專利名稱：新的高異黃酮類化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的高異黃酮類化合物及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉竹為百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)植物玉竹(尸o(ygo""&wo&W訓(xùn)(Mill.)Druce)干燥根莖，為常用中藥。最早以葳蕤之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。
玉竹味甘性平，微寒，無毒，歸肺、胃經(jīng)，能養(yǎng)陰潤肺，益胃生津，用于燥熱、傷陰、熱傷和胃陰之癥，有提高免疫力、強心、降血糖、降血脂等功效。主要含有多糖、皂苷、甾醇、黃酮類等成分。
高異黃酮類化合物(homoisoflavonoids)是黃酮化合物中特殊的一類，母體結(jié)
構(gòu)比異黃酮多一個碳原子。這類化合物在植物中較少見，主要分布于百合科沿階草屬Ophiopogon、綿棗兒屬Scilla、波羅蘭屬Eucomis和藍壺花屬Muscari等植物中。在豆科云實屬植物金鳳花Ga^a/^w'a/w/c/z^T/waN蘇木C. rap/ ""、鷹葉剌C. 6owfece//a等植物中也有少量發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人從玉竹中分離得到三個新結(jié)構(gòu)的高異黃酮類化合物I、 II、 III，并具有很高的抗腫瘤活性。
具體地，本發(fā)明涉及
(1)下式化合物及其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥
<formula>formula see original document page 3</formula>其中，K^為-OCH3或-CH3， R2為H或-CH3， R3為H或-OH， R4為-OH或醫(yī)OCH3。
(2)下式(1)、 (II)或(III)的化合物及其可藥用鹽、溶劑化物、立
體異構(gòu)體或前藥<image>image see original document page 4</image>
(3) —種藥物組合物，其含有項(1)或(2)的任一化合物作為活性成份和可藥用載體。
(4) 項(1)或(2)任一化合物在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。
(5) 根據(jù)項(4)的用途，其中所述的腫瘤為白血病、結(jié)腸癌、肺癌、肉瘤或肝癌。
本發(fā)明利用上述化合物I、 II、 III及其溶劑化物、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體及前藥作為活性成分，單獨或組合使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的用于腫瘤治療的藥物。
本發(fā)明涉及的具有上述用途的化合物不僅是化合物本身，適當時也可以是其藥學(xué)上可接受的鹽(酸或堿加成鹽)或其溶劑化物(例如水合物、醇合物等)、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體及前藥，下文中為簡便起見，都簡稱為本發(fā)明的化合物。
上述藥學(xué)可接受的加成鹽包括化合物能夠形成的治療活性的非毒性酸和堿加成鹽形式。堿性的化合物通過用適當?shù)乃崽幚韷A的形式可轉(zhuǎn)化成它們的藥學(xué)可接受的酸加成鹽。酸的例子包括無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、
硫酸、磷酸；有機酸，諸如乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、馬來酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、水楊酸、對氨基水楊酸、撲酸、苯甲酸、抗壞血酸等。堿加成鹽形式的例子是鈉、鉀、鈣鹽，以及與藥學(xué)可接受的胺形成的鹽，所述的胺是諸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，諸如精氨酸和賴氨酸。
在治療腫瘤中，用本發(fā)明的化合物，以常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物。如注射劑，散劑，丸劑，膠囊劑，片劑，微囊劑，軟膠囊劑，膜劑，栓劑，膏劑，酊劑，沖劑，氣霧劑等各種制劑。
給藥方式以及有效劑量的選擇將尤其根據(jù)所治療的疾病而異。給^方式和劑量的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本發(fā)明化合物的單位劑型通常將含有0.1至99重量％活性物質(zhì)，更通常為5至75重量％活性物質(zhì)。舉例來說，單位劑型可以含有l(wèi)mg至lg化合物，更通常為10mg至500mg，例如在50mg與400mg之間，劑量通常為100mg至200mg。
每個劑量單位或每次口服給藥優(yōu)選地含有1至250mg(關(guān)于腸胃外給藥，優(yōu)選地含有0.1至25mg)的項1化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的化合物將按照有效提供所需治療效果的量給藥。提供所需治療效果所必要的濃度將尤其根據(jù)疾病的明確性質(zhì)、患者的年齡、體重和疾病的嚴重性而異。
給藥劑量優(yōu)選地將對患者是無毒的，不過在某些情況下所治療疾病的嚴重性可能迫使給以導(dǎo)致一些毒性跡象的量的化合物。
通常，本發(fā)明化合物的給藥量將在0.01mg/kg至100mg/kg體重的范圍內(nèi)，
更優(yōu)選為0.1mg/kg至10mg/kg體重，特別是lmg/kg至5mg/kg體重。
藥學(xué)上可接受的本發(fā)明化合物正常地將按照每日劑量方案對受治療者給藥。關(guān)于成年患者，例如可以是項l化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的口服劑
量在lmg與500mg之間，優(yōu)選在lmg與250mg之間，或者靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)劑量在O.lmg與100mg之間，優(yōu)選在0.1mg與25mg之間，按照游離化合物計算，化合物每天分1至4次給藥。因而，關(guān)于體重70kg的普通人，本發(fā)明化合物的典型每日劑量將在70mg至700mg的范圍內(nèi)。這樣一種劑量例如可以每日分二至四次給藥。
不過，給藥劑量的大小和給藥的頻率最終將由治療該患者的醫(yī)師來決定和判斷。
本發(fā)明的藥理實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有顯著抑制人白血病細胞K562，人肺癌細胞A549，人結(jié)腸癌HCT-15等腫瘤細胞生長的活性，促進腫瘤細胞凋亡，提示可以用于腫瘤治療。體內(nèi)實驗研究結(jié)果進一步證實了本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性。


圖1為化合物I的'H-NMR圖譜
圖2為化合物I的13C-NMR圖譜
圖3為化合物I的ESI-MS圖譜
圖4為化合物I的HMBC圖譜
圖5為化合物I的HMQC圖譜
圖6為化合物I的H-HCOSY圖譜
圖7為化合物II的1H-NMR圖譜
圖8為化合物II的13C-NMR圖譜
圖9為化合物II的ESI-MS圖譜
圖10為化合物II的HMBC圖譜圖11為化合物II的HMQC圖譜圖12為化合物II的H-HCOSY圖譜圖13為化合物III的"H-NMR圖譜圖14為化合物III的13C-NMR圖譜圖15為化合物III的ESI-MS圖譜圖16為化合物III的HMBC圖譜圖17為化合物III的HMQC圖譜圖18為化合物I、 II、 III的分離流程圖
化合物I為淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇-水)，分子量346，分子式為C18H1807。!H-NMR(CD30D， 500MHz)& 6.82 (1H， d， J =8.5Hz， H-6')， 6,20(1H， d, J =2.5Hz，H曙3')， 6.17 (lH，dd， J=2.5, 8.5Hz,H-5')， 4.22 (1H， dd, J =4.0， 11.4Hz， H-2)， 4.10
(1H， dd， J =7.0， 11.4Hz， H-2)， 3.66 (3H， s, 6-OCH3)， 3.08 (1H， dd, J =5.0, 13.5Hz，H-9)， 2.88 (IH， m,H-3)， 2.52 (1H， dd， J =10.0， 13.5Hz， H-9)， l.卯(3H， s，8-CH3)。碳譜數(shù)據(jù)見表1。該化合物結(jié)構(gòu)為[5， 7-dihydroxy-6methoxyl-8-methyl-3-(2'， 4'—dihydrox—ybenzyl)chroman-4國onG]。
化合物II為淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇-水)，分子量316，分子式為C17H1606。!H-NMR(CD30D， 500MHz)& 6.80(1H， d, J =8.5Hz， H-6')， 6.24(1H, d， J =2.5Hz，H-3')， 6.17 (lH，dd，J=2.5, 8.5Hz，H-5')， 4.14 (1H， dd， J =4.0， 11.4Hz， H-2)， 4.01
UH，dd， J=7.0， 11.4Hz，H-2)， 3.08 (1H, dd, J =5.0, 13.5Hz， H-9)， 2.88 (IH，m,H-3)， 2.52 (1H, dd, J =10,0, 13.5Hz， H-9)， 1.87 ( 3H， s, 6-CH3)。碳譜數(shù)據(jù)見表1。該化合物結(jié)構(gòu)為[5， 7-dihydroxy-6-methyl-3-(2'， 4'-dihydroxybenzyl)-chrom-an-4-one]。
化合物III為淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇-水)，分子量344，分子式為C19H2()06。'H-NMR (CD3OD， 500MHz) & 7.08 (2H， d, J =8.5Hz， H-2'，6')， 6.79 (2H，d，J=8.0Hz，H-3',5') ，4.20 (1H, dd， J =4.5， 11.5Hz, H-2)， 4.03 (1H, dd, J =7.5， 11.5Hz,H-2)， 3.69 GH,s, 6-OCH3)， 3.07 (1H， dd， J =4.5， 14.0Hz， H-9)， 2.75 (lH，m，H-3)， 2.52 (lH，dd， J =10.5， 14.0Hz， H-9)， 1.90 (3H, s， 8-CH3)。碳譜數(shù)據(jù)見表1 。該合物結(jié)構(gòu)為[5, 7-dihydroxy-6醫(yī)methoxyl-8-methyl畫3-(4'-methoxybenzyl)
chroman-4-one]。
表1化合物I-III的碳譜數(shù)據(jù)13C-NMR (CD30D， 125MHz)
PositionCompound ICompound IICompound III
270.970.670.3
346.646,548.0
4200.4200.2199.4
4a102.4102.6102.3
158.9165.9159.0
6129.0105.1129.0
7158.5162.8158.6
8105.194.8105.2
83153.1162.3152.9
928.828.333.0
116.8116.9131.3
2,157.6157.5131,1
3,103.5103.5115.0
4,158.3158.3159.9
5,107.5107.4115.0
6,132.6132.6131.1
61.5-61.5
6-￡H3-6.9-
8-￡H37.2—7.2
4'- 0￡H3--55.6
8表2化合物I-III的HMBC數(shù)據(jù)
HCompound ICompound IICompound III
2-HC隱9,C-3， C-4,C-8aC-9,C-3，C-4 , C-8aC-9， C陽3,C-4 , C-8a
6-OCH3C國6-C-6
6-CH3-C陽5 :,C-7 ,C-8 ， C-6-
8-CH3C-8， C-7,C-4a， C-6 C-8a-C-8, C-7,C-5， C國6 C-8a
8-H-C-7，C隱8 ， C隱6， C-4-
3'-HC-l'， C-5', C-4'C-l',C-5', C-4'-
5'-Hc-r， c-3'c-i'，C-3', C-4'-
6'-HC-4', C-9C-4'，C-3'一
2', 6'國H--C-3'， C隱4', C-5'
3'， 5'-H--C誦2'， C-4', C-6'
具體實施例方式
下述實施例及實驗例用于證實本發(fā)明化合物的制備工藝及用途，不應(yīng)理解成對本發(fā)明的限制。除非特別說明，本發(fā)明中所有百分比均為體積百分比。
中藥玉竹(中國藥典)石家莊樂仁堂藥店waters996型高效液相色譜儀
HPLC制備色譜柱(VenusilXBPC-18， lOpm ， 10mmx250mm)INVOA500型核磁共振波譜儀Volian公司，TMS為內(nèi)標ZMD Micromass型質(zhì)譜儀英國Micromass公司柱層析硅膠青島海洋化工廠Sephadex LH-20 :安瑪西亞公司
薄層層析用硅膠板及色譜純乙腈默克公司
C02恒溫細胞培養(yǎng)箱美國SHELLAN公司PMI1640培養(yǎng)液GIBCO公司MTT: Sigma公司人白血病細胞K562:美國菌種保藏中心人肺癌細胞A549:美國菌種保藏中心
人結(jié)腸癌細胞HCT-15:美國菌種保藏中心
Victor 2 1420多標計數(shù)儀美國PE公司實施例l:化合物的制備
玉竹藥材50Kg粉碎后，用95%乙醇(乙醇/水，以下同)回流提取2次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮得浸膏4.2Kg，浸膏用4倍體積甲醇溶解，過濾，殘渣棄去，甲醇溶解部分用等體積石油醚萃取2次，得到石油醚層部分和甲醇層部分。對甲醇層部分進一步分離純化，得到化合物I、 II、 III。具體的分離流程見附圖18。實施例2 MTT法體外抑瘤實驗
實驗材料K562， A549， HCT-15
采用常規(guī)MTT法。收集處于對數(shù)生長期的上述各腫瘤細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，然后用10%的RPM1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0xl05/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100nl，分別加入不同濃度的化合物l-3，陰性對照藥為磷酸鹽緩沖液，陽性對照藥為順鉑。每組均設(shè)3個復(fù)孔。置于37'C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入10ulMTT (5mg/ml)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)上清，每孔加入10%的SDS 100ul，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，放置過夜，最后用酶標儀于490nm波長處測定各孔OD值，進行細胞增殖分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行/檢驗。
實驗結(jié)果顯示，化合物I-III對K562、 A549和HCT-15細胞生長有明顯的抑制作用?；衔颕-III對腫瘤細胞的IC5。值見下表
表l化合物I-III對腫瘤細胞的IC5c值(ICso: ug/ml)
化合物K562A549HCT-15
I12.532.719.1
II10.029.815.6
III13.235.321.4
順鉑2.485.022.37實施例3 S180肉瘤小鼠體內(nèi)抑瘤實驗
實驗材料:小鼠S180，河北醫(yī)科大學(xué)。清潔級昆明種小鼠，雄性，體重18-22g，購自河北省實驗動物中心。順鉑，山東省德州制藥廠生產(chǎn)。
實驗方法采用昆明種小鼠皮下接種S-180肉瘤模型。瘤種體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，記數(shù)，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為6xl(^個/ml，接種于小鼠右前肢腋下，每只0.21111，隨機分成5組，每組動物10只，同時記錄每組小鼠體重。設(shè)生理鹽水組和順鉑陽性對照組，三個化合物設(shè)5.0mg/Kg劑量組，于接種后次日連續(xù)腹腔注射給藥8天，第9天脫頸椎處死動物，記錄小鼠體重，解剖取出瘤塊，稱重，根據(jù)下式計算抑瘤率。
生理鹽水組平均瘤重一給藥組平均瘤重
抑瘤率(％) = - X100%
生理鹽水組平均瘤重
實驗結(jié)果本發(fā)明化合物對S180小鼠肉瘤的生長具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為35.9%， 40.3%， 34.2%，而對小鼠體重無明顯影響(見表2)。
表2化合物l-3對昆明種S180肉瘤小鼠的抑瘤率
組別齊U量(mg/kg)用藥前體重(g)用藥后體重(g)激
生理鹽水—19.9±1.221.0±0.7—
順鉬2.020.7±1.417.9±0.650.4
化合物I5.021.7±0.722.3±1.635.9
化合物II5.020.8±1.321.8±1.040.3
化合物III5.021.3±1.020.7±1.434.2
實施例4肝癌小鼠體內(nèi)抑瘤實驗
實驗材料BALb/c純系小鼠，雄性8-12周齡，體重20-22g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。H-22肝癌小鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。順鉑，山東省德州制藥廠生產(chǎn)。
實驗方法無菌抽取荷H-22肝癌小鼠第7天腹水，用生理鹽水稀釋10倍，于受試小鼠右前肢腋窩皮下注射0.21111。隨機分成5組，每組動物10只，同時記錄每組小鼠體重。設(shè)生理鹽水組和順鉑陽性對照組，化合物l、 2、 3給藥劑量均為5.0mg/Kg，于接種后次日連續(xù)腹腔注射給藥8天，第9天脫頸椎處死動物，記錄小鼠式計算抑瘤率。
生理鹽水組平均瘤重 一 給藥組平均瘤重
抑瘤率(％) = - xioo%
生理鹽水組平均瘤重
實驗結(jié)果化合物I、 II、 m對H-22肝癌小鼠的腫瘤生長具有一定的抑制作用，在5.0mg/kg的劑量時抑瘤率分別達到41.2。/。、 46.9%和37.8%，而對小鼠的體重無明顯影響，見表3。
表3本發(fā)明化合物對H-22肝癌小鼠(BALb/c小鼠)的抑瘤率
組別劑量(mg/kg)用藥前體重(g)用藥后體重(g)抑瘤率(％)
生理鹽水—20.7±1.221.9±1.3—
順鉬2.021.7±1.717.2±1.680.4
化合物15.020.7±1.421.3±0.941.2
化合物25.021.9±0.722.1±1.246.9
化合物35.020.9±0.922.0±1.537.8
權(quán)利要求
1.下式化合物及其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥其中，R1為-OCH3或-CH3，R2為H或-CH3，R3為H或-OH，R4為-OH或-OCH3。
2.下式(1)、 (II)或(III)的化合物及其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu) 體或前藥CH3,0、 HO、H3CO'OH O,0\ HO、OHCH3O(II);,OCH3H3CO,OH O(III),
3. —種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1或2的任一化合物作為活性成份和可藥 用載體。
4. 權(quán)利要求1或2的任一化合物在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的用途，所述的腫瘤為白血病、肺癌、結(jié)腸癌、肉瘤或肝癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類如下式所述的高異黃酮類化合物，其中，R¹為-OCH₃或-CH₃，R²為H或-CH₃，R³為H或-OH，R⁴為-OH或-OCH₃，以及含有上述化合物或其可藥用鹽的藥物組合物。本發(fā)明的化合物對于腫瘤，特別是白血病、結(jié)腸癌、肺癌、肉瘤或肝癌具有明顯的抑制作用。
文檔編號A61K36/88GK101591315SQ20081005518
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者任風(fēng)芝, 華 張, 張艷哲, 張艷立, 張雪霞, 朱京童, 李麗紅, 寧 王, 范玉玲, 賀建功, 鄭智慧, 陳書紅, 高月麒 申請人:華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司