專利名稱：毒隱翅蟲提取液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毒隱翅蟲提取液及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
毒隱翅蟲是隱翅蟲科中的一個屬，已知種類超過250種，產(chǎn)自除南極洲以 外的世界各地，中國已報道的毒隱翅蟲有21種。毒隱翅蟲主要生活在潮濕的 農(nóng)田、菜地、雜草叢中，是山溝、農(nóng)田常見的小型昆蟲。我國常見的毒隱翅蟲 有青翅敗形隱翅蟲(又稱梭形毒隱翅蟲、黃足蟻形隱翅蟲)，黑足蟻形隱翅蟲， 多毛隱翅蟲，巾形毒隱翅蟲，小紅毒隱翅蟲，蟻態(tài)毒隱翅蟲，西藏毒隱翅蟲等 7種，其中以青翅蟻形隱翅蟲分布最廣，遍及各省及臺灣等地區(qū)。毒隱翅蟲的卵、幼蟲、蛹和成蟲(除翅以外的各部分)都有毒素存在，成 蟲的毒素主要來源于血淋巴，雌、雄蟲體內(nèi)都含有毒素。毒隱翅蟲的毒素是蟲 體用來抵御外來侵襲的化學物質(zhì)。毒隱翅蟲的毒液化學成分復(fù)雜，含有醛類、 醌類、萜類等，有報道其毒素主要為3種，分別是毒隱翅蟲素、擬毒隱翅蟲素 和毒隱翅蟲酮。其中，毒隱翅蟲素的含量最高，分子量為503.65,溶于有機溶 劑乙醇、乙醚、氯仿及苯，不溶于水，結(jié)晶的毒隱翅蟲素在112匸熔化，弱酸 性，水中煮沸l(wèi)h不被破壞。我國毒隱翅蟲的資源較多，但對毒隱翅蟲毒素的 提取工藝及其藥效研究尚無完整的研究報道。糖尿病皮膚潰瘍，是導(dǎo)致糖尿病患者致殘致死的嚴重慢性并發(fā)癥之一。糖 尿病皮膚潰瘍主要在足部，是一種較頑固的慢性潰瘍，若向深部發(fā)展，則最后 截肢。全球近2億糖尿病患者中，有15%以上發(fā)生足潰瘍或壞疽。糖尿病皮膚 潰瘍患者的截肢是非糖尿病患者的15倍，每年的非創(chuàng)傷性截肢中約50%是糖 尿病患者，而后者85%以上是因足部皮膚潰瘍惡化、深部感染或鄰疽所致。糖 尿病皮膚潰瘍的治療，除了對癥治療(包括限制活動，減少體重負荷，抬高患 肢，以利于下肢血液回流，嚴格控制血糖，積極糾正酮癥酸中毒等影響皮膚潰 瘍愈合的各種不良因素)夕卜，傳統(tǒng)的常用擴張血管藥物如前列腺素El、西洛他唑、654-2以及活血化瘀中藥如燈盞花素、參脈等藥物治療，臨床上還有高 壓氧治療、血管再造術(shù)、細胞因子基因治療、營養(yǎng)神經(jīng)治療、真空封閉、擬人 皮膚活性物、自體皮瓣移植等方法，但目前尚無有效治療方法。雖然毒隱翅蟲 毒素治療慢性、壞死性皮膚潰瘍有零星報道，但運用毒隱翅蟲毒素提取液治療 糖尿病皮膚頑固性潰瘍的研究尚為鮮見。HL-60人白血病細胞株的凋亡為減緩人急性白血病進展的機制之一， BEL-7402人肝癌細胞株的凋亡為減緩人肝癌進展的機制之一。顯然，抑制 HL-60人白血病細胞株和BEL-7402人肝癌細胞株生長的藥物，對治療某些類 型的人白血病和人肝癌具有積極的意義。毛囊是一個獨立的器官，在機體一生中不斷經(jīng)歷生長期、退行期、.休止期 的周期性循環(huán)。來自外胚層的毛囊上皮成分和來自中胚層的毛囊真皮成分相互 作用，通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌在毛囊及其毛囊周圍合成和代謝大量的生 長因子、細胞因子、激素和神經(jīng)肽等完成復(fù)雜而有序的毛發(fā)生長周期。若有能 減少退行期、延緩休止期、激發(fā)生長期的藥物，其應(yīng)用前景不言而喻。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是公開一種毒隱翅蟲提取液和及其制備方法和其在藥物中 的應(yīng)用，以填補現(xiàn)有技術(shù)的空白。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液包括乙醇溶劑和毒隱翅蟲毒素，其中毒隱翅 蟲毒素的總含量不低于30%。所述毒隱翅蟲毒素為毒隱翅蟲素、擬毒隱翅蟲素和毒隱翅蟲酮的混合物。 本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液的制備方法包括如下順序步驟1) 在加熱架上安裝平底燒瓶，內(nèi)加75% ~95%乙醇平底燒瓶的3/5容積；2) 按索氏提取器的長度與內(nèi)徑大小，用濾紙做成套桶；3) 操作者帶乳膠手套，將釆集的活毒隱翅蟲稱重，然后在研缽中將毒隱翅 蟲搗碎，立即置于上述濾紙?zhí)淄皟?nèi)；4) 將套桶裝入索氏提取器，自上而下安裝索氏提取裝置，開啟冷凝水，加 熱回流；5) 保持回流2~4小時；6) 自然冷卻到室溫，濃縮定容為毒隱翅蟲體重的4-6倍。本發(fā)明制備的毒隱翅蟲提取液，可應(yīng)用于制備促進糖尿病皮膚潰瘍愈合的藥物、制備抑制HL-60人白血病細胞株生長的藥物、制備抑制BEL-7402人肝 癌細胞株生長的藥物及制備促進毛發(fā)生長的藥物。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明是如何實現(xiàn)的做進一步詳細、清楚、完整地 說明，所列實施例僅對本發(fā)明予以進一步的說明，并不因此而限制本發(fā)明。 實施例l1) 在加熱架上安裝平底燒瓶，內(nèi)加95%乙醇至平底燒瓶的3/5容積；2) 按索氏提取器的長度與內(nèi)徑大小，用濾紙做成套桶；3) 操作者帶乳膠手套，將釆集的活毒隱翅蟲稱重，然后在研缽中將毒隱翅 蟲搗碎，立即置于上述濾紙?zhí)淄皟?nèi)；4) 將套桶裝入索氏提取器，自上而下安裝索氏提取裝置，開啟冷凝水，加 熱到回流；5) 保持回流3小時；6) 自然冷卻到室溫，濃縮定容為毒隱翅蟲稱重的5倍。 檢測所制備的毒隱翅蟲提取液的組成含量，檢測方法如下APBOOO質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，HPLC高效液相色譜儀(曰本 Shimadzu公司)等儀器，甲醇、甲酸銨為HPLC級，以50%甲醇稀釋50-100 倍，記錄時間為60min，離子化方式為ESI,掃描范圍為50-900m/z。測定結(jié)果樣品含有毒隱翅蟲素(pederin)、擬毒隱翅蟲素(Pseudopederin) 和毒隱翅蟲酮(pederon)的化合物，總含量為70%。實施例21) 在加熱架上安裝平底燒瓶，內(nèi)加75%乙醇至平底燒瓶的3/5容積；2) 按索氏提取器的長度與內(nèi)徑大小，用濾紙做成套桶；3) 操作者帶乳膠手套，將釆集的活毒隱翅蟲稱重，然后在研缽中將毒隱翅 蟲搗碎，立即置于上述濾紙?zhí)淄皟?nèi)；4) 將套桶裝入索氏提取器，自上而下安裝索氏提取裝置，開啟冷凝水，加 熱到回流；5) 保持回流3小時；6) 自然冷卻到室溫，濃縮定容為毒隱翅蟲稱重的5倍。檢測所制備的毒隱翅蟲提取液的組成含量，檢測方法如下 API3000質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，HPLC高效液相色譜儀(日本 Shimadzu公司)等儀器，甲醇、甲酸銨為HPLC級，以50%甲醇稀釋50-100 倍，記錄時間為60min,離子化方式為ESI,掃描范圍為50-900m/z。測定結(jié)果樣品含有毒隱翅蟲素(pederin)、擬毒隱翅蟲素(Pseudopederin) 和毒隱翅蟲酮(pederon)的化合物，總含量為30%。實施例31) 在加熱架上安裝平底燒瓶，內(nèi)加85%乙醇至平底燒瓶的3/5容積；2) 按索氏提取器的長度與內(nèi)徑大小，用濾紙做成套桶；3) 操作者帶乳膠手套，將釆集的活毒隱翅蟲稱重，然后在研缽中將毒隱翅 蟲搗碎，立即置于上述濾紙?zhí)淄皟?nèi)；4) 將套桶裝入索氏提取器，自上而下安裝索氏提取裝置，開啟冷凝水，加 熱到回流；5) 保持回流3小時；6) 自然冷卻到室溫，濃縮定容為毒隱翅蟲稱重的5倍。 檢測所制備的毒隱翅蟲提取液的組成含量，檢測方法如下API3000質(zhì)譜儀(美囯應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，HPLC高效液相色譜儀(日本 Shimadzu公司)等儀器，甲醇、甲酸銨為HPLC級，以50%甲醇稀釋50-100 倍，記錄時間為60min，離子化方式為ESI,掃描范圍為50-900m/z。測定結(jié)果樣品含有毒隱翅蟲素(pederin)、擬毒隱翅蟲素(Pseudopederin) 和毒隱翅蟲酮(pederon)的化合物，總含量為5()0/。。實施例4本實施例為本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液在促進糖尿病皮膚潰瘍愈合中 的藥效實驗將32只清潔級雄性昆明小白鼠，體重18.12 土2.41g,隨機分為4組低劑 量組12只，高劑量組12只，空白組(無任何處理)4只，空白對照組(注射 等量生理鹽水，脊部開創(chuàng)，滴涂生理鹽水)4只。尾靜脈注射3%四氧嘧啶 100mg^g, 72小時后，自遠端尾靜脈釆血，血糖測定儀檢測血糖，若血糖濃 度>10.0 mmol/L即為造模成功。再72小時后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉 25mg/kg,背部剃毛，常規(guī)消毒，在脊背中央用剪刀制成面積為l平方厘米的 圓形創(chuàng)面，單籠喂養(yǎng)，定量飲水與喂食。術(shù)后3天，低劑量組和高劑量組開始用藥，用滴管在創(chuàng)面分別滴低劑量濃度或高劑量濃度的毒隱翅蟲提取液0.5ml, l次/3天。在術(shù)后第9天、第15天、 第21天、第27天(于滴涂藥物前)記錄創(chuàng)口面積、滲出、色澤、結(jié)痂情況， 然后分別處死低劑量組3只，高劑量組3只，空白對照組l只。取創(chuàng)面組織置 3.7%多聚甲醛溶液中，包埋，切片，組織學觀察炎癥細胞浸潤、上皮化發(fā)生、 真皮結(jié)構(gòu)、膠原纖維致密度、血管分布等情況。實驗結(jié)果表明四氧嘧啶糖尿病小白鼠造模，在背部皮膚潰瘍創(chuàng)口涂布含 有毒隱翅蟲毒素提取液后，創(chuàng)口滲出、收口時間短于對照組(空白對照組完全 收口愈合為28.25 ±0.62天，而低劑量組為26.25 ±0.71天，高劑量組為22.75 ±0.43天)，創(chuàng)口干燥、色澤由鮮紅變暗紅早于對照組；用藥組創(chuàng)面炎癥細胞 浸潤較對照組略少，膠原纖維網(wǎng)狀排列、疏松，血管分布均勻，而對照組真皮 結(jié)構(gòu)厚、膠原纖維紊亂、致密度高?？梢?，本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液可應(yīng) 用于制備促進糖尿病皮膚潰瘍愈合的藥物。實施例5本實施例為本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液在促進HL-60人白血病細胞株 生長中的藥效實驗-.釆用常規(guī)的四氮唑鹽(MTT)還原法，作用時間72小時。實驗結(jié)果表明 在低濃度和高濃度時，本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液對HL-60人白血病細胞株 生長的抑制率均達到90%以上，可應(yīng)用于制備促進HL-60人白血病細胞株生長 的藥物。實施例6本實施例為本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液在抑制BEL-7402人肝癌細胞株 生長中的藥效實驗釆用常規(guī)的磺酰羅丹明B (SRB)蛋白染色法，作用時間72小時。實驗結(jié) 果表明在低濃度和高濃度時，本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液對BEL-7402人 肝癌細胞株生長的抑制率均達到卯％以上，可應(yīng)用于制備抑制BEL-7402人肝 癌細胞株生長的藥物。本實施例為本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液在促進毛發(fā)生長中的藥效實驗 1)用滴管汲取毒隱翅蟲提取液0.5ml,滴在昆明小白鼠鼻部上方(紅色黏膜) 處，隔3天再滴一次，4天后，可見小白鼠鼻部上方(紅色黏膜)處長出密密的短絨毛。2)用滴管汲取毒隱翅蟲提取液lml，滴在昆明小白鼠右前肢上方皮膚上， 隔3天再滴一次，3天后，可見局部毛長于周圍約2mm。可見，本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液可應(yīng)用于制備促進毛發(fā)生長的藥物。
權(quán)利要求
1.一種毒隱翅蟲提取液，其特征在于所述提取液包括乙醇溶劑和毒隱翅蟲毒素，其中毒隱翅蟲毒素的總含量不低于30％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的毒隱翅蟲提取液，其特征在于所述毒隱翅蟲毒 素為毒隱翅蟲素、擬毒隱翅蟲素和毒隱翅蟲酮的混合物。
3. —種權(quán)利要求l所述的毒隱翅蟲提取液的制備方法，其特征在于所述 制備方法包括如下順序步驟1) 在加熱架上安裝平底燒瓶，內(nèi)加75% ~95%乙醇至平底燒瓶的3/5容積；2) 按索氏提取器的長度與內(nèi)徑大小，用濾紙做成套桶；3) 操作者帶乳膠手套，將釆集的活毒隱翅蟲稱重，然后在研缽中將毒隱翅 蟲搗碎，立即置于上述濾紙?zhí)淄皟?nèi)；4) 將套桶裝入索氏提取器，自上而下安裝索氏提取裝置，開啟冷凝水，加 熱回流；5) 保持回流2 4小時；6) 自然冷卻到室溫，濃縮定容為毒隱翅蟲體重的4 6倍。
4. 一種權(quán)利要求1所述的毒隱翅蟲提取液的應(yīng)用，其特征在于所述毒隱 翅蟲提取液在制備促進糖尿病皮膚潰瘍愈合藥物中的應(yīng)用。
5. —種權(quán)利要求1所述的毒隱翅蟲提取液的應(yīng)用，其特征在于所述毒隱 翅蟲提取液在制備抑制HL-60人白血病細胞株生長藥物中的應(yīng)用。
6. —種權(quán)利要求1所述的毒隱翅蟲提取液的應(yīng)用，其特征在于所述毒隱 翅蟲提取液在制備抑制BEL-7402人肝癌細胞株生長藥物中的應(yīng)用。
7. —種權(quán)利要求1所述的毒隱翅蟲提取液的應(yīng)用，其特征在于所述毒隱 翅蟲提取液在制備促進毛發(fā)生長藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毒隱翅蟲提取液，其包括乙醇溶劑和毒隱翅蟲毒素，其中毒隱翅蟲毒素的總含量不低于30％。本發(fā)明所述的毒隱翅蟲提取液通過在乙醇中回流提取制備而成，其可應(yīng)用于制備促進糖尿病皮膚潰瘍愈合的藥物、制備抑制HL-60人白血病細胞株生長的藥物、制備抑制BEL-7402人肝癌細胞株生長的藥物及制備促進毛發(fā)生長的藥物。
文檔編號A61K35/64GK101234128SQ20081003439
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者平 萬, 李利珍, 胡佳耀, 趙梅君 申請人:上海師范大學