專利名稱：：針對人c-Jun氨基末端激酶的小RNA分子在老年癡呆癥中的作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的，本發(fā)明涉及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路與Y分泌酶依賴的淀粉樣蛋白(AP)產(chǎn)生的相關(guān)性，以及針對人c-Jun氨基末端激酶的小RNA分子在老年癡呆癥中的作用。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默癥(Alzheimer'sdisease,AD)又叫老年癡呆癥，是目前世界上最嚴(yán)重最普遍的神經(jīng)退行性疾病，目前世界上約有2000萬人患有這種疾病。它的臨床病理特征表現(xiàn)為早期，病人記憶開始衰退，尤其短期記憶能力明顯減弱。中期，病人記憶進(jìn)一步衰退，生活行為混亂，對周圍事物辨別困難。晚期，病人性格嚴(yán)重變異，生活難以自理，最終提前死亡。AD病人腦內(nèi)的病理切片結(jié)果顯示有三個典型的病理特征沉積在細(xì)胞外的老年斑(Senilepl叫ue，SP)，細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangles,NFT)和神經(jīng)元的丟失(Neuronalloss)。其中老年斑中的主要成分是p-淀粉樣蛋白(Amyloid卩-peptide，Af3)，它的產(chǎn)生和積累被認(rèn)為是造成AD的主要原因。在病人年輕時期，A(3蛋白含量很低，和正常人沒有明顯差別。但是隨著病人年齡的增長，腦內(nèi)的AP蛋白的含量開始增加，AP蛋白的含量以指數(shù)形式增加，最后造成災(zāi)難性的后果。但是，到目前為止，對于AD中晚期的淀粉樣蛋白加速產(chǎn)生積累的原因還不是很清楚。A卩蛋白是一個含有39-43氨基酸的肽段，它由其前體蛋白APP經(jīng)過分泌酶水解而來。全長APP蛋白在腦內(nèi)的主要形式是APP695，成熟的APP單次跨膜，屬于I-型跨膜類蛋白，N端含有-個17個氨基酸的信號肽。APP蛋白大部分位于細(xì)胞外，胞內(nèi)部分是很短的APP蛋白C末端。APP被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面后，經(jīng)過兩種不同的代謝方式。根據(jù)最終是否產(chǎn)生Ap,可以分為淀粉樣蛋白途徑和非淀粉樣蛋白途徑。卩分泌酶和a分泌酶分別介導(dǎo)了這兩個過程，所以又叫做卩分泌酶代謝途徑和a分泌酶代謝途徑。上述兩種途徑產(chǎn)生的C99和C83都被Y分泌酶水解。Y分泌酶是一個有四個組分構(gòu)成的復(fù)合物，屬于天冬氨酸酶家族，其中早老素蛋白(Presenilin，PS)是Y分泌酶的酶活中心成員，另外三個成員Nicastrin(Net)，早老蛋白增強(qiáng)因子-2(PEN-2)和Anteriorpharynxdefective1protein(Aph-1)負(fù)責(zé)復(fù)合物的組裝，底物識別。PS1的基因敲除小鼠體內(nèi)A(3的含量明顯降低，y分泌酶活性下降。90%以上的家族性AD病癥都和PS1的突變體有關(guān)，因此，一直以來y分泌酶受到了研究人員的極大興趣。雖然目前對Y分泌酶復(fù)合物的生化特性已有比較清晰的了解，但是對于它活性的調(diào)控還不清楚，尤其是作為占有90%以上的散發(fā)性老年病中的y分泌醇如何受到調(diào)控，將是一個十分有意義的問題p氧自由基(ROS)是體內(nèi)新陳代謝過程中帶來的副反應(yīng)，氧自由基產(chǎn)生和清除在正常體內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控，當(dāng)氧自由基的產(chǎn)生多于清除時，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激(Oxidativestress)。H202，OH-，0—2屬于氧自由基。在AD病人腦中，氧化應(yīng)激修飾的DNA，蛋白，脂類都高于正常病人，尤其在神經(jīng)纖維纏結(jié)，老年斑富集區(qū)域有著比較高的濃度。因此，氧自由基和AD發(fā)病之間有著密切的關(guān)系。一般認(rèn)為，在體外，A(3單體逐漸聚合成可溶性Ap寡聚體的過程中，Cu+/Fe2+的輔助下，能夠產(chǎn)生過氧化氫。l付且，有報道顯小，A(3的神經(jīng)毒性需要通過氧自由基來介導(dǎo)。將神經(jīng)突觸暴露fA卩共培養(yǎng)中，細(xì)胞出現(xiàn)離子濃度失衡，谷胱酰胺釋放受阻等缺陷，這些都受到了氧自由基的介導(dǎo)。因此，經(jīng)典的A(3假說認(rèn)為，由于先天性家族突變或后天環(huán)境影響，使得淀粉樣蛋白逐漸在體內(nèi)沉積，產(chǎn)生的寡集體A卩具有神經(jīng)毒性，'很重要的一條通路就是能夠造成氧化應(yīng)激攻擊線粒體，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平失衡，并激活下游一系列激酶。激酶的活化又引起神經(jīng)纖維蛋白Tau的過量磷酸化，造成后者在細(xì)胞內(nèi)的異常纏結(jié)，對細(xì)胞合成運(yùn)輸，以及其他正常生理功能都帶來嚴(yán)重影響，最后造成細(xì)胞元的死亡和丟失，病人呈現(xiàn)癡呆的癥狀。目前有些證據(jù)表明氧化應(yīng)激并不僅僅是A(3積累的后果，它還可能是A(3產(chǎn)生的原因。有證據(jù)表明，過氧化氫刺激后，能引起神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的A(3產(chǎn)生增加。而且，通過抗氧化劑維生素E服藥后，能顯著減少轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型腦內(nèi)的老年斑數(shù)量和AP量。已有些證據(jù)試圖解釋氧化應(yīng)激如何調(diào)控APP代謝過程來影響A卩生成。比如，在哺乳動物眼睛細(xì)胞內(nèi)，過氧化氫處理后，能引起全長APP蛋白的表達(dá)量上升，從而引起A(3的產(chǎn)生上升。低濃度的過氧化氫刺激后，能夠引起細(xì)胞內(nèi)卩分泌酶的轉(zhuǎn)錄活性，從而增加P分泌酶的蛋白表達(dá)和酶解能力，使得C99的產(chǎn)量上升，AP的量增加，提示了過氧化氫具有將a水解途徑向P水解途徑轉(zhuǎn)換的作用。但是，也有文獻(xiàn)報道，過氧化氫刺激后，細(xì)胞內(nèi)A卩上升的同時，其APP和C99的量都減少，提示APP整個代謝過程加快?？傊?，目前過氧化氫引起A卩上升的原因還不是很清楚，尤其作為限制A卩產(chǎn)生的最后一個關(guān)鍵性步驟的Y分泌酶，它在過氧化氫引起的A(3上升過程中的作用還沒有研究。因此，.研究Y分泌酶在氧化應(yīng)激中是否受調(diào)控，以及怎樣受調(diào)控都是-'個七分重要和有意義的事情。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑的用途，用于制備抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物。本發(fā)明的另一目的在于提供--種用于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的小RNA分子。在本發(fā)明的第-方面，.提供一種c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑的用途，用于制備抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物。在另一優(yōu)選例中，"拮抗劑"包括抑制劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。在另一優(yōu)選例中，所述的淀粉樣蛋白產(chǎn)生是氧化應(yīng)激試劑誘導(dǎo)的；更特別的，所述的氧化應(yīng)激試劑是過氧化氫。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)退行性疾病是阿爾茨海默癥。在另--優(yōu)選例屮，所述的淀粉樣蛋["產(chǎn)生是Y分泌酶依賴的淀粉樣蛋白產(chǎn)生。在另一優(yōu)選例中，所述的c-Jim氨基末端激酶信號通路的拮抗劑是特異性干擾c-Jun氨基末端激酶基因表達(dá)的小RNA分子。在另一優(yōu)選例中，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第1-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的c-Jiin氨基末端激酶信號通路的拮抗劑是SP600125(分子式C14H8N20)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種用于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的小RNA分子，所述的小RNA分f:(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第1-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括(1)用候選物質(zhì)處理具有c-Jun氨基末端激酶信號通路的細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)；和(2)檢測所述細(xì)胞中c-Jim氨基末端激酶信號通路的變化情況；其中，若所述候選物質(zhì)Bn沮斷c-Jun氨基末端激酶信號通路，或抑制c-Jun氨基末端激酶信號通路的激活，則表明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(l)包括在測試組屮，將候選物質(zhì)加入到具有c-Jun氨基末端激酶信號通路的細(xì)胞中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的細(xì)胞中c-Jun氨基末端激酶信號通E各的變化情況，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的具有c-Jun氨基末端激酶信號通路的細(xì)胞；如果測試組中c-Jun氨基末端激酶信號通路或其相關(guān)蛋白的活性在統(tǒng)計學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低50%以上，較佳的低100%以上；更佳的低200%以上)對照組，就表明該候選物是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括在候選物質(zhì)處理之前或處理之后，用氧化應(yīng)激試劑(如過氧化氫)刺激細(xì)胞。較佳的，釆用過氧化氫刺激細(xì)胞，且過氧化氫的濃度高-f100"M，更佳的濃度為0.2mM或高f0.2mM，最佳的濃度為lmM或高于lmM。在另一優(yōu)選例中，進(jìn)一步還包括檢測所述細(xì)胞中Y分泌酶的活性；其中，若所述候選物質(zhì)可抑制Y分泌酶的活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，還包括設(shè)置另一對照組，所述的對照組是添加所述候選物質(zhì)的且不具有c-Jun氨基末端激酶信號通路的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞選自SH-SY5Y細(xì)胞、或HEK293細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗和/或動物試驗，以進(jìn)一步選擇和確定對于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生有用的物質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l.過氧化氫促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外淀粉樣蛋白的生成。A，SH-SY5Y/APP695myc細(xì)胞用含有1.0mM過氧化氫的無血清培液刺激l小時。培液收集后用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測分泌到胞外的淀粉樣蛋白含量。B.刺激后的細(xì)胞用RIPA裂解，經(jīng)過蛋白定量，測定細(xì)胞內(nèi)的淀粉樣蛋白圖2.過氧化氫并不影響APP的合成，也不影響a，(3分泌酶的活性。A.過氧化氫(lmM)刺激細(xì)胞，裂解細(xì)胞，用Westernblot法檢測APP蛋白的表達(dá)情況，抗休為myc抗體(a-myc，購自Covance公司)。其中，mAPP695myc表示成熟的APP，imAPP695myc表示未完全成熟的APP。以p-actin作為上樣量對照。B-D.將刺激后的無血清培液用酒精沉淀，濃縮蛋白后用APP的各種特異性抗體檢測，其中6E10(a-sAPPa或，購自Signetlaboratory)檢測培液中的a分泌酶水解產(chǎn)物(sAPPa)，anti-sAPPp(a-sAPPp,購自IBL)檢測培液中的(3分泌酶水解產(chǎn)物(sAPPp)，22Cll抗體(a-sAPPa+p,購自Chemicon)檢測培液中的a，卩分泌酶水解產(chǎn)物(SAPPa+p)。其中，以麗春紅染色的血清白蛋白條帶作為上樣量對照。E.先初步通過差速離心方法，提取了富含a，p分泌酶的細(xì)胞膜組分，然后加入a，(3分泌酶的特異性熒光底物各2ug，在體外37。C酶解反應(yīng)后，在激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長490nm條件下對分泌酶的活性進(jìn)行了檢測。圖3.過氧化氫促進(jìn)了Y分泌酶介3的APP水解過程。A，SH-SY5Y/APP695myc細(xì)胞用過氧化氫(1mM)刺激后，收集細(xì)胞用Westernblot檢測APP蛋白羧基末端產(chǎn)物的表達(dá)情況(CTFmyc，AICDmyc)。以(3-actin作為上樣量對照，a-p-actin為識別p-actin的抗體。B.過氧化氫促進(jìn)Y分泌酶介導(dǎo)的APP水解過程具有時間依賴性。用過氧化氫(lmM)刺激后，每隔十分鐘收集刺激的細(xì)胞，檢測APP蛋白羧基末端產(chǎn)物的含量。C，細(xì)胞用Y分泌酶的特異性抑制劑DAPT(1"M(+)，10"1^(++))預(yù)先處理3小時，再用過氧化氫(濃度分別是O，0.2和lmM)刺激，以驗證Y分泌酶是否參與其中。圖4.過氧化氫促進(jìn)Y分泌酶介導(dǎo)的SP-C99myc的水解過程。A-B.HEK293T細(xì)胞用pcDNA3.1-SP-C99myc瞬時轉(zhuǎn)染24小時，然后用過氧化氫(lmM)刺激，收集培液和細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)外的淀粉樣蛋白的含量。C.HEK293T細(xì)胞用pcDNA3.1-SP-C99myc瞬時轉(zhuǎn)染24小時，然后用過氧化氫(濃度分別是O，0.2和1mM)刺激后，Westernblot方法檢測SP-C99myc的水解情況。用0，0.2和1.0mM過氧化氫刺激，Westernblot方法檢測細(xì)胞內(nèi)的AICD表達(dá)量。E.用報告基因?qū)嶒灆z測過氧化氫對y分泌酶活性的促進(jìn)作用。細(xì)胞用C99GVP(獲自瑞典諾貝爾醫(yī)學(xué)研究所)，Gal4-luc(購自promega)，PRL-TK質(zhì)粒(購自promega)共同轉(zhuǎn)染24小時后，DAPT(10uM)預(yù)處理3小時，然后過氧化氫(lmM)刺激1小時，細(xì)胞裂解，檢測熒光素酶報告基閃活性。圖5.過氧化氫通過JNK信號通路促進(jìn)y分泌酶水解活性。A.SH-SY5Y細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗檢測細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化情況(一抗為抗p-JNK抗體(a-p-JNK)，購自CellSignaling;二抗為山羊抗兔IgG-Cy3，購自JacksonImmunoResearchLaboratories)。B-C.SH-SY5Y細(xì)胞分別用JNK信號抑制齊lJSP600125(濃度20uM)預(yù)處理3小時，然后檢測其對過氧化氫(濃度分別是0，0.2和1mM)引起的y分泌酶活化的抑制作用。D.設(shè)計針對JNK的特異性siRNA，將siRNA和APP695myc瞬時共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。再用過氧化氫(lmM)刺激，.檢測JNK信號通路對y分泌酶的活性影響。其中，a-JNK為抗JNK抗體，購自PharMingen公司。E和F.將對應(yīng)于APP蛋白序列第668位的JNK磷酸化位點(diǎn)的突變(由T突變?yōu)锳)，建立APP695mt(APP(T688A)),C99mt(C99(T688A))，用westernblot方法檢測過氧化氫(濃度1mM)刺激對其代謝的變化。圖6.JNK信^通路特異性介^r過諷化^引起的y分泌酶的水解活性。將SH-SY5Y細(xì)胞血清饑餓12小時，然后用U0126(5^M，購自Calbiochem)(A)，Wortmannin(20nM，購自Calbiochem)(B)，SP600125(20岸，購自Calbiochem)(C)分別刺激3小時。然后收集細(xì)胞，用Westernblot方法檢測ERK,PKB，JNK信號通路本身是否激活，以及對過氧化氫引起y分泌酶活化的影響。其中，a-p-ERK為抗磷酸化ERK的抗體(購自CellSignaling),a-ERK為抗ERK的抗體(購自SantaCruz);a-p-PKB為抗磷酸化PKB的抗體(購自SantaCruz)，a-PKB為抗PKB的抗體(購自SantaCruz)。圖7.體內(nèi)JNK信號通路在老年癡呆癥老年斑周圍激活。A.Westernblot方法檢測病人大腦組織(n-4)和對照大腦組織(n二4)中的JNK活化情況。B.組織免疫熒光實(shí)驗檢測轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576大腦內(nèi)的JNK激活狀況。冰9C.AD病理發(fā)生機(jī)制的示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，首次發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激試劑(如過氧化氫)可通過激活c-Jim氨基術(shù)端激酶(JNK)信號通路促進(jìn)y分泌酶的激活，從而導(dǎo)致淀粉樣蛋白(AP)的產(chǎn)生。因此，可基于該發(fā)現(xiàn)開發(fā)出新的針對神經(jīng)退行性疾病的藥物耙點(diǎn)。本發(fā)明人還幵發(fā)了可抑制JNK信號通路的制劑，其可有效降低細(xì)胞內(nèi)源性JNK蛋白的表達(dá)，有效抑制AP或y分泌酶活性的增加。JNK信號通路拮抗劑及其用途本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，H202促進(jìn)了Y分泌酶水解活性，從而加速了APP，C99(C-末端99片段)的代謝過程。但是全長APP蛋白的表達(dá)，以及a和p分泌酶的活性卻沒有顯著變化。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，JNK信號通路在過氧化氫刺激的細(xì)胞中被激活，然后通過激活Y分泌酶來促進(jìn)AI3的產(chǎn)生。利用抑制劑阻斷JNK信號通路，或利用合適的針對JNK的siRNA下調(diào)JNK表達(dá)，能夠有效的抑制11202對丫分泌酶水解活性的促進(jìn)。并且發(fā)現(xiàn)，磷酸化的JNK蛋白在阿爾茨海默癥(AD)病人的腦組織中明顯高于正常人，也即JNK蛋白在AD病人體內(nèi)被激活，而且激活的JNK定位在老年斑周圍。因此，氧化應(yīng)激活化的JNK通路通過激活Y分泌酶，從而促進(jìn)了A(3的產(chǎn)生和老年斑的擴(kuò)展。因此，基-f本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了JNK信^通路(或該通路相關(guān)蛋白，如JNK蛋t'l)的用途，川f篩選抑制A(3產(chǎn)化:的潛在物質(zhì)。也即，篩選通過抑制JNK信號通路，進(jìn)而抑制y分泌酶活性，從而抑制Af3產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了JNK信號通路的拮抗劑的用途，用于制備抑制AP產(chǎn)生的組合物。特別是可用于由抑制氧化應(yīng)激試劑(如過氧化氫)誘導(dǎo)的AP的產(chǎn)生。AP的產(chǎn)生是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵因素，因此所述的JNK信號通路的拮抗劑可用午預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病(例如AD)。如本文所用，所述的拮抗劑包括了抑制劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可抑制或阻斷JNK信號通路(或該通路相關(guān)蛋白，如JNK蛋白)的活性，降低JNK信號通路相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性，抑制JNK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，或抑制JNK信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的有效物質(zhì)。10作為本發(fā)明的一種方式，所述的JNK信號通路的拮抗劑例如是SP600125(分子式Cl4H8N20)?；蛘?，所述的拮抗劑是一種特異性結(jié)合JNK信號通路相關(guān)蛋白的抗體。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的拮抗劑是一種JNK特異性的小干擾RNA分子(siRNA)。如本文所用，"小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以問源互補(bǔ)序列的mRNA為靶kl標(biāo)降解特定的mRNA，這個過程就是RNA千擾(RNAinterference)過程。本發(fā)明的小干擾RNA分子nj特異性的f-擾JNK基因的表達(dá)，與其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性；并且經(jīng)驗證，其具有良好的干擾JNK表達(dá)的效果。所述的小RNA分f:(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。其中，(a)和(b)的小RNA分子可有效千擾JNK1的表達(dá)；(c)和(d)的小RNA分子可有效干擾JNK1或JNK2的表達(dá)(也即小RNA分子的序列對應(yīng)于JNK1或JNK2中同源序列部分)。本發(fā)明對siRNA的制備方法沒有特別的限制，.包括但不限于化學(xué)合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本發(fā)明所提供的siRNA的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達(dá)所述的siRNA。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，所述的siRNA是化學(xué)合成的。siRNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。-個雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。W此，舉例來講，h:補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)牛合成的雙鏈RNA復(fù)合物。所述的siRNA可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域己知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。此外，siRNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個或多個編碼正義鏈和反義鏈的表達(dá)盒來制備。當(dāng)正義鏈和反義鏈由一個單獨(dú)的表達(dá)盒編碼時，它們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈siRNA。篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)的方法在得知了所述的氧化應(yīng)激試劑可激活JNK信號通路，進(jìn)而促進(jìn)Y分泌酶活性，導(dǎo)致AJ3的產(chǎn)，i這一機(jī)制后，可以基于該機(jī)制篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)?？蓮乃龅臐撛谖镔|(zhì)中找到對f預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病有用的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括用候選物質(zhì)處理具有JNK信號通路的細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)；和檢測所述細(xì)胞中JNK信號通路的變化情況；若所述候選物質(zhì)可阻斷JNK信號通路，或抑制JNK信號通路的激活，則表明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時，為了更易于觀察到JNK信號通路的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的具有JNK信號通路的體系。更佳地，還包括設(shè)置另一對照組，該對照組是添加所述候選物質(zhì)的且不具有JNK信號通路的細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，還包括在候選物質(zhì)處理之前或處理之后，用氧化應(yīng)激試劑(如過氧化氫)刺激細(xì)胞。單純使用所述的氧化應(yīng)激試劑可激活JNK信號通路，如用候選物質(zhì)處理的細(xì)胞中JNK信號通路的激活情況低于對照組，或JNK信號通路被抑制，則說明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，進(jìn)一步還包括檢測所述細(xì)胞中Y分泌酶的活性；其中，若所述候選物質(zhì)可抑制Y分泌酶的活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。對于所用的細(xì)胞沒有特別的限制，只要其中具有JNK信號通路；較佳地還具有Y分泌酶；更佳地其在受到氧化應(yīng)激試劑刺激后，可發(fā)生"JNK信號通路-Y分泌酶-Ae產(chǎn)生"這一機(jī)制。通常，所述的細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞選自SH-SY5Y細(xì)胞、或HEK293細(xì)胞。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗和/或動物試驗，以進(jìn)一步選擇和確定對了-抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生有用的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)叨還提供r釆用所述篩選方法獲得的抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。-這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谝种频矸蹣拥鞍桩a(chǎn)生和/或預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病有用的物質(zhì)。組合物本發(fā)明還提供了--種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt。/。)的所述的JNK信號通路的拮抗劑，以及藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體。作為本發(fā)明的-種優(yōu)選方式，提供了-種fflf抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明所述的小RNA分子(如0.000001-50wt%)，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)t:可接受的載體是在本質(zhì)上對于人和/或動物無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)，并在本質(zhì)上與所述的小RNA分子、任何所用到的靶向元件以及其它成分無作用。所述"有效量"是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。本發(fā)明所述的小分子RNA的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的小分子RNA的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的重組腺病毒制劑每天以約0.0000lmg-50mg/kg動物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。在得知了所述JNK信號通路的拮抗劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的JNK信號通路的拮抗劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限f:皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。優(yōu)選的，可釆用基I大1治療的P段進(jìn)行。比如，R/點(diǎn)接將JNK信號通路的拮抗劑通過諸如注射等方法給藥f受試者；或者，可通過-定的途徑將攜帶JNK信號通路的拮抗劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或siRNA)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性JNK信號通路的拮抗劑，具體情況需視所述的拮抗劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于-(1)首次發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激試劑可通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路促進(jìn)y分泌酶的激活，從而導(dǎo)致淀粉樣蛋白(ap)的產(chǎn)生。因此，可基于該發(fā)現(xiàn)開發(fā)出新的針對神經(jīng)退行性疾病的藥物靶點(diǎn)。(2)找到一種"丁有效地抑制jnk信號通路的小rna分子，其可有效降低細(xì)胞內(nèi)源性jnk^ri的^達(dá)，碰抑制ae或產(chǎn)卞ae所必需的y分泌酶活性的增加。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一-步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。1.質(zhì)粒的構(gòu)建pcDNA3.1-APP695myc表達(dá)載體構(gòu)建以APP695cDNA(GenBank登錄號A33292)為模板，使用正向引物(5-TTTTCTAGAGATGCTGCCCGGTTTG-3(SEQIDNO:4)和反向引物(5-GAGTCTAGACTAGTTCTGCATCTGC-3(SEQIDNO:5))進(jìn)行PCR擴(kuò)增(F劃線為XbaI的位點(diǎn))。純化PCR擴(kuò)增片段，使用XbaI酶切后插入經(jīng)過同樣酶切的載體myc-pcDNA3.1(購自Invitrogen)，獲得pcDNA3.1-APP695myc表達(dá)載體。pcDNA3.1-SP-C99myc表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建從pcDNA3.l-APP695myc載體，切出帶有myctag的APP蛋白的C末端片段(C99myc)，構(gòu)建成為pcDNA3.1-C99myc。另外，帶有APP695信號肽序列的SP-C99參見THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,Vol.278,No.9，IssueofFebruary28:pp.68036808,2003，TheTransmembraneDomainoftheAmyloidPrecursorProteininMicrosomalMembranesIsonBothSidesShorterthanPredicted,通過兩端的HindIII和EcoRI位點(diǎn)，插入到pcDNA3.1-C99myc的對應(yīng)位點(diǎn)，連接成帶有信號肽的pcDNA3.1-SP-C99myc。IRES2-EGFP-AICD50myc，IRES2-EGFP-AICD57myc，IRES2-EGFP-AICD59myc質(zhì)粒的構(gòu)建以全長pcDNA3.1-APP695myc質(zhì)粒為模板，分別以正向引物5GAGAAGATCTATGATAGCGACAGTGATCGTC3'(SEQIDNO:6)，5-GAGAAGATCTATGACAGTGGATCGTCATTCACC-3(SEQIDNO:7)，5-GAGAAGATCTATGGTGATGCTGAAGGAAGAAAC-3(SEQIDNO:8)，禾口反向引物5GAATAGGGCCCTCTAGATGCATG3'(SEQIDNO:9)為引物，PCR克隆出AICD50myc,ACID57myc，AICD59myc片段，其中5端引入ATG啟動子，兩端引入BglII和BamHI位點(diǎn)，此片段插插入到IRES2-EGFP表達(dá)質(zhì)粒(獲自Invitrogen)對應(yīng)位點(diǎn)，連接成為相應(yīng)的IRES2-EGFP-AICDmyc質(zhì)粒。用于Y分泌酶熒光素報告基因?qū)嶒灥馁|(zhì)粒C99GVP購自瑞典諾貝爾醫(yī)學(xué)研究所，Gal4-luc，PRL-TK購HPromega公口」。2.定點(diǎn)突變pcDNA3.1-APP695myc和pcDNA3.1-SP-C99myc的定點(diǎn)突變通過PCR策略達(dá)到目的，正向引物是(5-TTGACGCCGCTGTCGCCCCAGAGGAGCGCCACCT-3(SEQIDNO:IO))和反向引物(5-GCTCCTCTGGGGCGACAGCGGCGTCAACCTC-3(SEQIDNO:11));PCR體系為模板0.5y1(50ng);20yM引物(5/3):0.5iU;2.0mMdNTP:l.Oul;T叫緩沖液l.Oul;Mg2+:0.4KOD-plusT叫聚合酶0.2ul;H20:6.4ul。PCR條件為95°C,3min;94°C,45s;60°C，30s;68°C，8min;68°C，10min;30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用Dpnl消化，37'C酶解反應(yīng)30min，降解來自模板的甲基化DNA。體系為PCR產(chǎn)物18.0Jil;NEB緩沖液1.0iM;Dpnl:l.Oul;37。C進(jìn)行l(wèi)h。取liM經(jīng)酶解的PCR產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)菌中。涂板，抗生素篩選后，酶切鑒定E確后，測序最后確定。獲得含冇的APP編碼基因中第2004位由ACC突變?yōu)镚CC(對應(yīng)卩APP695蛋白序列第668位由蘇氨酸突變?yōu)楸彼?的表達(dá)載體。3.細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞用磷酸鈣方法瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天，將HEK293T細(xì)胞按密度為2.0乂105細(xì)胞接種到12孔板中培養(yǎng)，次日達(dá)50%密度。轉(zhuǎn)染前4h，換為新鮮的10%FBS/DMEM/F12培液。分別配制溶液A:21pl2MCaCl2，1-2嗎大抽質(zhì)粒，142Wd2H20;溶液B:167^12XHEPEs(調(diào)pH為7.05)。輕輕混勻溶液A和溶液B，l-3min內(nèi)加入到細(xì)胞中。在顯微鏡下觀察形成的沉淀，一般情況下，沉淀呈現(xiàn)均勻太小的細(xì)沙狀，逐漸下沉到細(xì)胞表面被攝入。如果形成的CaP04沉淀過大，則需要重新制備液A和溶液B的混合物。HEPEs的pH,大抽的質(zhì)粒純度，A，B液混和的均勻程度對CaP04沉淀均有影響。37'C培養(yǎng)6-9h后，吸去轉(zhuǎn)染培液4.SH-SY5Y/APP695myc穩(wěn)定細(xì)胞株的建立SH-SY5Y細(xì)胞(獲自北京大學(xué)第六醫(yī)學(xué)院)，用Fugene6試劑轉(zhuǎn)染入pcDNA3-APP695myc載體。生長至70-80°/。滿時，進(jìn)行傳代操作，將細(xì)胞稀釋，均分至4個60mm培養(yǎng)皿中。(1)12h后，在培液中添加G418,使終濃度在500嗎/ml。添加選擇壓力后，細(xì)胞開始死亡。視細(xì)胞死t的程度，隔天換液。(2)2-3周后，基本再無死亡的細(xì)胞。此時進(jìn)行傳代操作，細(xì)胞計數(shù)后，按比例稀釋細(xì)胞至10cm培養(yǎng)皿中共200個細(xì)胞；此時細(xì)胞培液中的G418改為200"g/ml。剩余的細(xì)胞懸液則凍存，保存—f-液氮中。此時，可檢測轉(zhuǎn)染效率，或者進(jìn)行功能初步檢測。'(3)培養(yǎng)1周后，在顯微鏡下觀察，此時單個細(xì)胞己長成較大的單克隆，選擇形態(tài)較好，且均為單克隆的細(xì)胞，在培養(yǎng)皿的底部標(biāo)記。(4)小心將滅過菌的克隆環(huán)粘附無菌硅膠后，粘在標(biāo)記好的細(xì)胞克隆上，使細(xì)胞位于克隆環(huán)的正中。往克隆環(huán)中加入20tU胰酶，進(jìn)行細(xì)胞傳代操作，將細(xì)胞懸液盡數(shù)轉(zhuǎn)移至24孔板中，分別編號。(5)每天觀察細(xì)胞，待24孔板中的細(xì)胞長至70-80%滿時，將其傳代，轉(zhuǎn)移至6孔板中。(6)待6孔板中的細(xì)胞長至70-80%滿時，將其分別轉(zhuǎn)移至60mm培養(yǎng)皿中。(7)待60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞長至70-80%滿時，可將細(xì)胞凍存，抽RNA或蛋白，進(jìn)行下一步的鑒定。(8)對穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞在含G418抗性壓力的培液中持續(xù)培養(yǎng)。5.RNA干擾(1)siRNA目標(biāo)序列分別為siJNKl(5UCACAGUCCUGAAACGAUAtt3(SEQIDNO:l)):針對/"WmRNA(距離起始密碼子第59個核苷酸)；siJNK1/2(5AAAGAAUGUCCUACCUUCUtt3(SEQIDNO:2)):針對/"W，/"/t2mRNA(距離起始密碼子第377個核苷酸)；陰性對照siCtrl(5-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3(SEQIDNO:3))針對熒光素酶序列。siRNA采用化學(xué)合成法合成，3末端進(jìn)行了堿基修飾。'(2)配制20MMsiRNA儲液，往5nmolsiRNA中加入250"1常規(guī)溶解緩沖液，輕輕混勻后，在95i:水浴中變性2min，繼續(xù)放在水浴中自然冷卻至室溫，此過程在45min以上，以保證充分的退火配對，4'C放置過夜后待用。(3)用Lipfectine2000轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，將siRNA禾口pcDNA3.1-APP695myc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，其中pcDNA3.1-APPmyc為1.5Pg,siRNA為20lU。4872h后，檢測siRNA的抑制效率和作用結(jié)果。6.細(xì)胞免疫熒光染色將細(xì)胞固定于蓋玻片上，有細(xì)胞面朝上。在含0.5%羊血清，P/。BSA的PBS中室溫封閉1h。一抗室溫作用lh或4'C過夜，PBS洗3次，每次10min。二抗室溫1h，PBS洗3次，每次10min。DAPI染色，室溫3min，PBS洗3次，每次5min。用石蠟封片劑封片，在室溫避光晾干，熒光鏡下觀察。7.組織切片的免疫染色(1)組織灌流固定用戊巴比妥鈉(濃度4%，劑量40mg/kg)麻醉動物，70%乙醇消毒胸部，剖開胸部暴露心臟。用止血鉗夾住F腔靜脈，剪開右心房。從下部剪開左心室，沿左心室后壁插入針頭至主動脈弓，用止血鉗同時夾住針頭與心臟，以固定針頭。灌流200ml37'C預(yù)溫的0.9%生理鹽水，之后緩慢灌流100ml4%PFA(溶于0.1MPBS緩沖液，pH7.4)，約需30分鐘。剝離腦組織，在4%PFA中固定8小時。組織放入20%蔗糖中至沉底，換于30%蔗糖4'C保存。(2)固定組織的冰凍切片將蔗糖平衡后的組織放置于冰切專用模具中，加入OCT進(jìn)行包埋。將包埋好的組織塊固定于冰切機(jī)的切片頭上進(jìn)行切片，厚度一般為12-15pm。切好的切片在室溫放置l-2h晾干，-20'C或-8(TC保存。(3)組織切片固定穿孔從冰箱中取出切片，在室溫放置10-20min，使切片上的冷凝水晾干。在1XPBS中浸泡10min,使OCT溶解在1XPBS中。在預(yù)冷的4%PFA中4。C固定15min，0.3%TritonX-100穿孔20min。用70%甲酸小心處理腦片15min，暴露轉(zhuǎn)基W小鼠老年斑抗原，PBS洗去殘余甲酸。(4)免疫染色H/細(xì)胞免疫熒光染色基本相同。8.Western-blot(l)細(xì)胞蛋白裂解及樣品處理.-將35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞用lxPBS洗一遍，加入合適體積的蛋白裂解液，其中裂解液含有:.150mMNaCl，10mMEDTA，1%TritonX-100，0.25mMPMSF，0.1%SDS,l%Na-deoxycholate，20mMNaF，lmMPMSF，完全蛋白酶抑制劑(購自Roche)?；靹蚝螅?'C放置20min，使細(xì)胞完全從培養(yǎng)皿表面脫落并完全裂解。將裂解液4i:，12,000rpm離心15min。蛋白用Bradford方法進(jìn)行蛋[::l定量后，取100ul上清，加入100ul含1.3。/。醋酸鉀的80%乙醇和800u1無水乙醇，混勻后4°C，12,000rpm離心15min。棄上清，加入500^的75%乙醇洗鹽，離心后棄去上清，將沉淀晾干。加入適量的蛋白上樣緩沖液(2x上樣緩沖液0.125MpH6.8Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，10%(3-巰基乙醇，0.2%溴酚藍(lán))，煮沸10min后離心備用。細(xì)胞離心后可以直接加入迠量lx上樣緩沖液(按照1X1()S細(xì)胞加入00nllx上樣緩沖液)裂解細(xì)胞，煮沸后上樣。(2)細(xì)胞培液中的分泌型蛋白處理取條件性培養(yǎng)液，進(jìn)行乙醇沉淀，沉淀后用上樣緩沖液煮沸上樣。(3)組織樣品裂解及樣品處理取約50mg的組織，加入合適體積的組織裂解液，其中裂解液含有20mMED丁A(溶于0.1NNaOH)，10mMEGTA(溶于0.1NNaOH)'lmMPMSF(溶于無水EtOH)，2M尿素(溶fPBS),lmMDTT，完全蛋G酶抑制劑(購自Roche)，.勻漿器勻漿30次，4'C裂解20min，離心取上清進(jìn)行蛋白檢測。'2)制膠及電泳按照檢測目的蛋白的大小，先后配制合適濃度的下層膠(分離膠)及上層膠(濃縮膠)。上樣后，上層膠以10mA/Gel，下層膠以20mA/Gel的電流在室溫進(jìn)行垂直電泳，直至上樣緩沖液跑出膠的前沿[50mllOX電泳液(Tris30g，Glycine144g)'5ml10。/。SDS，d2H20補(bǔ)到500ml]。3)轉(zhuǎn)膜裁取7X9cm的3M濾紙4張，6X8cm的PVDF膜1張。將PVDF膜預(yù)先在無水乙醇中浸潤lmin，再在轉(zhuǎn)膜液中平衡5min[100ml10X轉(zhuǎn)膜液(丁ris30-g,Glycine144g)，200ml無水乙醇，&&0補(bǔ)到lOOOml]。取出SDS-PAGE膠，(121120沖洗后浸在轉(zhuǎn)膜液中，平衡5min。在轉(zhuǎn)膜液中，制備一個轉(zhuǎn)膜三明治(從上到下依次為濾紙、膠、膜、濾紙)，注意各層之間不要有氣泡，可以用空50ml離心管朝同一方向滾壓。將轉(zhuǎn)膜-:明治放入轉(zhuǎn)膜容器屮，注意膠朝負(fù)極，膜朝正極，4°C，50V轉(zhuǎn)膜3h。轉(zhuǎn)膜后，用麗存紅溶液對PVDF染色，檢測轉(zhuǎn)膜效率，剪取合適大小的含有H的蛋白的PVDF膜，用水洗去紅色染料。4)免疫反應(yīng)5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加入一抗，室溫反應(yīng)3h或4'C過夜，回收一抗，4。C保存。含有0.1%Tween20的"PBS洗膜3次，每次10min。加入二抗室溫反應(yīng)lh，洗膜。顯色。9.細(xì)胞熒光素酶活性測定1)在24孔板中接種2-4x104細(xì)胞/孔于0.5ml含10%FBS的DMEM/F12，在37。C、5%(302的培箱中培養(yǎng)，次日細(xì)胞達(dá)50-80%的覆蓋率即可用于轉(zhuǎn)染。2)制備溶液A和B:溶液A:每個樣品取0.5(agDNA(含C99GVP,Gal4-TK);0.1ng內(nèi)標(biāo)DNApRL-tk(Promega)，含iem〃a熒光素酶報告基因)，用DMEM/F12補(bǔ)足體積至25pl。若共轉(zhuǎn)其它質(zhì)粒，一起加入溶液A。溶液B:每個樣品取1.25piFugene6轉(zhuǎn)染試劑加至23.75(ilDMEM/F12中。輕輕混和溶液A、B，室溫放置30分鐘以上。3)用1mlDMEM/F12將每孔漂洗兩次后，每孔加入200(alDMEM/F12。4)將A、B混和液加到各樣品孔中，輕輕混勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱。5小時后每孔中加入含20%FBS的DMEM/FI2250pi,37"C培養(yǎng)過夜。'5)次日用500^含10%FBS的DMEM/F12更換培液。繼續(xù)37。C培養(yǎng)，過夜后測定熒光素酶活性。6)吸去細(xì)胞培液，輕輕加入lmlPBS溶液漂洗；吸盡PBS，加入細(xì)胞裂解液lxPLB100pl/L，室溫輕晃30分鐘。7)樣品測定管中加入10nl細(xì)胞裂解液及17Wfirefly熒光素酶底物L(fēng)ARII(獲自Promega)，混勻后測定firefly熒光素酶活性；再加入/^w7/a熒光素酶底物Stop&Glo(獲自Promega)17(al測定W，.〃a熒光素酶活性(Stop&Glo液兼可滅活firefly熒光素酶活性)。8)讀取flrefly、^m7/"熒光素酶活性數(shù)值以及兩者的比值。10.ELISA實(shí)驗為了檢測細(xì)胞內(nèi)外的AP40和AP42含量，12孔板中的SH-SY/APP695myc細(xì)胞或瞬轉(zhuǎn)pcDNA3.1-SP-C99myc的HEK293T細(xì)胞長到90%接觸狀態(tài)，用含有過氧化氫的無血清培液(300nl)處理1小時，收集培液待分析。細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA溶液裂解。RIPA含有50mMTris-HCl(pH8.0)，150mMNaCl，5mMEDTA，l%NP-40，0.25mMPMSF和完全蛋白酶抑制劑(Roche)。裂解液經(jīng)過勻漿，13,000g，4X:離心30分鐘，取上清。經(jīng)過Bradford蛋白定量后，取相同蛋白量待做ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)的A曰。所有試劑室溫放置30min，使用前輕勻。標(biāo)準(zhǔn)空白孔，標(biāo)準(zhǔn)Ae蛋白樣品孔，樣品空白孔，樣品孔各100ul，4。C過夜；7.8pg/ml500pg/ml。預(yù)哺育抗人A3(獲自Biosource)3540的96孔板中。用洗滌緩沖液洗7次，每次30s,吸水紙快速扣干。加入帶有HRP的標(biāo)'ki第".抗體(獲自Biosource)各100ul到各孔，室溫反應(yīng)lh;用洗滌緩沖液洗9次，毎次30s，吸水紙快速扣干；加100tUTMB緩沖液到各孔中，室溫避光放置30mins,顏色將由無色變?yōu)樗{(lán)色；加100ul終止緩沖液到各孔，輕打板側(cè)混勻，顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)黃色；在450nm下測值，30min內(nèi)完成。實(shí)施例1.過氧化氫誘導(dǎo)A卩表達(dá)過氧化氫是體內(nèi)存在的一種氧自由基，它具有自由通透細(xì)胞膜的特點(diǎn)，因此一直被用來模擬體外的氧化應(yīng)激實(shí)驗。己經(jīng)有文獻(xiàn)報道過氧化氫能夠誘導(dǎo)A(3產(chǎn)量上升，但是其機(jī)制還不是很清楚。本發(fā)明人利用高濃度的過氧化氫來模擬病人體內(nèi)的病理狀態(tài)，以研究病理狀態(tài)下的氧化應(yīng)激和淀粉樣蛋白之間的關(guān)系。利用過氧化氫刺激APPmyc穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用A(3酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒(購f:1Biosource)檢測A|340和A卩42的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過氧化氫刺激后，確實(shí)能夠引起AP的表達(dá)上升(圖1A)。由于A(340和AP42在細(xì)胞培液中的上升，可能是由于細(xì)胞內(nèi)A(3的分泌效率增加造成，因此，本發(fā)明人又收集過氧化氫刺激的SH-SY5Y細(xì)胞，檢測了細(xì)胞內(nèi)的A(3含量。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，同樣，細(xì)胞內(nèi)的A(3含量也有顯著上升(圖1B)。因此可見，過氧化氫刺激能夠引起APP-SY5Y細(xì)胞株內(nèi)的A(3含量上升。實(shí)施例2.過氧化氫并不能引起APP表達(dá)變化和a，p分泌酶活性改變因此需要研究導(dǎo)致過氧化氫促進(jìn)AP的上升的原因。AP由其前體蛋白APP蛋白經(jīng)過水解而來，因此，這個代謝過程中任何環(huán)節(jié)的調(diào)控失衡，都有可能最終造成AP的不正常沉積。本發(fā)明人首先檢測了全長蛋白APP蛋白的表達(dá)情況。Westernblot結(jié)果顯示，過氧化氫刺激前后，APP本身的代謝沒有明顯變化(圖2A)。包括成熟的APP(N-和0-糖基化APP)和未成熟的APP(N-糖基化APP)，因此提示，過氧化麵Uf沒有通過影響APP合成，翻譯后加L:途徑來影響AP的生成。其次，a分泌酶和e分泌酶能夠影響CTF(Ae前體蛋白)的生成，從而最終卩經(jīng)常被作為衡量a，卩分泌酶水解的指標(biāo)。本發(fā)明人收集了過氧化氫刺激前后的條件性培液，檢測了其中sAPP的含量。22C11能夠識別全長APP的N端，因此能夠識別培液中的sAPP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過氧化氫刺激前后，sAPP總量就沒有明顯變化(圖2B)。本發(fā)明人乂利用6E10，它能夠識別培液屮的sAPPa，以及抗sAPP(3，特異性識別sAPPp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激甜/^，sAPPa和sAPPpL^都沒有明顯的改變(圖2C和圖2D)。為了更加確定結(jié)果，又采用了分泌酶熒光素底物的方法，體外檢測a，卩分泌酶的活性。本發(fā)明人先初步收集了富含分泌酶的細(xì)胞膜組分，經(jīng)過體外37r酶活反應(yīng)兩小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論刺激前后，a，P分泌酶活性也沒有明顯的變化(圖2E)。因此可知，APP表達(dá)、分泌酶活性的改變并不是導(dǎo)致過氧化氫引起A卩生成增加的原因。實(shí)施例3.過氧化氫激活Y分泌酶水解途徑A卩由其前體蛋白APP經(jīng)過(3，y分泌酶依次分步水解而來，因此，對APP代謝的調(diào)控對AI3的最后含量有明顯的影響。鑒了-前面過氧化氫引起了A(3上升，本發(fā)明人檢測了APP的代謝情況，觀察Y分泌酶水解途徑是否受到影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常情況下，APP能夠被水解成C83和-.小部分C99,C末端再次給水解成AICD(APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)片段。當(dāng)過氧化氫刺激后，能夠引起C83，C99的產(chǎn)量減少，同時伴隨著AICD產(chǎn)量的明顯上調(diào)(圖3A)。本發(fā)明人收集了不同刺激時間的細(xì)胞，對細(xì)胞代謝進(jìn)行Time-Course實(shí)驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著刺激時間的增加，CTF逐漸代謝成為AICD的比例上升，并且在刺激后半小時開始有明顯的轉(zhuǎn)變。有趣的是，全長APP蛋白(成熟APP和非成熟APP)含量沒有明顯的改變(圖3B)。說明過氧化氫引起的Ap上升，并不是由于APP的量改變造成的，而確實(shí)是由于APP代謝過程發(fā)生了改變。由于AICD，CTF分別是Y分泌酶的產(chǎn)物和底物，本發(fā)明人定義AICD/(AICD+CTF)作為Y分泌酶水解效率的指標(biāo)。對幾次不同實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，發(fā)現(xiàn)過氧化氫刺激后，確實(shí)能夠AICD/(AICD+CTF)的比值明顯上升，提示過氧化氫顯著的促進(jìn)了Y分泌酶水解效率。為了確汄Y分泌酶是否確實(shí)參4了i:t:中的過程，本發(fā)明人應(yīng)用Y分泌酶特異性的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后WW過氣化S刺激，發(fā)現(xiàn)過氧化氫引起的AICD上調(diào)被抑制。在高濃度DAPT(10uM，Y分泌酶抑制劑)的刺激下，AICD完全被抑制，說明過氧化氫確實(shí)通過激活Y分泌酶水解途徑，促進(jìn)A卩的上升(圖3C)。實(shí)施例4.過氧化氫直接促進(jìn)了c99的代謝C99是A卩的直接前體，因此它的含量和A卩的最終產(chǎn)量密切相關(guān)。為了確定AP的上升由fY分泌酶的水解能力上升引起，木發(fā)明人首先構(gòu)建了帶有信號肽的C99，利用它表達(dá)后順利上膜，來代替全長APP來研究AP的代謝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過氧化氫刺激后，細(xì)胞外的AP含量顯著上調(diào)(圖4A)。同樣，本發(fā)明人對細(xì)胞內(nèi)的AP含量也進(jìn)行ELISA檢測，也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的A(3含量也有明顯上升(圖4B)。C99經(jīng)過y分泌酶分泌酶水解，代謝產(chǎn)物除了Af3外，還有一個產(chǎn)物就是AICD。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，隨著過氧化氫的不同濃度刺激，AICD的產(chǎn)量也相應(yīng)的明顯上調(diào)(圖4C)。由于AICD的產(chǎn)量上升也有可能是過氧化氫引起AICD降解減少造成，因此本發(fā)明人構(gòu)建了AICDmyc質(zhì)粒，瞬時表達(dá)24小時，檢測過氧化氫對其產(chǎn)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AICD在過氧化氫刺激前后并沒有明顯的增加(圖4D)。而且，DAPT預(yù)處理細(xì)胞后，抑制了Y分泌酶活性，從而阻斷了新的AICD的產(chǎn)生。殘留的AICD并沒有因為過氧化氫的刺激而在細(xì)胞內(nèi)累積。上述實(shí)驗都很好的說明了AICD的增加，是由于過氧化氫確實(shí)促進(jìn)了Y分泌酶水解途徑造成的。Y分泌酶熒光素報告基因?qū)嶒炇且粋€被廣泛用來衡量內(nèi)源性Y分泌酶活性的手段，在C99cDNA內(nèi)部Y分泌酶水解位點(diǎn)處，插入了Gal4禾nVP16的融合蛋白表達(dá)序列。在正常情況下，C99-GalGVP融合蛋白橫跨細(xì)胞膜，因此和只有本底表達(dá)的熒光素酶報告基因一起表達(dá)后，熒光素值非常小。但是如果經(jīng)過Y分泌酶水解后，產(chǎn)生了Ap和游離的GVP-AICD的片段，后者通過核定位序列，入核調(diào)控報告基因表達(dá)。因此，報告基因的熒光值能夠在一定程度上定量Y分泌酶的水解活性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅僅轉(zhuǎn)染Luc質(zhì)粒，熒光值非常低，而同時轉(zhuǎn)染了C99-GVP的質(zhì)粒后，熒光素值有明顯的上調(diào)。說明這個系統(tǒng)能夠正確工作。在加入過氧化氫刺激后，熒光素值又上升了2.5倍，本發(fā)明人加入DAPT預(yù)處理后，這個熒光值又被明顯的抑制到本底水平，說明y分泌酶水解確實(shí)在過氧化氫刺激過程中激活(圖4E)。實(shí)施例5.jnk信號通路通過激活y分泌酶介導(dǎo)過氧化氫引起的ap增加接下來需要研究細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致了Y分泌酶在過氧化氫刺激過程中被激活的機(jī)制。本發(fā)明人首先檢測了JNK信號通路在過氧化氫刺激后是否被激活。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，磷酸化的JNK在刺激后呈現(xiàn)染色陽性，而且分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。而在未刺激對照組中，并不能檢測同樣的JNK磷酸化陽性細(xì)胞(圖5A)。本發(fā)明人又用Westernblot證實(shí)了過氧化氫確實(shí)能夠引起JNK家族的P46，P54這兩個蛋白的磷酸化水平的上升。預(yù)先在細(xì)胞培液中加入JNK信號通路特異性抑制劑SP600125(20yM)(購自Calbiochem)3h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種JNK的磷酸化水平被明顯抑制。JNK信號通路確實(shí)在過氧化氫中被激活，之后研究它的激活與Y分泌酶活化的關(guān)系。本發(fā)明人將SP600125(20uM)預(yù)處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)y分泌酶水解途徑被明顯抑制，而在DMSO對照組中，過氧化氫依然能夠激活Y分泌酶活性依賴的AICDmyc生成增加(圖5B)。說明JNK抑制劑有效的抑制了Y分泌酶水解活性。對幾次實(shí)驗進(jìn)行灰度掃描實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)這個抑制具有顯著性意義。接著，又對SP600125對C99的Y分泌酶代謝抑制進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)同樣能夠抑制AICD的增加(圖5C)。為了更加確認(rèn)JNK信號通路在過氧化氫激活Y分泌酶水解途徑中的作用，本發(fā)明人利用siRNA技術(shù)，針對JNK1，JNK2進(jìn)行了siRNA序列設(shè)計，經(jīng)過多次實(shí)驗比較和對一系列siRNA序列的篩選，最終找到對于抑制JNK1具有優(yōu)異效果的siRNA—條，以及適合于同時抑制JNK1禾l]JNK2的siRNA—條。將上述siRNA禾uAPP695myc共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，所述的siRNA確實(shí)能夠有效的降低細(xì)胞內(nèi)源性JNK蛋白的表達(dá)。而在針對熒光素酶的對照siRNA中，JNK表達(dá)沒有受到明顯影響。進(jìn)一步檢測rY分泌酶的水解途徑，發(fā)現(xiàn)JNKsiRNA抑制后，確實(shí)能夠很好的抑制AICD的增加(圖5D)。之后研究JNK信號通路能夠激活Y分泌酶的原因。由于Y分泌酶途徑的促進(jìn)有可能來源于底物APP的修飾或者酶Y分泌酶的活性修飾。有文獻(xiàn)報道，APP的C末端668位蘇氨酸磷酸化能夠促進(jìn)APP的代謝，從而增加A(3的生成。本發(fā)明人將APP蛋白第668位蘇氨酸突變成丙氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過氧化氫依然能夠促進(jìn)APP668位突變體的y分泌酶水解途徑(圖5E)。同樣，在C99對應(yīng)位點(diǎn)的突變，也不能抑制y分泌酶的水解途徑(圖5F)。因此，本發(fā)明人的實(shí)驗說明，過氧化氫通過JNK信號通路激活y分泌酵水解，并不依賴APP668位蘇氨酸的磷酸化。將SH-SY5Y細(xì)胞血清饑餓12小時，然后用U0126，Wortmannin，SP600125分別預(yù)處理3小時，再用&02刺激30min，然后收集細(xì)胞，用Westernblot方法檢測ERK，PKB，JNK信號通路本身是否激活，以及對過氧化氫引起y分泌酶活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路特異性介導(dǎo)了過氧化氫引起的y分泌酶的水解活性(圖6)。實(shí)施例6.JNK信號通路在體內(nèi)的作用JNK信號通路屬于SAPK-JNK信號通路，它負(fù)責(zé)了體內(nèi)對應(yīng)激狀態(tài)下的應(yīng)答。本發(fā)明人選用了AD病人組織和正常老年人病人的腦組織作為檢測對象。AD病人和正常對照的情況見表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>Westernblot結(jié)果顯示，磷酸化的活化JNK蛋白在AD病人里明顯高于正常病人，但是JNK本身并沒有太多明顯的變化(圖7A)。為了驗證JNK蛋白在體內(nèi)是否被激活，本發(fā)明人又采用了組織免疫熒光的方法，檢測轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576(獲自Taconic公司)的JNK的磷酸化水平以及定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖7B)在轉(zhuǎn)基因小鼠中A卩特異性抗體6E10呈現(xiàn)淀粉樣蛋白沉積陽性(a)。而在非轉(zhuǎn)基因小鼠對照中，并沒有觀察到老年斑沉積(e)。同樣在轉(zhuǎn)基因小鼠中還檢測到JNK陽性(b)。激光共聚焦顯微鏡檢測到活化的JNK活化的細(xì)胞定位在老年斑周圍，而在老年斑所處位置，DAPI基本無法染上，說明細(xì)胞已經(jīng)死亡丟失(c，g)。因此，本發(fā)明人認(rèn)為，JNK細(xì)胞在AD病人和轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，被老年斑活化，定位在老年斑周圍，使老年斑呈現(xiàn)擴(kuò)展的趨勢。實(shí)施例7.藥物篩選細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-APP695myc的SH-SY5Y細(xì)胞，其中具有JNK信號通路。觀!j試組用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物；對照組不用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物。在候選物質(zhì)處理后，用過氧化氫刺激細(xì)胞，然后采用如實(shí)施例5的方法檢測JNK信號通路的變化情況。如果與對照組相比，測試組中的JNK信號通路的激活情況降低，則說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的物質(zhì)。實(shí)施例8.含siRNA的組合物將5nmolsJRNA加入到250ul純水中，或也可加入到250yl常規(guī)溶解緩沖液中，配制成含siRNA的組合物。討論在AD病人腦內(nèi)，氧化應(yīng)激現(xiàn)象比正常人要高，很多實(shí)驗也證明氧自由基參與了AD的發(fā)病過程，但是具體機(jī)制還不是很清楚。本發(fā)明人的結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度下的過氧化氫能夠促進(jìn)a卩的生成。而且，過氧化氫激活了y分泌酶的水解效率。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路的激活介導(dǎo)了Y分泌酶水解活性的增強(qiáng)。A(3的生成需要全長APP蛋白經(jīng)過p，Y分泌酶，依次水解而來。因此，APP的水解過程和A卩的量有著密切的關(guān)系。已經(jīng)有些實(shí)驗試圖解釋為什么氧化應(yīng)激過程中能夠引起A(3的生成。比如，有人報道APP本身量的增加，或者卩分泌酶的量和或活性的增加。但是，龜面有些矛盾的地方，還是沒有很清楚的給以解釋。尤其是y分泌酶作為A(3生成前最密切的一個步驟，它的活性是否受到調(diào)控，以及怎么受調(diào)控都是一個卜分重要而且吸引人的問題。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，y分泌酶水解活性得到增強(qiáng)，這個結(jié)論基于下面證據(jù)1.過氧化氫促進(jìn)AP生成的同時，另一個產(chǎn)物AICD的量也有顯著的上升，而作為Y分泌酶的直接底物，C83和C99的量卻明顯下降。同樣，過氧化氫激活Y分泌酶活性具有time-course效應(yīng)。2.Y分泌酶的特異性抑制劑DAPT能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的AICDh升過程，說明Y分泌酶確實(shí)參與了這個過程。3.C99代替和A卩的增加。說明"y分泌酶確實(shí)被激活。本發(fā)明人的實(shí)驗中全長APP表達(dá)沒有變化，而巨P分泌酶的水解活性沒有明顯的變化，這和現(xiàn)有報道不同。本發(fā)明人推測在高強(qiáng)度的過氧化氫刺激條件下，Y分泌酶的水解活性才有特異性的增強(qiáng)。過氧化氫屬f氧自由基的一種，它能在體內(nèi)新陳代謝中產(chǎn)牛。H前己有報道證明過氧化氫在生理條件和病理條件下都發(fā)揮著重要的作用。體內(nèi)正常的生理條件V，過氧化氫的濃度約為100uM。但是在免疫細(xì)胞內(nèi)，'為了清除病原體的侵入，機(jī)體會在局部地區(qū)產(chǎn)生高達(dá)mM級別的過氧化氫。而在AD病人腦內(nèi)的老年斑周圍區(qū)域，報道顯示氧自由基明顯上調(diào)。本發(fā)明人推測，AD周圍的老年斑區(qū)域，由于小膠質(zhì)細(xì)胞富集，炎癥的發(fā)生，而且本身A(3蛋白在沉積過程中，均會產(chǎn)生較高濃度的氧自由基。本發(fā)明人實(shí)驗中所使用的lmM過氧化氫正是代表了AD腦內(nèi)局部的病理條件?？傊诟邼舛鹊倪^氧化氫刺激條件下，y分泌酶特異性的被激活，從而促進(jìn)了A卩的產(chǎn)生。接下去要研究的一個問題是過氧化氫通過細(xì)胞內(nèi)怎樣的機(jī)制來促進(jìn)Y分泌酶的水解活性。已有報道顯示過氧化氫能夠激活細(xì)胞內(nèi)很多條信號通路，包括MAPK/ERK，PKB/AKT，SAPK/JNK信號通路。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)JNK信號通路特異性的介導(dǎo)了過氧化氫促進(jìn)的y分泌酶活性增強(qiáng)過程。基于下面的證據(jù)1.細(xì)胞免疫染色和westernblot實(shí)驗顯示，JNK信號通路在過氧化氫刺激后被激活。2.JNK特異性抑制劑SP600125的預(yù)處理能夠抑制y分泌酶水解活性。而ERK,PKB'的抑制劑都沒有類似效果。3.JNK的siRNA能夠抑制過氧化氫促進(jìn)的y分泌酶活性。JNK信號通路屬于體內(nèi)MAPK信號通路家族，它負(fù)責(zé)應(yīng)答體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，決定細(xì)胞的生死命運(yùn)。本發(fā)明人的實(shí)驗提示，在外界壓力下，細(xì)胞體內(nèi)通過JNK這條信號通路，應(yīng)對各種外界壓力，起了中樞的作用。Y分泌酶在半小時內(nèi)就被顯著激活，在這么短的時間內(nèi)不可能完成Y分泌酶各組成成分的轉(zhuǎn)錄翻譯修飾，并a經(jīng)運(yùn)輸組裝，最后完成水解APP這個冗長的過程。那么，口J能的機(jī)制是JNK直接磷酸化APP蛋白，使得APP這個底物變得更加適合y分泌酶水解。已有報道，APP蛋白的C末端668位蘇氨酸能夠被JNK激酶磷酸化。而且APP668的磷酸化和APP的代謝密切相關(guān)。本發(fā)明人假設(shè)APP668的蘇氨酸介導(dǎo)了本發(fā)明人的過氧化氫誘導(dǎo)的y分泌酶水解活性的增強(qiáng)過程，然而，令人意外的是，在過氧化氫刺激卩，Y分泌酶依然能夠促進(jìn)對APP668位突變體水解活性。同樣，SP-C99突變體的代謝能力也沒有受到影響。這提示了過氧化氫活化的y分泌酶水解活性并不依賴于底物APP蛋白的668為磷酸化。另一個可能是JNK信號通路的激活直接激活了Y分泌酶的酶活。過氧化氫刺激后，細(xì)胞呈現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表現(xiàn)出一系列細(xì)胞死亡的外形特征，比如細(xì)胞邊緣變圓，細(xì)胞核固縮，MTT下降，臺酚蘭染色增加。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，JNK抑制劑SP600125能夠特異tt:抑制過氧化氫導(dǎo)致的細(xì)胞死'，外形h具有明顯改觀。而其他抑制劑并沒"這種效^。聯(lián)系到Ap/i:細(xì)胞死卩:過程屮產(chǎn)生增加的現(xiàn)象，可以認(rèn)為，過氧化爭l刺激卜，細(xì)胞內(nèi)JNK倍^通路被激活，細(xì)胞走向死亡的命運(yùn)。在這個過程中，由于細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器的崩裂，細(xì)胞質(zhì)中的pH下降，呈現(xiàn)微酸性，這符合了Y分泌酶的偏酸性喜好，使得Y分泌酶的水解活性增強(qiáng)。經(jīng)典的A(3假說認(rèn)為，家族遺傳或外界環(huán)境的長期作用下，導(dǎo)致腦內(nèi)A卩的逐漸積累。A卩的神經(jīng)毒性逐漸發(fā)揮，通過積聚過程中攻擊細(xì)胞線粒體等增強(qiáng)氧自由基，改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子等水平，引起細(xì)胞毒性，并使得一系列激酶活化。激酶的活化又引起了Tau蛋白的過量磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。這些都將促進(jìn)細(xì)胞死亡。而本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為這個假說補(bǔ)充A(3逐漸積累后，引起的炎癥反應(yīng)，這些過程中氧自由基的積累，將會造成Y分泌酶的活化，從而促進(jìn)A(3的產(chǎn)生。這個惡性循環(huán)的加劇，很可能是AD中晚期AP沉積加速的一個原因，本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)為AD，尤其是散發(fā)性AD病理發(fā)生機(jī)制提供了一種可能的解釋(圖7C)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，過氧化氫活化的JNK信號通路，促進(jìn)了"/分泌酶水解活性，使得A卩的生成增加和老年斑的擴(kuò)人。根據(jù)這個理論，新的治療靶點(diǎn)可以在這個通路中產(chǎn)生。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉針對人c-Jun'試基末端激酶的小RNA分于在老年癡呆癥中的作用<130>082O18<160>11<170〉Patentnversion3.3<210〉1<211〉21<212〉RNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>小分子RNA<400〉1ucacaguccugaaacgauatt21<210〉2<211〉21<212>RNA<213〉人丄序列<220><221〉misc_t'eaUire<223〉小分于I州A<400>2aaagaauguccuaccuucutt21<210>3<211〉19<212〉隨<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉小分亍RNA<400>3cuuacgcugaguacuucga19<210〉4<211〉25<213〉人T.序列<220><221〉misc一feature<223〉引物〈400〉4mtctagagatgctgcccggtttg25<210〉5<211〉25<212〉畫<213〉人I序夕U<220〉<221>misc—feature<223〉引物<210>6<211〉31<212〉DNA<213〉人—K序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉6gagaagatctatgatagcgacagtgatxgtc31<210>7'<211〉33<2I2〉DNA<213〉人1:序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>gagtctagactagttctgcatctgc<400>gagaagatctatgacagtggatcgtcattcacc<210〉<211〉〈212〉<213〉833腿<■〉gagaagatctatggtgatgctgaaggaagaaac<210〉9<211〉23<212〉隨<213〉人l:序列<220〉<22>misc—feature<223>引物<400〉9gaatagggccctctagatgcatg23<210〉10<211>34〈212>DNA<213〉人丁.序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<210>11<211〉31<212〉腿<213>人1〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物"00〉11gctcctctggggcgacagcggcgtcaacctc31<400>ttgacgccgctgtcgccccagaggagcgccacct權(quán)利要求1.一種c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物。2.如權(quán)利要求1所述的用途，K持征在f，所述的組合物還用于預(yù)防或治療神經(jīng)退行性疾病。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淀粉樣蛋白產(chǎn)生是Y分泌酶依賴的淀粉樣蛋白產(chǎn)生。4.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑是特異性干擾c-Jim氨基末端激酶基因表達(dá)的小RNA分子。5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。6.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑是SP600125。7.—種用于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的小RNA分子，其特征在于，所述的小RNA分子(a)具有SEQIDNO:1中第1-19位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNO:2中第l-19位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。8.—種用于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權(quán)利要求7所述的小RNA分子，以及藥學(xué)上可接受的載體。9.一種篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)用候選物質(zhì)處理具有c-JUn氨基末端激酶信號通路的細(xì)胞；和(2)檢測所述細(xì)胞中c-Jim氨基末端激酶信號通路的變化情況；其中，若所述候選物質(zhì)P—J阻斷c-Jun氨基末端激酶信號通路，或抑制c-Jun氨基末端激酶信號通路的激活，則表明該候選物質(zhì)是抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，還包括在候選物質(zhì)處理之前或處理之后，用氧化應(yīng)激試劑刺激細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種c-Jun氨基末端激酶信號通路的拮抗劑的用途，用于制備抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的組合物。本發(fā)明還公開了一種用于抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的小RNA分子。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激試劑可通過激活c-Jun氨基末端激酶信號通路促進(jìn)γ分泌酶的激活，從而導(dǎo)致淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。因此，可基于該發(fā)現(xiàn)開發(fā)出新的針對神經(jīng)退行性疾病的藥物靶點(diǎn)。文檔編號A61K38/10GK101549147SQ200810035449公開日2009年10月7日申請日期2008年4月1日優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日發(fā)明者景乃禾,沈承勇,陳永峰申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院