專利名稱：采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用組織工程生物技術(shù)構(gòu)建器官型全層皮膚的方法，可以用于替 代活體動(dòng)物(人體)皮膚用于毒理學(xué)試驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，是外源化學(xué)因素(化學(xué)品、藥品等)或物理機(jī)械因素(紫 外線)毒性作用的器官。利用動(dòng)物或人體皮膚進(jìn)行皮膚毒性測(cè)試是藥品、食品添加劑 及原料、農(nóng)藥、生物制品、化學(xué)品健康安全評(píng)價(jià)的常用檢測(cè)項(xiàng)目。傳統(tǒng)的皮膚安全性 評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)不僅要求一定數(shù)量的動(dòng)物，而且試驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，某些反應(yīng)會(huì)給動(dòng)物造 成極大的痛苦。隨著國(guó)際動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利運(yùn)動(dòng)的興起，40多年前國(guó)外最先提出了 以〃減少〃、 〃替代〃和〃優(yōu)化"為代表的3R原則，并在此基礎(chǔ)上大力開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代 方法的研究。特別是近20年，不再以動(dòng)物模式為基礎(chǔ)的毒理學(xué)系統(tǒng)已被科學(xué)家采用 并被許多國(guó)家的政府、歐洲和國(guó)際法規(guī)所接受。2002年11月7日歐洲議會(huì)與歐盟理 事會(huì)在布魯塞爾達(dá)成協(xié)議，決定"從2009年起在歐盟范圍內(nèi)禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝 品毒性和過(guò)敏實(shí)驗(yàn)"，也"不允許成員國(guó)從外國(guó)進(jìn)口和銷售進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的化妝品"。 歐盟新化學(xué)品法規(guī)REACH (化學(xué)品的注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制)也提出鼓勵(lì)動(dòng)物試驗(yàn) 替代方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。采用體外構(gòu)建的組織工程皮膚進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)是動(dòng)物試驗(yàn)替代 技術(shù)的關(guān)鍵領(lǐng)域之一。
組織工程化皮膚分為組織型表皮替代物、真皮替代物和器官型全層皮膚替代物幾 類。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纖維細(xì)胞作滋養(yǎng)層，體外培養(yǎng)人自體表 皮纟田胞獲得成功(Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinozytes: the formation of keratinizing colonies from singlecells. Cell. 1975， 6:331-344)。美國(guó)Advanced Tissue Science公司生產(chǎn)的商品名 為Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、 PGL網(wǎng)為基礎(chǔ)，植入新生兒成纖維細(xì)胞 后培養(yǎng)成人工真皮替代物，結(jié)合自體表皮膜片用于臨床移植(Hansbrough JF, Dore C， Hansbrough WB. Clinical trails of a living dermal tissue replacement placed beneath mesh, split—thickness skin grafts on excised burn wounds. J Burn Care Rehabil， 1992， 13:519-529)。美國(guó)Organogenesis公司生產(chǎn)的Testskin人工皮月夫 模型，其表皮層由人角質(zhì)細(xì)胞分化形成，真皮層由人成纖維細(xì)胞種植于I型牛膠原支 架構(gòu)成 (Rodriguez H, 0'Connell C， Barker PE, et al. Measurement of DNA biomarkers for the safety of tissue-engineered medical products, using artificial skin as a model. Tissue Eng，2004, 10 (9-10):1332-1345)。 2001年2 月6 Fl伍津津等人申請(qǐng)了有關(guān)專利(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1107099. 4)，該發(fā)明包括膠原 凝膠的制備和細(xì)胞的三維培養(yǎng)等。2002年9月2日金巖等人申請(qǐng)了有關(guān)專利(中國(guó)專 利申請(qǐng)?zhí)?2139398. 2)，該發(fā)明包括膠原凝膠的制備和全層皮膚的培養(yǎng)等內(nèi)容。但這 幾種皮膚替代物主要用于燒傷和潰瘍、創(chuàng)傷等皮膚缺損病人的臨床治療，還不能替代 活體動(dòng)物皮膚成熟用于皮膚毒性檢驗(yàn)。作為組織工程皮膚也存在以下缺點(diǎn)人工表皮 由于不含真皮層，還不是真正意義上的人工皮膚；含雙層結(jié)構(gòu)的人工皮膚組織構(gòu)造上 還有待改進(jìn)；培養(yǎng)周期長(zhǎng)，皮膚功能在體外維持時(shí)間短，不適用于慢性毒性試驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題，就是提供一種采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器 官型人工皮膚的方法，該方法培養(yǎng)周期短，皮膚功能和活性在體外維持時(shí)間長(zhǎng)。能滿 足毒性檢驗(yàn)領(lǐng)域的需要。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明依次包括以下幾個(gè)步驟
1、制作由膠原與細(xì)胞外基質(zhì)混合物組成的復(fù)合膠原真皮支架1) 將殼聚糖與透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素兩者之一或全部混合制備成細(xì)胞 外基質(zhì)混合物；采用殼聚糖與透明質(zhì)酸混合時(shí)質(zhì)量比例為6.5 — 7.5: 2.5_ 3.5;采用殼聚糖與6-硫酸軟骨素時(shí)質(zhì)量比例為7.0 — 7.5: 2.5 — 3.0;采用殼 聚糖、透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素全部混合時(shí)質(zhì)量比例為4.5 — 5.5: 2.5 — 3.5: 1.5 — 2.5;
2) 在無(wú)菌條件下將膠原浸泡于冰冷-4'C、 0. 1%的醋酸溶液中，膠原濃度 為8-10mg/ml范圍，調(diào)節(jié)PH值到7. 2 — 7.3制備膠原溶液，操作應(yīng)在4"進(jìn)行；
3) 在膠原溶液中加入l)步驟所得的細(xì)胞外基質(zhì)混合物，得到復(fù)合膠原 溶液，復(fù)合膠原溶液中細(xì)胞外基質(zhì)混合物與膠原的質(zhì)量比例為2-2. 5: 7. 5-8;
4) 取lml制備好的復(fù)合膠原溶液置于孔徑為3.5 cm的圓形模具中或6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用0. lml的1%—1.5%的戊二醛溶液4'C共價(jià)交聯(lián)24士0. 5 小時(shí)，用0. 1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2-3次，制成海綿狀復(fù)合膠原 基質(zhì)；
5) 將復(fù)合膠原基質(zhì)用波長(zhǎng)254nm、36W的紫外線照射除菌后放置在-25 °C一-3CTC低溫冰箱冷凍過(guò)夜12-18小時(shí)，然后再在一50。C55°C、 1 Pa條 件下，凍干機(jī)真空冷凍干燥24土1小時(shí)，制備復(fù)合膠原真皮支架；
2、原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備
1) 將手術(shù)環(huán)切下的新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0. 1mol/LPBS緩沖液徹 底清洗，無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1.0mmX1.5mm的皮片， 用質(zhì)量濃度0. 25。/。裂解酶(Dispases)分離表皮和真皮，方式有37"C消化2± 0. 5小時(shí)或是4。C過(guò)夜12-18小時(shí)，生理鹽水或D-Hanks液清洗3-5次；
2) 表皮部分用質(zhì)量濃度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用角質(zhì)細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5% C02 37。C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 — 15min，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，用角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)人角質(zhì)細(xì)胞，每48-60小時(shí)半量換液；
3)真皮部分以0. 125%胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，放入含10% 新生牛血清高糖DMEM (H-固EM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24-36小時(shí)半量換液；
3、 人工真皮替代物制備
將第1步所得之復(fù)合膠原真皮支架置于12孔嵌入式培養(yǎng)皿上，加入含有10% 新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)，以最小容量100-200 u 1接種第2步3)培養(yǎng) 基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1 X 105Cell/cm2 — 2X 10Scell/cm、待4-8小時(shí)細(xì)胞粘附后，加1. 5_2ml足量含10%新生牛血清的H-DMEM 培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每36-48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)7-IO天，完成人工真皮替代物構(gòu) 建；所說(shuō)的嵌入式培養(yǎng)皿為Corning Costar公司的Transwell或millpore公司 的millcell，孔徑0. m，底部支持膜為透明的聚酯膜，使用前包被濃度為0. 4% 的人源IV型膠原蛋白；
4、 人工皮膚專用培養(yǎng)基制備
無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青 霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，轉(zhuǎn)移到H-DMEM液中；在無(wú)菌環(huán)境下， 按培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，使羊膜上皮面向上全鋪或半 鋪布于6孔板的孔底，然后加入角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，收集羊膜分泌液；
取角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基與人羊膜分泌液按體積比8—8. 5:1. 5 — 2混合，再添加 5X1(T1Q M霍亂毒素，2. 5yg/ml氫化可的松、25ug/ml胰島素、25ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白 和IXIO -1Q M甲狀腺素T3、 0. 001ng/mL人重組EGF、 24.3 ug/mL腺嘌呤活性成分， 配制成人工皮膚專用培養(yǎng)基；
5、 器官型全層人工皮膚制備在第3步所述人工真皮替代物上接種第2步2)原代培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，接種細(xì) 胞密度為1 x 105cell/cm2-2 x 105Cell/Cm2，用第4步制備的人工皮膚專用培養(yǎng)基代替 角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和含10y。新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，采用氣-液界面培養(yǎng)， 每48-60小時(shí)半量換液，8-10天后完成人工皮膚初級(jí)產(chǎn)品制備；
6、檢測(cè)
同一批以12孔培養(yǎng)板制備的人工皮膚中，取其中一塊人工皮膚從嵌入式培養(yǎng)皿取 下，固定于以PBS配制的4。/。多聚甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5" m—6um，蘇木素-伊紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)去除皮膚結(jié) 構(gòu)不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量 少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層和角化層三層結(jié)構(gòu)；真皮層含大量 成纖維細(xì)胞，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯的人工皮膚產(chǎn)品，可用于皮膚 毒性檢測(cè)試驗(yàn)。
所述的膠原為商品，主要成份為來(lái)源于牛肌腱或豬皮或鼠尾的I型膠原粉末。 所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM-KC)為商業(yè)化購(gòu)自國(guó)外公司，如美國(guó) BioWhiUaker公司的KBM(Keratin。cyte Basal Medium)或GIBC0公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
所述的真皮支架也可委托商業(yè)公司制備，以實(shí)現(xiàn)真皮支架的標(biāo)準(zhǔn)化。
所得的人工皮膚產(chǎn)品用于皮膚刺激性檢測(cè)化妝品、化學(xué)品等固體或液體受試物
直接放置于人工皮膚表面，液體用量為10yl，固體用量為(10士2)mg并涂布均勻， 作用(15±1)分鐘后，以無(wú)菌PBS沖洗去除受試物再孵育(42±1)小時(shí)。取下嵌入 式培養(yǎng)皿的半透支持膜,部分組織固定于多聚甲醛，HE染色觀察組織病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)； 部分組織采用MTT法分析細(xì)胞活性，或用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-2等毒性 效應(yīng)指標(biāo)。所說(shuō)的MTT法為一種檢驗(yàn)細(xì)胞活性的常規(guī)方法，所說(shuō)的ELISA檢測(cè)法為一種檢測(cè) 細(xì)胞因子的常規(guī)方法。
有益效果本發(fā)明的方法培養(yǎng)人工皮膚周期短，皮膚功能和活性在體外維持時(shí)間 較長(zhǎng)，能滿足毒性檢驗(yàn)領(lǐng)域的需要，制備的人工皮膚重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化程度高。通過(guò) 本發(fā)明制備的器官型全層皮膚在解剖和組織結(jié)構(gòu)上更接近于天然皮膚，其應(yīng)用于毒性 檢驗(yàn)的方式和檢測(cè)指標(biāo)更符合皮膚毒性作用的實(shí)際情況，可以代替整體動(dòng)物，直接應(yīng) 用于化學(xué)品、化妝品、藥品、農(nóng)藥等健康相關(guān)產(chǎn)品的皮膚毒性試驗(yàn)。


圖1為嵌入式培養(yǎng)毒性檢驗(yàn)用器官型全層人工皮膚的模式圖； 圖2器官型全層人工皮膚組織結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式
參見(jiàn)圖1和圖2。
圖1為嵌入式培養(yǎng)毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的模式圖
圖2所示為器官型全層人工皮膚組織結(jié)構(gòu)圖，HE染色，生物顯微鏡觀察，放大倍 數(shù)200倍。
本發(fā)明的采用嵌入式培養(yǎng)法三維構(gòu)建雙層活性人工皮膚的方法，依次包括以下幾 個(gè)歩驟
實(shí)施例1
1、制作真皮支架
1) 預(yù)先將殼聚糖、透明質(zhì)酸和6-硫酸軟骨素按質(zhì)量比例5: 3: 2用普通方 式混合，制備細(xì)胞外基質(zhì)混合物；
2) 無(wú)菌條件下，將來(lái)源于牛肌腱的膠原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中， 使膠原濃度為10mg/ml，調(diào)節(jié)PH值到7. 2制備膠原溶液，操作應(yīng)在4'C進(jìn)行；3) 然后將預(yù)先混合好的細(xì)胞外基質(zhì)混合物加入牛膠原溶液中，制得復(fù)合膠原 溶液，膠原與細(xì)胞外基質(zhì)混合物質(zhì)量比例為8: 2;
4) 取lml制備好的復(fù)合膠原溶液置于孔徑為3.5 cm的6孔培養(yǎng)板中，用 0. lml的1.5%的戊二醛溶液4'C共價(jià)交聯(lián)24小時(shí)，用0. 1mol/L磷酸鹽緩沖 液(PBS)漂洗3次，制成海綿狀復(fù)合膠原基質(zhì)；
5) 將復(fù)合膠原基質(zhì)用波長(zhǎng)254 nm、 36W的紫外線照射除菌后放置在-28°C 低溫冰箱冷凍過(guò)夜15小時(shí)，然后再在—52°C、 1 Pa條件下，凍干機(jī)真空冷 凍干燥24 h，制備復(fù)合膠原真皮支架；所得真皮支架呈多孔狀結(jié)構(gòu)，厚約3mm 士lmm，孔徑70士20um;真皮支架也可委托商業(yè)公司制備，以實(shí)現(xiàn)真皮支架 的標(biāo)準(zhǔn)化；
2、原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備
1) 將手術(shù)環(huán)切下的新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0. 1mol/LPBS緩沖液徹 底清洗，無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1. 0mmX 1. 5mm的皮片， 用質(zhì)量濃度0. 25y。裂解酶(Dispases))4'C過(guò)夜冷消化15小時(shí)，分離表皮和真 皮，生理鹽水或D-Hanks液清洗3次；
2) 表皮部分用質(zhì)量濃度0. 25%胰酶+0. 0P/。EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用角質(zhì)細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5% C02 37 。C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10min，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，用角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)；所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM-KC)為商業(yè)化購(gòu)自國(guó)外公 司，如美國(guó)BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBC0 公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte SFM)，每48小時(shí)半量換液;
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化獲取成纖維細(xì)胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24小時(shí)半量換液；3、 人工真皮替代物制備
將第1步所得之復(fù)合膠原真皮支架置于12孔嵌入式培養(yǎng)皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)，以最小容量150 u 1接種第2步3)培養(yǎng)基懸浮的原代 培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1.5X105cell/cm2， 4小時(shí)后細(xì)胞粘附，加1.5ml 含10%新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每36小時(shí)半量換液，培養(yǎng)8天，完成 人工真皮替代物構(gòu)建；所說(shuō)的嵌入式培養(yǎng)皿為Corning Costar公司的Transwell，孔 徑0.4iim，底部支持膜最好為透明的聚酯膜，使用前包被濃度為0.4。/。的人源IV型膠 原纖維；
4、 人工皮膚專用培養(yǎng)基制備
無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青 霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，轉(zhuǎn)移到H-DMEM液中；在無(wú)菌環(huán)境下， 按培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，使羊膜上皮面向上全鋪或半 鋪布于6孔板的孔底，然后加入角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，收集羊膜分泌液；
取角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基與人羊膜分泌液按體積比8:2混合，再添加5X1(T1Q M 霍亂毒素，2. 5ug/tnl氫化可的松、25wg/ml胰島素、25 y g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和1 X 10 "° M甲狀腺素T3、 0. 001ng/mL人重組EGF、 24.3 ug./mL腺嘌呤活性成分，配制成人工 皮膚專用培養(yǎng)基；
所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基為商業(yè)化購(gòu)買美國(guó)BioWhiUaker公司的KBM (Keratinocyte Basal Medium)角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基
5、 器官型全層人工皮膚培養(yǎng)
在第3步所述生長(zhǎng)于嵌入式培養(yǎng)皿上的人工真皮替代物上接種原代培養(yǎng)的人角質(zhì) 細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為lxl05cell/cm2;用第4步配制的人工皮膚專用培養(yǎng)基培養(yǎng)代 替含血清的H-DMEM培養(yǎng)基，氣-液界面培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，8-10天后完成人工皮膚初級(jí)產(chǎn)品構(gòu)建； 6、檢驗(yàn)
將構(gòu)建好的組織工程人工皮膚從嵌入式培養(yǎng)皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5tim—6pm，蘇木素-伊紅(H. E)染色；
顯微鏡下觀察該批次的人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)，如表皮層應(yīng)含基底層、棘層和角化 層三層結(jié)構(gòu)；真皮層應(yīng)含大量成纖維細(xì)胞，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯。 則該批人工皮膚可用于毒性檢驗(yàn)。
實(shí)施例2
1、制作真皮支架
1) 預(yù)先將殼聚糖和透明質(zhì)酸按質(zhì)量比例7.2: 2: 8用普通方式混合，制備細(xì) 胞外基質(zhì)混合物；
2) 無(wú)菌條件下，將來(lái)源于豬皮的膠原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中，使 膠原濃度為8mg/ml，調(diào)節(jié)PH值到7. 25制備膠原溶液，操作應(yīng)在4'C進(jìn)行， 先將以免豬膠原降解；
3) 將預(yù)先混合好的細(xì)胞外基質(zhì)混合物按與豬膠原質(zhì)量比例為2.5: 7.5加入 豬膠原溶液中，制得復(fù)合膠原溶液；
4) lml制備好的復(fù)合膠原溶液置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用0. lml的1.25%的 戊二酸溶液4。C共價(jià)交聯(lián)24.5小時(shí)，用O. 1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS) 漂洗3次，制成海綿狀復(fù)合膠原基質(zhì)；
5) 將復(fù)合膠原基質(zhì)用波長(zhǎng)254 nm、 36W的紫外線照射除菌后放置在-25'C低 溫冰箱冷凍過(guò)夜18小時(shí)，然后再在一53。C、 1Pa條件下，凍干機(jī)真空冷 凍干燥23h，制備復(fù)合膠原真皮支架；所得真皮支架呈多孔狀結(jié)構(gòu)，厚約 3誦，孔徑80士20ym;2、 人成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備
1) 將手術(shù)環(huán)切下的新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0. 1mol/LPBS緩沖液徹 底清洗，無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1.0mmX1.5mm的皮片， 用質(zhì)量濃度0. 25。/。裂解酶(Dispases)37'C消化2小時(shí)，分離表皮和真皮，生 理鹽水或D-Hanks液清洗5次；
2) 表皮部分用質(zhì)量濃度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用角質(zhì)細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5% C02 37 "C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15min，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，用角質(zhì)細(xì)胞專用培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)，每54小時(shí)半量換液，；
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化獲取成纖維細(xì)胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每30小時(shí)半量換液，；
3、 真皮替代物制備
將第1步所得之復(fù)合膠原真皮支架置于12孔嵌入式培養(yǎng)皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)，以最小容量150ul接種第2步3)培養(yǎng)基懸浮的原代 培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1. 5X105cell/cm2，待6小時(shí)細(xì)胞粘附后，加2ml 含1(F。新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每42小時(shí)半量換液，培養(yǎng)8天，完成 真皮構(gòu)建；所說(shuō)的嵌入式培養(yǎng)皿為millpore公司的millcell，孔徑0.4nm，底部支 持膜為透明的聚酯膜，使用前包被濃度為0.4。/。的人源IV型膠原纖維；.
4、 人工皮膚無(wú)血清專用培養(yǎng)基配制
商業(yè)化購(gòu)買GIBCO公司DK-SFM (Defined Keratinocyte SFM)角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清 培養(yǎng)基，與無(wú)菌條件下收集的羊膜分泌液，按體積比8.2: 1.8混合；然后添加5X10-w M霍亂毒素，2. 5 P g/ml氫化可的松、25 u g/ml胰島素、25 u g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和1 X 10 —1Q M甲狀腺素T3、 0. 001ng/mLEGF、腺嘌呤(24.3 ug/mL)等活性成分，配制成人工皮膚無(wú)血清專用培養(yǎng)基；
6、器官型全層人工皮膚培養(yǎng)
在生長(zhǎng)于嵌入式培養(yǎng)皿上的人工真皮上接種原代人角質(zhì)細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為1 x 105cell/Cm2;用人工皮膚專用培養(yǎng)基培養(yǎng)代替含血清的H-DMEM培養(yǎng)基，氣-液界 面培養(yǎng)，每54小時(shí)半量換液，IO天后完成表皮構(gòu)建；
5、檢驗(yàn)
將構(gòu)建好的組織工程人工皮膚從嵌入式培養(yǎng)皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5.5um，蘇木素-伊紅(H.E)染色；
去除顯微觀察下顯示皮膚結(jié)構(gòu)不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含 量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量少、膠原排列紊亂的人工皮膚。顯微鏡下觀察表皮層 含基底層、棘層和角化層三層結(jié)構(gòu)，真皮層含成纖維細(xì)胞、膠原纖維排列整齊，表皮 真皮分界明顯的人工皮膚。
實(shí)施例3
1、制作真皮支架
1) 預(yù)先將殼聚糖和6-硫酸軟骨素按質(zhì)量比例7.5: 2.5用普通方式混合，制 備細(xì)胞外基質(zhì)混合物；
2) 無(wú)菌條件下，將鼠尾膠原粉末浸泡于-4'C、 0. 1%醋酸溶液中，使牛膠原濃 度為9mg/ral，調(diào)節(jié)PH值到7. 2制備膠原溶液，操作應(yīng)在4匸進(jìn)行；
3) 將預(yù)先混合好的細(xì)胞外基質(zhì)混合物與鼠尾膠原按質(zhì)量比例為2.2: 7.8加 入鼠尾膠原溶液中，制得復(fù)合膠原溶液；
4) lnil制備好的復(fù)合膠原溶液置于孔徑為3.5 cm的圓形模具中，用0. lml
的1.25。/。的戊二醛溶液4'C共價(jià)交聯(lián)24小時(shí)，用0. 1mol/L磷酸鹽緩沖液
(PBS)漂洗2次，制成海綿狀復(fù)合膠原基質(zhì)；5)將復(fù)合膠原基質(zhì)用波長(zhǎng)254nm、36W的紫外線照射除菌后放置在-28'C低 溫冰箱冷凍過(guò)夜18小時(shí)，然后再在一5CTC、 1Pa條件下，凍干機(jī)真空冷 凍干燥24h，制備復(fù)合膠原真皮支架；
2、 人成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備
1) 將手術(shù)環(huán)切下的新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0. 1mol/LPBS緩沖液徹 底清洗，無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1.0mmX1.5mm的皮片， 用質(zhì)量濃度0. 25y。裂解酶(Dispases)4'C過(guò)夜冷消化16小時(shí)，分離表皮和真 皮，生理鹽水或D-Hanks液清洗5次；
2) 表皮部分用質(zhì)量濃度0. 25%胰酶+0. 01%EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用角質(zhì)細(xì) 胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5% C02 37 'C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12min，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，用角質(zhì)細(xì)胞專用培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)，每60小時(shí)半量換液，；
3) 真皮部分以0.125%胰酶消化獲取成纖維細(xì)胞，放入含10%新生牛血清 H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每36小時(shí)半量換液，；
3、 真皮替代物制備
將第1步所得之復(fù)合膠原真皮支架置于12孔嵌入式培養(yǎng)皿上，加入含有10%新生 牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)，以最小容量100 y 1接種第2步3)培養(yǎng)基懸浮的原代 培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為lX105cell/cm2，待8小時(shí)細(xì)胞粘附后，加2ml 含10。/。新生牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基浸沒(méi)培養(yǎng)，每48小時(shí)半量換液，培養(yǎng)7天，完成 真皮構(gòu)建；嵌入式培養(yǎng)皿為millpore公司的millcell,孔徑0.4um，底部支持膜為 透明的聚酯膜，使用前包被濃度為0.4。/。的人源IV型膠原纖維；
4、 人工皮膚無(wú)血清專用培養(yǎng)基配制
購(gòu)買美國(guó)BioWhittaker公司的商業(yè)化角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基KBM (KeratinocyteBasal Medium),與無(wú)菌條件下收集的羊膜分泌液，按體積比8.2: 1.8混合，再此基 礎(chǔ)上中添加5X 10 —1Q M霍亂毒素，2. 5 y g/ml氫化可的松、25 y g/ml胰島素、25 u g/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白禾口 1X10 -10 M甲狀腺素T3、 0. 001ng/mLEGF、腺嘌呤(24.3 ug/mL)等活性 成分，配制成人工皮膚無(wú)血清專用培養(yǎng)基； 6、器官型全層人工皮膚培養(yǎng)
在生長(zhǎng)于嵌入式培養(yǎng)皿上的人工真皮上接種原代人角質(zhì)細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為1 x 105Cell/cm2;用人工皮膚專用培養(yǎng)基培養(yǎng)代替含血清的H-DMEM培養(yǎng)基，氣-液界 面培養(yǎng)，每60小時(shí)半量換液，7天后完成表皮構(gòu)建；
5、檢驗(yàn)
將構(gòu)建好的組織工程人工皮膚從嵌入式培養(yǎng)皿取下，固定于以PBS配制的4%多聚 甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5^m，蘇木素-伊紅(H.E)染色；顯微 鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)，表皮層含基底層、棘層和角化層三層結(jié)構(gòu)；真皮層應(yīng) 含大量成纖維細(xì)胞，膠原纖維有序列排列；表皮真皮分界明顯。此批人工皮膚可用于 毒性檢驗(yàn)。
權(quán)利要求
1、一種采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方法，依次包括以下幾個(gè)步驟(1)制作由膠原與細(xì)胞外基質(zhì)混合物組成的復(fù)合膠原真皮支架1)將殼聚糖與透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素兩者之一或全部混合制備成細(xì)胞外基質(zhì)混合物；采用殼聚糖與透明質(zhì)酸混合時(shí)質(zhì)量比例為6.5-7.5∶2.5-3.5；采用殼聚糖與6-硫酸軟骨素時(shí)質(zhì)量比例為7.0-7.5∶2.5-3.0；采用殼聚糖、透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素全部混合時(shí)質(zhì)量比例為4.5-5.5∶2.5-3.5∶1.5-2.5；2)在無(wú)菌條件下將膠原浸泡于冰冷-4℃、0.1％的醋酸溶液中，膠原濃度為8-10mg/ml范圍，調(diào)節(jié)PH值到7.2-7.3制備膠原溶液，操作應(yīng)在4℃進(jìn)行；3)在膠原溶液中加入1)步驟所得的細(xì)胞外基質(zhì)混合物，得到復(fù)合膠原溶液，復(fù)合膠原溶液中細(xì)胞外基質(zhì)混合物與膠原的質(zhì)量比例為2-2.5∶7.5-8；4)取1ml制備好的復(fù)合膠原溶液置于孔徑為3.5cm的圓形模具中或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用0.1ml的1％-1.5％的戊二醛溶液4℃共價(jià)交聯(lián)24±0.5小時(shí)，用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2-3次，制成海綿狀復(fù)合膠原基質(zhì)；5)將復(fù)合膠原基質(zhì)用波長(zhǎng)254nm、36W的紫外線照射除菌后放置在-25℃--30℃低溫冰箱冷凍過(guò)夜12-18小時(shí)，然后再在-50℃--55℃、1Pa條件下，凍干機(jī)真空冷凍干燥24±1小時(shí)，制備復(fù)合膠原真皮支架；(2)原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備1)將手術(shù)環(huán)切下的新鮮包皮用含青霉素、鏈霉素的0.1mol/LPBS緩沖液徹底清洗，無(wú)菌條件下去除皮下組織，將包皮剪切成約1.0mm×1.5mm的皮片，用質(zhì)量濃度0.25％裂解酶(Dispases)分離表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小時(shí)或是4℃過(guò)夜12-18小時(shí)，生理鹽水或D-Hanks液清洗；2)表皮部分用質(zhì)量濃度0.25％胰酶+0.01％EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于IV型膠原包被的培養(yǎng)皿中，置5％CO2 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10-15min，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，用角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)人角質(zhì)細(xì)胞；3)真皮部分以0.125％胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，放入含10％新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)人工真皮替代物制備將第1步所得之復(fù)合膠原真皮支架置于12孔嵌入式培養(yǎng)皿上，加入含有10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)，以最小容量100-200μl接種第2步3)培養(yǎng)基懸浮的原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，培養(yǎng)7-10天，完成人工真皮替代物構(gòu)建；(4)人工皮膚專用培養(yǎng)基制備無(wú)菌條件下，取足月妊娠剖腹產(chǎn)的羊膜，鈍性分離除去絨毛膜，用含100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素的PBS沖洗干凈血污，轉(zhuǎn)移到DMEM液中；在無(wú)菌環(huán)境下，按培養(yǎng)板孔徑的大小將人羊膜剪成圓形或半圓的羊膜片，使羊膜上皮面向上全鋪或半鋪布于6孔板的孔底，然后加入角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，收集羊膜分泌液；取角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基與人羊膜分泌液按體積比8-8.5∶1.5-2混合，再添加5×10-10M霍亂毒素，2.5μg/ml氫化可的松、25μg/ml胰島素、25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和1×10-10M甲狀腺素T3、0.001ng/mL人重組EGF、24.3ug/mL腺嘌呤活性成分，配制成人工皮膚專用培養(yǎng)基；(5)器官型全層人工皮膚制備在第3步所述人工真皮替代物上接種第2步2)原代培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為1×105cell/cm2-2×105cell/cm2，用第4步制備的人工皮膚專用培養(yǎng)基代替角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，采用氣-液界面培養(yǎng)，8-10天后完成人工皮膚初級(jí)產(chǎn)品制備；(6)檢測(cè)同一批以12孔培養(yǎng)板制備的人工皮膚中，取其中一塊人工皮膚從嵌入式培養(yǎng)皿取下，固定于以PBS配制的4％多聚甲醛溶液中，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚5μm-6μm，蘇木素-伊紅(H.E)染色；顯微鏡下觀察人工皮膚的組織結(jié)構(gòu)去除皮膚結(jié)構(gòu)不完整、表皮分層不明顯或缺少分層、角質(zhì)細(xì)胞含量較少，真皮層成纖維細(xì)胞含量少、膠原排列紊亂者，即得表皮層含基底層、棘層和角化層三層結(jié)構(gòu)；真皮層含大量成纖維細(xì)胞，膠原纖維有序列排列，表皮真皮分界明顯的人工皮膚產(chǎn)品，可用于皮膚毒性檢測(cè)試驗(yàn)。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方 法，其特征是(1) 制作真皮支架1) 殼聚糖與透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素混合質(zhì)量比例為5: 3: 2;2) 膠原濃度為10mg/ral范圍，調(diào)節(jié)PH值到7. 2;3) 細(xì)胞外基質(zhì)混合物與膠原的質(zhì)量比例為2: 8;4) 戊二酸共價(jià)交聯(lián)24小時(shí)，漂洗3次，戊二醛濃度為1%_1.5%;5) 紫外線照射除菌后放置在-28t:低溫冰箱冷凍過(guò)夜15小時(shí)，然后再在一52 °C ，凍干機(jī)真空冷凍干燥24小時(shí)；(2) 原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的制備1) 37'C下2小時(shí)或4"過(guò)夜15小時(shí)分離表皮和真皮；2) 用美國(guó)BioWhittaker公司的KBM角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基；3) 真皮部分以0. 125%胰酶消化獲取原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，放入含10%新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3) 人工真皮替代物制備以容量150 y 1接種人皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1. 5X105cell/cm2，培養(yǎng)8天；(4) 人工皮膚專用培養(yǎng)基制備取角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基與人羊膜分泌液按體積比8: 2混合；(5) 器官型全層人工皮膚制備接種細(xì)胞密度為lxl05Cell/Cni2,氣-液界面培養(yǎng)，9天后完成人工皮膚初級(jí)產(chǎn)品 制備。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚 的方法，其特征是所說(shuō)的嵌入式培養(yǎng)皿為Corning Costar公司的Transwell或 millpore公司的millcell，孔徑0.4nm，底部支持膜為透明的聚酯膜，使用前包被 濃度為0. 4y。的人源IV型膠原纖維。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方 法，其特征是所述的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基SFM-KC為商業(yè)化購(gòu)自美國(guó)BioWhiUaker 公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBC0公司的DK-SFM (Defined Keratinocyte Serum Free Medium)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種采用嵌入式培養(yǎng)法制備毒性檢驗(yàn)用器官型人工皮膚的方法，屬于一種可以替代活體動(dòng)物(人體)皮膚用于毒理學(xué)試驗(yàn)的領(lǐng)域。它包括真皮支架制備、人成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞制備、真皮替代物制備、人工皮膚無(wú)血清專用培養(yǎng)基配制、器官型全層皮膚培養(yǎng)和人工皮膚毒性檢驗(yàn)，制備的人工皮膚重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化程度高。通過(guò)本發(fā)明制備的器官型全層皮膚在解剖和組織結(jié)構(gòu)上更接近于天然皮膚，其應(yīng)用于毒性檢驗(yàn)的方式和檢測(cè)指標(biāo)更符合皮膚毒性作用的實(shí)際情況，可以代替整體動(dòng)物，直接應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品、藥品、農(nóng)藥等健康相關(guān)產(chǎn)品的皮膚毒性試驗(yàn)。
文檔編號(hào)A61L27/36GK101318030SQ200810029210
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者紅 焦, 瑤 秦, 程樹(shù)軍 申請(qǐng)人:程樹(shù)軍;廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心