專利名稱：：一種聚甲基丙烯酸酯及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因治療用還原性陽離子聚甲基丙烯酸酯載體、其制備方法，本發(fā)明還涉及此聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物的構(gòu)建中的應(yīng)用及此聚甲基丙烯酸酯在基因治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：非病毒載體中的陽離子聚合物載體具有優(yōu)異的DNA結(jié)合能力，具有無免疫原性、裝載容量大、容易制備等優(yōu)點，便于進行靶向性及生物實用性改性，成為基因載體研究中的一個重要研究對象。文獻中報道了很多陽離子聚合物載體，如聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚酰胺基胺、聚氨基酯、殼聚糖等。陽離子聚合物基因載體的陽離子特性對轉(zhuǎn)染效率具有雙重影響第一，陽離子聚合物能夠提供與DNA自組裝的動力，有利于保護DNA免受降解；能夠壓縮DNA成為比自由DNA體積小的復(fù)合物顆粒，有利于進入細胞；通過排斥作用形成穩(wěn)定的基因納米復(fù)合物；基因納米復(fù)合物與細胞膜之間產(chǎn)生靜電吸附，促進基因納米復(fù)合物的內(nèi)吞。第二，納米基因復(fù)合物的陽離子特性與體液負電組分結(jié)合，不利于體內(nèi)轉(zhuǎn)運；靜電組裝的納米復(fù)合物阻止DNA釋放，不利于編碼基因表達；復(fù)合物的正電荷也破壞細胞的膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生溶血毒性。目前改善陽離子聚合物基因載體轉(zhuǎn)染特性的研究領(lǐng)域包括(l)引入親水基團，提高基因納米復(fù)合物的水溶性；(2)引入響應(yīng)細胞內(nèi)環(huán)境的可降解基團，研究可降解基團與不可降解聚合物的N/P(聚合物中氮原子數(shù)(N)與基因中負電荷數(shù)(P)的比例)關(guān)系，得封促進DNA縮合及在細胞內(nèi)可降解的聚合物；(3)引入內(nèi)涵體破壞性基團或成分如氯喹，膜破壞性肽及聚丙基丙烯酸；(4)引入靶向基團，提高復(fù)合物受體介導(dǎo)的內(nèi)吞；(5)引入賦予陽離子聚合物以脂質(zhì)特性的基團或成分，增強與細胞膜的結(jié)合能力，促進復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸；(6)引入潛在酸性基團或直接引入陰離子成分，中和載體的正電荷，減弱載體與基因的相互作用，促進DNA的釋放；(7)引入不同類型的氨基(如三級胺、咪唑基團或季銨鹽)，提高陽離子特性、水溶性以及破環(huán)內(nèi)涵體的能力；(8)陽離子聚合物中引入對氧化還原敏感的二硫鍵，能夠避免細胞或組織中各種酸性補體和酶的降解，在亞細胞還原空間選擇性的高效導(dǎo)入，并對各類核酸有緩釋性，有利于轉(zhuǎn)染核酸的長期穩(wěn)定表達。文獻[l]用流行性感冒病毒提取的膜破壞性縮氨酸共價連接各種聚甲基丙烯酸酯(pDMAEMA,pDAMA和可降解的pHPMA-DMAE)，并能夠維持此類縮氨酸破壞內(nèi)涵體膜的性質(zhì)，加入偶合劑^琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)以增加復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。聚縮氨酸濃縮DNA特性用動態(tài)光散射和電位測定表明粒度為100—250nm，電位為+15to—20mV。實驗結(jié)果顯示連接縮氨酸的聚甲基丙烯酸酯/DNA復(fù)合物單一聚甲基丙烯酸酯更高效的轉(zhuǎn)染C0S-7細胞活性。文獻[2]報道了聚(2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)(PDMAEMA)是一種水溶性的陽離子聚合物，它通過靜電作用能夠與DNA黏附，作為基因傳輸試劑。在聚合物/質(zhì)粒為2時，正電荷復(fù)合物的尺寸約0.2)am。PDMAEMA質(zhì)粒為3-5(w/w)時達到最佳轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率為3-6%，且PDMAEMA的毒性低。動態(tài)光散射研究表明，高分子量PDMAEMA(M300kDa)能有效濃縮質(zhì)粒DNA(粒度0.15-0.20)am),低分子量PDMAEMA/質(zhì)粒復(fù)合物的粒度為0,5-1.0(im。2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)與AA-乙烯基-吡咯烷酮(NVP)共聚物也可作為轉(zhuǎn)染試劑。與DMAEMA單聚物相比，54mol%NVP共聚物能夠提高轉(zhuǎn)染效率并降低毒性。文獻[3]報道了pDMAEMA/質(zhì)粒復(fù)合物的傳染效率和毒性的關(guān)系，研究了不同分子量的聚(2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)與pCMV-LacZ質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合物對C0S-7和0VCAR-3細胞系的轉(zhuǎn)染。對比研究了p(DMAEMA)/質(zhì)粒、聚(L一賴氨酸)和DEAE右旋糖苷)/質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，聚合物/質(zhì)粒比例為聚乙烯(L一賴氨酸)5/1，p(DMAEMA)6/1-13/1和DEAE右旋糖苷50/1-200/1時，轉(zhuǎn)染效率最高，細胞存活率為40-70%。在相同物理化學(xué)條件下，p(DMAEMA)/質(zhì)粒基因復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率比DEAE右旋糖苷/質(zhì)粒復(fù)合物高兩倍，比聚乙烯(L一賴氨酸)/質(zhì)粒基因復(fù)合物高八倍，表明轉(zhuǎn)染效率與物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。p(DMAEMA)分子量〉300kDa時轉(zhuǎn)染C0S-7andOVCAR-3細胞的效率更高。動態(tài)光散射表明高分子量p(DMAEMA)能有效壓縮DNA，復(fù)合物粒度為0.17-0.21)am。相反，低分子量的p(DMAEMA)/質(zhì)?；驈?fù)合物的粒度約為1.0pm。文獻[4]報道了聚(2-甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯)容易通過胞吞轉(zhuǎn)染細胞(pDMAEMA)，pDMAEMA毒性可以導(dǎo)致細胞死亡的溶菌酶裂解。結(jié)果表明(i):pDMAEMA具有高毒性，引起細胞壞死，(ii)通過流動相胞吞進行細胞內(nèi)在化，(iii)盡管pDMAEMA影響新的內(nèi)涵體、溶酶體的形態(tài)，但是，它不能夠在物理上阻止釋放基因到細胞質(zhì)中。文獻[5]報道了使用可逆加成-斷裂鏈遷移(RAFT)聚合反應(yīng)制備了a，o二巰基聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)。通過a，ffl-二巰基的氧化得到骨架中含有二硫鍵的還原性聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(rPDMAEMA)。rPDMAEMA的DNA復(fù)合物用動態(tài)和靜態(tài)光散射表征，與不含二硫鍵的PDMAEMA的DNA復(fù)合物相比，顯示低結(jié)構(gòu)密度和低DNA含量。評價了體外rPDMAEMA-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染和毒性，rPDMAEMA在平面細胞系中毒性很小。B16F10細胞和六個胰腺癌細胞系的轉(zhuǎn)染活性試驗表明rPDMAEMA復(fù)合物具有很好的轉(zhuǎn)染活性。該文獻報道的產(chǎn)物僅僅是結(jié)構(gòu)可控的線性聚合物，研究了二硫鍵交聯(lián)的rPDMAEMA的轉(zhuǎn)染和細胞毒性，沒有研究端巰基寡聚物的細胞轉(zhuǎn)染和細胞毒性，研究了熒光素酶對rPDMAEMA/質(zhì)?；驈?fù)合物報告基因表達比聚甲基丙烯酸酯(PDMAEMA)高3-4倍轉(zhuǎn)染活性。文獻[6]用不同交聯(lián)劑將低分子量的寡聚胺(d他iobis-succinimidylproprionate,dimethyldithiobis-propionamidate,andhexanedioldiacrylate)交聯(lián)寡聚得到可溶性聚陽離子。寡聚胺和交聯(lián)劑的種類影響生物物理特性，如DNA粘結(jié)，溶血性、內(nèi)涵體膜活性、轉(zhuǎn)染效率和基因載體的活性。研究了基于二硫鍵還原斷裂的聚合物降解或酯水解，寡聚乙烯基亞胺(800Da)基聚合物具有最高基因轉(zhuǎn)染效率。文獻[7]報道了含有二硫鍵的生物還原性聚(氨基胺)(SS-PAAs),伯胺與二硫鍵連接的雙丙烯酰胱胺通過Michael聚加成得到SS-PAAs。SS-PAA在生理條件下(pH7.4,150mMPBS，37GQ穩(wěn)定，在模擬細胞內(nèi)還原環(huán)境的2.5mMDTT溶液中快速降解(pH7.4，[R-SH])5mM，37GC)。SS-PAAs有效濃縮DNA成納米顆粒(<200nm)和正電性(〉+20mV)復(fù)合物，動力光散射和瓊脂糖凝膠試驗表明，該納米顆粒在中性條件下穩(wěn)定而在還原性環(huán)境中迅速破壞。在pH7.4-5.1時SS-PAAs復(fù)合物的緩沖能力高于聚乙烯亞胺(pEI),并迅速從細胞內(nèi)涵體中逃逸。體外SS-PAAs轉(zhuǎn)染C0S-7細胞的效率比支化pEI高，在有血清時，孵育時間從lh增大到4h，基因表達顯著提高。XTT試驗顯示SS-PAAs和它的復(fù)合物在高轉(zhuǎn)染活性時毒性很低。表明生物還原性SS-PAAs具有高潛力和非毒性聚合物基因載體。文獻[8]報道了聚(氨基乙烯基亞胺)，一種新的含有多重二硫鍵的縮氨酸聚合物(SS-PAEI)，將質(zhì)粒DNA(pDNA)輸送到細胞后能夠降解并及時釋放基因。雙丙烯胱酰胺與三種乙烯基胺單體通過Michael加成得到三種SS-PAEI即，乙二胺(EDA)，二乙烯基三胺(DETA)，三乙烯基四胺(TETA)。用'HNMR、凝膠色譜(GPC)、酸堿滴定和液-質(zhì)聯(lián)用色譜(LC-MS)分別測定了每個SS-PAEI的結(jié)構(gòu)、分子量、緩沖能力和分散系數(shù)。聚復(fù)合物(聚合物/pDNA)的物理化學(xué)特性用凝膠電泳，粒度儀和電位儀表征，復(fù)合物粒徑小于200nm，表面正電位32mV。SS-PAEIs的體外基因轉(zhuǎn)染特性用鼠NIH3T3細胞，牛動脈BAEC細胞和鼠動脈A7R5細胞評價。SS-PAEIs比聚乙烯亞胺(25KD)的基因表達高20%,并且毒性低?，F(xiàn)有技術(shù)中提及的聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚酰胺基胺、聚氨基酯、殼聚糖和聚甲基丙烯酸酯等大多數(shù)是線狀聚合物和取代支鏈為非可控的聚合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高細胞轉(zhuǎn)染率、低細胞毒性的還原性聚甲基丙烯酸酯本發(fā)明的另一個目的在于提供前述聚甲基丙烯酸酯的其制備方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供此聚合物在納米基因傳遞載體的構(gòu)建中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供該還原性聚甲基丙烯酸酯在基因治療方面的應(yīng)用。本發(fā)明所提供技術(shù)內(nèi)容如下，(l)兩種新的RAFT試劑一1,3,5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基)苯和1,3，5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基)苯；(2)兩種新聚合物一l,3,5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TEX-PDMAEMA)和1，3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基》苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TTP-PDMAEMA)的制備；(3)—種三端巰基聚合物聚[1，3，5.三端巰基(2-丙基苯基-2-(二甲氨基)乙基)]甲基丙烯酸酯](TT-PDMAEMA);(4)—種新的二硫鍵交聯(lián)的還原性聚合物(TrPDMAEMA);(5)兩類新的基因納米復(fù)合物構(gòu)建一TT-PDMAEMA/質(zhì)?；蚣{米復(fù)合物TrPDMAEMA/基因納米復(fù)合物方法。試驗表明，這兩種聚合物能夠有效濃縮質(zhì)?；驑?gòu)成納米復(fù)合物，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和Hella細胞的效率在30%以上，毒性試驗表明該物質(zhì)毒性低，細胞存活率大于80%。三端巰基聚合物一TT-PDMAEMA及其二硫鍵交聯(lián)的還原性聚合物一TrPDMAEMA的分子結(jié)構(gòu)式如下TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的數(shù)均摩爾質(zhì)量(M。)和重均摩爾質(zhì)量(Mw)聚分散系數(shù)(PDI,Mw/Mn)用凝膠色譜(GPC)表征，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為流動相，流動速率為1.0mL/min，溫度35。C。表1是本發(fā)明提供的基因傳遞載體的特征為，TT-PDMAEMA的分子量(Mn)在3500—4500g/mol,Mw/Mn在1.01-1.25;TrPDMAEMA的分子量(Mn)在16500-35700g/mol，Mw/M。在2.5-4.5，對[H+]緩沖容量在2.4-3.9pmol/mg。表1陽離子聚合物的摩爾質(zhì)量和緩沖容量:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由于TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA都含有2-(二甲氨基乙基)支鏈片段，因此它們都具有結(jié)合緩沖溶液中質(zhì)子的能力，具有質(zhì)子海綿的特性，都能夠壓縮質(zhì)?；虺蔀榧{米，粒度在80-150nm之間，該特性會引起納米復(fù)合物帶正電性，易于結(jié)合帶負電性的細胞膜，促進細胞的胞吞作用。TT-PDMAEMA分子骨架中含有巰基，TrPDMAEMA分子骨架中含有體外穩(wěn)定、體內(nèi)具有可逆性氧化還原性的二硫鍵。表2是本發(fā)明提供的TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的基因納米復(fù)合物物理化學(xué)特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*根據(jù)d-3Mw/(4pNARcj3)計算**估計的每個復(fù)合物的DNA分子平均數(shù)本發(fā)明提供的TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA基因傳遞載體通過以下方法實現(xiàn)1.TT-PDMAEMA的合成(1)1,3,5-三異丙基苯RAFT試劑的兩種合成方法1，3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯的合成在四氯化碳作溶劑中加入l,3，5-三異丙基苯，N-溴代琥珀酰亞胺和過氧化苯甲酰催化劑，回流，過濾，飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鎂干燥，去除溶劑，得到黃色油狀液體。在氯仿溶劑中加入上述黃色油狀液體，滴加苯硫代黃酰溴化鎂，回流，硅膠柱分離，得到l，3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙萄)苯。'H畫R(CDC13):1.74,6.82,7.313CNMR(CDC13):12.7.9,129.5，130.5，141.9,218.2，30.8，48.8,121.8合成路線圖如下1,3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯的合成在四氯化碳溶劑中加入1,3,5-三異丙基苯，N-溴代琥珀酰亞胺和過氧化苯甲酰催化劑，回流。經(jīng)過濾、飽和碳酸氫鈉洗滌和無水硫酸鎂干燥，去除溶，得到黃色油狀液體。在四氫呋喃溶劑中加入黃色油狀液體和乙基黃原酸鉀，經(jīng)回流、過濾、硅膠柱分離和去除溶劑，得到1,3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯。!H麗R(CDC13):1.11,3.57,1.74,6.8213CNMR(CDC13):13.5，60.5,172.0，30.8,45.5，148.1,121.3合成路線圖如下(2)2-二甲氨基-甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的RAFT聚合在四氫呋喃溶劑中加入DMAEMA、AIBN(偶氮二異丁腈)引發(fā)劑，1,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯，充分去氧，真空密封，60°C水浴中反應(yīng)。得到新物質(zhì)l,3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TEX-PDMAEMA),加入過量己烷沉淀、分離產(chǎn)物。聚合物用^NMR表征(Varianspectrometer,400MHz)，D4-甲醇和D-氯仿為溶劑。采用同樣制備方法，用1，3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙萄)苯反應(yīng)物代替1,3,5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯，可以得到l,3，5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TTP-PDMAEMA)。!HNMR(CDCI3):1.11,3,57,1.69,2.52,1.39,7.12，2.27,2.64，4.18。'HNMR(CDCl3):7.3,1.69，2.52，1.39,7.12,2.27，2.64,4.18。13CNMR(CDC13):13.5,60.5,172.0,45.5,22.2,52.4,29.4，29.3,118.8,146.3,41.2，58.2,66.1,174.5。"CNMR(CDC13):130.5,127.9,129.5,218.2,48.8，22.2,52.4,29.4,146.3，118.8,41.2,58.2:66.1,174.5。合成路線圖如下(3)TT-PDMAEMA的合成TEX-PDMAEMA溶解在四氫呋喃溶液中，加入數(shù)滴過硫酸銨溶液，充氮氣30min后，加入正丁胺，在氮氣保護下攪拌。反應(yīng)混合物加入過量己烷沉淀、過濾。采用同樣方法，用TTP-PDMAEMA代替TEX-PDMAEMA氨解后，也可以制備TT-PDMAEMAo^NMR(CDCl3):1.5,1.69，2.15,1.39，7.12,2.27，2.64，4.1813CNMR(CDC13):24.9，55.1,28.9，29.4，146.3,118.8,41.2,58.2,65.7,174.52.還原性TrPDMAEMA的制備釆用兩種方法方法l:二甲基亞砜(DMSO)加入到TT-PDMAEMA的去離子水溶液中，攪拌。除去水后，TrPDMAEMA從DMSO沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。方法2:在溶解TEX-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亞砜(DMSO)和正丁胺，在室溫條件下，該混合物溶液在氧氣氣氛中攪拌13-15天，然后蒸餾除去甲醇，將剩余混合物溶液溶解在四氫呋喃中，加入10倍過量(體積比)的己垸溶劑中沉淀、過濾，并干燥得到TrPDMAEMA同方法2，用TTP-PDMAEMA代替TEX-PDMAEMA也可以得到TrPDMAEMA。TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的合成路線圖如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>本發(fā)明從TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的合成路線確認，TEX-PDMAEMA、TTP-PDMAEMA和TT-PDMAEMA是合成TrPDMAEMA的中間體，TrPDMAEMA是TT-PDMAEMA進一步氧化得到的最終產(chǎn)物。上述中間體和產(chǎn)物的共同特點是1,3,5-三苯基超支化聚(2-(二甲氨基)乙基》甲基丙烯酸酯，不同點是TEX-PDMAEMA、TTP-PDMAEMA和TT-PDMAEMA的末端取代基團各異，而TrPDMAEMA則是通過TT-PDMAEMA的末端巰基進一步交聯(lián)的產(chǎn)物。同時將TrPDMAEMA和TT-PDMAEMA的細胞轉(zhuǎn)染和細胞毒性試驗果進行分別闡述。3.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA或TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的構(gòu)建體系1:TT-PDMAEMA溶解在醋酸鈉緩沖溶液(pH=4.0)中，將該緩沖溶液與質(zhì)粒基因按一定比例(聚合物中氮原子數(shù)(N)與基因中負電荷數(shù)(P)的比例范圍是0.75-4)混合，溫浴，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。采用相同方法，在醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物體系2:TT-PDMAEMA溶解在磷酸鈉緩沖溶液(pH=7.2)中，將高分子緩沖溶液與質(zhì)粒基因按一定比例(聚合物中氮原子數(shù)(N)與基因中負電荷數(shù)(P)的比例范圍是0.75-4)混合，溫浴，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。采用相同方法，在磷酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物。取上述兩種溶液少量，去離子水透析，用掃描電鏡觀察納米復(fù)合物的形貌。顯示納米復(fù)合物的粒度在80-150nm之間，；電位研究顯示基因納米復(fù)合物帶正電性，易于結(jié)合帶負電性的細胞膜，促進細胞的胞吞作用。4.TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在十二垸基硫酸鈉和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對鹽溶液的穩(wěn)定性用凝膠電泳試驗證明。對比研究裸質(zhì)粒DNA、TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的ln/。十二烷基硫酸鈉(SDS)、TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的水溶液、TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的0.5M氯化鈉溶液、TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1M氯化鈉溶液以及TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1.5M氯化鈉溶液。圖3顯示TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在大于1M氯化鈉溶液或1%十二烷基硫酸鈉溶液中穩(wěn)定性差。5.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA或TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的細胞轉(zhuǎn)染和細胞毒性(1)用細胞綠色熒光蛋白表達試驗研究細胞轉(zhuǎn)染本發(fā)明使用Hela細胞和HEK293T細胞的綠色熒光蛋白表達定量研究轉(zhuǎn)染效果。TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物溶液加入到平面培養(yǎng)的細胞中，轉(zhuǎn)染時間為4h。然后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下計數(shù)細胞綠色熒光蛋白表達。TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物溶液加入到平面培養(yǎng)的細胞中，轉(zhuǎn)染時間為4h。然后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下計數(shù)細胞綠色熒光蛋白表達。(2)細胞毒性試驗在96空板中分別加入TT-PDMAEMA或TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物磷酸鈉緩沖溶液(PBS)，pH=7.2,濃度范圍是10-60ng/ml，孵育24h，除去培養(yǎng)介質(zhì)，加入新鮮培養(yǎng)基和MTT溶液，通過酶標儀檢測Hela細胞和HEK293T細胞的有效性，與空白細胞對照，計算細胞存活率。在96空板中分別加入TrPDMAEMA和TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物磷酸鈉緩沖溶液(PBS)，濃度范圍是10-60嗎/ml，孵育24h，除去培養(yǎng)介質(zhì)，加入新鮮培養(yǎng)基和MTT溶液，通過酶標儀檢測Hela細胞和HEK293T細胞的有效性，與空白細胞對照，計算細胞存活率。試驗表明，這兩種聚合物能夠有效濃縮質(zhì)?；驑?gòu)成納米復(fù)合物，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和Hella細胞的效率在30。/o以上，毒性試驗表明該物質(zhì)毒性低，細胞存活率大于80%。本發(fā)明沒有采用技術(shù)背景中的各種陽離子聚合物通過修飾來提高轉(zhuǎn)染和降低毒性方法，也沒有采用線性結(jié)構(gòu)特點，而是合成具有超支化和類似樹枝結(jié)構(gòu)的端巰基TT-PDMAEMA和含有二硫鍵結(jié)構(gòu)的TrPDMAEMA,具體講，本發(fā)明產(chǎn)物在苯環(huán)的1，3，5-三個位置生成結(jié)構(gòu)可控的超支化的端巰基聚合物，通過二硫鍵交聯(lián)得到的產(chǎn)物更是類似樹枝狀的超支鏈聚合物，形成了與現(xiàn)有技術(shù)報道的聚合物具有完全不同的分子量、[H+]緩沖能力的聚合物。此外，本發(fā)明還研究了TT-PDMAEMA/質(zhì)?；驈?fù)合物和TrPDMAEMA/質(zhì)?；驈?fù)合物的綠色熒光蛋白表達，通過直接轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)，定量評價對細胞的轉(zhuǎn)染效率，并試驗二者在生物學(xué)方面的應(yīng)用，試驗發(fā)現(xiàn)端巰基產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染效率僅僅比二硫鍵交聯(lián)的超支化產(chǎn)物的稍低，也沒有明顯的細胞毒性。本發(fā)明所述的超支化和類似樹枝結(jié)構(gòu)的還原性陽離子聚甲基丙烯酸酯載體及其二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物具有如下具體有益效果1.TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA溶解在pH值4.0醋酸鈉緩沖溶液或pH值7.2磷酸鹽緩沖溶液中，帶正電性，分子骨架中的巰基或二硫鍵易與負電性的細胞膜結(jié)合，促進細胞胞吞的能力。2.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA或TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在上述兩種緩沖溶液中分散性好、結(jié)合基因能力強，轉(zhuǎn)染到細胞之后，還原性二硫鍵能夠在細胞內(nèi)選擇性斷裂，阻止細胞內(nèi)溶酶體破壞基因的能力，有利于基因的釋放。3.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA或TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物能夠高效轉(zhuǎn)染腫瘤細胞和正常細胞，粒徑分布為80-150nm，當濃度達到100嗎/ml時沒有顯著細胞毒性。4.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA或TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在0.5MNaCl溶液中24h內(nèi)穩(wěn)定。圖1:30|ag/mlTrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對HEK293T細胞的體外轉(zhuǎn)染后顯示的綠色熒光蛋白表達。(A)pH:4.0醋酸鈉緩沖溶液，(B)pH^7.2磷酸鈉緩沖溶液。圖2:30pg/mlTTPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對HEK293T細胞的體外轉(zhuǎn)染后顯示的綠色熒光蛋白表達。(A)pH-4.0醋酸鈉緩沖溶液，(B)pH二7.2磷酸鈉緩沖溶液圖3:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物凝膠電泳1是裸質(zhì)粒DNA;2是TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物+ln/。十二垸基硫酸鈉(SDS);3是TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的水溶液；4是TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的0.5M氯化鈉溶液；5是TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1M氯化鈉溶液；6是TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1.5M氯化鈉溶液。具體實施例方式實例1:1，3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯的合成在500ml圓底燒瓶中加入100ml四氯化碳，O.lmoll，3，5-三異丙基苯，0.45mol的N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、20mg過氧化苯甲酰催化劑，回流48h，過濾，飽和碳酸氫鈉洗滌三次，無水硫酸鎂干燥，蒸餾除去溶劑，得到黃色油狀液體，產(chǎn)率85%。將黃色油狀液體加入到100ml氯仿溶劑中，加入0.45md的硫代苯磺酰溴化鎂，回流48h，柱色譜分離，蒸餾除去溶劑，得到1,3,5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯。實例2:1，3，5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯的合成在500ml圓底燒瓶中加入100ml四氯化碳，O.lmoll,3，5-三異丙基苯，0.45molN-溴代琥珀酰亞胺、20mg過氧化苯甲酰催化劑，回流48h，過濾，飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鎂干燥，蒸餾除去溶劑，得到黃色油狀液體，產(chǎn)率80%。將黃色油狀液體加入到100ml氯仿溶劑中，加入乙基黃原酸鈉，回流48h，柱色譜分離，蒸餾除去溶劑，得到1,3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基》苯。實例3:TEX-PDMAEMA的合成在5ml圓底燒瓶中加入DMAEMA(lg)，偶氮二異丁腈(4mg)，1,3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯(80mg)和2ml四氫呋喃，充分去氧，真空密封，放置到60°C水浴中48h。得到l，3，5-端三磺酸酯基聚合物一TEX-PDMAEMA，加入過量己垸沉淀、分離產(chǎn)物。聚合物用&NMR表征，D4-甲醇和D-氯仿為溶劑。實例4:TTP—PDMAEMA的合成在10ml圓底燒瓶中加入DMAEMA(lg),偶氮二異丁腈(4mg)，1,3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯(80mg)和2ml四氫呋喃，充分去氧，真空密封，放置到60°C水浴中48h。得到1，3，5-端三磺酸酯基聚合物一TTP-PDMAEMA,加入過量己垸沉淀、分離產(chǎn)物。聚合物用iHNMR表征，D4-甲醇和D-氯仿為溶劑。實例5:TT-PDMAEMA的合成在100ml圓底燒瓶中加入TTP-PDMAEMA(lg)，8mL四氫呋喃，待TTP-PDMAEMA完全溶解后，充氮氣30min以便除去氧氣。然后上述體系中滴加3-4滴過飽和過硫酸銨水溶液和0.6mL正丁胺，在氮氣保護下攪拌5h。反應(yīng)混合物加入到10倍過量的己垸中，沉淀、過濾，得到TT-PDMAEMA。實例6:還原性TrPDMAEMA的制備方法1在10ml圓底燒瓶中，將0.2mL二甲基亞砜(DMSO)加入到含有0.5gTT-PDMAEMA的去離子水溶液中，攪拌14天。除去水，從DMSO沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。實例7:還原性TrPDMAEMA的制備方法2在10ml圓底燒瓶中，將0.2mLDMSO和0.2mL正丁胺加入到TEX-PDMAEMA甲醇溶液中，在氧氣氣氛中室溫攪拌14天，除去甲醇溶劑，TrPDMAEMA溶解在四氫呋喃中，加入過量己烷沉淀得到。實例8:還原性TrPDMAEMA的制備方法3在10ml圓底燒瓶中，將0.2mLDMSO和0.2mL正丁胺加入到TTP-PDMAEMA甲醇溶液中，在氧氣氣氛中室溫攪拌14天，除去甲醇溶劑，TrPDMAEMA溶解在四氫呋喃中，加入過量己垸沉淀得到。實例9:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)粒基因按N:P比為0.75混合，在5(^C水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例10:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為1.2混合，在50GC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例11:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為2混合，在50QC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例12:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為4混合，在50GC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例13:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TrPDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為0.75混合，在50QC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例14:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TrPDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為1.2混合，在50QC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例15:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TrPDMAEMA與質(zhì)粒基因按N:P比為2混合，在50GC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例16:醋酸鈉緩沖溶液中構(gòu)建TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在醋酸鈉緩沖溶液中TrPDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為4混合，在50GC水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例17:磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為0.75混合，在5(^C水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例18:磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)?；虬碞:P比為1.2混合，在5()Gc水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例19:磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中構(gòu)建TT—PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)粒基因按N:P比為2混合，在5(^C水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例20:磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中構(gòu)建TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中TT-PDMAEMA與質(zhì)粒基因按N:P比為4混合，在5(^C水浴中0.5h，靜止后，用于細胞轉(zhuǎn)染和檢驗細胞毒性。實例21:TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染所有的轉(zhuǎn)染實驗在24孔板完成，轉(zhuǎn)染實驗用HEK293T細胞。每孔中種植50,000細胞，孵育24h后，TT—PDMAEMA與質(zhì)粒DNA的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為3(Vg/ml。首先用150nL10。/。胎牛血清(FBS)的TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物孵育4h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24h，在熒光顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)染效率約30%(如圖2)。實例22:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染所有的轉(zhuǎn)染實驗在24孔板完成，轉(zhuǎn)染實驗用HEK293T細胞。每孔中種植50,000細胞，孵育24h，TrPDMAEMA與質(zhì)粒DNA的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為30叫/ml。用150^L10。/。胎牛血清(FBS)的TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物孵育4h，再加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24h，在熒光顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)染效率約40%(如圖l)。實例23:TT-PDMAEMA對HEK293T細胞的毒性兩萬個HEK293T細胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT—PDMAEM濃度依次為10，20，30和50(^g/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20MTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，細胞存活率均在78%以上。實例24:TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對HEK293T細胞的毒性兩萬個HEK293T細胞種植在96孔板中，孵育24h，在100|aLDMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為10，20，30和50|ag/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，細胞存活率均在82%以上。實例25:TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對Hela細胞的毒性兩萬個Hela細胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為10，20,30和50嗎/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，加入lOOiaL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，細胞存活率均在82%以上。實例26:TT-PDMAEMA對Hela細胞的毒性兩萬個Hela細胞種植在96孔板中，孵育24h，在100pLDMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為10，20，30和50ng/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20MTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，加入100nL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，細胞存活率均在82%以上。實例27:TrPDMAEMA對HEK293T細胞的毒性兩萬個HEK293T細胞種植在96孔板中，孵育24h,在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA濃度依次為10，20，30和100嗎/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h,加入100nL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，每孔的細胞存活率均在85%以上。實例28:TrPDMAEMA對Hela細胞的毒性兩萬個Hela細胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA濃度依次為10，20,30和100嗎/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每孔分別加入20MTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，每孔的細胞存活率均在85%以上。實例29:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對HEK293T細胞的毒性兩萬個HEK293T細胞種植在％孔板中，孵育24h，100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為10，20，30和100嗎/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100nL新鮮DMEM代替，每孔加入20MTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，每孔分別加入100nL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，每孔細胞存活率均在90%以上。實例30:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對Hela細胞的毒性兩萬個Hela細胞種植在96孔板中，孵育24h，100DMEM(Dulbecco，smodifiedeagle'smedium)/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為10，20，30和100嗎/ml，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100pL新鮮DMEM代替，每孔加入20nLMTT。在37。C，C02培養(yǎng)箱中細胞孵育4h，每孔分別加入lOOpL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細胞的有效性，每孔細胞存活率均在90%以上。實例31.TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在十二烷基硫酸鈉和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性50ng/ml的TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對鹽溶液的穩(wěn)定性用凝膠電泳試驗證明。凝膠電泳條孔中依次加入裸質(zhì)粒DNA;TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1%十二垸基硫酸鈉；TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的水溶液；TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的0.5M氯化鈉溶液；TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1M氯化鈉溶液以及TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1.5M氯化鈉溶液，顯示TT-PDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在0.5M氯化鈉溶液中24h穩(wěn)定。實例32.TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在十二烷基硫酸鈉和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性50ng/ml的TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對鹽溶液的穩(wěn)定性用凝膠電泳試驗證明(如圖3)。凝膠電泳條孔中依次加入裸質(zhì)粒DNA;TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1%十二烷基硫酸鈉；TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的水溶液；TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的0.5M氯化鈉溶液；TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1M氯化鈉溶液以及TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1.5M氯化鈉溶液。顯示TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在0.5M氯化鈉溶液中24h穩(wěn)定。實例33:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對小鼠肺的體內(nèi)轉(zhuǎn)染TrPDMAEMA與質(zhì)粒DNA的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為30iag/ml。對小鼠進行器官滴注TrPDMAEMA與質(zhì)粒DNA復(fù)合物，48h后處死小鼠，取小鼠肺進行切片，在熒光顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)染效率約40%。實例34:TrPDMAEMA/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對小鼠脊髓內(nèi)鞘細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)染TrPDMAEMA與質(zhì)粒DNA的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為30pg/ml。對小鼠脊髓內(nèi)鞘內(nèi)注射TrPDMAEMA與質(zhì)粒DNA復(fù)合物，48h后處死小鼠，對小鼠脊髓切片，在熒光顯微鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)染效率約40%。實例35:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)納米復(fù)合物對小鼠脾細胞的免疫活性TrPDMAEMA與CpG-ODN的N:P比例為0.75，質(zhì)量濃度為30ing/ml。小鼠脾細胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN復(fù)合物孵育3天，免疫活性增加23%。實例36:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)納米復(fù)合物對鼠胰腺細胞的免疫活性TrPDMAEMA與CpG-ODN的N:P比例為L2，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。小鼠脾細胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN復(fù)合物孵育3天，免疫活性增加27%。實例37:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)納米復(fù)合物對鼠胰腺細胞的免疫活性TrPDMAEMA與CpG-ODN的N:P比例為2，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。小鼠脾細胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN復(fù)合物孵育3天，免疫活性增加31%。實例38:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)納米復(fù)合物對鼠胰腺細胞的免疫活性TrPDMAEMA與CpG-ODN的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為30pg/ml。小鼠脾細胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN復(fù)合物孵育3天，免疫活性增加35%。文獻A.M.Funhoff，C.F.vanNostrum,M.C.Lok,J.A.Kruijtzer,D丄Crommelin,W.E.HenninkCationicpolymethacrylateswithcovalentlylinkedmembranedestabilizingpeptidesasgenedeliveryvectors,J.Control.Release2005,101(1—3):233-246.P.VanDeWetering,J.Y.Chemg,H.Talsma,D.J.A.Crommelin，W.E.Hennink，2陽(dimethylamino)ethylmethacrylatebased(co)polymersasgenetransferagents,J.Control-Release1998,53，145-153.P.VanDeWetering,J.Y.Cherng,H.Talsma,W.E.Hennink,Relationbetweentransfectionefficiencyandcytotoxicityofpoly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate)/plasmidcomplexes,J.Control.Release1997,49,59-69.R.A.Jones,M.H.Poniris,M.R.Wilson,pDMAEMAisinternalisedbyendocytosisbutdoesnotphysicallydisruptendosomes,J.Control.Release2004，96(3)379—391Y.Z.You,D.S.Manickam，Q.H.Zhou,D.Oupick》，Reduciblepoly(2-dimethylaminoethylmethacrylate):Synthesis,cytotoxicity,andgenedeliveryactivity,J.Control.Release2007,122,217-225J.Kloeckner,E.Wagner,M.Ogris,Degradablegenecarriersbasedonoligomerizedpolyamines，Eur.J.Pharm.Sci.2006,29(5)，414425C.Lin，Z.Zhong,M.C.Lok,X.Jiang,W.E.Hennink,J.Feijen,J.F.Engbersen,Novelbioreduciblepoly(amidoamine)sforhighlyefficientgenedelivery,Bioconjug.Chem.2007,18(1),138-145L.V.Christensen,C.W.Chang,W丄Kim,S.W.Kim,Z.Zhong，C.Lin，J.F.Engbersen,J.Feijen，Reduciblepoly(amidoethylenimine)sdesignedfortriggeredintracellulargenedelivery,Bioconjug.Chem.2006，17(5)，1233—1240權(quán)利要求1、一種還原性聚甲基丙烯酸酯，其特征在于，所述的還原性聚甲基丙烯酸酯為TT—PDMAEMA，其分子結(jié)構(gòu)式如下用凝膠色譜表征，TT-PDMAEMA的數(shù)均摩爾質(zhì)量為3500-4500g/mol，聚分散系數(shù)為1.01-1.25。2、如權(quán)利要求1的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法如下a.2-二甲氨基-甲基丙烯酸酯的可逆加成-斷裂鏈遷移聚合，在四氫呋喃溶劑中加入DMAEMA、偶氮二異丁腈引發(fā)劑，RAFT試劑，充分去氧，真空密封，60°C水浴中反應(yīng)，加入過量己烷沉淀、分離產(chǎn)物；b.將步驟a獲得的產(chǎn)物溶解在四氫呋喃溶液中，加入數(shù)滴過硫酸銨溶液，充氮氣30min后，加入正丁胺，在氮氣保護下攪拌，反應(yīng)混合物加入過量己垸沉淀、過濾，即得到TT-PDMAEMA。3、如權(quán)利要求2的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法，其特征在于，所述的RAFT試劑為1,3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯時，步驟a獲得的產(chǎn)物為TEX-PDMAEMA:1，3，5-三(2-(硫代苯磺?；?2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯。4、如權(quán)利要求2的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法，其特征在于，所述的RAFT試劑為1,3,5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯時，步驟a獲得的產(chǎn)物為TTP-PDMAEMA:1，3，5-三(2-(黃原酸乙酯基-2-丙基))苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯。5、如權(quán)利要求1的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因納米復(fù)合物的激光光散射參數(shù)為<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>其中*根據(jù)d^3Mw/(4p隊R/)計算林估計的每個復(fù)合物的DNA分子平均數(shù)。6、如權(quán)利要求5的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因納米復(fù)合物的構(gòu)建方法如下TT-PDMAEMA溶解在緩沖溶液中，將該緩沖溶液與質(zhì)?；虬匆欢ū壤?，聚合物中氮原子數(shù)與基因中負電荷數(shù)的比例范圍是N:P=0.75-4，混合，溫浴，靜止。7.如權(quán)利要求6的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖溶液為pH=4.0的醋酸鈉緩沖溶液。8.如權(quán)利要求6的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖溶液為pH=7.2的磷酸鈉緩沖溶液。9、一種權(quán)利要求1的還原性聚甲基丙烯酸酯，其特征在于二硫鍵交聯(lián)的還原性陽離子產(chǎn)物TrPDMAEMA的分子結(jié)構(gòu)式為-用凝膠色譜表征，其數(shù)均摩爾質(zhì)量為16500-35700g/mo1,聚分散系數(shù)為2.5-4.5，對[H+]緩沖容量在2.4-3.9Mmol/mg。10.如權(quán)利要求9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法如下-在TT-PDMAEMA的去離子水溶液中加入二甲基亞砜，攪拌，除去水后，沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。11.如權(quán)利要求9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法如下-在溶解TEX-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亞砜和正丁胺，在室溫條件下，該混合物溶液在氧氣氣氛中攪拌13-15天，然后蒸餾除去甲醇，將剩余混合物溶液溶解在四氫呋喃中，加入10倍體積比的過量的己垸溶劑中沉淀、過濾，并千燥得到TrPDMAEMA。12.如權(quán)利要求9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯的制備方法如下在溶解TTP-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亞砜和正丁胺，在室溫條件下，該混合物溶液在氧氣氣氛中攪拌13-15天，然后蒸餾除去甲醇，將剩余混合物溶液溶解在四氫呋喃中，加入10倍體積比的過量的己烷溶劑中沉淀、過濾，并干燥得到TrPDMAEMA。13.如權(quán)利要求9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因納米復(fù)合物的激光光散射參數(shù)為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>其中，*根據(jù)d:3Mw/(4pNAR/)計算**估計的每個復(fù)合物的DNA分子平均數(shù)。14.如權(quán)利要求9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因納米復(fù)合物的構(gòu)建方法如下TrTOMAEMA溶解在緩沖溶液中，將該緩沖溶液與質(zhì)?；虬匆欢ū壤?，聚合物中氮原子數(shù)N與基因中負電荷數(shù)P的比例范圍是0.75-4,混合，溫浴，靜止。15.如權(quán)利要求14的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖溶液為pH=4.0的醋酸鈉緩沖溶液。16.如權(quán)利要求14的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖溶液為pH=7.2的磷酸鈉緩沖溶液。17.如權(quán)利要求1或9的一種還原性聚甲基丙烯酸酯在基因治療中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及還原性陽離子聚甲基丙烯酸酯及其制備方法和此聚甲基丙烯酸酯在基因納米復(fù)合物構(gòu)建中的應(yīng)用及此聚甲基丙烯酸酯在基因治療的應(yīng)用。本發(fā)明以1，3，5-三異丙基苯為原料，與N-溴代琥珀酰亞胺、乙基黃原酸鉀反應(yīng)，得取代的1，3，5-三異丙基苯基乙基黃原酸酯，偶氮二異丁腈催化與2-(二甲氨基乙基)甲基并丙烯酸酯通過可逆加成-斷裂鏈遷移聚合、氨解和氧化反應(yīng)得—聚[1，3，5-三端巰基(2-丙基苯基-2-(二甲氨基)乙基)]甲基丙烯酸酯]及其二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。此聚甲基丙烯酸酯能濃縮質(zhì)粒基因成納米復(fù)合物，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和Hella細胞效率在30％以上，毒性低，細胞存活率大于80％。文檔編號A61K48/00GK101429260SQ20081004197公開日2009年5月13日申請日期2008年8月22日優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日發(fā)明者于伯章,李文新,馬繼飛申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所