/mL胰蛋白酶和1.4%瓊脂糖。在5%0)2的條件下，將感染有輪狀病毒的MA-104細(xì)胞在37'C下培養(yǎng)3天，然后疊加含有0.005%中性紅的0.7%瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)一天。培養(yǎng)完成后，將供試平板用3%甲醛溶液固定，除去用瓊脂固化的供試培養(yǎng)基，然后計(jì)數(shù)噬斑的數(shù)量。根據(jù)處理組和未處理組的噬斑數(shù)量計(jì)算對輪狀病毒的抑制率。3)對RS病毒(呼吸合胞體病毒)的作用將HEp-2細(xì)胞散播在6孔平板上，密度為5405細(xì)胞/孔，在5。/。二氧化碳的條件下在37'C下培養(yǎng)過夜。將RS病毒(A-2毒株)用無血清培養(yǎng)基稀釋至140PFU/mL，按0.5mL/孔的比率進(jìn)行感染和吸附達(dá)l小時(shí)。感染和吸附完成后，除去感染培養(yǎng)基，加入E'-MEM培養(yǎng)基，其中含有30ug/mL供試物、0.12%谷氨酰胺、2%胎牛血清和1%甲基纖維素。在5%0)2的條件下，將感染有RS病毒的HEp-2細(xì)胞在35'C下培養(yǎng)3天，培養(yǎng)完成后，將供試平板用3%甲醛溶液固定，除去含有甲基纖維素的供試培養(yǎng)基，然后將供試平板用5%Giemza溶液染色，計(jì)數(shù)噬斑的數(shù)量。根據(jù)處理組和未處理組的噬斑數(shù)量計(jì)算組合物對RS病毒的抑制率。2.5.4結(jié)果在lug/mL的組合物濃度下，以噬斑抑制率表示的抗流感病毒、輪狀病毒及RS病毒的活性分別為100%、93%和95%，表明異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯是良好的抗病毒劑。2.6體外抗腫瘤作用2.6.1實(shí)驗(yàn)材料異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯、含異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯組合物按實(shí)施例1制備。RPMI1640培養(yǎng)基GIBCO公司生產(chǎn)。新生牛血清(超級)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生產(chǎn)批號000523。胰蛋白酶，Sigma公司生產(chǎn)。MTT，Sigma公司。注射用鏈霉素，山東瑞陽制藥有限公司，lg(IOO萬單位)/支，批號200105101。注射用青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，80萬單位/支，批號L020318。其它常用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、人前列腺癌細(xì)胞株Bel-7402、人卵巢癌細(xì)胞株H0891(K人肺腺癌細(xì)胞株A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、人食管癌細(xì)胞株CaEs-17、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室。儀器C02培養(yǎng)箱(Forma3110,USA),超凈工作臺(BCN-1360,哈爾濱東聯(lián))，酶標(biāo)儀(BioRad550，USA)，倒置顯微鏡(Nikon),細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Costar,USA),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，USA)。2.5.2實(shí)驗(yàn)方法藥物及試劑配制RPMI1640培養(yǎng)基一袋加水1L，補(bǔ)加2g碳酸氫鈉，10萬單位青霉素和100mg鏈霉素，調(diào)節(jié)pH值至7.4,用0.22nm除菌濾膜過濾除菌。450mL培養(yǎng)基加滅活新生牛血清50mL即為完全培養(yǎng)液。胰蛋白酶用D-hanks緩沖液配成0.25%溶液，過濾除菌后4'C保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取待測樣品10.0mg，加到滅菌的0.5mL離心管中，加入DMSO100nL，配成100mg/mL原液，-4(TC冷凍保存。臨用前融化后取適量以完全培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)及傳代細(xì)胞均貼壁培養(yǎng)于含10mL完全培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37'C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后用滅菌D-hanks液洗兩次，加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2分鐘，倒掉胰蛋白酶，待輕搖細(xì)胞能完全脫落后，加完全培養(yǎng)液30mL后，用移液管吹散細(xì)胞，分裝于3個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。藥物處理取剛剛長成完整單層的細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，用移液管吹打均勻，取兩滴細(xì)胞懸液臺酚藍(lán)染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目(死細(xì)胞數(shù)目不得超過5%),用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至lxl()S個(gè)細(xì)胞/毫升。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入10(HiL細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，取出培養(yǎng)板后于每孔中補(bǔ)加10(HiL含不同濃度等測樣品的完全培養(yǎng)液，使得藥物終濃度分別為43.0、21.5、8.6、4.3、2.15、1.08、0.54和0.27pg/mL，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，另設(shè)4孔細(xì)胞加入不含藥完全培養(yǎng)液作正常對照孔。加完藥后培養(yǎng)板于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。取出培養(yǎng)板，每孔加入5mg/mL的MTi;液10nL，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄去每孔中培養(yǎng)液，加150i!L的DMSO溶解formazan結(jié)晶，振蕩使完全溶解。于BIO-TEK酶標(biāo)儀測定各孔光吸收，測定波長570nm，參考波長630nm。根據(jù)各孔OD值計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率和對腫瘤細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1、下述通式(I)所表示的化合物及其鉀鹽、鈉鹽或銨鹽，化學(xué)名稱為14-去氧-8(R)-12(S)-8(12)環(huán)氧穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯；英文名稱為14-deoxy-8(R)-12(S)-8(12)-epoxyandrographolide-19-sulfonate；簡稱異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯；R可以為H、Na、K或NH4。2、一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所示的化合物、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E(化學(xué)名稱3，14，19-三羥基-8(9)，12(13)-賴百當(dāng)二烯-15,16-內(nèi)酯-19-硫酸酯)、穿心蓮酸及穿心蓮內(nèi)酯，其重量比例為10%~30%:30%~75%:5%~30%:5%~30%，四種成分的總含量占組合物的重量比例^90%。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于異穿心蓮內(nèi)酯-19-硫酸酯與穿心蓮內(nèi)酯磺化物E占組合物的重量比例^50%。4、一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述的化合物、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E、穿心蓮酸及穿心蓮內(nèi)酯，其特征在于四種成分的色譜歸一化百分含量比例為'10%~30%:40%~75%:5%~15%:5%~15%。所采用的色譜分析條件如下色譜柱反相C18色譜柱，5^m，250x4.6mm;流動(dòng)相A:乙腈-異丙醇l:2(v/v)流動(dòng)相B:水(含0.2%磷酸)流動(dòng)相流動(dòng)相A-流動(dòng)相B25%:75%(v/v);流速lmL/min柱溫30°C;檢測波長225nm。5、權(quán)利要求2的組合物或權(quán)利要求4的組合物，其制備方法包括以下步驟(1)將濃硫酸與無水乙醇混合，加入穿心蓮內(nèi)酯單體粉末，充分?jǐn)嚢瑁覝胤胖茫?2)放置24小時(shí)后，加入氫氧化鈉水溶液調(diào)pH值6—8;(3)加入乙醇溶液，攪拌過濾，濾渣以乙醇溶液洗滌；(4)回收乙醇溶液得水溶液，過濾得濾液；(5)濾液通過柱色譜，以O(shè)DS反相硅膠為固定相，以乙醇水或甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，回收溶劑，常規(guī)冷凍干燥或減壓干燥得組合物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物制備方法，其特征在于，步驟(1)中的濃硫酸與無水乙醇的體積比為h1，穿心蓮內(nèi)酯與無水乙醇的比例為1:1(重量g:體積ml)。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物制備方法，其特征在于，歩驟(2)中使用的是20%—50%的氫氧化鈉水溶液。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物制備方法，其特征在于，步驟(3)中使用的是90%—95%的乙醇溶液。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物制備方法，其特征在于，步驟(5)中使用的是30—35%的乙醇水或甲醇水溶液。10、權(quán)利要求1所述的化合物、權(quán)利要求2所述的組合物或權(quán)利要求4所述的組合物在制備抗炎、拮抗炎癥因子、抗菌、解熱、抗病毒和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。11、一種藥物組合物，由權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2所述的組合物或權(quán)利要求4所述的組合物與藥學(xué)上可接受載體組成。12、權(quán)利要求11所述的組合物，由權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2所述的組合物或權(quán)利要求4所述的組合物與注射用水組成。13、權(quán)利要求11所述的組合物，由權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2所述的組合物或權(quán)利要求4所述的組合物與甘露醇或其他凍干粉針輔料組成。14、權(quán)利要求11所述的組合物，由權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求2所述的組合物或權(quán)利要求4所述的組合物與口服制劑輔料組成。全文摘要本發(fā)明公開了如通式(I)所表示的化合物及其鉀鹽、鈉鹽或銨鹽，還公開了包含通式(I)化合物、穿心蓮內(nèi)酯磺化物E、穿心蓮酸及穿心蓮內(nèi)酯的藥物組合物，以及它們的制備方法。利用該方法獲得的化合物和組合物有較好的拮抗炎癥因子、抗菌、解熱、抗腫瘤的作用。本發(fā)明還公開了使用上述化合物和組合物制備的口服或注射劑型。文檔編號A61P31/00GK101560198SQ20081001556公開日2009年10月21日申請日期2008年4月19日優(yōu)先權(quán)日2008年4月19日發(fā)明者于翠翠,付穎穎,珂劉,劉軍鋒,李景源,翟大偉,卉許,萌邵,鄒曉麗申請人:山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司