專利名稱：苯丙氨酸衍生物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化學(xué)合成藥物領(lǐng)域，涉及化合物苯丙氨酸衍生物(WEN)在抗乙肝 病毒復(fù)制中的藥用用途，具體涉及所述的化合物在細(xì)胞內(nèi)抗乙肝病毒復(fù)制的用途。 背景材料
乙型肝炎病毒(HBV)是引起人類慢性乙型肝炎，肝硬化甚至肝癌的重要病因。 乙肝病毒的復(fù)制與上述疾病的發(fā)生與發(fā)展有重要相關(guān)性。病毒基因組所編碼的病毒 DNA聚合酶是決定病毒復(fù)制性高低的關(guān)鍵組分。研究表明，乙肝病毒DNA聚合酶 由末端蛋白，連接臂，逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和RNaseH酶四部分組成。其中逆轉(zhuǎn)錄酶的作 用是以病毒前基因組RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成病毒DNA，然后經(jīng)過DNA復(fù)制子代 DNA [Radziwill, G. et al. 19卯.J Virol. 64:613-20.]。
有研究公開了根據(jù)HBV的RT結(jié)構(gòu)與功能，設(shè)計(jì)了數(shù)種抗乙肝病毒的藥物，如 拉米呋啶(3TC)，恩替卡韋等。目前，己知的抗病毒RT藥物，其中， 一大類為核 苷(酸)類似物，其抗病毒原理是通過摻入病毒DNA阻止核苷酸鏈繼續(xù)延長而阻斷病 毒復(fù)制；另一類為非核苷類藥物，其大部分為不同的疏水性化合物，其抗病毒原理 是通過作用于RT中的疏水性"口袋"(pockets)而阻礙RT的正常功能[Karayiannis. 2003. J Antimicrob Chemother. 51:761-785.; Spence R. A. et al. 1995. Science. 267: 988-993.]。目前，臨床上使用的HBVRT抑制劑均為核苷(酸)類似物。但是，長期 使用核苷(酸)類似物，可致使HBV對(duì)該類藥物產(chǎn)生耐藥性，為此，臨床治療需要研 發(fā)新的抗病毒藥物。
苯丙氨酸衍生物(WEN)曾被報(bào)道對(duì)丙型肝炎病毒聚合酶具有抑制作用[Wang M. et al. 2003, J. Biol. Chem. 278: 9489-9495.]。該化合物在2005年獲得美國專利[US Patent: US 6,887,877 B2.];專利名稱為治療或預(yù)防黃病毒感染的化合物和方法 (Compounds and methods for the treatment or prevention of Flavivirus infections)。該
專利公開了 WEN及其衍生物的結(jié)構(gòu)，以及在治療黃病毒科病毒感染中的應(yīng)用。目前尚未見WEN及其衍生物用于抑制HBV尤其是HBV RT及其復(fù)制的報(bào)道。
復(fù)旦大學(xué)分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室長期以來進(jìn)行HBVRT的研究，在HBVRT拇指亞 區(qū)發(fā)現(xiàn)有一段氨基酸保守的序列，并證明該區(qū)突變后有影響HBV復(fù)制的作用[Lin， X. et al. 2001. J Virol. 75: 11827-33.; Wang YX. et al， 2007. J Med Virol. 79: 676-682.; WangYX. et al, 2007. FEBS Lett 581: 558-564.]，[中國專利申請(qǐng)?zhí)?200510112431.8]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供苯丙氨酸衍生物的新的藥用用途，具體涉及苯丙氨酸衍生 物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
本發(fā)明所述的苯丙氨酸衍生物((25)-2-[(2，4-二氯-苯甲酰基)-(3-三氟甲基苯基)-氨基〗-3-苯基-丙酸),((2s)-2-[(2,4-dichloro-benzoyl)-(3-trifluoromethylbenzyl)-amino] -3-phenyl-propionic acid， WEN)為現(xiàn)有技術(shù)公開的化學(xué)合成法合成的化合物。
HBV尚無簡單可行的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，本發(fā)明首先建立可代表HBV復(fù)制的 細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的技術(shù)平臺(tái)，以此為基礎(chǔ)應(yīng)用WEN與HBV作用檢驗(yàn)WEN是否有 抗HBV的作用。
本發(fā)明利用乙肝病毒基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究病毒復(fù)制技術(shù)，測(cè)定苯丙氨酸衍生物 (WEN)抗乙肝病毒復(fù)制的作用。
本發(fā)明進(jìn)行了大量篩選抑制HBVRT化合物的研究，分別用不同濃度的所述的 WEN進(jìn)行抑制HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，所述的苯丙氨酸衍生物WEN具 有抗乙肝病毒復(fù)制的新用途，尤其是WEN在細(xì)胞內(nèi)抗乙肝病毒復(fù)制。
本發(fā)明所述的乙肝病毒可以是不同乙肝病毒基因型及耐藥毒株。
鑒于WEN可能作用于HBV RT拇指亞區(qū)，本發(fā)明在此基礎(chǔ)進(jìn)行了 WEN在抗 HBV復(fù)制中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)
采用已知的全基因組HBV轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞及復(fù)制效率測(cè)定方法，進(jìn)行WEN對(duì) 細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制抑制的測(cè)定，
1、通過已知的磷酸鈣共沉淀法將乙肝病毒基因組轉(zhuǎn)染入Huh-7細(xì)胞(購自武漢 大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，次日換液后，在培養(yǎng)上清中同時(shí)加入不同濃度的 WEN,并連續(xù)培養(yǎng)4-5天，提取細(xì)胞內(nèi)的HBV核心顆粒中的病毒，提取方法按現(xiàn) 有技術(shù)(DNA Wang YX. et al, 2007. J Med Virol. 79: 676-682);2、 用Southern印跡法，與標(biāo)記的HBV探針作分子雜交及放射自顯影術(shù)，檢驗(yàn) 在不同濃度的WEN存在條件下對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響；
3、 通過分析雜交信號(hào)的強(qiáng)弱作細(xì)胞內(nèi)HBVDNA含量測(cè)定，對(duì)比研究WEN處 理組和未處理組HBV復(fù)制特性的變化，驗(yàn)證WEN抗乙肝病毒的用途。
結(jié)果顯示，不同濃度(0.06、 0.6、 6禾B60pM) WEN并不影響HBV表達(dá)的病 毒蛋白；但60nMWEN明顯抑制已轉(zhuǎn)染有HBV復(fù)制細(xì)胞的作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述 的苯丙氨酸衍生物WEN具有抗乙肝病毒復(fù)制的用途，尤其是WEN在細(xì)胞內(nèi)抗乙 肝病毒復(fù)制。
本發(fā)明所述的苯丙氨酸衍生物(WEN)可制成藥物，治療乙肝病毒引起的或相 關(guān)的疾病；
或在所述WEN的基礎(chǔ)上修飾其結(jié)構(gòu)獲得衍生物，用于提高療效及降低對(duì)細(xì)胞 的毒性，以及用所述WEN單獨(dú)或與其他藥物或制品聯(lián)合應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)及臨床研究。
本發(fā)明所述的乙肝病毒引起的或相關(guān)的疾病包括急性或慢性乙型肝炎、重癥肝 炎、肝硬化、肝癌，或肝移植后的抗病毒治療。


圖1是WEN對(duì)Huh-7細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的作用結(jié)果，
其中，A為WEN對(duì)HBV基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞表達(dá)的病毒E和S抗原量的 影響；
B為Southern印跡法檢測(cè)WEN對(duì)HBV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1細(xì)胞水平測(cè)定不同劑量WEN對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用 轉(zhuǎn)染前一天將Huh-7細(xì)胞以每皿lxl(^個(gè)細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 16-18小時(shí)后換5 ml新鮮DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素G， 100嗎/ml鏈霉素，0.2 mM L-谷氨酰胺)，2~4小時(shí)后用20嗎DNA (10嗎含1.3 拷貝HBV基因組質(zhì)粒DNA， 4嗎pSEAP2-Contro1和6 |ig pCDNA3.1)按磷酸韋丐 共沉淀法分別轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞。次日換新鮮培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液中加入0.06、 0.6、6和60^M不同劑量的WEN，連續(xù)培養(yǎng)4天后，取200 pl培養(yǎng)上清測(cè)定外源性表達(dá) 的SEAP (secreted alkaline phosphatase)含量以校正轉(zhuǎn)染效率，然后抽提細(xì)胞內(nèi)病 毒顆粒DNA，提取方法按現(xiàn)有技術(shù)(DNA Wang YX. et al, 2007. J Med Virol. 79: 676-682)，最后采用HBV特異性Southern印跡法測(cè)定WEN處理后的細(xì)胞內(nèi)病毒顆 粒DNA含量。結(jié)果顯示與未處理組(0 pM)比較，不同濃度(0.06、 0.6、 6和 60nM) WEN不影響HBV表達(dá)的病毒蛋白；但其中60 WEN明顯抑制已轉(zhuǎn)染有 HBV復(fù)制細(xì)胞的作用，表明所述的苯丙氨酸衍生物WEN具有抗乙肝病毒復(fù)制的用 途。
權(quán)利要求
1、苯丙氨酸衍生物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
2、 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的苯丙氨酸衍生物還包括修飾其結(jié) 構(gòu)后獲得的衍生物。
3、 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的乙肝病毒為不同乙肝病毒基因型 或耐藥毒株。
4、 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述的用途是制備治療乙肝病毒引起或 相關(guān)疾病的藥物。
5、 按按權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述的乙肝病毒引起或相關(guān)疾病是急 性或慢性乙型肝炎、重癥肝炎、肝硬化、肝癌或肝移植后抗病毒。
6、 一種抗乙肝病毒的藥物，其特征是含有苯丙氨酸衍生物。
7、 按權(quán)利要求6所述的抗乙肝病毒的藥物，其特征是所述的藥物單獨(dú)或與其他 藥物或制品聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬化學(xué)合成藥物領(lǐng)域，涉及化合物苯丙氨酸衍生物(WEN)在抗乙肝病毒復(fù)制中的藥用用途。本發(fā)明利用乙肝病毒基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞研究病毒復(fù)制技術(shù)，分別用不同濃度的苯丙氨酸衍生物進(jìn)行抑制HBV復(fù)制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同濃度WEN并不影響HBV表達(dá)的病毒蛋白，但60μM WEN明顯抑制已轉(zhuǎn)染有HBV復(fù)制細(xì)胞的作用，證明所述的苯丙氨酸衍生物具有抗乙肝病毒復(fù)制的新用途，本發(fā)明的苯丙氨酸衍生物可制成藥物，治療乙肝病毒引起的或相關(guān)的疾??；或在修飾其結(jié)構(gòu)獲得衍生物，用于提高療效及降低對(duì)細(xì)胞的毒性，以及用所述WEN單獨(dú)或與其他藥物或制品聯(lián)合應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)及臨床研究。
文檔編號(hào)A61K31/185GK101491514SQ20081003315
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者王勇翔, 胡有洪, 聞?dòng)衩?申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)