專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種防治肌萎縮側(cè)索硬化的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及同型半胱氨酸下調(diào)劑在制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物中的用途。
背景技術(shù)：
：肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性死亡導(dǎo)致的疾病，約20%的家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(FALS)與銅/鋅超氧化物歧化酶(S0D1)基因突變有關(guān)。過(guò)表達(dá)突變S0D1基因的模型小鼠表現(xiàn)出與肌萎縮側(cè)索硬化患者相似的臨床表現(xiàn)，因此被廣泛用于疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。肌萎縮側(cè)索硬化作為一種致命的神經(jīng)退行性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制仍未清楚，目前研究證實(shí)，谷氨酸的興奮性氨基酸毒性作用，氧化應(yīng)激，線粒體功能異常，蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊等與肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)病有著密切的關(guān)系。肌萎縮側(cè)索硬化與其它神經(jīng)退行性疾病如帕金森癥或阿爾茨海默癥相比，發(fā)病機(jī)制不盡相同，其下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元更易受累，且進(jìn)展迅速。因肌萎縮側(cè)索硬化的病因和發(fā)病機(jī)制仍未清楚，到目前為止，本領(lǐng)域仍然缺乏對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化的特異有效的治療方法。因此研發(fā)特異性的肌萎縮側(cè)索硬化治療方法是目前研究中亟待解決的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供同型半胱氨酸下調(diào)劑在制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種同型半胱氨酸下調(diào)劑的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的肌萎縮側(cè)索硬化是家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化。在另一優(yōu)選例中，所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B2的混合物。在另一優(yōu)選例中，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):1。較佳的，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):h更佳地，葉酸與維生素B12的重量比例是(15-25):1。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于抑制炎癥反應(yīng)或抑制細(xì)胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥反應(yīng)是炎癥因子過(guò)量引起的炎癥反應(yīng)；或所述的細(xì)胞凋亡是凋亡蛋白水平過(guò)高或抗凋亡蛋白水平過(guò)低引起的細(xì)胞凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于降低脊髓內(nèi)炎癥因子的水平；降低脊髓內(nèi)凋亡蛋白的水平；提高脊髓內(nèi)抗凋亡蛋白的水平；或保護(hù)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥因子包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)或腫瘤壞死因子a(TNF-a)。在另一優(yōu)選例中，所述的凋亡蛋白包括剪切型胱冬肽酶3(CleavedCaspase-3)，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(CleavedPRAP)的水平。在另一優(yōu)選例中，所述的抗凋亡蛋白包括B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物，所述的組合物含有有效量的同型半胱氨酸下調(diào)劑，以及藥學(xué)上可接受的載體；其中，所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑是葉酸和維生素B12的混合物，含有葉酸5-80重量份；維生素B12:l重量份。在另一優(yōu)選例中，所述的混合物中，含有葉酸10-40重量份；維生素B12:l重量份。更佳的，所述的混合物中，含有葉酸15-25重量份；維生素B12:l重量份。在另一優(yōu)選例中，葉酸和維生素B12的混合物占組合物總重量的5-100y。；較佳的10-60%。在本發(fā)明的第三方面，提供一種預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的方法，給予需要的受試者有效量的同型半胱氨酸下調(diào)劑。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1.葉酸和維生素B12對(duì)S0D1-G93A小鼠發(fā)病時(shí)間和生存周期的影響。Kaplan-Meier生存分析的曲線表示了四組實(shí)驗(yàn)小鼠(SOD1組，B12-SOD1組，F(xiàn)A-SOD1組禾卩FA+B12-SOD1組，每組小鼠數(shù)量n二9)發(fā)病時(shí)間(A)和生存周期(B)的變化。圖2.實(shí)驗(yàn)小鼠120天時(shí)經(jīng)LC--MS/MS檢測(cè)的Hcy水平。數(shù)據(jù)顯示SOD1組小鼠Hcy的含量明顯高于WT組，而FA-SOD1組和FA+B12-SOD1小鼠Hcy水平比SOD1組則顯著降低。數(shù)據(jù)為平均數(shù)土SEM，*尸<0.01**尸<0.001(和WT組相比)，#尸<0.01(和SOD1組相比)每組小鼠n二8。圖3.葉酸及維生素B12對(duì)S0D1-G93A小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。(A)五組實(shí)驗(yàn)小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；其中，(a)WT組，(b)SODl組，(c)B12-SOD1組，(d)FA-SOD1組，(e)FA+B12-SOD1組。(B)五組小鼠脊髓L4-5段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM，由ANOVA分析所得。*尸<0.01，**尸<0.001(和WT組相比)，#尸<0.01(和SOD1組相比)每組小鼠n二3。Bar二100um。圖4.葉酸和維生素B12對(duì)小鼠脊髓前角膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。CDllb和GFAP作為標(biāo)記分別觀察小鼠脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞(紅)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(綠)的數(shù)目和狀態(tài)。每組n-3，Bar-30ixm。圖5.葉酸和維生素B12對(duì)小鼠脊髓組織內(nèi)炎癥相關(guān)因子和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響。(A)五組實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓組織內(nèi)炎癥相關(guān)因子iNOS和TNF-a水平變化。(B)五組實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白水平的變化。(C-G)五組實(shí)驗(yàn)組小鼠iNOS，TNF-a，Bcl-2，剪切型Caspase-3及剪切型PRAP的定量數(shù)值。其中，*尸<0.01，(和WT組相比)，#尸<0.01，##P<0.001(和SOD1組相比)每組n=3，數(shù)值為平均值土SEM。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)在肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物的血漿中同型半胱氨酸(Hcy)的含量顯著上升；并且意外地發(fā)現(xiàn)采用同型半胱氨酸下調(diào)劑，特別是葉酸和維生素B12的混合物，可非常有效地緩解哺乳動(dòng)物的肌萎縮側(cè)索硬化；并且本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，葉酸和維生素B12的混合物可非常有效地降低哺乳動(dòng)物脊髓內(nèi)炎癥因子的水平，降低脊髓內(nèi)凋亡蛋白的水平，提高脊髓內(nèi)抗凋亡蛋白的水平，有效地發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)以及抗凋亡的作用。同型半胱氨酸及其下調(diào)劑同型半胱氨酸是一種具有細(xì)胞毒性作用的含硫氨基酸，是由甲硫氨酸通過(guò)脫甲基作用產(chǎn)生的，其在機(jī)體內(nèi)代謝的平衡是幾方面共同作用的結(jié)果，而其降解轉(zhuǎn)化主要通過(guò)以下兩種途徑一是通過(guò)再甲基過(guò)程轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸；二是在胱硫醚-0-合酶的作用下轉(zhuǎn)化為胱硫醚(Cystathkmine)。同型半胱氨酸存在多種下調(diào)劑，包括維生素B6等。通過(guò)直接或間接途徑下調(diào)體內(nèi)同型半胱氨酸的物質(zhì)(如減少體內(nèi)同型半胱氨酸產(chǎn)生的物質(zhì)，促進(jìn)體內(nèi)同型半胱氨酸代謝為無(wú)毒產(chǎn)物的物質(zhì)等)均可用于本發(fā)明，用于降低體內(nèi)同型半胱氨酸的水平。作為本發(fā)明優(yōu)選的方式，所述的下調(diào)劑是(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。特別優(yōu)選的，所述的下調(diào)劑是葉酸和維生素B12的混合物。所述的葉酸或維生素B12也可以以被取代的形式存在。例如所述的葉酸可以是四氫葉酸，甲基四氫葉酸。四氫葉酸可在甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆臍淙~酸。甲基四氫葉酸可以提供甲基在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下使同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?，完成同型半胱氨酸的甲基化作用。葉酸的含量及甲基四氫葉酸的含量對(duì)同型半胱氨酸的水平有著直接的影響。而維生素B12作為甲基轉(zhuǎn)移酶的輔酶，促進(jìn)同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)變過(guò)程。所述的葉酸或維生素B12也可以以"生理學(xué)可接受的鹽"或"生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽"形式使用。所述的鹽包括(但不限于)與如下無(wú)機(jī)酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及與有機(jī)酸形成的鹽，而有機(jī)酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來(lái)酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的"前體藥物"的形式(當(dāng)以這種形式給藥時(shí)，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):l;較佳的，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):1;更佳的，葉酸與維生素B12的重量比例是(15-25):1。用途本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)在肌萎縮側(cè)索硬化模型小鼠血漿內(nèi)同型半胱氨酸水平明顯高于正常對(duì)照組小鼠，從而提示同型半胱氨酸對(duì)于肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)生或發(fā)展有重要的影響作用。進(jìn)一步深入的研究發(fā)現(xiàn)，葉酸和維生素B12的混合物可非常有效地緩解哺乳動(dòng)物的肌萎縮側(cè)索硬化。本發(fā)明人將模型小鼠隨機(jī)分成生理鹽水組(S0D1組)，葉酸用藥組(FA-S0D1組)，維生素B12用藥組(B12-S0D1組)及葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組(FA+B12-S0D1組)，小鼠六周起用藥，直至死亡。Rotarod檢測(cè)和生存時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥能夠顯著延緩疾病的發(fā)生，延長(zhǎng)模型小鼠的生存時(shí)間。免疫組化和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果說(shuō)明，葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥能夠明顯抑制模型小鼠脊髓中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低其脊髓中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)的蛋白水平。此外葉酸用藥及葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥還可明顯抑制凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3和剪切型PARP的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。因此，基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種同型半胱氨酸下調(diào)劑的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物。所述的肌萎縮側(cè)索硬化是家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化。所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑優(yōu)選地選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑可用于抑制炎癥反應(yīng)或抑制細(xì)胞凋亡。所述的炎癥反應(yīng)是體內(nèi)炎癥因子過(guò)量引起的炎癥反應(yīng)；所述的細(xì)胞凋亡是體內(nèi)凋亡蛋白水平過(guò)高或抗凋亡蛋白水平過(guò)低引起的細(xì)胞凋亡。所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑可用于降低脊髓內(nèi)炎癥因子的水平。優(yōu)選地，所述的炎癥因子包括iNOS或TNF-a。所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑可用于降低脊髓內(nèi)凋亡蛋白的水平。優(yōu)選地，所述的凋亡蛋白包括剪切型(Cleaved)Caspase-3，或剪切型(Cleaved)PRAP。所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑可用于提高脊髓內(nèi)抗凋亡蛋白的水平。優(yōu)選地，所述的抗凋亡蛋白包括Bcl-2。組合物如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、剌激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的組合物"包括但不限于藥物組合物、食物組合物或保健品組合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配制本發(fā)明的組合物的各組分的用量如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>較佳地，在組合物中，葉酸和維生素B12的混合物占組合物總重量的5-100%;更佳的10-60%。對(duì)于本發(fā)明所述的組合物的劑型沒(méi)有特別的限制，可以是任何適用于哺乳動(dòng)物服用的劑型；優(yōu)選的，所述的劑型可選自口服液、混懸液、膠囊劑、顆粒劑、片劑、丸劑、或乳劑。本發(fā)明的組合物中可以加入制備不同劑型時(shí)所需要的各種常規(guī)載體或輔料，如填充劑(如淀粉)、矯味劑(如甜菊素)、抗氧化劑、或包衣材料等?？刹捎贸Ｒ?guī)的方法制備成任何一種常用的劑型，如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑。本發(fā)明的混合物或組合物的用量可隨給予的模式、劑型和受試者的患病嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的組合物每天以約0.0001lg/kg動(dòng)物體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以14次分開(kāi)的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天的總劑量約為0.00550g，較佳地約為0.0220g?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療效果。例如，由治療狀況的需要，可每天分開(kāi)給予若干次的單一劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮施用方式、施用對(duì)象的身體狀況等因素，這些都是本領(lǐng)域技能范圍之內(nèi)的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。I.材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶人源突變的銅/鋅超氧化物歧化酶(S0D1)(G93A突變體)的轉(zhuǎn)基因小鼠(B6SJL-TgN[SODl-G93A]lGur，編號(hào)002726)購(gòu)自美國(guó)JacksonLaboratory(Barharbor，ME，U.S.A)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠的保種和繁殖方法為一個(gè)野生型母鼠和一個(gè)轉(zhuǎn)基因公鼠交配，其子代用幼鼠的鼠尾抽提獲得的DNA通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定。動(dòng)物分組和給藥48只S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為四組(1)0.9。/。生理鹽水灌胃組(SODl組，n-12);(2)4mg葉酸/kg體重/天灌胃用藥組(FA-SODl組，n=12);(3)0.2mg維生素B12/kg體重/天灌胃用藥組(B12-SODl組，n=2);(4)4mg葉酸和0.2mg維生素B12/kg體重/天聯(lián)合用藥組(FA+B12-SODl組，n=12)。所有小鼠自出生42天(6周)開(kāi)始每天給藥，直至死亡。其中36只轉(zhuǎn)基因小鼠(SODl組，n=9;FA-SODl組，n=9;B12-SOD1組，n=9;FA+B12-SOD1組，n=9)用于小鼠發(fā)病時(shí)間的判定及小鼠生存周期的觀測(cè)。其余的轉(zhuǎn)基因小鼠用于免疫組化和蛋白質(zhì)印跡樣本的制作。同時(shí)，10只與S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠同窩的野生型小鼠用于制作免疫組化和蛋白質(zhì)印跡時(shí)的對(duì)照樣本(即正常對(duì)照組，WT)。運(yùn)動(dòng)能力的評(píng)測(cè)和生存周期的觀測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的評(píng)測(cè)從70天開(kāi)始。在Rotarod儀器上(4cm直徑，20rpm轉(zhuǎn)速)，小鼠先練習(xí)5天使之習(xí)慣次運(yùn)動(dòng)并同時(shí)得到一個(gè)基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)值。記錄小鼠在儀器上停留的時(shí)間(5分鐘為上限)。每隔一天測(cè)定一次，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取其最好成績(jī)記錄。疾病發(fā)生定義為如小鼠在Rotarod儀器上停留的時(shí)間小于5分鐘，則該天記錄為小鼠疾病發(fā)生的時(shí)間。S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠疾病發(fā)生后逐漸表現(xiàn)出靜止性震，發(fā)展性步態(tài)不穩(wěn)，隨之雙下肢出現(xiàn)偏惻或雙惻的肢體癱瘓，疾病最后階段則完全癱瘓，不能自主進(jìn)食。從倫理學(xué)講應(yīng)在其不能自主進(jìn)食前將其處死，而轉(zhuǎn)基因小鼠的死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為將小鼠側(cè)臥放置，如其不能在30秒內(nèi)翻身為正常姿態(tài)者，判斷其死亡，該天記錄為小鼠的死亡時(shí)間。血漿同型半胱氨酸的測(cè)定A.樣本的制備1.樣品制備準(zhǔn)確吸取50|til血漿樣品于1.5ml離心管中，分別加入50|iil內(nèi)標(biāo)液(DL-高胱胺酸-D8)和50^1還原劑(l,4-二硫蘇糖醇)，混勻。室溫放置30分鐘，加入5(V1蛋白沉淀齊U(三氯醋酸)，窩旋混合30秒，高速離心15,000rpmX3分鐘，吸取上清液供色譜進(jìn)行分析。2.標(biāo)準(zhǔn)品制備準(zhǔn)確吸取5pl對(duì)照液(DL-同型半胱氨酸)，加入45ial稀釋液(小牛血清水溶液)稀釋后，與血漿樣品同樣的處理方法處理，得到的上清供色譜分析所用。B.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-MS/MS分析)1.色譜條件色譜柱為十八垸基硅烷鍵合硅膠填充；流動(dòng)相為0.02%甲酸的甲醇溶液-0.02%甲酸的水溶液(10:90)，流速0.20ml/min;柱溫為25。C;進(jìn)樣量為5|il。2.質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；MRM掃描分析，Ql/Q3離子通道分別選擇為m/z:136—90amu(Hcy)和140—94amu(內(nèi)標(biāo))。離子源參數(shù)包括霧化氣流速0.48MPa，氣簾氣流速0.52MPa，碰撞氣流速0.40MPa;離子源電壓2500V，離子源溫度450°C。3.樣品測(cè)定取處理好的對(duì)照品、質(zhì)控品和測(cè)定樣品溶液各5/xl注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖。4.結(jié)果計(jì)算以3個(gè)對(duì)照品的標(biāo)示濃度(5、15、45nmol/L)為橫坐標(biāo)(x)，以3個(gè)對(duì)照品的實(shí)際測(cè)定峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將測(cè)定樣本同型半胱氨酸峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算測(cè)定樣本同型半胱氨酸濃度。脊髓切片和尼氏染色分析轉(zhuǎn)基因小鼠(S0D1組，n=3;FA-SOD1組，n=3;B12-S0D1組，n=3;FA+B12-S0D1組，n=3)和野生型小鼠(n=3)在120天時(shí)被隨機(jī)挑選出來(lái)做脊髓樣本的采集。小鼠用10%水合氯醛深度麻醉后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟灌流10分鐘。一部分小鼠的脊髓(L4-L5段)用于組織病理學(xué)分析和免疫組織化學(xué)分析。脊髓取出后，浸泡于4%的多聚甲醛中4匸過(guò)夜，隨后用5%，30%的蔗糖溶液4°〇分別處理24小時(shí)。另一部分脊髓(Cl-L3段)用于蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)，其取出后迅速置于液氮中。脊髓L4-L5段經(jīng)上述處理后，用OCT包被，冰凍于-8(TC冰箱。脊髓連續(xù)切片的厚度為10|am，切片被貼到明膠(1%)包被過(guò)的載玻片上。為了計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，脊髓L4-L5段連續(xù)切片200張，每3張切片取1張做尼氏染色處理(1%甲苯胺藍(lán)染色，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片)。處理好的切片用顯微鏡明視野拍照后，計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)為(l)計(jì)數(shù)的目的神經(jīng)元所在的區(qū)域?yàn)榧顾枨敖遣糠?，中央?centralcanal)以上的部分。(2)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的直徑在20|am以上。(3)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有明顯的細(xì)胞核。脊髓切片的免疫組化分析脊髓切片(L4-L5段)分別用一抗CDllb(l:100'Serotec，Oxford,UK)，GFAP(1:2000，Sigma,St.Louis,MO，USA)來(lái)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)的狀態(tài)。同時(shí)為排除假陽(yáng)性，部分切片用單一的二抗處理，觀察。免疫組化的具體步驟如下1.0.01MPBS洗2X5min后，繼以1%&02室溫處理10min。2.封閉4。C1小時(shí)(PBS含4。/。血清，0.3%Triton-X-100，0.05%疊氮鈉)3.—抗CDllb或GFAP4。C孵育過(guò)夜(CDllb:1:100;GFAP:1:2000)。4.0.01MPBS洗3X5min后，二抗(熒光素標(biāo)記，分別為cy3:1:1000;FITC:1:200)室溫孵育2h。5.0.01MPBS洗3X5min后，終止反應(yīng)，顯微鏡下觀察，拍照。蛋白免疫印跡分析(Westernblot)蛋白樣本從液氮中取出，置于RIPA裂解液中(50MmTris-CLPh7.4，l%NP-40，0.25。/。Na-脫氧膽酸鹽(deoxycholate)，150mMNacl，lmMEDTA，lmMPMSF，lpg/ml抑肽酶(Aprotinin)，lfig/ml亮肽素(Leupeptin)，lpg/ml抑肽素(Pepstatin))。超聲破碎1分鐘。12，000rpm，4。C離心，15分鐘，取上清。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液(TBST+5。/。脫脂奶粉)，PVDF膜室溫封閉1小時(shí)。PVDF膜覆于一抗(iNOS，1:5000，chemicon，CA，USA;TNF-a，1:1000，cellsignaling,MA，USA;Bcl-2，l細(xì)0，SantaCruzBiotechnology,INC，SantaCruz;cleavedCaspase3，1:1000,SantaCruzBiotechnology,INC，SantaCruz;PARPandcleavage,1:1000，Cellsignaling,MA;USA,P隱actin，1:4000，Cellsignaling,MA，USA)4。C孵育過(guò)夜。二抗(抗兔HRP相連的IgG，1:2000;抗鼠HRP相連的IgG，1:2000，Pierce),室溫孵育2小時(shí)。采用化學(xué)發(fā)光法(SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate,Pierce;ILU.S.A)。顯影于X膠片，顯影，定影后使用Bio-Rad，QuantityOne-4.2.0圖象分析系統(tǒng)對(duì)Westernblot結(jié)果迸行灰度分析，從而對(duì)蛋白條帶的密度進(jìn)行定量；每個(gè)樣品的免疫印跡蛋白條帶與同一樣品的e-actin相比較后得出一個(gè)密度比，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析小鼠發(fā)病時(shí)間和生存周期數(shù)據(jù)使用Kaplan-Meier生存分析(SPSS13.0)，通過(guò)log-rank試驗(yàn)可得到一個(gè)x2值用于確定數(shù)據(jù)的差異性。其余數(shù)據(jù)使用ANOVA進(jìn)行檢測(cè)，若得到的尸值小于0.05則認(rèn)為數(shù)值之間差異明顯。所有的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式表示。II.實(shí)施例實(shí)施例1.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥延緩SOD1-G93A模型小鼠的發(fā)病時(shí)間，延長(zhǎng)小鼠壽命S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病癥狀與ALS患者的臨床表現(xiàn)十分相似，表現(xiàn)為漸進(jìn)性的肌無(wú)力，肌萎縮，直至癱瘓和死亡，病理標(biāo)志為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性退行性病變。在實(shí)施例中，本發(fā)明人采用了Rotarod儀器檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，以此作為評(píng)價(jià)疾病發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。通過(guò)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，葉酸灌胃的FA-SOD1組小鼠比生理鹽水灌胃的SOD1組小鼠其平均發(fā)病時(shí)間延緩了7天(114.4±1.7天(FA-SOD1)vs107.9士1.8天(SODl)，x2=6.33，尸<0.05)，F(xiàn)A+B12-SOD1組比SOD1組小鼠發(fā)病時(shí)間延緩了9天(116.3士2.0天(FA+B12-SOD1)vs107.9±1.8天(SODl)，x2=8.989，尸<0.05)，而維生素B12單獨(dú)使用對(duì)小鼠的發(fā)病則無(wú)明顯延緩(109.4士1.7天(B12-SODl)vs107.9±1.8天(SODl)，x2=0.015，尸〉0.05)，見(jiàn)14圖1A。本發(fā)明人通過(guò)檢測(cè)發(fā)病晚期小鼠的翻身情況確定小鼠的生存周期，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，葉酸灌胃的FA-S0D1組小鼠比生理鹽水灌胃的S0D1組小鼠其平均生存周期延長(zhǎng)了9天(137.7士1.9天(FA-S0D1)vs128.8±3.4天(S0D1)，x2=3.95，尸<0.05)，F(xiàn)A+B12-S0D1組比S0D1組小鼠平均生存周期延長(zhǎng)了13天(141.4±2.9天(FA+B12-SODl)vs128.8±3.4天(SODl)，x2=5.0，PO.05),而維生素B12單獨(dú)給藥仍無(wú)明顯作用(132.3il.9天(B12-SODl)vs128.8±3.4(S0D1)，x2=0.015，尸>0.05)，見(jiàn)圖1B。實(shí)施例2.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥降低小鼠血漿同型半胱氨酸水平鑒于同型半胱氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，且可能在S0D1-G93A小鼠體內(nèi)造成神經(jīng)退行性病變，測(cè)定各組模型小鼠和野生型小鼠血漿內(nèi)的Hcy水平以定量其變化顯的尤為重要。根據(jù)LC-MS/MS的結(jié)果，本發(fā)明人看到120天的SOD1組小鼠和野生型小鼠(WT)之間血柴Hcy水平存在顯著的差別(6.84土0.4pmol/L(SODl)vs3.8±0.26pmol/L(WT)，/^0.001)，S0D1組小鼠Hcy含量幾乎是野生型小鼠的兩倍。而葉酸用藥或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組小鼠血漿Hcy則分別下降了61%或69%(4.98±0.38/amol/L(FA-SODl)，4.75±0.67famol/L(FA+B12-SODl)vs6.84±0.4pmol/L(SODl)，尸<0.01)。維生素B12單獨(dú)使用組Hcy水平則只有微弱的，無(wú)顯著差異的下降(6.56士0.8|amol/L(B12-SODl)vs6.84±0.4nmol/L(SODl)在S0D1組，尸>0.05),見(jiàn)圖2。結(jié)果說(shuō)明，S0D1-G93A模型小鼠血漿內(nèi)Hcy水平明顯高于野生型小鼠，而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥則可以顯著降低模型小鼠血漿Hcy水平。實(shí)施例3.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥減少脊髄運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變導(dǎo)致S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生疾病的直接因素為脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性變。本實(shí)施例中，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)各組轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓(L4-5)前角組織切片，尼氏染色，顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，120天SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目明顯下降(219.67±21.32個(gè)(S0D1)vs792±40.07個(gè)(WT);n=3;尸O.OOl)，見(jiàn)圖3A中a和b。而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以有效保護(hù)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，使疾病晚期(120天)小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的數(shù)目明顯增多，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞體也較生理鹽水組明顯增大(383.5土24.43個(gè)(FA-S0D1)，413.67±32.48個(gè)(FA+B12國(guó)S0D1)vs219.67±21.32個(gè)(S0D1);n=3;尸<0.01)，見(jiàn)圖3A中d和e。而維生素B12單獨(dú)用藥對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活則無(wú)明顯的保護(hù)作用(248土24.49個(gè)(B12-S0D1)vs219.67±21.32個(gè)(SOD1);n=3;尸>0.05)，見(jiàn)圖3A中c)。同時(shí)，對(duì)各組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)也得出了相應(yīng)的結(jié)果，見(jiàn)圖3B。實(shí)施例4.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥抑制轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少了炎癥因子的分泌據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，炎癥反應(yīng)在ALS病情的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，膠質(zhì)細(xì)胞的激活是S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一。在本實(shí)施例中，本發(fā)明人使用CDllb和GFAP作為標(biāo)記分別觀測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，120天時(shí)S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角膠質(zhì)細(xì)胞包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被廣泛激活，而葉酸尤其是葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活得到了顯著的抑制，表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，尤其是激活態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞減少顯著。維生素B12單獨(dú)用藥組膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的改變則不明顯。結(jié)果見(jiàn)圖4。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)中還使用Westernblot的方法檢測(cè)五組實(shí)驗(yàn)小鼠脊髓組織中iNOS和TNF-a的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比iNOS和TNF-a的水平明顯升高，而葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可顯著降低S0D1-G93A小鼠脊髓內(nèi)兩種炎癥因子的水平，見(jiàn)圖5A。同時(shí)，本發(fā)明人也注意到，葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥組轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織內(nèi)iNOS和TNF-a的水平與葉酸單用組相比更低，說(shuō)明聯(lián)合用藥對(duì)小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制效果更好，見(jiàn)圖5C和圖5D。維生素B12單獨(dú)用藥對(duì)小鼠脊髓兩種炎癥因子的釋放并沒(méi)有明顯作用，見(jiàn)圖5A。實(shí)施例5.葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥影響脊髓凋亡相關(guān)蛋白的水平，減少了凋亡的發(fā)生已有報(bào)道說(shuō)明高水平的Hcy可以通過(guò)激活神經(jīng)元凋亡途徑導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥均可降低轉(zhuǎn)基因小鼠血漿Hcy水平，為進(jìn)一步探討其對(duì)小鼠體內(nèi)凋亡水平的影響，本發(fā)明人用Westernblot的方法檢測(cè)了各組實(shí)驗(yàn)小鼠脊髓組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2，剪切型(Cleaved)Caspase-3(即Caspase-3蛋白的活性形式)和剪切型(Cleaved)PRAP(即PRAP蛋白的活性形式)的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥與灌胃生理鹽水相比，可明顯降低凋亡蛋白cleavedCaspase-3和cleavedPRAP的水平，同時(shí)可顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，見(jiàn)圖5B。尤其是發(fā)現(xiàn)葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可使抗凋亡蛋白BcI-2的水平升高，接近正常野生型小鼠的水平，而且更顯著抑制了cleavedCaspase-3和cleavedPRAP的水平，這也說(shuō)明了葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓內(nèi)有非常顯著的抗凋亡作用。維生素B12單獨(dú)使用則作用不明顯。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)也說(shuō)明，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥在模型小鼠體內(nèi)可通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)起到顯著的抗凋亡作用，且葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥的效果更佳，見(jiàn)圖5E-G。實(shí)施例6組合物的制備和用藥本發(fā)明人配制了組合物，精密稱(chēng)量如下重量的各組分:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將按照上表組合物的配方稱(chēng)取組分，充分混合，與1000ml蒸餾水混合，制成液態(tài)組合物。按照實(shí)施例1的方法將各組合物給藥模型小鼠，發(fā)現(xiàn)各組合物均可有效延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，其中組合物1的效果最為優(yōu)異。討論在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠S0D1-G93A血漿中同型半胱氨酸(Hcy)的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常的野生型小鼠，這提示本發(fā)明人考慮使用針對(duì)性的降低Hcy的治療方法是否能夠降低SODl-G93A小鼠體內(nèi)的Hcy的水平，以及考慮這種針對(duì)性的治療方式對(duì)S0D1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的病情的發(fā)生發(fā)展是否有一定的保護(hù)作用。進(jìn)而，本發(fā)明人試驗(yàn)了多種藥物，發(fā)現(xiàn)葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯延緩S0D1-G93A小鼠的發(fā)病時(shí)間，同時(shí)也顯著延長(zhǎng)了轉(zhuǎn)基因小鼠的生存周期。本發(fā)明人進(jìn)一步研究了葉酸或葉酸和維生素B12對(duì)S0D1-G93A小鼠保護(hù)作用的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以保護(hù)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，明顯增加120天的轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活數(shù)目。同時(shí)葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可抑制小鼠脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少膠質(zhì)細(xì)胞尤其是激活態(tài)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，顯著降低炎癥相關(guān)因子iNOS和TNF-a的水平。此外，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥還可增加抗凋亡蛋白Bc-2的水平，降低凋亡蛋白cleavedCaspase-3及cleavedPRAP的水平。本發(fā)明人的研究結(jié)果表明，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠S0D1-G93A有著非常明顯的保護(hù)作用。已報(bào)道Hcy作為一種毒性的含硫氨基酸，與帕金森病，阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系。但是，肌萎縮側(cè)索硬化與帕金森癥或阿爾茨海默癥相比，發(fā)病機(jī)制不盡相同；且確切的Hcy在ALS患者或轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的水平變化或明確的Hcy與ALS發(fā)生發(fā)展的證據(jù)一直沒(méi)有報(bào)道。在小鼠的炎癥反應(yīng)方面，通過(guò)本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯抑制轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角膠質(zhì)細(xì)胞的激活同時(shí)降低炎癥相關(guān)蛋白iNOS和TNF-a的水平。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以明顯增加轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓組織內(nèi)Bcl-2的水平，這為葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥的抗凋亡作用提供了有力的證據(jù)。cleavedCaspase-3及cleavedPRAP位于凋亡通路的下游，在S0D1-G93A小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果證實(shí)了葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥可以通過(guò)抑制S0D1-G93A小鼠體內(nèi)的凋亡水平達(dá)到其對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用。通過(guò)本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)和分析，可以確定葉酸或葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥18200810042947.3對(duì)ALS模型小鼠的發(fā)病和生存都有著顯著的延長(zhǎng)作用，且葉酸和維生素B12聯(lián)合用藥是非常有效的預(yù)防和治療ALS的手段，在臨床上有著良好的應(yīng)用前在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種同型半胱氨酸下調(diào)劑的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑選自(a)葉酸；或(b)葉酸和維生素B12的混合物。3.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(5-80):1。4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，葉酸與維生素B12的重量比例是(10-40):1。5.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物用于抑制炎癥反應(yīng)或抑制細(xì)胞凋亡。6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的炎癥反應(yīng)是炎癥因子過(guò)量引起的炎癥反應(yīng)；或所述的細(xì)胞凋亡是凋亡蛋白水平過(guò)高或抗凋亡蛋白水平過(guò)低引起的細(xì)胞凋亡。7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的炎癥因子包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶或腫瘤壞死因子a。8.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的凋亡蛋白包括剪切型胱冬肽酶3，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的水平。9.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抗凋亡蛋白包括B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白。10.—種預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物，所述的組合物含有-有效量的同型半胱氨酸下調(diào)劑，所述的同型半胱氨酸下調(diào)劑是葉酸和維生素B12的混合物，含有葉酸5-80重量份；維生素B12:l重量份；以及藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明涉及防治肌萎縮側(cè)索硬化的組合物。本發(fā)明公開(kāi)了一種同型半胱氨酸下調(diào)劑的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療哺乳動(dòng)物肌萎縮側(cè)索硬化的組合物；所述的下調(diào)劑是葉酸或葉酸和維生素B12的混合物。所述的下調(diào)劑可非常有效地緩解哺乳動(dòng)物的肌萎縮側(cè)索硬化，降低哺乳動(dòng)物脊髓內(nèi)炎癥因子的水平，降低脊髓內(nèi)凋亡蛋白的水平，提高脊髓內(nèi)抗凋亡蛋白的水平。文檔編號(hào)A61P37/06GK101675932SQ20081004294公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年9月16日優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日發(fā)明者樂(lè)衛(wèi)東,張曉潔,靚李,倩王,晟陳申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院