專利名稱：鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：
表阿霉素(epirubicin，4’-epiadriamycin，epidoxorubicin，EPI)，是意大利學者Arcamone等于1975年通過半合成途徑合成的一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是阿霉素的同分異構(gòu)體，區(qū)別在于其氨基糖的4’位置上的羥基由順式變?yōu)榉词健１戆⒚顾氐淖饔脵C理為直接嵌入DNA堿基，抑制拓撲異構(gòu)酶II活性，產(chǎn)生氧和藥物自由基以及與金屬離子發(fā)生螯合作用等。目前主要用于治療乳腺癌、惡性淋巴瘤、軟組織肉瘤、肺癌、胸膜間皮瘤、胃腸癌、頭頸癌、卵巢癌、前列腺癌、轉(zhuǎn)移性膀胱癌等腫瘤。
經(jīng)過30多年的臨床應用實踐，證實表阿霉素的抗腫瘤活性與阿霉素相等而毒性小，尤其是心臟毒性。表阿霉素的急性心臟毒性主要表現(xiàn)在心電圖的改變，如心率失常，室性期前收縮和非特異性的ST-T改變等，一般能夠自行恢復。當所述的表阿霉素的累積劑量超過100mg/m2時可出現(xiàn)充血性心力衰竭(CHF)；表阿霉素的其他毒性，還表現(xiàn)為骨髓抑制，急性毒性或劑量限制性毒性，白細胞下降和輕度的血小板下降，少數(shù)出現(xiàn)血紅蛋白下降；胃腸道反應，如惡心嘔吐，厭食，黏膜炎和腹瀉；藥物外漏于皮下引起的局部水皰，蜂窩組織炎和壞死，靜脈炎，脫發(fā)，極少有肝腎功能損害。
脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中形成的具有雙分子層的直徑僅有幾十納米至數(shù)微米的超微球狀粒子。1965年Bangham等發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體，20世紀70年代Gregoriadis等首先將脂質(zhì)體作為藥物載體應用。由于脂質(zhì)體具有獨特的作用特點，而受到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)顯示了靶向性是脂質(zhì)體作為藥物載體的主要目標之一，尤其在腫瘤治療方面，利用脂質(zhì)體的靶向作用，將脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物的有效載體而得到廣泛應用。另外，藥物被包埋在脂質(zhì)體中緩慢釋放，在血循環(huán)中脂質(zhì)體藥物要比游離藥物有更長的滯留時間，因而延長藥物的作用時間，起到長效作用；藥物由于有脂質(zhì)體包封將提高被包封藥物的穩(wěn)定性，還能保護定向至某些需治療的靶器官或組織中釋放，使這些靶器官或組織藥物濃度提高，提高了藥物的療效；同時，一些非器官或組織藥物濃度則分布很少，避免了藥物對這些器官或組織的影響，從而降低了藥物的毒性。
目前，國內(nèi)外上市產(chǎn)品主要為表阿霉素及其鹽的粉針劑和注射劑。但在臨床應用中發(fā)現(xiàn)其依然存在較強的毒副作用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種藥物含量高，生物利用度高，體內(nèi)循環(huán)時間長，毒副作用低的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體制劑及其制備方法。
本發(fā)明將表阿霉素制成脂質(zhì)體，能進一步降低毒性，更安全更適合臨床應用于腫瘤治療，尤其是兒童的腫瘤治療。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn) 采用pH梯度或者硫酸銨梯度法主動載藥，獲得包封率超過90％的脂質(zhì)體，使較小的體積中含有較高的表阿霉素主藥成分，能明顯降低生產(chǎn)成本，在制成凍干制劑后，更適合工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，含有鹽酸表阿霉素和中性磷脂和膽固醇和/或負電荷磷脂和/或長循環(huán)磷脂，按每1000mL脂質(zhì)體溶液計，其中的原料量為 鹽酸表阿霉素500mg～2000mg 中性磷脂700mg～20000mg 負電荷磷脂 0mg～5000mg 長循環(huán)磷脂 0mg～8000mg 膽固醇 200mg～10000mg 其中中性磷脂與膽固醇的摩爾比例為1∶1～1∶0.1，中性磷脂與負電荷磷脂的摩爾比例為5∶3～5∶0.1，鹽酸表阿霉素與磷脂的重量比例為0.01∶1～1∶1。
優(yōu)選每1000mL脂質(zhì)體溶液中的原料量為 鹽酸表阿霉素750mg～1250mg 中性磷脂5000mg～10000mg 負電荷磷脂2000mg～4000mg 長循環(huán)磷脂3000mg～4000mg 膽固醇7000mg～10000mg 上述脂質(zhì)體所包含的中性磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、雙硬脂酸卵磷脂或雙軟脂酸卵磷脂。
上述脂質(zhì)體所包含的帶負電荷磷脂選自雙肉豆蔻酸磷脂酰甘油、雙月桂酸磷脂酰甘油、雙軟脂酸磷脂酰甘油、雙硬脂酸磷脂酰甘油、雙肉豆蔻酸磷脂酸、雙硬脂酸磷脂酸、雙月桂酸磷脂酸、雙軟脂酸磷脂酸、雙油酸磷脂酰絲氨酸或雙亞油酸磷脂酰肌醇。
上述脂質(zhì)體所包含的長循環(huán)磷脂材料選自所有不同分子量的聚乙二醇(PEG)與雙硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)反應生成的PEG-DSPE。
上述脂質(zhì)體通過下述方法和步驟制備 分別稱取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解于茄形瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入pH4.0的檸檬酸緩沖液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，用微型擠壓器制備空白脂質(zhì)體。加入pH11.4的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2，將空白脂質(zhì)體溶液與處方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液混合，置于65℃水浴中保溫15～30min，即得。
上述脂質(zhì)體的制備方法，還可以用如下方法制得 分別稱取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解于茄形瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜。在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，用微型擠壓器制備空白脂質(zhì)體，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液洗脫通過Sephadex G50凝膠柱或者通過透析的方法(透析液為10％蔗糖溶液)更換外水相，加入處方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置于65℃水浴中保溫15～30min，即得。所述的透析液選自10％蔗糖溶液。
本發(fā)明制得的脂質(zhì)體的包封率均大于80％，通過投射電鏡觀察，脂質(zhì)體圓整，表面光滑，測定粒徑得到，脂質(zhì)體分布較窄，粒徑約為100nm。
對本發(fā)明的脂質(zhì)體進行大鼠體內(nèi)的藥動學考察，結(jié)果顯示 與注射劑相比，脂質(zhì)體劑型顯著改變了表阿霉素藥物在大鼠體內(nèi)的行為，從藥動學參數(shù)可以看出，顯著延長了藥物在血液中的循環(huán)時間，增大了AUC，減小了清除率和分布容積。
表1是大鼠靜脈注射注射劑和脂質(zhì)體后的血藥濃度。
表2是大鼠靜脈注射注射劑和脂質(zhì)體后的藥動學參數(shù)。
表1.
表2.

本發(fā)明采用統(tǒng)計矩的計算方法對所述的脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的組織分布情況，和脂質(zhì)體和對照注射劑在48h內(nèi)在心、肝、脾、肺和腎組織中的藥物濃度的各組織經(jīng)時數(shù)據(jù)進行處理，得到0~48h時間段對照組和脂質(zhì)體組AUC值，結(jié)果表明，相對于注射劑對照組，脂質(zhì)體組在肝、脾、肺中的分布顯著增加，在心臟中分布顯著減少(為注射劑組的57％)，提示脂質(zhì)體能降低表阿霉素藥物在心臟中的蓄積，從而減少其心臟毒性。
本發(fā)明的脂質(zhì)體進行了大鼠毒性實驗，反應動物體全身毒性的體重數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，未給藥和脂質(zhì)體組的大鼠體重持續(xù)增長，注射劑組大鼠在第4～6天間，體重明顯下降，提示注射劑連續(xù)給藥后因藥物蓄積而出現(xiàn)毒性反應。
本發(fā)明測定了連續(xù)給藥三次后實驗大鼠的心電圖，并計算了大鼠的心率，結(jié)果顯示，相對于未給藥的大鼠，注射劑的心率顯著減慢，而本脂質(zhì)體組的心率減慢情況相對緩和。表3是大鼠連續(xù)給藥3次后的心率減慢情況。
表3 通過以上的實驗數(shù)據(jù)證實，本發(fā)明的脂質(zhì)體藥物含量高，生物利用度高，體內(nèi)循環(huán)時間長，全身及心臟的毒副作用低，更適合臨床應用。



圖1是小鼠靜脈注射注射劑和脂質(zhì)體后在各組織中的分布情況。
圖2是大鼠在試驗期間(6天)的體重變化。

具體實施例方式 實施例1制備表阿霉素脂質(zhì)體 表阿霉素0.4mg 氫化磷脂30mg 膽固醇 11.5mg 制備方法稱取上述配方量的磷脂類物質(zhì)、膽固醇溶于適量的氯仿/甲醇溶液中，得類脂溶液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，用微型擠壓器制備空白脂質(zhì)體，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液洗脫通過Sephadex G50凝膠柱更換外水相，加入配方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置65℃水浴中保溫20min，即得。經(jīng)測定，所制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為94.8％。
實施例2制備表阿霉素脂質(zhì)體 表阿霉素0.4mg 大豆卵磷脂 30mg DSPG6mg 膽固醇 11.5mg 制備方法稱取上述配方量的磷脂類物質(zhì)、膽固醇溶于適量的氯仿/甲醇溶液中，得類脂溶液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，探頭超聲減少粒徑，依次過兩次孔徑為0.22μm、0.15μm的濾膜得脂質(zhì)體混懸液，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液洗脫通過Sephadex G50凝膠柱更換外水相，加入配方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置于65℃水浴中保溫20min，即得。所制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為95.6％。將其冷凍或噴霧干燥即得粉針劑。
實施例3制備表阿霉素脂質(zhì)體 表阿霉素0.4mg 蛋黃卵磷脂 30mg 雙肉豆蔻酸磷脂酰甘油6mg PEG2000-DSPE7mg 膽固醇 11.5mg 制備方法稱取上述配方量的磷脂類物質(zhì)、膽固醇溶于適量的氯仿/甲醇溶液中，得類脂溶液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，用微型擠壓器制備空白脂質(zhì)體，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液洗脫通過Sephadex G50凝膠柱更換外水相，加入配方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置于65℃水浴中保溫20min，即得。制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為94.2％。將其冷凍或噴霧干燥即得粉針劑。
實施例4 表阿霉素 0.8mg 雙硬脂酸卵磷脂60mg 雙月桂酸磷脂酰甘油24mg 膽固醇24mg 制備方法稱取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解于茄形瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入pH4.0的檸檬酸緩沖液，振搖2h至脂質(zhì)膜完全水化，用微型擠壓器減少和均勻粒徑制備空白脂質(zhì)體，加入pH11.4的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2，將空白脂質(zhì)體溶液與處方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液混合，置于65℃水浴中保溫30min，即得。制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為91.6％。將其冷凍或噴霧干燥即得粉針劑。
實施例5 表阿霉素1mg 雙軟脂酸卵磷脂 75mg 雙軟脂酸磷脂酸 30mg 膽固醇 25mg 稱取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解于茄形瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖1h至脂質(zhì)膜完全水化，探頭超聲減少粒徑，依次過兩次孔徑為0.22μm、0.15μm的濾膜得脂質(zhì)體混懸液，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液為透析液，透析24h，然后加入處方量的鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置于65℃水浴中保溫15～30min，即得。制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為93.4％。將其冷凍或噴霧干燥即得粉針劑。
實施例6 表阿霉素1mg 氫化磷脂75mg 雙肉豆蔻酸磷脂酰甘油30mg 制備方法同實施例1，制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為80.4％。
實施例7 表阿霉素10mg 氫化磷脂750mg 雙軟脂酸磷脂酰甘油 400mg 膽固醇 100mg 制備方法同實施例1，制得的表阿霉素脂質(zhì)體的包封率為87.4％。
權(quán)利要求
1、一種鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，其特征是含有鹽酸表阿霉素和中性磷脂和膽固醇和/或負電荷磷脂和/或長循環(huán)磷脂組成，每1000mL脂質(zhì)體溶液中的原料為
鹽酸表阿霉素500mg～2000mg
中性磷脂700mg～20000mg
負電荷磷脂 0mg～5000mg
長循環(huán)磷脂 0mg～8000mg
膽固醇 200mg～10000mg
其中，中性磷脂與膽固醇的摩爾比為1∶1～1∶0.1，中性磷脂與負電荷磷脂的摩爾比為5∶3～5∶0.1，鹽酸表阿霉素與磷脂的重量比為0.01∶1～1∶1。
2、按權(quán)利要求1所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，其特征是每1000mL脂質(zhì)體溶液中的原料為
鹽酸表阿霉素750mg～1250mg
中性磷脂5000mg～10000mg
負電荷磷脂 2000mg～4000mg
長循環(huán)磷脂 3000mg～4000mg
膽固醇 7000mg～10000mg。
3、按權(quán)利要求1所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，其特征是所述的中性磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、雙硬脂酸卵磷脂或雙軟脂酸卵磷脂。
4、按權(quán)利要求1所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，其特征是所述的帶負電荷磷脂選自雙肉豆蔻酸磷脂酰甘油、雙月桂酸磷脂酰甘油、雙軟脂酸磷脂酰甘油、雙硬脂酸磷脂酰甘油、雙肉豆蔻酸磷脂酸、雙硬脂酸磷脂酸、雙月桂酸磷脂酸、雙軟脂酸磷脂酸、雙油酸磷脂酰絲氨酸或雙亞油酸磷脂酰肌醇。
5、按權(quán)利要求1所述的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體，其特征是所述的長循環(huán)磷脂選自不同分子量的聚乙二醇與雙硬脂酸磷脂酰乙醇胺反應生成的聚乙二醇-雙硬脂酸磷脂酰乙醇胺。
6、權(quán)利要求1的鹽酸表阿霉素脂質(zhì)的制備方法，其特征是采用pH梯度或硫酸銨梯度法，包括以下步驟
分別取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解，減壓蒸發(fā)除去氯仿，得脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入pH4.0的檸檬酸緩沖液，振搖至脂質(zhì)膜水化后，制得空白脂質(zhì)體，加入pH11.4的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至6.8-7.2，將所述空白脂質(zhì)體溶液與鹽酸表阿霉素蔗糖溶液混合，置65℃水浴保溫15～30min，即得；或，
分別取配方量的中性磷脂、負電荷磷脂、長循環(huán)磷脂、膽固醇，用氯仿溶解，減壓蒸發(fā)除去氯仿，得脂質(zhì)薄膜，在脂質(zhì)薄膜中加入150mM的硫酸銨溶液，振搖至脂質(zhì)膜水化后，制得空白脂質(zhì)體，將空白脂質(zhì)體溶液以10％蔗糖溶液洗脫，通過Sephadex G50凝膠柱或通過透析法更換外水相，加入鹽酸表阿霉素蔗糖溶液，混合，置65℃水浴中保溫15～30min，即得。
7、按權(quán)利要求5的方法，其中所述的透析法中的透析液為10％蔗糖溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體及其制備方法。本發(fā)明的脂質(zhì)體由鹽酸表阿霉素和中性磷脂和膽固醇和/或負電荷磷脂和/或長循環(huán)磷脂和緩沖液等組成，采用pH梯度或者硫酸銨梯度法主動載藥，獲得的脂質(zhì)體包封率超過90％，使較小的體積中含有較高的表阿霉素主藥成分，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有藥物含量高，生物利用度高，體內(nèi)循環(huán)時間長，毒副作用低等優(yōu)點，能明顯降低生產(chǎn)成本，在制成凍干制劑后，更適合工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明脂質(zhì)體適合臨床應用于腫瘤治療，尤其是兒童的腫瘤治療。
文檔編號A61K31/7028GK101264056SQ200810036499
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者方曉玲, 潔 郭, 張志文, 潘振華, 江 吳 申請人:復旦大學