專利名稱：一種含有重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液及其制備方法，特別是一種適用于治療各種原因引起的角膜上皮損傷的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的滴眼液及其制備方法。

背景技術(shù)：
人眼角膜共分5層，最外面那層厚約50微米的非角化鱗狀上皮叫做角膜上皮。角膜上皮經(jīng)常暴露于惡劣的環(huán)境中，容易受到物理、化學、微生物、寄生蟲、免疫等多種因素的損害，常導致角膜上皮愈合延遲或不愈，嚴重的可造成角膜潰瘍、穿孔等嚴重并發(fā)癥，臨床治療頗感棘手。此外，眼科手術(shù)和創(chuàng)傷后快速而完整的角膜上皮修復對維持正常視力也是必要的。目前，臨床上可供選用的促角膜上皮損傷的有效藥物并不多見，常用的藥物是進口的小牛血清眼膏。國內(nèi)市場上唯一基因工程藥物貝復舒(重組牛bFGF滴眼劑)的問世，開創(chuàng)了國內(nèi)治療角膜上皮損傷藥物的新紀元，主藥是重組牛bFGF，但是對于人的適應(yīng)性差并且對角膜新生血管有促進作用。正常角膜無血管，這是維持角膜透明的重要因素，同時也是角膜能夠處于相對免疫赦免狀態(tài)的一個必要條件。但是在眼部感染性疾病、化學傷以及長期配戴角膜接觸鏡的患者，角鞏膜緣部的血管會侵入角膜并向中央生長，形成角膜新生血管。角膜新生血管的結(jié)構(gòu)往往比較脆弱，滲透性強，易發(fā)生出血和繼發(fā)纖維化，從而嚴重影響視力乃至失明。同時，角膜新生血管也破壞了角膜的免疫赦免狀態(tài)，使角膜移植術(shù)后免疫排斥的發(fā)生率明顯升高。
角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2)是成纖維細胞生長因子家族中第10個成員，是機體內(nèi)自身存在的多肽生長因子，KGF-2為單拷貝基因，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，定位于15號染色體，是一條單鏈多肽，含有5個半胱氨酸殘基，其中4個半胱氨酸形成2對二硫鍵，另一個在折疊的肽中，為β2三葉草型。其編碼的蛋白由208個氨基酸殘基組成，N端有約40個氨基酸殘基的信號肽序列，成熟蛋白為169個氨基酸(40～208氨基酸殘基)，理論分子質(zhì)量為19.3×103，相對分子質(zhì)量約為24×103。KGF-2不同于FGFs家族其他成員的最重要一點是KGF-2由成纖維細胞及其他間質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生，對肝素具有很強的親和力，特異性作用于上皮細胞表面的酪氨酸激酶受體FGFR2IIIb(KGFR)和FGFR1IIIb。KGF-2與FGFR2IIIb的親和力很高，而與FGFR1IIIb的親和力很低，只有在高濃度KGF-2存在時才與FGFR1IIIb結(jié)合。KGF-2特異的促上皮細胞增殖作用主要通過FGFR2IIIb介導，而FGFR2IIIb僅在上皮細胞中表達。KGF-2與受體結(jié)合后，促使受體胞內(nèi)的C端酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體具有酪氨酸激酶活性，并與一系列的靶蛋白發(fā)生作用，引發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，其生理作用主要承擔間質(zhì)細胞-上皮細胞之間的信號轉(zhuǎn)導，是體內(nèi)上皮細胞增殖的重要旁分泌介質(zhì)，有廣泛的生物學功能。目前證實，KGF-2不僅起著維持正常組織的結(jié)構(gòu)和功能，而且參與組織的損傷修復，對燒傷、潰瘍、切割傷的修復、再生比其他生長因子具有更顯著的促進愈合、減少瘢痕的作用。FGFs家族中各成員之間功能具有一定的交叉，其中KGF-2對上皮組織具有高度特異性，對比目前上市的生長因子類滴眼液具有修復角膜上皮細胞的同時并不促進損傷引起的角膜新生血管的生長。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是公開一種具有角膜修復并不促進角膜新生血管生長的滴眼液，特別是一種適用于治療各種原因引起的角膜上皮損傷的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的滴眼液。
本發(fā)明的另一個目的是公開上述滴眼液的制備方法。
本發(fā)明所研制的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液，主要由重組人角質(zhì)細胞生長因子-2和基質(zhì)兩部分組成。其中重組人角質(zhì)細胞生長因子-2是利用基因工程方法表達后純化得到的?；|(zhì)部分由一定比例的抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑組成和合適的緩沖體系組成。其中抗氧化劑的種類以及各自的濃度分別為0.1％～5％甲硫氨酸；0.1％～5％組氨酸；螯合劑為0.01～1％EDTA；穩(wěn)定劑的種類以及各自的濃度分別為0.5％～10％甘露醇；1％～10％甘油；0.1％～5％L-組氨酸鹽酸鹽；0.1％～5％PEG-300；表面活性劑的種類以及各自的濃度為0.01％～0.5％泊洛沙姆188；0.001～0.5％吐溫80；滲透壓調(diào)解劑為0.1％～0.7％氯化鈉；合適的緩沖體系為5mM～100mM磷酸鹽緩沖液，緩沖體系的pH范圍是6.0～7.5。
本發(fā)明所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液的制備過程是將抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑用處方量磷酸鹽緩沖液溶解，測定滲透壓，用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)解滲透壓，加入1μg/ml～1mg/ml人角質(zhì)細胞生長因子-2，除菌過濾，分裝。
蛋白質(zhì)類滴眼液的研制，關(guān)鍵是解決這類藥物的穩(wěn)定性問題，在一定溶液條件下，KGF-2分子中Met、Cys、His、Trp及Tyr的某些基團由于與各種活潑氧具有很高的反應(yīng)性易受到氧化，從而導致蛋白質(zhì)的活性下降，因此需要加入抗氧劑；本發(fā)明制備方法采用甲硫氨酸、組氨酸作為抗氧化劑，用量為0.1％～5％。KGF-2蛋白在一定溶液條件下，容易發(fā)生水不溶性聚集而沉淀，非離子型表面活性劑泊洛沙姆188、吐溫80能防止蛋白質(zhì)吸附于表面，而抑制其凝聚和沉淀，阻止其變性；高濃度的聚乙二醇類常作為蛋白質(zhì)的低溫保護劑和沉淀結(jié)晶劑。本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量試驗，確定0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.01％～0.5％吐溫80、0.5％～2％PEG300，0.1％～5％賴氨酸的鹽酸鹽可抑制10mM磷酸鹽緩沖液KGF-2的聚集。
本發(fā)明的優(yōu)點在于提高了KGF-2液體制劑的穩(wěn)定性，可在常溫條件下放置，使應(yīng)用更為方便。
具體實施例 一、處方實施例 處方 KGF-2 100μg 甘油 2g 甲硫氨酸 0.2g 組氨酸鹽酸鹽 1g EDTA 0.2g 吐溫80 0.01g 氯化鈉 0.5g 50mM磷酸鹽緩沖液 加至100ml 制備 稱取處方量甘油、甲硫氨酸、組氨酸鹽酸鹽、EDTA、吐溫80和氯化鈉溶于50mM磷酸鹽緩沖液60ml中，流通蒸汽滅菌(115℃，30分鐘)。冷卻后，在局部百級環(huán)境下加入處方量KGF-2，攪勻后加入50mM磷酸鹽緩沖液至約90ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，補充50mM磷酸鹽緩沖液至100ml。0.22μm濾膜過濾，分裝即得。
穩(wěn)定性實驗 按照《中國藥典》(2005年版)進行穩(wěn)定性加速實驗。溫度25℃±2℃，相對濕度60％RH±5％。在0個月、1個月、2個月、3個月、6個月末取樣進行外觀、澄明度、pH值和KGF-2含量測定，結(jié)果見下表。
表1KGF-2加速穩(wěn)定性考察結(jié)果
由上表可見，KGF-2滴眼劑在考察期內(nèi)穩(wěn)定，預(yù)計可在常溫下避光存放N年。
在溫度4℃±2℃，相對濕度60％±10％條件下進行長期實驗24個月。在0個月、3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月末取樣進行外觀、色澤、pH值和KGF-2含量測定，結(jié)果見下表。
表2KGF-2長期穩(wěn)定性考察結(jié)果

由上表可見，KGF-2滴眼劑在考察期內(nèi)穩(wěn)定。
二、藥理實施例 為了充分證明由重組人角質(zhì)細胞生長因子-2為原料制備的本發(fā)明滴眼液的藥理作用，本發(fā)明研究人員以重組人表皮生長因子衍生物滴眼劑為陽性對照，進行了以下藥效學試驗。
1.實驗動物 1.1健康新西蘭白兔130只，體重1.5～2.0kg，雌雄兼有。實驗前用裂隙燈顯微鏡檢查眼前段無病變。
2.藥物 2.1受試藥物重組人角質(zhì)細胞生長因子滴眼液由吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司提供。
2.2滴眼劑基質(zhì)由吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司提供。
2.3陽性對照藥采用重組人表皮生長因子衍生物滴眼劑。
2.4其他試驗用藥物均為市售品。
3.角膜堿燒傷模型的制作 動物以20mg/kg戊巴比妥鈉靜脈麻醉，用1％丁卡因表面麻醉，開瞼器開眼，暴露角膜，取直徑為8mm的單層濾紙，浸入1mol/L的NaOH溶液中10秒，取出后除去多于NaOH，將其貼于角膜中央60秒，即用60ml生理鹽水沖洗眼表及結(jié)膜囊。
4.分組及治療方法 將130只新西蘭大白兔，分成5組，每組26只，其中3組為受試藥物角質(zhì)細胞生長因子滴眼液高，中，低劑組，另外兩組分別為角膜損傷模型對照組及陽性藥物對照組，為排除兔的個體差異對治療效果的影響，本實驗隨機抽取每只兔的左右眼為實驗眼和空白對照眼。試驗組眼滴角質(zhì)細胞生長因子滴眼液每日3次，每次3滴?？瞻捉M滴平衡鹽溶液作對照。分組情況如下 ①角質(zhì)細胞生長因子大劑量組 26 ②角質(zhì)細胞生長因子中劑量組 26 ③角質(zhì)細胞生長因子小劑量組 26 ④陽性藥對照組 26 ⑤陰性對照組26 5觀察指標 5.1活體觀察 分別于燒傷前及給藥后1、2、7、14d第一次滴眼前用裂隙燈顯微鏡觀察眼前段的大體情況。
5.2上皮愈合面積及愈合率 分別于堿燒傷后的0、1、3、5、7、9、14d對兔眼行熒光染色，用裂隙燈顯微鏡觀察角膜著色的情況。測定角膜表面熒光染色的面積。計算角膜上皮愈合面積和角膜上皮愈合率。用SAS軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)均表為X±SD，差異顯著性定為P＜0.05。
角膜上皮愈合面積(mm2)＝給藥前熒光素著色面積-給藥后熒光素著色面積按角膜上皮愈合率＝(0d著色面積-觀察時著色面積)/0d著色面積×100％公式計算角膜上皮愈合率。
5.3角膜新生血管的影響 分別于堿燒傷后的7、11、14、21d用裂隙燈顯微鏡觀察測量、照相。以長入新生血管的垂直長度為準。新生血管的形成面積按Robert電腦教學模型公式S＝C/12X3.14X[r2-(r-L)2]，其中C為圓周鐘點數(shù)，r為角膜半徑，L為新生血管的長度。
6.實驗結(jié)論 1)重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液對堿燒傷兔角膜上皮愈合的影響 本研究建立的新西蘭大白兔角膜堿燒傷模型中，設(shè)計的角膜燒傷面積約為50mm2。燒傷后，燒傷區(qū)內(nèi)的角膜組織立即呈灰白色混濁，角膜上皮壞死脫落，周圍組織雖透明，但已有輕微水腫。經(jīng)熒光素染色和裂隙燈檢查可見，各試驗組角膜原燒傷區(qū)的著色區(qū)面積均為47mm2左右，自給藥后角膜原燒傷區(qū)逐漸由外周向中央愈合，重組人角質(zhì)細胞生長因子-2組和重組人表皮生長因子衍生物組至傷后第4天時均可見到原燒傷區(qū)角膜上皮完全愈合的兔眼，隨后隨著用藥天數(shù)的增加，完全愈合的眼數(shù)亦增加，到第14天時低、中、高劑量重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼劑組和陽性對照組完全愈合的兔眼分別達到53％、78％、81％和72％，而陰性對照組在整個觀察期內(nèi)均未見到完全愈合的眼。實驗結(jié)果表明重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液可減緩堿燒傷愈合過程中的角膜上皮細胞再脫落，三種劑量的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼劑均可顯著促進堿燒傷兔角膜上皮的愈合，治療效果與陽性對照組沒有明顯差異。
2)病理組織形態(tài)學變化 正常兔角膜由上皮細胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細胞層組成，上皮細胞層由5-6層細胞組成，排列規(guī)則。角膜堿燒傷后，上皮層完全脫落，前彈力層模糊，角膜基質(zhì)暴露、水腫、增厚，凝固性壞死，內(nèi)皮細胞面見纖維素性滲出及少數(shù)炎性細胞浸潤；至傷后第14天，重組人角質(zhì)細胞生長因子2滴眼液3種劑量治療組的角膜原燒傷區(qū)已被5-6層上皮細胞覆蓋，上皮細胞極向明顯，細胞間連接緊密，前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細胞層基本恢復正常；陽性對照組表現(xiàn)出與實驗組相似的促角膜上皮修復的作用；陰性對照組兔眼原燒傷區(qū)的角膜上皮細胞亦已有明顯的增殖再生，但新生上皮層表面細胞部分脫落，大部分基質(zhì)纖維變性和水腫。
3)重組人角質(zhì)細胞生長因子-2滴眼液對堿燒傷兔角膜上皮新生血管面積的影響
*p＜0.05，各組與一組比較。
實驗數(shù)據(jù)表明，KGF-2滴眼液堿燒傷后的7、11、14、21d高、中、低劑量組與模型組比較新生血管面積沒有顯著差異，陽性對照組堿燒傷后的7、11、14、21d高、中、低劑量組與模型組比較新生血管面積有顯著差異。實驗結(jié)果說明KGF-2不促進堿燒傷后兔角膜新生血管的生長。
權(quán)利要求
1.一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2)滴眼液，其特征在于，它由重組人角質(zhì)細胞生長因子-2，抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑和合適的緩沖體系組成。
2.權(quán)利要求1所述的滴眼液，其中重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的濃度為1μg/ml～1mg/ml。
3.權(quán)利要求1所述的滴眼液，其中抗氧化劑的種類以及各自的濃度分別為0.1％～5％甲硫氨酸、0.1％～5％組氨酸；螯合劑為0.01～1％EDTA；穩(wěn)定劑的種類以及各自的濃度分別為0.5％～10％甘露醇、1％～10％甘油、0.1％～5％L-組氨酸鹽酸鹽、0.1％～5％PEG-300；表面活性劑的種類以及各自的濃度為0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.001～0.5％吐溫80；滲透壓調(diào)解劑為0.1％～0.7％氯化鈉；合適的緩沖體系為5mM～100mM磷酸鹽緩沖液，緩沖體系的pH范圍是6.0～7.5。
4.一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2)滴眼液的制備方法，其特征在于，將抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑用處方量磷酸鹽緩沖液溶解，測定滲透壓，用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)解滲透壓，加入1μg/ml～1mg/ml人角質(zhì)細胞生長因子-2，除菌過濾，分裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有角膜上皮損傷修復作用的滴眼液，其特征在于，它由重組人角質(zhì)細胞生長因子-2與一定比例的抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑和合適的緩沖體系組成；本發(fā)明還公開了上述滴眼液的制備方法。藥理實驗表明，本發(fā)明的滴眼液能很好的促進角膜上皮損傷的修復。
文檔編號A61P27/02GK101537172SQ20081003015
公開日2009年9月23日 申請日期2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者李校堃, 王曉杰, 田海山, 王會巖, 馬吉勝, 黃志鋒, 黃亞東, 健 肖, 鑫 周, 朱佳男, 琪 項 申請人:溫州醫(yī)學院, 廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司, 吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司