專利名稱：：內毒素吸附劑的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種內毒素吸附劑及制備方法，特別是一種用于血液灌流的內毒素吸附劑及其制備方法。
背景技術：
：內毒素是革蘭氏陰性菌生長時釋放或死亡時由細胞壁裂解產生的一類脂多糖類物質，極微量(納克級)內毒素進入人體就會引起高熱，血管擴張，甚至昏厥或死亡。內毒素血癥是臨床最常見的致死疾病之一，死亡率可達40%-90%。臨床上尚無有效治療內毒素血癥的方法，已有的方法之一是通過鍵合有多粘菌素(PMB)的吸附劑進行血液灌流。其中多粘菌素是一種環(huán)狀十肽，為環(huán)狀結構的7肽和3肽的N端，含有疏脂性和親脂性基團及一個多肽尾。多粘菌素為一種離子表面除垢劑，能破壞革蘭氏陰性菌外層或細胞質膜的通透性。血液灌流療法是依靠吸附劑直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物質，達到凈化血液、緩解和治療疾病的目的。ZL03144231.5號中國發(fā)明專利公開一種內毒素吸附劑及其制備方法，通過以瓊脂為原料，釆取向曱苯-四氯化碳混合液中加瓊脂水溶液的方法，得到球狀瓊脂，經堿性條件下環(huán)氧氯丙烷活化后與二胺反應，產物經與戊二醛反應，產生部分交聯，得到強度較好的珠狀瓊脂作為吸附劑載體。載體與多粘菌素B等含胺基的配基反應后，經NaB&還原，即得到以瓊脂凝膠為載體，固定有效量多粘菌素的內毒素吸附劑。該種內毒素吸附劑的多粘菌素B固載量為10.6-22.5毫克/克吸附劑，內毒素吸附量達0.5-1納克/克吸附劑。200510046452.4號中國發(fā)明專利申請/>開一種用于血液灌流的內毒素吸附劑的制備方法，通過生物相容性好的球形瓊脂糖凝膠為基質，采用環(huán)氧氯丙烷、己二胺、1，1，-羰基二咪唑活化后，4建合多粘菌素B配基后，經NaB&還原，即得到內毒素吸附劑。通過該方法制備的吸附劑多粘菌素B固載量6.12毫克/克吸附劑，內毒素吸附量達22納克/克吸附劑。上述內毒素吸附劑的多粘菌素B固載量均較小，吸附效果不理想。此外，上述內毒素吸附劑在制備過程用環(huán)氧乙基活化基質與配體偶聯時需要堿性條件，pH為9-13，溫度為20-40°C。這樣的條件對作為基質的瓊脂糖凝膠強度破壞較大，使內毒素吸附劑在血液灌流過程容易產生微粒，給使用帶來風險。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種新的內毒素吸附劑的制備方法。為實現上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為內毒素吸附劑的制備方法，以球形多孔纖維素為載體，通過三氯三嗪活化，再與亞磷酸三乙酯偶聯，后固載多粘菌素B,得到內毒素吸附劑。更具體地，包括以下步驟a.三氯三嗪活化球形多孔纖維素向球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加三氯三溱與N,N-二異丙基甲酰胺和二氯乙烷的混合溶液，使三氯三嗪濃度為0.05-1.0克/毫升，控制體系溫度0-5。C，攪拌反應2-6小時；b.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向活化球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加亞磷酸三乙酯，使亞磷酸三乙酯的濃度在0.2-0.3克/毫升，控制體系溫度50-70°C，攪拌反應2-6小時；C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向偶聯活化的球形多孔纖維素的乙醇懸浮液中，加入20-40克/升的多粘菌素B硼酸溶液，控制體系溫度30-40°C，攪拌反應1.5-2.5小時；D.無熱源處理在潔凈環(huán)境中，向固載多粘菌素B的球形多孔纖維素中加入2倍體積的0.1-1N醇-鈉溶液，浸泡1-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。再具體地，包括以下步驟A.三氯三口秦活化球形多孔纖維素向球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加三氯三嗪與N，N-二異丙基曱酰胺和二氯乙烷的混合溶液，使三氯三嗪濃度為0.05-1.0克/毫升，控制體系溫度0-5。C,攪拌反應2-6小時后過濾、洗滌，得到活化球形多孔纖維素；B.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向活化球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加亞磷酸三乙酯，使亞磷酸三乙酯的濃度在0.2-0.3克/毫升，控制體系溫度50-70°C，攪拌反應2-6小時后過濾、洗滌，得到偶聯活化的球形多孔纖維素；C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向偶聯活化的球形多孔纖維素的乙醇懸浮液中，加入20-40克/升的多粘菌素B硼酸溶液，控制體系溫度30-40°C,攪拌反應1.5-2.5小時，過濾、洗滌，得到固載多粘菌素B的內毒素吸附劑；D.無熱源處理在潔凈環(huán)境中，向固載多粘菌素B的球形多孔纖維素中加入2倍體積的0.1-1N醇-鈉溶液，浸泡1-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。上述方法中，內毒素吸附劑是通過將球形多孔纖維素以三氯三溱活化后與亞磷酸三乙(醇)酯偶聯，然后鍵合多粘菌素B。其反應原理如下三氯三,分子中與碳相連的3個氯原子具有很強的親電性，受碳氮雙^t的影響，活性強。隨著第一個氯原子的脫除，三氯三嗪分子中其他氯原子的反應活性降低，需升高反應溫度以促進親核取代反應的進行。亞磷酸三乙酯的磷原子上有一對孤對電子有親核性，易進攻碳氮雙鍵上缺電子的碳，同時亞磷酸三乙酯分子中的三價磷易被三氯三。秦氧化成更穩(wěn)定的五價磷，放出大量的熱。三氯三溱通常在堿的作用下選擇性地與醇反應生成單取代產物，升高溫度使所得的烷氧基取代產物與亞磷酸三乙(醇)酯發(fā)\,0CH2C12a生反應，然后再用堿性更強的多粘菌素B取代磷酸三乙酯，可將多粘菌素B固載在球形多孔纖維素球上，制得吸附性能良好的內毒素吸附劑。上述方法不但工藝過程簡單，多粘菌素B固載量大，而且工藝條件溫和，不會使多粘菌素B在反應過程中發(fā)生結構的改變。此外，通過使用化學鍵合的方式將多粘菌素B連接在載體上，使固載的配基穩(wěn)定，在后續(xù)的滅菌及使用過程中不會大量脫落。本發(fā)明A步驟中的球形多孔纖維素的懸浮液中球形多孔纖維素的濃度可以為60-70克/升。本發(fā)明B步驟中的三氯三嗪與N，N-二異丙基甲酰胺和二氯乙烷的混合溶液中，N，N-二異丙基甲酰胺和二氯乙烷的體積比可以是0.06-0.08。本發(fā)明B步驟中的多粘菌素B硼酸緩沖溶液的PH值可以為9.7。本發(fā)明中對球形多孔纖維素沒有嚴格的限制，但優(yōu)選的是粒徑為20-40毫米的球形多孔纖維素。球形多孔纖維素可以通過商業(yè)途徑購買，可參照現有技術中公知的方法自行制備，亦可參考如下方法制得A.制備纖維素粘膠液將30克脫脂棉，浸漬在270克19°/。的氫氧化鈉水溶液中，室溫下堿化2小時，然后抽濾，擠去堿液，裝入密閉容器內，老化3天。然后向其中加入18克二硫化碳，30。C下磺化5小時左右，得到橙色粘膠液，向其中加入300克6%的氫氧化鈉溶液，攪拌均勻制得纖維素黃原酸酯粘膠液。B.制備交聯球形纖維素顆粒將油相分散劑900克氯苯、320克四氯化碳和2克油酸鉀混合攪拌30分鐘，使之均勻。將水相纖維素黃原酸酯粘膠液300克、致孔劑聚合度為200的聚乙二醇50克和30克交聯劑三偏磷酸鈉混合均勻，調整PH值至IO.2,然后將水相加入到油相中，調整攪拌速度使粘膠液分散成大小適宜的液珠，升溫至5(TC,反應1.5小時，然后升溫到90°C,保溫2小時，攪拌下自然冷卻至室溫，過濾，得到含有致孔劑的交聯纖維素球形顆粒。C.后處理將纖維素球形顆粒用大量自來水沖洗，然后用75%酒精浸泡過夜，再用大量去離子水洗凈，過濾得到球形多孔纖維素顆粒。下面參照具體實施例^t本發(fā)明予以詳細i兌明。具體實施方式實施例1A.三氯三。秦活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素球真空抽濾，除去表面水份。向三口燒瓶中加入50克球形多孔纖維素球，加入100毫升二氯乙烷，調節(jié)體系溫度為4土1。C,攪拌均勻后，緩慢滴加18.2克三氯三嗪和15.8毫升N，N-二異丙基甲酰胺和100毫升二氯乙烷的混合溶液，滴加完成后，繼續(xù)攪拌反應4小時。反應完成后，濾出反應殘液，將活化球形多孔纖維素球用冷無水乙醚洗滌數次，再用大量的純化水洗滌，濾干得活化球形多孔纖維素，備用。B.活化球形多孔纖維素與亞磚酸三乙酯偶聯向三口燒瓶中加入上述活化球形多孔纖維素，加入200毫升二氯乙烷，攪拌使活化球形多孔纖維素懸浮，緩慢滴加44克亞200810028948.2說明書第7/ll頁磷酸三乙酯。滴加完成后，體系升溫至7(TC,繼續(xù)攪拌反應6小時。反應完成后，濾出反應殘液，用正己》克洗滌it次，以除去未反應的亞磷酸三乙酯，再用無水乙醚洗滌數次，最后用純化水洗滌，濾千水份得偶聯球形多孔纖維素，備用。C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B先稱取30克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至31±1。C,攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7,得到多粘菌素B硼酸溶液備用。將偶聯纖維素球加入四口燒瓶中，加入100毫升乙醇，攪拌30分鐘后，快速加入上述多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至31土rC,用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7,反應2小時。反應完成后，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B的球形多孔纖維素，用純化水洗滌兩次，室溫保存。D.去熱源處理1.4克氫氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95%酒精，混合均勻得0.5N醇-鈉溶液。將固載多粘菌素B的球形多孔纖維素加入至上述0.5N醇-鈉溶液中，浸泡2小時，用注射用水洗至中性，得無熱原的內毒素吸附劑一。實施例2A.三氯三溱活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素球真空抽濾，除去表面水份。向三口燒并瓦中加入50克球形多孔纖維素球，加入100毫升二氯乙烷，調節(jié)體系溫度為i±rc,攪拌均勻后，緩慢滴加22.8克三氯三嗪和14毫升N,N-二異丙基曱酰胺和100亳升二氯乙烷的混合溶液，滴加完成后，繼續(xù)攪拌反應6小時。反應完成后，濾出反應殘液，將活化球形多孔纖維素用冷無水乙瞇洗滌數次，再用大量的純化水洗滌，濾干得活化球形多孔纖維素，備用。B.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向三口燒并瓦中加入上述活化球形多孔纖維素，加入200亳升二氯乙烷，攪拌使活化球形多孔纖維素懸浮，緩慢滴加60克亞磷酸三乙酯。滴加完成后，體系升溫至5(TC繼續(xù)攪拌反應4小時。反應完成后，濾出反應殘液，用正己》克洗滌凄丈次，以除去未反應的亞磷酸三乙酯，再用無水乙醚洗滌數次，最后用純化水洗滌，濾千水份得偶聯球形多孔纖維素，備用。C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B先稱取30克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至31±1°C，攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7，得到多粘菌素B硼酸溶液備用。將偶聯球形多孔纖維素加入四口燒瓶中，加入100毫升乙醇，攪拌30分鐘后，快速加入上述多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至39土rC，用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7,反應1.5小時。反應完成后，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B球形多孔纖維素，用純化水洗滌兩次，室溫保存。D.吸附劑去熱源1.4克氫氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95%酒精，混合均勻得0.5N醇-鈉溶液。將固載多粘菌素的球形多孔纖維素加入至上述0.5N醇-鈉溶液中，浸泡2小時，用注射用水洗至中性，得無熱原的內毒素吸附劑二。實施例3A.三氯三溱活化球形多孔纖維素先將球形多孔纖維素球真空抽濾，除去表面水份。向三口燒瓶中加入50克球形多孔纖維素球，加入100毫升二氯乙烷，調節(jié)體系溫度為3±rc,攪拌均勻后，緩慢滴加11.4克三氯三嗪和12毫升N，N-二異丙基甲酰胺和100毫升二氯乙烷的混合溶液，滴加完成后，繼續(xù)攪拌反應2小時。反應完成后，濾出反應殘液，將活化球形多孔纖維素用冷無水乙醚洗滌數次，再用大量的純化水洗滌，濾干得活化球形多孔纖維素，備用。B.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向三口燒瓶中加入上述活化球形多孔纖維素，加入200毫升二氯乙烷，攪拌使活化球形多孔纖維素懸浮，緩慢滴加50克亞磷酸三乙酯。滴加完成后，體系升溫至6(TC繼續(xù)攪拌反應2小時。反應完成后，濾出反應殘液，用正己烷洗滌數次，以除去未反應的亞^^酸三乙酯，再用無水乙醚洗滌^t次，最后用純化水洗滌，濾干水份得偶聯活化球形多孔纖維素，備用。C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B先稱取30克多粘菌素B硫酸鹽，加入1升pH值為9.7的硼酸緩沖溶液中，升溫至3i±rc，攪拌溶解1小時，用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7,制得多粘菌素B硼酸溶液備用。將偶聯活化^^形多纖維素加入四口燒并瓦中，加入100毫升乙醇，攪拌30分鐘后，快速加入上述多粘菌素B硼酸溶液，開啟攪拌，升溫至35土rC,用5N氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至9.7,反應2.5小時。反應完成后，濾出反應殘液，得到約50毫升左右固載多粘菌素B的球形多孔纖維素，用純化水洗滌兩次，室溫保存。D.吸附劑去熱源1.4克氫氧化鈉溶解于84毫升純化水中，再加入36毫升95%酒精，混合均勻得0.5N醇-鈉溶液。將固載多粘菌素B球形多孔纖維素加入至上述0.5N醇-鈉溶液中，浸泡2小時，用注射用水洗至中性，得無熱原的內毒素吸附劑二。檢測方法1、內毒素吸附劑多粘菌素B固載量檢測將無熱原的內毒素吸附劑裝入直徑4厘米的砂芯漏斗，內毒素吸附劑在砂芯漏斗中的高度為2厘米，將砂芯漏斗裝在抽濾裝置上，開啟真空泵抽濾1分鐘，抽千球表面水份，在電子天平上準確稱量內毒素吸附劑0.0500克置于25毫升比色管中，每個樣品作一平行管，加水4.0毫升，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04(pH值=8.04)緩沖溶液各1.0毫升，混勻，于80。C反應30分鐘，冷卻至室溫加水至25毫升混勻，靜止10分鐘，于570納米處耳又各樣品管內溶液才企測0D值。取25毫升比色管6支，向其中分別加入200微克/毫升多粘菌素B溶液O、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5毫升，加水稀釋至4.0毫升，再向各管中加入2%茚三酮溶液和Na2HP04-KH2P04(pH值=8.04)緩沖溶液各1.0毫升，混勻，于80。C反應30分鐘，冷卻至室溫加水至25毫升混勻，靜止10分鐘，于570納米處檢測OD值。根據標準溶液和吸光度回歸線性方程，由內毒素吸附劑的吸光度在線性方程上求得內毒素吸附劑上多粘菌素B的固載量，以毫克/克吸附劑表示。2、吸附劑內毒素吸附量檢測在潔凈環(huán)境中，稱無熱原吸附劑1克于so毫升去熱原錐形瓶中，用滅菌注射用水沖洗兩次，吸干表面水份，加入25毫升10納克/毫升的內毒素溶液，蓋上瓶塞，密封。同時做細菌內毒素檢查用水空白樣和內毒素溶液原始樣。放入恒溫水浴振蕩器中，設定溫度37°C，190轉/分鐘，振蕩吸附2小時，用顯色基質鱟試劑法檢測內毒素溶液濃度，計算吸附劑內毒素吸附量以納克/克吸附劑。按照上述方法對通過實施例1、2、3制得的內毒素吸附劑一、內毒素吸附劑二、內毒素吸附劑三進行檢測，檢測結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>根據上表的檢測結果，可以看出通過本發(fā)明方法制備的內毒素吸附劑，其多粘菌素B的固載量及內毒素的吸附量均遠遠大于現有技術中的內毒素吸附劑?；诒景l(fā)明精神或主要特征的具體形式并不僅限于上述實施例，還可有多種組合或變化，如B步驟中的各種時間、溫度等均可在一定程度上進行調整，因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的上述實施方式都只能認為是對本發(fā)明的說明而不能限制本發(fā)明，在與本發(fā)明權利要求書相當的含義和范圍內的任何變化，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。權利要求1、內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于以球形多孔纖維素為載體，通過三氯三嗪活化，再與亞磷酸三乙酯偶聯，后固載多粘菌素B，得到內毒素吸附劑。2、根據權利要求1所述的內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.三氯三溱活化球形多孔纖維素向球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加三氯三溱與n，n-二異丙基曱酰胺和二氯乙烷的混合溶液，使三氯三溱濃度為0.05-1.0克/毫升，控制體系溫度0-5°c,攪拌反應2-6小時；b.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向活化球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加亞磷酸三乙酯，使亞磷酸三乙酯的濃度在0.2-0.3克/毫升，控制體系溫度50-70°c,攪拌反應2-6小時；C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向偶聯活化的球形多孔纖維素的乙醇懸浮液中，加入20-40克/升的多粘菌素b硼酸溶液，控制體系溫度30-40°c,攪拌反應1.5-2.5小時；D.無熱源處J里在潔凈環(huán)境中，向固載多粘菌素b的球形多孔纖維素中加入2倍體積的0.1-in醇-鈉溶液，浸泡1-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。3、根據權利要求1所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟A.三氯三。秦活化球形多孔纖維素向球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加三氯三溱與N，N-二異丙基甲酰胺和二氯乙烷的混合溶液，使三氯三。秦濃度為0.G5-1.0克/毫升，控制體系溫度0-5°C,攪拌反應2-6小時后過濾、洗滌，得到活化球形多孔纖維素；B.活化球形多孔纖維素與亞磷酸三乙酯偶聯向活化球形多孔纖維素的二氯乙烷懸浮液中，緩慢滴加亞磷酸三乙酯，使亞磷酸三乙酯的濃度在0.2-0.3克/毫升，控制體系溫度50-70°C,攪拌反應2-6小時后過濾、洗滌，得到偶聯活化的球形多孔纖維素；C.偶聯活化球形多孔纖維素固載多粘菌素B向偶聯活化的球形多孔纖維素的乙醇懸浮液中，加入20-40克/升的多粘菌素B硼酸溶液，控制體系溫度30-40°C，攪拌反應1.5-2.5小時，過濾、洗滌，得到固載多粘菌素B的球形多孔纖維素；D.無熱源處理在潔凈環(huán)境中，向固載多粘菌素B的球形多孔纖維素中加入2倍體積的0.1-1N醇-鈉溶液，浸泡1-4小時，用滅菌注射用水沖洗至中性。4、根據權利要求2或3所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述B步驟中的三氯三。秦與N，N-二異丙基曱酰胺和二氯乙烷的混合溶液中，N,N-二異丙基曱酰胺和二氯乙烷的體積比0.06-0.08。5、根據權利要求2或3所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述A步驟中的球形多孔纖維素的懸浮液中球形多孔纖維素的濃度為60-70克/升。6、根據權利要求2或3所述內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述B步驟中的多粘菌素B硼酸緩沖溶液的PH值為9.7。7、根據權利要求1至3任一項所述的內毒素吸附劑的制備方法，其特征在于所述球形多孔纖維素的粒徑為0.2-0.4毫米。全文摘要內毒素吸附劑的制備方法，以球形多孔纖維素為載體，通過三氯三嗪活化，再與亞磷酸三乙酯偶聯，后固載多粘菌素B，得到內毒素吸附劑。通過該方法制得的內毒素吸附劑性能穩(wěn)定，吸附性能好。文檔編號A61M1/00GK101322934SQ200810028948公開日2008年12月17日申請日期2008年6月17日優(yōu)先權日2008年6月17日發(fā)明者凡董申請人:珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司