專利名稱：毛葡萄及其提取物在制備抗血栓藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毛葡萄提取物在制備抗血栓藥物中的應用。
背景技術(shù)：
據(jù)最新調(diào)查顯示，全球每年約有850萬人患上由心、腦血管血栓而引的心、 腦血管疾病，其中約有160萬因此引發(fā)嚴重心、腦血管病，150萬人因此引發(fā) 腦卒中。目前抗血栓藥主要有抗凝劑、抗血小板及溶栓藥，其中主要以西藥為主， 中成藥主要是丹參制劑。以上這些藥品對血栓病人起了一定作用，但大多數(shù)療 效不很理想，另外存在一定的副作用，因此從中草藥中提取具有抗血栓作用的 天然藥物越來越受到重視。分布于西南及陜西、甘肅、江蘇、安徽、浙江、江西、臺灣、湖北、廣西 等地的毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd),木質(zhì)藤本，長達8m。幼枝、葉 柄和花序軸密生白色或褐色蛛絲狀柔毛，老枝紫紅色。單葉互生；葉柄長 3-7cm;葉片卵形或五角狀卵形，不分裂或具不明顯的3-5角棱以至3-5裂， 長8-15cm，寬6-10cm，先端急尖，基部近截形或淺心形，邊緣有微波狀牙齒， 上面綠色，初被柔毛，后變無毛，下面密被灰白色或灰棕色絨毛。花雜性異株， 圓錐花序長8-llcm，稀達16cm，與葉對生，分枝近平展；花小，淡黃綠色， 具細梗，無毛；花萼不明顯；花瓣5，長約1.8mm，先端粘合成帽狀脫落；雄 蕊5-6,與花瓣對生；子房埋于花盤中。漿果球形，熟時黑紫色，直徑6-8mm。 種子三角形，長約4mm，背部扁圓，腹部有兩角棱?；ㄆ?-6月，果期7-9 月。毛葡萄的根皮和葉可被用于藥，根皮能調(diào)經(jīng)活血、舒筋活絡，主治月經(jīng)不 調(diào)、白帶，外用治跌打損傷、筋骨疼痛，葉能止血，用于外傷出血。現(xiàn)有的文獻資料中并未發(fā)現(xiàn)毛葡萄及其提取物具有抗血栓的作用，也并未 發(fā)現(xiàn)毛葡萄及其提取物可以用于制備抗血栓藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供毛葡萄及其提取物的新用途，即在制備預防和治療 心腦血管血栓的藥物中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為毛葡萄的提取物在制備預防 和治療心腦血管血栓的藥物中的應用。毛葡萄的不同部位其提取物的成分和比例是不同的，例如其葉子中黃酮的 相對含量大于其根莖中黃酮的含量，優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述毛葡萄的提取物 是以毛葡萄的葉子為原料提取工藝中采用的溶劑和提取方法也會影響提取的效率和所獲得提取物 的組成，本發(fā)明中以水、低級醇、低級酮或乙酸乙酯中的一種或者一種以上的組合作溶劑對毛葡萄進行提??；提取方法可以采用浸泡提取、回流提取、超聲 提取、逆流提取、超臨界萃取中的一種。最終獲得的所述毛葡萄提取物中主要含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、皂苷、無 機營養(yǎng)元素、酚類化合物和/或黃酮。在預防和治療心、腦血管血栓時，毛葡萄用量按體重計算，其用量是提取 物0.05-3000mg/kg/日；優(yōu)選劑量為0.05-1000mg/kg/日；由于不同個體之間 存在差異，本發(fā)明提取物的用量不限于所述范圍。本發(fā)明所述毛葡萄提取物可以制備預防和治療心、腦血管血栓的藥物組合 物，該藥品用于預防心、腦血管血栓的形成制備抗血栓藥物時，可用藥用載 體混合，也可以另外加入各種礦物質(zhì)，優(yōu)選體內(nèi)不足的元素和微量必需元素的 礦物質(zhì)也可以加入其它藥品、天然藥物、氨基酸或維生素。所包括的藥品、 天然藥物、氨基酸或維生素沒有特殊的限制，如阿斯匹林、丹參、水蛭、銀 杏、紅花、當歸、谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、維生素B6維生素B1、維生素C、 維生素E等。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1. 毛葡萄屬常見中草藥，而且從實施例中的毒性實驗可知，本發(fā)明所述的 毛葡萄提取物可用于制備抗血栓藥物，具有顯著療效且無毒副作用；2. 毛葡萄屬來源廣泛，本發(fā)明所述提取方法工藝簡單，因此相對人工合成抗血栓藥物而言，本發(fā)明更加經(jīng)濟、工藝更簡單，同時綠色環(huán)保。


附圖l實施例3中大鼠血栓形成的H-E染色圖(A.對照組，B.丹參組)； 附圖2實施例3中大鼠血栓形成的H-E染色圖(A.大劑量藥物組，B.中劑量藥物組，C.小劑量藥物組)； 附圖3實施例6中大鼠腦栓塞的TTC染色圖(A. 對照組，B.丹參組，C.大劑量藥物組，D.中劑量藥物組，E.小 劑量藥物組)。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖1 3及實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例1,制備毛葡萄提取物制備方法1:取500克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)葉(來源 江西，蘇州大學生藥研究所鑒定)，浸泡于水中，加熱提取3次，每次45分鐘， 合并提取液用蒸發(fā)濃縮至至1000亳升，再用終濃度為50%乙醇沉去雜質(zhì)，過 濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮后的溶液經(jīng)冷凍干燥后得到粉末狀提取物150 克(代號為KXSH-T1), 回收率30%，經(jīng)測定含黃酮25%還含有酚類、 氨基酸、多糖。制備方法2:取500克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)葉(來源 江西，蘇州大學生藥研究所鑒定)，浸泡于70%乙醇中，用回流提取方法提取 3次，每次40分鐘，合并提取液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮后的溶液 經(jīng)冷凍干燥后得到粉末狀提取物125克(代號為KXSH-T2)，回收率25%, 經(jīng)測定含黃酮30%還含有酚類、氨基酸、多糖。制備方法3:取300克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)葉(來源 江西，蘇州大學生藥研究所鑒定)，浸泡于50%丙酮中，用回流提取方法提取 2次，每次40分鐘，合并提取液過濾后蒸發(fā)除去丙酮，濃縮后的溶液經(jīng)干燥 后得到提取物75克(代號為KXSH-T3), 回收率25%,經(jīng)測定含黃酮54.29%。還含有酚類、氨基酸、多糖。 實施例2，毒性實驗用昆明小鼠40只(蘇州大學動物實驗中心提供)，雌雄各半；18-20g,分 對照組20只(雌雄各半)，中藥組20只(雌雄各半)，分養(yǎng)。實驗組24小時 內(nèi)給藥3次，每8小時灌胃l次；給予KXSH-T1每次按0.12g/10g體重灌胃， 總劑量為0.36g/10g體重，相當于正量的230倍。對照組灌生理鹽水，每次 灌胃體積與實驗組相等。灌胃后存活14天，每天觀察兩組小鼠的生活狀態(tài)， 大小便情況，以及體重變化。觀察結(jié)果實驗組和對照組均未發(fā)現(xiàn)動物死亡，兩組的生活狀態(tài)和大、小 便均正常，兩組之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯差別，體重計算如下灌胃前實驗組平均為 17.38g，對照組為17.7g; 灌胃兩周后，實驗組平均為24.64g，對照組為 24.8g;急毒實驗表明，毛葡萄葉提取液在正常用量的230倍沒有發(fā)現(xiàn)任何毒 性反應，該藥安全可靠。實施例3血栓模型(動靜脈旁路模型)先準備好一根塑料管(直徑為0.3 mm)兩 端拉細，管中放置一根6cm的4號線，并灌滿50U/ml肝素。手術(shù)分離右側(cè) 的頸總動脈和左側(cè)的頸外靜脈。靜脈端先結(jié)扎靜脈遠心端，剪開一個小口，將 管向近心端插入并結(jié)扎固定。動脈端先用血管夾夾住近心端，剪開一個小口， 將管向近心端插入并結(jié)扎固定。然后放開血管夾，血流應通暢，計時20分后 將線取出。分別稱量線的濕重和干重，將形成的血栓固定、切片、HE染色， 觀察血栓。腹主動脈取血，離心，取血清，-20lC保存待測TXB2和6-keto-PGF-2a含量。實驗分組及過程SD大鼠50只，雌雄各半，約250g/只，分對照組10 只，中藥大、中、小劑量組(KXSH-T1)和陽性對照組(丹參)，各組動物分養(yǎng)。 大劑量藥物組每天灌中藥4ml (lg/kg體重)；中劑量藥物組每天灌中藥4ml (0.5g/kg體重)小劑量藥物組每天灌中藥4ml (0.25g/kg體重)；對照組灌 生理鹽水4ml/只；陽性對照組丹參(70mg/kg體重)。連續(xù)灌胃9天；第十天 于灌胃1小時后按血栓模型過程行動靜脈旁路手術(shù)。實驗結(jié)果血栓濕重對照組平均為48.60土5.38mg ,丹參組平均為43.1 土4.01mg; 藥物小劑量組42.1士5.42mg;藥物中劑量組41.0士4.08mg;藥物大劑量組 29.3士6.07mg;血栓干重對照組平均為14.10土1.73mg ，丹參組平均為13.0土1.15mg; 藥物小劑量組12.4土1.35mg;藥物中劑量組12.4士0.97mg;藥物大劑量組 9.6士1.26mg;TXB2含量測定結(jié)果對照組平均為295±88 pg/ml, 丹參組平均為277±63 pg/ml;藥物小劑 量組268±29 pg/ml;藥物中劑量組218±8 pg/ml 6:藥物大劑量組258 ±90 pg/ml;6-keto-PGF-2a含量測定結(jié)果對照組平均為81.4±27pg/ml，丹參組平均為118±20 pg/ml;藥物小劑量 組103±18pg/ml;藥物中劑量組125±34pg/ml:藥物大劑量組103±14 pg/ml;血栓H-E染色在顯微鏡下對照組和實驗組均是混合型血栓(紅細胞、 血小板和白細胞組成)，但對照組血小板形成的血栓和血栓中白細胞數(shù)比實驗 組明顯多，特別中劑藥物組血小板形成的結(jié)構(gòu)和白細胞數(shù)明顯少，表明該藥有 明顯抑制血小板和白細胞聚集作用，見附圖l-2。實施例4將大鼠分為4組1、空白對照組每天自來水灌胃5ml/只，連續(xù)7天。 第7天停食，次晨取血檢測。2、血瘀模型對照組每天自來水灌胃5ml/只， 連續(xù)7天，于第7天皮下注射腎上腺素0.08ml/100g體重共2次，兩次間隔4 小時。在兩次注射腎上腺素之間將大鼠浸入冰水內(nèi)5分鐘。處置后停食，次晨 取血檢測。3和4為藥物組共分二組，第3組5ml(lg/kg體重)KXSH-T1灌 胃，第4組5ml(70mg/kg體重)丹參灌胃，連續(xù)7天，于第7天皮下注射腎上 腺素0.08ml/100g體重共2次，兩次間隔4小時。在兩次注射腎上腺素之間將 大鼠浸入冰水內(nèi)5分鐘。處置后停食，次晨取血檢測。從腹主動脈抽血，用于血粘度測定每動物抽2ml枸櫞酸鈉抗凝(1: 9), 用血粘度儀測定；用于血小板凝聚實驗的每動物抽3ml枸櫞酸鈉抗凝(1: 9，， 500轉(zhuǎn)/分鐘，離心l分鐘，取上清(橙黃色，富血小板血漿PRP)做血小板 凝集試驗，后再2500轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘，取上清(乏血小板血漿PPP) 用做儀器調(diào)零，用多功能機能血液凝聚儀檢測血小板凝集。結(jié)果血粘度空白對照組平均為6.6cP;血瘀模型對照組為6.9cP;丹參組為 5.70cP;毛葡萄葉提取液組為4.13cP。血小板凝聚實驗(PAGT)結(jié)果空白對照組PAG平均為34.1:血瘀模 型對照組為51.3;丹參組為29.5;毛葡萄葉提取液組為13.6 。結(jié)果表明毛葡萄提取物有明顯降低血粘度和血小板凝聚作用。實施例5血栓模型(動靜脈旁路模型)先準備好一根塑料管(直徑為0.3 mm)兩 端拉細，管中放置一根6cm的4號線，并灌滿50U/ml肝素。手術(shù)分離右側(cè) 的頸總動脈和左側(cè)的頸外靜脈。靜脈端先結(jié)扎靜脈遠心端，剪開一個小口，將 管向近心端插入并結(jié)扎固定。動脈端先用血管夾夾住近心端，剪開一個小口， 將管向近心端插入并結(jié)扎固定。然后放開血管夾，血流應通暢，計時20分后 將線取出。分別稱量線的重量。實驗分組及過程SD大鼠50只，雌雄各半，約250g/只，分對照組10 只，中藥大、中、小劑量組(KXSH-T2)和兩個陽性對照組(丹參和奧地心血康)， 各組動物分養(yǎng)。大劑量藥物組每天灌中藥4ml(lg/kg體重)；中劑量藥物組每 天灌中藥4ml(0.5g/kg體重)小劑量藥物組每天灌中藥4ml(0.25g/kg體重)； 對照組灌生理鹽水4ml/只；陽性對照組丹參(70mg/kg體重)；陽性對照奧地 心血康(60mg/kg體重)。連續(xù)灌胃7天；第8天于灌胃1小時后按血栓模型 過程行動靜脈旁路手術(shù)。實驗結(jié)果血栓濕重對照組平均為25.08土3.02mg;丹參組平均為25.1 土4.47mg; 藥物小劑量組24.03土2.69mg;藥物中劑量組20.02±3.73mg;藥物大劑量組17.33土3.47mg;奧地心血康組平均為21.73 ± 4.24mg; 該實驗表明該藥有明顯抑制血栓形成作用。實施例6取健康雌性SD大鼠50只，體重250克左右.隨機分為五組取KXSH-T3 做實驗:大劑量藥組(lg/kg體重)；中劑量藥物組(0.5g/kg體重)；小劑量藥 物組(0.25g/kg體重)；對照組灌生理鹽水4ml/只；陽性對照組丹參(70mg/kg 體重)。連續(xù)灌胃7天后作腦栓塞模型，從頸總動脈插入直徑為0.2mm的尼 龍線至頸內(nèi)動脈，從頸內(nèi)、外動脈分叉處計算約18 mm,然后固定并結(jié)扎頸 總動脈。存活24小時后取腦作TTC染色，用醫(yī)學圖像分析儀計算梗死面積。 見附圖3統(tǒng)計結(jié)果如下大劑量組梗死面積占5.82%;中劑組點3.72%;小劑量組 點6.87%;陽性對照丹參組點10.51%;模型(對照)組點9.29%。 結(jié)果表明KXSH-T3抗血栓藥有明顯的抗腦血栓形成作用。
權(quán)利要求
1.一種中草藥提取物，其特征在于所述中草藥提取物為毛葡萄提取物，以水、低級醇、低級酮和乙酸乙酯中的一種或者一種以上的組合作為溶劑，采用浸泡提取法、回流提取法、超聲提取法、逆流提取法或超臨界萃取法中的一種，對毛葡萄進行提取而得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中草藥提取物，其特征在于所述毛葡萄的提 取物以毛葡萄的葉子為原料提取而得。
3. 權(quán)利要求1或2所述的毛葡萄提取物在制備預防和治療心腦血管血栓 的藥物中的應用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛葡萄提取物在制備預防和治療心腦血管血栓 的藥物中的應用，其特征在于毛葡萄提取物在預防和治療心、腦血管血栓時 用量按體重計，提取物的用量是0.05-3000mg/kg/日。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的毛葡萄提取物在制備預防和治療心腦血管血栓 的藥物中的應用，其特征在于毛葡萄提取物在預防和治療心、腦血管血栓時 用量按體重計，提取物的用量是0.05-1000mg/kg/日。
6. —種預防和治療心腦血管血栓的藥物，其特征在于含有權(quán)利要求1所 述的毛葡萄提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了毛葡萄提取物在制備抗血栓藥物中的應用，所述毛葡萄的提取物是以毛葡萄的葉子為原料，以水、低級醇、低級酮和乙酸乙酯作溶劑、或這些溶劑中任選組合的混合溶劑進行提取得到的提取物；提取方法采用浸泡提取、回流提取、超聲提取、逆流提取、超臨界萃取中的一種。本發(fā)明所述的毛葡萄提取物可用于制備抗血栓藥物，具有顯著療效且無毒副作用。
文檔編號A61K36/87GK101264180SQ20081002520
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者吳開云 申請人:蘇州大學