專利名稱：養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦微循環(huán)障礙的改善作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，特別涉及中藥養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦微循環(huán) 障礙的改善作用。
背景技術(shù)：
世界腦血管疾病的平均發(fā)病率為140-200/10萬(wàn)人口，平均死亡率為1()0/K)萬(wàn)人口，是發(fā)病率和死亡率較高的病種。改善腦血管損傷對(duì)挽救生命和降低醫(yī)療 財(cái)政都有著重要的意義。缺血再灌注引起的腦血管損傷約占腦血管損傷原因的6()%左右。缺血再灌注后產(chǎn)生的過(guò)氧化物降解1-KB，活化NF-icB， NFKB的亞基 進(jìn)入胞核，激活粘附分子、炎性因子和凋亡相關(guān)基因位點(diǎn)，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)， 炎性因子的釋放和啟動(dòng)凋亡相關(guān)蛋白的合成。白細(xì)胞的L選擇素和血管內(nèi)皮的E 選擇素表達(dá)增加引起白細(xì)胞沿血管壁的滾動(dòng)，進(jìn)而，過(guò)表達(dá)的白細(xì)胞黏附分子 CDllb/CD18與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM-L的結(jié)合導(dǎo)致白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。黏附于血管內(nèi)皮的白細(xì)胞釋放大量過(guò)氧化物和蛋白酶，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜，引起血管通透性增加和血漿白蛋白漏出，造成血管周圍組織的水腫。過(guò)氧化物剌激又可引起血管周圍的肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎性因子和血管活性因子，這些因子從血管外攻擊血管加重白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和白蛋白的外漏。血管周圍組織的水腫從血管外壓迫血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹和白細(xì)胞黏附，血小板積聚等都成為阻礙血流的因素，導(dǎo)致再灌注后不復(fù)灌的區(qū)域形成。缺血再灌注引起的腦血管損傷是諸多要素參與的多環(huán)節(jié)的損傷過(guò)程，以往的 研究主要集中于用抗過(guò)氧化物，抗黏附分子表達(dá)，抗血小板凝聚等作用于腦障礙 的某一環(huán)節(jié)，由于作用環(huán)節(jié)單一，不足以綜合地改善腦微循環(huán)障礙，至今沒(méi)有取 得良好的臨床療效?？勺饔糜谀X微循環(huán)障礙的不同病理環(huán)節(jié)的，由多成分組合的 復(fù)合制劑有可能起到綜合地改善腦微循環(huán)障礙的作用。養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì) 辛為主要成分構(gòu)成的中藥復(fù)方制劑，1996年被中國(guó)國(guó)家食品與藥品監(jiān)督管理局 (SFDA)作為治療頭痛，眩暈和腦血管疾病的中藥復(fù)方制劑，批準(zhǔn)在中國(guó)臨床應(yīng)用。已往的體外研究己經(jīng)證明該中藥復(fù)方制劑中芍藥甙，川芎嗪，阿魏酸在體外 有抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生的作用，川芎嗪體外有抑制白細(xì)胞和血管內(nèi)皮黏附因子表達(dá) 的作用。但是，有關(guān)養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注引起的腦微循環(huán)障礙是否具有改 善作用未見(jiàn)報(bào)告。由于沙鼠wi ] L i s環(huán)發(fā)育不完全，結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈就可以建立全腦缺血模型。 所以本研究用蒙古沙鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎建立的缺血再灌注模型，用可視化動(dòng)態(tài)連 續(xù)系統(tǒng)觀察蒙古沙鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎之后腦微循環(huán)動(dòng)態(tài)，包括腦血流量，血流速 度，血管徑，血管內(nèi)皮過(guò)氧化物產(chǎn)生，白細(xì)胞黏附，血管通透性的變化，并用透 射和掃描電鏡觀察細(xì)靜脈和毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的變化，探討?zhàn)B血清腦顆粒對(duì)缺血 再灌注引起的腦微循環(huán)障礙的改善作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種養(yǎng)血清腦顆粒的新的治療用途，特別是用養(yǎng)血清腦顆粒治療 和預(yù)防腦微循環(huán)障礙。養(yǎng)血清腦顆粒是一種已經(jīng)上市的中成藥物，其配方組成為當(dāng)歸、赤芍、川 芎、雞血藤、勾藤、夏枯草等臨床上用于治療頭痛、眩暈等癥。本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血清腦顆?？梢灶A(yù)防和治療腦微循環(huán)障礙因而擴(kuò)大 了其應(yīng)用范圍，為此，本發(fā)明的內(nèi)容主要包括，用養(yǎng)血清腦顆粒制備一種治療和 預(yù)防腦微循環(huán)障礙的藥物。為證明本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果，現(xiàn)將有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整列如下實(shí)驗(yàn)一、動(dòng)物模型用2%無(wú)巴比妥鈉(100mg/kg.bw)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸前去毛， 常規(guī)消毒，正中失狀位切開(kāi)皮膚，逐層分離，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。用特殊設(shè)計(jì)的 閉合器(一根細(xì)的聚乙烯導(dǎo)管和一根粗的塑料管組成的套索)閉鎖雙側(cè)頸總動(dòng)脈 (缺血)，30分后解除閉索(再灌注)。然后依次縫合頸部肌肉和皮膚。在操作過(guò) 程中保持恒溫，動(dòng)物清醒后送回恒溫飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。再灌注第5天用20%烏拉坦 (2. 0g/kg. bw)經(jīng)腹腔注射麻醉進(jìn)行腦微循環(huán)觀察或取腦做組織化學(xué)和免疫組織 化學(xué)染色。假手術(shù)組除了不閉索雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其他操作同缺血再灌注組。缺血 再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組分別在再灌注3小時(shí)灌胃給與0. 4g/kg和0. 8g/kg養(yǎng)血清腦顆粒，此后每天灌胃一次，第 5天灌胃后90分鐘麻醉進(jìn)行腦微循環(huán)觀察或取腦做組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。腦血流量測(cè)定用激光多普勒血流灌注成像儀(PeriScanPiM3， PERIMED， Sweden)測(cè)量蒙 古沙鼠腦血流量。頭皮正中切口，暴露顱骨，去除粘在顱骨的結(jié)締組織。計(jì)算機(jī) 控制的光學(xué)掃描器發(fā)出低能量的氦-氖激光照射在暴露的顱骨上。掃描器與顱骨 的距離是18. 5cm。掃描器的掃描區(qū)域是8X 10 mm，激光束穿透的深度是().5mm。掃描后顯示器上顯示一幅彩色圖像代表不同區(qū)域的灌注水平。記錄在缺血前，再 灌注第1， 2， 3， 4， 5天時(shí)腦血流圖像。所有圖像用LDPIwin軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè) 量。以缺血再灌注前的全腦灌注量為基礎(chǔ)值，計(jì)算再灌注后各時(shí)間點(diǎn)腦血流量的 變化率。 腦微循環(huán)觀察再灌注第5天麻醉動(dòng)物，在頸部正中切開(kāi)，分離氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī) (All:-V8)，在整，觀察過(guò)程保持機(jī)械通氣。暴露股靜脈，插入并留置直徑為5mm 的聚乙烯導(dǎo)管。切開(kāi)腦部皮毛，用手提式顱鉆在前囟點(diǎn)前開(kāi)一3X3mm的顱窗。 將37度的人工腦脊液連續(xù)滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤(rùn)。用連接于熒光攝 像機(jī)(C7M)， HAMAMATSU， Japan)的正立生物顯微鏡(DMLFS， LE丄CA， Germany), 用1()倍物鏡選擇直徑在30-50ym， 200" m長(zhǎng)沒(méi)有明顯彎曲的細(xì)靜脈，連續(xù)觀察 并用連接于熒光攝像機(jī)刻錄機(jī)(DVR-R25, Malata， China)記錄微循環(huán)動(dòng)態(tài)30 分鐘。細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速測(cè)定用連接于生物顯微鏡的高速攝影機(jī)(FASTCAM-ultima APX, photron， Japan), 用1000幅/秒的攝影速度記錄細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈的紅細(xì)胞流速。在25幅/秒的速度 回放錄像中用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.0 software (Med i a Cybernetic, USA)測(cè)量細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈的管徑和細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速。血管徑是同一位置三次測(cè) 量的平均值。黏附于細(xì)靜脈壁白細(xì)胞測(cè)定將熒光標(biāo)記物Rhodamine 6G按5mg/kg. bw的使用量，經(jīng)股靜脈緩慢推注。用連接于生物顯微鏡的超敏感攝像機(jī)(Hamamatsu EB-CCD Camera C7190 Japan) 觀察并紀(jì)錄白細(xì)胞黏附與細(xì)靜脈壁的動(dòng)態(tài)。設(shè)定在細(xì)靜脈壁3()秒位置沒(méi)有發(fā)生 變化的白細(xì)胞為黏附白細(xì)胞。在直徑30-S0nm， 200"ni長(zhǎng)的小靜脈觀察并紀(jì)錄 黏附與血管壁的白細(xì)胞。 細(xì)靜脈壁過(guò)氧化物產(chǎn)生動(dòng)態(tài)測(cè)定將10umol/m]濃度的過(guò)氧化物熒光探針dihydrorhodaniinc 123連續(xù)滴加在 腦觀察部位的表面。當(dāng)過(guò)氧化物與DHK相遇時(shí)，可以將1)HR還原成rhodaminc 123， 用連接于生物顯微鏡的超敏感攝像機(jī)(Ha隨matsu EB-CCD Camera C7190 .)ap;m) 觀察并紀(jì)錄1)HR的發(fā)光部位和強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)510nm，發(fā)射波長(zhǎng)5:Mnm)。為了測(cè) 量血管內(nèi)皮組織熒光強(qiáng)度的差別，用圖像分析軟件Image-Pro plus 5.()測(cè)量血 管內(nèi)腔和血管壁的平均熒光強(qiáng)度。測(cè)量每一個(gè)血管內(nèi)腔和血管壁的平均熒光強(qiáng) 度，它們的差值(D[)反應(yīng)了D1(R被氧化的程度。 血漿白蛋白漏出率算定另取蒙古沙土鼠，將50mg/kg. bw的FITC標(biāo)記的血漿白蛋白經(jīng)股靜脈緩慢推 注。用波長(zhǎng)488nm的氦氖激光束照射在開(kāi)顱部位，用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)觀察并紀(jì) 錄細(xì)靜脈內(nèi)外FTTC標(biāo)記熒光圖像。用圖像分析軟件Image-Pro plus 5. () (Idia Cyl證U:ics lnc， USA)測(cè)定細(xì)靜脈內(nèi)(Iv)和血管外(Ii) F訂C標(biāo)記白蛋白的螢光強(qiáng)度。用ii/:iv的比值以判定細(xì)靜脈內(nèi)白蛋白向血管外漏出的情況。Tuncl染色另取沙鼠，在再灌注5天后經(jīng)左心室以lOmL/分鐘灌注生理鹽水將血管內(nèi)的 血液沖洗干凈后，以3m]/分鐘的速度灌注4%多聚甲醛，灌注20分鐘后轉(zhuǎn)入 1%多聚甲醛浸泡2小時(shí)后，把組織放入-6(TC正己烷速凍，用冰凍切片機(jī) (CM18(X), Leka， German)進(jìn)行冠狀切片，厚度為6 p m。選取含有完整海馬區(qū) 域的切片用Tunel試劑盒(11684795910， Roche， German)進(jìn)行染色，用激光共 聚焦顯微鏡顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞核和Tunel陽(yáng)性的激發(fā)光波長(zhǎng)分別是405和 488，，在海馬CAi區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行Tunel陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。 電鏡在再灌注5天，經(jīng)左心室以10ml/分鐘灌注生理鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干 凈后，以3ml/分鐘的速度灌注固定液，固定液成分為4%甲醛，2%戊二醛，().1M磷酸緩沖液。灌注40分鐘后，然后迅速取下整個(gè)大腦，冠狀切面切成卜加ni 厚組織片，然后轉(zhuǎn)移到,，戊二醛固定液中4'C固定過(guò)夜，然后用().]M磷酸緩沖 液沖洗三次，再用1%俄酸固定液4'C固定2小時(shí)。再用系列丙酮脫水，用Epon812 樹(shù)脂包埋劑包埋，6CTC孵育48小時(shí)。然后進(jìn)行修塊，切成60nm厚的組織片，用 醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，再用JEM-1230透射電鏡觀察(,]EM 1230, .J亂，Jap朋)。 結(jié)果1. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦血流量的影響圖l表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.8g/kg組蒙古沙鼠腦血流量的變化。各組間的腦 血流量在觀察期間內(nèi)沒(méi)有明顯性差異。2. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈管徑的影響圖2表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì) 靜脈血管徑的結(jié)果。各組間腦細(xì)動(dòng)脈和靜脈管徑?jīng)]有顯著變化。3. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的影響圖3表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì) 靜脈紅細(xì)胞流速的結(jié)果。各組間蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速?zèng)]有顯著 性差異。4. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞的影響圖4表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦蒙古沙鼠細(xì) 靜脈壁黏附白細(xì)胞的結(jié)果。假手術(shù)組細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞少于1個(gè)/200um，缺 血再灌注組腦細(xì)靜脈壁的粘附白細(xì)胞數(shù)顯著增加(3. 1±0. 17)，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg和0.8g/kg顯著抑制了腦細(xì)靜脈壁的粘附白細(xì)胞數(shù)(].3±0. 11和1. 3±0. 17)。5. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁D服熒光強(qiáng)度的影響圖5是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg組， 缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)腦細(xì)靜脈壁DHR熒光強(qiáng)度的結(jié)果。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦細(xì)靜脈壁DHR熒光強(qiáng)度顯著 增強(qiáng)，養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘詼p弱腦細(xì)靜脈壁DHR熒光強(qiáng)度的增加。 fi.養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響圖6表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦蒙古沙鼠細(xì) 靜脈白蛋白漏出的結(jié)果。假手術(shù)組腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白僅有少量的漏出。 缺血再灌注組F1TC標(biāo)記白蛋白的漏出顯著增加。養(yǎng)血清腦顆粒濃度依存性減少 腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。7. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦海馬CAl區(qū)神經(jīng)細(xì)胞Tuncl染色的影 響圖7A是假手術(shù)組(a)，缺血再灌注組(b)，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg 組(c)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組(d)蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)大 腦海馬CAl區(qū)Tune]染色的圖像。假手術(shù)組沒(méi)有觀察到Tunel陽(yáng)性細(xì)胞(h)，缺血 再灌注組可以看見(jiàn)許多Tunel陽(yáng)性細(xì)胞(b)，養(yǎng)血清腦顆粒給藥組Ttmel陽(yáng)性細(xì)胞 濃度依存性減少(c和d)。圖7B是各組腦海馬CAl區(qū)Timel染色的結(jié)果。與假手術(shù) 組相比，缺血再灌注組海馬CAl區(qū)Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，養(yǎng)血清腦顆粒 可以濃度依存性減少海馬CA1區(qū)Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。8. 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)超微結(jié)構(gòu)的影響 圖8是假手術(shù)組(A，D)，缺血再灌注組(B，E)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒組(C,F)蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)血管透射電鏡的圖像。假手術(shù)組可以觀察到 血管內(nèi)皮光滑，血管周圍組織的無(wú)水腫現(xiàn)象(A,D)。缺血再灌注組可以觀察到血 管周圍組織出現(xiàn)明顯水腫(B, E)。缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒組可以觀察到血管周 圍水腫明顯減輕(C, F)。圖9是假手術(shù)組(A,D)，缺血再灌注組(B，E)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒 組(C，F(xiàn))蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)海馬神經(jīng)元透射電鏡的圖像。假手術(shù)組海馬 神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整(A,D)。缺血再灌注組海馬出現(xiàn)暗細(xì)胞， 神經(jīng)元損傷(B，E)。缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒組形態(tài)較完整，損傷較輕(C，F(xiàn))。 結(jié)論在結(jié)扎蒙古沙鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈引起的蒙古沙鼠全腦缺血再灌注損傷3小時(shí) 后，開(kāi)始給予養(yǎng)血清腦顆粒5日，可以抑制腦微循環(huán)障礙和腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，該作用可能與其抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生和調(diào)亡相關(guān)。實(shí)驗(yàn)二、動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重27(廣300g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，合 格證號(hào)SYXK (京)2002-0002。在12小時(shí)切換燈源，溫度22。C，相對(duì)濕度40% 的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。 藥物養(yǎng)血清腦顆粒主要組成為當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍 珠母、細(xì)辛等，天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z 10960082，批號(hào) 050608。實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配制成().16 g/ml、 0.08 g/ml的溶液。 試劑Rh()clamine 6G，購(gòu)買于美國(guó)FLUKA公司，批號(hào)83688。 F)uorosccin i sothiocyanate Conjugate Bovine A.lb咖in (FTTC-album:i n)， 由美國(guó)S1(;MA 公司生產(chǎn)。 模型的建立用20%烏拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw)，在頸部正中切開(kāi)，逐層分 離頸部右側(cè)肌肉(胸骨舌骨肌，胸鎖乳突肌)，小心分離頸總動(dòng)脈及其分支，用 微動(dòng)脈夾夾閉經(jīng)總動(dòng)脈近心端，雙線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并于中間剪斷，于近心端游 離斷支系一活結(jié)，分離頸內(nèi)動(dòng)脈致翼腭動(dòng)脈(PtA)分支處，用微動(dòng)脈夾夾閉頸 內(nèi)動(dòng)脈，用顯微剪在結(jié)扎處和活結(jié)中間開(kāi)一小孔，將動(dòng)脈插線(3-0 prolene， Johnson&Johnson， USA)小心插入后將活結(jié)扎緊，去除頸內(nèi)動(dòng)脈微動(dòng)脈夾，將動(dòng) 脈插線插入1.8、2.2 cm，造成缺血，60 min后撤出動(dòng)脈插線扎緊活結(jié)，開(kāi)始再 灌注(T/iO。假手術(shù)組除了不插入動(dòng)脈插線，其他操作同缺血再灌注組。給藥組 在麻醉前90分鐘分別灌胃給與養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg和0. 8g/kg。 腦微循環(huán)的觀察動(dòng)物麻醉后，暴露股靜脈，插入并留置直徑為1 mm聚乙烯導(dǎo)管。在頸部正 中切開(kāi)，逐層分離肌肉，游離氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(A1X-V8)。切開(kāi)腦部皮 毛，用手提式顱鉆在頂葉冠狀縫后，矢狀縫右，開(kāi)大小約為4X6 mm的顱窗。 用細(xì)針頭把硬腦膜刺破，并用顯微鑷、剪把硬腦膜撕剪開(kāi)，暴露腦皮質(zhì)。將37 °C的人工腦脊液連續(xù)滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤(rùn)。置于可視化動(dòng)態(tài)正置微循 環(huán)觀察系統(tǒng)下觀察，使用連接于熒光攝像機(jī)的正立生物顯微鏡的io倍物鏡選擇 直徑在20-40 um、 200 u m內(nèi)沒(méi)有明顯彎曲和分支的細(xì)靜脈。在基礎(chǔ)觀察20 分鐘后，用線栓法使大腦中動(dòng)脈缺血，60分鐘后撤出動(dòng)脈插線，再灌注開(kāi)始。 將大鼠移至正置顯微鏡下，用連接于熒光攝像機(jī)刻錄機(jī)(DVR-560I1, PHLIPS， Holland)連續(xù)觀察并記錄再灌注0 min， 20 min， 40 m'n， 60 min同一視野內(nèi) 選定血管的微循環(huán)動(dòng)態(tài)。細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的測(cè)定及管徑變化率的測(cè)定用連接于生物顯微鏡的高速攝影機(jī)，以1024幅/秒的攝影速度，記錄在缺血 前以及再灌注0min， 20min， 40 min， 60 min時(shí)同一視野內(nèi)細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速。在回放的高速攝像錄像DVD上，用圖像分析軟件:[mage-Proplus 5. 0 (Media C'yht'mt、t「ics Jnc， USA)測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)紅細(xì)胞血流速度，并對(duì)選定血管的管徑進(jìn) 行三次測(cè)量，取其均值，用各時(shí)間點(diǎn)的均值與基礎(chǔ)值的比表示血管徑變化率。 黏附于細(xì)靜脈壁白細(xì)胞的測(cè)定將熒光標(biāo)記物Rhodamine 6(;按5 mg/kg. bw的使用量，在基礎(chǔ)觀察前5 min 經(jīng)股靜脈緩慢推注。用連接于正置生物顯微鏡(BX51WI， 0LYMPUS， JAPAN)的攝 像頭(USS-301， l國(guó),USA)在波長(zhǎng)543 nm下，觀察并紀(jì)錄在缺血前，再灌注() min、 20 min、 40 min、 60 min的熒光圖像，在回放的錄像中計(jì)數(shù)200 u ni長(zhǎng)細(xì) 靜脈內(nèi)停留于血管壁同一位置超過(guò)30秒以上的白細(xì)胞數(shù)。 細(xì)靜脈血漿白蛋白漏出率將FITC標(biāo)記的血漿白蛋白按50 mg/kg. bw的使用量，在基礎(chǔ)觀察前10 min 經(jīng)股靜脈緩慢推注給藥。用連接于正置生物顯微鏡的攝像頭在波長(zhǎng)488 nm下， 觀察并紀(jì)錄在缺血前，以及再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 min時(shí)同一視野 的熒光圖像。在回放的DVD上，在用圖像分析軟件Image-Pr叩lus 5.0 (Media Cybemetrics Inc, USA)測(cè)定細(xì)靜脈內(nèi)外FITC熒光強(qiáng)度。以I/R前的細(xì)靜脈血 管外與細(xì)靜脈血管內(nèi)的FITC熒光強(qiáng)度的比值為基礎(chǔ)值，用各時(shí)間點(diǎn)的比值與基 礎(chǔ)值的比表示FITC熒光強(qiáng)度的變化率。 腦血流量測(cè)定另取大鼠，用激光多普勒血流灌注成像儀(Per J Scan P頂3， Pt':RIMED， Sweden)觀'J定缺血前(0 min)， 缺血后5 min，再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 n"n
時(shí)觀察和記錄區(qū)域的腦血流量，用LDPIwin軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量。以1/R前的測(cè)
定數(shù)值為基礎(chǔ)值，用再灌注后各時(shí)間點(diǎn)腦血流量與基礎(chǔ)值的比表示腦血流量的變化率。
結(jié)果
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠腦局部血流量的影響
圖l()是用激光多普勒血流量?jī)x測(cè)得的Sham組、I/R組、C(;0.4+I/R組和 a;().8+l/R組在缺血前，缺血5分鐘，再灌注后大鼠腦患側(cè)血流量圖。Sham組大 鼠各時(shí)間腦血流量無(wú)明顯變化。]:/R組大鼠在缺血5分鐘時(shí)，腦血流量明顯降低， 再灌注后腦血流量逐漸恢復(fù)。CGO. 4+I/R組和CG(). 8+l/R組大鼠在缺血5分時(shí)的 腦血流量也顯著降低，但在再灌注開(kāi)始，腦血流量恢復(fù)速度比較快。
圖11是各組腦血流量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，[/R組，C(;O. 4+I/R組和C(;(). 8+『/K組在 缺血5分時(shí)腦血流量顯著降低，C(;O. 4+l/R組在再灌注0分和再灌注20分有一 過(guò)性的升高，CGO. 8+l/R組在再灌注20分腦血流量也有一過(guò)性的升高。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠腦細(xì)靜脈管徑變化率的影響
圖丄2顯示Sham組，工/R組，C(;O. 4+I/R組和CGO. 8+T/R組大鼠腦細(xì)靜脈管 徑在整個(gè)觀察過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)]:/R后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的影響
圖13顯示Sham組，1/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組在缺血前和再灌 注后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的經(jīng)時(shí)變化。Sham組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在 本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著的變化。17R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流在再灌注()時(shí) 顯著下降，持續(xù)到再灌注40分。CG0.4+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在再灌 注Omtn時(shí)顯著也有所下降，然后逐漸恢復(fù)。CGO. 8+工/R組在再灌注Omin時(shí)顯著 也有所下降，但是恢復(fù)速度比I/R組快。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)I/R后大鼠腦細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞的影響
圖14顯示Sham組，I/R組，CG(). 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞數(shù)量的變化。在本觀察期間內(nèi)，Sham組大鼠腦細(xì)靜脈壁僅有少量的 白細(xì)胞黏附，I/R組大鼠在再灌注開(kāi)始后，腦細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附數(shù)量顯著地增 多，并持續(xù)增多到本觀察結(jié)束時(shí)。養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘砸种拼笫蟠笫竽X細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附的增加。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)I/R后大鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響
圖15顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+丄/R組和CGO. 8十I/R組大鼠腦細(xì)靜脈FH'C 標(biāo)記白蛋白漏出的動(dòng)態(tài)。Sham組大鼠，在本觀察期間內(nèi)大鼠腦細(xì)靜脈IMTC標(biāo)記 白蛋白僅有少量的漏出。I/R組大鼠腦細(xì)靜脈FTC標(biāo)記白蛋白的漏出從再灌注0 分后顯著地增加一直持續(xù)到再灌注60分。C(;的投予在再灌注W)分顯著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠腦細(xì)靜脈F [TC標(biāo)記白蛋白的漏出。 結(jié)論
養(yǎng)血清腦顆粒的預(yù)給藥可以預(yù)防大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的大鼠患側(cè)大 腦皮層的微循環(huán)障礙。 實(shí)驗(yàn)三、 動(dòng)物
蒙古沙土鼠，雄性，體重65 90g,購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，合格證 號(hào)SCXK (京)2000-0012。在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心，按北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物處理規(guī)定，自由進(jìn)食飲水，單籠飼養(yǎng)，溫度22'C,相對(duì)濕度4(W， 12小時(shí) 切換燈源(早晨7點(diǎn)開(kāi)燈)。 藥物
養(yǎng)血清腦顆粒由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)Z1096(K)82。生 產(chǎn)過(guò)程根據(jù)嚴(yán)格的現(xiàn)代生產(chǎn)工藝，藥物成分標(biāo)準(zhǔn)化。養(yǎng)血清腦顆粒的主要成分是 當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍珠母、細(xì)辛，實(shí)驗(yàn)前配制成80呢AiJ 和16()mg/mJ的水溶液。 化學(xué)試劑
Dihydrorhodamine 123 (DHR)購(gòu)買于美國(guó)Eugene公司，異硫氰酸熒光素標(biāo) 記白蛋白(F1TC-albumin)購(gòu)買于美國(guó)SIGMA公司，Rhodamine 6G perch丄orate 購(gòu)買于美國(guó)FLUKA公司，烏來(lái)糖(Urethane)購(gòu)買于中國(guó)上海天蓮精細(xì)化工有限 公司生產(chǎn)。 動(dòng)物模型
取20%烏拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，經(jīng)腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在頸 部正中切開(kāi)，分離氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V8)，在整個(gè)觀察過(guò)程保持機(jī)械通氣。特殊設(shè)計(jì)的閉合器(一根細(xì)的聚乙烯導(dǎo)管和一根粗的塑料管組成的套索) 放置在雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不影響血流'1。暴露股靜脈，插入并留置直徑為5mm的聚 乙烯導(dǎo)管。切開(kāi)腦部皮毛，用手提式顱鉆在前囟點(diǎn)前開(kāi)一3X3,的顱窗。將37 度的人工腦脊液連續(xù)滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤(rùn)。用連接于熒光攝像機(jī)
(C719()， IIAM認(rèn)ATSU， J即an)的正立生物顯微鏡(DMLFS， LF」CA， Germany), 用10倍物鏡選擇直徑在30-50 pm， 200um長(zhǎng)沒(méi)有明顯彎曲的細(xì)靜脈，在監(jiān)視器 上基礎(chǔ)觀察(.即8A, TCL, Huizhou， Chjna) ]O分后，閉索蒙古沙土鼠雙側(cè)頸 動(dòng)脈(缺血)，30分后解除閉索(再灌注)il。連續(xù)觀察并用連接于熒光攝像機(jī)刻 錄機(jī)(DVR-R25， Malata， China)記錄微循環(huán)動(dòng)態(tài)60分鐘。假手術(shù)組不閉索雙 側(cè)頸動(dòng)脈，其他操作同缺血再灌注組。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg +缺血再灌注組， 養(yǎng)血清腦顆0. 8g/kg +缺血再灌注組在缺血再灌注90分鐘前,分別用灌胃管，灌 胃給予養(yǎng)血清腦顆粒水溶液0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw。 細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速測(cè)定
用連接于生物顯微鏡的高速攝影機(jī)(FASTCAM-ultima APX， phoLron, Japan)， 用l()O()幅/秒的攝影速度記錄細(xì)靜脈的紅細(xì)胞流速。在25幅/秒的速度回放錄像 中用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.0 software (Med j a Cybernetic, USA)測(cè) 量在缺血前，以及再灌注開(kāi)始0分、10分、20分、30分、40分、50分、分時(shí) 同一視野內(nèi)細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速，流速的變化率定義為再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的流速與 缺血前流速的比值。 細(xì)靜脈壁過(guò)氧化物產(chǎn)生動(dòng)態(tài)測(cè)定
在基礎(chǔ)觀察前10分鐘，將lOumol/ml濃度的過(guò)氧化物熒光探針 dihydrorhod柳ine 123連續(xù)滴加在腦觀察部位的表面。當(dāng)過(guò)氧化物與DHR相遇 時(shí)，可以將D服還原成rhodamine 123，用連接于生物顯微鏡的超敏感攝像機(jī) (IJamamatsu EB-CCD Camera C7190 Japan)觀察并紀(jì)錄DHR的發(fā)光部位和強(qiáng)度 (激發(fā)波長(zhǎng)510nm，發(fā)射波長(zhǎng)534nm)。為了測(cè)量血管內(nèi)皮組織熒光強(qiáng)度的差別， 用圖像分析軟件Image-Pro plus 5. 0測(cè)量血管內(nèi)腔和血管壁的平均熒光強(qiáng)度。 測(cè)量每一個(gè)血管內(nèi)腔和血管壁的平均熒光強(qiáng)度，它們的差值(Dl)反應(yīng)了 DHR 被氧化的程度。測(cè)量缺血前(Ibase)，以及再灌注開(kāi)始0分、L0分、2()分、30 分、犯分、50分、60分時(shí)細(xì)靜脈壁和血管內(nèi)熒光強(qiáng)度差值([x)，以缺血前的數(shù)值為基礎(chǔ)值，用各時(shí)間的值(Ix)與基礎(chǔ)值(Ibase)的比表示DI1R螢光強(qiáng)度
的變化，以判定細(xì)靜脈壁過(guò)氧化物的產(chǎn)生動(dòng)態(tài)。
黏附于細(xì)靜脈壁白細(xì)胞測(cè)定
另取蒙古沙土鼠，在基礎(chǔ)觀察前()分鐘，將熒光標(biāo)記物l化odam]'nc W;按 5mg/kg.bw的使用量，經(jīng)股靜脈緩慢推注。用連接于生物顯微鏡的共聚焦掃描裝 置(mo-lhd Radiance 2100， England )和計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)(Del 1 opt. i pi ex (;x2W), Germany)進(jìn)行觀察和記錄。用波長(zhǎng)5"rai的氦氖激光束照射在開(kāi)顱部位 進(jìn)行觀察，圖像經(jīng)『hU A/[〕轉(zhuǎn)換器數(shù)字華后，X-t掃描熒光圖像 (512X512X8-bit)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)等待處理。設(shè)定3()秒掃描的30張圖片中部 位沒(méi)有發(fā)生變化的白細(xì)胞為黏附白細(xì)胞。在直徑30-50iim， 200pm長(zhǎng)的小靜脈 觀察并紀(jì)錄在缺血前，以及再灌注0分、10分、30分、60分黏附與血管壁的白 細(xì)胞。
細(xì)靜脈管徑及血漿白蛋白漏出率測(cè)定
另取蒙古沙土鼠，在基礎(chǔ)觀察前10分鐘，將50mg/kg. bw的F1TC標(biāo)記的血 漿白蛋白經(jīng)股靜脈緩慢推注。用波長(zhǎng)488nm的氦氖激光束照射在開(kāi)顱部位，用共 聚焦顯微鏡系統(tǒng)觀察并紀(jì)錄在缺血前，以及再灌注開(kāi)始、l()分、3()分、W)分時(shí) 同一視野內(nèi)細(xì)靜脈內(nèi)外F1TC標(biāo)記熒光圖像。用圖像分析軟件Image-Pro plus 5.()
(Media Cybemetries Inc, USA)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)細(xì)靜脈管徑血管內(nèi)徑。血管徑是 同一位置三次測(cè)量的平均值。管徑的變化率是再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的管徑與缺血前 管徑的比值。用工mage-Pro plus 5. 0測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)靜脈內(nèi)(lv)和血管外
(li) 「]TC標(biāo)記白蛋白的螢光強(qiáng)度。以缺血再灌注前的細(xì)靜脈血管外的FITC螢 光強(qiáng)度(IU與細(xì)靜脈血管內(nèi)的FITC螢光強(qiáng)度(lv)的比值為基礎(chǔ)值，用各時(shí) 間li/]v的比值與基礎(chǔ)值的比表示FITC螢光強(qiáng)度的變化，以判定細(xì)靜脈內(nèi)白蛋 白向血管外漏出的動(dòng)態(tài)。 腦血流量測(cè)定
一部分蒙古沙土鼠，用激光多普勒血流灌注成像儀(PeHScan PIM3， Pl':R丄,，Sweden)測(cè)量腦血流量。頭皮正中切口，暴露顱骨，去除粘在顱骨的 結(jié)締組織。計(jì)算機(jī)控制的光學(xué)掃描器發(fā)出低能量的氦-氖激光照射在暴露的顱骨 上。掃描器與顱骨的距離是18.5cm。掃描器的掃描區(qū)域是8X10 mm,激光束穿透的深度是0.5mm。掃描后顯示器上顯示一幅彩色圖像代表不同區(qū)域的灌注水 平。記錄在缺血前，再灌注開(kāi)始0分、i0分、20分、30分、犯分、50分、60 分時(shí)腦血流圖像。所有圖像用LDPIwin軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量。以缺血再灌注前的 全腦灌注量為基礎(chǔ)值，計(jì)算再灌注后各時(shí)間點(diǎn)腦血流量的變化率。 電鏡
在再灌注60分鐘后，經(jīng)左心室以]Oml/分鐘灌注生理鹽水將血管內(nèi)的血液 沖洗干凈后，以3ml /分鐘的速度灌注固定液，固定液成分為4%甲醛，2% 戊二醛，0. 1M磷酸緩沖液。灌注40分鐘后，然后迅速取下整個(gè)大腦，冠狀切面 切成1--2mm厚組織片，然后轉(zhuǎn)移到3%戊二醛固定液中4'C固定過(guò)夜，然后用().1M 磷酸緩沖液沖洗三次，再用"/。俄酸固定液4。C固定2小時(shí)。再用系列丙酮脫水， 用f':pon812樹(shù)脂包埋劑包埋，6(TC孵育48小時(shí)。然后進(jìn)行修塊，切成6()nm厚 的組織片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，再用JEM-1230透射電鏡觀察(.U:M 1230， ,,，Japan)。
掃描電鏡標(biāo)本制備，灌流后迅速取下整個(gè)大腦，切成大約幾個(gè)毫米寬的小 方薄片。先用戊二醛固定2小時(shí)，用0. 1M磷酸緩沖液沖洗，再用().1M磷酸緩 沖液配置的0、(h固定2小時(shí)，用系列酒精脫水，標(biāo)本移入醋酸戊酯。樣品放在干 燥器樣品盒，用C(),'臨界點(diǎn)干燥法，使樣品干燥而不變形。用導(dǎo)電膠將樣品粘在 樣品托上，然后在離子鍍膜儀中鍍金3分鐘，以使樣品表面導(dǎo)電。最后在掃描電 鏡.1SM-56()0LV(,fSiVI-5600LV, JE0L, Japfcin)下觀察。 開(kāi)放毛細(xì)血管計(jì)數(shù)
皮質(zhì)毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)在各組的放大20倍的掃描電鏡圖像中計(jì)數(shù)。每組圖像 的開(kāi)放毛細(xì)血管數(shù)的平均值為各組沙鼠的大腦皮質(zhì)的平均開(kāi)放毛細(xì)血管密度，結(jié) 果在圖24中。結(jié)果
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈管徑的影響
圖16表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 血管徑的連續(xù)變化。假手術(shù)組在本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著地變化。缺血再灌注組 細(xì)靜脈在再灌注開(kāi)始時(shí)有一過(guò)性輕微擴(kuò)張，持續(xù)到再灌注分。養(yǎng)血清腦顆粒 0.化/kK+缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組的腦細(xì)靜脈管徑在觀 察期間內(nèi)沒(méi)有顯著地變化。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的影響
圖i7表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.化/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 紅細(xì)胞流速的連續(xù)變化。假手術(shù)組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在本觀察期間內(nèi) 沒(méi)有顯著地變化。缺血再灌注組在再灌注開(kāi)始到再灌注20分期間腦細(xì)靜脈紅細(xì) 胞血流速度顯著地降低。養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg給藥組在再灌注IO分后，顯著 地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞血流速度的降低。養(yǎng)血清腦顆粒0. 8 組在再灌注丌始時(shí)就抑制了的腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞血流速度的降低。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦血流量的影響
圖18表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦血流量 的連續(xù)變化。假手術(shù)組的腦血流量在本觀察期間內(nèi)沒(méi)有明顯的變化，缺血再灌注 組在再灌注開(kāi)始后顯著降低，且持續(xù)到再灌注60分。養(yǎng)血清腦顆粒0.1g/kg+缺 血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注10分后，顯著地抑制了 缺血再灌注引起的腦血流量的降低。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞的影響
圖J9表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞的連續(xù)變化。假手術(shù)組在觀察結(jié)束時(shí),黏附于腦細(xì)靜脈壁的白細(xì)胞在 不到3個(gè)/200um。缺血再灌注組于蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁的白細(xì)胞數(shù)在再灌注開(kāi) 始增加，在再灌注結(jié)束時(shí)，已經(jīng)達(dá)到6個(gè)/2()0 n m。養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg+缺血再灌注組，在再灌注3()分后顯著地抑制了白細(xì)胞與大腦細(xì)靜脈管壁粘附。養(yǎng)血 清腦顆粒().8+缺血再灌注組，在再灌注IO分后就顯著地抑制了白細(xì)胞與大腦細(xì) 靜脈管壁粘附。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁)HR熒光強(qiáng)度的影響
圖20是缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒組蒙古沙鼠在缺血再灌注甜和再灌注 6()分時(shí)腦細(xì)靜脈壁D服熒光強(qiáng)度變化的圖像。缺血再灌注蒙古沙鼠(a)和養(yǎng)血 清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠(c)在缺血前，沒(méi)有觀察到細(xì)靜脈壁DHR熒光發(fā) 光部位.在再灌注60分時(shí)，可以觀察到缺血再灌注蒙古沙鼠沿腦細(xì)靜脈壁l)MR 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的部位(b)，而養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠沒(méi)有觀察到 腦細(xì)靜脈壁l)服熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)(d).
圖21表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒().1g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒().8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 壁DIIR熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化。假手術(shù)組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁的l)HK熒光強(qiáng)度比在 本觀察期間內(nèi)幾乎沒(méi)有變化。缺血再灌注組蒙古沙鼠腦靜脈壁的l)冊(cè)熒光強(qiáng)度比 在再灌注10分后開(kāi)始增加，且持續(xù)增加。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組 和養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注l()分顯著地抑制了缺血再灌注引起 的腦細(xì)靜脈壁的1川R螢光強(qiáng)度的增加。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響
圖22是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈FITC 標(biāo)記白蛋白漏出的圖像。在缺血再灌注前，假手術(shù)蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙 鼠和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠均沒(méi)有觀察到F1TC標(biāo)記白蛋白漏出細(xì)
靜脈外。在再灌注60分時(shí)，假手術(shù)蒙古沙鼠幾乎沒(méi)有觀察到腦細(xì)靜脈Frrc標(biāo)記
白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以觀察到FITC標(biāo)記白蛋白的明顯漏出。 養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分時(shí)，只有少量F(TC標(biāo)記 白蛋白的漏出于細(xì)靜脈外。 '
圖23表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 HTC標(biāo)記白蛋白漏出的連續(xù)變化。假手術(shù)組在本觀察期間，腦細(xì)靜脈F「「C標(biāo)記 白蛋白的僅有少量的漏出。缺血再灌注組從再灌注開(kāi)始就可觀察到F1TC標(biāo)記白蛋白的漏出，并持續(xù)增加。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組在再灌注6()分
顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜脈Fn'c標(biāo)記白蛋白的漏出。養(yǎng)血清腦顆
粒().8+缺血再灌注組在再灌注30分以后顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜 脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)超微結(jié)構(gòu)的影響
圖24-A是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組大腦皮質(zhì) 掃描電鏡下毛細(xì)血管開(kāi)放的圖像。假手術(shù)組可見(jiàn)皮質(zhì)中有許多毛細(xì)血管，且分布 較均勻。缺血再灌注組可以觀察到開(kāi)放的毛細(xì)血管顯著減少，而且分布不均勻， 養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組開(kāi)放的毛細(xì)血管數(shù)量與假手術(shù)組相接近。圖 是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)的結(jié) 果。毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)相對(duì)于假手術(shù)組(41.33±0.667)在缺血再灌注后明顯下降
(30. 33± 1.667 )，養(yǎng)血清腦顆粒顯著抑制了毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)的減少
"2±0. 577)。
圖25是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠再 灌注6()分后的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管的透射電鏡和掃描電鏡的圖象。圖a， h， c是 透射電鏡圖像，假手術(shù)組(a)可以觀察到血管內(nèi)皮光滑，血管周圍組織的無(wú)水 腫現(xiàn)象。缺血再灌注組(b)可以觀察到血管周圍組織出現(xiàn)明顯水腫。養(yǎng)血清腦 顆粒+缺血再灌注組(c)可以觀察到血管周圍水腫明顯減輕。圖d， c，('是掃描 電鏡圖像，假手術(shù)組(d)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮光滑，內(nèi)皮細(xì)胞間 連接緊密。缺血再灌注組(e)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮可以觀察到血 管內(nèi)細(xì)胞眾多的隆起，內(nèi)皮細(xì)胞連接處，細(xì)胞間相互嵌合的指狀突起肥大，且內(nèi) 皮表面出現(xiàn)許多突起的小泡。養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組(f)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部 細(xì)靜脈血管內(nèi)皮較光滑，連接處指狀突起和小泡明顯減少。
結(jié)論養(yǎng)血清腦顆粒的預(yù)給藥可以抑制缺血再灌注引起的蒙古沙鼠腦皮層微 循環(huán)障礙，該作用與其抑制過(guò)氧化物，抑制白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，保護(hù)血 管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血漿白蛋白外漏相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)四、
動(dòng)物 '
S[)大鼠，雄性，體重27(廣300 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，合格證號(hào)SYXK (京)2002-0002。在12小時(shí)切換燈源，溫度22。C，相對(duì)濕度'10%
的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。
藥物
養(yǎng)血清腦顆粒主要組成為當(dāng)歸、川芎、白芍、鉤藤、雞血藤、夏枯草、珍 珠母、細(xì)辛等，天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z1()96()()82，批號(hào) 050608。實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配制成O. 16 g/m]、 0.08 g/ml的溶液。 試劑
Rhodfcimine 6(;，購(gòu)買于美國(guó)FU」KA公司，批號(hào)83688。 Fl uor。sco i n is()thiocyanate Conjugate Bovine Albumin (FITC-albumin)， 由美國(guó)SI(;MA 公司生產(chǎn)。硫酸阿托品注射液(Atropine Sulfate [njecU'on)，天津金耀氨 基酸有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0504121。肝素鈉，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公 司生產(chǎn)，批號(hào)0506117。烏拉坦，北京化學(xué)試劑公司，分析純，批號(hào)0棚1。 SP-9()()0免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)買于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗 l)UMA多克隆抗體購(gòu)買于Cell signaling。羊抗P53多克隆抗體，小鼠抗 Caspa.se-3單克隆抗體，兔抗Bel-2多克隆抗體購(gòu)買于Santa Cruz公司。 模型的建立
用20°/。烏拉坦肌肉注射麻醉大鼠(2.5 g/kg.bw)，在頸部正中切開(kāi)，遂層分 離頸部右側(cè)肌肉(胸骨舌骨肌，胸鎖乳突肌)，小心分離頸總動(dòng)脈及其分支，用 微動(dòng)脈夾夾閉經(jīng)總動(dòng)脈近心端，雙線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并于中間剪斷，于近心端游 離斷支系一活結(jié)，分離頸內(nèi)動(dòng)脈致翼腭動(dòng)脈(PtA)分支處，用微動(dòng)脈夾夾閉頸 內(nèi)動(dòng)脈，用顯微剪在結(jié)扎處和活結(jié)中間開(kāi)一小孔，將動(dòng)脈插線(3-0 prolcne， Johnson&Johnson， USA)小心插入后將活結(jié)扎緊，去除頸內(nèi)動(dòng)脈微動(dòng)脈夾，將動(dòng) 脈插線插入1.8 2.2 cm，造成缺血，60 min后撤出動(dòng)脈插線扎緊活結(jié)，開(kāi)始再 灌注(I/R)。假手術(shù)組除了不插入動(dòng)脈插線，其他操作同缺血再灌注組。給藥組 在麻醉前90分鐘分別灌胃給與養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg和().8g/kg。 腦微循環(huán)的觀察
動(dòng)物麻醉后，暴露股靜脈，插入并留置直徑為1 mm聚乙烯導(dǎo)管。在頸部正 中切開(kāi)，逐層分離肌肉，游離氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(ALC-V8)。切開(kāi)腦部皮 毛，用手提式顱鉆在頂葉冠狀縫后，矢狀縫右，開(kāi)大小約為4X6 mm的顱窗。用細(xì)針頭把硬腦膜刺破，并用顯微鑷、剪把硬腦膜撕剪開(kāi)，暴露腦皮質(zhì)。將37 °C 的人工腦脊液連續(xù)滴加在顱窗上以保持大腦表面濕潤(rùn)。置于可視化動(dòng)態(tài)正置微循 環(huán)觀察系統(tǒng)下觀察，使用連接于熒光攝像機(jī)的正立生物顯微鏡的K)倍物鏡選擇 直徑在20-40 ym、 200 um內(nèi)沒(méi)有明顯彎曲和分支的細(xì)靜脈。在基礎(chǔ)觀察20 分鐘后，用線栓法使大腦中動(dòng)脈缺血，60分鐘后撤出動(dòng)脈插線，再灌注開(kāi)始。 將大鼠移至正置顯微鏡下，用連接于熒光攝像機(jī)刻錄機(jī)(DVR-5柳1， PIIL1PS， Holland)連續(xù)觀察并記錄再灌注0 min， 20 min， 40 min， 60 min同一視野內(nèi) 選定血管的微循環(huán)動(dòng)態(tài)。
細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的測(cè)定及管徑變化率的測(cè)定
用連接于生物顯微鏡的高速攝影機(jī)，以1024幅/秒的攝影速度，記錄在缺血 前以及再灌注()min， 20min， 40min， 60 min時(shí)同一視野內(nèi)細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速。
在回放的高速攝像錄像[)VD上，用圖像分析軟件mage-Proplus 5. 0 (Mc)dia Cyhenic、trics Inc, USA)測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)紅細(xì)胞血流速度，并對(duì)選定血管的管徑進(jìn) 行三次測(cè)量，取其均值，用各時(shí)間點(diǎn)的均值與基礎(chǔ)值的比表示血管徑變化率。 黏附于細(xì)靜脈壁白細(xì)胞的測(cè)定
將熒光標(biāo)記物Rh()dainine 6(;按5 mg/kg. bw的使用量，在基礎(chǔ)觀察前5 min 經(jīng)股靜脈緩慢推注。用連接于正置生物顯微鏡(BX51WI， ()LYMPUS， JAPAN)的攝 像頭(險(xiǎn)3(H，嗎，USA)在波長(zhǎng)543 nm下，觀察并紀(jì)錄在缺血前，再灌注() min、 20 min、 40 min、 60 min的熒光圖像，在回放的錄像中計(jì)數(shù)200 ii m長(zhǎng)細(xì) 靜脈內(nèi)停留于血管壁同一位置超過(guò)30秒以上的白細(xì)胞數(shù)。 細(xì)靜脈血漿白蛋白漏出率
將FTC標(biāo)記的血漿白蛋白按50 mg/kg. bw的使用量，在基礎(chǔ)觀察前10 mi n 經(jīng)股靜脈緩慢推注給藥。用連接于正置生物顯微鏡的攝像頭在波長(zhǎng)488 nm下， 觀察并紀(jì)錄在缺血前，以及再灌注0 min、 20 min、 40 min、 60 min時(shí)同一視野 的熒光圖像。在回放的DVD上，在用圖像分析軟件Image-Pr叩]us 5.0 (Media Cybemetrics :Lnc， USA)測(cè)定細(xì)靜脈內(nèi)外FITC熒光強(qiáng)度。以1/lr前的細(xì)靜脈血 管外與細(xì)靜脈血管內(nèi)的FITC熒光強(qiáng)度的比值為基礎(chǔ)值，用各時(shí)間點(diǎn)的比值與基 礎(chǔ)值的比表示FITC熒光強(qiáng)度的變化率。 腦血流量測(cè)定另取大鼠，用激光多普勒血流灌注成像儀(PeriScan P1M3， P[':KIMf':D， Svvc'don) 須(j定缺血前(()min)， 缺血后5 min， ■再灌注0 min、 20 min、 '") min、 W) min 時(shí)觀察和記錄區(qū)域的腦血流量，用LDPlwin軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量。以1/ir前的測(cè) 定數(shù)值為基礎(chǔ)值，用再灌注后各時(shí)間點(diǎn)腦血流量與基礎(chǔ)值的比表示腦血流量的變 化率。
活體腦片鈣離子染色
另取大鼠，A 1小時(shí)后，麻醉后取腦，將腦放入pH為7./)的人工腦脊液 中(ACS";將腦組織倒放在腦片槽中，用切片刀做冠狀切片，厚度約為1 mm， 選擇的觀察面位于距離Interaural Line (耳間線)約6. 4 mm、距離Bregma (前 鹵點(diǎn))約2. 6 mm的切面。將腦冠狀切片放入冷ACSF中，通入純氧穩(wěn)定5分鐘； 然后將穩(wěn)定后的腦片移至含有30 uM的FLuo-3/AM和2 ul/ml Pluroriic 卩-127(18%(w/v))的室溫ACSF中，通純氧負(fù)載45分鐘；后以不含熒光探針的ACSF 洗潘2 — 3次，轉(zhuǎn)入含有2 ug/mL的Hoechst33342的ACSF中，室溫下通純氧染 核5分鐘；再以不含熒光探針的ACSF洗滌2 — 3次，移入通有純氧的ACSF中穩(wěn) 定20分鐘。即可平鋪在塑料皿內(nèi)觀察。用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)，設(shè)激 發(fā)波長(zhǎng)分別為405 nm (核)、488隨(Fluo-:0，用63倍物鏡對(duì)腦片皮層位置l化 至Partl區(qū)域接近表面的層面鈣離子濃度進(jìn)行觀察和記錄。不同區(qū)域取五個(gè)視 野，計(jì)數(shù)鈣超載神經(jīng)元和神經(jīng)元總數(shù)，計(jì)算鈣超載神經(jīng)元占總計(jì)數(shù)神經(jīng)元總數(shù)的 比為鈣超載神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞率。 氯化三苯四氮唑(TTC)染色
另取大鼠，再灌注24小時(shí)麻醉后，剪下頭部置于腦定位儀沿視交叉往后平 均切成5片，用含2%TTC的磷酸鹽緩沖液在37'C染色30min，然后再用4%多聚甲 醛固定并拍照。用Image-Pro-Plus軟件測(cè)量梗死比率(即梗死區(qū)體積占同側(cè)大腦 半球的百分比)。
光鏡腦組織切片制備及Nissl染色
另取大鼠，再灌注24小時(shí)麻醉后，經(jīng)左心室插管灌注。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將 每組大鼠快速用生理鹽水250ml (室溫)灌注，再用4%多聚甲醛150ml (fC) 緩慢灌注，持續(xù)60min左右，迅速取腦，在腦定位模具中沿視交叉冠狀位切取腦 組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中后固定6 811后入30%的蔗糖中，待腦組織沉底后冰凍切片，制成20to厚的切片，每隔5張切片取5張分別行常規(guī)Nissl
染色，脫水封片后于光鏡下觀察。
免疫組織化學(xué)染色
切片入().()1ir.ol/L PBS搖洗3次后，入Triton X-IO()液3()mi n (37°C)，入 3X過(guò)氧化氫2()min (避光)，血清封閉lh (室溫)，分別滴加1: K)()抗l)53、抗 P隠、抗lk卜2、抗Ca叩ase-3抗體5()W.于各組不同的切片上，置于室溫下lh， 入rc冰箱過(guò)夜。第二天復(fù)溫lh后入滴加ABC試劑盒中B、 C液于對(duì)應(yīng)的 切片上，室溫下各孵育lh，各步驟之間均入0. 01mol/L PBS搖洗3次，l)八B顯色， 常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。每組各5張切片， 每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并作統(tǒng)計(jì)分析。 透射電鏡
另取大鼠，缺血再灌注24小時(shí)后，麻醉下經(jīng)左心室以i0 ml/分鐘灌注生理 鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干凈后，以3 nil /分鐘的速度灌注固定液12() ml， 固定液成分為4%甲醛，2%戊二醛，0. 1M磷酸緩沖液。然后迅速取下整個(gè)大 腦，冠狀切面切成卜2 mm厚組織片，然后轉(zhuǎn)移到3%戊二醛固定液中固定過(guò)夜， 然后用沖洗液洗三次，再用W俄酸固定液固定2小時(shí)。再用系列丙酮脫水，用 Kpon812樹(shù)脂包埋劑包埋，6(TC孵育48小時(shí)。然后進(jìn)行修塊，切成60 nm厚的 組織片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，分別于缺血區(qū)，半影區(qū)和半影對(duì)側(cè)鏡像區(qū)用 JI:M-1230透射電鏡觀察大腦超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠腦局部血流量的影響
圖26是用激光多普勒血流量?jī)x測(cè)得的Sham組、I/R組、CG(). 4+1/1 組和 C(;0.8+l/R組在缺血前，缺血5分鐘，再灌注后大鼠腦患側(cè)血流量圖。Sham組大 鼠各時(shí)間腦血流量無(wú)明顯變化。I/R組大鼠在缺血5分鐘時(shí)，腦血流量明顯降低， 再灌注后腦血流量逐漸恢復(fù)。CG0. 4+I/R組和CG(). 8十I/R組大鼠在缺血5分時(shí)的 腦血流量也顯著降低，但在再灌注開(kāi)始，腦血流量恢復(fù)速度比較快。
圖27是各組腦血流量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，I/R組，CG0. 4+I/R組和C(;(). 8十1/K組在 缺血5分時(shí)腦血流量顯著降低，CG0. 4+I/R組在再灌注0分和再灌注20分有一 過(guò)性的升高，CG(). 8+I/R組在再灌注20分腦血流量也有一過(guò)性的升高。養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠腦細(xì)靜脈管徑變化率的影響
圖28顯示Sham組，T/R組，CGO. 4+I/R組和C(;O. 8+T/R組大鼠腦細(xì)靜脈管 徑在整個(gè)觀察過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)T/R后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的影響
圖29顯示Sh柳組，I/R組，C(;O. 4十I/R組和CGO. 8+/R組在缺血前和再灌 注后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的經(jīng)時(shí)變化。Sham組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在 本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著的變化。1/K組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流在再灌注()min時(shí) 顯著下降，持續(xù)到再灌注4()分。CG0.4+I7R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在再灌 注()min時(shí)顯著也有所下降，然后逐漸恢復(fù)。CG(). 8+I/R組在再灌注(kin時(shí)顯著 也有所下降，但是恢復(fù)速度比]/R組快。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)1/R后大鼠腦細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞的影響
圖30顯示Sham組，1/R組，CGO. 4+I/R組和C(;(). 8+T/R組大鼠腦細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞數(shù)量的變化。在本觀察期間內(nèi)，Sham組大鼠腦細(xì)靜脈壁僅有少量的 白細(xì)胞黏附，17R組大鼠在再灌注開(kāi)始后，腦細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附數(shù)量顯著地增 多，并持續(xù)增多到本觀察結(jié)束時(shí)。養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘砸种拼笫蟠笫竽X 細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附的增加。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)I/K后大鼠腦細(xì)靜脈血漿白蛋白滲出的影響
圖31顯示Sht加組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+] /R組大鼠腦細(xì)靜脈FITC 標(biāo)記白蛋白漏出的動(dòng)態(tài)。Sham組大鼠，在本觀察期間內(nèi)大鼠腦細(xì)靜脈l'TrC標(biāo)記 白蛋白僅有少量的漏出。I/R組大鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出從再灌注() 分后顯著地增加一直持續(xù)到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分顯著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)1/R大鼠腦皮層鈣超載神經(jīng)元的影響
圖32A顯示的是Sham組，I/R組和CG+I/R組大鼠腦皮層活體鈣染色圖片。 圖中藍(lán)染者為神經(jīng)元，綠染者為鈣離子。Sham組大鼠神經(jīng)元內(nèi)偶見(jiàn)綠染的鈣離 子。1/l 組大鼠神經(jīng)元內(nèi)綠染的鈣離子明顯增多，CG+I/R組大鼠較1/R組大鼠神 經(jīng)元內(nèi)的綠染鈣離子明顯減少。
圖32B比較了 Sham組，I/R組和CG+I/R組大鼠腦皮層鈣超載神經(jīng)元的陽(yáng)性 細(xì)胞率。Sham大鼠腦皮層鈣超載細(xì)胞為17. 9%。
I/R組大鼠腦皮層鈣超載細(xì)胞的上升至65.6%。、 C(;+T/R組大鼠腦皮層鈣超載神經(jīng)細(xì)胞比降到38.5%，顯著地 低于1/K組。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦梗死區(qū)域的影響
圖W顯示TTC染色結(jié)果，白色區(qū)域代表缺血梗死區(qū)。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死蒼 白區(qū)，1/R組腦切片中缺血側(cè)腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下基底核都有明顯的白色梗死灶。養(yǎng) 血清腦顆粒預(yù)防給藥后梗死區(qū)域均有所減小。
圖vi是梗死體積統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，與假手術(shù)組相比，iA組梗死率明顯
升高，養(yǎng)血清腦顆粒預(yù)給藥濃度依存性降低了大鼠缺血再灌注后的梗死率。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦NissL染色的影響
圖35是Sham組(A1-A3)， I/R組(B1-B3) ，CG(). 4+l/R組(C卜C3)和C(;O. 8+l/K 組(l)l-l):O大鼠腦組織Ni.ssl染色的結(jié)果。Sham組鏡下可見(jiàn)正常大腦皮質(zhì)各層細(xì) 胞排列整齊、規(guī)則，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)基質(zhì)無(wú)水腫?；咨窠?jīng)節(jié)區(qū)神經(jīng)元結(jié) 構(gòu)也lH常，神經(jīng)纖維無(wú)損壞；皮質(zhì)神經(jīng)元胞體體積較大，胞漿淡染，內(nèi)含大而圓 的泡狀核，胞核規(guī)整，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)尼氏體(A1 -A:O。 1/K組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，胞體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊?？梢?jiàn)核固縮、核溶解。部分神 經(jīng)細(xì)胞皺縮，變形呈三角形，尼氏小體減少或消失，呈現(xiàn)光鏡下的淡染區(qū)(B1H )。 C:(;(). 4 + l/R組仍然存在部分細(xì)胞排列紊亂的情況。但是皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰， 胞體腫脹、核固縮、核溶解程度較1/R組明顯減輕,淡染區(qū)面積減小，病變范圍 明顯縮小(Cl-C3) 。 CGO. 8+I/R組神經(jīng)元數(shù)量較多，但層次紊亂，細(xì)胞大而圓，尼氏 體深染(DJ-D3)。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠大腦免疫組織化學(xué)染色的影響
圖36是Sham組(Al， M，Ci,Dl)， 1/R組(A2， B2，C2， D2)， C(U+1/K組 (A3， B3，C3， D3)和CG0. 8+l/R組(A4， B4, C4， D4)大鼠腦Qaspasc-3、 P5:〗、1糧、 Bc卜2免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組Caspase-3、 P53、 PUM、 Bc卜2均未見(jiàn) 明顯表達(dá)(Al， B1，C1,D1)。 1/R組觀察半影區(qū)皮質(zhì)可見(jiàn)P5:KB2)、 PUMA(C2)的表 達(dá)增強(qiáng)，胞核胞漿均有表達(dá)，部分皺縮細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻一致性表達(dá)。CaspascKKA2) 和Bd-2 (D2)的表達(dá)較Sham組增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陽(yáng)性顆粒主要位于神 經(jīng)元胞漿中。C(;(). 4+I/R組Caspase-3 (A3) 、 PUMA(C3)的表達(dá)量較I/K組明顯減 少，而P53(B3)的陽(yáng)性細(xì)胞減少了，同時(shí)Bcl-2(D3)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較1/R組明顯增多。8+I/R組R53(M)、 P暖(C4)、 Caspase-3 (A4)的表達(dá)量較1/R組明顯減 少，而Ik卜2(IM)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與I/R組接近。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖37所示，Sham組Caspase-3、 P53、 PUM八、13cl-2均未見(jiàn)明顯 表達(dá)，與Sham組相比，I/R組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，C(;0.4+l/l 組 C:u叩hso-3 、 PUMA的表達(dá)量較I/R組明顯減少，而P53表達(dá)未見(jiàn)顯著性差異， 同時(shí)1〗cl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較[/R組明顯增多。C(;O. 8+:〖/R組P5:〗、P隠、Ca叩as(廣:〗 的表達(dá)量較組明顯減少，而B(niǎo)el-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較組未見(jiàn)明顯差異。 養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠超微結(jié)構(gòu)的影響
圖38顯示的是Sham組(Al-A3)， I/R組(B1-B3)和CG+I/R組(C卜C3)大鼠 腦皮層缺血區(qū)透射電鏡的圖像。Sham組大鼠腦血管周圍未見(jiàn)水腫，內(nèi)皮光滑 (八2)，神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整(A3)。 1/K組在缺血再灌注區(qū)可 見(jiàn)血管周圍出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，壓迫管腔，血管內(nèi)皮不光滑，出現(xiàn)指狀突起肥大(l")， 腦皮層神經(jīng)元大量皺縮，細(xì)胞器降解難辨，出現(xiàn)暗細(xì)胞和壞死神經(jīng)元(B3) 。CX+I/K
組血管周圍水腫減輕，但是管腔仍狹窄(C2)，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整(c:0。
圖39顯示的是1/R組(A， B, C)和CG+T/R組(D， E， F)大鼠腦皮層半影區(qū)透射電 鏡的圖像。1/K組可見(jiàn)血管周圍出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，但是血管內(nèi)皮相對(duì)光滑，有小泡 突出管腔(B)，仍可見(jiàn)暗細(xì)胞(C)。 CG十1/R組組血管周圍水腫明顯減輕(l':)，神 經(jīng)元受損較輕(F)。
圖40顯示的是I/R組(A, B, C)和CG+I/R組(D， E, F)大鼠腦皮層半影對(duì)側(cè)鏡像 區(qū)透射電鏡的圖像。T/R組血管周圍仍可見(jiàn)輕微水腫(B)， CG+I/R組血管周圍水
腫消失(i':)。 二者神經(jīng)元形態(tài)正常(c和F)。
圖i表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0.8g/kg組蒙古沙鼠腦血流量的變化。各組間的腦 血流量在觀察期間內(nèi)沒(méi)有明顯性差異。
圖2表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì) 靜脈血管徑的結(jié)果。各組間腦細(xì)動(dòng)脈和靜脈管徑?jīng)]有顯著變化。
圖3表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì) 靜脈紅細(xì)胞流速的結(jié)果。各組間蒙古沙鼠腦細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速?zèng)]有顯著
性差異。
圖4表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦蒙古沙鼠細(xì) 靜脈壁黏附白細(xì)胞的結(jié)果。假手術(shù)組細(xì)靜脈壁黏附白細(xì)胞少于1個(gè)/加()inn，缺 血再灌注組腦細(xì)靜脈壁的粘附白細(xì)胞數(shù)顯著增加(3. 1±0. 17)，養(yǎng)血清腦顆粒
0. .1g/kg和().8g/kg顯著抑制了腦細(xì)靜脈壁的粘附白細(xì)胞數(shù)(IJ土O. 11和
1. 3±(). 17)。
圖5是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg組， 缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)腦細(xì)靜脈壁圖R 熒光強(qiáng)度的結(jié)果。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦細(xì)靜脈壁DIIR熒光強(qiáng)度顯著 增強(qiáng)，養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘詼p弱腦細(xì)靜脈壁l)HR熒光強(qiáng)度的增加。
圖6表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化Vkg 組，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組在再灌注5天蒙古沙鼠腦蒙古沙鼠細(xì) 靜脈白蛋白漏出的結(jié)果。假手術(shù)組腦細(xì)靜脈1;[TC標(biāo)記白蛋白僅有少量的漏出。 缺血再灌注組F]TC標(biāo)記白蛋白的漏出顯著增加。養(yǎng)血清腦顆粒濃度依存性減少 腦細(xì)靜脈F1TC標(biāo)記白蛋白的漏出。
圖7A是假手術(shù)組(a)，缺血再灌注組(b)，缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg 組(c)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒0. 8g/kg組(d)蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)大 腦海馬CAl區(qū)Tunel染色的圖像。假手術(shù)組沒(méi)有觀察到Tunel陽(yáng)性細(xì)胞(a)，缺血 再灌注組可以看見(jiàn)許多Tunel陽(yáng)性細(xì)胞(b)，養(yǎng)血清腦顆粒給藥組Tunel陽(yáng)性細(xì)胞 濃度依存性減少(c和d)。圖7B是各組腦海馬CAl區(qū)Tunel染色的結(jié)果。與假手術(shù) 組相比，缺血再灌注組海馬CAl區(qū)Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，養(yǎng)血清腦顆粒 可以濃度依存性減少海馬CAl區(qū)Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
圖8是假手術(shù)組(A,D)，缺血再灌注組(B，E)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒 組(C，F(xiàn))蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)血管透射電鏡的圖像。假手術(shù)組可以觀察到 血管內(nèi)皮光滑，血管周圍組織的無(wú)水腫現(xiàn)象(A，D)。缺血再灌注組可以觀察到血 管周圍組織出現(xiàn)明顯水腫(B， E)。缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒組可以觀察到血管周圍水腫明顯減輕(C，F(xiàn))。
圖9是假手術(shù)組(A，d)，缺血再灌注組(b,E)和缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒 組(C，F(xiàn))蒙古沙鼠在再灌注5天時(shí)海馬神經(jīng)元透射電鏡的圖像。假手術(shù)組海馬 神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整(A， d)。缺血再灌注組海馬出現(xiàn)暗細(xì)胞，
神經(jīng)元損傷(b,io。缺血再灌注+養(yǎng)血清腦顆粒組形態(tài)較完整，損傷較輕(c，n。
圖10是用激光多普勒血流量?jī)x測(cè)得的Sham組、17r組、C(;(H+I/K組和
c(;(). +i/k組在缺血前，缺血5分鐘，再灌注后大鼠腦患側(cè)血流量圖。sh，組大
鼠各時(shí)間腦血流量無(wú)明顯變化。1/R組大鼠在缺血5分鐘時(shí)，腦血流量明顯降低， 再灌注后腦血流量逐漸恢復(fù)。C(;O. 4+I/R組和CGO. 8+[/R組大鼠在缺血5分時(shí)的 腦血流量也顯著降低，但在再灌注開(kāi)始，腦血流量恢復(fù)速度比較快。
圖11是各組腦血流量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，I/R組，CGO. 4+l/R組和C(;O. 8+l/K組在 缺血5分時(shí)腦血流量顯著降低，CGO. 4+f/R組在再灌注()分和再灌注2()分有一 過(guò)性的升高，CG(). 8+I/R組在再灌注20分腦血流量也有一過(guò)性的升高。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)缺血再灌注后大鼠腦細(xì)靜脈管徑變化率的影響
圖12顯示Sham組，L/R組，C(;(). 4+I/R組和C(;(). 8+1/R組大鼠腦細(xì)靜脈管 徑在整個(gè)觀察過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。
養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)I/R后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的影響
圖13顯示Sham組，I/R組，C(;O. 4+I/R組和CGO. 8+T/R組在缺血前和再灌 注后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的經(jīng)時(shí)變化。Sham組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在 本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著的變化。1:/R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流在再灌注()min時(shí) 顯著下降，持續(xù)到再灌注40分。CG0.4+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在再灌 注()min時(shí)顯著也有所下降，然后逐漸恢復(fù)。CGO. 8+I/R組在再灌注()mi n時(shí)顯著 也有所下降，但是恢復(fù)速度比1/R組快。
圖14顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+l/R組大鼠腦細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞數(shù)量的變化。在本觀察期間內(nèi)，Sham組大鼠腦細(xì)靜脈壁僅有少量的 白細(xì)胞黏附，I/R組大鼠在再灌注開(kāi)始后，腦細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附數(shù)量顯著地增 多，并持續(xù)增多到本觀察結(jié)束時(shí)。養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘砸种拼笫蟠笫竽X 細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附的增加。
圖15顯示Sham組，I/R組，C(;O. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈1'TI'C 標(biāo)記白蛋白漏出的動(dòng)態(tài)。Sham組大鼠，在本觀察期間內(nèi)大鼠腦細(xì)靜脈FiTC標(biāo)記白蛋白僅有少量的漏出。l:/R組大鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出從再灌注0 分后顯著地增加一直持續(xù)到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分顯著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠腦細(xì)靜脈F[TC標(biāo)記白蛋白的漏出。
圖16表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒().化/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 血管徑的連續(xù)變化。假手術(shù)組在本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著地變化。缺血再灌注組 細(xì)靜脈在再灌注開(kāi)始時(shí)有一過(guò)性輕微擴(kuò)張，持續(xù)到再灌注60分。養(yǎng)血清腦顆粒 ().化/kg+缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組的腦細(xì)靜脈管徑在觀 察期間內(nèi)沒(méi)有顯著地變化。
圖17表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.化Zkg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 紅細(xì)胞流速的連續(xù)變化。假手術(shù)組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在本觀察期間內(nèi) 沒(méi)有顯著地變化。缺血再灌注組在再灌注開(kāi)始到再灌注20分期間腦細(xì)靜脈紅細(xì) 胞血流速度顯著地降低。養(yǎng)血清腦顆粒0.4g/kg給藥組在再灌注l()分后，顯著 地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞血流速度的降低。養(yǎng)血清腦顆粒().《 組在再灌注開(kāi)始時(shí)就抑制了的腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞血流速度的降低。
圖18表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.化/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦血流量 的連續(xù)變化。假手術(shù)組的腦血流量在本觀察期間內(nèi)沒(méi)有明顯的變化，缺血再灌注 組在再灌注開(kāi)始后顯著降低，且持續(xù)到再灌注60分。養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg+缺 血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組在再灌注10分后，顯著地抑制了 缺血再灌注弓I起的腦血流量的降低。
圖19表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞的連續(xù)變化。假手術(shù)組在觀察結(jié)束時(shí)，黏附于腦細(xì)靜脈壁的白細(xì)胞在 不到:]個(gè)/200y m。缺血再灌注組于蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁的白細(xì)胞數(shù)在再灌注開(kāi) 始增加，在再灌注結(jié)束時(shí)，已經(jīng)達(dá)到6個(gè)/20() u m。養(yǎng)血清腦顆粒().4g/kg+缺血 再灌注組，在再灌注30分后顯著地抑制了白細(xì)胞與大腦細(xì)靜脈管壁粘附。養(yǎng)血 清腦顆粒0. 8+缺血再灌注組，在再灌注10分后就顯著地抑制了白細(xì)胞與大腦細(xì)靜脈管壁粘附。
圖20是缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒組蒙古沙鼠在缺血再灌注前和再灌注 6()分時(shí)腦細(xì)靜脈壁DHR熒光強(qiáng)度變化的圖像。缺血再灌注蒙古沙鼠(a)和養(yǎng)血 清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠(c)在缺血前，沒(méi)有觀察到細(xì)靜脈壁DI1R熒光發(fā) 光部位.在再灌注60分時(shí)，可以觀察到缺血再灌注蒙古沙鼠沿腦細(xì)靜脈壁l)HR 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的部位(b)，而養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠沒(méi)有觀察到 腦細(xì)靜脈壁D冊(cè)熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)(d).
圖2]表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 壁DHR熒光強(qiáng)度的連續(xù)變化。假手術(shù)組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈壁的DHR熒光強(qiáng)度比在 本觀察期間內(nèi)幾乎沒(méi)有變化。缺血再灌注組蒙古沙鼠腦靜脈壁的DHR熒光強(qiáng)度比 在再灌注10分后開(kāi)始增加，且持續(xù)增加。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組 和養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在再灌注10分顯著地抑制了缺血再灌注引起 的腦細(xì)靜脈壁的DHR螢光強(qiáng)度的增加。
圖22是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒組蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈F1TC 標(biāo)記白蛋白漏出的圖像。在缺血再灌注前，假手術(shù)蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙 鼠和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠均沒(méi)有觀察到FITC標(biāo)記白蛋白漏出細(xì) 靜脈外。在再灌注60分時(shí)，假手術(shù)蒙古沙鼠幾乎沒(méi)有觀察到腦細(xì)靜脈F:[TC標(biāo)記 白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以觀察到FITC標(biāo)記白蛋白的明顯漏出。 養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后6()分時(shí)，只有少量FITC標(biāo)記 白蛋白的漏出于細(xì)靜脈外。
圖23表示的是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg十缺血再灌 注組，養(yǎng)血清腦顆粒0.8+缺血再灌注組在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠腦細(xì)靜脈 [nTC標(biāo)記白蛋白漏出的連續(xù)變化。假手術(shù)組在本觀察期間，腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記 白蛋白的僅有少量的漏出。缺血再灌注組從再灌注開(kāi)始就可觀察到F:ITC標(biāo)記白 蛋白的漏出，并持續(xù)增加。養(yǎng)血清腦顆粒0. 4g/kg+缺血再灌注組在再灌注60分 顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。養(yǎng)血清腦顆 粒().8+缺血再灌注組在再灌注30分以后顯著地抑制了缺血再灌注引起的腦細(xì)靜 脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。圖24-A是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組大腦皮質(zhì) 掃描電鏡下毛細(xì)血管開(kāi)放的圖像。假手術(shù)組可見(jiàn)皮質(zhì)中有許多毛細(xì)血管，且分布 較均勻。缺血再灌注組可以觀察到開(kāi)放的毛細(xì)血管顯著減少，而且分布不均勻， 養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組開(kāi)放的毛細(xì)血管數(shù)量與假手術(shù)組相接近。圖24-15 是假手術(shù)組，缺血再灌注組，養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)的結(jié) 果。毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)相對(duì)于假手術(shù)組(41.33±0.667)在缺血再灌注后明顯下降
(30. 33 士 1. 667 )，養(yǎng)血清腦顆粒顯著抑制了毛細(xì)血管開(kāi)放數(shù)的減少
(42±0. 577)。
圖25是假手術(shù)組，缺血再灌注組和養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組蒙古沙鼠再 灌注60分后的大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管的透射電鏡和掃描電鏡的圖象。圖a， h， c是 透射電鏡圖像，假手術(shù)組(a)可以觀察到血管內(nèi)皮光滑，血管周圍組織的無(wú)水 腫現(xiàn)象。缺血再灌注組(b)可以觀察到血管周圍組織出現(xiàn)明顯水腫。養(yǎng)血清腦 顆粒+缺血再灌注組(c)可以觀察到血管周圍水腫明顯減輕。圖d， c， f是掃描 電鏡圖像，假手術(shù)組(d)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮光滑，內(nèi)皮細(xì)胞間 連接緊密。缺血再灌注組(e)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部細(xì)靜脈血管內(nèi)皮可以觀察到血 管內(nèi)細(xì)胞眾多的隆起，內(nèi)皮細(xì)胞連接處，細(xì)胞間相互嵌合的指狀突起肥大，且內(nèi) 皮表面出現(xiàn)許多突起的小泡。養(yǎng)血清腦顆粒+缺血再灌注組(f)蒙古沙鼠腦皮質(zhì)部 細(xì)靜脈血管內(nèi)皮較光滑，連接處指狀突起和小泡明顯減少。
圖26是用激光多普勒血流量?jī)x測(cè)得的Sham組、I/R組、CGO. 4+T/R組和 CGO. 8+I/R組在缺血前，缺血5分鐘，再灌注后大鼠腦患側(cè)血流量圖。Sham組大 鼠各時(shí)間腦血流量無(wú)明顯變化。I/R組大鼠在缺血5分鐘時(shí)，腦血流量明顯降低， 再灌注后腦血流量逐漸恢復(fù)。CGO. 4+]/R組和CGO. 8+I/R組大鼠在缺血5分時(shí)的 腦血流量也顯著降低，但在再灌注開(kāi)始，腦血流量恢復(fù)速度比較快。
圖27是各組腦血流量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/K組在 缺血5分時(shí)腦血流量顯著降低，CGO. 4+I/R組在再灌注0分和再灌注20分有一 過(guò)性的升高，CGO. 8+I/R組在再灌注20分腦血流量也有一過(guò)性的升高。
圖28顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈管 徑在整個(gè)觀察過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。
圖29顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和CGO. 8+I/R組在缺血前和再灌注后大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速的經(jīng)時(shí)變化。Sham組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在 本觀察期間內(nèi)沒(méi)有顯著的變化。I/R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流在再灌注()min時(shí) 顯著下降，持續(xù)到再灌注40分。CG0.4+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞流速在再灌 注()min時(shí)顯著也有所下降，然后逐漸恢復(fù)。CGO. 8+I/R組在再灌注()min時(shí)顯著 也有所下降，但是恢復(fù)速度比T/R組快。
圖30顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+I/R組和C(;(). 8+I/R組大鼠腦細(xì)靜脈壁 黏附白細(xì)胞數(shù)量的變化。在本觀察期間內(nèi)，Sham組大鼠腦細(xì)靜脈壁僅有少量的 白細(xì)胞黏附，I/R組大鼠在再灌注開(kāi)始后，腦細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附數(shù)量顯著地增 多，并持續(xù)增多到本觀察結(jié)束時(shí)。養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘砸种拼笫蟠笫竽X 細(xì)靜脈白細(xì)胞黏附的增加。
圖31顯示Sham組，I/R組，CGO. 4+:L/R組和CGO. 8+T/R組大鼠腦細(xì)靜脈FITC 標(biāo)記白蛋白漏出的動(dòng)態(tài)。Sham組大鼠，在本觀察期間內(nèi)大鼠腦細(xì)靜脈F1TC標(biāo)記 白蛋白僅有少量的漏出。I/R組大鼠腦細(xì)靜脈FH'C標(biāo)記白蛋白的漏出從再灌注() 分后顯著地增加一直持續(xù)到再灌注60分。CG的投予在再灌注60分顯著地抑制 缺血再灌注引起的大鼠腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。
圖:32A顯示的是Sham組，I/R組和CG+T/R組大鼠腦皮層活體鈣染色圖片。 圖中藍(lán)染者為神經(jīng)元，綠染者為鈣離子。Sham組大鼠神經(jīng)元內(nèi)偶見(jiàn)綠染的f丐離 子。1/R組大鼠神經(jīng)元內(nèi)綠染的鈣離子明顯增多，C(;+]:/R組大鼠較17R組大鼠神 經(jīng)元內(nèi)的綠染鈣離子明顯減少。
圖32B比較了 Sham組，I/R組和CG+I/R組大鼠腦皮層鈣超載神經(jīng)元的陽(yáng)性 細(xì)胞率。Sham大鼠腦皮層鈣超載細(xì)胞為17.9%。
I/R組大鼠腦皮層鈣超載細(xì)胞 的上升至65.6%。、 CG+I/K組大鼠腦皮層鈣超載神經(jīng)細(xì)胞比降到38. 5%，顯著地 低于1/R組。
圖33顯示TTC染色結(jié)果，白色區(qū)域代表缺血梗死區(qū)。假手術(shù)組未見(jiàn)梗死蒼 白區(qū)，IZR組腦切片中缺血側(cè)腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下基底核都有明顯的白色梗死灶。養(yǎng) 血清腦顆粒預(yù)防給藥后梗死區(qū)域均有所減小。
圖34是梗死體積統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，與假手術(shù)組相比，I/R組梗死率明顯 升高，養(yǎng)血清腦顆粒預(yù)給藥濃度依存性降低了大鼠缺血再灌注后的梗死率。
圖35是Sham組(A1-A3), I/R組(B1-B3) ，CG(). 4+I/R組(C1-C3)和C(;(). 8+1/R組(1〕卜D3)大鼠腦組織Nissl染色的結(jié)果。Sham組鏡下可見(jiàn)正常大腦皮質(zhì)各層細(xì) 胞排列整齊、規(guī)則，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)基質(zhì)無(wú)水腫?；咨窠?jīng)節(jié)區(qū)神經(jīng)元結(jié) 構(gòu)也正常，神經(jīng)纖維無(wú)損壞；皮質(zhì)神經(jīng)元胞體體積較大，胞漿淡染，內(nèi)含大而圓 的泡狀核，胞核規(guī)整，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)尼氏體(A1-A3)。 1/R組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，胞體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊。可見(jiàn)核固縮、核溶解。部分神 經(jīng)細(xì)胞皺縮，變形呈三角形,尼氏小體減少或消失，呈現(xiàn)光鏡下的淡染區(qū)(Bl-B3)。 C(;(). 4+l/R組仍然存在部分細(xì)胞排列紊亂的情況。但是皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰, 胞體腫脹、核固縮、核溶解程度較/R組明顯減輕，淡染區(qū)面積減小，病變范圍 明顯縮小(C1-C3) 。 CGO. 8+I/R組神經(jīng)元數(shù)量較多，但層次紊亂，細(xì)胞大而圓，尼氏 體深染(D1-D3)。
圖36是Sham組(Al， Bl， Cl， Dl)， I/R組(A2， B2, C2， D2) ， CG(). 4+T/R組(A3， B3，C:U)3)和C(;0. 8+T/R組(A4， B4， C4, D4)大鼠腦Caspase-3、〖)53、 PUMA、 Bc卜2 免疫組織化學(xué)染色的圖像。Sham組Caspase-3、 P53、 PUMA、 Bel-2均未見(jiàn)明顯 表達(dá)(AL， B1，C1,D1)。 1/R組觀察半影區(qū)皮質(zhì)可見(jiàn)P53(B2)、 PUMA(C2)的表達(dá)增 強(qiáng)，胞核胞漿均有表達(dá)，部分皺縮細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻一致性表達(dá)。Ca叩&sc-:K八2) 和Bc卜2 (D2)的表達(dá)較Sham組增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陽(yáng)性顆粒主要位于神 經(jīng)元胞漿中。CGO. 4+I/R組Caspase-3 (A3) 、 P腿(C3)的表達(dá)量較T/R組明顯減 少，而P53(B3)的陽(yáng)性細(xì)胞減少了，同時(shí)Bel-2(D3)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較1/R組明顯增 多。C(;(). 8+I/R組P53(B4) 、 PUMA(C4) 、 Caspase-3 (A4)的表達(dá)量較I/R組明顯減 少，而B(niǎo)el-2 (D4)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與I/R組接近。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖37所示，Sham組Caspase-3、 P53、 PUMA、 Bc]-2均未見(jiàn)明顯 表達(dá)，與Sham組相比，I/R組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，C(;O. 4+l/R組 Caspase-3 、 PUMA的表達(dá)量較I/R組明顯減少，而P53表達(dá)未見(jiàn)顯著性差異， 同時(shí)Bc丄-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較I/R組明顯增多。C(;O. 8+I/R組P53、 PL謹(jǐn)、Caspase-3 的表達(dá)量較T/R組明顯減少，而B(niǎo)el-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較I/R組未見(jiàn)明顯差異。
圖38顯示的是Sham組(A1-A3)， I/R組(B1-B3)和CG+I/R組(C1-C3)大鼠 腦皮層缺血區(qū)透射電鏡的圖像。Sham組大鼠腦血管周圍未見(jiàn)水腫，內(nèi)皮光滑 (A2)，神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整(A3)。 1/R組在缺血再灌注區(qū)可 見(jiàn)血管周圍出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，壓迫管腔，血管內(nèi)皮不光滑，出現(xiàn)指狀突起肥大(B2)，腦皮層神經(jīng)元大量皺縮，細(xì)胞器降解難辨，出現(xiàn)暗細(xì)胞和壞死神經(jīng)元(B3) 。C(;+l/K 組血管周圍水腫減輕，但是管腔仍狹窄(C2)，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整(C3)。
圖39顯示的是I/R組(A， B， C)和CG+I/R組(D， E， F)大鼠腦皮層半影區(qū)透射電 鏡的圖像。1/K組可見(jiàn)血管周圍出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，但是血管內(nèi)皮相對(duì)光滑，有小泡 突出管腔(B)，仍可見(jiàn)暗細(xì)胞(C)。 CG+1/R組組血管周圍水腫明顯減輕(l':)，神 經(jīng)元受損較輕(F)。
圖40顯示的是I/R組(A， B, C)和CG+I/R組(D, E， F)大鼠腦皮層半影對(duì)側(cè)鏡像 區(qū)透射電鏡的圖像。17R組血管周圍仍可見(jiàn)輕微水腫(B)， CG+I/R組血管周圍水 腫消失(H) 。 二者神經(jīng)元形態(tài)正常(C和F)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1
養(yǎng)血清腦顆粒，由如下重量份的原料藥制成當(dāng)歸250- 420;川芎280^00; 赤芍200-380;熟地黃200-400;鉤藤580-750;雞血藤550-780;夏枯草600-720; 決明子500-750;珍珠母560-750;延胡索200-420;細(xì)辛30-100。上述配方以 克為單位，其顆粒的制備可采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備成lO()()g顆粒劑。
權(quán)利要求
1. 養(yǎng)血清腦顆粒在制備一種治療腦微循環(huán)障礙的藥物應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述養(yǎng)血清腦顆粒是由當(dāng)歸25()-化0份; 川芎280-400份；白芍200-380份；熟地黃200-400份；鉤藤580-750份； 雞血藤550-780份；夏枯草600-720份；決明子500-750份；珍珠母560-750 份；延胡索200-420份；細(xì)辛30-100份為主要成分制成的中藥復(fù)方制劑。
3. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒可以抑制腦微循 環(huán)障礙和腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，該作用與其抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生和調(diào)亡相關(guān)。
4. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒抑制了腦細(xì)靜脈 壁的粘附白細(xì)胞數(shù)。
5. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒的預(yù)給藥可以抑 制缺血再灌注引起的腦皮層微循環(huán)障礙。
6. 權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒的預(yù)給藥可以抑 制缺血再灌注引起的腦皮層微循環(huán)障礙，該作用與其抑制過(guò)氧化物，抑制白 細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血漿白蛋白外漏相關(guān)。
7. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒可以濃度依存性 減弱腦細(xì)靜脈壁DHR熒光強(qiáng)度的增加。
8. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒濃度依存性減少 腦細(xì)靜脈FITC標(biāo)記白蛋白的漏出。
9.權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆?？梢詽舛纫来嫘?減少染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
10. 權(quán)利要求l的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是養(yǎng)血清腦顆粒在再灌注開(kāi)始時(shí) 就抑制了的腦細(xì)靜脈紅細(xì)胞血流速度的降低。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥制劑的新用途，特別涉及中藥養(yǎng)血清腦顆粒對(duì)腦微循環(huán)障礙的改善作用，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，養(yǎng)血清腦顆?？梢砸种颇X微循環(huán)障礙和腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，該作用與其抑制過(guò)氧化物產(chǎn)生和凋亡相關(guān)。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101530498SQ20081005242
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者安麗華, 昕 常, 徐想順, 芳 王, 胡白和, 趙新榮, 韓晶巖 申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司