專利名稱：：一種長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑及其制備方法。技術(shù)背景長春花生物堿類抗腫瘤藥物為夾竹桃科植物長春花中提取的一種有抗癌活性的生物堿。主要抑制微管蛋白聚合，而妨礙紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止于中期。也可作用于細(xì)胞膜，干擾細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，使蛋白質(zhì)合成受抑制，亦可抑制RNA合成。長春花生物堿類抗腫瘤藥物的抗瘤譜較廣，臨床上廣泛用于治療各種癌癥，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、頭頸部癌及多種其他實(shí)體瘤。這類抗腫瘤藥物主要包括長春堿(Vinblastine,VLB)，長春新堿(Vincristine,VCR)和長春地辛(Vindesine，VDS)。然而，臨床上廣泛采用長春花生物堿類抗腫瘤藥物的生理鹽水溶液或葡萄糖注射液缺乏對腫瘤組織的選擇性，臨床上表現(xiàn)為惡心、嘔吐、脫發(fā)和血管刺激性。此外，其可促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，對腫瘤耐藥細(xì)胞的敏感性下降。長春花生物堿類抗腫瘤藥物的毒副作用嚴(yán)重限制了其長期重復(fù)用于腫瘤的治療。改變長春花生物堿類抗腫瘤藥物的組織分布和提高其對腫瘤組織的選擇性可顯著降低毒性。長春花生物堿類抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體制劑可降低藥物毒副作用，增加藥物在腫瘤組織的分布，從而減輕劑量依賴的急性毒性。但是長春花生物堿類抗腫瘤藥物脂質(zhì)體也存在諸多缺點(diǎn)。如藥物被包封在內(nèi)水相，很快從脂質(zhì)體中釋放出來，導(dǎo)致制劑不穩(wěn)定；通常藥物經(jīng)脂質(zhì)體包裹后細(xì)胞毒作用較游離的藥物弱；此外，脂質(zhì)體的制備過程復(fù)雜，需要多種脂質(zhì)成分的復(fù)合(至少兩種脂質(zhì)成分)，粒徑控制需要特殊的設(shè)備和裝置，且儲存過程中易絮凝等，因此不利于推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑，它是一種動力學(xué)穩(wěn)定體系，具有良好的穩(wěn)定性，并在體內(nèi)具有靶向作用，能增加藥物在腫瘤組織的分布，可以躲避腫瘤細(xì)胞膜上耐藥蛋白的識別，從而提高療效，降低毒性。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑，其粒徑在10150nm之間，各原料及其質(zhì)量百分比為長春花生物堿類抗腫瘤藥物0.1%5%載體0.5%3%穩(wěn)定劑0.5%3%pH為2的鹽酸溶液89%98.9%上述原料的質(zhì)量百分比之和為100%。所述的長春花生物堿類抗腫瘤藥物是長春堿(Vinblastine,VLB)、長春新堿(Vincristine,VCR)和長春地辛(Vindesine，VDS)中的一種。所述的載體為醫(yī)用級別的氰基丙烯酸正丁酯，其具有人體可親和性、器官靶向性、生物可降解性、緩釋性和無毒等特點(diǎn)。所用穩(wěn)定劑為醫(yī)用級別的右旋糖苷，分子量為70000。本發(fā)明長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑的優(yōu)選方案為，其粒徑在60100nm之間，各原料及其質(zhì)量百分比為長春花生物堿類抗腫瘤藥物0.5%2.5%載體1.0%2.5%穩(wěn)定劑1.0%2.5%pH為2的鹽酸溶液91.0%96.0%上述原料的質(zhì)量百分比之和為100°/。。本發(fā)明還一個目的是提供上述長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑的制備方法，具體包括下列步驟1)準(zhǔn)確稱取長春花生物堿類抗腫瘤藥物、載體、穩(wěn)定劑、pH為2的鹽酸溶液，備用；2)將所述量的右旋糖苷加入到pH值為2的鹽酸溶液中，完全溶解后加入所述量的長春花生物堿類抗腫瘤藥物，邊攪拌邊加入氰基丙烯酸正丁酯；3)恒溫磁力攪拌8h，轉(zhuǎn)速為600rpm;4)用O.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。將步驟4)所制得溶液用0.45um微孔濾膜過濾后于凍干溫度為-4(TC-7(TC條件下進(jìn)行冷凍干燥，制備成凍干粉劑。本發(fā)明選用的載體氰基丙烯酸丁酯屬于氰基丙烯酸垸基酯類，在體內(nèi)降解慢、耐受性好，降解產(chǎn)物為聚氰基丙烯酸，它不儲存于組織而從尿中排泄，是臨床應(yīng)用中具有前景的納米材料。右旋糖苷70000是一種安全的天然表面活性劑，在制備納米粒的過程中，作為穩(wěn)定劑加入右旋糖苷70000，當(dāng)其吸附在兩相界面上時，可引起界面張力降低，并形成立體位阻，使形成的納米粒之間不易聚集，穩(wěn)定性好，粒徑分布較窄。因此，本發(fā)明選用氰基丙烯酸丁酯為載體，右旋糖苷70000為穩(wěn)定劑。長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑是由氰基丙烯酸正丁酯在pH值為2的酸性介質(zhì)中通過乳化聚合作用形成納米級粒子，并將長春花生物堿類抗腫瘤藥物包裹于其中。本發(fā)明的長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑，凍干后溶解于生理鹽水溶液中，可瘤內(nèi)注射、瘤周注射劑或靜脈注射，對人及動物的頭頸部腫瘤、食道癌、肝癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和鼻咽癌有極好的療效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明長春花生物堿類抗腫瘤藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑，粒徑較窄、粒子之間分散性好，無粘連。2.制備方法具有快速簡便、成本低、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且制備過程中不用有機(jī)溶劑，不存在有機(jī)溶劑殘留問題。3.納米粒作為藥物載體協(xié)助長春花生物堿類抗腫瘤藥物跨過細(xì)胞膜，且可躲避耐藥腫瘤細(xì)胞膜上耐藥蛋白的識別，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度升高，這樣大大提高了藥物的利用率，藥效增加。4.腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的吞噬性，腫瘤組織血管的通透性也較大，所以，靜脈途徑給予的納米粒子可在靜脈內(nèi)輸送，從而提高療效，減少給藥劑量和毒性反應(yīng)。圖l本發(fā)明長春堿納米粒透射電鏡圖；圖2A正常C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HE染色圖；圖2B長春堿生理鹽水溶液作用48h后的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HE染色圖；圖2C長春堿納米粒作用48h后的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HE染色圖；圖2D正常BT325神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光染色圖；圖2E.長春堿生理鹽水溶液作用48h后的BT325神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光染色圖；圖2F.長春堿納米粒作用48h后的BT325神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光染色圖。具體實(shí)施方式以下通制備方法實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限由此范圍。實(shí)施例1精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入100mg長春堿VLB，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例2精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入20mg長春新堿，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春新堿納米粒溶液。實(shí)施例3精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入20mg長春堿，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6,0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例4精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入lg長春堿VLB，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例5精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入lg長春新堿，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春新堿納米粒溶液。實(shí)施例6精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入500mg長春地辛VDS，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例7精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入500mg長春新堿，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春新堿納米粒溶液。實(shí)施例8精密稱取0.4g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入100mg長春堿，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.4mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例9精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入0.2g長春堿VLB、0.5g長春新堿VCR和0.3g長春地辛VDS，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例10精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入0.5g長春堿VLB、0.6g長春新堿VCR和0.2g長春地辛VDS，在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。實(shí)施例11精密稱取0.2g右旋糖苷，用0.01moL/L的鹽酸溶液20mL完全溶解后加入0.3g長春堿VLB、0.4g長春新堿VCR和0.7g長春地辛VDS,在600rpm的磁力攪拌下，緩慢滴加0.2mL氰基丙烯酸丁酯，室溫下攪拌8h后，用0.1MNaOH調(diào)pH至6.0終止反應(yīng)，此時產(chǎn)生的淡藍(lán)色溶液即為長春堿納米粒溶液。以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明的長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒粒徑大小測定本發(fā)明經(jīng)透射電鏡及馬爾文粒度分析儀檢測得平均粒徑為74.4nm，且粒度均勻，大部分粒徑在60nm150nm之間，分散性好，無粘連，具體見附圖1(長春堿聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的透射電鏡照片X10萬倍)。試驗(yàn)例2本發(fā)明的長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒溫度穩(wěn)定性測定將適量制備好的長春花生物堿類抗腫瘤藥物聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒裝入棕色玻璃瓶中，密封，置于4。C冰箱、室溫25。C和37。C三種溫度條件下留樣考察30d，每隔5d取樣觀察。結(jié)果表明，該長春花生物堿類抗腫瘤藥物聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒在此三種溫度條件下均保持膠體溶液，未見分層、渾濁和結(jié)晶析出的現(xiàn)象，溫度穩(wěn)定性好。試驗(yàn)例3本發(fā)明長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑對大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的影響選擇對數(shù)生長期的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl()S/mL，接種于96孔板(每孔200^L)，于37'C、5%C02條件下培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，分別更換為含不同濃度(5ng/mL、50ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL、50000ng/mL)的VLB生理鹽水溶液(I組)及VLB載藥納米粒溶液(n組)的培養(yǎng)基。48h后更換為無血清培養(yǎng)基，每孔加新配制的5mg/mLMTT液20(iL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔中上清液，每孔加入DMSO150pL溶解甲簪沉淀，用微型超聲震蕩器震蕩搖勻10min,使紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測定490nm波長下的吸光值。同時設(shè)調(diào)零孔(加入200^iL完全培養(yǎng)基，不含細(xì)胞)和空白對照孔(加入20(^L完全培養(yǎng)基)，每組濃度設(shè)3個平行孔，結(jié)果取其平均值。與長春花生物堿類抗腫瘤藥物的生理鹽水溶液組類抗腫瘤藥物的聚氰基丙烯酸正丁酯納米?？梢燥@著提高藥物對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率(p<0.05)。表1VLB-PBCA-NP對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*表示與同一藥物濃度的1組比較，差異顯著(p<0.05)試驗(yàn)例4本發(fā)明長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的影響選擇對數(shù)生長期的BT325神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化后用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為lxl05/mL，接種于96孔板(每孔200jiL)后，分組及作用方式、檢測方法同實(shí)施例1。表2VLB-PBCA-NP對BT325神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*表示與同一藥物濃度的I組比較，差異顯著(p<0.05)試驗(yàn)例5長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米粒制劑對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)影響1.HE染色觀察藥物對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)影響待細(xì)胞爬片長滿培養(yǎng)皿底壁80%以上時，加入不同處理組(正常組、空白納米粒組、VLB生理鹽水組及VLB載藥納米粒組)的藥物作用48h后，按照HE染色的程序進(jìn)行染色。正常的C6細(xì)胞核漿比倒置，突起明顯，呈典型的成纖維樣生長，細(xì)胞之間界限清晰，活力旺盛(附圖2A)，VLB生理鹽水溶液作用后的細(xì)胞有部分發(fā)生凋亡(附圖2B)，而同樣濃度的VLB-PBCA-NP作用后的細(xì)胞則明顯發(fā)生凋亡，細(xì)胞核深染，邊緣皺縮，突起消失，細(xì)胞數(shù)量減少(附圖2C)。2.熒光染色觀察藥物對BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底壁80%以上時，加入不同處理組(正常組、空白納米粒組、VLB生理鹽水組及VLB載藥納米粒組)的藥物作用48h后，用10嗎/mL的Hoechst33342避光5XC02條件下染色10min,棄上清液，以磷酸鹽緩沖液洗滌一次，倒置熒光顯微鏡下觀察。正常BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈梭形，核形態(tài)飽滿，核質(zhì)著色淺，密度均勻一致，兩端突起明顯，呈典型成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞之間界限清晰，折光率高，活力旺盛(附圖2D)。VLB生理鹽水處理后，部分細(xì)胞皺縮為圓形、折光率減弱(附圖2E)。VLB-PBCA-NP組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞間距變大，貼壁能力下降，多數(shù)脫落漂浮于培養(yǎng)液中，大多數(shù)細(xì)胞皺縮變圓，兩端突起消失，為典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)(附圖2F)。權(quán)利要求1、一種長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑，特征是，其粒徑在10～150nm之間，各原料及其質(zhì)量百分比為長春花生物堿類抗腫瘤藥物0.1％～5％載體0.5％～3％穩(wěn)定劑0.5％～3％pH為2的鹽酸溶液89％～98.9％上述原料的質(zhì)量百分比之和為100％；所述的長春花生物堿類抗腫瘤藥物是長春堿VLB、長春新堿VCR和長春地辛VDS中的一種或多種混合物；所述載體是醫(yī)用級別的氰基丙烯酸正丁酯；所述所穩(wěn)定劑是醫(yī)用級別的右旋糖苷，分子量為70000。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑，特征是，其粒徑在60100nm之間，各原料及其質(zhì)量百分比為長春花生物堿類抗腫瘤藥物0.5%2.5%載體1.0%2.5%穩(wěn)定劑1.0%2.5%pH為2的鹽酸溶液91.0%96.0%上述原料的質(zhì)量百分比之和為100%。3、制備權(quán)利要求1所述的長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑的方法，其特征是，具體包括下列步驟1)準(zhǔn)確稱取長春花生物堿類抗腫瘤藥物、載體、穩(wěn)定劑、pH為2的鹽酸溶液，備用；2)將所述量的右旋糖苷加入到pH值為2的鹽酸溶液中，完全溶解后加入所述量的長春花生物堿類抗腫瘤藥物，邊攪拌邊加入氰基丙烯酸正丁酯；3)恒溫磁力攪拌8h，轉(zhuǎn)速為600rpm;4)用O.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0。全文摘要本發(fā)明公開了一種長春花生物堿類抗腫瘤藥物納米粒制劑，其粒徑在10～150nm之間，各原料及其質(zhì)量百分比為長春花生物堿類抗腫瘤藥物0.1％～5％、載體0.5％～3％、穩(wěn)定劑0.5％～3％、pH為2的鹽酸溶液89％～98.9％，上述原料的質(zhì)量百分比之和為100％。該抗腫瘤制劑可有效增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的敏感性，降低藥物毒性。本發(fā)明制備方法具有快速簡便、成本低、可操作性強(qiáng)、粒徑分布較窄等優(yōu)點(diǎn)，且制備過程中不用有機(jī)溶劑，不存在有機(jī)溶劑殘留問題。文檔編號A61K31/475GK101259099SQ20081001738公開日2008年9月10日申請日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者劉玉梅,歐陽五慶申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)