專利名稱：一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋
放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物及其制備方法和藥學(xué)用途，更具體
地說，涉及一種小劑量多次皮下注射后可防治骨質(zhì)疏松癥的人甲狀旁
腺素1-34肽類似物。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥是單位體積內(nèi)骨礦成分和骨基質(zhì)比例不斷減少，骨組 織顯微結(jié)構(gòu)破壞，骨質(zhì)變薄，骨密度降低、骨脆性增加和骨折危險性 升高的一種全身骨代謝障礙疾病。WHO已將骨質(zhì)疏松癥列為影響老年 人身體健康的三大疾病(骨質(zhì)疏松癥、老年性癡呆和糖尿病)之一，并 且是僅次于心血管疾病的第二位疾病，因此預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥已 經(jīng)受到了全世界的關(guān)注。
以往的研究表明人甲狀旁腺素1-34肽[hPTH (1-34)]在體內(nèi)外幾 乎保持有完整人甲狀旁腺素(hPTH)的全部生物活性。小劑量間歇性 注射hPTH(1-34)可刺激成骨細胞增殖及骨小梁增長，它不僅能使已
丟失的松質(zhì)骨重建，骨密度明顯增加，而且能改善骨強度，促進骨膜 形成及骨小梁連續(xù)性。hPTH(l-34)通過激活PTH/PTHrP受體來調(diào)節(jié)成 骨細胞功能。其促進骨組織合成的首要以及必要機制為激活cAMP/PKA
5信號通路。多年的研究表明，hPTH(l-34)第一位的絲氨酸(Ser)和 第二位的纈氨酸(Val)為激活腺苷酸環(huán)化酶所必須的，Ser缺失或 者被修飾，hPTH(l-34)的活力均大大降低。研究人員多次試驗結(jié)果顯 示，由于雌激素不足而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的大鼠皮下小劑量多次注射 Pro-Pro-[Argu]-hPTH (1-34)-Pro-Pro后，骨質(zhì)增加、骨結(jié)構(gòu)改善、 骨韌性增加。
然而hPTH及其相關(guān)肽類藥物的注射劑在治療骨質(zhì)疏松時需要頻
繁給藥給患者帶來極大的不便和痛苦，因此開發(fā)hPTH(l-34)的類似
物的其他非注射給藥途徑使患者順應(yīng)性較好尤為重要。然而，由30
多個氨基酸構(gòu)成的多肽經(jīng)鼻飼或者口服給藥的生物利用度很低，通常
不大于1 % ，鼻飼或者口服給藥的給藥量是注射途徑給藥量的幾十倍。
用化學(xué)合成的方法生產(chǎn)hPTH(l-34)價格昂貴，患者很難承受巨額的
治療費用(約每年7200美元)，因此巿場需要一種具有天然hPTH(l-34)
的促骨合成機制的人甲狀旁腺素1-34肽類似物[hPTH (1-34)類似
物],可通過簡便、高效、低成本的方法進行大規(guī)模制備獲得該產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲 狀旁腺素l-34肽類似物。
本發(fā)明的另 一個目的是提供生產(chǎn)該人甲狀旁腺素l-34肽類似物 的方法。
本發(fā)明的再一個目的是公開該人甲狀旁腺素l-34肽類似物的藥 物用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 所述人甲狀旁腺素l-34肽類似物，其氨基酸序列為 Pro-R「Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu—Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu 一G1n-As p—Va1-H i s-Asn-Phe-Pro-Pro-As p
其中Ri為Pro、 Ala、 Gly、 Ser、 Val或Leu。所述人甲狀旁腺素 1-34肽類似物的制備方法包括重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu) 建步驟，人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體的制備步驟，人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的獲得步驟。所述人甲狀旁腺素1-34肽類似物 用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物的用途。
本發(fā)明的目的還可以通過以下技術(shù)解決措施來進一步實現(xiàn)
所述人甲狀旁腺素1-34肽類似物的優(yōu)選氨基酸序列為 P r o-P r o-S e r-Va1-S e r -G1u-11e-G1n-Leu-Me t -H i s -A s n-Ar g-G1y-Ly s -HisHLeu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Le u-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp (簡稱Y肽鏈)。
所述人甲狀旁腺素l-34肽類似物是一個前體分子，可在體內(nèi)外被 二肽酶IV/CD26識別切割掉N端二肽。
所述人甲狀旁腺素1-34肽類似物的C端天冬氨酸(Asp)和N端脯 氨酸(Pro)可以重復(fù)串聯(lián)形成多聯(lián)體，即一個類似物C端的Asp和下 一個類似物N端的Pro形成酸水解位點，在鹽酸作用下可以斷開，其氨 基酸序列為
Met-X「Asp— (Pro—R「Ser-Va1—Ser-Glu-Ile—Gln-Leu—Met-His-Asn—Arg-Gly-Lys-His—Leu-Asn-Ser-Met—Glu-Arg-Va1—Glu-Trp—Leu-Arg-
Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp) n
其中Xa為含有a個氨基酸殘基的肽鏈(a為非負整數(shù))；n>l。 L肽
鏈序列可以為
Gly-Asp-Glu-Ile-Ile-His-Leu-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ser—Leu—Ala -Leu-Thr-Gin-Thr纟n=8。
在重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建步驟中，質(zhì)粒pET28a 為表達載體質(zhì)粒，質(zhì)粒pED-Pro-Pro-[ArgU]]hPTH (1-34)-Pro-Pro為 模板，是通過PCR反應(yīng)獲得含有人甲狀旁腺素1-34肽類似物基因的 DNA片段的擴增序列，引物的核苷酸序列為 PI: 5'ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3z P2: 5'CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3' P3: 5'AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC3, P4:
5' AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTG GCTCTG3' P5:
5'CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATG AAA3';在人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體的制備步驟中，將重 組基因工程菌BL21/pET-8PTH'經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-乙醇沉淀得到 多聯(lián)體粗品，其中發(fā)酵溫度是36-38°C， pH6.8-7.2;在人甲狀旁腺 素1-34肽類似物的獲得步驟中，將多聯(lián)體粗品經(jīng)酸水解-沉淀-離子交換柱層析純化得到人甲狀旁腺素1-34肽類似物，其中酸水解用 40-60mmol/L濃度的稀鹽酸，CM52陽離子交換樹脂純化，乙酸銨洗脫， 獲得人甲狀旁腺素類似物，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，達到電泳純。其 技術(shù)路線詳述如下
1. 重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建
以質(zhì)粒pED-Pro-Pro-[Arg11]] hPTH (1-34)-Pro-Pro為模板逐步 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-8PTH',將質(zhì)粒pET-8PTH'轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 ^c力er/c力/a co// BL21,得到含有編碼人甲狀旁腺素(1-34)肽類 似物的多聯(lián)體基因的工程菌。
2. 人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的制備
將重組基因工程菌BL21/pET-8PTH'經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-乙醇 沉淀得到多聯(lián)體粗品。
3.人甲狀旁腺素1-34肽類似物的獲得
將多聯(lián)體粗品經(jīng)酸水解-沉淀-離子交換柱層析純化得到人甲狀 旁腺素l-34肽類似物。
所述藥物是含有人甲狀腺旁素1-34肽類似物或其藥物上可接收 鹽的水溶液的制劑，也可以是人甲狀旁腺素l-34肽類似物與若干種 可藥用的載體或賦形劑構(gòu)成的組合物。
本發(fā)明的有益效果為人甲狀旁腺素1-34肽類似物生產(chǎn)成本低、產(chǎn) 量高，可以廣泛用于制備具有天然hPTH (1-34 )肽活性的新的人甲狀 旁腺素制劑。另外，其N端存在二肽酶IV/CD26的識別位點，能使其進 入人體后被二肽酶IV/CD26識別切割，發(fā)揮天然hPTH的生物活性。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
圖1含有編碼人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體基因的工程 菌的構(gòu)建方法。
圖2人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體基因序列T7啟動子 正向測序結(jié)果(圖A),人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體基因序 列T7終止子反向測序結(jié)果(圖B)。
圖3人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體經(jīng)酸水解得到人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的單體的示意圖。
圖4人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的酸水解以及純化 單體的電泳圖。
圖5人甲狀旁腺素l-34肽類似物的電噴霧質(zhì)譜圖。
圖6 SD大鼠皮下注射人甲狀旁腺素1-34肽類似物后血清鈣離
子濃度時效關(guān)系圖。
具體實施例方式
以下通過附圖及實施例對本發(fā)明作進 一 步說明。 一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似 物，其氨基酸序列是
Pro-R廠Ser-Va卜Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu -G1n-A s p-Va1-H i s -A s n-Phe-Pr o-P r o-A s p
其中l(wèi)為Pro、 Ala、 Gly、 Ser、 Val或Leu。該人甲狀旁腺素1-34肽類似物是一個前體分子，可在體內(nèi)外被二肽酶IV/CD26識別切割掉 N端二肽。
該人甲狀旁腺素1-34肽類似物的C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨 酸(Pro)可以重復(fù)串聯(lián)形成多聯(lián)體，即一個類似物C端的Asp和下一 個類似物N端的Pro形成酸水解位點，在鹽酸作用下可以斷開，其氨基 酸序列為
Met-Xa-Asp- (Pro-R「Ser-Val-Ser-Glu-lie-Gin-Leu-Met-His-Asn-A rg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser—Met-Glu—Arg-Val-Glu—Trp—Leu—Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp) n
其中Xa為含有a個氨基酸殘基的肽鏈U為非負整數(shù))；n>l。
人甲狀旁腺素1-34肽類似物的制備方法包括重組質(zhì)粒以及相應(yīng) 的基因工程菌的構(gòu)建步驟，人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的 制備步驟，人甲狀旁腺素l-34肽類似物的獲得步驟。在重組質(zhì)粒以 及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建步驟中，質(zhì)粒pET28a為表達載體質(zhì)粒， 質(zhì)粒pED-Pro-Pro- [Arg11] ] hPTH (1-34) -Pro-Pro為模板，是通過PCR 反應(yīng)獲得含有人甲狀旁腺素1-34肽類似物基因的DM片段的擴增序 列；在人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的制備步驟中，將重組 基因工程菌BL21/pET-8PTH'經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-乙醇沉淀得到多 聯(lián)體粗品，其中發(fā)酵溫度是36-38'C， pH6.8-7.2;在人甲狀旁腺素 1-34肽類似物的獲得步驟中，將多聯(lián)體粗品經(jīng)酸水解-沉淀-離子交 換柱層析純化得到人甲狀旁腺素1-34肽類似物，其中酸水解用 40-60隱ol/L濃度的稀鹽酸，CM52陽離子交換樹脂純化，乙酸銨洗脫， 獲得人甲狀旁腺素類似物，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，達到電泳純。 該人甲狀旁腺素1-34肽類似物可用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物的用途，藥物可以是含有人甲狀腺旁素1-34肽類似物或其藥物上 可接收鹽的水溶液的制劑，也可以是人甲狀旁腺素l-34肽類似物與 若干種可藥用的載體或賦形劑構(gòu)成的組合物。
本說明書中所提到的材料中
(1) 宿主菌和質(zhì)粒
宿主菌i5^c力er/c力/a BL21是基因工程常用工具菌種，質(zhì)粒 pET28a為基因工程常用克隆載體，在與基因工程研究有關(guān)的實驗室 一般都有保存。
(2) 酶和試劑
分子克隆工具酶購自MBI公司；PCR純化試劑盒為Promega公司 產(chǎn)品。
(3) 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻Sambrook J, FristshEF， Maniatis T. Molecular Cloning.， A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。該書是基因工程技術(shù)領(lǐng)域的經(jīng)典
著作，在高校圖書館均有收藏。
(4) CM52陽離子交換樹脂為Whatman公司產(chǎn)品。 本說明書所提到的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA
片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是 常規(guī)搡作方法，參見Sambrook J, FristshEF,Maniatis T. Molecular Cloning^ A Laboratory Manual 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， pp.16-340。
12實施例1
1.重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建
(1)重組質(zhì)粒pET-8PTH'的構(gòu)建
在基因水平上于每個肽單體兩端預(yù)留編碼酸水解位點(Asp-Pro) 的核苷酸序列，設(shè)計引物Pl(含有Xbal酶切位點)和P2(含有HindIII 酶切位點以及編碼Asp的GAT和終止密碼子TAA)，以質(zhì)粒 pED-Pro-Pro-[Arg"]] hPTH (1-34)-Pro-Pro (該質(zhì)粒的構(gòu)建方法見公 開號CN1597697A的專利申請)為模板，用PCR方法擴增得到編碼Y 肽鏈的DNA片段，用XbaI、 HindIII消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消 化的pET28a質(zhì)粒連接，得到載體pED-PT『，該載體中編碼人甲狀旁 腺素1-34肽類似物的核苷酸序列前具有BamHI酶切位點。
設(shè)計編碼Met-Xa-Asp肽鏈(即fusion partner)的序列，其中
Xa為
G1y-As p-G1u-11e-11e-H i s-Leu-Thr-As p-Phe-As p-Va1-Ser-Leu-A1a -Leu-Thr-Gln-Thr，以pED-PTH'為模板，P3(含有BglII酶切位點)、 P4為引物，用PCR反應(yīng)得到一段DNA序列，以該序列為模板，P3、 P5 (含有Xbal酶切位點)為引物，再用PCR反應(yīng)得到編碼 Met-Xa-Asp-PTH'肽鏈的插入序列，用Xbal、 BglII消化，與用Xbal 和BamHI消化的載體pED-PT『連接，得到載體pET-2PTH'。
以pET-2PTH'為模板，P3、 P5為引物，PCR反應(yīng)得到編碼 Met-Xa-Asp-2PTH'肽鏈的插入序列，用Xbal、 BglII消化，與用Xbal 和BamHI消化的載體PET-2PTH'連接，得到載體pET-4PTH'。將含有2段人甲狀旁腺素1-34肽類似物的插入序列Xbal、Bg111 消化后的片段再分次與用Xbal和BamHI消化的載體pET-4PTH'連接 得到pET-6PTH'。
將含有2段人甲狀旁腺素1-34肽類似物的插入序列Xbal、Bg111 消化后的片段再分次與用Xbal和BamHI消化的載體pET-6PTH'連接， 最終得到重組質(zhì)粒pET-8PTH',其步驟見附圖l。 (2)相應(yīng)得基因工程菌的構(gòu)建
轉(zhuǎn)化大腸桿菌^c力er/c力/a co// BL21后經(jīng)PCR篩選，得到重組 基因工程菌BL21/pET-8PTH'。
從該工程菌中抽提的質(zhì)粒由上海英駿公司核苷酸自動測序儀進 行測定，進一步驗證人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體基因序列 的正確性，序列測定結(jié)果見附圖2。 其中，5條引物序列如下 Pl: 5'ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3' P2: 5'CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3z P 3: 5'AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC 3' P4:
5' AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTG GCTCTG3' P5:
5'CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATG AAA3z2.人甲狀旁腺素l-34肽類似物的制備 (1)人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的制備
挑取表達量達50°/。以上的重組基因工程菌BL21/pET-8PTH'接種 到LB培養(yǎng)基中，37t:恒溫過夜培養(yǎng)，按2%比例轉(zhuǎn)接種入新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)4小時后加入終濃度為5mmol/L的乳糖誘導(dǎo)，
繼續(xù)培養(yǎng)。離心回收的菌體按10倍重量體積加入菌體裂解液 (50mmol/L Tris-HCl pH 8. 0, 5隱ol/LEDTA, 0. 75% Triton X-100, 100mg/L溶菌酶)，劇烈混勻，凍融，37'C振搖至溶液不粘稠，12000rpm 離心20分鐘回收沉淀。沉淀按10倍重量體積加入包涵體洗滌液I (50mmol/L Tris-HCl pH8. 0, 5 mmol/LEDTA pH8. 0， 0.75% Triton X-IOO)，洗滌3次，再按相同比例用包涵體洗滌液II (50mmol/L Tris-HCl pH8. 0， 5 mmol/LEDTA pH8. 0， 150mmol/LNaCl, 0. 75% Triton X-100)和III (50mmol/L Tris-HCl pH8. 0, 2mol/LUrea)分別洗滌 l次，每次洗滌后均是12000rpm離心20分鐘，收獲沉淀，得人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體包涵體粗品。
該包涵體粗品按20倍重量體積加入包涵體溶解液(50mmol/L Tris-HCl PH8. 0, 8mol/LUrea)，混勻，4'C緩慢攪拌過夜至包涵體溶 解，離心后收集上清并在上清中加入0. 7倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇， -20'C沉淀20分鐘后離心，上清再加入原體積3. 5倍體積的無水乙醇， -20。C沉淀2小時，離心收集沉淀，干燥，即為人甲狀旁腺素1-34肽 多聯(lián)體粗品。以上每次離心均為12000rpm, 20分鐘。 (2)人甲狀旁腺素l-34肽類似物的制備按每lg多聯(lián)體粗品加入10mL 50隱ol/L HC1溶解，置48。C水浴48 小時。多聯(lián)體粗品酸水解后，用NaOH調(diào)節(jié)水解液pH值至4. 6,有大量 沉淀生成，12000rpm離心20min,去除沉淀后上清液對80mmol/L乙酸 銨透析(透析袋截留分子量為2000Da)后流動上樣于以80mmol/L乙酸 銨平衡的CM5^日離子交換樹脂，以80mmol/L乙酸銨對300mmol/L乙酸
銨進行梯度洗脫，收集樣品峰，透析除鹽，凍千收集純品蛋白，見附 圖3。 SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4，圖中l(wèi).人甲狀旁腺素1-34肽類似 物的多聯(lián)體；2.人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體經(jīng)50mmol/L鹽 酸48'C水洛24h得到的產(chǎn)物；3.人甲狀旁腺素l-34肽類似物的多聯(lián)體 經(jīng)50誦ol/L鹽酸48。C水洛48h得到的產(chǎn)物；4.人甲狀旁腺素l-34肽類 似物的多聯(lián)體酸水解產(chǎn)物調(diào)節(jié)等電點得到的沉淀；5.人甲狀旁腺素 l-34肽類似物的多聯(lián)體酸水解產(chǎn)物調(diào)節(jié)等電點得到的上清；6.陽離 子交換層析(CM-52)得到的穿透峰；7.陽離子交換層析(CM-52 ) 純化后的人甲狀旁腺素1-34肽類似物單體。
凍干品經(jīng)電噴霧質(zhì)譜鑒定，計算得分子量為4663.76Da，與理論 分子量4664. Ol相比誤差小于O. 01%,見附圖5。 3.人甲狀旁腺素1-34肽類似物生物學(xué)活性的檢測
選用平均體重為200g的SD雌性大鼠，人甲狀旁腺素1-34肽類 似物給藥組和hPTH (1-34)對照組各5只。用無菌生理鹽水將人甲 狀旁腺素1-34肽類似物和hPTH (1-34 )分別稀釋至15 " g/mL,每只 大鼠皮下注射lml。分別在給藥前以及給藥后15分鐘、30分鐘、45 分鐘、l小時、2小時、4小時、6小時、8小時和24小時取血，凝血后離心取血清，觀察供測血鉤變化趨勢見附圖6。大鼠血清中鈣離
子濃度隨時間的變化，說明人甲狀旁腺素l-34肽類似物比天然hPTH
(1-34)有相似的生物活性。
除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替 換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。序列表.doc
SEQUENCE LISTING
<110> <120>
<130〉
<160>
<170>
<210〉 <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
中國藥科大學(xué)
一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物及其制備方 法和應(yīng)用
人甲狀旁腺素1-34肽類似物 7
Pateivtln version 3. 5 1
39 PRT
Artificial Sequence
人甲狀旁腺素l-34肽類似物 1
Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His 15 10 15
Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp
20
Val His Asn Phe Pro Pro Asp 35
25 30
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
2
333 PRT
Artificial Sequence
人甲狀旁腺素l-34肽類似物多聯(lián)體
2
Met Gly Asp Glu lie lie His Leu Thr Asp Phe Asp Val Ser Leu Ala 15 10 15
Leu Thr Gin Thr A印Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His
20
25 30
Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg
35
40 45
Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val 50 55 60
Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met
65
70
75 80
Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe
85
90 95
Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Arg
100
105 110
Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys
115
120 125Leu Gin Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu 130 135 140
lie Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg
145 150 155
160
VbI Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp VbI His Asn Phe Pro Pro
165 170
175
Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys
180 185
190
His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin
195 200
205
Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin
210 215
220
Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu
225 230
235 240
Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp Pro
245 250
255
Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu
260 265
270
Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val
275 280
285
His Asn Phe Pro Pro Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met
290 295
300
His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu
305 310
315 320
Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe Pro Pro Asp 325 330
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PI
<400> 3
attcccctct agaaataatt ttgt
<210〉 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2
<400> 4
24ccgcaagctt aatctggcgg gaagttatga aca 33
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> <223> P3
<400> 5
aaaagatctg gcgggaagtt atgaacatc 29
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P4
<400> 6
agatatacat gggcgatgaa atcatccacc tgactgactt cgatgtttct ctggctctg 59
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P5
<400> 7
ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatgggcg atgaaa 5權(quán)利要求
1、一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物，其氨基酸序列為Pro-R1-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp其中R1為Pro、Ala、Gly、Ser、Val或Leu。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲 狀旁腺素1-34肽類似物，其氨基酸序列為P r o-P r o-Se r-Va1-S e r-G1u-11e-G1n-Leu-Me t -H i s -A s n-A r g-G1y-Ly s -His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Le u-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素l-34肽類似物，其特征在于所述人甲狀旁腺素1-34肽類似 物是一個前體分子，可在體內(nèi)外被二肽酶IV/CD26識別切割掉N端二 肽。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素1-34肽類似物，其特征在于所述人甲狀旁腺素1-34肽類似 物C端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(Pro)重復(fù)串聯(lián)形成多聯(lián)體， 是一個類似物C端的Asp和下一個類似物N端的Pro形成酸水解位點， 在鹽酸作用下可以斷開，其氨基酸序列為Met-X「Asp- (Pro-R「Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-A rg-Gly-Lys-His-Leu—Asn-Ser—Met—Glu—Arg-Val-Glu-Trp—Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gin-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp)n 其中Xa為含有a個氨基酸殘基的肽鏈(a為非負整數(shù))；n>l。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素1-34肽類似物，其特征在于所述Xa肽鏈序列為 G1y-As p-G1u-11e-11e-H i s -Leu-Thr-A s p-Phe-A s p-Va1-Se r-Leu-A1 a -Leu-Thr-Gln-Thr; n=8。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的制備方法，包括重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工 程菌的構(gòu)建步驟，人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的制備步驟， 人甲狀旁腺素1-34肽類似物的獲得步驟，其特征在于:在重組質(zhì)粒以 及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建步驟中，質(zhì)粒pET 28a為表達載體質(zhì)粒， 質(zhì)粒pED-Pro-Pro-[Arg11]]hPTH(1-34)-Pro-Pro為模板，是通過PCR 反應(yīng)獲得含有人甲狀旁腺素1-34肽類似物基因的DM片段的擴增序 列，引物的核苷酸序列為PI: 5'ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3'P2: 5'CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3zP3: 5'AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC3zP4:5'AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTG GCTCTG3'P5:5' CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATG AAA3'。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素l-34肽類似物的制備方法，其特征在于:在人甲狀旁腺素1-34 肽類似物的多聯(lián)體的制備步驟中，將重組基因工程菌BL21/pET-8PTH'經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-乙醇沉淀得到多聯(lián)體粗品，其中發(fā)酵溫度是 36-38°C， pH6. 8-7. 2。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的制備方法，其特征在于:在人甲狀旁腺素1-34 肽類似物的獲得步驟中，將多聯(lián)體粗品經(jīng)酸水解-沉淀-離子交換柱層 析純化得到人甲狀旁腺素l-34肽類似物，其中酸水解用40-60mmol/L 濃度的稀鹽酸，CM52陽離子交換樹脂純化，乙酸銨洗脫，獲得人甲 狀旁腺素類似物，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，達到電泳純。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素l-34肽類似物的應(yīng)用，其特征在于:所述的人甲狀旁腺素1-34肽類似物用于制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物的用途。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀 旁腺素1-34肽類似物的應(yīng)用，其特征在于所述藥物是含有人甲狀 旁腺素l-34肽類似物或其藥物上可接收鹽的水溶液的制劑；所述藥 物是人甲狀旁腺素l-34肽類似物與若干種可藥用的載體或賦形劑構(gòu) 成的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，涉及一種能串聯(lián)表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物及其制備方法和用于治療骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用。該hPTH(1-34)類似物的N端存在二肽酶IV/CD26識別位點，能使其在進入體內(nèi)后被二肽酶IV/CD26識別切割，發(fā)揮天然hPTH的防治骨質(zhì)疏松的作用。該hPTH(1-34)類似物的制備方法是一個包括重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌的構(gòu)建、人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯(lián)體的制備、人甲狀旁腺素1-34肽類似物的獲取過程。
文檔編號A61P19/00GK101307105SQ200810025408
公開日2008年11月19日 申請日期2008年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者姣 鳳, 劉景晶, 劉言華, 潔 吳, 尤科軍, 施小明, 曹榮月, 李泰明, 王春曉, 豪 范 申請人:中國藥科大學(xué)