專利名稱：一種乙肝多肽疫苗及其應(yīng)用的制作方法
一種乙肝多肽疫苗及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽疫苗領(lǐng)域，具體地說是一種具有治療性作用的乙型肝炎多 肽疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗作為治療乙肝的藥物制劑的應(yīng)用。背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒是一種具有很強傳染性的病毒，全球目前約有3億5千萬人 口感染乙型肝炎病毒，每年大約有1百萬感染者死于乙型肝炎及由乙型肝炎誘 發(fā)的肝硬化，肝壞死和肝癌。乙型肝炎可以分為急性及慢性兩種，95%左右急 性乙肝患者可以通過治療而痊愈；5°/ 左右轉(zhuǎn)變成慢性乙型肝炎。絕大多數(shù)的慢 性乙肝患者成為終生病毒攜帶者。中國是世界上罹患慢性乙肝最嚴(yán)重的國家。全國乙肝病毒表面抗原(HBsAg) 攜帶率平均10% (表面抗原攜帶者約1億人)。全國人群乙型肝炎感染率高達(dá) 60% (約有6億多人已被乙肝病毒感染過)。若不及時有效地清除乙型肝炎病毒 (HBV)，約25°/。的乙肝病毒攜帶者會發(fā)展為肝硬化，5-10°/。的患者會演變成肝 癌。目前人們對乙型病毒性肝炎主要采取預(yù)防手段，即接種乙型肝炎疫苗進行 預(yù)防。預(yù)防疫苗主要用于從未感染過的機體，因此天然結(jié)構(gòu)的病毒蛋白可直接 作為疫苗抗原。但是已經(jīng)開發(fā)出應(yīng)用的乙型肝炎病毒疫苗，雖然能對HBV感染 起到良好的預(yù)防作用，但對感染HBV的機體，卻難以發(fā)揮治療和清除病毒的作 用。主要原因在于機體對乙肝病毒產(chǎn)生了特異性免疫耐受，免疫系統(tǒng)不能有效 地清除病毒。世界范圍內(nèi)對乙肝特別是無癥狀病毒攜帶者和慢性乙肝患者，一 直沒有療效確實及根治的方法，現(xiàn)有的干擾素等藥物不僅價格昂貴，而且效率 低，容易復(fù)發(fā)。近年來，隨著體外大量培養(yǎng)病毒技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)和對病毒及亞結(jié)構(gòu) 分析和純化方法的發(fā)展，人們對病毒結(jié)構(gòu)的認(rèn)識日趨豐富。與此同時，將病毒 分解成各有效生物活性成分的方法也已出現(xiàn)。人們發(fā)現(xiàn)一些含類脂病毒(如流 感病毒、麻滲病毒和水泡性口炎病毒等)的表面成分或其蛋白的一部分肽段， 在免疫動物后會產(chǎn)生一定的保護性免疫。同時，蛋白質(zhì)分析方法及免疫學(xué)都有 了長足的發(fā)展，這些新方法使我們可以迅速而又準(zhǔn)確地確定病原體中可誘導(dǎo)免 疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)及其片段，并產(chǎn)生了一種新疫苗-多肽表位疫苗。多肽表位疫 苗就是在具有抗原性的蛋白中選取單一表位或者多個表位進行組合，搭配，因 而可以在較小的分子中展現(xiàn)完整蛋白的免疫原性。合成多肽生產(chǎn)費用低且便于純化，又不含諸如微生物培養(yǎng)物或其他病毒或白蛋白的殘留物等生物成分。另一優(yōu)點是多肽合成的重復(fù)性好，每批產(chǎn)品均可通過N端測序和氨基酸分析來控 制。所以其結(jié)構(gòu)簡單，易于生產(chǎn)而且高效、高特異性的特點使之成為當(dāng)今疫苗 研發(fā)的熱點。多肽疫苗是目前研究領(lǐng)域內(nèi)較受重視的研究方向之一。尤其是病毒多肽疫 苗的研究取得了許多進展，結(jié)果令人鼓舞。1999年美國NIH公布了兩種HIV-1 病毒多肽疫苗，對人體進行的I期臨床試驗結(jié)果，證實兩種多肽能刺激機體產(chǎn) 生特異性抗體和特異性細(xì)胞免疫，并有較好的安全性。我國清華大學(xué)也證實 HIV-I膜蛋白內(nèi)一段多肽有很強的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯示有良好 的發(fā)展前景，國外學(xué)者從丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2內(nèi)篩選出一般多肽，它可 刺激機體產(chǎn)生保護性抗體。其它病毒的多肽疫苗及抗腫瘤、避孕多肽疫苗的研 究也取得了較大tt。美國Scripps研究所的F VChisari申請了四項美國專利，主要內(nèi)容是關(guān) 于在HBV抗原上所確定的分別來源于核心抗原、表面抗原、多聚酶和X抗原的 CTL表位。目前國內(nèi)文獻所報道的以激活免疫系統(tǒng)為基礎(chǔ)的乙肝多肽疫苗大都 集中于選用HBV病毒的蛋白的天然序列。當(dāng)前，對HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)尚無 根治的方法。如何打破機體慢性感染所形成的免疫耐受狀態(tài)，治愈乙肝是抗 HBV治療研究的重要課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服目前乙肝疫苗的缺點，提供一種具有強細(xì)胞免 疫原性可以作為治療用的、不易產(chǎn)生HBV感染免疫耐受、使用安全的疫苗；同 時，本發(fā)明還提供一種制備簡單、易于構(gòu)建、穩(wěn)定性好的乙肝疫苗的制備方法， 本發(fā)明還涉及這種乙肝疫苗作為治療乙肝的藥物制劑的應(yīng)用。抗原表位是抗原誘生特異性免疫應(yīng)答的最小的結(jié)構(gòu)和功能單位，包括B 細(xì)胞抗原表位、T輔助細(xì)胞表位和殺傷性T細(xì)胞表位。由于不同類型免疫應(yīng)答 的下調(diào)、缺乏及紊亂是許多疾病的病因，因此以抗原表位為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計日 益受到重視。在表位水平上對抗原性的認(rèn)識已促成這樣一種趨勢基于抗原分 子的免疫干預(yù)手段已不再停留于病原體或天然抗原整體分子水平而開始向表 位水平過度。以表位為基礎(chǔ)的疫苗包括多肽疫苗和以表位為基礎(chǔ)的基因疫苗 等。HBV慢性感染的機制之一是機體不能誘生有效的特異性免疫應(yīng)答，尤其是 病毒特異性的CTL應(yīng)答。研究證實在HBV慢性感染中，特異性CTL的數(shù)量和活 性明顯下降，不足以清除肝細(xì)胞內(nèi)感染的病毒。由于機體的免疫機制清除感染 的肝炎病毒主務(wù)農(nóng)賴于特異性的細(xì)胞免疫，而慢性感染者缺乏或下調(diào)了病毒特 異性的細(xì)胞免疫，因此，如何增強特異性細(xì)胞免疫，特別是誘生HBV特異性 CTL應(yīng)答是治療性疫苗設(shè)計的主要策略。本發(fā)明正是以多肽疫苗的方式入手，已知HBV基因中的表面蛋白抗原在HBV與肝細(xì)胞相應(yīng)受體的粘附中起重要作用，而且在自然感染狀態(tài)下，可能與 病毒清除密切相關(guān)，因此本發(fā)明選取表面蛋白的CTL抗原決定簇。HBV疫苗免疫比自然感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答范圍窄，從而產(chǎn)生一種可能性， 即HBsAg中單個氨基酸置換可使這種HBV變異林能在疫苗免疫個體內(nèi)復(fù)制，但 不能在自然免疫個體內(nèi)復(fù)制。Wi lson等假設(shè),對于預(yù)防HBV疫苗逃逸突變抹的 傳播"需要含有能誘導(dǎo)抗常見HBV突變抹中和抗體的特異性表位的疫苗"。合 成多肽的方法符合這些要求，在單個劑量中可以包括不同序列，也可對疫苗進 行改變以加入新出現(xiàn)的變異序列。因此，本發(fā)明主要選取了能防止免疫逃逸和 免疫耐受的天然病毒表位的變異序列，且表位的篩選來自亞裔人種的病毒的主 要亞型。另夕卜，多表位的聯(lián)合使用將有可能誘導(dǎo)出多重免疫效果，進一步地避免病 毒的逃逸。但是過多的表位一起使用將造成表位間的互相竟?fàn)幣c抑制作用，不 利于有效的CTL的誘生。因此，本發(fā)明選用了兩種多肽表位，既可產(chǎn)生雙價的 免疫原性，同時又避免了過多的表位間的竟?fàn)幰种谱饔?。本發(fā)明的構(gòu)建疫苗采用Fmoc多肽合成法，合成藥學(xué)上可以接受兩條多肽 主體；本發(fā)明還可以加入佐劑，如聚肌胞，陽離子脂質(zhì)體，白細(xì)胞介素IL-12， GM-CSF, Y-千擾素等，也可以不加佐劑。所述的藥物組合物可以通過常規(guī)的 免疫途徑應(yīng)用于人類，從而引發(fā)免疫應(yīng)答。所述應(yīng)用途徑包括但不限于肌肉注 射、皮下注射、皮，注射、，靜脈注射和鼻粘膜滴注等。 、 、。為慢性乙型肝炎治療性多肽疫苗，用于打破HBV感染的免疫耐受，對慢性乙型 肝炎進行治療。通過本發(fā)明后續(xù)的實施例表明，用本發(fā)明構(gòu)建的多肽疫苗免疫 HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了小鼠T細(xì)胞，能特異性地識別并清除帶有HBV多肽 以及被乙肝表面蛋白標(biāo)記的靶細(xì)胞。本發(fā)明的實施例還表明HBV核酸疫苗能特 異性誘導(dǎo)IFN-y的分泌。以下將結(jié)合附圖和實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)說明的是，實施例是對本 發(fā)明的技術(shù)方案的進一步說明，但并不表明本發(fā)明僅限于這些實施例。
圖1多肽體外活性;險測結(jié)果圖2是本發(fā)明乙肝多肽疫苗免疫時間及方式圖；圖3是HBV-S2A和HBV-S5A誘導(dǎo)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的特異性的CTL擴增 的ELSP0T實驗的直方圖圖4-5是HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾細(xì)胞導(dǎo)致HBV特異 性的CTL擴增分析圖4是針對S2和S5的特異性的CTL擴增的直方圖，圖5 是4十對S2和S5的Tetramer實—瞼和ELISP0T實—瞼結(jié)果圖。圖6-8HBV-S2A和HBV-S5A特異性的CTL特異性地識別HBV天然多肽的試驗結(jié)果圖圖6為特異性的CTL擴增的tetramer實驗結(jié)果圖，圖7是針對S2A 的51鉻釋放實驗結(jié)果圖，圖8為針對S5A的51鉻釋放實驗的結(jié)果圖。
具體實施方式實施例1T細(xì)胞抗原決定簇的篩選和改造本發(fā)明是基于表位的疫苗設(shè)計(英文譯名為EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN, EBVD)。首先篩選靶抗原，通過高分辨率的免疫識別研究獲得表位圖 譜。以多種殺傷性T細(xì)胞實驗進行功能篩選，選取具有較強免疫原性的殺傷性 T細(xì)胞的表位。再對其進行氨基酸的修飾與改造與修飾，采用計算機輔助疫苗設(shè)計" (Computers Aid Vaccine Design, CAVD)技術(shù)對改造和修飾進行分析。采用不同 的分析軟件，如NetMHC3.0, HLA p印tide binding predictions, MHCPred, MHCform等軟件，分析的主要方面有多肽的與MHC I類分子的結(jié)合能力， 結(jié)合能量以及濃度。才艮據(jù)軟件分析的結(jié)合能力數(shù)值，結(jié)合能量的大小以及IC50的濃度值，篩 選獲得十七個乙肝表面抗原HBsAg殺傷性T細(xì)胞抗原決定簇表位的類似物1) HBV畫SIA: YLQAGFFLL2) HBV畫S2A: VLQAGFFLV3) HBV國S3A: YLDSWWTSL4) HBV-S4A: ILLLCLIFV5) HBV-S5A: FLLTRILTV6) HBV畫S6A: FIIFLFILV7) HBV-S7A: FLFILIXCV8) HBV國S8A: UXCLIFLV9) HBV國S9A: YLIXCLIFL10) HBV-S10A: YLLCLIFLL11) HBV-SUA: YLLDYQGML12) HBV-S12A: YMLPVCPLL13) HBV畫S13A: YLSLLVPFV14) HBV-S14A: YMWYWGPSL15) HBV畫S15A: YLSPFLPLL16) HBV-S16A: MMWYWGPSV17) HBV-S17A: VLLDYQGMV實施例2HBV-S5A多肽的合成工藝據(jù)多肽序列羧基端選 擇不同的多肽樹脂，如羧基端為頡氨酸，選擇FmocVal-Wang-Resin(購于吉爾 生化)，如J^S端為亮氨酸，選擇Fmoc Leu-Wang-Resin(購于吉爾生化)進行合 成。合成步驟如下9種帶側(cè)鏈保護基的Fmoc-氨基酸原料-固相合成-脫側(cè)鏈保護基-HPLC純化-冷凍干燥1. 氨基酸t(yī)t酸名稱 Fmoc-L-Ala-OH Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH Fmoc-L-Gln(Trt)-OH Fmoc-L-Gly-OH Fmoc-L-Ile-OH Fmoc-L-Leu-OH Fmoc-L-Phe-OH Fmoc隱L-Thr(tBu)-OH Fmoc-L-Val-OH Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH Fmoc-L-Ser(tBu5誦OH Fm。c-L-Trp(Boc)國OH Fmoc陽L-Asp(OtBu)-OH Fmoc-L-CysCTr0-OH Fmoc-L-Met畫OH Fmoc-L-Pro國OH2. 固相合成的過程 采用HBTU/HOBt法活化氨基酸，按照序列連接到氨基樹脂上，共進行8步合成。以10mmole規(guī);漠為例，稱取樹脂20克(樹脂裝載率為0.5mmole/g),倒入 多肽合成儀反應(yīng)器內(nèi)，按照目標(biāo)多肽的氨基酸序列從C-端向N-端稱取 40mmole相應(yīng)的帶保護基氨基酸，并排列在合成儀中。在室溫條件下，按照電 腦程序分別自動進行完成8步合成反應(yīng)。合成結(jié)束后，得到帶側(cè)鏈保護基的多肽樹脂。取出多肽樹脂，放入真空干燥器 中干燥2小時后稱重。3. 脫保護基及沉淀來源Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. IncSynpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc Synpep. Inc將帶保護基的目標(biāo)多肽樹脂置入帶塞的三角燒瓶中，加入裂解試劑如下表:試劑 用量(mL) 水 12.5 三氟乙酸 470 三異丙基硅烷 12.5 二辟u乙醇 5恒溫在25。C條件下，攪拌反應(yīng)2小時；過濾、收集濾液，樹脂用少量三 氟乙酸洗滌，過濾合并入收集液。在攪拌下，滴加3000mL水乙醚(-10。C ), 得到白色沉淀，過濾，用少量冰乙醚洗滌粗品，并將粗品放入真空干燥器中干 燥過夜。4. HPLC純化通過HPLC反相純化制備得到目標(biāo)多肽純品三氟乙酸鹽溶液(純度>95% )。① 色語柱50mm*250mm Kromasil RP-18 10jnm 100A制備色譜柱② 流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液 B:O.P/o三氟乙酸乙腈溶液③ 上樣溶液將多肽粗品(純度約40~50%)用:0.1%三氟乙酸水溶液配成濃度為8.0mg/ml (按粗品計算)的溶液，并通過0.22jum濾膜過濾。
洗脫條件采用線性梯度洗脫，流速為120ml/min，紫外280nm;險測，洗脫梯度如下表時間 (min) 流動相B 0隱5 6% 5-40 6%-20% 40-45 20%誦40% 45-60 德 ⑤樣品收集在20-35分鐘期間，按照60ml/瓶分布收集洗脫主峰，并對各個樣品液進行 分析檢測。合并所有純度大于98%的樣品液。將純化好的樣品液通過HPLC反相換鹽制備得到多肽粗品純品乙酸鹽溶液 (純度>98% )。① 色譜柱50mm *250mm Kromasil RP-18 10 |i m 1OOA制備色鐠柱② 流動相A:0.5。/o乙酸水溶液 B:0.5。/。乙酸乙腈溶液③ 上樣溶液向多肽純?nèi)芤杭尤氲润w積超純水。④ 洗脫條件采用線性梯度洗脫，流速為120ml/min，紫外280nm檢測，洗脫梯度如下表時間 (min) 流動相B 0-5 5% 5畫20 5%-30%⑤ 樣品收集 收集所有洗脫主峰溶液。 除去乙腈將多肽溶液倒入圓底燒瓶，25°C， -0.099 Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去所有 乙腈，剩余液體通過0.22pm濾膜過濾，留待冷凍干燥。5.冷凍干燥將目標(biāo)多肽醋酸水溶液倒入真空冷凍干燥機樣品盤內(nèi)，按照電腦程序進行 凍干。實施例3多肽活性的活性檢測實驗采集HLA-A2的正常人的血液，F(xiàn)ioll-Hypaque法離心分離PBMC，用 RPMI160完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1 x 107ml,體外培 養(yǎng)24h,待其恢復(fù)原生長狀態(tài)后進行后續(xù)處理。將分離的得到的HLA-A2人PBMC制成單細(xì)胞懸液，以2 x l05/ml濃度懸 浮于RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、10ng/ml抗原、30U/ml rhlL-2 )中， 分配于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，持續(xù)培養(yǎng)1周后，以1000r/min離心10min，去 上清，用前述培養(yǎng)液重懸，用各種表位肽刺激，每周刺激1次，共兩次，末次刺激24h后，離心收集細(xì)胞，用前述培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞至1 x 107ml,用作效應(yīng) 細(xì)胞。采用T2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，生長狀態(tài)良好的T2細(xì)胞，用前2h加入相應(yīng)的 多肽(1 |ag/ml )預(yù)包被，用51Cr標(biāo)記后，按照效靶比(E/T) 50: 1與效應(yīng)細(xì) 胞共培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后取上清檢測Y計數(shù)值，如圖1所示。實施例4 HBV-S2A和HBV-S5A誘導(dǎo)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的CTL活性為了評價HBV-S2A和HBV-S5A誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的效力，用UV-B52(指 HBV-S2A多肽與HBV-S5A多肽)對HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫。取 HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分別溶于lml PBS,給藥前與等體積的lmg/ml 的聚肌胞(Sigma,弁CatP1530)混合后用lml的注射器經(jīng)皮下注射給藥。兩組動 物分別在第1， 4， 15，和18天以多肽佐劑(對照)或25 pi UV-B52-S2A和25 |il UV-B52-S5A以^爾比1:1的比例聯(lián)合進行免疫，免疫時間及劑量見圖2。每 只小鼠注射的總劑量(4次)為腳g。在最后一次給藥后兩周，以雙盲法收集脾細(xì)胞。將每只動物的脾臟收集至 一個含有5mlRPMI培養(yǎng)基的15ml的離心管中，并在管子上標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小鼠的 編號。樣品保存于冰上，并于收集的當(dāng)天進行分析。將脾臟碾磨并制成單細(xì)胞 懸液。用密度梯度離心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分離單核細(xì)胞， 并在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl(^細(xì)胞/ml。將每只小鼠的脾細(xì)胞收集后分為四組，在預(yù)包被了具有高親和性的單克隆 抗體的ELISPOT的板中，每孔置來自免疫組或?qū)φ战M的脾細(xì)胞lxl(^個，并 加入10jug/ml的HBV-S2A， HBV-S5A，對照多肽或者不加多肽共同進行孵育。 在37°C ， 5% C02and 100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，溶解細(xì)胞并洗脫。 細(xì)胞因子在釋放的區(qū)域被捕獲并由 一個結(jié)合了生物素的抗細(xì)胞因子抗體標(biāo)記。 經(jīng)顯色后形成一個黑點。用ELISPOT計數(shù)器計算斑點的數(shù)量，即活化的T細(xì) 胞的數(shù)量。經(jīng)顯色，在AID國際平板計數(shù)器上，用3.2.3版IFN-Y斑點計數(shù)軟 件分4斤每只^皮免疫動物4十對每種抗原的y-IFN斑點。與對照組相比，在用HBV多肽類似物免疫的小鼠脾臟T細(xì)胞中，檢測到 了高水平的多肽特異性的CTL活性。ELISPOT分析表明，HLA-A2轉(zhuǎn)基因小 鼠對HBV-S2A和HBV-S5A產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答，10只小鼠的脾細(xì)胞均可 誘導(dǎo)IFN-y的產(chǎn)生(見圖3)。而在注射多肽載體的動物(對照組)中，未產(chǎn) 生顯著的應(yīng)答(見圖3)。實施例5 HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾細(xì)胞導(dǎo)致HBV特異性 的CTL擴增為了評價HBV-S2A和HBV-S5A誘導(dǎo)的CTL的數(shù)量的擴 能力，用UV-B52對HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg 分別溶于lml PBS,給藥前與等體積的lmg/ml的聚肌胞(Sigma, #Cat. P1530) 混合后用lml的注射器經(jīng)皮下注射給藥。兩組動物分別在第1， 4， 15，和18 天以多狀佐劑(對照)或25 pl UV-B52-S2A和25 pl UV-B52-S5A以摩爾比1:1 的比例聯(lián)合進行免疫，免疫時間及劑量見圖2。每只小鼠注射的總劑量(4次) 為100嗎。在最后一次給藥后兩周，以雙盲法收集脾細(xì)胞。將每只動物的脾臟收集至 一個含有5mlRPMI培養(yǎng)基的15ml的離心管中，并在管子上標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小鼠的 編號。樣品保存于冰上，并于收集的當(dāng)天進行分析。將脾臟碾磨并制成單細(xì)胞 懸液。用密度梯度離心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分離單核細(xì)胞， 并在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl(^細(xì)胞/ml。將每只小鼠的脾 細(xì)胞分成兩份，每份lxl(^個細(xì)胞，與鼠-抗鼠CD8a(Ly-2)單克隆抗體(BD Biosciences, 553031 )和HBV-S2A tetramer或者鼠-抗鼠CD8a (Ly-2)單克隆 抗體(BD Biosciences, 55303l)和HBV-S5A tetramer共染色。用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀進行數(shù)據(jù)收集，并用cellquest軟件進行淋巴細(xì)胞分類，計 算在CD8+CTL亞群中tetramer+的細(xì)胞的百分比。用天然的S2多肽刺激 UV-B25免疫后的小鼠脾細(xì)胞，6天后，檢測培養(yǎng)物中CD8+HLA-A2/S2四聚 體陽性細(xì)胞的數(shù)量。免疫小鼠新鮮脾細(xì)胞中，該細(xì)胞的檢測頻率為0.19% (見 圖4)。用天然S2刺激后，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，其頻率為4.97%，擴增了 25 倍(見圖5),而S5組的試驗結(jié)果也與此相似，且頻率更高，擴增倍數(shù)為33 倍。與之相比，對照組經(jīng)S2或S5刺激后的小鼠脾細(xì)胞，頻率未顯著改變(見 圖3)。實施例6 HBV-S2A和HBV-S5A特異性的CTL特異性地識別HBV天然多肽 的免疫原性分析為了檢測HBV-S2A和HBV-S5A誘導(dǎo)的T細(xì)胞能否特異性識別天然的 HBV多肽，采用來自HBV-S2A和HBV-S5A免疫后的T細(xì)胞，用ELISPOT 法檢測多肽特異性的IFN- Y釋放，并用51鉻放射分析檢測多肽誘導(dǎo)的特異性 殺傷功能。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分別溶于lml PBS,給藥前與等體積的 lmg/ml的聚肌胞(Sigma, #Cat. P1530)混合后用lml的注射器經(jīng)皮下注射給藥。 兩組動物分別在第1, 4， 15,和18天以多肽佐劑(對照)或25 pl UV-B52-S2A 和25 pl UV-B52-S5A以摩爾比1:1的比例聯(lián)合進行免疫，免疫時間及劑量見 圖2。每只小鼠注射的總劑量(4次)為100ng。在最后一次給藥后兩周，以雙盲法收集脾細(xì)胞。將每只動物的脾臟收集至 一個含有5mlRPMI培養(yǎng)基的15ml的離心管中，并在管子上標(biāo)記轉(zhuǎn)基因小鼠的編號。樣品保存于冰上，并于收集的當(dāng)天進行分析。將脾臟碾磨并制成單細(xì)胞懸液。用密度梯度離心法(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)分離單核細(xì)胞， 并在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至lx107細(xì)l包/ml。將每只小鼠的脾細(xì)胞收集后分為四組，在預(yù)包被了具有高親和性的單克隆 抗體的ELISPOT的板中，每孔置來自免疫組或?qū)φ战M的脾細(xì)胞lxl(^個，并 加入10pg/ml的HBV-S2A, HBV-S5A,對照多肽或者不加多肽共同進行孵育。 在37°C , 5% C02 and 100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，溶解細(xì)胞并洗脫。 細(xì)胞因子在釋放的區(qū)域被捕獲并由 一個結(jié)合了生物素的抗細(xì)胞因子抗體標(biāo)記。 經(jīng)顯色后形成一個黑點。用ELISPOT計數(shù)器計算斑點的數(shù)量，即活化的T細(xì) 胞的數(shù)量。經(jīng)顯色，在AID國際平板計數(shù)器上，用3.2.3版IFN-Y斑點計數(shù)軟 件分析每只^皮免疫動物4十對每種抗原的，IFN斑點。將5xl06個來自于對照組與免疫組的脾細(xì)胞與5xl()S個經(jīng)脂多糖刺激72 小時后，伽瑪照射和加載多肽的同源小鼠的脾細(xì)胞置24孔板中共同培養(yǎng)，48 小時后，加入1 ng/ml鼠重組IL-2。細(xì)胞培養(yǎng)6天后，從培養(yǎng)板中收集CTLs, 計數(shù)后將CTL分成三組，三組濃度分別為lxl07/ml, 3xl06/ml和lxl06/ml。每 組三孔，每孔加100ul置96孔板中置37。C備用。用T2細(xì)胞(來自美國模式 菌體收藏+心)做為靶細(xì)胞測定CTL的免疫原性。將3 x 106 T2細(xì)胞分成3 組， 一組不加多肽作為對照，另兩組分別加入25嗎HBV-S2A和HBV-S5A, 每組加入100uCi的51Cr， 37。C培養(yǎng)1個小時。標(biāo)記和裝載后，洗脫細(xì)胞三次， 再次制成懸浮液，濃度為1()S/ml。在上述含有CTL的U形板中，每孔加入100(^1 靶細(xì)胞。為了測定自發(fā)及最大釋放量，每個耙位配制另外6個含有10(Hil把細(xì) 胞的孔。其中三孔加入100pl培養(yǎng)液，用于測定自發(fā)釋;^文量；另三孔加入100|al 2%SDS，用于測定最大釋放量。37。C培養(yǎng)4小時后收集上清液，用Y計數(shù)器 進行計數(shù)。按照以下方法對特異性裂解進行確定％特異釋放=[(試驗釋放值 -自發(fā)釋放值)/(最大釋放值-自發(fā)釋放值)]xlOO。/。。按以下方法表達(dá)數(shù)據(jù)X 軸表示效應(yīng)靶位比；y軸表示相應(yīng)的特異性裂解百分比。將試驗組小鼠脾細(xì)胞 的結(jié)果與未免疫小鼠的脾細(xì)胞結(jié)果進行對比。如圖6-8所示，HBV-S2A特異性的CTL能有效地交叉識別天然的S2多 肽和S5多肽，其中Tetramer實驗顯示針對S2A和S5A的特異性的CTL有明 顯的擴增(見圖6 )， 51鉻釋放實驗顯示這些特異性的CTL能導(dǎo)致耙細(xì)胞的裂 解(T2分別加入了天然的S2和S5 )。而這些CTL對不含多肽的T2對照細(xì)胞 無影響(見圖7-8)。序列表< 110>珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司<120〉一種新型乙肝多肽疫苗及其應(yīng)用<160>17<210>1 <211>9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>1Tyr Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Leu 1 5<210>2 <211>9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>2Val Leu Gin Ala Gly Phe Phe Leu Val 1 5<210>3 <211〉9 <212>PRT<213>乙型肝炎病毒 <400>3Tyr Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu 1 5<210〉4 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>4
lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Val 1 5
<210>5 <211〉9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>5
Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr Val 1 5
<210>6 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>6
Phe lie lie Phe Leu Phe lie Leu Val 1 5
<210>7 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒<400>7
Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Val 1 5
<210>8 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>8
Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Val 1 5
<210>9 <211>9 <212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>9
Tyr Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu 1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>10
Tyr Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu 1 5
<210>11 <211>9<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400〉11
Tyr Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Leu 1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>12
Tyr Met Leu Phe Val Cys Pro Leu Leu 1 5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400〉13
Tyr Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>14
Tyr Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 1 5<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒 <400>15
Tyr Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu 1 5
<210>16
<211>9
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<213>乙型肝炎病毒 <400>16
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Val 1 5
<210>17
<211>9
<212>PRT
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Val Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Val 1 權(quán)利要求
1、一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，含有多肽，多肽能刺激引起CTL反應(yīng)，并且多肽序列中含有1個突變的氨基酸殘基，突變位于肽段的N末端或C末端。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗 含有一種或者一種以上多肽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述 多肽的tt酸序列中含有9個氨基酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽 選自如下序列VLQAGFFLV、 YLQAGFFLL、 FLLTRILTV、 YLDSWWTSL、 FIIFLFILV、 FLFILLLCV、 ILLLCLIFV、 YLLLCLIFL、 LLLCLIFLV、 YLLCLIFLL、 VLLDYQGMV、 YLLDYQGML、 YMLPVCPLL、 YLSLLVPFV、 醒WYWGPSV、 YMWYWGPSL、 YLSPFLPLL。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所迷的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽 選自如下序列VLQAGFFLV, FLLTRILTV。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述CTL 反應(yīng)為乙肝病毒特異性的CTL反應(yīng)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗 是藥學(xué)上可接受的任意一種劑型。
8、 權(quán)利要求l-7中任意一項所述的乙肝多肽疫苗在制備治療乙肝病毒 慢性感染持續(xù)狀態(tài)及相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥 物的用途。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所迷的用途，其特征在于，所述乙肝病毒慢性持續(xù) 感染狀態(tài)為慢性乙肝肝炎或乙型肝炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型乙肝多肽疫苗及其應(yīng)用。一種乙肝多肽疫苗，含有多肽，所述多肽能刺激引起CTL反應(yīng)，并且所述多肽序列中含有1個突變的氨基酸殘基，突變位于肽段的N末端或C末端。所述疫苗含有一種多肽或者一種以上多肽。所述乙肝多肽疫苗應(yīng)用于制備治療乙肝病毒慢性感染持續(xù)狀態(tài)及相關(guān)的繼發(fā)性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或藥物，可有效避免由天然病毒多肽序列引起的免疫耐受。
文檔編號A61K39/00GK101618211SQ20081002921
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者曹春來, 肖擁軍, 妍 郭 申請人:珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司