專(zhuān)利名稱(chēng)：：Vegf受體融合蛋白在制備治療伴隨vegf升高的炎癥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的相關(guān)資料參見(jiàn)同一申請(qǐng)人的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN200510073595.4(W02005/121176A1，發(fā)明名稱(chēng)"抑制血管生成的融合蛋白質(zhì)及其用途")和CN200610066257.2(W02007/112675A1，發(fā)明名稱(chēng)"VEGF受體融合蛋白及其應(yīng)用")，這兩個(gè)申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容作為本申請(qǐng)的一部分全文并入本申請(qǐng)。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以作為VEGF抑制藥物的基礎(chǔ)是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8具有與VEGF的特異性結(jié)合的能力，但親和力高低有差異，以半效結(jié)合濃度(IC5。)作為親和力大小的指標(biāo)，IC5。越小說(shuō)明親和力越強(qiáng)。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與VEGF的親和力IC5。值位于4.6pM_ll.2pM，其中FP3的IC5。值最低為4.6pM，因此FP3與VEGF的親和力最高。(見(jiàn)實(shí)施例1)本發(fā)明的一個(gè)目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一種或多種作為VEGF抑制劑，用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，主要包括但不限于膿毒癥、重癥膿毒癥和膿毒癥休克等。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8適用但不限于如下病因引起的伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)由各種微生物(如病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、真菌、寄生蟲(chóng)等)感染引起；由各種腹腔內(nèi)感染(如化膿性膽囊炎、膽炎、化膿性腹膜炎、非感染性胰腺炎、腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位等)引起；由各種呼吸系統(tǒng)感染(如化膿性支氣管炎、細(xì)支氣管炎，克雷白桿菌肺炎、吸入性肺炎、肺炎球菌性肺炎、葡萄球菌肺炎、過(guò)敏性肺炎、軍團(tuán)病肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎、衣原體肺炎、支原體肺炎、假單胞菌屬肺炎、綠膿桿菌肺炎)引起；由泌尿系統(tǒng)感染(如腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎)引起；由產(chǎn)科感染、兒科感染、燒傷后感染、臟器移植后感染、藥物中毒等引起。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一種或多種VEGF抑制劑與其它治療藥物聯(lián)合使用治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，這些藥物包括但不限于抗感染藥物，除栓素注射劑即重組人活化蛋白C(RecombinantHumanActivatedProteinC，rhAPC，或禾爾Drotrecoginalfa)，Avastin，Lucentis，VEGF-Trap，Nexavar，Sutent和Zactima等。此外，還可以包括抗內(nèi)毒素抗體、抗腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-a抗體、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1受體拮抗齊U、高遷移率族蛋白1、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、補(bǔ)體C5a、補(bǔ)體受體(C5aR)及半胱氨酸蛋白酶阻斷劑、細(xì)胞凋亡抑制劑、己酮可可堿，氯胺酮，烏司他丁，低分子肝素鈣等。所述的抗感染藥物包括但不限于各種抗生素如①13-內(nèi)酰胺類(lèi)包括青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)；②氨基糖甙類(lèi)，包括鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素等；③四環(huán)素類(lèi)，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素等；④酰胺醇類(lèi)(氯霉素類(lèi))，包括氯霉素、甲砜霉素等；⑤大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)，包括紅霉素、白霉素、無(wú)味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素、交沙霉素等；⑥其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、萬(wàn)古霉素、桿菌肽等；抗真菌感染的藥物，如多烯類(lèi)(兩性霉素B及其衍生物)、三唑類(lèi)(如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等)、嘧啶類(lèi)(如氟胞嘧啶)、棘白菌素類(lèi)(如卡泊芬凈)、復(fù)方磺胺甲口惡唑等；抗病毒類(lèi)藥物，如阿糖腺苷、阿昔洛韋(無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷)、泛昔洛韋、更昔洛韋、伐昔洛韋、噴昔洛韋；抗支原體藥物；抗腫瘤藥物如絲裂霉素、放線(xiàn)菌素D、博萊霉素、阿霉素等；具有免疫抑制作用的藥物，如環(huán)孢霉素。本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用一種或多種選自VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的VEGF抑制劑與其它治療方法聯(lián)合用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，其它治療方法包括治療肺功能障礙的機(jī)械通氣，補(bǔ)充體液(見(jiàn)實(shí)施例6)等，還包括但不限于外科引流，針對(duì)器官功能衰竭的適當(dāng)支持護(hù)理，例如治療腎功能衰竭的血液透析，治療循環(huán)衰竭的血液制品輸液療法，腸道補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供將治療有效劑量的VEGF抑制劑，即VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一種或多種和任選的藥物載體給予患者，治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明的VEGF受體融合蛋白包括它們的純化合物形式、溶劑化物形式、鹽形式或鹽的溶劑化物形式。本發(fā)明涉及的融合蛋白制品經(jīng)過(guò)純化達(dá)到藥用純度后，可以根據(jù)制劑的需要制備成藥物制劑，按藥物制劑的常規(guī)制法完成，優(yōu)選溶液制劑或干粉制劑，作為干粉制劑，使用時(shí)將干粉溶解，使成為溶液。本發(fā)明所述的融合蛋白制劑，可以加入藥物穩(wěn)定所需的藥用載體等，可以是適合的任何形式，優(yōu)選自磷酸鈉(SodiumPhosphate)、琥珀酸鈉(SodiumSuccinate)、組氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯20/80(Polysorbate20/80)、氯化鈉(SodiumChloride)、蔗糖(Sucrose)、三羥甲基氨基甲烷(Trometamol)和乳糖等。本發(fā)明涉及的制劑緩沖液應(yīng)含有pH緩沖系統(tǒng)如磷酸鹽(Phosphate)、檸檬酸鹽(Citrate)、乙酸鹽(Acetate)、琥珀酸鹽(Succinate)、三羥甲基氨基甲烷(Trometamol,又名Tris)或組氨酸(Histidine)等中的一種或多種，pH的范圍在3.0至9.0。本發(fā)明涉及的制劑緩沖液可以含有滲透壓調(diào)節(jié)齊U，優(yōu)選自氯化鈉(SodiumChloride)、葡萄糖(Dextrose)等。另外根據(jù)需要還可加入防腐劑，助溶劑等輔助成分，可以選自任何適宜的藥劑學(xué)常規(guī)的輔助成分。溶劑選擇水或其他等滲溶液，緩沖溶液等?？珊蟹栏瘎┤玎绻?Thimerosal)、亞硫酸氫鈉(SodiumBisulfite)、苯基乙醇(BenzylAlcohol)等。對(duì)于凍干制劑，可含有賦形劑如甘露醇(Mannitol)等；對(duì)于溶液制劑，可含有表面活性劑如聚山梨醇酯(Polysorbate20或80)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。在上述制劑中，融合蛋白的濃度范圍在O.Olmg/ml至1000mg/ml。本發(fā)明融合蛋白的用量根據(jù)臨床的需要、具體疾病、患者體重、病情、病程、臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)而定，作為指導(dǎo)，可以按照每次給藥O.lmg-3000mg，優(yōu)選lmg-2000mg，可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每?jī)芍?、每三周等給藥一次，或者每日給藥一次以上。本發(fā)明涉及的含有抑制血管生成的VEGF抑制劑可以通過(guò)多種不同的給藥途徑給予病人，其中包括(但不限于)靜脈給藥，皮下注射，腹腔內(nèi)注射，肌注，局部給藥和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等。下列多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)出融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以單獨(dú)使用或與其它藥物、治療手段等聯(lián)合使用，用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)(1)對(duì)于靜脈注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)構(gòu)建的膿毒癥大鼠模型，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治療可以提高大鼠存活數(shù)量，其中FP3效果最好，并且融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治療可以抑制大鼠血漿VEGF水平，其中FP3對(duì)VEGF含量抑制最強(qiáng)。(見(jiàn)實(shí)施例2)(2)對(duì)于盲腸結(jié)扎穿孔(CaecalLigationPuncture,CLP)構(gòu)建的膿毒癥大鼠模型，分為正常組，假手術(shù)組，CLP對(duì)照組，F(xiàn)P1治療組和FP3治療組，檢測(cè)不同組織部位的腫瘤壞死因子TNF-a的表達(dá)量，TNF-a量越高，說(shuō)明動(dòng)物發(fā)生的炎癥越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CLP造模后動(dòng)物肝臟、肺臟以及血漿中的TNF-a含量迅速升高，之后緩慢降低；與CLP對(duì)照組相比，F(xiàn)P1和FP3治療可不同程度地降低肝、肺組織和血漿TNF-a水平，并且FP3略?xún)?yōu)于FP1。因此，融合蛋白FP1和FP3有助于下調(diào)TNF-a的過(guò)量表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。(見(jiàn)實(shí)施例3)(3)融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與抗生素聯(lián)用可以顯著提高膿毒癥大鼠的生存率，以融合蛋白FP3為例，將盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)致膿毒癥大鼠模型分為未治療組、抗生素治療組、融合蛋白FP3治療組，及FP3與抗生素聯(lián)合治療組。結(jié)果顯示與未治療組相比，抗生素治療組和FP3治療組均使大鼠存活率顯著提高，抗生素治療組和FP3治療組無(wú)顯著差異；而FP3與抗生素聯(lián)合治療組存活率提升最為顯著，顯著高于其他組。(見(jiàn)實(shí)施例4)(4)融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)合使用可以提高重癥膿毒癥小鼠的存活率，并且與對(duì)照組或單獨(dú)使用抗生素治療組相比，炎性因子TNF-a和IL-6水平均有所降低。說(shuō)明融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)合使用對(duì)重癥膿毒癥小鼠有較好的治療作用，并且優(yōu)于抗生素的單獨(dú)使用。(見(jiàn)實(shí)施例5)(5)融合蛋白FP3治療可以對(duì)膿毒癥休克犬的肝、腎功能起到保護(hù)作用。膿毒癥休克犬建模后，其ALT、AST、BUN、Cr等肝、腎指標(biāo)逐漸升高，F(xiàn)P3治療時(shí)上述指標(biāo)升高較慢，說(shuō)明肝、腎功能受損較小。FP3起到了治療和緩解膿毒癥休克的作用。(見(jiàn)實(shí)施例6)附圖1是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8結(jié)構(gòu)示意圖。它們由不同的FLT-1片段、KDR片段以及免疫球蛋白Fc片段用基因工程方法構(gòu)建而成。附圖2是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與VEGF的親和力實(shí)驗(yàn)。附圖3是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8對(duì)大鼠存活數(shù)量的影響。附圖4是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8對(duì)大鼠血槳VEGF含量的影響。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的部分應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與VEGF結(jié)合親和力的實(shí)驗(yàn)本發(fā)明用測(cè)定游離VEGF的量來(lái)確定各種融合蛋白結(jié)合VEGF的能力。在這一試驗(yàn)中，將一定量的VEGF(10PM)加入離心管中，然后將含有一定濃度梯度的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8分別加到含有VEGF的離心管中，混合好后，在37°C的培養(yǎng)箱中保存一個(gè)小時(shí)。一個(gè)小時(shí)以后，各個(gè)離心管中游離的VEGF由R&D系統(tǒng)公司(R&Dsystems)提供的檢測(cè)VEGF量的試劑盒——VEGF檢測(cè)試劑盒(VEGFassayKit)測(cè)定。以半效結(jié)合濃度(theHalfMaximalInhibitoryConcentration,IC50)作為親禾口力大小的指標(biāo)，IC50越小說(shuō)明親和力越強(qiáng)。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8都能有效地與VEGF親和結(jié)合，其IC5。值見(jiàn)附圖2，各融合蛋白親和力ICs。值位于4.6pM-ll.2pM，其中FP3的IC5。值最低為4.6pM，因此FP3與VEGF的親和力最高。8實(shí)施例2融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8對(duì)LPS膿毒癥大鼠生存率和血槳VEGF的影響本實(shí)驗(yàn)采用靜脈注射脂多糖(LPS)法構(gòu)建膿毒癥大鼠模型(參考SchultzMJetal.(2002)，AnnMed，34:573-581)。清潔級(jí)雄性大鼠270只，體重200g-240g，各給予靜脈注射脂多糖(LPS)30mg/kg，隨機(jī)分為9組，各30只。其中一組為對(duì)照組，其余依次為融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治療組。對(duì)照組靜脈注射等體積生理鹽水，融合蛋白治療組分別給予靜脈注射相應(yīng)融合蛋白各10mg/kg。于完成后0-96小時(shí)記錄大鼠存活的數(shù)量。將實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠立即心臟取血，或于96小時(shí)后處死再心臟取血，將血液樣品保存于-2(TC備用。VEGF檢測(cè)采用雙抗夾心ELISA法試劑盒，先用抗大鼠VEGF單抗包被酶標(biāo)板，大鼠血漿樣品中的VEGF會(huì)與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠VEGF(二抗)，將與結(jié)合在單抗上的大鼠VEGF結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，它將與結(jié)合在單抗上的大鼠VEGF結(jié)合而形成免疫復(fù)合物。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Str印tavidin將與二抗的生物素結(jié)合，最后加入TMB顯色。VEGF濃度與0D(450nm)成正比。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。大鼠存活數(shù)量的結(jié)果見(jiàn)附圖3:與對(duì)照組相比，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治療組均提高了大鼠96小時(shí)后的存活數(shù)量，其中FP3組的存活數(shù)量最高。大鼠血漿VEGF含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖4，LPS膿毒癥大鼠模型建立后，大鼠血漿VEGF含量迅速升高。與對(duì)照組(即圖3和圖4中的control組)相比，融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治療組大鼠血槳VEGF含量均顯著降低，均為P<0.05，其中FP3組VEGF含量最低。實(shí)施例3融合蛋白FP1和FP3對(duì)CLP膿毒癥大鼠TNF-a水平影響清潔級(jí)雄性大鼠，體重230g260g，用于制備盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥大鼠模型(參考ChaudryIHetal.(1979)，Surgery,85:205-211)。112只動(dòng)物隨機(jī)分組。l，正常組8只；2，假手術(shù)組8只；3，對(duì)照組32只分別于術(shù)后2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)處死(各8只)；4，F(xiàn)P1給藥組32只術(shù)后靜脈給予FP16mg/kg，分別于2、8、24、48小時(shí)處死(各8只)；5，F(xiàn)P3給藥組32只術(shù)后靜脈給予FP36mg/kg，分別于2、8、24、48小時(shí)處死(各8只)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死方式為麻醉后活殺，采集腹主動(dòng)脈血，分離血清，分裝后-S(TC保存；另外取肝臟、肺臟，液氮保存。TNF-a的檢測(cè)將肝、肺組織稱(chēng)重后勻漿，離心后取上清液。組織樣本適當(dāng)稀釋用于檢測(cè)，血清樣本復(fù)融后直接檢測(cè)，采用大鼠TNF-aELISA檢測(cè)試劑盒，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果見(jiàn)表1:CLP造模4小時(shí)后，動(dòng)物肝、肺組織、血漿中TNF-a水平迅速升高，之后緩慢降低。與對(duì)照組相比，F(xiàn)P1和FP3治療可不同程度地抑制肝、肺組織和血漿中的TNF-a水平，24小時(shí)時(shí)FP1組和FP3組均與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組有顯著差異，P<0.05，并且FP3組略?xún)?yōu)于FP1組。因此，融合蛋白FPl和FP3有助于下調(diào)TNF-a的過(guò)量表達(dá)，從而減輕機(jī)體發(fā)生的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。表1:FP3和FP4對(duì)CLP膿毒癥大鼠TNF-a水平的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例4融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)用對(duì)膿毒癥大鼠保護(hù)作用清潔級(jí)雄性大鼠構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥大鼠模型。將120只大鼠隨機(jī)分為模型未治療組(n=30)、抗生素治療組(n=30)、融合蛋白FP3治療組(n=30)和聯(lián)合治療組(n=30)。各治療組給藥方式FP3治療組經(jīng)尾靜脈注射FP310mg/kg;抗生素治療組分別經(jīng)肌肉注射氨芐青霉素100mg/kg、慶大霉素20mg/kg;聯(lián)合治療組分別肌肉注射氨芐青霉素100mg/kg、慶大霉素20mg/kg，以及尾靜脈注射FP310mg/kg。模型未治療組同法注射等量生理鹽水作為對(duì)照。觀(guān)察記錄5天存活率，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果見(jiàn)表2:與模型未治療組相比，其余各組均使膿毒癥大鼠存活率顯著提升(P<0.05)，聯(lián)合治療組存活率顯著高于其他組(P<0.05)，抗生素治療組和FP3治療組無(wú)顯著差異。表2:融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)用對(duì)膿毒癥大鼠存活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例5融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)用對(duì)重癥膿毒癥小鼠細(xì)胞因子的影響將健康昆明系小鼠，體重20g-22g，用于制備重癥膿毒癥小鼠模型(參考JacksonJetal.(1979)，JEndotoxin,1996，3:201-218)。將重癥膿毒癥小鼠模型90只，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(n=30)，抗生素治療組(n=30)，融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)合治療組(n=30)。抗生素尼泰欣和FP3給藥方式均為腹腔注射，F(xiàn)P3為3mg/kg，尼泰欣為0.04g/kg，均為每日1次，連用3天。生理鹽水對(duì)照組注射等量生理鹽水。檢測(cè)指標(biāo)給藥3天后處死小鼠取肺臟，若試驗(yàn)小鼠死亡則立即取肺臟，勻槳后離心分離上清，置-8(TC冰箱保存。腫瘤壞死因子a(TNF-a)測(cè)定采用放射免疫分析法，單位用mg/kg表示，白細(xì)胞介素6(IL-6)測(cè)定采用抗原競(jìng)爭(zhēng)放射免疫方法，單位為Pg/kg，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，給藥3天后，聯(lián)合治療組小鼠存活數(shù)量最高，并且炎性因子TNF-a和IL-6水平較其它兩組均有明顯降低(P值均小于0.05)。說(shuō)明融合蛋白FP3與抗生素聯(lián)合使用對(duì)重癥膿毒癥小鼠有較好的治療作用，并且優(yōu)于抗生素的單獨(dú)使用。表3:抗生素尼泰欣、融合蛋白FP3治療重癥膿毒癥小鼠(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例6融合蛋白FP3對(duì)膿毒癥休克犬肝、腎的保護(hù)作用采用健康雄性犬，體重15kg-17kg，構(gòu)建膿毒癥休克犬模型(FinkMPetal.(1990)，Shock.JSurgRes，49:186)。將膿毒癥休克犬隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組(n=20)接受10ml/(kg*h)林格氏液(RLS)。FP3治療組(n=20)lOmin內(nèi)給予首劑FP35mg/kg，然后持續(xù)泵入5mg/(kg*h)，F(xiàn)P3溶于林格氏液，保證液體量相同。模型建立前及建立后的0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)分別取血10ml，分離出血清放置于-S(TC冰箱儲(chǔ)存，集中進(jìn)行測(cè)定。肝、腎檢測(cè)指標(biāo)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平等，采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。膿毒癥休克犬的肝、腎指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表4-1和表4-2，結(jié)果顯示膿毒癥休克建模后，犬的ALT、AST、BUN、Cr水平逐漸升高，其中24小時(shí)后與建模前相比差異顯著(P<0.05)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)P3治療組各種指標(biāo)升高較慢，其中12小時(shí)-24小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明FP3起到了治療和緩解膿毒癥休克的作用。表4-1:膿毒癥休克犬肝功能指標(biāo)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4-2:膿毒癥休克犬腎功能指標(biāo)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)時(shí)間BUN(mmo1/L)CrOmol/L)對(duì)照組FP3組對(duì)照組FP3組建模前3.13±0.823.08±0.9298.2±18.7102.6±17.903.34±0.983.47±0.56103.8±16.9101.3±19.2123.99±1.243.55±1.26123.6±17.3109.8±21.2244.73±1.21'3.61士1.33155.8±21.0110.0±18.70074]序列表0075]〈110〉成都康弘生物科技有限公司0076]〈120>VEGF受體融合蛋白在制備治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)的藥物中的0077]〈130〉無(wú)0078]〈160>40079]〈170>PatentInversion3.50080]〈210>10081]〈211>4550082]〈212>PRT0083]〈213〉人工序列0084]〈400>10085]MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSer0086]1510150087]CysLeuLeuLeuThrGlySerSerSerGlyGlyArgProPheValGlu0088]2025300089]MetTyrSerGlulieProGlulielieHisMetThrGluGlyArgGlu0090]3540450091]LeuVallieProCysArgValThrSerProAsnlieThrValThrLeu0092]5055600093]LysLysPheProLeuAspThrLeulieProAspGlyLysArglielie0094]657075800095]TrpAspSerArgLysGlyPhelielieSerAsnAlaThrTyrLysGlu0096]8590950097]lieGlyLeuLeuThrCysGluAlaThrValAsnGlyHisLeuTyrLys0098]1001051100099]ThrAsnTyrLeuThrHisArgGinThrAsnThrlielieAspValVal0100]1151201250101]LeuSerProSerHisGlylieGluLeuSerValGlyGluLysLeuVal0102]1301351400103]LeuAsnCysThrAlaArgThrGluLeuAsnValGlylieAspPheAsn0104]145150155160120105]TrpGluTyrProSerSerLysHisGinHisLysLysLeuValAsnArg0106]1651701750107]AspLeuLysThrGinSerGlySerGluMetLysLysPheLeuSerThr0108]1801851900109]LeuThrlieAspGlyValThrArgSerAspGinGlyLeuTyrThrCys0110]1952002050111]AlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLysAsnSerThrPheValArg0112]2102152200113]ValHisGluLysAspLysThrHisThrCysProLeuCysProAlaPro0114]2252302352400115]GluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLys0116]2452502550117]AspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValValVal0118]2602652700119]AspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAsp0120]2752802850121]GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinTyr0122]2902953000123]AsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGinAsp0124]3053103153200125]TrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeu0126]3253303350127]ProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArg0128]3403453500129]GluProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLys0130]3553603650131]AsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsp0132]3703753800133]lieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLys0134]3853903954000135]AlaThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSer0136]4054104150137]LysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSer0138]4204254300139]CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSer0140]4354404450141]LeuSerLeuSerProGlyLys0142]4504550143]〈210>213〈211>552〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSer151015CysLeuLeuLeuThrGlySerSerSerGlyGlyArgProPheValGlu202530MetTyrSerGlulieProGlulielieHisMetThrGluGlyArgGlu354045LeuVallieProCysArgValThrSerProAsnlieThrValThrLeu505560LysLysPheProLeuAspThrLeulieProAspGlyLysArglielie65707580TrpAspSerArgLysGlyPhelielieSerAsnAlaThrTyrLysGlu859095lieGlyLeuLeuThrCysGluAlaThrValAsnGlyHisLeuTyrLys100105110ThrAsnTyrLeuThrHisArgGinThrAsnThrlielieAspValVal115120125LeuSerProSerHisGlylieGluLeuSerValGlyGluLysLeuVal130135140LeuAsnCysThrAlaArgThrGluLeuAsnValGlylieAspPheAsn145150155160TrpGluTyrProSerSerLysHisGinHisLysLysLeuValAsnArg165170175AspLeuLysThrGinSerGlySerGluMetLysLysPheLeuSerThr180185190LeuThrlieAspGlyValThrArgSerAspGinGlyLeuTyrThrCys195200205AlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLysAsnSerThrPheValArg210215220ValHisGluLysProPheValAlaPheGlySerGlyMetGluSerLeu225230235240ValGluAlaThrValGlyGluArgValArglieProAlaLysTyrLeu245250255GlyTyrProProProGlulieLysTrpTyrLysAsnGlylieProLeu260265270GluSerAsnHisThrlieLysAlaGlyHisValLeuThrlieMetGlu140183]2752802850184]ValSerGluArgAspThrGlyAsnTyrThrVallieLeuThrAsnPro0185]2902953000186]lieSerLysGluLysGinSerHisValValSerLeuValValTyrVal0187]3053103153200188]ProProGlyProGlyAspLysThrHisThrCysProLeuCysProAla0189]3253303350190]ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro0191]3403453500192]LysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValVal0193]3553603650194]ValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrVal0195]3703753800196]AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGin0197]3853903954000198]TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGin0199]4054104150200]AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAla0201]4204254300202]LeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinPro0203]4354404450204]ArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThr0205]4504554600206]LysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer0207]465470475■0208]AsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyr0209]4854904950210]LysAlaThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr0211]5005055100212]SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPhe0213]5155205250214]SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLys0215]5305355400216]SerLeuSerLeuSerProGlyLys0217]5455505520218]〈210>30219]〈211>3080220]〈212>PRT0221]〈213〉人工序列15〈400>3GlyArgProPheValGluMetTyrSerGlulieProGlulielieHis151015MetThrGluGlyArgGluLeuVallieProCysArgValThrSerPro202530AsnlieThrValThrLeuLysLysPheProLeuAspThrLeuliePro354045AspGlyLysArglielieTrpAspSerArgLysGlyPhelielieSer505560AsnAlaThrTyrLysGlulieGlyLeuLeuThrCysGluAlaThrVal65707580snGlyHisLeuTyrLysThrAsnTyrLeuThrHisArgGinThrAsn859095ThrlielieAspValValLeuSerProSerHisGlylieGluLeuSer100105110ValGlyGluLysLeuValLeuAsnCysThrAlaArgThrGluLeuAsn115120125ValGlylieAspPheAsnTrpGluTyrProSerSerLysHisGinHis130135140LysLysLeuValAsnArgAspLeuLysThrGinSerGlySerGluMet145150155160LysLysPheLeuSerThrLeuThrlieAspGlyValThrArgSerAsp165170175GinGlyLeuTyrThrCysAlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLys180185190AsnSerThrPheValArgValHisGluLysProPheValAlaPheGly195200205SerGlyMetGluSerLeuValGluAlaThrValGlyGluArgValArg210215220lieProAlaLysTyrLeuGlyTyrProProProGlulieLysTrpTyr225230235240LysAsnGlylieProLeuGluSerAsnHisThrlieLysAlaGlyHis245250255ValLeuThrlieMetGluValSerGluArgAspThrGlyAsnTyrThr260265270VallieLeuThrAsnProlieSerLysGluLysGinSerHisValVal275280285SerLeuValValTyrValProProAspLysThrHisThrCysProLeu290295300CysProAlaPro305308〈210>4〈211>214〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>4GlyArgProPheValGluMetTyrSerGlulieProGlulielieHis151015MetThrGluGlyArgGluLeuVallieProCysArgValThrSerPro202530AsnlieThrValThrLeuLysLysPheProLeuAspThrLeuliePro354045AspGlyLysArglielieTrpAspSerArgLysGlyPhelielieSer505560AsnAlaThrTyrLysGlulieGlyLeuLeuThrCysGluAlaThrVal65707580AsnGlyHisLeuTyrLysThrAsnTyrLeuThrHisArgGinThrAsn859095ThrlielieAspValValLeuSerProSerHisGlylieGluLeuSer100105110ValGlyGluLysLeuValLeuAsnCysThrAlaArgThrGluLeuAsn115120125ValGlylieAspPheAsnTrpGluTyrProSerSerLysHisGinHis130135140LysLysLeuValAsnArgAspLeuLysThrGinSerGlySerGluMet145150155160LysLysPheLeuSerThrLeuThrlieAspGlyValThrArgSerAsp165170175GinGlyLeuTyrThrCysAlaAlaSerSerGlyLeuMetThrLysLys180185190AsnSerThrPheValArgValHisGluLysAspLysThrHisThrCys195200205ProLeuCysProAlaPro2102141權(quán)利要求本發(fā)明的一個(gè)目的是利用一種或多種選自以下融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的VEGF抑制劑用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，其中FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的結(jié)構(gòu)如下所述FP1由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和人免疫球蛋白Fc組成；FP2由KDR的第1免疫球蛋白樣區(qū)域、FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域和人免疫球蛋白Fc組成；FP3由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3和第4免疫球蛋白樣區(qū)域和人免疫球蛋白Fc組成；FP4由編碼FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域、FLT-1的第4免疫球蛋白樣區(qū)域和和人免疫球蛋白Fc組成；FP5由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3-5免疫球蛋白樣區(qū)域和和人免疫球蛋白Fc組成；FP6由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域、FLT-1的第4-5免疫球蛋白樣區(qū)域和和人免疫球蛋白Fc組成；FP7由由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域、KDR的第3和第4免疫球蛋白樣區(qū)域組成；FP8由FLT-1的第2免疫球蛋白樣區(qū)域和KDR的第3免疫球蛋白樣區(qū)域組成；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，有效劑量的VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一種或多種和適量藥學(xué)上可以接受的載體制備成藥物制劑給藥于患者，治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，所述藥用載體可以是pH緩沖系統(tǒng)，滲透壓調(diào)節(jié)劑，防腐劑，穩(wěn)定劑等輔助成分，其中融合蛋白的濃度范圍在0.01mg/ml至1000mg/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)主要包括膿毒癥(S印sis)、重癥膿毒癥(SevereS印sis)、膿毒癥休克(S印sisShock)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，本發(fā)明涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8，可以包括它們的純化合物形式、溶劑化物形式、鹽形式或鹽的溶劑化物形式。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，本發(fā)明涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8，可以根據(jù)需要制備成藥物制劑，按藥物制劑的常規(guī)制法完成，可以為溶液制劑或干粉制劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，本發(fā)明融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8，用量可以O(shè).lmg-3000mg/次，優(yōu)選lmg-2000mg/次，可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每?jī)芍?、每三周等給藥一次，或者每日給藥一次以上。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，本發(fā)明涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8，可以通過(guò)多種不同的給藥途徑給予病人，其中包括(但不限于)靜脈給藥，皮下注射，腹腔內(nèi)注射，肌注等。8.本發(fā)明的另一個(gè)目的是，利用一種或多種選自融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制劑與其它治療藥物聯(lián)合使用治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，所述的其它治療藥物包括但不限于抗感染類(lèi)藥物，重組人活化蛋白C等。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，所述的抗感染類(lèi)藥物包括但不限于抗細(xì)菌的藥物如P_內(nèi)酰胺類(lèi)，氨基糖甙類(lèi)，四環(huán)素類(lèi)，酰胺醇類(lèi)(氯霉素類(lèi))，大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)及其它抗生素；抗真菌感染的藥物如多烯類(lèi)、三唑類(lèi)、嘧啶類(lèi)、棘白菌素類(lèi)等；抗病毒類(lèi)藥物；抗支原體藥物；抗腫瘤類(lèi)藥物；具有免疫抑制作用的藥物等。10.—種或多種選自VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的VEGF抑制劑與其它治療方法聯(lián)合用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，其它治療方法包括但不限于機(jī)械通氣，外科引流，補(bǔ)充體液和針對(duì)器官功能衰竭的適當(dāng)支持護(hù)理等。全文摘要本發(fā)明涉及一種或多種選自VEGF受體融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制劑用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)，所述炎癥反應(yīng)主要包括但不限于膿毒癥、重癥膿毒癥和膿毒癥休克。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可與一種或多種其它藥物、治療手段聯(lián)合用于治療伴隨VEGF升高的炎癥反應(yīng)。文檔編號(hào)A61P31/00GK101721699SQ20081004627公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者俞德超,王敬章申請(qǐng)人:成都康弘生物科技有限公司