專利名稱：：微波促進(jìn)固相合成胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。技術(shù)背景糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前,全球約有2億糖尿病患者,預(yù)計(jì)到2025年將增加至3億。2007年，中國(guó)有3000萬(wàn)糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2030年,我國(guó)糖尿病患者人數(shù)將突破5000萬(wàn)，中國(guó)已經(jīng)成為僅次于印度的糖尿病第二大國(guó)，其中2型糖尿病約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%。現(xiàn)在治療2型糖尿病最有效的方法是注射胰島素。在臨床上采用胰島素強(qiáng)化治療的方法來(lái)延緩糖尿病進(jìn)程，胰島素治療在降低血糖的同時(shí)可以一定程度上逆轉(zhuǎn)胰島y5-細(xì)胞功能損害。但是使用胰島素會(huì)出現(xiàn)低血糖的危險(xiǎn)。受到劑量大小、注射部位、注射途徑、個(gè)體差異或注射后未進(jìn)食等因素的影響，如果使用胰島素稍有不慎，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的低血糖副作用。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)是一種葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖，這種葡萄糖依賴性的促胰島素分泌特性，避免了糖尿病治療中常存在的產(chǎn)生低血糖癥的危險(xiǎn)，這些生理功能使開(kāi)發(fā)GLP-l作為一種2型糖尿病治療藥物具有廣闊的前景。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞所分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，在體內(nèi)有多種存在形式。胰高血糖素原基因位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，在胰腺和腸道L細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，生成由160個(gè)氨基酸組成的胰高血糖素原(proglucagon,PG)。胰高血糖素原在胰腺和腸道中裂解后轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物不同。PG在腸道中主要裂解為腸高血糖素(Glicentin:PG169)，腸高血糖素分子繼續(xù)裂解為GRPP(PG130)和胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin:PG3369);插入肽-2(IP-2:PG111~123);胰高血糖素樣肽-2(GLP-2:PG126158);和GLP-l(l37)-OH(PG72~108)。GLP-1(137)-OH是無(wú)活性的肽鏈,需酶解切除N端6肽，成為具有生理活性的GLP-l(737)-OH,其C末端甘氨酸可以作為酰胺化酶的底物，因此GLP-l(7~37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1(7~36)-NH2,氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2;GLP-l(7~37)-OH的氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG陽(yáng)COOH。GLP-1(736)-NH2是人體內(nèi)GLP-1主要的天然形式，約占80%,其促進(jìn)胰島素分泌的作用在GLP-1肽中最強(qiáng)。另外GLP-1(737)-OH約占20%，兩者具有相同的生理功能。GLP-1通過(guò)作用于胰島A-細(xì)胞膜上的受體GLP-1受體(GLP-1R)，促進(jìn)胰島素的分泌。GLP-1R在胰腺^-細(xì)胞膜上高度表達(dá),是由463個(gè)氨基酸組成,屬于七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體家族，與GLP-1高度特異性結(jié)合。GLP-1與其受體結(jié)合后可以增加胰島細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶的活性，刺激細(xì)胞內(nèi)的第二信使cAMP的增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜K+通道關(guān)閉,細(xì)胞去極化，誘發(fā)電壓依賴性的Ca^通道開(kāi)放，細(xì)胞外Ca^內(nèi)流，細(xì)胞槳Ca^濃度升高觸發(fā)胰島素的釋放。此外cAMP水平升高,又激活cAMP依賴的蛋白激酶A和磷酸化酶,進(jìn)而剌激^細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，刺激^細(xì)胞的增值和分化。胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)具有多種生物學(xué)效應(yīng)。如下1、具有血糖依賴性的腸促胰島素分泌作用；2、阻止胰腺"-細(xì)胞退化，刺激》-細(xì)胞的增值和分化；3、誘導(dǎo)前胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)前胰島素的生物合成；4、增加胰島素的敏感性；5、增加生長(zhǎng)抑素分泌，抑制胰高血糖素的產(chǎn)生(此作用也是血糖依賴性)；6、抑制胃酸分泌，延遲胃排空；7、通過(guò)作用于丘腦下部的中樞抑制食欲，降低食物攝取量等作用。然而，雖然天然GLP-1在治療糖尿病上有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但它在體內(nèi)卻會(huì)被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV,DPPIV)快速降解[6]。二肽基肽酶IV可特異性識(shí)別GLP-1N末端第二位丙氨酸Ala殘基，從肽鏈N末端第2位丙氨酸(Ala)處切除二肽，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的形式，其體內(nèi)半衰期僅5分鐘左右。GLP-1分子N端是與GLP-1受體的結(jié)合部位，其組氨酸殘基喪失，導(dǎo)致GLP-1完全失去生物活性。所以這需要我們對(duì)天然GLP-1進(jìn)行改造，以期望尋找到能夠抵抗DPP-IV，生物半衰期長(zhǎng)的GLP-1類似物。多肽可以通過(guò)基因工程的方法或者化學(xué)合成的方法得到?；蚬こ痰姆椒ㄔ讷@取長(zhǎng)肽(氨基酸殘基長(zhǎng)度大于50)或蛋白質(zhì)上比化學(xué)方法有優(yōu)勢(shì)，但是多肽的化學(xué)合成方法尤其是在固相合成策略出現(xiàn)后，在制備氨基酸殘基長(zhǎng)度小于40的多肽或小肽上有基因工程方法難以比擬的靈活性、多樣性和高效性等。1963年Merrifield創(chuàng)立并開(kāi)發(fā)了固相合成多肽的方法。固相多肽合成一般有兩種策略即Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略和Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，Merrifield創(chuàng)立的固相合成法即為Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略。但是，Boc/Bzl正交保護(hù)固相合成策略中存在一些缺點(diǎn)，如副反應(yīng)多、條件苛刻以及在延長(zhǎng)肽鏈的過(guò)程中多肽鏈會(huì)從固相上丟失等。而隨后出現(xiàn)的Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略則反應(yīng)條件溫和的多。當(dāng)近年來(lái)微波技術(shù)運(yùn)用于多肽的固相合成中后，使多肽的合成技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)飛躍。微波促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)是由于其使極性分子在微波場(chǎng)中快速旋轉(zhuǎn)，使得一些反應(yīng)速率較常規(guī)加熱方法快10到IOOO倍，而且產(chǎn)率大大提高。1986年Gedye等人首次報(bào)道了將微波應(yīng)用于有機(jī)合成中，微波可以促進(jìn)許多化學(xué)反應(yīng)，如Diels-Alder反應(yīng)，皂化反應(yīng)等，可以顯著地加快反應(yīng)速率并提高收率。在1992年，Hui-mingYu等首先報(bào)道了將微波應(yīng)用于多肽固相合成領(lǐng)域中，他們完成了?；d體蛋白片斷十肽(acylcarrierprotein,ACP65~74)的合成。如何高效的合成長(zhǎng)肽(大于30肽)在世界上仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槎嚯碾S著肽鏈的增加，其合成難度成倍增加。用傳統(tǒng)的固相方法合成長(zhǎng)肽，其收率往往很低雜質(zhì)較多純化困難，從而從實(shí)用的角度上說(shuō)失去了合成的意義。其次合成周期長(zhǎng)，在中間不出現(xiàn)困難肽序的情況下30肽一般需要近一個(gè)星期時(shí)間才能完成合成周期，如果出現(xiàn)困難肽序，往往就無(wú)法合成得到目標(biāo)多肽。而使用微波促進(jìn)固相合成多肽，可以克服困難肽序，合成傳統(tǒng)固相方法無(wú)法得到的多肽，而且合成時(shí)間大大縮短，且顯著提高多肽粗品純度及收率，使得產(chǎn)品的純化大大方便，只要經(jīng)過(guò)一次制備型HPLC就能得到純度較高的產(chǎn)品；此外還可以非常方便的用D型氨基酸及非天然氨基酸等對(duì)多肽進(jìn)行定點(diǎn)修飾，去尋找活性更高、生物半衰期更長(zhǎng)的多肽，這更是基因工程技術(shù)無(wú)法做到的。因此，我們?cè)贕LP-1類似物的合成中采用此種方法快速高效的合成得到GLP-1系列類似物。
發(fā)明內(nèi)容胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)是葡萄糖依賴性的促胰島素分泌腸降血糖多肽激素，其有治療糖尿病的優(yōu)點(diǎn)突出，但是其生物半率期短。本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)其易被二肽基肽酶W(dipeptidylp印tidaseIV，DPPIV)及體內(nèi)其它活性酶(如中性肽鏈內(nèi)切酶neutralendopeptidase24.11水解)的缺點(diǎn)，將其易被水解部位的氨基酸用其它氨基酸或非天然氨基酸替換，以期望達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的效果，合成了一類GLP-1衍生物。其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式His-Xaa廠Xaa2-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp隱Xaa3-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa4-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa5-Phe-Ile-AIa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa6(SEQ.IDNO:1)Xaa!:Asp,Asn,Arg,Lys,His,Glu,Gln，Trp，Phe,Tyr，Met,D-Gly,D-VaL，D-Leu，D-Ile,D-Ser,D-ThrXaa2:Glu,ProXaa3:Val,LeuXaa4:Gly,Glu，Gln，Trp,Phe，Tyr，Met,D-Gly，D-VaL，D-Leu,D-Ile，D-Ser，D-Glu，D-Gln,D隱Trp，D-MetXaa5:Glu,LeuXaa6:Gly,-NH2本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了GLP-1衍生物的固相制備方法，本發(fā)明采用微波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略高效快速地合成得到系列GLP-1類似物。其特征在于采用微波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂，茚三酮法檢測(cè)為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基得到載有第一個(gè)氨基酸殘基的樹(shù)脂；再進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護(hù)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù)的步驟，依次延長(zhǎng)所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹(shù)脂，最后用裂解劑將多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相色譜純化，凍干得多肽純品。載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂的制備方法，其特征是通過(guò)在微波照射條件下Fmoc保護(hù)氨基酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂所使用的固相載體是Rink樹(shù)脂、Wang樹(shù)脂或2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂?；罨瘎┦嵌h(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N，N"-羰基二咪哇(CDI)、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酉旨(HBTU)或使用的l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)、l-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-l,2,3-苯并三嗪-4(3印-酮(^008丁)。有機(jī)堿為三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA);微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間為515min。Fmoc保護(hù)基的脫除是通過(guò)使用含有O.lmol.U1的l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的六氫吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基吡咯垸酮(NMP)為反應(yīng)溶劑。微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間為110min。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.提出的一種GLP-1類似物可以在保留降糖活性的基礎(chǔ)上,提高GLP-1的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)作用時(shí)間。具有抗DPPIV等酶解作用，生物半率期較GLP-1原型長(zhǎng)。2.微波促進(jìn)固相合成GLP-1類似物大大的提高了偶合反應(yīng)速率，常規(guī)固相合成方法充分偶合一個(gè)氨基酸到樹(shù)脂上去，往往需要2小時(shí)到20小時(shí)不等，甚至更長(zhǎng)。而微波促進(jìn)則平均只需要10分鐘左右；常規(guī)固相合成方法脫Fmoc保護(hù)基，往往需要30分鐘到1小時(shí)不等，而微波促進(jìn)則平均只需要5分鐘左右，這極大的提高了多肽合成的效率，縮短了合成周期。3.微波促進(jìn)固相合成GLP-1類似物合成得到的粗品的純度大于60%,較常規(guī)固相合成方法大大提高，這方便了后續(xù)的純化工作，只需要經(jīng)過(guò)一次制備液相純化，凍干即可得到目標(biāo)純品。4.微波促進(jìn)固相方法合成GLP-1類似物，其成本低，由于偶合效率較高，所需要保護(hù)氨基酸平均只需要2倍過(guò)量，較常規(guī)固相合成方法需要4到5倍過(guò)量大為降低。5.微波促進(jìn)固相合成GLP-1類似物方法易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、大規(guī)模化，這使其更適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此用本發(fā)明提供的微波促進(jìn)固相合成技術(shù)制備的GLP-1類似物，收率高、合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)。制備得到的GLP-1類似物，比天然GLP-1更加穩(wěn)定，適合作為治療糖尿病藥物的活性成分。上文對(duì)本發(fā)明做了一般性描述，下面附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。其中圖1顯示的是GLP-1(7~36)-NH2與DPPIV溫孵0h和4h的HPLC分析譜圖；圖2顯示的是GLP-1(7~36)-NH2與人血漿溫孵Oh和4h的HPLC分析譜圖；圖3顯示的是改造后的D-Gly8-GLP-(7~36)-NH2與DPPIV溫孵Oh和4h的HPLC分析譜圖；圖4顯示的是改造后的D-Gly8-GLP-(7~36)-NH2與人血漿溫孵Oh和4h的HPLC分析譜圖；具體實(shí)施方式在本說(shuō)明書全文中采用以下縮寫Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基嗎啉；DIEA:N,N'-二異丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺；DMSO:二甲亞砜；DCM:二氯甲垸；FmOC:N-9芴甲氧羰基；DIC:N，N'-二異丙基碳二亞胺；CDI:N,N，-羰基二咪唑；DMAP:4-二甲氨基吡啶；HOSU:N-羥基琥珀酰亞胺；EDC.HChl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU:苯并三氮唑-N，N,N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU:6-氯苯并三氮唑-l,l,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT:l-羥基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT:l-羥基-苯并三氮唑；PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-l-基-氧基三吡咯垸基磷；HPLC:高效液相色譜；ESI-MS:電噴霧質(zhì)譜；Gly:甘氨酸；Ser:絲氨酸；Ala:丙氨酸；Thr:蘇氨酸；Val:纈氨酸；lie:異亮氨酸；Leu:亮氨酸；Tyr:酪氨酸；Phe:苯丙氨酸；His:組氨酸；Pro:脯氨酸；Asp:天門冬氨酸；Met:蛋氨酸；Gill:谷氨酸；Trp:色氨酸；LyS:賴氨酸；Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺；Gin:谷氨酰胺。本發(fā)明是通過(guò)下列實(shí)施列來(lái)進(jìn)行說(shuō)明的，但這些實(shí)施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。實(shí)施例1His-DiSll-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:2)的微波促進(jìn)固相合成(1)樹(shù)脂的溶脹稱取Fmoc-rinkamide-MBHAResin50mg(取代量0.4mmol/g)，經(jīng)7mLDCM溶脹30min,抽濾去DCM，再用10mLNMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM，NMP7mL沖洗干凈。(2)微波促進(jìn)Fm0C保護(hù)基的脫除將溶脹好的樹(shù)脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0.1MHOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)1min，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在5(TC以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含O.lMHOBT的25%哌淀/NMP(V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(TC，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的樹(shù)脂。(3)微波促進(jìn)Fmoc-Arg(Pbf)-rinkamide-MBHAResin的合成將Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)禾口DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹(shù)脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50'C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹(shù)脂3次。(4)偶合效率的檢測(cè)用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測(cè)樹(shù)脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下一個(gè)偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹(shù)脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml0.001MKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于IO(TC加熱5分鐘，如果樹(shù)脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。溴酚蘭法取少量樹(shù)脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1%的溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹(shù)脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。(5)肽鏈的延長(zhǎng)按照D-Gly8-GLP-(736)-NH2的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時(shí)間520min不等。得到連有D-Gly8-GLP-(7~36)-NH2的樹(shù)脂。將上述得到的連有D-Gly8-GLP-(7~36)-NH2的樹(shù)脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑RegeantK(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT,82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0。C下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。最終得到D-Glys-GLP-(736)-NH2粗品63.2mg，收率為94.3%。(7)D-Gly8-GLP-(7~36)-NH2粗品的純化將上面得到的D-GlyrGLP-(736)-NH2粗品，溶于少量的水中，用島津制備型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340mmx28mm，5pm);流動(dòng)相A:0.1%TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B:0.1%TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B20%65%,40min;流速為6mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。收集的溶液凍干得純品，最終得到純品29.7mg。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1095.5，[M+4H]4+821.9，[M+5H]5+657.8;calu[M+3H]3+1095.5，[M+4H]4+821.9，[M+5H]5+657.7。理論相對(duì)分子質(zhì)量為3283.6，實(shí)際相對(duì)分子量為3283.6。實(shí)施例228根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例228的多肽，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。實(shí)施例2His-Asn陽(yáng)Glu陽(yáng)Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv陽(yáng)Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:3);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3340.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1114.5，[M+4H]4+836.1，[M+5H]5+669.1;calu[M+3H]3+1114.6，[M+4H]4+836.3，[M+5H]5+669.1。實(shí)施例3His-Trp-Glu-Glv-Thr國(guó)Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr國(guó)Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-He-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:4);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3412.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1138.6，[M+4H]4+854.2，[M+5H]5+683.6;calu[M+3H]3+1138.6，[M+4H]4+854.2，[M+5H]5+683.6。實(shí)施例4His-Tvr-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:5);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3389.8。ESI-MSm/z:foundcalu[M+3H]3+1130.8，[M+4H]4+848.4，[M+5H]5+679.0;calu[M+3H]3+1130.9，[M+4H廣848.5,[M+5Hf+679.0。實(shí)施例5His-幽-Glu-Gly陽(yáng)Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys陽(yáng)Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:6);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3357.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1120.2，[M+4H]4+840.4，[M+5H]5+672.5;calu[M+3H]3+1120.3;[M+4H]4+840.5，[M+5H]5+672.6。實(shí)施例6His-Siii-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr國(guó)Leu-Glu陽(yáng)Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:7);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3355.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1119.3，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.2;calu[M+3H]3+1119.6，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.1。實(shí)施例7His-D-Val-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:8);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3325.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1109.8，[M+4H]4+832.4，[M+5H]5+665.9;calu[M+3H]3+1109.6，[M+4H]4+832.4，[M+5H]5+666.1。實(shí)施例8His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe陽(yáng)Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln國(guó)Ala陽(yáng)Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:9);論相對(duì)分子質(zhì)量為3339.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1114.2,[M+4H]4+836.0,[M+5H〗5+668.8;calu[M+3H]3+1114.3，[M+4H]4+835.9，[M+5H]5+669.0。實(shí)施例9His-D-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Ast>Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:10);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3313.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1105.5，[M+4H]4+829.5，[M+5H]5+663.7;calu[M+3H]3+1105.6，[M+4H]4+829.4，[M+5H]5+663.7。實(shí)施例10His-D-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Ast)-Val-Ser陽(yáng)Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala隱Lys-Glu-Phe國(guó)Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:11);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3339.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1114,2，[M+4H]4+836.0，[M+5H]5+668.8;calu[M+3H]3+1114.3，[M+4H]4+835.9，[M+5H]5+669.0。實(shí)施例11His-D-Thr陽(yáng)Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser國(guó)Ser-Tvr國(guó)Leu-Glu隱Glv-Gln-Ala陽(yáng)Ala-Lvs國(guó)Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:12);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3327.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.8;calu[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.9，[M+5H]5+666.5。實(shí)施例12His隱Ser-Pro-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser陽(yáng)Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:13);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3281.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1095.0，[M+4H]4+821.5，[M+5H]5+657.5;calu[M+3H]3+1094.9，[M+4H]4+821.4，[M+5H〗5+657.3。實(shí)施例13His-Val-Pro-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala隱Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:14);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3293.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1098.9，[M+4H〗4+824.5;calu[M+3H〗3+1098.9，[M+4H]4+824.4。實(shí)施例14His-Leu-Pro-Glv-Thr陽(yáng)Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala隱Lys-Glu國(guó)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:15);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3307,8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1103.8，[M+4H]4+828.0，[M+4H+Na]5+667.0;calu[M+3H]3+1103.6，[M+4H]4+827.9，[M+4H+Na]5+667.0。實(shí)施例15His-Glv陽(yáng)Pro-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu陽(yáng)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:16);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3251.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1084.8，[M+4H]4+813.8，[M+5H]5+651.2;calu[M+3H]3+1084.9，[M+4H]4+813.9，[M+5H]5+651.3。實(shí)施例16His誦Glv-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser國(guó)Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:17);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3297.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1100.3,[M+4H]4+825.3，[M+5H]5+660.7;calu[M+3H]3+1100.2，[M+4H]4+825.4，[M+5H]5+660.5。實(shí)施例17His-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr陽(yáng)Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu國(guó)Gly-Gln-Ala陽(yáng)Ala-Lys-Glu陽(yáng)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:18);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3327.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.8,[M+5H]5+666.6;calu[M+3H]3+1110.2，[M+4H]4+832.9，[M+5H]5+666.5。實(shí)施例18His-Thr-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:19);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3341.7。ESI-MSm/z:calu[M+3H]3+1115.1，[M+4H]4+836.5，[M+5H]5+669.4;calu[M+3H]3+1114.9，[M+4H]4+836.4，[M+5H]5+669.3。實(shí)施例19His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe陽(yáng)Thr-Ser陽(yáng)Asp-Leu-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu曙Glv-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu國(guó)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:20);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3353.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+672.0;calu[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+671.8。實(shí)施例20His-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser陽(yáng)Asp-Val-Ser國(guó)Ser-Tvr陽(yáng)Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Leu國(guó)Phe國(guó)Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:21);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3297.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1100.2，[M+4H]4+825.4，[M+4H+Na]5+665.0;calu[M+3H]3+1100.3，[M+4H]4+825.5，[M+4H+Na]5+665.0。實(shí)施例21His-Ile-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp陽(yáng)Leu-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu陽(yáng)Phe陽(yáng)Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:22);。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+672.0;calu[M+3H]3+1118.9，[M+4H]4+839.5，[M+5H]5+671.8。實(shí)施例22His-Leu-Glu陽(yáng)Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser陽(yáng)Ser-Tyr-Leu-Glu墨Gly-Gln-Ala-Ala-Lvs-Leu陽(yáng)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:23);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3323.8。ESI-MSm/z:found[M+3H〗3+1108.9，[M+4H]4+831.9，[M+5H]5+666.0;calu[M+3H]3+1108.9，[M+4H]4+832.0，[M+5H]5+665.8。實(shí)施例23His-Glv-Glu-Gly-Thr-Phe陽(yáng)Thr-Ser-Asp-Val-Ser國(guó)Ser-Tyr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala國(guó)Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:24);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3267.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1090.2，[M+4H]4+817.9，[M+5H]5+654.5;calu[M+3H]3+1090.2，[M+4H]4+817.9，[M+5Hf十654.5。實(shí)施例24His-Ehe-Glu-Gly陽(yáng)Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser陽(yáng)Tyr-Leu-Glu-filii-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu隱Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:25);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3345.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1149.4，[M+4H]4+862.4;calu[M+3H]3+1149.6，[M+4H]4+862.5。實(shí)施例25His-Ik-Glu陽(yáng)Gly-Thr國(guó)Phe-Thr-Ser陽(yáng)Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu陽(yáng)Glu-Sla-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:26);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3411.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1138.2，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4;calu[M+3H]3+1138.3，[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4。實(shí)施例26His陽(yáng)M-Glu-Gly-Thr陽(yáng)Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-幽-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:27);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3397.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1133.5，[M+4H]4+850.5，[M+5H]5+680.5;calu[M+3H]3+1133.6，[M+4H]4+850.4，[M+5H]5+680.6。實(shí)施例27His-Lvs陽(yáng)Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser隱Asp-Val-Ser國(guó)Ser-Tvr-Leu國(guó)Glu-Glu-Gln國(guó)Ala陽(yáng)Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:28);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3426.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1143.2，[M+4H]4+857.7，[M+5H]5+686.6;calu[M+3H]3+1143.3，[M+4H]4+857.7，[M+5H]5+686.4。實(shí)施例28His-D-Glv-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu國(guó)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:29);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3355.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1119.4，[M+4H]4+839.8，[M+4H+K]5+679.8;calu[M+3H]3+1119.6，[M+4H]4+839.9，[M+4H+K]5+672.7。實(shí)施例29His-D-Leu墨Glu-Glv-Thr-Phe國(guó)Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln陽(yáng)AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.IDNO:30)的微波促進(jìn)固相合成(1)樹(shù)脂的溶脹稱取WangResin50mg(取代量0.4mmol/g)，經(jīng)7mLDCM溶脹30min,抽濾去DCM，再用10mLNMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM，NMP7mL沖洗干凈。(2)Fmoc-Gly-WangResin的合成將Fmoc-Gly-OH(0.08mmol)，HBTU(0.08mmol)，HOBT(0.08mmol)禾卩DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹(shù)脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50'C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹(shù)脂3次。將得到的樹(shù)脂加入10ml15n/。的醋酐/DCM溶液中，再加入O.OlgDMAP，室溫下振搖3h，反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹(shù)脂3次。(3)微波促進(jìn)Fmoc保護(hù)基的脫除將溶脹好的樹(shù)脂放入反應(yīng)器中，加入7mL含0.1MHOBT的25。/。哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)lmin，微波功率為15W，反應(yīng)溫度控制在50'C以內(nèi)，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻，反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液；再加入7mL含O.lMHOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反應(yīng)器中再反應(yīng)4min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在5(TC，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護(hù)基的樹(shù)脂。(4)微波促進(jìn)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-WangResin的合成將Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再將此溶液加入上面的樹(shù)脂中，在微波反應(yīng)器中反應(yīng)7min，微波功率為25W，反應(yīng)溫度控制在50'C，使用空氣壓縮機(jī)壓縮空氣冷卻。反應(yīng)結(jié)束后濾除反應(yīng)液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹(shù)脂3次。(4)偶合效率的檢測(cè)用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測(cè)樹(shù)脂的偶合效率，顯色反應(yīng)為陰性即可進(jìn)入下一個(gè)偶合循環(huán)。茚三酮法取少量樹(shù)脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml0.001MKCN稀釋于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于IOO'C加熱5分鐘，如果樹(shù)脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。溴酚蘭法取少量樹(shù)脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1%的溴酚藍(lán)二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹(shù)脂顯藍(lán)色即為陽(yáng)性。(5)肽鏈的延長(zhǎng)按照D-Leu8-Leu16-GLP-(737)-OH的序列，重復(fù)上述脫保護(hù)和偶合的步驟依次連接上相應(yīng)的氨基酸，偶合微波促進(jìn)反應(yīng)時(shí)間520min不等。得到連有D-Leu8-Leu16-GLP-(7~37)-OH的樹(shù)脂。(6)樹(shù)脂上多肽的裂解將上述得到的連有D-Leu8-Leu16-GLP-(7~37)-OH的樹(shù)脂放入反應(yīng)瓶中，各加入裂解劑RegeantK(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5,V/V)10mL，先在0。C下振搖30min，再在常溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標(biāo)多肽的粗品。最終得到D-Leu8-Leu16-GLP-(737)-OH粗品59.8mg，收率為92.4%。(7)D-Leu8-Leu16-GLP-(7~37)-OH粗品的純化將上面得到的D-Leu8-Leu16-GLP-(7~37)-OH粗品，溶于少量的水中，用島津制備型反相HPLC純化粗品。純化中采用C18反相制備柱(340mmx28mm，5pm);流動(dòng)相A:0.1%TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B:0.P/。TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B20W65X，40min;流速為6mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。收集的溶液凍干得純品，最終得到純品29.7mg。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1138.2，[M+4H]4+854.0,[M+5H]5+683.5;calu[M+3H]3+1138.3,[M+4H]4+854.0，[M+5H]5+683.4.實(shí)際相對(duì)分子量為3411.8。實(shí)施例3033根據(jù)實(shí)施例29所述的方法，根據(jù)相應(yīng)的序列合成得到實(shí)施例3031的多肽，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)確證各自的分子量。實(shí)施例30His-^r-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lmi-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile陽(yáng)Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.IDNO:31);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3385.8。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1129.4，[M+4H]4+847.5，[M+5H]5+678.2;calu[M+3H]3+1129.6,[M+4H]4+847.4，[M+5H]5+678.2。實(shí)施例31-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.IDNO:32);理論相對(duì)分子質(zhì)量為3341.7。ESI-MSm/z:found[M+3H]3+1119.7，[M+4H]4+839.7，[M+5H]5+672.1;calu[M+3H]3+1119.7，[M+4H]4+839.9，[M+5H]5+672.2。實(shí)施例32GLP-1及其類似物對(duì)DPPIV的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)純化后的GLP-1或其類似物D-Gly8-GLP-(7~36)-NH25nmol和5mU的DPPIV在200pL濃度為50mM的Tris-HCL緩沖溶液中，37。C溫孵4h，pH7.4。最后加入10^20%的乙腈/水溶液終止反應(yīng)。分別取0h，4h點(diǎn)的溫孵溶液，離心，取上清液，進(jìn)HPLC分析；柱尾收集降解產(chǎn)物GLP-1(936)-NH2。分析采用C18反相柱(150mmx4.6mm，5nm);流動(dòng)相A:0.1%TFA/水(V/V)，流動(dòng)相B:0.1%TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B10%45%，22min;流速為1mL/min;柱溫為40°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。如圖1，圖2所示，結(jié)果顯示未經(jīng)改造的天然GLP-1在與DPPIV溫孵4h后，基本上皆被水解為無(wú)活性的GLP-1(936)-NH2，完整的肽鏈小于10%。而改造后的GLP-1類似物與DPPIV溫孵4h后基本上都仍保持原型，未見(jiàn)有降解，完整的肽鏈大于90%。結(jié)果表明通過(guò)對(duì)GLP-1易被DPPIV水解的部位改造，可以使GLP-1類似物抵抗DPPIV的酶解作用，從而能保持肽鏈的完整性。實(shí)施例33GLP-1及其類似物對(duì)人血漿的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)純化后的GLP-1或其類似物D-Gly8-GLP-(7~36)-NH25nmol禾[l10人血漿在200nL濃度為50mM的Tris-HCL緩沖溶液中，37。C溫孵4h，pH7.4。最后加入10^20%的乙腈水溶液終止反應(yīng)。分別取0h,4h點(diǎn)的溫孵溶液，離心，取上清液，進(jìn)HPLC分析。分析采用C18反相柱(150mmx4.6mm，5pm);流動(dòng)相A:0.1。/oTFA/水(V/V)，流動(dòng)相B:0.1%TFA/乙腈(V/V);流動(dòng)相梯度流動(dòng)相B0%，3min;0%24%，17min;24%48%，30min;48%80%，lmin。流速為1mL/min;柱溫為40。C;檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。如圖3，圖4所示，結(jié)果顯示未經(jīng)改造的天然GLP-1在與人血漿溫孵4h后，基本上皆被水解為無(wú)活性的GLP-1(936)-NH2，完整的肽鏈小于15%。而改造后的GLP-1類似物與人血漿溫孵4h后基本上都仍保持原型，未見(jiàn)有降解，完整的肽鏈大于90%。結(jié)果表明通過(guò)對(duì)GLP-1易被酶水解的部位改造，可以使GLP-1類似物抵抗血漿中的酶解作用，從而能保持肽鏈的完整性。實(shí)施例34GLP-1及其類似物體內(nèi)降糖活性實(shí)驗(yàn)取10周齡雄性昆明小鼠(體重18-22g)，隨機(jī)分組，每組6只。只給飲水，禁食過(guò)夜。一組按照小鼠體重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液(濃度20°/。)和生理鹽水；其他組按照小鼠體重每千克腹腔注射18mmol的葡萄糖溶液和25nmol的GLP-1類似物溶液(10pmol/L)。在0，15，30，45，60用血糖儀測(cè)定血糖值。如表1所示，由于修飾后的GLP-1具有抗酶解作用，其生物半衰期大大延長(zhǎng)，所以體內(nèi)降血糖實(shí)驗(yàn)顯示其促胰島素分泌作用不僅未被減弱，還比未經(jīng)改造的天然GLP-1更強(qiáng)。表lGLP-1及其類'似物降血糖的效應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>序列表<110>中國(guó)藥科大學(xué)<120微波促進(jìn)固相合成胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)類似物及其應(yīng)用<160>32<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2),.(2)<223>第2位的Xaa是Asp,Asn，Arg，Lys,His,Glu，Gln，Trp,Phe，Tyr，Met,D-Gly，D-VaL，D-Leu,D-Ile，D-Ser,或D-Thr<220><221>合成構(gòu)建體<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是Glu,或Pro■:.乂".■<220><221〉合成構(gòu)建體<222>(IO)..(IO)<223>第10位的Xaa是Val，或Leu<220〉<221>合成構(gòu)建體<222>(16)..(16)<223>第10位的Xaa是Gly,Glu,Gin,Tip,Phe,Tyr,Met,D-Gly,D-VaL,D-Leu，D-Ile,D-Ser,D-Glu，D-Gln,D國(guó)Tip,或D-Met<220><221>合成構(gòu)建體<222>(21)..(21)<223>第21位的Xaa是Glu，或Leu<220><221>合成構(gòu)建體<222>(31)..(31)<223>第31位的Xaa是Gly，或-NH2<400>1HisXaaXaaGlyThrPheThrSerAspXaaSerSerTyrLeuGluXaa151015GinAlaAlaLysXaaPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArgXaa202530<210>2<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Gly<400>2HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>3<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>3HisAsnGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>4<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>4HisTrpGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>5<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>5HisTyrGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>6<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>6HisMetGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>7<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>7HisGluGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheleAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Val<400>8HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>9<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的XaaD-Leu<400>9HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015LeuValLysGlyArg202530<210>10<211>30<212>PR丁<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Ser<400>10HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>11<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Ile<400>11HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Thr<400>12HisXaaGiuGyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>13<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>13HisSerProGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>14<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>14HisValProGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>15<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>15HisLeuProGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>16<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>16HisGlyWoGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>17<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>17HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>18<2I1>30<212>PRT<23>人工序列<400>18HisSerGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>19<211>30<2〗2>PRT<213>人工序列<400>19HisThrGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>20<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>20HisLeuGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<20>21<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>21HisSerGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysLeuPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>22<211>30<212>PRT<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><210>27<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>27HisValGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>28<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>28HisLysGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>29<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Gly<400>29HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspValSerSerTyrLeuGluGlu151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArg202530<210>30<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Leu<400>30HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>31<211>31<212>PRT<213>人工序列<400>31HisSerGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPhelieAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530<210>32<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成構(gòu)建體<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是D-Gly<400>32HisXaaGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerSerTyrLeuGluGly151015GinAlaAlaLysGluPheHeAlaTrpLeuValLysGlyArgGly202530權(quán)利要求1.一種含有式I(SEQ.IDNO1)結(jié)構(gòu)的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，得到的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物；其特征在于其結(jié)構(gòu)具有以下形式His-Xaa1-Xaa2-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa3-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa4-Gln-Ala-Ala-Lys-Xaa5-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa6(SEQ.IDNO1)Xaa1Asp，Asn，Arg，Lys，His，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，或D-Thr；Xaa2Glu，或Pro；Xaa3Val，或Leu；Xaa4Gly，Glu，Gln，Trp，Phe，Tyr，Met，D-Gly，D-VaL，D-Leu，D-Ile，D-Ser，D-Glu，D-Gln，D-Trp，或D-Met；Xaa5Glu，或Leu；Xaa6Gly，或-NH2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，具有如下序列His-S^ly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser匿Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:2);His-她扁Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu國(guó)Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:3);His-Trp-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu陽(yáng)Glu-Glv-Gln國(guó)Ala隱Ala-Lys-Glu國(guó)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:4);His-2ir-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly陽(yáng)Gln-Ala-Ala-Lys陽(yáng)Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:5);His-幽-Glu-Gly-Thr-Phe陽(yáng)Thr-Ser國(guó)Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu墨Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ak-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:6);His-Glu-Glu-Glv-Thr-Phe陽(yáng)Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Gly-Gln陽(yáng)Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:7);His陽(yáng)D-Val-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser隱Asp陽(yáng)Val陽(yáng)Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu陽(yáng)Glv隱Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:8);His-D-Leu-Glu陽(yáng)Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val陽(yáng)Ser-Ser墨Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln陽(yáng)Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:9);His-DiSeE-GIu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp扁Val-Ser-Ser-Tyr扁Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:10);His-DJk-Glu-Gly墨Thr-Phe-Thr-Ser-Asp陽(yáng)Val-Ser-Ser-Tyr陽(yáng)Leu-Glu-Gly-Gln隱Ala-Ala-Lys-Glu陽(yáng)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:11);His-DiIhr-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr隱Leu-Glu-Gly-Gln墨Ala-Ala-Lys-Glu陽(yáng)Phe-Ile國(guó)Ala-Trp-Leu-Val國(guó)Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:12);His-^tEm-Gly國(guó)Thr-Phe國(guó)Thr-Ser-Asp陽(yáng)Val-Ser-Ser-Tyr陽(yáng)Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:13);His-M^m-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser陽(yáng)Asp陽(yáng)Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys國(guó)Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:14);His-LeUrEm-Gly隱Thr-Phe隱Thr-Ser國(guó)Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly國(guó)Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:15);His-^lydEm-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:16);His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-L^-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:17);His-Ser-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu陽(yáng)Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln陽(yáng)Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:18);His-Thr-Glu-Glv陽(yáng)Thr-Phe-Thr國(guó)Ser-Asp國(guó)Leu陽(yáng)Ser國(guó)Ser-Tvr陽(yáng)Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:19);His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr隱Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv隱Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:20);His-Ser國(guó)Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:21);His-Ik-Glu-Gly-Thr墨Phe-Thr-Ser-Asp-Lmi國(guó)Ser-Ser國(guó)Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln國(guó)Ala-Ala國(guó)Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:22);His-Leu國(guó)Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp隱Val-Ser陽(yáng)Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:23);His-Glv-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:24);His-Phe-Glu-GW-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp國(guó)Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:25);His陽(yáng)Ik-Glu-Gly腳Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu他-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:26);His陽(yáng)Val-Glu-Gly陽(yáng)Thr-Phe陽(yáng)Thr陽(yáng)Ser-Asr)-Val-Ser-Ser-Tyr隱Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lvs隱Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:27);His-Lvs-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln陽(yáng)Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Aia-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:28);His-D陽(yáng)Gly-Glu-Glv-Thr陽(yáng)Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(SEQ.IDNO:29)His-D-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser國(guó)Asp-Leu隱Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu陽(yáng)Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.IDNO:30);His-Ser國(guó)Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tvr-Leu-Glu-Glv國(guó)Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile隱Ala國(guó)Trp-Leu陽(yáng)Val-Lys-Gly-Arg-Gly陽(yáng)OH(SEQ.IDNO:31)His-D-Glv-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glv-Gln-Ala-Ala-Lvs-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp陽(yáng)Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ.IDNO:32)。3.—種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的GLP-1類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。4.權(quán)利要求l中所述的GLP-1類似物或者其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑在制備用于治療糖尿病的藥物中的運(yùn)用。5.權(quán)利要求1中所述的GLP-1類似物的制備方法，其特征在于采用微波促進(jìn)Fmoc/tBu正交保護(hù)固相合成策略，于固相載體上先合成得到載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂，茚三酮法檢測(cè)為陰性后脫去Fmoc保護(hù)基得到載有第一個(gè)氨基酸殘基的樹(shù)脂；再進(jìn)入下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，按照相應(yīng)的肽序用不同的保護(hù)氨基酸重復(fù)偶聯(lián)和脫保護(hù)的步驟，依次延長(zhǎng)所需的氨基酸序列，合成得到載有相應(yīng)多肽的樹(shù)脂，最后用裂解劑將多肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)得到多肽粗品。粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相色譜純化，凍干得多肽純品。6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成GLP-1類似物方法，其特征是載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂的制備方法，是通過(guò)在微波照射條件下Fmoc保護(hù)氨基酸先經(jīng)活化劑活化后再與固相載體偶合得到，反應(yīng)中加入l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有機(jī)堿中和反應(yīng)的酸性。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載有第一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的樹(shù)脂的制備方法，其特征在于使用的固相載體是Rink樹(shù)脂、Wang樹(shù)脂或2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂；使用的活化劑是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、N,N"-羰基二咪唑(CDI)、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或6-氯苯并三氮唑-l,l,3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU);使用的l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物為N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)、1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羥基-l，2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT);使用的有機(jī)堿為三乙胺(TEA)、N-甲基嗎啉(NMM)或二異丙基乙胺(DIEA);微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間為515min。8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述微波促進(jìn)固相合成GLP-1類似物合成方法，其特征是Fmoc保護(hù)基的脫除是通過(guò)使用含有0.1mol.U1的l-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的六氫吡啶溶液在微波促進(jìn)下反應(yīng)，選用二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)為反應(yīng)溶劑；微波促進(jìn)條件是微波頻率2450MHz，反應(yīng)溫度20~100°C，反應(yīng)時(shí)間為110min。全文摘要本發(fā)明涉及新型GLP-1類似物及其微波促進(jìn)固相合成方法。通過(guò)對(duì)天然GLP-1的8，9，16，22，27或37位點(diǎn)進(jìn)行改造得到具有更長(zhǎng)藥理作用時(shí)間的GLP-1類似物；其化學(xué)合成是通過(guò)微波促進(jìn)固相合成方法高效快速實(shí)現(xiàn)，粗品經(jīng)制備級(jí)高效液相純化，最后凍干得到GLP-1類似物。文檔編號(hào)A61P3/00GK101255191SQ20081001968公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日發(fā)明者倪帥鍵,周映紅,周金培,張惠斌,遲玉石,海錢,黃文龍申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)