專利名稱：：垂盆草醇提物的醫(yī)藥應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中草藥提取物的醫(yī)藥應(yīng)用，尤其涉及一種垂盆草醇提物的醫(yī)藥應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又名臥莖景天、鼠牙半枝、瓜子草、佛指甲、石指甲、入藥始載于《百草鏡》。系景天科多年生肉質(zhì)草木植物。垂盆草是歷版《中國藥典》收載的常用中藥之一。垂盆草是一種重要的藥用植物資源，在夏、秋二季采收，除去雜質(zhì)，其新鮮或干燥全草入藥，具有清熱解毒、利尿消腫、排膿生肌之效，用于濕熱黃疽，丹毒潰瘍，小便不利，癰腫瘡瘍，急、慢性肝炎的治療，并且具有較好的保肝護(hù)肝、免疫抑制、雌激素作用、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用及抑菌等功效[潘金火，中國藥業(yè)，16:365—366(2002);KimWH,etal.JNutrSciVitaminol,50:100-105(2004);OhH，etal.BiolPharmBull.，27:2035-2037(2004)]，是具有廣闊前景的藥用植物。民間用垂盆草治療急性肝炎有特殊功效，單味垂盆草一般服用15天即可治愈，在治療時表現(xiàn)的作用是退黃、降酶，肝腫改善，肝區(qū)隱痛消失，小便轉(zhuǎn)為正常。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，垂盆草能有效抑制炎性滲出，減少肝細(xì)胞損傷，明顯降低谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，降酶作用迅速而持久[郭佳等，上海醫(yī)藥雜志，11:47(1991)]，這與史書記載的該藥有"清熱解毒、消腫"之效完全吻合。垂盆草的主要成分為垂盆草苷、甾醇類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、某些糖類物質(zhì)及生物堿類物質(zhì)等(何愛民等，中草藥，28:517—522(1997);何愛民等，中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，28:271—274(1997);HeAimin,etal.Phytochemistry,49:2607-2610(1998)]。研究表明，黃酮類化合物通過清除超氧陰離子和羥自由基抑制脂質(zhì)過氧化的起始，是清除氧自由基的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是促進(jìn)疲勞恢復(fù)，增加機(jī)體運(yùn)動能力的有效成分。垂盆草在臨床上已廣泛應(yīng)用于治療咽喉腫痛、熱淋水火燙傷、蛇蟲咬傷及各種急慢性活動性肝炎，但對于垂盆草醇提物抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供垂盆草醇提物的新的醫(yī)藥應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明的垂盆草醇提物按如下方法制備得到將垂盆草干草用95%乙醇提取23次，乙醇用量為10毫升/(克干草*次)，合并提取液，濃縮，提取物濃縮液采用石油醚萃取去除脂類，石油醚用量為2毫升/克干草，揮去石油醚，再用甲醇溶解，甲醇用量為0.2毫升/克干草，減壓蒸干。通過上述制備方法制得的垂盆草提取物中總黃酮含量為430%，甾醇含量為3.520%，垂盆草苷含量為0.410%，三萜類0.210%。垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響實(shí)驗(yàn)表明，200pg/ml垂盆草醇提物在作用24小時后即對肝癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，而在作用72小時后各劑量組醇提物均對肝癌細(xì)胞有非常顯著的抑制作用。說明垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，且有一定的劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，垂盆草醇提物可使肝癌細(xì)胞阻滯于靜止(G0/G1)期，從而抑制了細(xì)胞的分裂增殖，具有顯著的抗腫瘤活性。通過考察免疫細(xì)胞化學(xué)檢測垂盆草醇提物對HepG2VEGF和c-myc的表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)垂盆草醇提物可顯著抑制二者的表達(dá)，尤其對VEGF有非常顯著的抑制作用。由此說明，垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞有抑制作用。此外，通過考察RT-PCR法檢測垂盆草醇提物對HepG2VEGF和c-myc的mRNA水平的影響，發(fā)現(xiàn)醇提物可顯著抑制VEGF、c-myc的mRNA水平，進(jìn)一步證實(shí)垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞有抑制作用。綜上研究，垂盆草醇提物可用于制備抗肝癌藥物。有益效果本發(fā)明對垂盆草醇提物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。垂盆草醇提物具有顯著的抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從RNA和蛋白水平抑制腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，可作為抗肝癌藥物。圖1為垂盆草醇提物作用HepG2細(xì)胞48h后對其細(xì)胞周期的影響。A為藥物終濃度為0pg/ml時HepG2的細(xì)胞周期分布；B為藥物終濃度為50pg/ml時H印G2細(xì)胞周期變化；C為藥物終濃度為100ng/ml時HepG2細(xì)胞周期變化；D為藥物終濃度為200^g/ml時HepG2細(xì)胞周期變化。隨藥物濃度增大，細(xì)胞阻滯于靜止期的數(shù)量逐漸增多。圖2為垂盆草醇提物對HepG2細(xì)胞VEGF、c-myc表達(dá)的影響。A、B、C、D、E分別為藥終濃度O，25，50，100，200^g/ml時VEGF的表達(dá)；F、G、H、I、J分別為藥終濃度O，25，50，100，200嗎/ml時c-myc的表達(dá)。隨藥物濃度增大，VEGF、c-myc表達(dá)量逐漸下降。圖3為垂盆草乙醇提物對HepG2細(xì)胞的VEGF和c-myc的mRNA水平影響的電泳分析圖。隨藥物濃度增大，VEGF和c-mycmRNA水平顯著下調(diào)。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:垂盆草醇提物的制備垂盆草千草500g，于95n/。的乙醇5000mL中浸泡5天，紗布過濾，收集藥液。重復(fù)2次，合并藥液，離心取上清，所得上清液經(jīng)減壓蒸發(fā)揮去溶劑，用石油醚1000mL萃取去除脂類，揮去石油醚，再用100mL甲醇溶解，減壓蒸干、干燥得醇提物。實(shí)施例2:醇提物對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用醇提物經(jīng)DMSO溶解并用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，使DMSO終濃度為0.1%，經(jīng)無菌濾器除菌備用。人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10X小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于37°C、5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整細(xì)胞濃度為口104個/ml，接種于96孔板，lOO^d/孔，4小時貼壁后，加入醇提物使終濃度分別為25,50,100,200lig/ml的，另設(shè)陰性對照組(RPMI1640培養(yǎng)基)和0.1%DMSO溶劑對照組，每組設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時，MTT法檢測增殖結(jié)果。各劑量組對HepG2的作用結(jié)果見表l。結(jié)果顯示，200jag/ml醇提物在作用24小時后即對肝癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，而在作用72小時后各劑量組醇提物均對肝癌細(xì)胞有非常顯著的抑制作用。說明垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，且有一定的劑量依賴關(guān)系。表1垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響(pg/ml)24h48h72h一50.3397±0.0308~0.5167±0.03560.8394±0.0261250.3138±0.02570.5108±0.03150.7455±0.0208***500.3104±0.00870.5080±0.01700.6823±0.0256***1000.3010±0.00380.4976±0.03120.6764士0.0609"5152000.2978±0.0205*0.4458±0.0452*0.6738±0.0368****p<0.05,***p<0.001,與對照組相比較實(shí)施例3:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分別收集對照組和醇提物各劑量作用48h后的HepG2細(xì)胞lxl06個，PI染色，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果見附圖l。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，醇提物可使肝癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制了它的增殖活性。實(shí)施例4:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以5xl(^個/ml細(xì)胞濃度接種到放有蓋玻片的六孔板中，4h貼壁后將藥物以不同濃度加入其中。培養(yǎng)48h后取出蓋玻片。PBS清洗標(biāo)本2次，80%丙醇4°<:固定，染色步驟嚴(yán)格按SABC，DAB試劑盒說明書操作。檢領(lǐng)!lVEGF和c-Myc蛋白表達(dá)。同時設(shè)對照組。染色結(jié)果以細(xì)胞漿或核膜出現(xiàn)棕黃色髙出背景的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。未經(jīng)醇提物作用的對照組VEGF(圖2，A)和c-myc(圖2，F(xiàn))有很強(qiáng)的陽性表達(dá)。在25，50，100和200ng/ml醇提物作用48小時后肝癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)水平依濃度遞增呈非常顯著下降(圖2，B，C，D，E);c-myc表達(dá)也有明顯的下降(圖2，G，H，I，J)。計(jì)算每組的陽性細(xì)胞率。分析結(jié)果見表2。醇提物可顯著抑制二者的表達(dá)。由此說明，垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)有顯著的抑制作用。表2垂盆草醇提物對HepG2VEGF和c一myc蛋白表達(dá)水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*p<0.05，***p<0.001,與對照組相較實(shí)施例5:RT-PCR檢測VEGF、c-myc的mRNA水平的改變實(shí)驗(yàn)組和對照組HepG2細(xì)胞分別用Biozol試劑提取RNA，依照提取試劑盒步驟操作后得到白色沉淀，加入in/。。DEPC水3(^l至RNA完全溶解。紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度。取各組總RNA各2昭分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以P-actin為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量RT-PCR。先在94。C預(yù)變性5min，然后分別為94。C變性30s，58。C退火40s，72。C延伸30s，共30個循環(huán)，最后72'C延伸7min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。醇提物對肝癌細(xì)胞VEGF、c-myc表達(dá)強(qiáng)度的影響見表3和圖3。醇提物可顯著抑制VEGF、c-myc的mRNA水平。進(jìn)一步證實(shí)垂盆草醇提物對肝癌細(xì)胞有抑制作用。表3垂盆草醇提物對HepG2VEGF和c-myc的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種垂盆草醇提物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的垂盆草醇提物按如下方法制備得到將垂盆草干草用95%乙醇提取23次，乙醇用量為10毫升/(克干草*次)，合并提取液，濃縮，提取物濃縮液采用石油醚萃取去除脂類，石油醚用量為2毫升/克干草，揮去石油醚，再用甲醇溶解，甲醇用量為0.2毫升/克干草，減壓蒸干。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于垂盆草醇提物在抑制肝癌細(xì)胞的增殖中的應(yīng)用。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于垂盆草醇提物在肝癌細(xì)胞阻滯于靜止期，抑制細(xì)胞的分裂增殖中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于垂盆草醇提物在降低腫瘤相關(guān)基因的VEGF和c-myc的蛋白表達(dá)水平，從蛋白質(zhì)水平抑制肝癌細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于垂盆草醇提物在降低腫瘤相關(guān)基因的VEGF和c-myc的mRNA水平，從轉(zhuǎn)錄水平抑制肝癌細(xì)胞的增殖中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及垂盆草醇提物的新用途，即在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對垂盆草醇提物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。垂盆草醇提物具有顯著的抑制肝癌細(xì)胞的增殖，調(diào)控細(xì)胞周期，從RNA和蛋白水平抑制腫瘤相關(guān)基因表達(dá)，可用于制備抗腫瘤藥物。文檔編號A61K36/41GK101229214SQ200810019200公開日2008年7月30日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日發(fā)明者煜孫,張偉云,曹麗麗,沈文斌,邱水晴,陳維霞,鵑黃,黃丹丹申請人:南京大學(xué)