專利名稱：：一種溶葡萄球菌酶局部緩釋制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物抗菌緩釋制劑，具體的說涉及一種溶葡萄球菌酶緩釋制劑。
背景技術(shù)：
：溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一種肽鏈內(nèi)切酶。該酶可切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽鍵橋結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到迅速溶解并殺死細(xì)菌的目的。體外藥效學(xué)研究表明，溶葡球菌酶對多種金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有良好的抑殺效果，對化膿性棒狀桿菌、鏈球菌和巴氏桿菌具有較好的抑殺效果。特別是對耐藥性金黃色葡萄球菌，MRSA及具有多藥抗性的"超級細(xì)菌"，溶葡萄球菌酶也同樣有很強(qiáng)的殺菌作用，由于其能溶解出于包括生長靜止期的細(xì)菌，故不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株。已有文獻(xiàn)報(bào)道體內(nèi)注射溶葡球菌酶用以治療金黃色葡萄球菌引起的主動脈心內(nèi)膜炎及奶牛乳腺炎，可達(dá)到清除致病菌的目的。然而，藥物動力學(xué)研究表明，溶葡球菌酶通過靜脈注射后在動物體內(nèi)分布迅速，代謝速度快，其在血相中的消除半衰期為29分鐘。如此短的半衰期意味著需要進(jìn)行大劑量給藥或重復(fù)多次給藥，對其在臨床上的應(yīng)用不利。利用生物可降解聚合物，包裹多肽、蛋白質(zhì)藥物制成緩釋微球，可調(diào)節(jié)藥物的釋放速率，延長給藥時間，保護(hù)蛋白活性，對生物藥物的臨床應(yīng)用具有重要意義。根據(jù)不同的臨床治療需要，這些微粒可用于各種口服、注射、埋植等各種給藥途徑。傳統(tǒng)的藥物制備工藝，如相分離法、噴霧干燥法等，容易使蛋白質(zhì)變性、失活，很難滿足生物大分子的藥物傳遞。通過超臨界流體微粒制備蛋白及多肽緩釋微球具有其它方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。對于極性物質(zhì)來說，由于它們在C02中相對溶解度低，通常需要將其溶解于常規(guī)使用的溶劑中。Yeo等描述了超臨界反溶劑(SupercriticleAnti-Solvent，SAS)過程作為制備微球的技術(shù)(Yeo等ifecro/Ho2ecw7es,7効《W,p《iW0。在SAS方法中，C02流體和溶解含極性溶質(zhì)的液體溶劑被分別泵入霧化罐中，通過噴嘴后形成細(xì)小液滴。在霧化罐中，C(M乍為溶質(zhì)的逆溶劑，溶質(zhì)的固體微粒形成并被回收到提籃式設(shè)計(jì)的過濾器中。在多肽類藥物的微粒制備過程中，這些溶劑的選擇需要具有以下一些特性(1)能與超臨界C02流體完全互溶；(2)不影響多肽的立體結(jié)構(gòu)和活性。美國專利US6，063，910描述了應(yīng)用超臨界流體技術(shù)制備蛋白微粒的過程。在該過程中，蛋白質(zhì)作為溶質(zhì)被溶解于90%乙醇溶液后，被泵入超臨界C02流體霧化罐中，形成平均粒徑小于5Um的蛋白質(zhì)微球。Caliceti等描述了一種通過超臨界反溶劑方法制胰島素-聚乳酸微球的制備方法(/o"77a70/^/7Z^o"e^^^朋M，Wr^^WP"5)。首先將胰島素、聚乙二醇1000、聚乳酸分別溶解于二甲亞砜(DMSO)、二氯甲烷溶液中，再將兩種溶液等體積混合后被泵入霧化罐，通過SAS法形成胰島素-聚乙二醇-PLA緩釋微球。其中胰島素的釋放速率主要由水溶性聚乙二醇含量所控制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種具有較長殺菌活性時間的緩釋制劑。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是提供該緩釋制劑的制備方法。本發(fā)明需要解決的另一個技術(shù)問題是公開該緩釋制劑的應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一種含鋅的金屬蛋白酶，它能專一降解革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌)細(xì)胞壁肽聚糖層的甘氨酸肽鍵，從而裂解金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，起到徹底殺死細(xì)菌的目的，尤其對耐藥性金黃色葡萄球菌等難以根除的致病菌的效果非常好。聚乳酸類(PLA，PLGA)可生物降解材料是基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)材料，可作為藥物控制釋放的載體材料，該類物質(zhì)降解產(chǎn)物為乳酸和水分子，生物相容性好。本發(fā)明以溶葡萄球菌酶為殺菌活性成分，通過超臨界流體微粒制備技術(shù)制得含溶葡萄球菌酶的聚乳酸-羥基乙酸(PLA-PLGA)多聚物微球。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述及的溶葡萄球菌酶緩釋制劑包括溶葡萄球菌酶l_10wt%，甘露醇l-10wt%，聚乳酸(PLA)0-90wt%，聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)5_95wt%。其中所述及的溶葡萄球菌酶可采用上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司市售的產(chǎn)品。所述及的甘露醇為市售注射用甘露醇。所述及的PLA為分子量為30，000至100，OOO的DL-或D-多聚乳酸。所述及的PLGA為分子量為30，000至100，000的DL-聚乳酸-聚羥基乙酸聚合物，其中乳酸與羥基乙酸的重量比為9:11:1。所述及的溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其優(yōu)選配方的組成及重量百分比為溶葡萄球菌酶1-5%，甘露醇1-2%，聚乳酸(PLA)0-90%，聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)5-95%。所述及的藥物制劑的制備方法包括如下步驟1、溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亞微米微球的制備方法，包括如下步驟a)配制溶液A:按上述比例稱取溶葡萄球菌酶，將其溶解于DMSO中；b)按上述比例稱取PLA和PLGA，將其溶解于二氯甲烷中，加入溶液A中，得到溶液B;c)將溶液B與超臨界C02流體混合，通過超臨界反溶劑過程(SAS)技術(shù)制備平均粒徑小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA藥物緩釋微球；d)收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA藥物緩釋微球。本發(fā)明以溶葡萄球菌酶為殺菌活性成分，通過超臨界流體微粒制備技術(shù)制得含溶葡球菌酶的含聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)多聚物微球。可通過二種途徑調(diào)節(jié)溶葡萄球菌酶的釋放速率1、由于聚乳酸-羥基乙酸在體內(nèi)的降解速率大于聚乳酸的降解速率，通過增加聚乳酸-羥基乙酸的比例可增加溶葡萄球菌酶的釋放速率；2、聚乳酸-羥基乙酸共聚物中親水性羥基乙酸比例高，聚合物降解速率快，因此改變?nèi)樗帷⒘u基乙酸在聚合物中的比例可調(diào)節(jié)溶葡萄球菌酶的釋放速率。通過該法制備的溶葡萄球菌酶微球可經(jīng)由注射或包埋在體內(nèi)緩慢釋放溶葡萄球菌酶，有效殺滅多種耐藥性致病菌，避免因使用傳統(tǒng)抗生素帶來的毒副作用及耐藥菌的出現(xiàn)，具有較高的臨床意義和應(yīng)用價值。本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亞微米微球緩釋制劑具有如下特點(diǎn)1、殺菌效果強(qiáng)。該制劑對革蘭氏陽性菌尤其是金黃色葡萄球菌，具有很強(qiáng)的殺菌作用。2、藥物緩釋能力強(qiáng)。通過調(diào)節(jié)PLA-PLGA中乳酸和輕基的相對含量的比例，溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亞微米微球藥物在體液中的緩釋可控制在3天至三個月。3、穩(wěn)定性強(qiáng)。本品在25。C常溫保存6個月，生物活性基本沒有改變。圖1是溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球的體外緩釋曲線圖2是溶葡萄球菌酶-PLGA微球的體外緩釋曲線具體實(shí)施例方式實(shí)施例1溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球的制備1、溶葡球菌酶溶液配備稱取10毫克溶葡球菌酶凍干粉，溶解于含有IO毫克甘露醇的IO毫升二甲亞砜(DMS0)中，配制成lmg/ml的溶葡球菌酶溶液。2、PLA-PLGA有機(jī)溶液的配備稱取0.4克分子量為30，000-50，000的聚乳酸多聚物，0.1克分子量為30，000-50，000的聚乳酸-羥基乙酸(其中乳酸、羥基乙酸比例為75:25)多聚物，溶解于10毫升二氯甲垸，配制成5%PLA-PLGA溶液。3、將5%PLA-PLGA溶液逐滴緩慢加入配制好的溶葡球菌酶-DMSO溶液，備用。4、平衡超臨界C(V流體，過程溫度37。C、壓力13.5MPa，C02流速為20g/min，泵入上述配制好的溶葡球菌酶溶液，通過超臨界反溶劑法制得溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球。5、經(jīng)檢測溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球平均粒徑約為3-15微米。實(shí)施例2溶葡萄球菌酶-PLGA微球的制備1.溶葡球菌酶溶液配備稱取20毫克溶葡球菌酶凍干粉，溶解于含有10毫克甘露醇的10毫升二甲亞砜(DMSO)中，配制成lmg/ml的溶葡球菌酶溶液。2.PLGA有機(jī)溶液的配備稱取0.5克分子量為30，000-50，000聚乳酸-羥基乙酸(其中乳酸、羥基乙酸比例為50:50)多聚物，溶解于10毫升二氯甲烷，配制成5%PLGA溶液。3.將5%PLGA溶液逐滴緩慢加入配制好的溶葡球菌酶-DMSO溶液，備用。4.平衡超臨界C02流體，過程溫度37°C、壓力13.5MPa，C(V流速為/min，泵入上述配制好的溶葡球菌酶溶液，通過超臨界反溶劑法制得溶葡球菌酶-PLGA微球。5.經(jīng)檢測溶葡球菌酶-PLGA微球平均粒徑約為3-15微米。實(shí)施例3溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球的體外緩釋曲線稱取5mg實(shí)施例l制備的微粒，置于10ml的PBS緩沖溶液(pH7.4)中，密封，4。C恒溫恒速(100r'min-1)振蕩。分別在三個月內(nèi)內(nèi)定時取緩沖液，檢測溶葡球菌酶酶活性，計(jì)算溶葡球菌酶累積釋放百分率。緩釋溶葡球菌酶微球的體外釋藥結(jié)果如圖l所示該結(jié)果顯示，溶葡球菌酶在體外釋藥過程時間長達(dá)三個月，釋放速度較為穩(wěn)定，可在維持溶葡球菌酶的穩(wěn)定長效釋放。實(shí)施例4溶葡球菌酶-PLGA微球的體外緩釋曲線稱取5mg實(shí)施例2制備的微粒，置于10ml的PBS緩沖溶液(pH7.4)中，密封，4"C恒溫恒速(100r，min-1)振蕩。一周內(nèi)定時取緩沖液，檢測溶葡球菌酶酶活性，計(jì)算溶葡球菌酶累積釋放百分率。緩釋溶葡球菌酶微球的體外釋藥結(jié)果如圖2所示該結(jié)果顯示，溶葡球菌酶在體外釋藥過程時間約為一周，釋放速度較為穩(wěn)定。實(shí)施例5溶葡萄球菌酶微球穩(wěn)定性試驗(yàn)1、將實(shí)施例1制備的溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25"C存放6個月。2、于不同存放時間，稱取5mg溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球置于100ml的PBS緩沖溶液(pH7.4)中，密封，4"C恒溫恒速振蕩24小時，通過0.22um濾膜過濾，取100ul緩沖液，檢測溶葡球菌酶酶活性，結(jié)果如表l所示，溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25X:存放6個月后酶活性沒有發(fā)生變化。表1、溶葡萄球菌酶微球穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其特征在于，組分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶1-10％，甘露醇1-10％，聚乳酸(PLA)0-90％，聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)5-95％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其特征在于，所述的聚乳酸(PLA)為分子量為30，OOO—IOO,000的DL-或D-多聚乳酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其特征在于，所述及的聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)為分子量為30，OOO—IOO，000的DL-聚乳酸-聚羥基乙酸聚合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其特征在于，所述及的聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)中乳酸與羥基乙酸的重量比為9:11:1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑，其特征在于，優(yōu)選的組分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶1-5%，甘露醇1-2%，聚乳酸(PLA)0-90先，聚乳酸一羥基乙酸(PLGA)5-95%。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟a)配制溶液A:按上述比例稱取溶葡萄球菌酶，將其溶解于DMSO中；b)按上述比例稱取PLA和PLGA，將其溶解于二氯甲烷中，加入溶液A中，得到溶液B;c)將溶液B與超臨界C02流體混合，通過超臨界反溶劑過程(SAS)技術(shù)制備平均粒徑小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA藥物緩釋微球；d)收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA藥物緩釋微球。7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的溶葡萄球菌酶緩釋制劑的應(yīng)用，其特征在于，溶葡萄球菌酶緩釋微粒采用注射或體內(nèi)包埋的方式給藥。全文摘要本發(fā)明公開了一種溶葡萄球菌酶緩釋制劑及其制備方法和應(yīng)用。該制劑的組分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶1-10％，甘露醇1-10％，聚乳酸(PLA)0-90％，聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)5-95％。該制劑以溶葡萄球菌酶為殺菌活性成分，通過超臨界流體微粒制備技術(shù)制得含溶葡萄球菌酶的聚乳酸-羥基乙酸(PLA-PLGA)多聚物微球。該制劑的理化性能好、殺菌效果強(qiáng)，在體外釋藥速率過程時間可調(diào)節(jié)，釋藥過程時間可達(dá)三天至三個月，釋放速度穩(wěn)定。文檔編號A61K38/48GK101618210SQ20081004358公開日2010年1月6日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者莉李,黃青山申請人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司