專利名稱:一種青藤堿衍生物通過(guò)拮抗TNF-α信號(hào)通路治療自身免疫病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域。更具體地涉及青藤堿衍生物的用途。
背景技術(shù):
自身免疫病以其發(fā)病率高、無(wú)有效治療手段而成為直接威脅人類生命健康 和影響生活質(zhì)量的嚴(yán)重疾病。比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)在我國(guó)普通人群中的發(fā)病率高達(dá)0.35 — 0.4%,而且有逐年上升的趨勢(shì)。 RA是一種器官特異性的自身免疫病,病變主要累及全身大小關(guān)節(jié),最終導(dǎo)致關(guān) 節(jié)強(qiáng)直,生活自理能力喪失。同樣,強(qiáng)直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅班狼瘡,由于沒(méi) 有有效治療方法,而嚴(yán)重危害人類的健康。
基礎(chǔ)研究和臨床觀察表明Thl細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體 液免疫,在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要的調(diào)節(jié)作用。而在疾病的致病 過(guò)程中,炎癥因子是促進(jìn)免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致疾病的關(guān)鍵。因此,抑制炎癥 (anti-inflammatory)的介質(zhì)或細(xì)胞因子,對(duì)治療疾病是有益的。對(duì)于許多自 身免疫病,包括RA,銀屑病(psoriatic)禾口炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD) , TNF-a的產(chǎn)生和活性對(duì)于疾病的產(chǎn)生和嚴(yán)重程度起著至關(guān)重
要的作用。
臨床資料表明釆用抗腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的重組受體以及TNF-a的 人源化單克隆抗體的生物治療所得到的臨床結(jié)果令人振奮,它可通過(guò)中和 TNF-a生理活性而抑制炎癥病變的形成。臨床效果十分顯著,如使用抗體治療, 次日關(guān)節(jié)痛減輕, 一周后C-反應(yīng)蛋白降低,腫脹關(guān)節(jié)數(shù)降低。但是抗體治療仍有 難以克服的缺陷,比如,用量大,且價(jià)格昂貴;反復(fù)給藥易產(chǎn)生中和抗體,使 療效降低。
因此,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種對(duì)TNF-a的活性有抑制作用的小分子化合 物,來(lái)取代注射生物大蛋白
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供青藤堿衍生物的新用途。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種如式I所示的青藤堿衍生物的用途,
<formula>formula see original document page 4</formula>
它可用于制備預(yù)防或治療自身免疫疾病的組合物。
在另一優(yōu)選例中,所述的自身免疫疾病是巨噬細(xì)胞趨化引起的自身免疫疾病。 在另一優(yōu)選例中,所述的自身免疫疾病組合物是由腫瘤壞死因子-a(TNF-a)
信號(hào)通路傳導(dǎo)弓I起的自身免疫疾病。
在另一優(yōu)選例中,所述的自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid
Arthritis, RA),強(qiáng)直性脊柱炎,系統(tǒng)性紅班狼瘡,銀屑病(psoriatic),炎癥性
在本發(fā)明的第二方面,提供了一種如式I所示的青藤堿衍生物在制備腫瘤壞 死因子-a(TNF-oc)信號(hào)通路阻斷劑組合物中的用途。
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在另一優(yōu)選例中,所述的腫瘤壞死因子-a(TNF-a)信號(hào)通路阻斷是由于抑制了 Ikb-a的降解。
在另一優(yōu)選例中,本發(fā)明所述的組合物含有(a)如式I所示的青藤堿衍生物,
和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中,所述的組合物包括藥物組合物或保健品組合物。 在另一優(yōu)選例中,所述的組合物選自粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、
口服液或片劑。
腸病(inflammatory bowel disease, IBD)。據(jù)此,本發(fā)明提供了一種對(duì)TNF-a的活性有抑制作用的小分子化合物,即 如式I所示的青藤堿衍生物,它可以通過(guò)拮抗TNF-a信號(hào)通路治療自身免疫疾 病。
圖1顯示了式I化合物的半數(shù)抑制濃度;其中
A表示其抑制伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激引起的細(xì)胞增殖情況,B表示其抑 制脂多糖(LPS)刺激引起的細(xì)胞增殖情況。
圖2顯示了式I化合物的半數(shù)細(xì)胞毒濃度。
圖3顯示了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(Experimental autoimmune uveoretinitis, EAU)模型發(fā)病前后的組織形態(tài);其中
A左圖顯示了正常小鼠的眼球照片(眼底鏡觀察),A右圖顯示了視網(wǎng)膜 的組織化學(xué)切片;B左圖顯示了 EAU的眼球照片,B右圖和視網(wǎng)膜的組織化學(xué) 切片。
圖4顯示了式I化合物對(duì)EAU動(dòng)物模型評(píng)分的影響;其中將建立的EAU動(dòng) 物模型作為對(duì)照。
圖5顯示了式I化合物對(duì)ThG引起的巨噬細(xì)胞趨化過(guò)程的影響。 圖6顯示了式I化合物對(duì)I-KBoc降解的影響。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究,意外地發(fā)現(xiàn)如式I的化合物可用于治療自 身免疫疾病。進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn),它可有效阻滯ThG引起的巨噬細(xì)胞的趨化過(guò)程, 并且能特異性地阻斷TNF-a信號(hào)通路,從而抑制炎癥因子的合成。
本發(fā)明提供的式I化合物是青藤堿本體(代號(hào)1000)(如式II)的衍生 物,它可,包括但不限于,由植物中提取或化學(xué)合成、半合成、生物轉(zhuǎn)化的方 式獲得
5本發(fā)明提供的組合物中含有治療有效量的式I化合物和藥學(xué)上或食品學(xué)上 可接受的載體。所述的藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體指用于治療劑或營(yíng)養(yǎng)劑 的載體,包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些載體它們本身并不是 必要的活性成分,且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員所熟矢口的。在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , N.J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上或食 品學(xué)上可接受的載體可包括液體,如水、鹽水、甘油和乙醇。另外,這些載體 中還可能存在輔助性的物質(zhì),如崩解劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、pH緩沖物質(zhì)、調(diào)味 劑等。來(lái)自于其它的具有預(yù)防或治療自身免疫疾病,和/或具有阻斷TNF-a信號(hào) 通路作用的輔助性活性成分(例如其他輔助性藥材、植物提取物或化合物等), 也包括在藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體的定義中。
所述的組合物可以是藥物組合物或保健品組合物。
本發(fā)明提供了式I化合物在預(yù)防或治療自身免疫疾病中的應(yīng)用。所述的自 身免疫疾病可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的,例如但不限于RA,強(qiáng)直性脊柱 炎,系統(tǒng)性紅班狼瘡,銀屑病,IBD。本發(fā)明提供的式I化合物特別適用于預(yù) 防或治療巨噬細(xì)胞趨化引起的自身免疫疾病,由TNF-a信號(hào)通路傳導(dǎo)引起的自 身免疫疾病,禾P/或由免疫細(xì)胞增殖引起的自身免疫疾病。
本發(fā)明提供的式I化合物在預(yù)防或治療自身免疫疾病中的有效劑量是每曰500-1500mg/50kg體重??梢愿鶕?jù)病患的具體情況,由醫(yī)生或相關(guān)人員給予相 應(yīng)的使用劑量。
本發(fā)明提供了式I化合物在阻斷TNF-a信號(hào)通路中的應(yīng)用,尤其適用于抑 制Ikb-a降解。
本發(fā)明提供的式I化合物在阻斷TNF-a信號(hào)通路中的有效劑量是每日 500-1500mg/50kg體重??梢愿鶕?jù)病患的具體情況,由醫(yī)生或相關(guān)人員給予相 應(yīng)的使用劑量。
本發(fā)明提供的式I化合物可以阻滯ThG引起的巨噬細(xì)胞趨化過(guò)程,可以抑 制免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞)的增殖。
本發(fā)明提供的式I化合物可作為研究免疫信號(hào)傳導(dǎo)規(guī)律的分子探針,所述 的探針可以使用本領(lǐng)域熟知的方法獲得,例如在式I化合物上共價(jià)或非共價(jià)連 接分子信號(hào)。
本發(fā)明提供的式I化合物也可用于篩選對(duì)免疫信號(hào)傳導(dǎo)具有相關(guān)作用的藥 物??梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行篩選,例如但不限于,針對(duì)某個(gè)耙點(diǎn)(如 抑制I-icBa),通過(guò)檢驗(yàn)待篩藥物和式I化合物的拮抗作用或協(xié)同作用的大小, 獲知待篩藥物的藥效。
本發(fā)明提到的上述特征,或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書所 揭示的所有特征可與任何組合物形式并用,說(shuō)明書中所揭示的各個(gè)特征,可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明,所揭示的特 征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
1、 首次發(fā)現(xiàn)式I化合物在治療自身免疫性疾病方面具有較強(qiáng)的療效(比 青藤堿本體強(qiáng)數(shù)倍)以及較青藤堿更低的毒性;
2、 首次發(fā)現(xiàn)式I化合物具有阻斷TNF-a信號(hào)通路的作用;
3、 首次發(fā)現(xiàn)式I化合物具有阻滯ThG引起的巨噬細(xì)胞趨化過(guò)程。
7下面將結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于 說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說(shuō)明,否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1 制備式I化合物
可以參見(jiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)CN200510024478. 9的方法得到式I化合物(代號(hào) 1032,在以下的實(shí)施例中都將使用此代號(hào))。
實(shí)施例2
青藤堿衍生物免疫抑制活性的測(cè)定
首先在小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入T細(xì)胞或B細(xì)胞的特異性絲裂原 (ConA、 LPS),刺激T或B細(xì)胞增殖,然后分別以不同濃度梯度(測(cè)定第一 組化合物IC50時(shí),選擇曲線驟變區(qū)域附近的濃度作梯度,之后各組化合物測(cè) 定時(shí),根據(jù)第一組的濃度梯度做相應(yīng)調(diào)整)加入青藤堿(如式II所示,代號(hào) 1000,在以下的實(shí)施例中都將使用此代號(hào))及其衍生物(其中包括實(shí)施例l獲 得的1032),在48小時(shí)后用3H摻入法測(cè)量淋巴細(xì)胞增殖情況,算得IC5。值, 以衡量其對(duì)免疫細(xì)胞的生物學(xué)活性作用。
結(jié)果見(jiàn)圖1。
結(jié)果表明,本發(fā)明提供的式I化合物具有非常強(qiáng)效的抑制免疫細(xì)胞增殖的 作用。
實(shí)施例3
青藤堿衍生物毒性的測(cè)定
在小鼠脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)體系中以不同濃度梯度加入青藤堿(如式n所示)
及其衍生物(其中包括實(shí)施例1獲得的1032),在42小時(shí)加入MTT (噻唑蘭),48小時(shí)后反應(yīng)終止,用分光光度計(jì)測(cè)量OD值,由下面公式算出CC50值,以表 征毒性大小。以青藤堿作為對(duì)照,觀察各衍生物相對(duì)于青藤堿的水平。
細(xì)胞毒性(%)=^ ="1£^腦
結(jié)果見(jiàn)圖2。
結(jié)果顯示,有數(shù)種衍生物的毒性要比青藤堿(代號(hào)1000)明顯低,安全性更好。
綜合實(shí)施例1、 2中的數(shù)據(jù),從諸多衍生物中選取活性很高且毒性很低的 1032化合物進(jìn)行以下療效及機(jī)制研究。
實(shí)施例4
1032對(duì)自身免疫病的療效驗(yàn)證
將實(shí)施例l獲得的1032化合物,在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(EAU) 動(dòng)物模型(對(duì)照)中檢驗(yàn)其療效。
用光間受體視黃素物質(zhì)結(jié)合蛋白(IRBP)(其純化方法如下)加完全弗氏佐 劑(CFA,加入了滅活的結(jié)核桿菌)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生EAU (對(duì)照)。其間在皮下打 入10-30mg/kg劑量1032化合物,21天后取眼球切片打分,以衡量1032化合 物在EAU這種Thl介導(dǎo)的自身免疫病模型(對(duì)照)中的治療作用。
結(jié)果見(jiàn)圖3和4。
結(jié)果表明,1032對(duì)于EAU具有很好的治療效果。 IRBP的純化方法
第一天
1、 冰浴下碾磨牛眼視網(wǎng)膜(200只),浸泡于160ml PBS中,加入O. 9ml苯 甲基磺酰氟(即PMSF) , 4'C慢速攪拌3小時(shí)得一混合液;
2、 將步驟l得到的混合液離心,4'C, 10000rpm, l小時(shí);
3、 取上清,加入伴刀豆球蛋白A瓊脂糖4B (ConA S印harose 4b),得一 混合液(伴刀豆球蛋白A瓊脂糖4B預(yù)處理10ml伴刀豆球蛋白A瓊脂糖4B用結(jié) 合緩沖液洗過(guò)5 —6次,平衡于150ml結(jié)合緩沖液中〕;
4、 將步驟3得到的混合液慢速攪動(dòng)2小時(shí),4'C放置過(guò)夜; 第二天
5、 早上不時(shí)攪動(dòng)l小時(shí);
6、 將混合液加到ConA-S印harose 4B親和層析柱中,流干,液體棄之不用;
97、 柱子用100ml結(jié)合緩沖液(50mM Tris, 140mM NaCl,pH7.6)洗,加入 10ml洗脫緩沖液(結(jié)合緩沖液中含0.5M甲基a-D-吡喃甘露糖苷(sigma)),攪
拌使懸浮得一混合液;
8、 將步驟7得到的混合液放置2小時(shí)(期間每0.5小時(shí)攪拌一次),收集上
清;
9、 再向除去上清后的混合液中加入10ml洗脫緩沖液,攪拌使懸浮,放置4 小時(shí)(期間每0.5小時(shí)攪拌一次),收集上清;
10、 再向除去上清后的混合液中加入10ml洗脫緩沖液,攪拌使懸浮,放置 4小時(shí)(期間每O. 5小時(shí)攪拌一次),收集上清;
11、 合并三次洗脫液(即三次上清),在PBS中透析過(guò)夜,期間換2次PBS。 透析后的即為IRBP。
實(shí)施例5
1032對(duì)ThG引起的巨噬細(xì)胞趨化過(guò)程的阻滯效果驗(yàn)證
在0小時(shí)和24小時(shí)分別在C57BL/6小鼠腹腔注射ThG,它可以趨化體內(nèi)的 巨噬細(xì)胞,同時(shí)這些巨噬細(xì)胞能夠釋放炎性因子比如TNF-a 。
同時(shí)打入10-30mg/kgl032化合物或者不打入,48小時(shí)后對(duì)腹腔沖洗出的 細(xì)胞計(jì)數(shù),并且對(duì)其細(xì)胞亞型用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),以說(shuō)明1032對(duì)巨噬細(xì) 胞遷移和其釋放炎癥性細(xì)胞因子的改變。
結(jié)果見(jiàn)圖5。
結(jié)果表明,1032對(duì)ThG引起的巨噬細(xì)胞趨化過(guò)程有很明顯的阻滯效果。 實(shí)施例6
1032治療自身免疫病的機(jī)制探討
首先用加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞,這種細(xì)胞對(duì) TNF-a的信號(hào)敏感,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,加入重組純化的TNF-a (購(gòu)自 P印rotech),使TNF-a終濃度為0. 4ng/ml,同時(shí)以一定濃度梯度(0.14iamol/ml, 0.28)amol/ml, 0.56pmol/ml, 1.12pmol/ml)加入實(shí)施例1獲得的1032化合物, 20 — 30分鐘后裂解細(xì)胞,用Western Blot的方法檢測(cè)TNF-a信號(hào)通路中信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)分子I-KBa的降解程度,從而表明小分子對(duì)TNF-a所開啟的信號(hào)通路的 直接影響。
10結(jié)果見(jiàn)圖6。
結(jié)果表明,1032能夠拮抗TNF-a信號(hào)通路,這也很可能是1032治療自身 免疫病的分子機(jī)制。
TNF-a所導(dǎo)致炎癥反應(yīng)主要是通過(guò)激活NF-icB所產(chǎn)生,在非誘導(dǎo)的穩(wěn)態(tài), 細(xì)胞的I-KBa蛋白與NF-KB 二聚體結(jié)合,使得NF-ic B被限制在胞漿中。 TNF-ci和其他能誘導(dǎo)激活NF-KB的細(xì)胞因子一樣,能夠誘導(dǎo)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 蛋白的相互作用,傳遞給一個(gè)IKK復(fù)合物,由IKKa, IKKP, IKKy所組成。 對(duì)IKK復(fù)合物的激活可以磷酸化I一icBa蛋白的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域,使I-KB被 SKPl-Cullin-Fboxtype E3泛素化酶所識(shí)別,并被蛋白酶體降解,從而釋放 NF-k B入核表達(dá)生成炎癥因子。
通過(guò)檢測(cè)I一KBa蛋白的降解程度,可以間接表征NF-KB介導(dǎo)的炎癥因 子表達(dá)水平I一KBa蛋白降解量越多,被釋放入核的NF-k B量越多,炎癥 因子表達(dá)水平越高;1032能抑制I一icBci蛋白降解,也就說(shuō)明1032能抑制炎 癥因子的表達(dá)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍,本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中,任 何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法,若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同,也或是一種等效的變更,均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1. 一種如式I所示的青藤堿衍生物的用途,其特征在于,用于制備預(yù)防或治療自身免疫疾病的組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病是巨噬細(xì)胞 趨化引起的自身免疫疾病。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病組合物是由 腫瘤壞死因子-oc信號(hào)通路傳導(dǎo)引起的自身免疫疾病。
4. 如權(quán)利要求1一3任一所述的用途,其特征在于,所述的自身免疫疾病選自 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,強(qiáng)直性脊柱炎,系統(tǒng)性紅班狼瘡,銀屑病,炎癥性腸病。
5. —種如式I所示的青藤堿衍生物在制備腫瘤壞死因子-a信號(hào)通路阻斷劑組合物中的用途。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述的腫瘤壞死因子-a信號(hào)通路 阻斷是由于抑制了 Ikb-oc的降解。
7. 如權(quán)利要求1或5任一所述的用途,其特征在于,所述的組合物含有(a)如 式I所示的青藤堿衍生物,和(b)藥學(xué)上可接受的載體。
8. 如權(quán)利要求7所述的用途,其特征在于,所述的組合物包括藥物組合物或 保健品組合物。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途,其特征在于,所述的組合物選自粉劑、顆 粒劑、膠囊劑、注射劑、口服液或片劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種青藤堿衍生物通過(guò)拮抗TNF-α信號(hào)通路治療自身免疫病,即如式I的青藤堿衍生物的用途,它可用于制備預(yù)防或治療自身免疫疾病的組合物。本發(fā)明還公開了式I化合物在制備腫瘤壞死因子-α(TNF-α)信號(hào)通路阻斷劑組合物中的用途。
文檔編號(hào)A61K31/4985GK101485661SQ20081003275
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月17日
發(fā)明者周海濱, 姚祝軍, 兵 孫, 嘉 鄒, 釗 馬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所