專利名稱：多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物材料及其制備方法，具體的來說，是涉及一種多孔的保留有生 物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)及制備方法。
背景技術：
膀胱的先天畸形、感染、外傷、腫瘤等病變均可導致膀胱結構破壞和功能障礙而需行 膀胱替代手術。胃腸道是百前用于膀胱替代的主要替代物。然而，由于胃腸道處在泌尿系 的環(huán)境中，可能會引起代謝紊亂，感染，結石形成甚至惡變等一系列并發(fā)癥。因此，探尋 合理的膀胱替代物是擺在我們面前的一項挑戰(zhàn)，而組織工程技術無疑為我們提供了有力的工具。組織工程膀胱的基本原理就是將體外培養(yǎng)的膀胱種子細胞，接種到支架材料上，形成 細胞-支架材料的復合體，再將其用于膀胱替代。缺乏理想的支架材料仍然是目前組織工 程膀胱的研究和應用的一個難題。以往的研究證實，人工合成的多聚物(如聚乙醇酸、聚 乳酸等)支架材料由于機械力學、生物相容性、結構和功能等原因而未能得到滿意的結果。 豬小腸粘膜下層由于其厚度太薄，可能并不適合進行膀胱全層的構建；而且有研究證實， 在豬小腸粘膜下層接種尿路上皮細胞24小時后即出現(xiàn)細胞死亡，這是由于豬小腸粘膜下 層有核酸物質(zhì)的殘留，免疫組化分析表明還有豬小腸樣結構出現(xiàn)。膀胱無細胞基質(zhì)(BAM)是將膀胱進行脫細胞處理后得到的支架材料，具有良好的生 物相容性。動物實驗證明，利用BAM進行膀胱替代后，觀察到尿路上皮細胞再生良好，BAM 替代區(qū)的尿路上皮細胞和膀胱本身的尿路上皮幾乎一樣；但是，膀胱平滑肌細胞再生欠佳， 在BAM替代的中心區(qū)，平滑肌細胞較稀少，排列雜亂不規(guī)則(Brown等，Biomaterials 2002:23(10) :2179-2190. Cayan等，J Urol 2002:168(2) :798-804. 0bara等，Urology 2006:68(4) :892-897. Urakami等，World J Urol 2007 ;25 (2) :207-213. Probst等，BJU Int 2000:85(3) :362-371. Piechota等，J Urol 1998; 159(5): 1717-1724. Sutherland等，J Urol 1996:156(2 Pt 2) :571-577. Redd等，J Urol 2000:164(3 Pt 2) :936-941. Kajbafzadeh等，J Surg Res 200715; 139(2) : 189-202. Cartwright等J Biomed Mater Res A 2006; 77 (2) : 390-395 )。在英國約克大學研究人員Bol land和Ingham等人的研究(Bol land 等,Biomaterials 2007; 28 (6) : 1061-1070)和所申請的膀胱無細胞基質(zhì)制備的專利中(專利號GB2433745)，他們發(fā)明了采用物理擴張豬膀胱的方法來促進脫細胞的效率，在他們所 制備的BAM中，細胞成分被完全去除，所制備的BAM具備有良好的機械力學性能。但是， 利用他們所制備的BAM進行細胞接種實驗，結果表明接種豬膀胱平滑肌細胞后，培養(yǎng)7 天，未觀察到細胞侵入BAM，培養(yǎng)14天也僅觀察到少量的細胞侵入到BAM中，培養(yǎng)21天 也未觀察到平滑肌細胞在BAM中均勻分布。組織工程膀胱的支架材料應具備合適的超微結構特征合適的孔徑、較高的高孔隙率 和孔與孔之間互相交通(Hollister,Nat Mater 2005:4(7) :518-524)。只有具備合適的超 微結構特征，大量的膀胱種子細胞才能快速的黏附到支架材料上，快速向材料中心區(qū)長入， 并均勻地分布在支架材料中?，F(xiàn)有的BAM制備技術對其超微結構的影響還不明確，在 Bolland和Ingham等人的研究，BAM接種豬膀胱平滑肌細胞之后，細胞未能快速侵入，也 不能均勻地分布在BAM中，這可能是因為他們所制備的BAM不具備合適的超微結構特征， 不能滿足組織工程膀胱支架材料的要求。因此，制備BAM時，使其具有多孔的超微結構特 征，才能作為組織工程膀胱的支架材料。目前，在所有的BAM的制備方案中，研究者們均著眼于脫細胞的效率，而忽視了脫細 胞過程中所使用的曲拉通X-100，脫氧膽酸納以及十二烷基硫酸鈉等對細胞外基質(zhì)中生物 活性因子的影響。近來，研究發(fā)現(xiàn)，膀胱細胞外基質(zhì)本身含有大量的內(nèi)源性的生物活性因 子，包括VEGF，bFGF， PDGF-BB， KGF， EGF， BMP4等(Chun等，Biomaterials2007:28(29) :4251-4256)。在以往的研究中，用這些所制備的BAM進行膀胱替代后，膀胱 平滑肌細胞再生欠佳，在BAM替代的中心區(qū)，平滑肌細胞較稀少，排列雜亂不規(guī)則，可能 是因為在制備BAM時，破壞了這些內(nèi)源性的生物活性因子。因此，在制備BAM的時，如果既 能徹底地去除細胞成分，又能有效的保留BAM本身所含有的內(nèi)源性的生物活性因子，那么， 所制成的保留有生物活性因子的BAM將是更理想的組織工程膀胱的支架材料。另外，組織工程膀胱植入體內(nèi)后，需要快速血管化，建立血液循環(huán)，以進行營養(yǎng)物質(zhì) 供應和氣體交換(Jain等，Nat Biotechnol 2005:23(7) :821-823)。目前研究證實，支架 材料的超微結構在血管化方面發(fā)揮重要作用；孔徑大，高孔隙率和孔與孔之間交通較好的 支架材料，血管化就會迅速且充分(Druecke等，J Biomed Mater Res A 2004 ;68(1) :10-18)。 膀胱細胞外基質(zhì)本身所含有的生物活性因子如VEGF， bFGF， PDGF-BB等，均是能促進血管 新生的生長因子。因此，利用多孔的并保留有內(nèi)源性生物活性因子的BAM作為支架材料構 建組織工程膀胱，植入體內(nèi)后，有望促進其充分快速血管化，建立血液循環(huán)。綜上所述，本領域迫切需要提供一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)， 作為組織工程膀胱的支架材料。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)及制備 方法，使得制備的膀胱無細胞基質(zhì)具有合適的超微結構特征，同時又較好地保留了膀胱細 胞外基質(zhì)中的生物活性因子，為組織工程膀胱研究和應用提供一種理想的支架材料。 本發(fā)明的目的通過以下的技術方案實施一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于a) 所述的膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞、無尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)；b) 上述的膀胱無細胞基質(zhì)具有良好的生物相容性；C)上述的膀胱無細胞基質(zhì)中保留有生物活性因子，包括促進細胞黏附的黏附因子、促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子；d)上述的膀胱無細胞基質(zhì)的超微結構特征孔徑大小60-250 um，孔隙率80-90%。 上述的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于所述的膀胱無細胞基質(zhì)的質(zhì)厚度為0. 5-3. 0mm。 上述的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于所述的膀胱無細胞基質(zhì)來自下列動物的膀胱豬、兔、狗或牛。上述多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)的制備方法，其特征在于制備步驟如下a) 膀胱的獲取將上述動物的正常膀胱和部分尿道全部取出，置于緩沖液中，迅速帶到實驗室后仔細去除外表面的脂肪和漿膜組織，經(jīng)尿道插入輸液皮條導管并將其用絲線固定在尿道上，然后經(jīng)此輸液皮條導管用緩沖液沖洗膀胱，將膀胱腔內(nèi)的尿液沖洗干凈；b) 經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入消化液，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全 浸入此消化液中，室溫中振蕩消化，然后倒出此消化液；C)再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；d) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入低滲緩沖液，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀 胱完全浸入此低滲緩沖液中，靜置過夜，然后倒出此低滲緩沖液；e) 再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；f) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入含表面活性劑的高滲緩沖液，夾閉輸液皮條導 管，再將整個膀胱完全浸入此含表面活性劑的高滲緩沖液中，室溫中振蕩洗滌，然后倒出 此含表面活性劑的高滲緩沖液；g) 再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；h) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入含核酸酶的緩沖液，夾閉輸液皮條導管，再將 整個膀胱完全浸入此含核酸酶的緩沖液中，室溫中振蕩洗滌，然后倒出此含核酸酶的緩沖液，得到膀胱無細胞基質(zhì)；i)將上述的膀胱無細胞基質(zhì)用緩沖液沖洗； j)將上述的膀胱無細胞基質(zhì)用去離子水沖洗；k)將上述的膀胱無細胞基質(zhì)置于深低溫冰箱中冷凍，再在冷凍干燥機中凍干，得到 凍干的膀胱無細胞基質(zhì)；1)將上述的凍干的膀胱無細胞基質(zhì)進行滅菌，得到無菌的膀胱無細胞基質(zhì)； m)將上述的無菌的膀胱無細胞基質(zhì)低溫密封保存，備用。上述的制備方法，其特征在于在步驟a， c， e， g和i中所述的緩沖液為4'C預冷的 lOmM磷酸鹽緩沖液，Bi7.2-7.4，沖洗次數(shù)為3次。上述的制備方法，其特征在于在步驟b中所述的消化液為含0.25%/0. 038%的胰蛋白酶 /乙二胺四乙酸四鈉的消化液，PH為7.2-7.4;灌入膀胱內(nèi)的消化液的體積為30ml-500ml 溶液，室溫中振蕩消化時間為0.5-4小時。上述的制備方法，其特征在于在步驟d中所述的低滲緩沖液為10mM三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸緩沖液，^ 8.0，內(nèi)含5mM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/ml抑肽酶；向膀胱腔內(nèi) 灌入的低滲緩沖液體積為60-1200ml，靜置過夜的溫度為4TC。上述的制備方法，其特征在于在步驟f中所述的含表面活性劑的高滲緩沖液，其中的 表面活性劑是曲拉通X-100，濃度為0.5-1.5%;其中的高滲緩沖液為50mM三羥甲基氨基 甲垸-鹽酸緩沖液，PH 8. 0，內(nèi)含0. 5M氯化鈉，lOmM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/ml抑 肽酶；向膀胱腔內(nèi)灌入的含表面活性劑的高滲緩沖液體積為60-1200ml，室溫中振蕩洗滌 時間為12-48小時。上述的制備方法，其特征在于在步驟h中所述的含核酸酶的緩沖液，其中的核酸酶為 I型脫氧核糖核酸酶和A型核糖核酸酶，二者濃度分別為25-100U/ml和1-2U/ml;緩沖 液為10niM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液，PH7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂，2mM氯化鈣和150mM 氯化鈉；向膀胱腔內(nèi)灌入的含核酸酶的緩沖液的體積為60-1200ml，室溫中振蕩洗滌時間 為12-36小時。上述的制備方法，其特征在于在步驟j中所述的去離子水為4"C預冷的無菌去離子水， 沖洗次數(shù)為3次。上述的制備方法，其特征在于在步驟k中所述的膀胱細胞無細胞基質(zhì)置于深低溫冰箱 中的冷凍溫度為-2(TC至-7(TC，冷凍時間為2-6小時；冷凍干燥機中凍干的時間為24-96 小時。上述的制備方法，其特征在于在步驟1中所述的膀胱無細胞基質(zhì)滅菌的方法為環(huán)氧乙垸滅菌。上述的制備方法，其特征在于在步驟m中所述的低溫保存的溫度為-2(TC至4'C。將上述所制備的膀胱無細胞基質(zhì)進行如下分析1. 組織學檢測，觀察其有無細胞成分殘留；2. 掃描電鏡分析，觀察其超微結構特征；3. 種子細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)人膀胱平滑肌細胞(HBSMC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)， 進行直接接觸細胞毒性實驗，分析BAM的生物相容性；4. 細胞黏附實驗和細胞接種實驗，觀察大量的種子細胞(HBSMC和HUVEC)是否能快 速黏附到BAM上，是否能快速侵入BAM并均勻地分布在BAM之中，從而分析BAM是否具有合適 的超微結構特征。5. 將BAM勻漿后，吸取上清液，用該上清液包被培養(yǎng)板，觀察其對細胞黏附的效果， 分析BAM是否保留有促進細胞黏附的黏附因子；6. 制備BAM條件培養(yǎng)基，觀察BAM條件培養(yǎng)基對細胞生長、增殖、遷移和刮傷愈合的 效果，分析BAM是否保留有促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子；有益效果本發(fā)明提供了一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)及其制備方法。 本發(fā)明取豬、兔、狗或牛的膀胱，聯(lián)合使用物理、化學和酶消化等脫細胞技術，所制 備的膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞，無尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)，具有良好的生 物相容性。同時，本發(fā)明所用的膀胱為來自大動物豬、兔、狗或牛的膀胱，能為制備動物 的膀胱無細胞基質(zhì)并在人體的應用奠定基礎。另外，本發(fā)明所用的動物膀胱取材方便，來 源豐富，技術操作簡單，制備成本低廉。與現(xiàn)有的BAM相比，本發(fā)明所制備的BAM具有三維多孔的超微結構特征，即孔徑大小 60-250um，孔隙率80-90%，厚度0. 8-3. Omm范圍。細胞黏附和細胞接種實驗表明，接種 細胞后，大量細胞快速地黏附到BAM中，然后快速地向內(nèi)部侵入并均勻地分布在BAM中； 朋SMC在部分區(qū)域還形成細胞團塊，HUVEC還形成管狀樣結構。因此，本發(fā)明所制備的BAM 具有合適的超微結構特征，能夠滿足組織工程膀胱的支架材料的要求。本發(fā)明也建立了一種新的評價無細胞基質(zhì)是否保留有生物活性因子的方法。將無菌的 BAM勻漿處理后，其勻漿上清液包被培養(yǎng)板能明顯地促進HBSMC和HUVEC的黏附，這表明 本發(fā)明所制備的BAM保留有促進細胞黏附的黏附因子。另外，制備BAM的條件培養(yǎng)基，該條件培養(yǎng)基含有能促進HBSMC和HUVEC生長、增殖、遷移和刮傷愈合的生長因子和趨化因 子，這些生物活性因子是由BAM釋放到培養(yǎng)基中的。因此，本發(fā)明所制備的BAM還保留有 促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子。綜上所述，本發(fā)明所制備的膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞、無尿路上皮層、無粘膜下層、 無血管系統(tǒng)，具有良好的生物相容性，具有合適的超微結構特征，保留有生物活性因子， 是一種理想的組織工程膀胱的支架材料。本發(fā)明所制備的膀胱無細胞基質(zhì)可接種尿路上皮細胞和平滑肌細胞，用于構建組織工 程膀胱壁；可再聯(lián)合接種內(nèi)皮細胞或者內(nèi)皮細胞的前體細胞，將組織工程膀胱在體外進行 預血管化；可接種多潛能的干細胞，如骨髓間充質(zhì)干細胞，脂肪干細胞和胚胎干細胞，使 其誘導分化為膀胱組織。另外，本發(fā)明所制備的膀胱無細胞基質(zhì)，還可以作為輸尿管、膀 胱和尿道的替代材料，并可以用于異種動物；并可復合外源性的重組生物活性因子，如重 組人或鼠VEGF, bFGF, PDGF-BB， EGF等等，以促進組織再生和血管新生。本發(fā)明所制備的一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)，可經(jīng)紫外線照射， 戊二醛、京尼平交聯(lián)處理，以延長體內(nèi)降解時間；可經(jīng)乙酸、I型膠原酶等處理進一步增 大孔徑，提高孔隙率。
具體實施方式
實施例l豬膀胱無細胞基質(zhì)的制備，制備步驟如下a) 豬膀胱的獲取將體重為20公斤的豬的膀胱和部分尿道全部取出，置于4'C預冷 的10mM磷酸鹽緩沖液，ffl7.2-7.4中，迅速帶到實驗室后仔細去除外表面的脂肪和漿膜組 織，經(jīng)尿道插入輸液皮條導管并將其用絲線固定在尿道上，然后經(jīng)此輸液皮條導管用4°C 預冷的lOmM磷酸鹽緩沖液，ffl7. 2-7. 4沖洗膀胱3次，將膀胱腔內(nèi)的尿液沖洗干凈；b) 經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入100ml含O. 25%/0. 038%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 四鈉的消化液，PH為7.2-7.4，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此消化液中， 室溫中振蕩消化2小時，然后倒出此消化液；c) 再經(jīng)輸液皮條導管用4。C預冷的lOmM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4,沖洗3次，然后 倒出此緩沖液；d) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的10mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液， PH8.0，內(nèi)含5mM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/ml抑肽酶，夾閉輸液皮條導管，再將整個 膀胱完全浸入此低滲緩沖液中，4T:靜置過夜，然后倒出此低滲緩沖液；e) 再經(jīng)輸液皮條導管用4'C預冷的10raM磷酸鹽緩沖液，PH7. 2-7. 4，沖洗3次，然后倒出此緩沖液；f) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的含1. 0%曲拉通X-100的50 mM三羥甲 基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH8.0，內(nèi)含0.5M氯化鈉，10raM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/ml 抑肽酶；夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此含曲拉通X-100的高滲緩沖液中， 室溫中振蕩洗滌24小時，然后倒出此含曲拉通X-100的高滲緩沖液；g) 再經(jīng)輸液皮條導管用4。C預冷的10mM磷酸鹽緩沖液，^7.2-7.4，沖洗3次，然后 倒出此緩沖液；h) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入300ml的含50U/ml I型脫氧核糖核酸酶和1U/ml A型核糖核酸酶的10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH 7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂，2mM 氯化鈣和150mM氯化鈉，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此含核酸酶的緩沖液 中，室溫中振蕩洗滌24小時，然后倒出此含核酸酶的緩沖液，得到豬膀胱無細胞基質(zhì)；i) 將上述的豬膀胱無細胞基質(zhì)用4。C預冷的lOmM磷酸鹽緩沖液，PH7. 2-7. 4，沖洗3次；j)將上述的豬膀胱無細胞基質(zhì)用4"C預冷的無菌去離子水沖洗3次； k)將上述的豬膀胱無細胞基質(zhì)置于-70'C的深低溫冰箱中冷凍3小時，再在冷凍干燥 機中凍干48小時，得到凍干的豬膀胱無細胞基質(zhì)；1)將上述的凍干的豬膀胱無細胞基質(zhì)進行環(huán)氧乙垸滅菌，得到無菌的豬膀胱無細胞基質(zhì)；m)將上述的無菌的豬膀胱無細胞基質(zhì)fC密封保存，備用。取上述步驟1中的豬膀胱無細胞基質(zhì)經(jīng)10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋并進行切片 (5um)。進行HE染色觀察有無細胞核殘留和細胞外基質(zhì)的情況；同時進行免疫組織化學染 色觀察有無細胞成分(平滑肌肌動蛋白，結蛋白和波形蛋白)的殘留和細胞外基質(zhì)中I型膠 原的保留情況。結果表明，在HE染色中，豬膀胱無細胞基質(zhì)無細胞核，呈疏松多孔樣，無 尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)。免疫組化染色表明豬膀胱無細胞基質(zhì)的平滑肌肌 動蛋白、結蛋白和波形蛋白染色均陰性，I型膠原蛋白染色陽性。取步驟l中的無菌的豬膀胱無細胞基質(zhì)進行內(nèi)腔面和縱切面的超微結構觀察，將所獲 得圖像用Image Pro Plus軟件進行測量分析其孔徑大小，孔隙率(孔的面積/圖像總面積)， 全層厚度。結果表明，凍干的豬膀胱無細胞基質(zhì)具有多孔的超微結構特征孔徑大小 100-180um，孔隙率85%，孔與孔之間互相溝通，厚度1. 8mm;豬膀胱無細胞基質(zhì)的內(nèi)腔 面呈多孔樣，無尿路上皮，無完整的粘膜下層。實施例2兔膀胱無細胞基質(zhì)的制備，制備步驟如下a) 兔膀胱的獲取將體重為4公斤的新西蘭白兔的膀胱和部分尿道全部取出，置于4 "C預冷的lOraM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4中，迅速帶到實驗室后仔細去除外表面的脂肪和 漿膜組織，經(jīng)尿道插入輸液皮條導管并其用絲線固定在尿道上，然后經(jīng)此輸液皮條導管用 4'C預冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4沖洗膀胱3次，將膀蹄腔內(nèi)的尿液沖洗干凈；b) 經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入40ml含0. 25%/0. 038%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 四鈉的消化液，PH為7.2-7.4，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此消化液中， 室溫中振蕩消化0.5小時，然后倒出此消化液；c) 再經(jīng)輸液皮條導管用fC預冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7. 2-7. 4，沖洗3次，然后 倒出此緩沖液；d) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入80ml的lOrnM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液， PH8.0，內(nèi)含5mM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/nil抑肽酶，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此低滲緩沖液中，rc靜置過夜，然后倒出此低滲緩沖液；e) 再經(jīng)輸液皮條導管用4"C預冷的lOraM磷酸鹽緩沖液，ffl7. 2-7. 4，沖洗3次，然后 倒出此緩沖液；f) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入80ml的含1. 0%曲拉通X-100的50 mM三羥甲 基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH8.0，內(nèi)含0.5M氯化鈉，10mM乙二胺四乙酸四鈉和10 KlU/ml 抑肽酶；夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此含曲拉通X-100的高滲緩沖液中， 室溫中振蕩洗滌12小時，然后倒出此含曲拉通X-100的高滲緩沖液；g) 再經(jīng)輸液皮條導管用4。C預冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次，然后 倒出此緩沖液；h) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入80ml的含25U/ml I型脫氧核糖核酸酶和1U/ml A型核糖核酸酶的lOmM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液，ra 7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂，2mM 氯化鈣和150mM氯化鈉，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全浸入此含核酸酶的緩沖液 中，室溫中振蕩洗滌12小時，然后倒出此含核酸酶的緩沖液，得到兔膀胱無細胞基質(zhì)；i) 將上述的兔膀胱無細胞基質(zhì)用4。C預冷的10mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗3次；j)將上述的兔膀胱無細胞基質(zhì)用4'C預冷的無菌去離子水沖洗3次； k)將上述的兔膀胱無細胞基質(zhì)置于-7(TC的深低溫冰箱中冷凍2小時，再在冷凍干燥 機中凍干24小時，得到凍干的兔膀胱無細胞基質(zhì)；1)將上述的凍干的兔膀胱無細胞基質(zhì)進行環(huán)氧乙垸滅菌，得到無菌的兔膀胱無細胞基質(zhì)；m)將上述的無菌的兔膀胱無細胞基質(zhì)4t:密封保存，備用。取上述步驟i中的兔膀胱無細胞基質(zhì)經(jīng)l(M中性甲醛同定、脫水、石蠟包埋并進行切片 (5um)。進行HE染色觀察有無細胞核殘留和細胞外基質(zhì)的情況；同時進行免疫組織化學染 色觀察有無細胞成分(平滑肌肌動蛋白，結蛋白和波形蛋白)的殘留和細胞外基質(zhì)中I型膠 原的保留情況。結果表明，在HE染色中，兔膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞，呈疏松多孔樣，無 尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)。免疫組化染色表明兔膀胱無細胞基質(zhì)的平滑肌肌 動蛋白、結蛋白和波形蛋白染色均陰性，I型膠原蛋白染色陽性。取步驟l中的無菌的兔膀胱無細胞基質(zhì)進行內(nèi)腔面和縱切面的超微結構觀察，將所獲 得圖像用Image Pro Plus軟件進行測量分析其孔徑大小，孔隙率(孔的面積/圖像總面積)， 全層厚度。結果表明，凍干的兔膀胱無細胞基質(zhì)具有多孔的超微結構特征孔徑大小 60-120 um，孔隙率88%,孔與孔之間互相溝通，厚度0. 6國；兔膀胱無細胞基質(zhì)的內(nèi)腔面 無尿路上皮，無完整的粘膜下層。實施例3.種子細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 3. 1 HBSMC的分離、培養(yǎng)和鑒定經(jīng)根治性全膀胱切除的膀胱癌患者同意，取一小塊無明顯腫瘤生長的膀胱組織，用機 械分離法將尿路上皮層完整去除，采用濃度為0.25%/0.038%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 四鈉和O. 1% I型膠原酶序貫消化，將所得的細胞懸液接種于含10^FBS的DMEM/F-12全培養(yǎng) 基進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，并用細胞爬片免疫染色觀察平 滑肌肌動蛋白，結蛋白的表達。倒置顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的人膀胱平滑肌細胞呈長梭形，融合后呈典型的"峰谷" 樣形態(tài)；平滑肌肌動蛋白和結蛋白染色均陽性，陽性率大于98%。本發(fā)明選用第2-5代的 HBSMC.3. 2 HUVEC的分離、培養(yǎng)和鑒定經(jīng)產(chǎn)婦同意，取一段長約20cm的臍帶，用生理鹽水將臍靜脈沖洗3次，然后在臍靜脈中 灌入O. 1%1型膠原酶溶液消化10分鐘，將消化下來的細胞收集重懸于含生長因子MV BulletKit、 10% FBS的EGM-2全培養(yǎng)基，接種到培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。利用 倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察；利用流式細胞技術觀察CD146和CD105的表達情況。倒置顯微鏡下觀察，體外培養(yǎng)的HUVEC呈橢圓形；流式細胞分析，其表達CD146和 CD105，雙陽性率達100%。本發(fā)明中均使用2-5代的HUVEC。實施例4.豬BAM的生物相容性的檢測選用第4代的HBSC和HUVEC，采用直接接觸細胞毒性實驗，將這兩種細胞分別用于豬BAM 的生物相容性檢測。用lml全培養(yǎng)基分別重懸4X104個HBSMC或5X104個HUVEC并接種到 有O. 1%明膠預包被的24孔板，培養(yǎng)過夜。將8mmXmm大小的豬BAM輕輕地放到含有細胞地孔 中作為實驗孔。同時設立對陰性對照和空白對照只有細胞而無豬BAM的孔作為對照孔； 只有培養(yǎng)基而沒有細胞，含或不含豬BAM的孔作為空白對照。此后每日更換一半地培養(yǎng)基， 培養(yǎng)48或96小時后，每孔加入80U 1的CCK-8試劑，HBSC繼續(xù)培養(yǎng)3小時，HUVEC繼續(xù)培養(yǎng)4 小時。然后將變成黃色的培養(yǎng)基轉移到96孔板(150p1/孔)，并用酶標儀讀取450nm的0D 值(620nm作為參考波長)。實驗孔和對照孔的OD值分別減去對應的空白孔的OD值，用 Ind印endent Samples Student' s卜test分析實驗孔和對照孔是否有統(tǒng)計學差異(/KO. 05 即認為有統(tǒng)計學差異)。直接接觸細胞毒性實驗表明，豬BAM中無細胞毒性物質(zhì)殘留在培養(yǎng)48-96小時后， 豬BAM組和對照組的細胞活性無明顯差異(p〉0. 05)。上述結果表明，豬BAM具有良好的生物相容性。實施例5.驗證豬BAM是否具有合適的超微結構特征 5.1 .細胞薪附實驗首先將凍干的且無菌的1.5X1.5cn^大小的豬BAM放到ultra-low attachment 24-well plates孔中，使其能改完整地覆蓋孔底，無豬BAM的tissue culture treated 24-well plates作為對照培養(yǎng)板，每組4個復孔；實驗孔和對照孔分別加入lml細胞密度為5X105/ml 的細胞懸液；分別于培養(yǎng)1小時和3小時，收集培養(yǎng)基，計數(shù)培養(yǎng)基中未黏附到豬BAM或者 tissue culture treated plates孔底的細胞數(shù)，從而計算出黏附細胞數(shù)，然后計算出黏 附細胞所占的百分數(shù)，數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用LSD檢驗進 行統(tǒng)計處理(/X0.05即認為有統(tǒng)計學差異)。本細胞黏附實驗旨在觀察豬BAM是否具有合適的超微結構特征以支持大量細胞的快速 黏附。細胞黏附實驗的結果發(fā)現(xiàn)，接種朋SMC后培養(yǎng)1小時，有71.5±3.4%的細胞黏附到豬 BAM，明顯高于對照組的27.5±2.5% C0.05);培養(yǎng)3小時，黏附細胞達到83士2.6%，明顯 高于對照組的34.3±3.3%， (/K0.05)。接種HUVEC后培養(yǎng)1小時，有73. 5±5. 5%的細胞黏附 到豬BAM，明顯高于對照組的34土5.2M (/X0.05);培養(yǎng)3小時，黏附細胞達到89土2.6%，明 顯高于對照組的41±2.6% (/X0.05)。5. 2 .細胞接種實驗首先將凍干且無菌的0. 5X0. 5cm2大小的豬BAM放到ultra-low attachment 24-well plates孔中；分別調(diào)整朋SMC密度為1 X lOVml或HUVEC密度為5X 106/ml，分別取100 y 1 細胞懸液加入到不同的豬BAM之上，使其慢慢水化，只加入培養(yǎng)基而沒有細胞的豬BAM作 為對照孔；培養(yǎng)1小時，使細胞黏附；然后將有細胞或無細胞的豬BAM轉移到25-cm2的培 養(yǎng)瓶中，加入10ml培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)瓶保持直立，繼續(xù)培養(yǎng)，此后每日更換培養(yǎng)基；分 別于培養(yǎng)1天和培養(yǎng)3天后，取出豬BAM，包埋于OCT中，在冰凍切片機內(nèi)切片(5ix m)， 進行服染色，觀察細胞侵入豬BAM和在豬BAM中的空間分布情況。細胞接種實驗旨在觀察豬BAM是否具有合適的超微結構特征以支持種子細胞快速侵入 并均勻分布在BAM中。結果表明，豬BAM接種HBSMC后培養(yǎng)1天，HBSMC開始向豬BAM中心侵入； 培養(yǎng)3天后，HBSMC均勻地分布在豬BAM中，部分區(qū)域還形成細胞團塊。豬BAM接種HUVEC之 后1天，HUVEC也快速地向豬BAM中心區(qū)侵入；培養(yǎng)3天后，觀察到HUVEC較均勻的分布在豬 BAM中，還形成管狀養(yǎng)結構。細胞黏附和細胞接種實驗表明，接種細胞后，大量細胞快速地黏附到膀胱無細胞基質(zhì) 中，然后快速地向內(nèi)部侵入并均勻地分布在膀胱無細胞基質(zhì)中。因此，本發(fā)明所制備的BAM 具有合適的超微結構特征，能夠滿足組織工程膀胱的支架材料的要求。實施例6.驗證豬BAM是否保留有生物活性因子 6.1 BAM勻漿，取上清液取一塊2cmX2cm的無菌的豬BAM放玻璃組織勻漿器中，加入2ml 4"C預冷的無菌的 lOmMPBS (PH7.2-7.4)中，4'C研磨勻漿30分鐘；然后將勻漿液移至離心管中，4°C、 12000 轉/分離心10分鐘；吸取上清液，將上清液4'C保存?zhèn)溆谩?.2觀察豬BAM勻漿上清液包被培養(yǎng)板后對細胞黏附的效果取6.1中所制備的豬BAM勻漿上清液，包被培養(yǎng)板作為實驗組，用PBS代替上清液包被培 養(yǎng)板作為對照組；然后在豬BAM勻漿上清液包被組和對照組中分別接種朋SMC和HUVEC，分 別培養(yǎng)0.5，1和3小時后，將黏附細胞消化下來，計數(shù)黏附細胞數(shù)，計算出黏附細胞所占初 始細胞總數(shù)的百分率，數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用LSD檢驗進 行統(tǒng)計處理(/X0.05即認為有統(tǒng)計學差異)。本黏附實驗旨在驗證豬BAM中是否保留有促進細胞黏附的黏附因子。實驗結果表明，用 豬BAM勻漿上清液包被培養(yǎng)板后，能明顯的促進HBSMC和HUVEC的黏附，細胞黏附快于對照 組。這表^§，本發(fā)明所制備的豬BAM保留有促進細胞黏附的黏附因子。6. 3制備BAM條件基礎培養(yǎng)基、BAM條件全培養(yǎng)基，對照基礎培養(yǎng)基、對照全培養(yǎng)基首先分別配制20ml的含0.5W胎牛血清、0.5M牛血清白蛋白的DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基和 20ml的含0. 5W胎牛血清的EBM-2基礎培養(yǎng)基；20ml的含10X胎牛血清的DMEM/F-12全培養(yǎng)基 和20ml的含生長因子MV BulletKit、 1(m胎牛血清的EGM-2全培養(yǎng)基；分別將上述四種培養(yǎng) 基均分為兩份，即每份10ml;分別于10ml DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基、10ml EBM-2基礎培養(yǎng) 基、10ml DMEM/F-12全培養(yǎng)基和10ml EGM-2全培養(yǎng)基中各浸入一塊5cmX5cm大小的無菌的 BAM;浸入BAM和未浸入BAM的培養(yǎng)基同時置于4'C孵育7天，孵育期間每日手搖人工振蕩2次， 每次持續(xù)0.5分鐘；最后得到BAM條件基礎培養(yǎng)基、BAM條件全培養(yǎng)基，對照基礎培養(yǎng)基、 對照全培養(yǎng)基，備用。6.4觀察種子細胞在BAM條件培養(yǎng)基中的生長速率、增殖、遷移活性和促進刮傷愈合的潛能分別繪制HBSMC和HUVEC在BAM條件全培養(yǎng)基和對照全培養(yǎng)基中的生長曲線，比較HBSMC 和HUVEC的生長速率；進行細胞增殖實驗和遷移實驗，比較HBSMC和HUVEC在BAM條件基礎培 養(yǎng)基和對照基礎培養(yǎng)基中的增殖、遷移活性；通過刮傷愈合實驗，比較BAM條件基礎培養(yǎng) 基和對照基礎培養(yǎng)基促進HBSMC和HUVEC刮傷愈合的潛能(用Ind印endent Samples Student' s t-test進行統(tǒng)計學分析，；XO. 05即認為有統(tǒng)計學差異)。本實驗旨在驗證BAM是否能釋放促進HBSMC和HUVEC生長、增殖、遷移和刮傷愈合的生物 活性因子至培養(yǎng)基中。實驗結果表明與對照全培養(yǎng)基相比，冊SMC和HUVEC在BAM條件全 培養(yǎng)基中的生長速率更快；HBSMC和HUVEC在BAM條件基礎培養(yǎng)基中的增殖活性和遷移活性 明顯高于對照基礎培養(yǎng)基0X0.05)。刮傷實驗表明，BAM條件基礎培養(yǎng)基更能促進HBSMC和 HUVEC的刮傷愈合。刮傷的HBSMC在BAM條件基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，愈合了42. 6±5. 0%， 而對照基礎培養(yǎng)基僅愈合了22±1.9% (/K0.05);刮傷的HUVEC在BAM條件基礎培養(yǎng)基中培 養(yǎng)36小時，愈合了38.6士3. 1%，而對照基礎培養(yǎng)基僅愈合了7±2.2% (p<0. 05)。上述結果表明，本發(fā)明所制備的豬BAM條件培養(yǎng)基含有能夠明顯地促進朋SMC和HUVEC 增殖的生長因子、促進HBSMC和HUVEC遷移的趨化因子，這些生物活性因子是由豬BAM釋 放到培養(yǎng)基中的。這表§1§，本發(fā)明所制備的豬BAM中保留有促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子。綜上所述，本發(fā)明所制備的BAM中，保留有生物活性因子，包括促進細胞黏附的黏附 因子，促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子。
權利要求
1.一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于a)所述的膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞、無尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)；b)上述的膀胱無細胞基質(zhì)具有良好的生物相容性；c)上述的膀胱無細胞基質(zhì)中保留有生物活性因子，包括促進細胞黏附的黏附因子、促進細胞增殖的生長因子和促進細胞遷移的趨化因子；d)上述的膀胱無細胞基質(zhì)的超微結構特征孔徑大小60-250μm，孔隙率80-90％。
2. 根據(jù)權利要求1所述的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于所述的膀胱無細胞基質(zhì)的質(zhì) 厚度為0.5-3.0mm。
3. 根據(jù)權利要求1所述的膀胱無細胞基質(zhì)，其特征在于所述的膀胱無細胞基質(zhì)來自下列動物的膀胱豬、兔、狗或牛。
4. 一種制備權利要求1所述的膀胱無細胞基質(zhì)的方法，其特征在于制備步驟如下a) 膀胱的獲取將上述動物的正常膀胱和部分尿道全部取出，置于緩沖液中，迅速 帶到實驗室后仔細去除外表面的脂肪和漿膜組織，經(jīng)尿道插入輸液皮條導管并將其用絲線 固定在尿道上，然后經(jīng)此輸液皮條導管用緩沖液沖洗膀胱，將膀胱腔內(nèi)的尿液沖洗干凈；b) 經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入消化液，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀胱完全 浸入此消化液中，室溫中振蕩消化，然后倒出此消化液；C)再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；d) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入低滲緩沖液，夾閉輸液皮條導管，再將整個膀 胱完全浸入此低滲緩沖液中，靜置過夜，然后倒出此低滲緩沖液；e) 再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；f) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入含表面活性劑的高滲緩沖液，夾閉輸液皮條導 管，再將整個膀胱完全浸入此含表面活性劑的高滲緩沖液中，室溫中振蕩洗滌，然后倒出 此含表面活性劑的高滲緩沖液；g) 再經(jīng)輸液皮條導管用緩沖液沖洗，然后倒出此緩沖液；h) 再經(jīng)輸液皮條導管向膀胱腔內(nèi)灌入含核酸酶的緩沖液，夾閉輸液皮條導管，再將 整個膀胱完全浸入此含核酸酶的緩沖液中，室溫中振蕩洗滌，然后倒出此含核酸酶的緩沖 液，得到膀胱無細胞基質(zhì)；i) 將上述的膀胱無細胞基質(zhì)用緩沖液沖洗； j)將上述的膀胱無細胞基質(zhì)用去離子水沖洗；k)將上述的膀胱無細胞基質(zhì)置于深低溫冰箱中冷凍，再在冷凍干燥機中凍干，得到 凍干的膀胱無細胞基質(zhì)；1)將上述的凍干的膀胱無細胞基質(zhì)進行滅菌，得到無菌的膀胱無細胞基質(zhì)； m)將上述的無菌的膀胱無細胞基質(zhì)低溫密封保存，備用。
5. 稂據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟a， c， e， g和i中所述的緩 沖液為4"預冷的lOmM磷酸鹽緩沖液，PH7.2-7.4，沖洗次數(shù)為3次。
6. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟b中所述的消化液為含 0.25%/0.038%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四鈉的消化液，PH為7.2-7.4;灌入膀胱內(nèi)的消化 液的體積為30ml-500ml溶液，室溫中振蕩消化時間為0.5-4小時。
7. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟d中所述的低滲緩沖液為 10mM三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液,PH8.0，內(nèi)含5mM乙二胺四乙酸四鈉和10KIU/ml 抑肽酶；向膀胱腔內(nèi)灌入的低滲緩沖液體積為6(M200ml，靜置過夜的溫度為4'C。
8. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟f中所述的含表面活性劑的高 滲緩沖液，其中的表面活性劑是曲拉通X-100，濃度為0.5-1.5%;其中的高滲緩沖液為50mM 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH8.0，內(nèi)含0.5M氯化鈉，lOmM乙二胺四乙酸四鈉和 10KIU/ml抑肽酶；向膀胱腔內(nèi)灌入的含表面活性劑的高滲緩沖液體積為60-1200ml，室溫 中振蕩洗滌時間為12-48小時。
9. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟h中所述的含核酸酶的緩沖 液，其中的核酸酶為I型脫氧核糖核酸酶和A型核糖核酸酶，二者濃度分別為25-100U/ml 和l-2U/ml;緩沖液為10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，PH 7.6，內(nèi)含2mM氯化鎂， 2mM氯化鈣和150mM氯化鈉；向膀胱腔內(nèi)灌入的含核酸酶的緩沖液的體積為60-1200ml， 室溫中振蕩洗滌時間為12-36小時。
10. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟j中所述的去離子水為4'C預 冷的無菌去離子水，沖洗次數(shù)為3次。
11. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟k中所述的膀胱細胞無細胞 基質(zhì)置于深低溫冰箱中的冷凍溫度為-20'C至-7(TC，冷凍時間為2-6小時；冷凍干燥機中 凍干的時間為24-96小時。
12. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟1中所述的膀胱無細胞基質(zhì)滅 菌的方法為環(huán)氧乙烷滅菌。
13. 根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于在步驟m中所述的低溫保存的溫度 為-2(TC至4。C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多孔的保留有生物活性因子的膀胱無細胞基質(zhì)及制備方法。取豬、兔、狗或牛的膀胱，經(jīng)消化液，低滲緩沖液、含表面活性劑的高滲緩沖液、含核酸酶的緩沖液和去離子水等處理后，再經(jīng)冷凍、凍干和滅菌后得到無菌的膀胱無細胞基質(zhì)。所述的膀胱無細胞基質(zhì)不含細胞、無尿路上皮層、無粘膜下層、無血管系統(tǒng)，具有良好的生物相容性，具有合適的超微結構特征，保留有生物活性因子，包括細胞黏附因子、生長因子和趨化因子，是一種理想的組織工程膀胱的支架材料。
文檔編號A61L27/56GK101327338SQ200810020808
公開日2008年12月24日 申請日期2008年8月1日 優(yōu)先權日2008年8月1日
發(fā)明者周六化, 孫則禹, 戴玉田, 斌 楊 申請人:南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院